JP4129606B2 - 非性的凝集性を有する分裂酵母 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe )の凝集変異株に関する。
【0002】
【従来の技術】
出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)において構成的に凝集する変異株はFLO変異株と呼ばれ近年解析が進められてきている(Teunissen,A.W.R.H. and Steensma,H.Y.,Yeast,11,1001-1013(1995) )。FLO変異株はビール製造において最も重要であり、かつ菌体と培養液との分離工程での手間のかかる作業がきわめて容易に行えるために、盛んに利用されている。
【0003】
培養後に酵母が凝集して発酵タンクの底に自然に沈んでくることは、ビール醸造にとって都合の良い現象であり、ビール醸造所はこの酵母の凝集という現象を、機構は不明のまま安価な酵母の分離方法として利用してきた。近年の遺伝学および分子生物学的手法を用いた解析から、その凝集に関する遺伝子(FLO)が同定され解析がなされるようになり、一層注目されている。
【0004】
これまでにFLO遺伝子の中で凝集素(フロッキュリン)をコードする遺伝子としてFLO1、FLO5、FLO9、FLO10が同定されている。これら遺伝子のコードするタンパク質はきわめて類似した構造を有し、すべてマンノースを特異的に認識するマンノース特異的レクチン活性を有している。また細胞表層への局在にはC末端部分にGPIアンカーが結合していることが明らかにされている。このようにサッカロミセス・セレビシエにおける凝集のメカニズムは細胞表層に局在する凝集素が細胞表層のマンナンを含む複合糖質に結合することにより起こることが、明らかになってきた。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe )[以下、S.ポンベという]は出芽酵母サッカロミセス・セレビシエとは系統進化的にきわめて異なる酵母であり、細胞増殖機構、染色体構造、RNAスプライシング機構、糖蛋白質糖鎖へのガラクトース残基の付加等の諸性質が複雑で動物細胞と類似している利点がある。そのため醸造以外に、遺伝子工学的手法による異種タンパク質の生産のための良き宿主として近年注目されてきている[Giga-Hama,Y. and Kumagai,H. eds.,Foreign gene expression in fission yeast Schizosaccharomyces pombe.1997,Springer-Verlag,Germany]。
【0006】
目的タンパク質の生産に際し、培養液と菌体との分離工程は、菌体内タンパク質および培地中に分泌されるタンパク質のどちらの生産においても必要なものであり、生産規模が増すに従いその効率化が求められる。しかし、S.ポンベにおいては性的凝集に関する現象については古くから解析が行われているが、非性的に凝集する変異株については全く報告がない。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはS.ポンベの非性的に凝集する変異株を取得し、その株の持つ性質、変異遺伝子の同定、産業用利用などを検討することを目的に、変異株の取得を行った。その結果、非性的に凝集するS.ポンベの変異株を取得するに至った。本発明は、非性的に、カルシウムイオン、リチウムイオン、マンガンイオン、銅イオンおよび亜鉛イオンのいずれにも依存する凝集する性質を有する分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe )変異株、である。また本発明は、その非性的に凝集する性質が、ある種の金属イオンに依存し、またある種の糖によって阻害される性質を有する変異株である。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明において、「非性的に、カルシウムイオン、リチウムイオン、マンガンイオン、銅イオンおよび亜鉛イオンのいずれにも依存する凝集する性質」(以下、非性的凝集性という)とはS.ポンベが本来有する性的に凝集する性質(性的凝集性)とは異なる凝集性を有する性質をいう。しかし、本来有する性的凝集性が失われていることを意味するものではない。また、「構成的凝集性」とは非性的凝集性と同一の性質をいうが、特に増殖過程において増殖と同時に(非性的に)凝集する性質を指していう。
【0009】
S.ポンベは本来フェロモンで誘導される性的凝集性を有する。たとえば、増殖過程において栄養不足をきたすと性的凝集を生じやすい。しかし、タンク培養などによる人工的大量培養においては通常充分な量の栄養を有する培養液中で培養が行われることより性的凝集を起こすことは少ない。一方、本発明の変異株では充分な量の栄養を有する培養液中で培養が行われても増殖とともに凝集(構成的凝集)を起こす。これは、この変異株が非性的凝集性を有することによる。
【0010】
このように本発明の変異株はタンク培養などにおいて菌体を凝集させることができ、それにより菌体と培養液を容易に分離できる。したがって、たとえば遺伝子工学的手法によって蛋白質を生産する場合に本発明変異株を宿主として用いることにより、繁雑な工程である遠心分離や濾過などによる菌体と培養液の分離工程を格段に容易に行うことができる。
