CN103228798A - 使用固定的引物直接捕获、扩增及测序靶标dna - Google Patents

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Abstract

某些实施方案提供用于捕获基因组片段的方法。所述方法可以包括：获得包含第一群表面结合寡核苷酸和第二群表面结合寡核苷酸的基底；将所述第一群表面结合寡核苷酸的第一成员杂交到筛选寡核苷酸，所述筛选寡核苷酸包含与所述第一成员杂交的区域以及包含基因组序列的区域；延伸所述第一群表面结合寡核苷酸的所述第一成员以产生载体结合筛选引物，所述载体结合筛选引物包含与所述基因组序列互补的序列；将所述载体结合筛选引物杂交到包含所述基因组序列的核酸片段；延伸所述载体结合筛选引物以产生包含例如在基因组中位于所述基因组序列侧翼的序列的延伸产物；以及在所述基底上扩增所述延伸产物。

Description

使用固定的引物直接捕获、扩增及测序靶标DNA
交叉引用
本专利申请要求2010年9月24日提交的美国临时专利申请序列号61/386,390以及2011年5月11日提交的美国临时专利申请序列号61/485,062的优先权，这两份专利全文并入本文中。
政府权利
本发明根据国立卫生研究院授予的第HG000205号合同在政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。
背景
在许多测序方法中，尤其是重测序方法（即，其中对基因座进行重测序的方法）中，首先捕获靶标，然后进行测序。多种靶标捕获方法已由人们开发并与高通量测序系统集成。具体地讲，使用珠粒或微阵列的基于杂交的测定法以及使用分子倒置探针或基因组环化寡核苷酸的基于溶液中的技术可应用于捕获靶标DNA。然后制备经捕获的DNA用于测序。通常采用复杂的分子生物学方案来制备富集的DNA样品，并且在某些情况下，测序文库的产生涉及许多酶促反应、纯化步骤以及通过凝胶电泳进行的大小选择。用于靶标捕获DNA测序的样品制备过程可能是劳动密集型的，而后续样品操作会导致DNA含量的偏差并增加测序错误率。
发明概述
本文提供用于捕获和扩增核酸片段例如由RNA制备的基因组片段或cDNA的方法。还提供了用于实践该方法的试剂盒。在某些实施方案中，该方法包括：a)获得包含第一群表面结合寡核苷酸和第二群表面结合寡核苷酸的基底，其中第一和第二群表面结合寡核苷酸的成员不在基底上空间寻址；b)将第一群表面结合寡核苷酸的第一成员杂交到筛选寡核苷酸，该筛选寡核苷酸包含与第一成员杂交的区域以及包含基因组序列的区域；c)延伸第一群表面结合寡核苷酸的第一成员以产生载体结合筛选引物，该载体结合筛选引物包含与基因组序列互补的序列；d)将载体结合筛选引物杂交到包含基因组序列的核酸片段（如基因组片段或cDNA）；e)延伸载体结合筛选引物以产生包含例如在基因组中位于基因组序列侧翼的序列的延伸产物；f)在基底上扩增延伸产物，例如通过使用第一和第二群表面结合寡核苷酸的未延伸成员的桥式PCR，以产生PCR产物。
在某些实施方案中，该方法包括：a)获得包含第一群表面结合寡核苷酸和第二群表面结合寡核苷酸的基底，其中第一和第二群表面结合寡核苷酸不在基底上空间寻址；b)将第一群表面结合寡核苷酸的第一成员杂交到筛选寡核苷酸，该筛选寡核苷酸包含与第一成员杂交的区域以及包含基因组序列的区域；c)延伸第一群表面结合寡核苷酸的第一成员以产生载体结合筛选引物，该载体结合筛选引物包含与基因组序列互补的序列；d)将载体结合筛选引物杂交到包含基因组序列的核酸片段；e)延伸载体结合筛选引物以产生包含例如在基因组中位于基因组序列侧翼的序列的延伸产物；以及f)在基底上扩增延伸产物，例如使用桥式PCR，以产生PCR产物。
取决于如何实施方法，可将衔接子在杂交前连接到基因组片段，或在延伸载体结合筛选引物后连接到延伸产物。远侧衔接子可杂交到表面结合寡核苷酸（其自身可以是通过第二群表面结合寡核苷酸的沿模板延伸而产生的延伸产物），从而使得可以发生桥式PCR。筛选引物还可以包含测序引物结合位点，该位点可用于对PCR产物测序。
上述方法通常可用于重测序方法，其中可利用参考基因座的序列，并需要在多个测试样品中对相同的基因座重测序。在该应用中，对筛选寡核苷酸进行设计以杂交到基底上的寡核苷酸，并对位于基因座侧翼的区域重测序。将基因座捕获到基底上，然后扩增，再进行测序。例如，可从由一个个体或多个个体（例如，多达10、50、100、200或1,000或更多个个体）制备的样品中捕获单个基因座或多个不同的基因座（例如，多达10、50、100、200或1,000或更多个基因座）。
在某些实施方案中，该方法包括：a)获得包含第一群表面结合寡核苷酸和第二群表面结合寡核苷酸的基底，其中第一和第二群表面结合寡核苷酸随机散布在基底上并且不在空间上寻址；b)将第一群表面结合寡核苷酸的第一成员杂交到筛选寡核苷酸，该筛选寡核苷酸包含与第一成员杂交的区域以及包含基因组序列的区域；c)延伸第一群表面结合寡核苷酸的第一成员以产生载体结合筛选引物，该载体结合筛选引物包含与基因组序列互补的序列；d)将载体结合筛选引物杂交到包含基因组序列的衔接子连接片段（例如，衔接子连接基因组片段）；e)延伸载体结合筛选引物以产生包含位于基因组序列侧翼（例如在基因组中）的序列以及衔接子连接基因组片段的衔接子序列的产物；以及f)使用桥式PCR进行产物的扩增以产生PCR产物。
