WO2006025295A1 - マンナンタンパク質を放出する酵母株およびマンナンタンパク質の製造法 - Google Patents

マンナンタンパク質を放出する酵母株およびマンナンタンパク質の製造法 Download PDF

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WO2006025295A1
WO2006025295A1 PCT/JP2005/015619 JP2005015619W WO2006025295A1 WO 2006025295 A1 WO2006025295 A1 WO 2006025295A1 JP 2005015619 W JP2005015619 W JP 2005015619W WO 2006025295 A1 WO2006025295 A1 WO 2006025295A1
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WO
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mannan
protein
yeast
mannan protein
seq
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PCT/JP2005/015619
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English (en)
French (fr)
Inventor
Miwa Tanaka
Tetsuji Odani
Toshifumi Yuuki
Yasuyuki Ohtake
Yoh-Ichi Shimma
Takehiko Yoko-O
Yasunori Chiba
Yoshifumi Jigami
Original Assignee
Asahi Breweries, Ltd.
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)

Definitions

  • the present invention relates to a yeast strain that releases a yeast cell wall component, particularly a mannan protein, particularly a mannan protein containing ⁇ -mannan, into a medium, and a mannan protein using this strain, particularly a mannan containing ⁇ -mannan.
  • the present invention relates to a method for producing a protein.
  • the present invention also relates to a method for producing mannan, particularly ⁇ -mannan.
  • yeast has a long history of safety and has been used not only for bread production and fermentation of alcohol such as beer, but also for yeast itself as an extract or as a yeast cell wall.
  • the cell wall is mainly composed of insoluble glucan and has been mainly used as dietary fiber.
  • Glucan is also known to have functions such as immunostimulation, and has become one of the food materials that attract attention in the recent health food boom.
  • water-soluble polysaccharides mainly composed of mannan protein are also present in the cell wall.
  • Mannan protein is a general term for substances in which mannan chains are bound to proteins located in the cell wall in a binding mode called ⁇ -glycoside bond or 0-glycoside bond.
  • Mannan extraction methods reported in these can be broadly classified into three. (1) Extraction of hot water (including dilute alkali) (Japanese Examined Patent Publication No. 64-3479, Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-109423) (2) Autolysis (Japanese Examined Publication No. 58-57153) (3) Digestion with cell wall lytic enzyme ( Shoko 59-40 126).
  • the crude extracts obtained by these methods function by appropriately combining a mannan-copper complex to remove copper, deproteinize with hydrochloric acid, alcohol precipitation, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, protease treatment, etc.
  • the sex fraction was collected. The purification steps in these methods are complicated, and the amount recovered per liter of medium was about 10 mg.
  • Rhodotorula mucilaginosa strain YR-2 is known as a yeast that secretes mannan out of bacteria (Japanese Journal of Nutrition, Food Science Society, 55 ⁇ , 33-39 (2002), JP 2002-095492).
  • the mannan secreted by this yeast is a so-called ⁇ -mannan composed of ⁇ 1,3- and ⁇ 1,4-bonds, and is different from ⁇ -mannan contained in the mannan protein which is a cell wall component.
  • An object of the present invention is to provide a yeast strain that releases a mannan protein that is as close to the native state of yeast as possible, particularly a mannan protein containing human mannan, and such a mannan protein, particularly a mannan protein containing ⁇ -mannan. It is to provide an efficient manufacturing method.
  • Another object of the present invention is to provide a mannan protein, particularly a mannan protein containing ⁇ -mannan, which is produced using the yeast strain and koji of the present invention or the method of the present invention and which is close to the natural state.
  • ⁇ -mannan is a polymer of D-mannose composed of ⁇ 1, 6-, ⁇ -1, 2- or a 1, 3-linkage.
  • Another object of the present invention is to provide a method for efficiently producing mannan, particularly ⁇ -mannan.
  • a further object of the present invention is to provide a mannan close to the natural state, especially ⁇ -mannan, produced using the process of the present invention.
  • mannan protein and mannan are yeast-derived mannan protein (yeast mannan protein) and yeast-derived mannan (yeast mannan), respectively.
  • the present invention is a yeast strain characterized by releasing yeast cell wall components, particularly mannan proteins, particularly mannan proteins containing ⁇ -mannan, into a medium. More specifically, the present invention is a yeast that releases a mannan protein containing human mannan into a medium by having a mutation in a sugar chain synthesis system gene. More specifically, the present invention relates to a yeast strain that releases mannan protein into a culture medium, characterized in that the mutation is in a gene that codes for a protein involved in the mechanism that causes the mannan protein to remain in the cell wall. It is.
  • the present invention is a yeast that releases a mannan protein including ⁇ -mannan having a mutation in a gene encoding a 1,2-mannosyltransferase. More specifically, the present invention relates to a yeast strain that releases a mannan protein containing ⁇ -mannan, which has a mutation in the gene encoding ⁇ 1,2-mannosyltransferase, and which comprises the above 1,2-mannosyltransferase.
  • nucleic acid capable of hybridizing under stringent conditions with a nucleic acid having the sequence of nucleotide numbers 234 to 2081 of the sequence set forth in SEQ ID NO: 17 (this region encodes GPI10 protein (GpilOp)), Fermentation mother stock.
  • the yeast of the present invention is a yeast identified by the accession number FERM BP-10390 or FERM BP-10391.
  • the present invention also provides a method for culturing a yeast characterized by releasing cell wall components into a medium, in particular, an enzyme that releases mannan protein, particularly mannan protein containing ⁇ -mannan, into a medium in a liquid medium.
  • a method for producing a mannan protein, particularly a mannan protein comprising a mannan protein which comprises recovering a mannan protein released into the medium, particularly a mannan protein comprising ⁇ -mannan.
  • the present invention also provides a mannanta naturally produced in the cell wall produced by the above method. It is also an isolated mannan protein that is close to the protein and in a state (close to the natural state), particularly an isolated mannan protein containing ⁇ -mannan.
  • the present invention relates to a mannan protein naturally occurring in the cell wall comprising removing a protein moiety obtained from the present invention and / or from a mannan protein of the present invention, in particular a mannan protein comprising ⁇ -mannan.
  • a mannan protein comprising ⁇ -mannan.
  • yeast that releases cell wall components, particularly mannan protein, into the medium is produced and used.
  • Such a yeast can be obtained by mutagenesis treatment of yeast and selecting a yeast strain in which mannan protein can no longer remain on the cell wall.
  • the yeast to be mutated is not particularly limited. Sesaccharomyces bayanus, Saccharomyces kudriavzevii, Tanorebeguchi Kluyveromyces lactis, Candida utilis, Candida citis ⁇ , Saccharomyces cerevisiae More preferable Mutagenesis treatment can be performed by general methods such as mutagen treatment such as EMS, UV irradiation, and irradiation. Are well known to those skilled in the art (Ishikawa et al., Microbial Genetics Experimental Methods). Kaiser. C. et al., 1994 Metho ds in east enetics, old bpnng Harbor Laboratory.
  • a yeast strain that releases almost no mannan protein such as a wild-type yeast strain
  • YPD medium a yeast strain that releases almost no mannan protein
  • 4 ml of 2% dalcose Suspend in an appropriate buffer such as 0.2 M phosphate buffer (pH 8.0), and add ethylmethanesulfonate (EMS) at a final concentration of 1% to 5%, preferably about 3%.
  • EMS ethylmethanesulfonate
  • the concentration of EMS and the treatment time are appropriately adjusted so that the survival rate is 15% to 60%, preferably about 20 to 30%. Can be varied.
  • neutralize EMS with 6% sodium thiosulfate solution and apply the cells to an appropriate medium such as YPD medium.
  • the yeast of the present invention encodes a 1,2-mannosyltransferase involved in the biosynthesis of a synthesizing enzyme such as a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor at a site necessary for the mannan protein to remain in the cell wall.
  • a synthesizing enzyme such as a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor
  • GPI glycosylphosphatidylinositol
  • the yeast of the present invention is a yeast that cannot retain the mannan protein in the cell wall while retaining a function essential for force survival having a mutation in GPI10. Therefore, the yeast of the present invention can also be obtained by a site-specific or random mutagenesis method targeting a gene encoding 1,2-mannosyltransferase, for example, GPI10. Such molecular biological techniques are also well known to those skilled in the art.
  • the yeast of the present invention has a mutation in the GPI10 gene such that a proline residue at position 498 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18 is substituted with a leucine residue. It is.
  • the yeast of the present invention comprises a nucleic acid having a sequence of nucleotide numbers 234 to 2081 of the sequence shown in SEQ ID NO: 17 (GpilOp is encoded by this region) and a string.
  • the stringent condition means a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not substantially formed.
  • DNA having high homology with stringent conditions for example, DNAs having a homology of 70% or more, preferably 80% or more preferentially hybridize, and DNAs having a lower homology are preferentially hybridized.
  • DNAs having a homology of 70% or more, preferably 80% or more preferentially hybridize are preferentially hybridized.
  • no hybridization, or hybridization at a temperature and salt concentration corresponding to 50 ° C, 2xSSC, 0.1% SDS, preferably lxSSC, 0.1% SDS, more preferably 0.1xSSC, 0.1% SDS is there.