【0011】
本発明変異株はたとえば人工的突然変異手段により非性的凝集性を有しない通常のS.ポンベから取得できる。すなわち、非性的凝集性を有しないS.ポンベを突然変異誘発物質で処理し、処理されたS.ポンベから非性的凝集性を有する菌を選択し、さらに選択された菌から非性的凝集性が優性変異であるものを選択することにより作成できる。
【0012】
後述実施例において、以下に示す具体的作成手段により本発明変異株を取得するとともに、その性質を決定した。
(1)S.ポンベとしてTP4−1D株やTP4−5A株[ともに、登田 隆博士(Imperial Cancer Research Fund )より供与された]などの株を以下の実験に用いる。
(2)上記S.ポンベをメタンスルホン酸エチル(以下、EMSという)などの突然変異誘発物質で処理した後、YPD液体培地などの培養液にて生育させる。
(3)培養後、容易に菌体が沈殿する画分を分取する。
(4)分取した菌体をYPDプレートなどに塗布して培養する。
(5)コロニーの形状から凝集株を選別する。
(6)選別した変異株(h+ )株を野生株の(h- )株とかけあわせ、ランダムスポアー法によりハプロイドを取得する。
(7)カルシウムイオン存在下、非存在下での凝集の有無を決定する。
(8)凝集を阻害する糖の種類を決定する。
(9)細胞表層やその他の糖鎖を含有する構成成分に凝集を阻害する糖を含まない変異株と上記凝集変異株との凝集の様子を比較観察する。
【0013】
その結果、得られた変異株は目的とする非性的に(かつ構成的に)凝集する性質を有するS.ポンベ変異株であった。また、この変異株は、ガラクトースによりその非性的凝集性が阻害される性質を有していた。同様に、1−メチルアルファガラクトシド、1−メチルベータガラクトシド、ラクトース、メリビオースおよびラフィノースによりその非性的凝集性が阻害される性質を有していた。一方、マンノース、グルコース、フルクトース、N−アセチルガラクトサミンおよびガラクトサミンではその非性的凝集性は阻害されなかった。
【0014】
さらに、得られた上記変異株の非性的凝集性はカルシウムイオン依存性を有していた。すなわち、カルシウムイオン非存在下では非性的凝集性は見られなかった。同様に、この非性的凝集性はリチウムイオン、マンガンイオン、銅イオンおよび亜鉛イオンのいずれの存在にも依存し、これらのイオンの非存在下では非性的凝集性は見られなかった。このように、上記変異株が非性的に凝集するためには上記のような陽イオンのいずれかが存在する必要がある。
【0015】
【実施例】
[例1]
分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe )TP4−1D株をMM液体培地100mlに接種し、OD600=0.2〜0.5まで27℃で培養した。培養液を50mlのディスポ遠心管を用いて4℃、3000rpmで10分間遠心し集菌し、次いでOD600=5となるように新しいMM液体培地を加えた。
【0016】
この菌体溶液に濃度が2wt%となる量のEMSを添加し、30℃で3時間、穏やかに振盪培養した。室温、3000rpmで10分間遠心して集菌し、MM液体培地で3回洗浄した。廃液は50wt%チオ硫酸ナトリウム水溶液で処理した。
【0017】
得られた菌体にOD600=0.01となる量のMM液体培地を加え、それをMM液体培地でさらに100倍、500倍、および1000倍希釈し、それぞれの希釈液をYPDプレート( 1wt%のイーストエキストラクト、2wt%のペプトンおよび2wt%のグルコースを含む3wt%寒天プレート)に蒔いた。
【0018】
27℃で3〜4日培養し、生育してきたコロニーをEMS処理菌とした。この菌体をYPD液体培地にて生育させた。培養して容易に菌体が沈殿する画分を分取し、さらにYPDプレートに塗布して28℃で4日間培養を行った。分裂酵母の凝集する変異株はYPDプレートのコロニーの形状から[野生株の性的凝集は椀状に凝集するのに対しこの変異株は円錐状に凝集する]、比較的容易に選別できる。このような方法で数株の凝集変異株を取得した。
【0019】
取得した凝集変異株の中で凝集の程度が強い変異株(h+ )株1つを選びそれを野生株(h- )とかけあわせ、ランダムスポアー法(Alfa,C.,Fantes,P.,Hyams,J.,McLeod,M.,Warbrick,E.,Experiments with Fission Yeast, Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1993) )によりハプロイドを取得した(この変異株をARC027株と名付けた[受託番号:FERM P−16989])。この操作を3回行った後の変異株をARC028株と名付けた[受託番号:FERM P−16990]。このARC028株を野生株とかけあわせたところ、2倍体においても凝集特性を示したことから優性変異であることがわかった。この変異をGSF1(for Galactose Specific Flocculation )変異と名付けた。