在可供选择的实施方案中，该方法包括：a)获得包含第一群表面结合寡核苷酸和第二群表面结合寡核苷酸的基底，其中第一和第二群表面结合寡核苷酸随机散布在基底上并且不在空间上寻址；b)将第一群表面结合寡核苷酸的第一成员杂交到筛选寡核苷酸，该筛选寡核苷酸包含与第一成员杂交的区域以及包含基因组序列的区域；c)延伸第一群表面结合寡核苷酸的第一成员以产生载体结合筛选引物，该载体结合筛选引物包含与基因组序列互补的序列；e)延伸载体结合筛选引物以产生包含位于基因组序列侧翼的序列的产物；f)将双链衔接子连接到产物上以产生衔接子修饰产物；以及g)使用桥式PCR进行衔接子修饰产物的扩增以产生PCR产物。
在特定情况下，该方法可进一步包括：i.将基因组片段连接到包含测序引物的位点和与第二表面结合寡核苷酸相同的核苷酸序列的衔接子，ii.将衔接子连接的基因组片段杂交到第一群表面结合寡核苷酸的第一成员，ii.延伸衔接子连接的片段所杂交到的第一群表面结合寡核苷酸的第一成员；以及iv.将延伸产物的含衔接子的末端杂交到第二载体结合多核苷酸，从而产生桥并有利于桥式PCR。
附图简述
以下详细说明的某些方面在结合附图阅读时可以得到最好的理解。要强调的是，根据惯例，附图的多个特征未按比例绘制。相反，为清楚起见，多个特征的尺寸被任意放大或缩小。附图中包括以下图例：
图1.称为“OS-Seq”的主题方法的一个实施方案的概览。(a)OS-Seq是与Illumina NGS平台无缝集成的靶向重测序方法。本方法需要靶标特异性寡核苷酸、测序文库和Illumina簇生成试剂盒。靶标捕获、处理和测序在NGS系统上进行。源于各引物-探针的数据被靶向并为链特异性的。此处显示的是OS-Seq-366的中位覆盖度特征图。(b)OS-Seq的处理涉及杂交、DNA聚合酶介导的延伸和DNA变性三个步骤。第1步：将靶标特异性寡核苷酸用于将流通池引物修饰为引物-探针。在Illumina测序系统中，将两种类型的引物（命名为C和D）固定在双端流通池。在OS-Seq中，使用寡核苷酸的复合文库将D引物的子集修饰为引物-探针。寡核苷酸具有杂交到D型流通池引物的序列。然后将杂交的寡核苷酸用作DNA聚合酶的模板，并延伸D引物。变性后，将靶标特异性引物-探针随机固定在流通池上。第2步：使用引物-探针捕获单衔接子文库中的基因组靶标。用于Illumina测序的样品制备涉及将特定的DNA衔接子添加到基因组DNA片段。这些衔接子包括测序引物和固定的流通池引物的位点。在OS-Seq中，我们使用修饰的衔接子由基因组DNA制备单衔接子文库。在高热杂交到其互补引物-探针的过程中捕获单衔接子文库中的靶标。将捕获的单衔接子文库片段用作DNA聚合酶的模板，并延伸引物-探针。变性从固定的靶标中释放出模板DNA。第3步：使固定的靶标与Illumina测序相容。在Illumina测序中，需要使用C和D引物进行的固定的测序文库片段的固相扩增。在OS-Seq中，在低热杂交期间，固定的靶标的单衔接子尾在流通池表面上杂交到C型引物，其使桥结构稳定化。使用DNA聚合酶延伸固定的靶标的3’末端和C引物。在变性后，形成两个互补的、固定的测序文库片段，它们包含完整的C和D引发位点并与固相扩增相容。在OS-Seq的三个步骤后，固定的靶标在结构上与标准双端Illumina文库相同，然后使用Illumina标准试剂盒和方案进行扩增和处理。该方法的原理可用在其他测序平台上。(c)本图显示了OS-Seq-366测定法中沿着KRAS基因的覆盖度特征图。相对于外显子1起点的碱基位置在x轴上示出，并指明了KRAS外显子。(d)在柱和阵列合成的寡核苷酸内进行的引物-探针产率的均一性评估。在柱合成的（蓝色，n=366）和阵列合成的（红色，n=11,742）寡核苷酸之间对捕获的均一性进行了比较。在x轴上，将寡核苷酸按序列捕获产率分选，在y轴上为归一化的引物-探针产率。为了计算归一化产率，将各寡核苷酸产率除以得自所有寡核苷酸的中位产率。
图2.用于OS-Seq的测序文库制备。将基因组DNA片段化、末端修复、A加尾、衔接子连接和PCR的一般方案用于制备OS-Seq文库。
图3.OS-Seq的设计策略。(a)距离外显子10个碱基设置引物-探针，或(b)在大外显子内部每500个碱基拼接引物-探针。
图4.OS-Seq寡核苷酸的生成。柱合成法产生了大量成熟的101-mer OS-Seq寡核苷酸，其可容易地用在测定法中。将微阵列合成法用于生成高含量寡核苷酸库。使用结合了另外的序列的引物将前体寡核苷酸扩增成寡核苷酸。将尿嘧啶切除用于从OS-seq寡核苷酸的编码链裂解扩增引物位点。
图5.OS-Seq中寡核苷酸组分的结构。(a)成熟的101-mer OS-Seq寡核苷酸包含靶标特异性位点以及编码引物2和流通池引物‘D’的序列。(b)使用结合了OS-Seq寡核苷酸5’末端的尿嘧啶以及另外的活性位点的引物扩增微阵列合成的寡核苷酸，以用于测序。(c)OS-Seq的衔接子包含T悬垂，用于粘端连接到A加尾的基因组片段。此外，索引序列以及流通池引物‘C’位点存在于dsDNA衔接子中。
图6.OS-Seq中遇到的插入物大小分布的说明。基因组DNA的片段化产生200与2kb之间的片段。测序文库的制备将共同的衔接子添加到片段的末端。PCR扩增进一步扭曲片段大小分布。靶标位点随机分布在单衔接子文库片段内。将文库片段固定在流通池上，引物-探针与衔接子之间的距离定义基因组DNA插入物的大小。将桥式PCR应用于扩增固定的靶标DNA（一般来讲，固相PCR优先地扩增较短的片段）。在簇扩增和处理后，使用两个位点对固定的片段测序。Read1源于基因组DNA，Read2源于合成的引物-探针。Read1用于通过OS-Seq数据评估基因组DNA序列。
图7.OS-Seq的重现性。(a)OS-Seq的技术重现性。使用OS-Seq分析了两个相同的文库。将个体引物-探针的测序产率在技术平行样之间进行比较。(b)OS-Seq的生物学重现性。使用索引衔接子制备了两个不同的基因组DNA文库。在同一OS-Seq实验中对文库进行分析。在图中，在两个独立的生物学平行样之间对引物-探针特异性捕获产率进行比较。