  • a polypeptide having a sequence having 40% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 can be considered as a 1,2-mannosyltransferase candidate in the present invention.
  • a gene encoding a polypeptide can be considered as a gene encoding ⁇ 1,2-mannosyltransferase.
  • Nucleic acid or amino acid homology can be found in NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankOver view.html) or DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome). -j.html) can be calculated by using BL ASTN, BLASTP, FASTA, etc.
  • Saccharomyces paradoxus gb AABY01000142.1
  • 86% for Saccharomyces mikatae gb: AABZ01000054.1 85% for Saccharomyces bayanus gb: AACG0100048 5.1
  • lactose 68% for 49643748, 50% for Neurospora crassa ref-NW-04710.1, Schizosaccharomyces pombe ref-NC—003421.1 "41%, 49% for Candida albicans gb: AACQ 01000012.1
  • homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 of SMP3 and ALG9 is 40% and 43%, respectively.
  • a protein encoded by an acid and a protein having 40% or more sequence homology with the sequence shown in SEQ ID NO: 18 are generally available (having X 1,2-mannosyltransferase activity.
  • the nucleic acid is introduced into an ⁇ 1,2-mannosyltransferase-deficient yeast strain (e.g., Eu roscarf Y24509) along with the appropriate promoter and other sequences required for expression to complement the a1,2-mannosyltransferase of the defective strain. (Especially lethal complementation).
  • proteins having a 1,2-mannosyltransferase activity are also collectively referred to as a 1,2-mannosyltransferase.
  • the yeast of the present invention comprises a nucleic acid having a sequence of nucleotide numbers 234 to 2081 of the sequence shown in SEQ ID NO: 17 (GpilOp is encoded by this region) and a stringent.
  • a proline residue corresponding to the 498th proline residue of the sequence shown in SEQ ID NO: 18 is substituted with a leucine residue.
  • This yeast has a mutation.
  • the proline residue corresponding to the 498th proline residue in the sequence described in SEQ ID NO: 18 can be determined by aligning amino acid sequences.
  • the candidate strains are synthesized in an appropriate medium, for example, synthetic; 3 ⁇ 4 ⁇ (Difco dry soil Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17% Glucose (2%, amino acid 0.13%) is cultured at approximately 30 ° C for 2-4 days, and the supernatant is precipitated by adding approximately 2-3 times the amount of ethanol as needed (ethanol precipitation method). It can be analyzed by PAS staining etc. after -PAGE (SDS-polyacrylamide electrophoresis). The medium and culture temperature do not inhibit the growth of the yeast !, and preferably are suitable for the growth of the yeast! Next, a strain that has been confirmed to release more mannan protein into the medium than the parental wild-type strain can be selected and used as the yeast of the present invention.
  • 3 ⁇ 4 ⁇ Difco dry soil Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17% Gluco
  • yeast of the present invention can be added or removed by backcrossing the yeast of the present invention, or by mating with a mutant yeast strain or a wild-type yeast strain.
  • mannan protein release, growth rate and auxotrophy have been improved, or other properties have been imparted or improved
  • diploid, mannan protein-releasing yeast can be made.
  • Yeast Multiplication methods and conditions are well known to those skilled in the art (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)).
  • the present inventors have produced various derivative strains that release mannan protein, particularly a-mannan protein, using MTY9 as a starting material (Fig. 4).
  • Typical examples of yeasts that release mannan proteins of the present invention and that can be used in the present invention, particularly mannan proteins including hi-mannan, include the yeasts identified by the following accession numbers:
  • the AB9 strain is particularly preferable because it releases a large amount of mannan protein, particularly mannan protein including ⁇ -mannan, has good growth, and has no auxotrophy. Both ⁇ 9 and ⁇ 9 can be used as starting materials for producing yeast that releases mannan proteins, particularly mannan proteins containing ⁇ -mannan.
  • the obtained yeast is preferably used in a liquid medium, for example, a synthetic medium (Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, amino acid 0.13%) at about 30 ° C.
  • the culture supernatant is grown under aerobic conditions for 24 hours or longer, more preferably 24 hours to 96 hours, more preferably 24 hours to 72 hours, and the yeast cells are removed by centrifugation and Z or filter filtration.
  • Mannan protein can be recovered as a residue collected or filtered through an ultrafiltration membrane or an ethanol Z aqueous solution, for example, a 2: 1 precipitate (ethanol concentration 66.7% (v / v)).
  • the ultrafiltration is preferably performed with a molecular weight of about 10,000, preferably about 50,000 as a threshold value.
  • the culture medium and culture temperature should not inhibit the growth of the yeast, and are preferably suitable for the growth of the yeast.
  • Mannan protein recovered by ultrafiltration may be subjected to a drying step after dilution with an appropriate amount of water.
  • the ethanol precipitation collection is dissolved in water and then dried.
  • lyophilization or the like may be performed.
  • the dried mannan protein obtained by ethanol precipitation is a white, highly water-soluble powder that contains about 10% protein.
  • Mannan protein of ⁇ 900 mg / l, preferably 200 mg / l to 880 mg / l can be obtained.
  • At least 150 mg / l to 300 mg / l after 24 hours of culture at least 150 mg / l to 900 mg / l, preferably 200 mg / l after 72 hours of culture.
  • From 1 to 880 mg / l of mannan protein can be obtained.
  • the yeast of the present invention releases mannan protein into the medium as it grows, that is, as cell wall synthesis proceeds, so that the mannan in the culture supernatant is further examined by examining the culture conditions. It is also possible to increase the concentration and total amount of protein
  • the mannan protein obtained by such a method is not subjected to any chemical and Z or physical treatment, and is close to mannan protein naturally present in the cell wall. It can be used in the food industry such as beverages.
  • mannan protein released by the yeast of the present invention particularly the mannan protein strength protein containing a-mannan
  • an isolated mannan close to the natural state can be obtained.
  • it is possible to obtain more useful isolated mannan by removing the protein portion having various structures.
  • any method known to those skilled in the art may be used to remove the protein portion having the mannan protein strength, but it is particularly preferable to use the method without significantly modifying the structure of the mannan portion.
  • the removal of the protein portion from the mannan protein can be carried out, for example, by partial degradation with a glycosylation enzyme such as endoglycosidase, acid treatment, or alkali treatment.
  • Mutagenesis Wild-type yeast strain YNN27 was cultured in YPD medium, collected, suspended in 0.2 M phosphate buffer (pH 8.0) containing 4 ml of 2% glucose, and ethyl sulfonate (3%). Suspended in EMS). It was shaken at 30 ° C for 70 minutes for mutation treatment. After the mutation treatment, EMS was neutralized with 6% sodium thiosulfate solution, and the cells were applied to YPD medium. The 129 yeast strains that had grown were used as candidate strains.
  • sample A a culture solution-derived ethanol precipitation sample
  • Butoethanol was boiled in a 100 ° C hot water bath for 3 minutes and then used for the test.
  • Sample A mixed with sample buffer 10 ⁇ 1 was electrophoresed with TEFCO precast SDS-PAGE gel 4-12% gradient gel (Cat. No. 01 032) at 18 mA per gel for about 2 hours. .
  • the acrylamide gel was removed from the assembly, and fixed by shaking in 50% methanol for 1 hour. The methanol water was discarded, the water was renewed and shaken for 20 minutes. After repeating this operation again, the solution was replaced with an acid solution and shaken for 1 hour. After washing again with water twice for 20 minutes each time, the solution was replaced with a coloring solution and shaken for 1 hour to develop color. The result was judged visually.
  • Mannan in mannan protein was quantified by DIONEX ion chromatography as follows.
  • the culture solution-derived ethanol precipitation sample (sample A) described in 2) was prepared.
  • the culture supernatant (sample B) obtained by filtering the culture was also analyzed.
  • the mixture was cooled to room temperature, transferred to a 15 ml disposable centrifuge tube, and dried with a centrifugal evaporator. After drying, dissolve in 5 ml of water and pass through a Waters Sep-pak plus C18 (WAT0 20515: equilibrated with 5 ml of methanol and 5 ml of water) and a 0.45 mm sample filter. did.
  • Glucose and mannose monosaccharide standard solutions of 20, 40, and 60 ppm were used as standards for quantification V, and when they did not enter the calibration curve, analysis was performed by appropriately diluting.
  • the instrument used was an ion chromatography instrument GP-50 manufactured by Dionetas, and the amperometry detector ED-40 was used as the detector.
  • the mobile phase is MilliQ water for solution A, 200 mM sodium hydroxide solution for solution D, and A: D is set to 95: 5 for starting analysis up to 30 minutes, from 30 to 45 minutes 0: 100, 45 component force 70 The minutes were set at 95: 5.
  • a quantitative value was obtained from a calibration curve using a standard solution, and the content in each sample was calculated.
  • the concentration of mannose in the medium was 13.4 mg / l, which was about 4 times the concentration in the culture supernatant of the wild strain.
  • YNN27 or AH22 was multiplied, and MT39-6A and MT41-10D were finally obtained.
  • These strains were haploid and had strong auxotrophy and good mannan protein release. By multiplying them, a diploid strain AB9 without auxotrophy was produced.