以下の試験はARC0028株を用いて行った。なお、ARC0027株も同じ性質を有していた。
【0020】
[例2]
ARC0028株の凝集の陽イオン依存性について調べた。
ARC0028株をYPD液体培地にて32℃で2日間培養した結果、菌体が構成的に凝集して培養器底部に沈殿した。次にこの菌体を250mMのEDTA水溶液にて菌体を洗浄した。その結果、菌体の凝集は完全に解離し、EDTA水溶液中に均一に分散した。さらにこの分散液に250mMとなる量の塩化カルシウムを添加したところ、菌体は再び凝集し培養器底部に沈殿した。このことより、この変異株の凝集はカルシウムイオン依存性であること(すなわち、凝集にはカルシウムイオンが必要であること)がわかった。
カルシウムイオン以外の陽イオンについて同様な実験をした結果、この変異株の凝集性はリチウムイオン、マンガンイオン、銅イオンおよび亜鉛イオンに依存していることがわかった。
【0021】
[例3]
次にARC0028株の凝集の糖特異性について調べた。
ARC0028株をYPD液体培地にて32℃で2日間培養した結果、菌体が構成的に凝集して培養器底部に沈殿した。次にこの菌体を250mMのEDTA水溶液で菌体を洗浄し菌体の凝集を解離させた。この分散液に、2Mとなる量のガラクトースを添加して撹拌し、その後250mMとなる量の塩化カルシウムを添加した。その結果、菌体の凝集は起こらず、菌体は分散状態のままであった。このことより、この変異株の凝集性はガラクトースにより阻害されることがわかった。
【0022】
ガラクトースの添加量を変えて同様の試験を行い、凝集阻害を起こさせるガラクトースの濃度を測定した。その結果を図1に示す。図1はガラクトース濃度(mM)と凝集率(%)との関係を示すグラフである。図1より50%凝集阻害をもたらすガラクトース濃度は約8mMであった。
【0023】
他の糖で同様の凝集阻害実験を行った結果、1−メチルアルファガラクシド、1−メチルベータガラクトシド、ラクトース、メリビオースおよびラフィノースが凝集阻害活性を有していた。一方、マンノース、グルコース、フルクトース、N−アセチルガラクトサミンおよびガラクトサミンは凝集阻害活性を有していなかった。
【0024】
以上の結果からARC0028株の持つ凝集活性はガラクトース特異的であり、その糖の特異性は単糖の場合はC−4、C−6およびC−2位を厳しく認識していることがわかった。さらに糖鎖の場合は非還元末端にガラクトースがあればアグリコンの特性は低いことがわかった。
【0025】
[例4]
S.ポンベはその糖鎖構成成分としてガラクトースを生産することが知られている(Font de Mora,J.,Valentin,E.,Herrero,E.,J.Gen.Microbiol.,136,2251-2259(1990) )。本発明者らはすでに糖鎖の構成成分としてガラクトース鎖が全く付加されないgms1変異株を取得している(Tabuchi,M.,Tanaka,N.,Iwahara,S.,Takegawa,K.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,232,121-125(1997) )。そこでgms1+ 遺伝子破壊株をガラクトース鎖を含まないマーカー菌として、共凝集性(co-flocculation )を野生株と比較した。
【0026】
混合した菌をEDTA水溶液で処理してARC0028株の凝集を解除した。その後、カルシウムイオンを添加して、共凝集性を調べた。その結果ARC0028株と野生株の混合した場合は、ARC0028株は野生株と共凝集するために上澄みは透明になった。一方、ARC0028株とgms1+ 遺伝子破壊株を混合した場合には完全に共凝集することなく上澄みに凝集しない菌体が認められた。
【0027】
【発明の効果】
本発明者は、非性的に(かつ構成的に)凝集する分裂酵母S.ポンベ変異株を見い出した。この凝集変異株は、その凝集性がガラクトースなどの特定の糖で阻害され、またカルシウムイオンなどの特定の陽イオン依存性である変異株であり、S.ポンベ細胞表層のガラクトースを認識して凝集するものであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図1】凝集の程度とガラクトースの濃度との関係を示すグラフ。
Claims (4)
- 非性的に、カルシウムイオン、リチウムイオン、マンガンイオン、銅イオンおよび亜鉛イオンのいずれにも依存する凝集する性質を有する分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe )変異株。
- 凝集する性質がガラクトースにより阻害される凝集性である、請求項1に記載の変異株。
- 非性的凝集性を有する分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe )ARC027株(受託番号:FERM P−16989)。
- 非性的凝集性を有する分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe )ARC028株(受託番号:FERM P−16990)。
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