图8A-B.GC含量对靶向产率的影响。为了分析在引物-探针的效率中GC含量的影响，我们测定了各靶标特异性引物-探针序列的GC含量。我们对失败（捕获了0个靶标）的引物-探针进行了归类。将失败引物-探针的比例在不同的%CG含量类别之间进行比较。X轴表示分选的CG类别的百分比，y轴报告了各GC含量类别内失败引物-探针的比例。
图9A-B.OS-Seq与鸟枪(shotgun)文库创建方法的处理流程的比较。
定义
除非本文另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文所述的那些的任何方法和材料也可用于实践或检验本发明，但将描述优选的方法和材料。
本文提及的所有专利和出版物，包括此类专利和出版物内所公开的所有序列，以引用方式明确并入。
数值范围包括定义该范围的数值的端值。除非另外指明，否则核酸均以5'至3'方向从左向右书写；氨基酸序列均以氨基至羧基方向从左向右书写。
本文提供的标题不限制本发明的各个方面或实施方案。因此，紧接下文定义的术语通过作为整体引用到本说明书而更全面地定义。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY，第2版，John Wiley and Sons,New York(1994)以及Hale和Markham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,N.Y.(1991)为技术人员提供了本文所用的许多术语的一般含义。另外，为了清楚起见和方便参考，下文将定义某些术语。
如本文所用的术语“样品”涉及包含一种或多种所关注的分析物的材料或材料混合物，通常但不一定为液体形式。本文所用的核酸样品可以是复杂样品，因为它们包含多种不同的含有序列的分子。由哺乳动物（如，小鼠或人）mRNA制备的片段化基因组DNA和cDNA是复杂样品的类型。复杂样品可具有多于104、105、106或107个不同的核酸分子。DNA靶标可源于任何来源，诸如基因组DNA、cDNA（来自RNA）或人工DNA构建体。本文可以采用含有核酸（例如由组织培养细胞制备的基因组DNA）的任何样品、组织样品或FPET样品。
术语“核苷酸”旨在包括那些不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基还含有经修饰的其他杂环碱基的部分。此类修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、烷基化核糖或其他杂环化合物。此外，术语“核苷酸”包括那些含有半抗原或荧光标记以及可以不仅含有常规核糖和脱氧核糖还含有其他糖的部分。修饰的核苷或核苷酸还可以在糖部分上包含修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素原子或脂族基团取代，被官能化为醚、胺等等。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文可互换使用以描述任何长度的聚合物，例如，大于约2个碱基，大于约10个碱基，大于约100个碱基，大于约500个碱基，大于约1000个碱基，多达约10,000个或更多个构成核苷酸的碱基，例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，并可通过酶法或合成方法产生（例如，如美国专利号5,948,902以及其中引用的参考文献中所述的PNA），其可以与两个天然存在的核酸类似的序列特异性方式与天然存在的核酸杂交，例如可以参与Watson-Crick碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶（分别为G、C、A和T）。
如本文所用的术语“核酸样品”表示含有核酸的样品。
如本文所用的术语“靶标多核苷酸”是指研究中的所关注多核苷酸。在某些实施方案中，靶标多核苷酸包含所关注的和研究中的一个或多个序列。
如本文所用的术语“多核苷酸”表示长度为约2至200个核苷酸、最多500个核苷酸的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可以是合成的或可以通过酶法制备，并在一些实施方案中为30至150个核苷酸长。寡核苷酸可包含核糖核苷酸单体（即，可以是寡核糖核苷酸）或脱氧核糖核苷酸单体。寡核苷酸可以例如为10至20、11至30、31至40、41至50、51-60、61至70、71至80、80至100、100至150或150至200个核苷酸长。
术语“杂交”是指核酸链通过本领域已知的碱基配对与互补链结合的过程。如果两个序列在中等至高严格杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，则将核酸视为“可选择性杂交”到参考核酸序列。中等和高严格杂交条件是已知的（参见例如Ausubel等，Short Protocols inMolecular Biology，第3版，Wiley&Sons1995和Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，2001Cold SpringHarbor,N.Y.）。高严格条件的一个实例包括在约42℃下在50%甲酰胺、5X SSC、5X Denhardt溶液、0.5%SDS和100μg/ml变性的载体DNA中杂交，然后在室温下在2X SSC和0.5%SDS中洗涤两次，再在42℃下在0.1X SSC和0.5%SDS中洗涤两次。