  • the AB9 strain is a particularly suitable strain for industrial use, which has good growth without auxotrophy and can stably release mannan protein.
  • MTY9 and AB9 which is a homodiploid strain
  • MTY9 and AB9 are patent biological deposit centers of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1-1, Tsukuba Rinto, 1-1-1, Chuo No. 6, Ibaraki Prefecture, Japan). Postal code 305-8566), the deposit numbers are as follows:
  • AB9 was originally deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on July 13, 2004, and was assigned the deposit number FERM P-20116. Transferred to international deposit and assigned accession number FERM BP-10390. MTY9 was originally deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on July 13, 2004, and was assigned the deposit number FERM P-20117, and was deposited internationally on August 3, 2005. And was given the accession number FERM BP-10391.
  • Plasmids containing yeast chromosome fragments that lost mannan-releasing properties in a plasmid-dependent manner were recovered using the Q-BIO gene RPM Yeast Plasmid Isolation Kit (2069-400), and the DNA sequence of the region containing the inserted fragment was determined. Were determined. The nucleotide sequence was analyzed using Prism3100Avant (Applied Biosystems) and Big Dye Terminator Kit ver.3.0 (4390242).
  • ORF protein coding region
  • GPI10 is involved in the biosynthesis of the GPI anchor, and in the MTY9 strain and its derivatives, the mannan protein cannot remain in the cell wall because the GPI anchor is not sufficiently biosynthesized, and is released into the medium. It was thought to be a spider.
  • Mannan protein-releasing strain MT37-2B (strain produced by backcrossing MTY9) and wild type strain GPI10 gene was recovered and mutation sites were identified.
  • Rl primer set including 1000 bases upstream and 300 bases downstream of GPI10 ORF
  • F2 AATAGATTAATTTGCCCC (SEQ ID NO: 4)
  • F6 CATTTACTTGGAGACCCA (SEQ ID NO: 8)
  • R1 TTGTTCTGCTCTACGAACTTTTCA (SEQ ID NO: 10)
  • R2 GGCTGTATGTTTTACCTG (SEQ ID NO: 11)
  • R3 ACAGATTCAACAAGATAG (SEQ ID NO: 12)
  • R4 TCAAAAGAGTTGATGAAC (SEQ ID NO: 13)
  • R5 CAATGTGCCGGCTCCAAT (SEQ ID NO: 14)
  • R6 AGATAAGCTCAAAGAAGA (SEQ ID NO: 15)
  • R7 TACTTGCCGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 16)
  • ⁇ 27 of the parent strain is 100% -mutated with the nucleotide sequence of the GPI10 gene in the database (the sequence of nucleotide numbers 234 to 2081 of SEQ ID NO: 17 (this region encodes GpilOp)), and the mutated yeast strain Nucleotide sequences that differ only in the two were powerful.
  • One site was a single base substitution in the ORF upstream 78 base, and the other site was a mutation in the ORF. Therefore, in order to confirm which of these mutations is involved in mannan protein release, the recovered gene was Subcloning and plasmid shuffling were performed. The gene was collected using TOYOBO's KOD + and reacted according to the attached protocol.
  • GpilOp is considered to be a membrane protein that transmembranes multiple times in amino acid sequence.
  • the mutation of MT Y9 strain was found to be a mutation that replaces proline in the C-terminal domain with leucine (Fig. 3).
  • the amino acid sequence of wild type GpilOp is shown in SEQ ID NO: 18.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18 is a sequence encoded by nucleotide numbers 234 to 2081 described in SEQ ID NO: 17.
  • Mannan-releasing yeast strain MTY9 in 1 L synthetic medium (Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, amino acid 0.13%) in an Erlenmeyer flask at 30 ° C for 10 days Rotating culture and sampling over time were conducted, and the release of mannan protein was examined by the SDS S-PAGE method shown in Example 1. Around 40 hours after the start of culture, cell growth entered the stationary phase from the logarithmic growth phase, but it was revealed that the amount of mannan protein increased with cell growth. When quantified using the method described in Example 1, it was shown that about 150 mg of mannan protein was recovered per liter of culture supernatant in terms of mannose after completion of the culture.
  • Mannan protein-releasing strain AB9 was cultivated in 2 L synthetic medium (Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, Amino acid 0.13%) in jar culture (30 ° C, pH 5.5, aeration 1 wm, agitation 200 rpm, 72 hours) and culture fluid power Mannan protein was quantified in the same manner as in Example 3. This indicated that about 230 mg of mannan protein was recovered per liter of culture supernatant in terms of mannose.
  • 2 L synthetic medium Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, Amino acid 0.13%
  • Mannan protein-releasing strain AB9 was jar-cultured in 2 L of synthetic medium (Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.51%, Glucose 6%, amino acid 0.4%) (30 C., pH 5.5, aeration rate 1 wm, agitation 200 rpm, 72 hours) and culture fluid force Mannan protein was quantified in the same manner as in Example 3. This indicated that about 880 mg of mannan protein was recovered per liter of culture supernatant in terms of mannose.
  • synthetic medium Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.51%, Glucose 6%, amino acid 0.4%) (30 C., pH 5.5, aeration rate 1 wm, agitation 200 rpm, 72 hours
  • culture fluid force Mannan protein was quantified in the same manner as in Example 3. This indicated that about 880 mg of mannan protein was recovered per
  • the recovered mannan protein was treated with Endoglycosidase H (EndoH), electrophoresed, and then subjected to PAS staining.
  • EndoH Endoglycosidase H
  • An ethanol precipitation sample was prepared from the culture medium of MTY9 by the method described in Example 1.
  • the ethanol-precipitated sample was enzymatically treated using EndoH (P0702S) from New England Biolabs according to the recommended protocol. That is, 4 L of 10 ⁇ denaturing buffer (5% SDS, 10% j8-ME) was added to 36 L of solution A, and boiled at 100 ° C. for 10 minutes.
  • the sample was mixed with 5 ⁇ l of 10 ⁇ G5 buffer (0.5 M sodium citrate pH 5.5) and stirred, and then divided into 25 ⁇ L and 20 L. 25 L was kept at 37 ° C for 1 hour as a negative target.
  • Mannan-releasing yeast strain MT36-4D (MATa ura3, see Fig. 4) was cultured in 6L of synthetic medium (Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, ulucose 2%, nonacid 0.13%)
  • synthetic medium Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, ulucose 2%, nonacid 0.13%
  • a sample was prepared by drying the aqueous mannan protein solution recovered by ethanol precipitation with a freeze dryer (1.05 g).
  • Mannan-releasing strain MT36-4D in 6 L synthetic medium (Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, amino acid 0.13%) in an Erlenmeyer flask as described in Example 3
  • the culture supernatant obtained by culturing and culturing the yeast cells by filtration was used as a sample.
  • Mannan-releasing strain MT36-4D (Fig. 4) was prepared in a triangular flask using 6 L of synthetic medium (Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%, amino acid 0.13%). After culturing as described above, the culture strength was removed by filtration. 10% of the culture supernatant was filtered with 100% ethanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a final concentration of 33%, 50%, 60%, 6 6.7%, 80%, respectively. (Volume concentration) was adjusted to -30 ° C.
  • the present invention provides yeast that releases mannan protein, particularly mannan protein containing ⁇ -mannan, into a culture medium, a method for producing the same, and an isolated mannan protein that is close to the natural state produced by the method. . That is, according to the present invention, 1) yeast that releases mannan protein, particularly mannan protein containing ⁇ -mannan, into the medium, and 2) conventionally, mannan protein has been recovered by physical or chemical treatment, whereas There is provided an efficient method for producing mannan protein, which comprises recovering mannan protein from a medium in which the yeast is cultured.
  • a mannan protein particularly a mannan protein containing ⁇ -mannan can also be provided continuously according to the present invention.
  • the yeast of the present invention that releases mannan protein into the medium can also be used to breed useful yeast strains.
  • the yeast of the present invention can be used as a parent strain to produce a new yeast strain that has been further added or removed by backcrossing or mating with a mutant yeast strain or a wild yeast strain. You can also
  • an isolated mannan close to the natural state can be provided by removing the protein portion near the natural state obtained by culturing the yeast of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of plasmid YCp50-Chr.VII.
  • FIG. 2 shows the chromosomal region used for plasmid shuffling to determine the mutated region involved in mannan protein release, and the rescue results for mannan release.
  • FIG. 3 shows the hydrophobic region distribution of GpilOp.
  • FIG. 4 is a systematic diagram of various mannan protein-releasing yeast strains that also derive the MTY9 strain.