如本文所用的术语“双链体”或“双链的”描述碱基配对即杂交到一起的两个互补多核苷酸。
如本文所用的术语“扩增”是指使用靶标核酸作为模板生成靶标核酸的一个或更多个拷贝。
术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”、“测定”和“分析”在本文可互换使用，以指代任何形式的测量，并包括测定某一要素是否存在。这些术语包括定量和/或定性测定。评估可以是相对的或绝对的。“评估...的存在”包括测定存在的某物的量，以及测定其是否存在。
术语“使用”具有其常规含义，并因此表示采用（例如投入服务）某方法或组合物获得某目的。例如，如果将某程序用于创建文件，则执行程序以制作文件，该文件通常为该程序的输出。在另一个实例中，如果使用计算机文件，则通常访问、读取该文件，并将该文件中存储的信息用于获得某目的。相似地，如果使用唯一性标识符例如条形码，则通常读取该唯一性标识符以识别例如与该唯一性标识符相关的物体或文件。
如本文所用，术语“Tm”是指寡核苷酸双链体的熔融温度，在该温度下，双链体的一半保持杂交，而双链体的另一半则解离成单链。寡核苷酸双链体的Tm可以通过实验测定或使用下式预测：Tm=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(G+C分数)–(60/N)，其中N为链长度，[Na+]小于1M。参见Sambrook和Russell（2001;Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor N.Y.，第10章）。还存在预测寡核苷酸双链体Tm的其他公式，一个公式对于给定的条件或一套条件可能更合适或不够合适。
如这里所用的术语“在溶液中游离的”描述未结合或系链到另一分子的分子，诸如多核苷酸。
如本文所用的术语“变性”是指将核酸双链体分离成两条单链。
如本文所用的术语“基因组序列”是指在基因组中存在的序列。由于RNA由基因组转录，因此，该术语涵盖存在于生物体核基因组中的序列，以及存在于由这样的基因组转录的RNA（如mRNA）的cDNA拷贝中的序列。
如本文所用的术语“基因组片段”是指基因组的区域，例如动物或植物基因组，诸如人、猴、大鼠、鱼或昆虫或植物的基因组。基因组片段可以为或可以不为衔接子连接的。基因组片段可以为衔接子连接的（在此情况下，其具有连接到片段一个或两个末端、至少分子5’末端的衔接子），或非衔接子连接的。
在某些情况下，用于本文所述的方法的寡核苷酸可使用参考基因组区域设计，即，已知核苷酸序列的基因组区域，例如，其序列登记在例如NCBI的Genbank数据库或其他数据库的染色体区域。这样的寡核苷酸可用在使用含有测试基因组的样品的测定法中，其中该测试基因组含有该寡核苷酸的结合位点。
如本文所用的术语“连接”是指将第一DNA分子的5’末端的末端核苷酸通过酶催化法接合到第二DNA分子3’末端的末端核苷酸。
术语“衔接子”是指双链的以及单链的分子。
“多个”包含至少2个成员。在某些情况下，多个可具有至少10个、至少100个、至少100个、至少10,000个、至少100,000个、至少106个、至少107个、至少108或至少109个或更多个成员。
如果两个核酸为“互补的”，则核酸之一的每个碱基与另一核酸中的对应核苷酸碱基配对。术语“互补的”和“完美互补的”在本文同义使用。
“引物结合位点”是指引物在寡核苷酸或其互补链中杂交到的位点。
如本文所用的术语“分离”是指两种元件的物理分离（例如，通过大小或亲和力等）以及使一个元件降解而留下另一个完整无损。
如本文所用的术语“测序”是指借以获得对多核苷酸的至少10个连续核苷酸的身份（例如，至少20个、至少50个、至少100个或至少200个或更多个连续核苷酸的身份）的方法。
在包含不空间寻址的表面结合多核苷酸群的基底的背景下，术语“不空间寻址”是指基底所含的表面含有不同的寡核苷酸分子，它们相对于彼此无特定的顺序或位置，即，处于随机的位置或与彼此随机散布。这样的基底不需要为平坦的，并在某些情况下可以为珠粒的形式。包含空间或光学寻址的单一寡核苷酸群的基底（例如，微阵列和编码珠粒等）被排除在本定义之外。包含第一群表面结合寡核苷酸和第二群表面结合寡核苷酸的基底，其中第一和第二群表面结合寡核苷酸不空间寻址，是指包含在整个基底上随机分布的至少两群不同的寡核苷酸的基底。基底可以例如是平坦的或珠粒的形式。
如本文所用的术语“衔接子连接的”是指已连接到衔接子的核酸。衔接子可以连接到核酸分子的5’末端或3’末端。
如本文所用的术语“延伸”是指通过使用聚合酶添加核苷酸而延伸引物。如果对退火形成核酸的引物进行延伸，则核酸作为延伸反应的模板。
术语“桥式PCR”是指固相聚合酶链反应，其中在反应中延伸的引物通过它们的5’末端被系链到基底上。在扩增期间，扩增子在系链的引物之间形成桥。桥式PCR（其也可以称为“簇PCR”）用于Illumina的Solexa平台。桥式PCR和Illumina的Solexa平台在许多出版物中有所概述，例如Gudmundsson等(Nat.Genet.200941:1122-6)，Out等(Hum.Mutat.200930:1703-12)和Turner(Nat.Methods20096:315-6)，美国专利7,115,400，以及专利申请公布US20080160580和US20080286795。
如本文所用的术语“条形码序列”是指将唯一性核苷酸序列用于在反应中鉴定和/或跟踪多核苷酸的来源。条形码序列可位于寡核苷酸的5′末端或3’末端。条形码序列的大小和组成可以差异巨大；以下参考文献提供了选择适用于特定实施方案的条形码序列集的指导原则：Brenner，美国专利号5,635,400；Brenner等，Proc.Natl.Acad.Sci.,97:1665-1670(2000)；Shoemaker等，Nature Genetics,14:450-456(1996)；Morris等，欧洲专利公布0799897A1；Wallace，美国专利号5,981,179等。在特定实施方案中，条形码序列的长度范围可为4至36个核苷酸、或6至30个核苷酸或8至20个核苷酸。
其他术语定义可出现在整个说明书中。
发明详述
主题方法的某些特征结合图1进行描述，该图示出了其中在将片段杂交到基底前将衔接子连接到片段的实施方案。在可供选择的实施方案中，在方案的随后添加衔接子。该方法通常包括获得包含至少两个不同序列的表面结合寡核苷酸的基底，所述寡核苷酸在空间上彼此散布。此类基底目前用于Illumina的Solexa测序技术，并在许多参考文献中有所描述，例如美国专利号7,115,400和专利公布号US20080160580及US20080286795，它们的此类公开内容以引用方式并入。下文所示的一些实施方案可描述将该方法用于分离基因组的片段。这些实施方案可容易地适于其他类型的序列，例如cDNA或合成的DNA。
在某些实施方案中，将第一群表面结合寡核苷酸的第一成员杂交到筛选寡核苷酸，该筛选寡核苷酸包含：a)与第一成员杂交的区域和另外的区域、测序引物位点，以及b)包含靶标基因组序列的区域。用于该步骤的筛选寡核苷酸的量可经过优化，使得足量的第一群寡核苷酸保持不杂交到筛选寡核苷酸并可用于在方案随后进行的桥式PCR步骤。将第一群表面结合寡核苷酸的第一成员进行延伸，以产生包含载体结合筛选引物的双链体，该载体结合筛选引物包含与靶标基因组序列互补的序列。通过变性移除筛选寡核苷酸，留下延伸的载体结合筛选引物。然后将延伸的载体结合筛选引物与衔接子连接的基因组片段（其可通过化学、物理方式或使用酶使基因组DNA片段化并且然后将衔接子连接到所得片段的末端而制成）杂交，该衔接子连接的基因组片段包含靶标基因组序列、位于靶标基因组序列侧翼的序列以及位于一条或两条链5’末端的衔接子序列。使载体结合筛选引物延伸，以得到产物，该产物包含在基因组中位于基因组序列侧翼的序列以及衔接子连接的基因组片段的衔接子序列。
在一些实施方案中，衔接子连接的基因组片段的衔接子可杂交到第二群表面结合寡核苷酸。然而，在某些情况下，在扩增前，可使第二群表面结合寡核苷酸杂交到修饰寡核苷酸，该修饰寡核苷酸包含a)与第二成员杂交的区域，以及包含衔接子序列的区域。用于该步骤的修饰寡核苷酸的量可经过优化，使得足量的产物分子发生杂交。可使第二群表面结合寡核苷酸的第二成员延伸，以产生包含载体结合衔接子引物的双链体，该载体结合衔接子引物包含与衔接子序列互补的序列。通过变性移除修饰寡核苷酸，留下载体结合衔接子引物。然后可通过桥式PCR扩增产物。
如图1b中所示，使产物通过第一未延伸的表面结合寡核苷酸以及第二表面结合寡核苷酸扩增，以产生PCR产物。在某些情况下，基因组片段为包含5’末端衔接子的衔接子连接的基因组片段。在这些情况下，第二群表面结合寡核苷酸的成员杂交到衔接子的互补序列。在可供选择的实施方案中，可将衔接子连接到延伸产物上，从而将杂交到第二群表面结合寡核苷酸的衔接子置于延伸产物的3’末端上。在其他实施方案中，扩增使用以下物质完成：a)未延伸的第一群表面结合寡核苷酸的成员；以及b)通过以下方式制备的载体结合引物：i.将第二群表面结合寡核苷酸的成员杂交到寡核苷酸，该寡核苷酸包含与第二群表面结合寡核苷酸的成员杂交的区域以及与衔接子互补的区域；以及ii.使第二群表面结合寡核苷酸的成员延伸，以产生杂交到延伸产物5’末端的载体结合引物。
在一些实施方案中，基因组片段为包含5’末端衔接子的衔接子连接的基因组片段，其中延伸产生在其3’末端包含与衔接子互补的序列的延伸产物，并且其中第二群表面结合寡核苷酸的成员在桥式PCR期间杂交到与衔接子互补的序列。在该实施方案中，5’末端衔接子包含在该末端连接到基因组片段的测序引物的结合位点。
在其他实施方案中，该方法在步骤e)与f)之间包括将衔接子连接到延伸产物的3’末端上，并且其中在桥式PCR期间将第二群表面结合寡核苷酸的成员杂交到衔接子。在这些实施方案中，衔接子包含在该末端连接到基因组片段的测序引物的结合位点。
在一些实施方案中，第二群表面结合寡核苷酸通过以下方式制备：i.将初始第二群表面结合寡核苷酸的成员杂交到寡核苷酸，该寡核苷酸包含与第二群表面结合寡核苷酸的成员杂交的区域以及与基因组片段的序列互补的区域；以及ii.使初始第二群表面结合寡核苷酸的成员延伸，以产生第二群表面结合寡核苷酸。
在一些实施方案中，第二群表面结合寡核苷酸可通过以下方式制备：将包含与所述核酸片段的序列互补的区域的寡核苷酸连接到初始第二群表面结合寡核苷酸，以产生所述第二群表面结合寡核苷酸。该连接可通过在进行连接的两个寡核苷酸之间形成桥的夹板寡核苷酸而促进。换句话讲，可通过基于连接的过程引入修饰寡核苷酸，其中将桥联寡核苷酸用于指导原始固体载体寡核苷酸的修饰，以产生载体结合的衔接子引物。相似地，可使用类似的桥联寡核苷酸形成载体结合的衔接子引物，以产生靶标修饰所需的引物延伸。
在一些情况下，筛选寡核苷酸包含介于与所述第一成员杂交的所述区域与包含所述基因组序列的所述区域之间的测序引物的结合位点。
在一些实施方案中，该方法可进一步包括对PCR产物的第一链测序，以获得位于基因组序列侧翼的序列的核苷酸序列的至少一部分。该方法可进一步包括对PCR产物的第二链测序，以获得位于基因组序列侧翼的序列的核苷酸序列的至少一部分。