  • SEQ ID NOs: 1 to 16 PCR primers

Abstract

　本発明により、できる限り酵母が本来持つ状態に近いマンナンタンパク質、特にα-マンナンを含むマンナンタンパク質を多量に放出する酵母株、および、そのようなマンナンタンパク質、特にα-マンナンを含むマンナンタンパク質を効率よく製造する方法が提供される。具体的には、糖鎖合成系遺伝子に変異を持つことにより、α-マンナンを含むマンナンタンパク質を培地中に放出する酵母、および、そのようなマンナンタンパク質を効率よく製造する方法が提供される。

Description

明 細 書
マンナンタンパク質を放出する酵母株およびマンナンタンパク質の製造 法
技術分野
[0001] 本発明は、酵母細胞壁構成成分、特にマンナンタンパク質、とりわけ α -マンナンを 含むマンナンタンパク質を培地中に放出する酵母株、並びにこの株を用いたマンナ ンタンパク質、特に α -マンナンを含むマンナンタンパク質の製造法に関する。また、 本発明は、マンナン、特に α -マンナンの製造方法にも関する。
[0002] (背景技術）
酵母の利用はその高い安全性力 長い歴史があり、パンの製造、ビール等アルコ ール類の発酵のみならず、酵母自身もエキスとして、あるいは酵母細胞壁としてさま ざまな用途に用いられてきた。細胞壁は不溶性グルカンを主体としており、主に食物 繊維として利用されてきた。グルカンには免疫賦活等の機能があることも知られてお り、近年の健康食品ブームの中で、注目される食品素材のひとつとなっている。一方 、細胞壁中にはマンナンタンパク質を主体とする水溶性多糖類も存在する。マンナン タンパク質は細胞壁に局在するタンパク質に Ν-グリコシド結合あるいは 0-グリコシド 結合とよばれる結合様式でマンナン鎖が結合した物質の総称である。酵母細胞壁由 来の水溶性多糖類の機能性についても多くの研究がなされており、制癌作用（特公 昭 58— 57153号）、抗腫瘍作用（特開昭 58— 109423号、特公昭 64— 3479号）、抗感 染作用（特開昭 58— 109423号)、抗高血圧作用（特開昭 63— 101327号)、抗植物ウイ ルス作用（特公昭 59— 40126号)等が報告されている。また特にマンナン部分に着目 した研究でも、インターフェロン誘導活性 (Acta Virology, 1970;14:1- 7)、マクロファー ジ遊走阻止活性（Jpn. J. of Microbiol, 1975;19:355- 362)、 TNF a産生の増強（Micr obiol. Immunol, 2002;46(7):503_12)など多くの機能性が報告されている。
[0003] これらで報告されているマンナンの抽出方法は大別すると 3つに分類することが出 来る。（1)熱水（希アルカリを含む)抽出（特公昭 64— 3479号、特開昭 58— 109423号) (2)自己消化 (特公昭 58— 57153号）（3)細胞壁溶解酵素による消化 (特公昭 59— 40 126号）、である。これら方法により得た粗抽出液は、マンナン—銅複合体を形成させ 脱銅する、塩酸により除タンパク質する、アルコール沈殿、イオン交換クロマトグラフィ 一、ゲルろ過クロマトグラフィー、プロテアーゼ処理などを適宜組み合わせることにより 機能性画分を回収していた。これらの方法における精製ステップは煩雑であり、また 、培地 1Lあたりの回収量は lOOmg程度であった。
[0004] またマンナンの生合成に関する種々の酵母株を用いて、マンナン構造を改変する 技術が報告されている（特開平 2-419,特開平 6-277086,特開平 6-296482,特開平 9 -135689,特開平 9-266792)。マンナンの構造の違いによっても直鎖状マンナンの抗 腫瘍活性 (特開昭 54-97692)、リン含有マンナンの腹水型腫瘍に対する抗腫瘍活性 ( 特開昭 58-121216)などの機能が報告されている。
これらの知見を生かすためにも、効率的なマンナンタンパク質製造法の開発が望ま れていた。
マンナンを菌対外に分泌する酵母としては、 Rhodotorula mucilaginosa YR-2株が知 られている（日本栄養'食糧学会誌、 55卷、 33-39 (2002)、特開 2002-095492)。この 酵母の分泌するマンナンは β 1 ,3-、 β 1 ,4-結合の繰り返しよりなるいわゆる β -マン ナンであり、細胞壁成分であるマンナンタンパク質に含まれる α -マンナンとは異なる
[0005] (発明の開示）
本発明の目的は、できる限り酵母が本来持つ状態に近いマンナンタンパク質、特に ひ -マンナンを含むマンナンタンパク質を放出する酵母株、および、そのようなマンナ ンタンパク質、特に α -マンナンを含むマンナンタンパク質を効率よく製造する方法を 提供することである。
また本発明の別の目的は、本発明の酵母株および Ζまたは本発明の方法を用い て製造される、天然状態に近い、マンナンタンパク質、特に α -マンナンを含むマン ナンタンパク質を提供することである。ここで、 α -マンナンとは、 α 1 ,6-、 α - 1 ,2-また は a 1 ,3-結合からなる D-マンノースの重合体である。
本発明のまた別の目的は、マンナン、特に α -マンナンを効率的に製造する方法を 提供することである。 本発明の更なる目的は、本発明の方法を用いて製造される、天然状態に近いマン ナン、特に α -マンナンを提供することである。
本発明において、特に断らない限り、マンナンタンパク質およびマンナンは、それぞ れ酵母由来のマンナンタンパク質 (酵母マンナンタンパク質）および酵母由来のマン ナン (酵母マンナン)である。
[0006] 本発明は、酵母細胞壁成分、特にマンナンタンパク質、とりわけ α -マンナンを含む マンナンタンパク質を培地中に放出することを特徴とする酵母株である。より具体的 には、本発明は、糖鎖合成系遺伝子に変異を持つことにより、 ひ-マンナンを含むマ ンナンタンパク質を培地中に放出する酵母である。さらに具体的には、本発明は、そ の変異がマンナンタンパク質を細胞壁にとどまらせる機構にかかわるタンパク質をコ ードする遺伝子内にあることを特徴とする、マンナンタンパク質を培地中に放出する 酵母株である。
特に本発明は a 1,2-マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子内に変異を 有する、 α -マンナンを含むマンナンタンパク質を放出する酵母である。さらに具体的 には、本発明は α 1,2-マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子内に変異を 有する、 α -マンナンを含むマンナンタンパク質を放出する酵母株であって、前記ひ 1 ,2-マンノシルトランスフェラーゼが配列番号 17記載の配列のヌクレオチド番号 234〜2 081の配列（この領域によって GPI10タンパク質（GpilOp)がコードされる）を有する核 酸とストリンジェントな条件でハイブリダィズし得る核酸によってコードされる、前記酵 母株である。
特に本発明の酵母は、受託番号 FERM BP-10390または FERM BP-10391で特定さ れる酵母である。
[0007] また本発明は、細胞壁成分を培地中に放出することを特徴とする酵母、特にマンナ ンタンパク質、とりわけ α -マンナンを含むマンナンタンパク質を培地中に放出する酵 母を液体培地で培養し、培地中に放出されたマンナンタンパク質、とりわけ α -マン ナンを含むマンナンタンパク質を回収することを含む、マンナンタンパク質、とりわけ a -マンナンを含むマンナンタンパク質の製造方法である。
また、本発明は前記方法によって製造される、細胞壁に天然に存在するマンナンタ ンパク質に近 、状態にある（天然状態に近 、）単離マンナンタンパク質、特に α -マン ナンを含む単離マンナンタンパク質でもある。
更に、本発明は、本発明によって得られるおよび/または本発明のマンナンタンパ ク質、特に α -マンナンを含むマンナンタンパク質から、タンパク質部分を除去するこ とを含む、細胞壁に天然に存在するマンナンタンパク質に含まれる状態に近！ヽ（天然 状態に近い）マンナン、特に α -マンナンの製造方法、および、前記方法によって得 られるマンナン、特に α -マンナンである。
[0008] (発明を実施するための最良の形態）
本発明において、細胞壁構成成分、特にマンナンタンパク質を培地中に放出する 酵母が作製および使用される。このような酵母は、酵母を変異誘発処理し、マンナン タンパク質を細胞壁にとどまらせることが出来なくなった酵母株を選抜することによつ て得ることができる。変異処理する酵母は特に限定されないが、サッカロミセス'セレ ピン/ 'ェ (Saccharomyces cerevisiae)ンゾケッカロ セス，ホンへ (bchizosaccharomyce s pombe)、サッカロミセス'ノヽラドキサス (Saccharomyces paradoxus)^サッカロミセス'ミ カグェ (saccharomyces mikatae八ケッカロ セス ·ノヽャヌス (saccharomyces bayanus)、 サッカロミセス ·クドリアヴゼヴイイ (Saccharomyces kudriavzevii)、タノレイべ口ミセス ·ラタ チス（Kluyveromyces lactis)、カンジダ'ゥチリス（Candida utilis)、カンジダ'ァリビカン ス (Candida albicans)力好まし \、 Saccharomyces cerevisiae より好ましい。変異 発 処理は一般的な方法、たとえば EMS等の変異原処理、 UV照射、放射線照射によつ て行うことができる。これらの方法による酵母の変異誘発手順は当業者にはよく知ら れたものである（石川ら、微生物遺伝学実験法、共立出版; Kaiser. C.ら、 1994 Metho ds in east enetics,し old bpnng Harbor Laboratoryノ。
[0009] 例えば、 EMSによって変異誘発を行う場合、マンナンタンパク質をほとんど放出しな い酵母株、例えば野生型酵母株を YPD培地にて培養し、集菌した後 4mlの 2%ダルコ ースを含む適切なバッファー、例えば 0.2Mリン酸バッファー（pH8.0)に懸濁し、最終 濃度 1%〜5%,好ましくは約 3%程度でェチルメタンスルホネート（EMS)を添加する 。この懸濁液を更に 30°Cにて 30分間〜 90分間振とうし、変異処理する。 EMSの濃度 および処理時間は生存率が 15%〜60%、好ましくは 20〜30%程度になるように適宜 変動させることができる。変異処理後 6%チォ硫酸ナトリウム溶液にて EMSを中和し、菌 体を適切な培地、例えば YPD培地に塗布する。
[0010] 本発明の酵母は、マンナンタンパク質を細胞壁にとどまらせるのに必要な部位の合 成酵素、たとえばグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI)アンカーの生合成にか かわる a 1,2-マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば GPI10に変異 を有し、マンナンタンパク質を細胞壁にとどまらせることが出来なくなった株であること が好ましい。 GPI10によってコードされる GPIタンパク質（GpilOp)は 616アミノ酸からな り、複数の膜貫通領域を持つ膜タンパク質である。この遺伝子の欠損は一般に致死 性であり、生存に必須の役割を担っていると考えられる。本発明の一態様において、 本発明の酵母は GPI10に変異を有する力 生存に必須な機能を残しつつ、マンナン タンパク質を細胞壁中にとどまらせることができない酵母である。したがって、本発明 の酵母は、 ひ 1,2-マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば、 GPI10を 標的とした部位特異的、またはランダム変異導入法によっても得ることが出来る。その ような分子生物学的手法も当業者にはよく知られている。本発明の特に好ましい一態 様において、本発明の酵母は、 GPI10遺伝子内に、配列番号 18記載のアミノ酸配列 中の 498番のプロリン残基がロイシン残基へ置換されるような変異を有する酵母であ る。
[0011] また、本発明の別の一態様において、本発明の酵母は配列番号 17記載の配列の ヌクレオチド番号 234〜2081の配列（この領域によって GpilOpがコードされる）を有す る核酸とストリンジェントな条件でハイブリダィズし得る核酸によってコードされる a 1,2 -マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質内およびそのタンパク質をコー ドする遺伝子内に変異を有する酵母である。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわ ゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが実質的に形成されな い条件を言う。例えば、ストリンジ工ントな条件とは高い相同性を有する DNA、例えば 7 0%以上、好ましくは 80%以上の相同性を有する DNA同士が優先的にハイブリダィズ し、それより相同性が低い DNA同士が有意にはノ、イブリダィズしない条件、あるいは 5 0°C、 2xSSC、 0.1% SDS、好ましくは lxSSC、 0.1% SDS、より好ましくは 0.1xSSC、 0.1 % SDSに相当する温度および塩濃度でハイブリダィズする条件である。これらと同等 な条件も当業者には容易に理解できるであろう（例えば、 Sambrookら、 1989, Molecu larし loning: A Laboratory Manual,弟 2版 (1989) Cold bpnng Harbor Laboratory Pre ss, Cold Spring Harbor, New York、 Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biolo gy, John Wiley & Sons, Inc. (1994)参照。 )。
また、アミノ酸配列については、配列番号 18記載のアミノ酸配列と 40%以上の相同 性を示す配列を有するポリペプチドも本発明においては a 1,2-マンノシルトランスフ エラーゼ候補として考慮することができ、このポリペプチドをコードする遺伝子を α 1,2 -マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子として考えることができる。核酸また はアミノ酸の相同性は、 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankOver view.html)や DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html)にて利用可能な BL ASTNまたは BLASTP、 FASTA等を利用することによって計算することが出来る。
[0012] 例 ば ¾accharomyces cerevisiaeのみなら *f、 Saccharomyces paraaoxus、 Saccharo myces mikatae、 Saccharomyces bayanus、 Saccharomyces kudriavzevii、 Kluyveromyc es lactis、にも上述したプログラムを用いて高いホモロジ一を有する遺伝子が見出さ れている。さらに Neurospora crassa:ncu00193.1, Schizosaccharomyces pombe— 972h:S PCC16A11.06c、 Candida albicans:ca4431が GpilOpに相同性を有するタンパク質とし て挙げられている。また Saccharomyces cerevisiaeにおいても GpilOpと相同性を有す るタンパク質として例えば SMP3、 ALG9が見出されて!/、る。
例えば、 Saccharomyces paradoxus gb:AABY01000142.1では 88%、 Saccharomyces mikatae gb:AABZ01000054.1では 86%、 Saccharomyces bayanus gb:AACG0100048 5.1では 85%、 Saccharomyces kudriavzevii gb:AACI01000185.1では 84%、 Kluyvero myces lactis gi:49643748では 68%、 Neurospora crassa ref-NW— 04710.1では 50%、 S chizosaccharomyces pombe ref-NC—003421.1" 41%、 Candida albicans gb:AACQ 01000012.1では 49%のホモロジ一を配列番号 18記載のアミノ酸配列に対して有して いる。また SMP3、 ALG9の配列番号 18記載のアミノ酸配列に対するホモロジ一はそ れぞれ 40%、 43%である。
[0013] 本配列番号 17記載の配列のヌクレオチド番号 234〜2081の配列（この領域によって GpilOpがコードされる）を有する核酸とストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズする核 酸によってコードされるタンパク質、および、配列番号 18記載の配列と 40%以上の配 列相同性を示すタンパク質が (X 1,2-マンノシルトランスフェラーゼ活性を有しているこ とは、一般に入手可能な α 1,2-マンノシルトランスフェラーゼ欠損酵母株 (例えば、 Eu roscarf Y24509)にその核酸を適切なプロモーターおよびその他の発現に必要な配 列と共に導入して、欠損株の a 1,2-マンノシルトランスフェラーゼが相補されること (特 に致死性の相補）により確認することが出来る。
なお、本明細書においては、 a 1,2-マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタン パク質を総称して a 1,2-マンノシルトランスフェラーゼともいう。
[0014] また、本発明の別の好ましい一態様において、本発明の酵母は、配列番号 17記載 の配列のヌクレオチド番号 234〜2081の配列（この領域によって GpilOpがコードされ る）を有する核酸とストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズし得る核酸のヌクレオチド配 列を有する α 1,2-マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子内に、配列番号 18記載の配列 の 498番プロリン残基に相当するプロリン残基がロイシン残基に置換される変異を有 する酵母である。配列番号 18記載の配列の 498番プロリン残基に相当するプロリン残 基は、アミノ酸配列のアラインメントを行うことによって明らかにすることができる。
[0015] このような候補酵母株のマンナン放出性に関しては、候補株を適切な培地、例えば 、合成； ¾·地 (Difco干土 Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid and Ammonium sulfate 0. 17%, Glucose 2%,アミノ酸 0.13%)で約 30°Cにて例えば 2〜4日培養し、上清を必要に 応じて約 2〜3倍量のエタノールを加えて沈殿させ（エタノール沈殿法）、 SDS-PAGE (SDS-ポリアクリルアミド電気泳動）にかけ、 PAS染色等により分析することが出来る。 培地および培養温度は酵母の増殖を阻害しな!、、好ましくは酵母の増殖に適して!/ヽ ればよい。次に、親株である野生型株よりも多くマンナンタンパク質を培地中に放出 していることが確認できた株を本発明の酵母として選択し、利用することが出来る。
[0016] また、本発明の酵母を戻し交配する、または変異酵母株又は野生型酵母株と接合 させること等により、更に他の性質を付加、除去することが出来る。例えば、本発明の 酵母株の一つを接合の親に用いることにより、マンナンタンパク質の放出量、生育速 度および栄養要求性が改善された、あるいは、更に他の特性が付与または改善され た、または二倍体の、マンナンタンパク質放出酵母を作製することができる。酵母の 掛け合わせの方法および条件は当業者にはよく知られたものである (Ausubelら、 Cu rrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994))。