在特定实施方案中，该方法可包括使哺乳动物基因组片段化以产生片段化基因组，任选地向片段化基因组添加衔接子，以及将片段化基因组施加到基底上。片段化通过物理、化学方式或使用限制性酶完成。例如，片段化通过声波或剪切完成。
在特定情况下，杂交通过以下方式完成：从多个不同的个体制备多个片段化基因组，混合多个片段化基因组以产生库，将片段化基因组的库施加到基底，以及获得包含位于不同个体中的基因组序列侧翼的序列的PCR产物。这些实施方案可进一步包括对PCR产物的至少第一链测序，以获得位于不同个体中的基因组序列侧翼的序列的核苷酸序列的至少一部分。在特定方面，在混合前，将不同的衔接子连接到来自不同个体的片段化基因组，其中该衔接子包含条形码序列，该条形码序列允许在对PCR产物测序后鉴定衔接子连接的基因组片段的来源。
在某些实施方案中，该方法包括：使用包含第一条形码序列的第一衔接子用衔接子连接来自第一受试者的片段化基因组DNA以产生第一产物；使用包含第二条形码序列的第二衔接子用衔接子连接来自第二受试者的片段化基因组DNA以产生第二产物；将第一和第二产物合并以产生混合模板；以及使用该混合模板执行权利要求1的方法以提供各自包含条形码序列的第一和第二PCR产物。混合模板在一些情况下可包含来自至少1,000个受试者的片段化基因组DNA。
在一些实施方案中，该方法可涉及：i.将基因组片段连接到包含测序引物的位点和与第二表面结合寡核苷酸相同的核苷酸序列的衔接子，ii.将衔接子连接的基因组片段杂交到第一群表面结合寡核苷酸的第一成员，iii.延伸衔接子连接的片段所杂交到的第一群表面结合寡核苷酸的第一成员；以及iv.将延伸产物的含衔接子的末端杂交到第二载体结合多核苷酸，从而产生桥并有利于桥式PCR。
本文还提供一种系统。在某些情况下，该系统可以包括：a)包含第一群表面结合寡核苷酸和第二群表面结合寡核苷酸的基底，其中第一和第二群表面结合寡核苷酸不在基底上空间寻址；b)包含与第一群的第一成员杂交的区域以及含基因组序列的区域的筛选寡核苷酸；c)衔接子；以及e)执行权利要求1的方法的说明。可例如使用Illumina的Solexa平台或另一种固相测序方法对PCR产物进行测序，以获得位于靶标基因组序列侧翼的序列的核苷酸序列的至少一部分。
在特定实施方案中，该方法可采用允许鉴定位于靶标基因组序列侧翼的序列的来源的条形码序列。在这些实施方案中，衔接子连接的基因组片段的衔接子可包含条形码序列，其允许在对PCR产物测序后鉴定衔接子连接的基因组片段的来源。在特定实施方案中，该方法包括：使用包含第一条形码序列的第一衔接子用衔接子连接来自第一受试者（该受试者可以包括在第一多个受试者的库中）的片段化基因组DNA以产生第一产物；使用包含第二条形码序列的第二衔接子用衔接子连接来自第二受试者（该受试者可以包括在第二多个受试者的库中）的片段化基因组DNA以产生第二产物；将第一和第二产物合并以产生混合模板；以及使用该混合模板执行上述方法以提供各自包含条形码序列的第一和第二PCR产物。在上述方法中，所用的衔接子具有：具有相同序列并杂交到表面结合寡核苷酸的部分，以及具有不同核苷酸序列的含条形码序列的部分。
本发明提供扩增所选序列的第二方法。该方法的原理与上述方法的原理相似，不同的是：a)杂交到载体结合筛选引物的基因组片段未连接衔接子；以及b)衔接子在延伸了载体结合筛选引物之后。衔接子连接后，产物可用于桥式PCR产物，如上所讨论。如在上文所述的可供选择的实施方案中，扩增使用以下物质完成：a)第一群表面结合寡核苷酸的未延伸成员；以及b)通过以下方式制备的载体结合引物：i.将第二群表面结合寡核苷酸的成员杂交到寡核苷酸，该寡核苷酸包含与第二群表面结合寡核苷酸的成员杂交的区域以及与衔接子的序列互补的区域；以及ii.使第二群表面结合寡核苷酸的成员延伸以产生载体结合的引物。与上述方法一样，可对PCR产物测序以获得位于基因组序列侧翼的序列的核苷酸序列的至少一部分。
在一个可供选择的实施方案中，基因组片段可连接到不仅包含测序引物结合位点还包含与第二群表面结合寡核苷酸相同的序列的衔接子。如图所示，当将延伸的第一群表面结合寡核苷酸（其通常在高温下完成，即，至少90℃）杂交到衔接子连接的片段并延伸时，延伸产物包含杂交到第二群表面结合寡核苷酸的序列（其通常在较低温度下完成，例如低于60℃，例如低于55℃），从而有利于使用第一和第二群表面结合寡核苷酸扩增基因组片段。该方法在图14中示出。
在特定实施方案中，第一群寡核苷酸相对于施加到基底的筛选寡核苷酸的量以至少5倍、10倍、20倍、50倍、或100倍、500倍、1,000倍、2000倍、10,000倍、50,000倍摩尔过量存在。在一个实施方案中，摩尔过量可在5倍至50,000倍摩尔过量的范围内，例如100倍至5,000倍摩尔过量。
在某些实施方案中，可将基底与多种不同的筛选寡核苷酸接触，每一种包含与第一群表面结合寡核苷酸的成员杂交的区域（该区域在不同的筛选寡核苷酸中具有相同的核苷酸序列）以及含基因组序列的区域。筛选寡核苷酸每一种的基因组序列均不同，从而允许在基底上对多种基因组区域进行捕获、扩增和测序。
试剂盒
本公开还提供用于实践如上所述的主题方法的试剂盒。在某些实施方案中，主题试剂盒可以包含：a)包含第一群表面结合寡核苷酸和第二群表面结合寡核苷酸的基底，其中第一和第二群表面结合寡核苷酸不在基底上空间寻址；以及b)包含与第一群的第一成员杂交的区域以及含基因组序列的区域的筛选寡核苷酸。该试剂盒还可以包含上文及下文所述的可用于本方法的其他试剂，例如衔接子、连接酶、杂交缓冲液等。