[0017] 実際に本発明者らは MTY9を出発材料として、マンナンタンパク質、特に a -マンナ ンタンパク質を放出する種々の派生株を作製して ヽる（図 4)。
本発明の、および、本発明で使用し得る、マンナンタンパク質、特にひ-マンナンを 含むマンナンタンパク質を放出する酵母の典型的な例として、以下の受託番号で特 定される酵母が挙げられる：
b.cerevisiae MTY9
[MATa gpilO ura3 trpl]
受託番号 FERM BP-10391、および、
S.cerevisiae AB9 (ホモ二倍体株）
[MATa/a gpilO/gpilO ura3/URA3 Ieu2/LEU2]
受託番号 FERM BP-10390
AB9株はマンナンタンパク質、特に α -マンナンを含むマンナンタンパク質の放出量 も多く、生育も良好であり、栄養要求性もないので、特に好ましい。 ΜΤΥ9、 ΑΒ9はい ずれもマンナンタンパク質、特に α -マンナンを含むマンナンタンパク質を放出する 酵母を作製するための出発材料として使用することが出来る。
[0018] 得られた酵母を液体培地、例えば合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/o Ami no acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%,アミノ酸 0.13%)で約 30°Cにて、好 ましくは 24時間以上、より好ましくは 24時間〜 96時間、更に好ましくは 24時間〜 72時 間、好気条件にて生育させ、遠心分離および Z又はフィルターろ過により酵母細胞 を取り除いた培養上清を回収し、限外ろ過膜でろ過した残液又はエタノール Z水溶 液、例えば 2:1 (エタノール濃度 66.7%(v/v))の沈殿物としてマンナンタンパク質を回収 することができる。限外ろ過は、分子量約 1万、好ましくは約 5万を閾値として行うのが 好ましい。培地および培養温度は酵母の増殖を阻害しなければよぐ好ましくは酵母 の増殖に適して 、ればよ 、。
[0019] 限外ろ過により回収したマンナンタンパク質は、適当量の水をカ卩ぇ希釈した後に乾 燥工程を行っても良い。エタノール沈殿回収物について水で溶解した後、乾燥工程 、たとえば凍結乾燥等を行っても良い。エタノール沈殿法で得られた乾燥マンナンタ ンパク質は白色の水溶性が高い粉末であり、約 10%程度のタンパク質を含む。本発 明の酵母、および本発明の方法に依れば、培養条件に依存して典型的な合成培地 を使用した場合 24時間〜 72時間の培養で培地中にマンノース換算で少なくとも 150m g/l〜900mg/l、好ましくは 200mg/l〜880mg/lのマンナンタンパク質を得ることができる 。より具体的には培養条件に依存して、マンノース換算で、 24時間の培養により少な くとも 150mg/l〜300mg/l、 72時間の培養により少なくとも 150mg/l〜900mg/l、好ましく は 200mg/l〜880mg/lのマンナンタンパク質を得ることができる。
本発明の酵母は、その性質上増殖に伴って、すなわち、細胞壁合成が進むに従つ て、培地中にマンナンタンパク質を放出するため、培養条件を検討することにより更 に培養上清中のマンナンタンパク質の濃度および総量を増加させることも可能である
[0020] このような方法により得られたマンナンタンパク質は化学的および Z又は物理的処 理が一切加えられて ヽな 、、細胞壁に天然に存在するマンナンタンパク質に近 ヽ状 態にあり、食品や飲料といった食品産業への利用が可能である。
更に、本発明により、または、本発明の酵母が放出するマンナンタンパク質、特に a -マンナンを含むマンナンタンパク質力 タンパク質部分を除去することにより、天 然状態に近い単離マンナンを得ることが出来る。あるいは、種々の構造を有するマン ナンタンパク質力 タンパク質部分を除去することにより、更に有用な単離マンナンを 得ることちでさる。
マンナンタンパク質力ものタンパク質部分の除去は当業者に知られたどのような方 法でも良いが、マンナン部分の構造を著しく改変しな 、方法を用 、るのが特に好まし い。マンナンタンパク質からのタンパク質部分の除去は、例えば糖鎖切り出し酵素、 例えばエンドグリコシダーゼによる部分分解、酸処理、またはアルカリ処理によって行 うことが出来る。
[0021] (実施例）
実施例 1.マンナンタンパク皙を放出する酵母の作製
1)変異誘発 野生型酵母株 YNN27を YPD培地にて培養し、集菌した後 4mlの 2%グルコースを含 む 0.2Mリン酸バッファー（pH8.0)に懸濁し、 3%となるようにェチルメタンスルホネート（ EMS)に懸濁した。 30°Cで 70分間振とうし、変異処理した。変異処理後 6%チォ硫酸ナ トリウム溶液にて EMSを中和し、菌体を YPD培地に塗布した。生育してきた酵母 129株 を候補株とした。
[0022] 2)スクリーニング
候補酵母株を単離後、それぞれを 10 mlの合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid 0.67%, Glucose 2%,アミノ酸 0.13%)中で、 3晚 30°Cで振とう培養した。 培養液は 6000rpm 5分間遠心分離した後、培養上清を 0.45 μ mのディスクフィルタ 一によるろ過で完全に酵母を除去した。ろ過済みの培養上清に 20mlのエタノールを 加え、 -30°Cでー晚放置した。翌日 7000rpm 15分間遠心分離を行い、上澄み液を捨 てた。沈殿は一度 66.7%エタノールにて洗浄した後、 100 1の水に懸濁した。これを 培養液由来エタノール沈殿試料 (以下、「試料 A」と記載する。）とした。
得られた各試料を、それぞれ等量の 2x SDS-PAGEサンプルバッファー（15%グリセ ロール， 0.125 mM Tris/Cl pH6.8, 5 mM Na EDTA, 2% SDS, 0.1% BPB, 1% 2—メルカ
2
ブトエタノール）と混合し、 100°C湯浴中にて 3分間煮沸した後試験に使用した。
[0023] 得られたサンプルは、 SIGMA社 Glycoprotein Detection Kit(Cat# GLYCO- PRO)添 付のプロトコールに従って分析した。
サンプルバッファーと混合済みの試料 A 10 μ 1を TEFCO社プレキャスト SDS- PAGE ゲル 4-12%グラジェントゲル (Cat.No.01 032)によりゲル 1枚あたり 18 mAで約 2時間 電気泳動を行った。電気泳動終了後、アクリルアミドゲルをアッセンプリからはずし、 5 0%メタノール中で 1時間振とうし固定を行った。メタノール水を捨て、新たに水をカロえ、 20分間振とうした。この操作を再度繰り返した後、酸ィ匕液に置換し、 1時間振とうした。 再び水で 2回各 20分間振とうし洗浄した後、発色液に置換し、 1時間振盪し、発色を 行った。結果は目視により判定した。
[0024] その結果、試験した 129種の酵母株のうち、明らかにマンナンタンパク質を放出する 株が 3株得られた。また、野生型株でも僅かにマンナンタンパク質が培地中に放出さ れることが観察された。得られたマンナンタンパク質放出酵母株のうちの 1株、 MTY9 株を用いて更に種々の派生株を作製した。
[0025] 3)マンナンの定量
マンナンタンパク質中のマンナンの定量は以下のように DIONEXイオンクロマトグラ フィ一によつて行った。
2)に記載した培養液由来エタノール沈殿試料 (試料 A)を調製した。また、培養物を ろ過して得られた培養上清 (試料 B)につ 、ても分析を行った。
試料 A 50-60 μ 1に対し、 2mlの 2Νトリフルォロ酢酸（RiedeHie- Haen 61030)を加え 、凍結、減圧させた後、加水分解管で 100°C 16時間分解を行った。試料 B 2mlに対し 12N TFAを 400 /z 1加え、凍結、減圧させた後、加水分解管で 100°C 16時間分解を行 つた o
分解終了後室温まで冷却し、 15mlデイスポーザブル遠心管に移し、遠心エバポレ 一ターで乾燥させた。乾燥後 5mlの水に溶解し、 Waters社 Sep- pakプラス C18 (WAT0 20515: 5 mlのメタノール及び 5mlの水で平衡化したもの）及び 0.45mmのサンプルフィ ルターを通し、イオンクロマトグラフィー用試料とした。
[0026] グルコース及びマンノース各 20, 40, 60ppmの単糖標準液を定量用の標準として用 V、、この検量線に入らな力つた場合は適宜希釈して分析を行った。
装置はダイオネタス社のイオンクロマトグラフィー装置 GP-50を用い、検出器にはァ ンぺロメトリー検出器 ED- 40を使用した。移動相は A液を MilliQ水、 D液を 200 mM水 酸ィ匕ナトリウム溶液とし、 A : Dを分析開始力も 30分まで 95:5とし、 30分から 45分まで 0: 100、 45分力 70分までを 95:5とした。標準液を用いた検量線より定量値を求め、各試 料中の含量を算出した。
[0027] グルコース及びマンノースのピークはそれぞれ 18分、 20分に出現し、この濃度範囲 での直線性は相関係数 0.999程度と概ね良好であった。
マンナンタンパク質放出酵母株 MTY9由来の試料 Aを分析したところ、主な構成単 糖はマンノースであり、マンノース対グルコースは 90: 10程度であった。同様にこの株 の試料 Bを分析したところ、マンノース対グルコースは 35:65程度であった。
培地中のマンノース濃度は 13.4mg/lであり、これは野生株の培養上清中の濃度の 約 4倍であった。 [0028] 4)種々の派生株の作製
変異原処理により直接得られた MTY9と野生型株 AH22と掛け合わせることで、マン ナンタンパク質放出性の改善、および、マンナンタンパク質放出に関係する変異以 外の変異を外すことを試みた。定法に従!ヽ掛け合わせた 2倍体株を減数分裂させ、 顕微鏡下でミクロマニピュレータ一により子嚢胞子を分離し、それぞれの子嚢胞子に 由来する酵母株のマンナンタンパク質放出性を調べた。
こうして得られた MT26-14Cを元に、 YNN27あるいは AH22を掛け合わせ、最終的に MT39-6A及び MT41-10Dを得た。これらの株は 1倍体であり、栄養要求性を持ってい た力 生育、マンナンタンパク質放出は良好であった。さら〖ここれらを掛け合わせるこ とで、栄養要求性のない 2倍体株 AB9株を作製した。 AB9株は栄養要求性がなぐ生 育も良好でマンナンタンパク質を安定的に放出することの出来る工業用に特に適し た株である。
これらの酵母株の由来を図 4に模式的に示した。これらの酵母株のうち、 MTY9およ びホモ二倍体株である AB9は、独立行政法人産業技術研究所 特許生物寄託セン ター（日本国茨城県つくば巿東 1-1-1 中央第 6、郵便番号 305-8566)に寄託されて おり、それぞれ受託番号は次のとおりである：
[0029] S . cerev i s i ae MTY9 ( gpi lO)
[MAT a gpi lO ura3 t rpl ]
受託番号 FERM BP- 10391 , および、
S . cerev i s i ae AB9
[MATa/ a gpi lO/gp i l O ura3/URA3 I eu2/LEU2]
受託番号 FERM BP- 10390
[0030] AB9は 2004年 7月 13日付けで独立行政法人産業技術研究所 特許生物寄託セン ターに原寄託され、受託番号 FERM P-20116が付与されており、 2005年 8月 3日付け で国際寄託に移管され、受託番号 FERM BP-10390が付与された。 MTY9は、 2004年 7月 13日付けで独立行政法人産業技術研究所 特許生物寄託センターに原寄託さ れ、受託番号 FERM P-20117が付与されており、 2005年 8月 3日付けで国際寄託に 移管され、受託番号 FERM BP-10391が付与された。
[0031] m2. 虽遣伝早: よび 虽き β位の特定
1)変異遺伝子の特定 マンナン放出酵母 MTY9に YCp50由来酵母染色体ライブラリー ATCC37415を導入 し、マンナン放出性を失った株をスクリーニングした。酵母染色体ライブラリーの酵母 細胞への導入は定法（Ausubelら、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wil ey & Sons, Inc. (1994))に従って行った。
酵母染色体断片を含むプラスミド依存的にマンナン放出性を失った株から、 Q-BIO gene社 RPM Yeast Plasmid Isolation Kit(2069- 400)を用いてプラスミドを回収し、挿入 断片を含む領域の DNA配列を決定した。ヌクレオチド配列の解析は Applied Biosyste ms社の Prism3100Avantを用い、同社の Big Dye Terminator Kit ver.3.0 (4390242)を 用いて行った。
用いたプライマーの酉己列は CCCAGTCCTGCTCGCTTCGCT (フォワードプライマ 一）（配列番号 1)および、 GTCGGCGATATAGGCGCCAGC (リバースプライマー） ( 配列番号 2)である。ヌクレオチド配列につ!/、てサッカロミセス ·ゲノムデータベース（S accharomyces Genome Database) (http:/ / genome-www.stanford.edu/ ¾accharomyce s/)の Blastnプログラムを用いて相同性検索を行った結果、 7番染色体の DNA断片で あることが明らかになった。図 1にプラスミド依存的にマンナン放出性を失った株から 回収されたプラスミド YCp50-Chr.VIIの構造を示した。
[0032] この断片に含まれるタンパク質コード領域（ORF)は YGL141と YGL142の二つのみ であった。制限酵素を用いてこの領域の断片を作製し、どちらの ORFが変異を相補 するカゝ確認したところ、相補性を示す ORFは YGL142すなわち GPI10遺伝子であるこ とが明らかになった（図 2)。
GPI10は GPIアンカーの生合成に関与しており、 MTY9株およびその派生株におい てマンナンタンパク質は GPIアンカーが十分に生合成されないために細胞壁にとどま ることができず、培地中に放出されて 、くものと考えられた。
[0033] 2)変異部位の特定
マンナンタンパク質放出株 MT37-2B(MTY9を戻し交配して作製した株)と野生型株 力 それぞれ GPI10遺伝子を回収し、変異個所の特定を行った。
遺伝子の回収は Applied Biosystems社の AmpliTaq Goldを用いた PCRで行った。第 一回目の PCR反応では変異誘発した酵母株、野生型株の染色体 DNAを铸型とし、 F ο
寸
1及び Rlのプライマーセットで GPI10 ORFの上流 1000ベース及び下流 300ベースを含
[1
む断片（3141bp)を増幅し、 500 bp間隔で設定した F1,F2,F3,F4,F5,F6,F7,R1,R2,R3, R4,R5,R6,R7を用いて全長のヌクレオチド配列を決定した。
各プライマーの配列は下記のとおり：
GGAGCAATATGATTGTTGAAGTTTGG (配列番号 3)
F2: AATAGATTAATTTGCCCC (配列番号 4)
F3: ATGGCTCACGAGGTTCAT (配列番号 5)
F4: ACTTGATAAGAGAAACGA (配列番号 6)
F5: TTTCTTTCAAAGCTTACC (配列番号 7)
F6: CATTTACTTGGAGACCCA (配列番号 8)
F7: TCTGTACTAGGCTGAGTA (配列番号 9)
R1: TTGTTCTGCTCTACGAACTTTTCA (配列番号 10)
R2: GGCTGTATGTTTTACCTG (配列番号 11)
R3: ACAGATTCAACAAGATAG (配列番号 12)
R4: TCAAAAGAGTTGATGAAC (配列番号 13)
R5: CAATGTGCCGGCTCCAAT (配列番号 14)
R6: AGATAAGCTCAAAGAAGA (配列番号 15)
R7: TACTTGCCGAAAGAAACC (配列番号 16)
[0035] 親株の ΥΝΝ27はデータベース上の GPI10遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号 17 のヌクレオチド番号 234〜2081の配列（この領域によって GpilOpがコードされる））と 10 0%—致し、変異誘発した酵母株でのみ違うヌクレオチド配列は 2箇所見つ力つた。一 箇所は ORF上流 78ベースにある 1塩基置換で、もう一箇所は ORF中の変異であった そこで、これらのうちどちらの変異がマンナンタンパク質放出に関与するのかを確認 するため、回収した遺伝子をサブクローニングし、プラスミドシャフリングを行った。遺 伝子の回収は TOYOBOの KOD+を用い、添付のプロトコールどおり反応を行った。ヌ クレオチド配列を確認し、他の変異が入っていないことを確認し、サブクローユングに よりシャフリング用のプラスミドを作製した。 [0036] これらプラスミドを定法に従 、本発明の酵母株 (MT37-2B)に再導入し、 PAS染色で マンナンタンパク質放出性を検討した。結果 ORF上流にのみ変異を持つプラスミドで はマンナンタンパク質放出性が野生型株並に抑えられたのに対し、 ORF中の変異を 持つプラスミドではマンナンタンパク質が放出されており、この ORF中の変異がマン ナン放出に関与していることが明ら力となった。
GpilOpはアミノ酸配列力も複数回膜貫通する膜タンパク質と考えられているが、 MT Y9株の変異は C末端ドメインに存在するプロリンがロイシンに置換する変異であること が明らかになった（図 3)。なお、野生型 GpilOpのアミノ酸配列を配列番号 18に示した 。配列番号 18記載のアミノ酸配列は配列番号 17記載のヌクレオチド番号 234〜2081 によってコードされる配列である。
[0037] 実施例 3.本発明の酵母株力ゝらのマンナンタンパク皙の回収 I
マンナン放出酵母株 MTY9を 1 Lの合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/o A mino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%,アミノ酸 0.13%)中で 30°Cにて 10 日間三角フラスコにて回転培養し、経時的にサンプリングを行い実施例 1に示した SD S-PAGE法でマンナンタンパク質の放出を調べた。培養開始後 40時間ごろ細胞の増 殖が対数増殖期から定常期に入ったが、マンナンタンパク質量は細胞の増殖に伴!ヽ 増加することが明らかになった。実施例 1に記載した方法を用いて定量したところ、培 養終了後にマンノース換算で培養上清 1Lあたり約 150 mg程度のマンナンタンパク質 が回収されることが示された。
[0038] 実施例 4.本発明の酵母株からのマンナンタンパク質の回収 II
マンナンタンパク質放出株 AB9を 2Lの合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%,アミノ酸 0.13%)でジャー培養（ 30°C, pH5.5,通気量 1 wm,攪拌 200rpm、 72時間）し、培養液力 実施例 3と同様に してマンナンタンパク質を定量した。これにより培養上清 1Lあたりマンノース換算で約 230 mgのマンナンタンパク質が回収されることが示された。
[0039] 実施例 5.本発明の酵母株からのマンナンタンパク質の回収 III
マンナンタンパク質放出株 AB9を 2Lの合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid and Ammonium sulfate 0.51%,Glucose 6%,アミノ酸 0.4%)でジャー培養（30 °C, pH5.5,通気量 1 wm,攪拌 200rpm、 72時間）し、培養液力 実施例 3と同様にし てマンナンタンパク質を定量した。これにより培養上清 1Lあたりマンノース換算で約 8 80mgのマンナンタンパク質が回収されることが示された。