除了上述组分外，该主题试剂盒通常进一步包含使用试剂盒的组分实践主题方法的说明。实践主题方法的说明通常记录在合适的记录介质上。例如，该说明可印刷在基材上，诸如纸张或塑料等上。因此，该说明可作为包装说明书存在于试剂盒中、存在于试剂盒容器或其组件（即，与包装或分包装相关的）的标签上等。在其他实施方案中，该说明作为电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质上，例如CD-ROM、磁盘等。在其他实施方案中，实际的说明不存在于试剂盒中，但提供从远程来源获得说明的方法，例如通过互联网。该实施方案的实例为包含web地址的试剂盒，可在该地址查看说明和/或可从该地址下载说明。与说明一样，获得说明的该方法也记录在合适的基材上。其他所需的组件将包括相关的计算机程序和/或计算机脚本，以对已安装在测序仪上的先前程序进行修改。
除了说明外，试剂盒还可以包含用于测试试剂盒的一种或多种对照分析物混合物，例如，两种或更多种对照分析物。
为了进一步说明本发明，给出了以下具体实施例，应当理解，提供这些实施例是为了说明本发明而不应被视为是以任何方式限制本发明的范围。
2010年9月24日提交的美国临时专利申请序列号61/386,390以及2011年5月11日提交的美国临时专利申请序列号61/485,062的公开内容（包括所有图例、实施例、详细说明和寡核苷酸序列）全部并入本文中。
实施例
下面将给出执行靶向DNA测序的新方法。该方法基于：在固相载体上对通用引物苔(lawn)（即，包含至少两个随机分布的引物的苔）进行修饰以用作靶标DNA捕获装置，对捕获的DNA直接测序以及无需对样品进行大量操作。该方法使得靶标DNA捕获和测序实验能够与相关的流体平台无缝集成。该方法使用固相载体上的通用引物苔作为DNA捕获基底，同时维持其测序潜能。该方法可使用未处理的天然DNA作为模板进行测序。使用该方法的测序不一定依赖于实验室设施。此外，在样品处理中引入的许多偏差得以避免并且相对于其他方法可在更短的时间以更低的成本分析明显更小的样品。该方法可用于分析单链和双链模板。分析单链DNA模板的能力可能对于某些测序应用具有重要意义，这些应用使用来自病理学归档标本的福尔马林固定石蜡包埋样品。相似地，通过允许单链DNA模板测序，该方法无需被设计为保护DNA双链信息的复杂的核酸提取步骤和昂贵的片段化仪器。相反，样品可通过裂解和热片段化制备，其廉价而又有效。直接的捕获测序测定法不限于人基因组DNA而是包括其他核酸底物，诸如可对细菌和病毒DNA和RNA进行分析。也可捕获转录组、非编码RNA和miRNA并进行测序。除了核苷酸序列捕获和测序外，还可以研究其他遗传和表观遗传性质，诸如DNA甲基化、大基因组重排和基因表达。该方法还可用于从群中选择合成的DNA。
一般来讲，测序已被视为其中对DNA样品进行结构修饰以有利于在测序系统上进行分析的过程。下文所述的方法对测序系统进行改良并因此无需修饰及大量制备样品。通过使用合成的DNA寡核苷酸对通用引物苔进行官能化，可以直接测定未处理的样品的靶基因文库。为了减少非特异性捕获，将提供用于形成桥联结构的序列的特定DNA组分按顺序带入，并使引物苔自我修饰。用于所有类型测序仪的测序文库制备依赖于将特定的双链衔接子序列加入DNA模板。由于捕获寡核苷酸用作固定在固体载体上的衔接子，因此，用于测定法的文库制备只需添加单个衔接子。这大大缩短了样品处理，并且不需要克隆扩增也不需要基于凝胶电泳的大小分离。在某些情况下，可将第二衔接子添加到固体载体上的捕获模板。本发明的某些实施方案允许使用原始DNA作为测序模板。
用于执行高通量重测序的多种现行方法涉及捕获靶标DNA并作为单独的方法进行测序。这在某些情况下会导致多种问题，包括：i)对DNA材料的操作需要耗费大量的劳力和时间，ii)因复杂的实验方案所致的错误，iii)因筛选和分子扩增过程产生的偏差，以及iv)需要大量的原料。据信，下述方法消除了其中许多问题的来源，因为该方法几乎不涉及先期的样品处理，可实现完全自动化和高度扩展。
作为概念验证，对人基因组中的10个癌症基因的所有外显子测序，以证实测定法可重现并可用于捕获和测序基因组的特定区域。该测定方法经Illumina基因组分析仪加以证实，但应当注意，该方法广泛适用于使用固相载体的任何测序仪。
下述方法（其某些原理在图1中示出）可用于有效捕获任何靶标DNA序列并允许对捕获的基因组片段直接测序。测序所用的基因组DNA样品可通过简单的热片段化步骤制备，并且整个测定法可完全自动化并在固体载体上执行。捕获和后续反应可通过流体系统调控。
另外的实施方案提供了一种允许制备用于在固体载体上测序的DNA片段的方法，方式是使用片段化DNA作为模板，并采用流体系统将测序衔接子添加到捕获的DNA片段。作为概念验证，将Illumina下一代DNA测序仪用于开发这些方法。展示了从使用引物苔修饰和人基因组中的366个靶点进行的集成捕获和测序制备反应中得到的结果。除了25分钟的热片段化外，所有步骤都在Illumina流通池的固相载体上完成。
下述数据证实了测定法的稳健性以及通用引物苔和作为捕获基底的流体系统的适用性。已鉴定了引物苔修饰的特有参数，它们使得该方法能稳健地实施。除了复杂的真核基因组外，该方法可应用于捕获微生物和其他生物体的基因组、病毒DNA和RNA、不同来源的转录组以及合成的DNA。此外，引入并验证了对固定在流体系统固体载体上的天然引物苔“编程”以及执行特定应用的概念。
材料和方法