[0040] 実施例 6.放出されたマンナンタンパク質の分析
1)マンナンタンパク質からのマンナンの切り出し
回収したマンナンタンパク質力もの糖鎖切出し酵素によるマンナンの切り出しの可 能性を調べるため、回収したマンナンタンパク質を Endoglycosidase H (EndoH)で処 理し、電気泳動後、 PAS染色を行った。
実施例 1に記載した方法によって MTY9の培養液からエタノール沈殿試料を調製し た。 New England Biolabs社の EndoH (P0702S)を用い、同社の推奨するプロトコール に従ってこのエタノール沈殿試料の酵素処理を行った。すなわち 36 Lの A液に 4 Lの 10x変性バッファー（5% SDS, 10% j8 - ME)を加え、 100°Cで 10分間煮沸した。試料 に 5 μ 1の 10x G5バッファー（0.5Mクェン酸ナトリウム pH5.5)をカ卩えて攪拌した後、 25 μ Lと 20 Lに分けた。 25 Lは陰性対象としてそのまま 37°Cにて 1時間保温した。残 りの 20 μ Lには 5 L (2500 unit)の EndoHをカ卩え、 37°Cにて 1時間保温した。保温後、 等量の 2x SDS-PAGEサンプルバッファーを添カ卩し、実施例 1と同様な方法に従って 電気泳動および PAS染色した。
その結果、 PAS染色で染まるマンナンタンパク質の移動度は EndoH処理で大きく変 化し、マンナンの切り出しによりタンパク質の質量が小さくなつたことが確認された。
[0041] 2)マンナンタンパク質のタンパク質含量およびアミノ酸糸且成
マンナン放出酵母株 MT36-4D (MATa ura3、図 4参照）を 6Lの合成培地（Difco社 Y east Nitrogen Base w/o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, ulucose 2%, ノ 酸 0.13%)で培養した培養上清力もエタノール沈殿によって回収したマンナンタンパク 質水溶液を、凍結乾燥機にて乾燥して試料を調製した (1.05 g)。
試料〖こ 0.5 mlの 12 N塩酸を加え 110°Cにて 22時間加水分解を行い、アミノ酸分析計 (日本電子データム JLC-500/V)にてアミノ酸組成の分析を行った。結果を表 1に示 す。エタノール沈殿にて回収されたマンナンタンパク質中のタンパク質含量は約 10% 程度であった。構成アミノ酸ではセリンゃスレオニンが比較的多 、ことが示された。 [0042] 表 1.アミノ酸組成
Figure imgf000018_0001
[0043] 実施例 7.マンナンタンパク質の回収条件の最谪化
1)限外ろ過におけるカットオフ分子量
マンナン放出株 MT36- 4Dを 6Lの合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/o Ami no acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%,アミノ酸 0.13%)で三角フラスコに て実施例 3に記載したように培養し、培養物力 酵母菌体をろ過により除去した培養 上清を試料とした。 2 mlの試料を Millipore社製限外ろ過カラム Centricon (YM50, YM 10, YM-3)に装荷し、指定条件（YM-50:5000 x g 15分 ,YM-10:5000 x g 1時間, YM- 3:7500 x g 2時間）にて遠心分離することにより限外ろ過を行った。ろ液及び残留液 を別々に回収し、それぞれを 2mlにメスアップし、 12N TFAを 400 /z 1加え、凍結、減圧 したのち、加水分解管中で 100°C、 16時間加水分解を行った。加水分解後遠心エバ ポレーターにより乾燥し、分析試料として調製後、イオンクロマトグラフィーにより分析 した。試験結果を表 2に示す。マンノースは 90%以上が分子量 1万以上の画分に存在 し、グルコースは広い分子量の範囲で存在していた。大部分のマンナンタンパク質は 分子量 5万以上の画分に回収された力 効率的にマンナンタンパク質を回収するた めには分子量 1万以上を分取するように限外ろ過を行うのが適切であることが示され た。
[0044] 表 2.マンノース画分の分子量分布
Figure imgf000019_0001
[0045] 2)エタノール沈殿におけるエタノール濃度
マンナン放出株 MT36-4D (図 4)を 6Lの合成培地（Difco社 Yeast Nitrogen Base w/ o Amino acid and Ammonium sulfate 0.17%, Glucose 2%,アミノ酸 0.13%)で三角フラス コを用いて実施例 3に記載したように培養し、培養物力 酵母菌体をろ過により除去 した培養上清 10mlに 100%エタノール（和光純薬）をそれぞれ最終濃度 33%,50%,60%,6 6.7%,80% (体積濃度）となるようにカ卩え、 - 30°Cでー晚放置した。翌日 7000rpmにて 15 分間遠心分離を行い、上澄み液を捨て、沈殿を一度 66.7%エタノールにて洗浄した 後、 100 /z lの水に懸濁し、それぞれについて SDS-PAGE及び PAS染色を行った。 その結果、マンノースの収率はエタノール濃度 60%以上で良好であり、特にエタノー ル濃度 66.7%または 80%の場合に効率よく回収できることが示された。
[0046] 本発明により、マンナンタンパク質、特に α -マンナンを含むマンナンタンパク質を 培地中に放出する酵母及びその製造方法、また本方法によって製造された天然状 態に近い単離マンナンタンパク質が提供される。すなわち、本発明により、 1)マンナ ンタンパク質、特に α -マンナンを含むマンナンタンパク質を培地中に放出する酵母 、 2)従来はマンナンタンパク質を物理的あるいは化学的処理により回収してきたのに 対し、前述の酵母を培養した培地中からマンナンタンパク質を回収することを特徴と する、マンナンタンパク質の効率的な製造方法が提供される。 特に、本発明の酵母は連続培養可能であるので、本発明によりマンナンタンパク質 、特に α -マンナンを含むマンナンタンパク質を連続的に提供することもできる。本発 明の、マンナンタンパク質を培地中に放出する酵母は有用な酵母株を育種するため にも利用できる。例えば、本発明の酵母を戻し交配する、または変異酵母株又は野 生型酵母株と接合させること等により、更に他の性質を付加、除去された新たな酵母 株を作製するための親株として利用することもできる。
さらに、本発明の酵母を培養することによって得られる天然状態に近いマンナンタ ンパク質力 タンパク質部分を除去することにより、天然状態に近い単離マンナンを 提供することができる。
[0047] (参考文献）
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2. 日本栄養'食糧学会誌、 55卷、 33-39 (2002)
図面の簡単な説明
[0048] [図 1]図 1はプラスミド YCp50- Chr.VIIの概略図である。
[図 2]図 2は、マンナンタンパク質放出に関与する変異領域を決定するためのプラスミ ドシャフリングに使用した染色体領域および、マンナン放出性に関するレスキュー結 果を示す。
[図 3]図 3は GpilOpの疎水性領域分布を示す。
[図 4]図 4は、 MTY9株力も派生する種々のマンナンタンパク質放出酵母株の系統図 である。
配列表フリーテキスト
[0049] 配列番号 1〜16 : PCRプライマー

Claims

請求の範囲
[1] 糖鎖合成系遺伝子に変異を持つことにより、 ひ-マンナンを含むマンナンタンパク質 を培地中に放出する酵母。
[2] 糖鎖合成系遺伝子が ex 1 ,2-マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であ つて、前記 α 1 ,2-マンノシルトランスフェラーゼカ 配列番号 17記載の配列のヌクレオ チド番号 234〜2081の配列を有する核酸とストリンジヱントな条件でハイブリダィズし 得る核酸によってコードされる、請求項 1記載の酵母。
[3] a 1 ,2-マンノシルトランスフェラーゼが配列番号 18記載のアミノ酸配列を有する、請 求項 2記載の酵母。
[4] a 1 ,2-マンノシルトランスフェラーゼが配列番号 18記載のアミノ酸配列を有し、変異 が前記配列の 498番プロリン残基がロイシン残基に置換された変異である、請求項 2 記載の酵母。
[5] サッカロミセス'セレビシァェ、シゾサッカロミセス 'ボンべ、サッカロミセス'ノ ラドキサ ス、サッカロミセス.ミカタエ、サッカロミセス'バヤヌス、サッカロミセス 'クドリアヴゼヴィ ィ、クルイべ口ミセス'ラクチス、カンジダ'ゥチリス、カンジダ'ァリビカンスからなる群よ り選ばれる、請求項 1〜4のいずれか 1項記載の酵母。
[6] サッカロミセス 'セレビシァェである、請求項 5記載の酵母。
[7] 受託番号 FERM BP-10390または FERM BP-10391で特定される、請求項 6記載の 酵母。
[8] 請求項 1〜7のいずれか 1項記載の酵母を培養すること、および、培地中に放出さ れたマンナンタンパク質を回収すること、を含む、 α -マンナンを含むマンナンタンパ ク質の製造方法。
[9] 請求項 1〜7のいずれか 1項記載の酵母を培養すること、培地中に放出されたマン ナンタンパク質を回収すること、前記マンナンタンパク質中のマンナンをタンパク質部 分から切断すること、および、前記マンナンを回収すること、を含む、 α -マンナンの 製造方法。
[10] マンナンタンパク質中のマンナンをタンパク質部分力 切断すること力 マンナンタ ンパク質に糖鎖切り出し酵素を作用させること、または、酸若しくはアルカリ処理を行 うことによって行われる。請求項 9記載の a -マンナンの製造方法。
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