基因组DNA样品.从Coriell Institute获得NA18507的基因组DNA。从结直肠癌患者获得新鲜冷冻组织样品。患者材料在知情同意下从Stanford Cancer Center获得，研究得到了Stanford UniversitySchool of Medicine的机构审查委员会(IRB)批准。制作冷冻组织切片，执行苏木精-伊红染色，并通过病理检查测定了各样品的肿瘤组成。分别从细胞组成为90%肿瘤或完全正常的区域解剖代表肿瘤和正常组织的样品。使用E.Z.N.A SQ DNA/RNA蛋白质共提取试剂盒(OmegaBio-Tek,Norcross,GA)提取基因组DNA。将DNA制备、阵列杂交和扫描的标准方案用于采用SNP6.0阵列(Affymetrix,Santa Clara,CA)分析样品。使用Genotyping Console软件和Birdseed V2算法(Affymetrix)进行数据分析。与研究的样品一起分析了十三个另外的微阵列数据集，以便评估SNP读出(call)的质量。使用0.01的P值阈值对SNP6.0阵列数据过滤。
靶标筛选和电子(in silico)OS-Seq寡核苷酸设计.将CCDS版本20090902、人基因组版本NCBI37–hg19和dbSNP版本ID131用作多态性参考数据集。对于基因筛选，将GeneRanker注释数据库用于按重要性优先级选择344个癌基因。为了找到寡核苷酸的靶标特异性序列，从CCDS获取候选基因的外显子定义。对于最有靶向性的外显子（小于500bp），40-mer靶标特异性序列为外显子边际5’末端外部的10个碱基（图3a）。使用个体引物-探针靶向外显子的两条链。OS-Seq-366只覆盖外显子的侧翼。在OS-Seq-11k测定法中，将大于500bp的外显子通过拼接靶标特异性序列直到覆盖整个外显子区域而进行处理（图3b）。为了改善OS-Seq-11k的中靶(on-target)特异性，我们使用了Repbase来鉴定和消除靶向高重复性序列的寡核苷酸序列。
寡核苷酸合成.将两个策略应用于寡核苷酸合成。对于OS-Seq-366，我们设计了366个101-mer寡核苷酸（图5a），然后进行柱合成(Stanford Genome Technology Center,Stanford,CA)（图4a）。对寡核苷酸定量，并以等摩尔浓度混合。对于OS-Seq-11k，使用原位微阵列合成(LC Sciences,Houston)方法合成11,742个前体寡核苷酸（图5b）。靶标特异性寡核苷酸的序列见下表2。
Figure BDA00003232996600231
Figure BDA00003232996600241
微阵列合成的寡核苷酸的扩增.使用了三个25μl的前体80-mer寡核苷酸子库（587、638和415nM）（图5b）。采用PCR方法扩增前体低浓度寡核苷酸（图4b）。将阵列合成的寡核苷酸子库稀释到10fM/寡核苷酸，并用作PCR扩增的模板。使用Taq DNA聚合酶(NEB)和dNTP（1mMdATP、1mM dCTP、1mM cGTP、500nM dTTP和500nM dUTP）在标准反应条件下进行PCR。在95℃下变性30s后，进行了20轮扩增循环（95℃，30s；55℃，30s；68℃，30s）。扩增引物1在3’末端含尿嘧啶，而扩增引物2结合了另外的功能序列（图5b）。将扩增的寡核苷酸进行纯化以移除多余的引物(Fermentas)，然后使用0.1U/μl的尿嘧啶-DNA切除混合物(Epicentre,Madison,WI)在37℃处理45min，以分离通用扩增引物位点并裂解成熟的寡核苷酸101-mer编码链。寡核苷酸需要5’末端为功能性和游离的，以便在引物-探针固定过程中具有准确的靶标特异性位点延伸。在酶的热休克失活（65℃，10min）后，对寡核苷酸制备物进行纯化(Fermentas)。最后，我们对三个寡核苷酸子库进行定量，并以等摩尔浓度的各子库创建了单个库。
通过修饰流通池引物苔制备OS-Seq引物-探针.在Illumina基因组分析仪IIx(Illumina,San Diego)系统中，固相载体（即，流通池）具有两种引物（‘C’和‘D’），它们以极高的密度随机固定在聚丙烯酰胺层上。对于OS-Seq实验，使用Illumina簇生成工作站对‘D’引物的子集进行特异性修饰。在NGS引物修饰前，在95℃下对133nM寡核苷酸库进行热变性5分钟。我们使用了热休克（95℃持续5min）游离出OS-Seq寡核苷酸的编码链。不需要另外的链纯化，因为第二条链在流通池上失活并在杂交后被洗掉。将变性的寡核苷酸用4x杂交缓冲液(20x SSC,0.2%Tween-20)稀释。将所得的100nM寡核苷酸用于流通池修饰实验。将30μl寡核苷酸混合物分配到流通池的各通道上。在温度斜坡期间（在18分钟内从96℃至40℃），寡核苷酸特异性退火成固定的引物‘D’。之后，以退火的寡核苷酸作为模板，将DNA聚合酶用于延伸‘D’引物。延伸后，将原始寡核苷酸模板从延伸的‘D’引物变性并从固相载体洗涤。将标准Illumina v4试剂用于延伸、洗涤和变性步骤。引物‘D’的修饰导致了引物-探针的固定。
测序文库制备.我们在图2中勾画出了用于制备OS-Seq测序文库的基因组DNA片段化、末端修复、A加尾、衔接子连接和PCR的一般方案。我们使用了来自NA18507的1μg基因组DNA和速冻结直肠癌样品作为原料。使用Covaris E210R(Covaris,Woburn,MA)使基因组DNA片段化，得到500bp的平均片段大小（占空比5%，强度3，每次脉冲200个循环，80秒）。使用0.25U的Klenow大片段(New England Biolabs,Ipswich,MA)、7.5U的T4DNA聚合酶(NEB)、400μM的各dNTP(NEB)、25U的T4多核苷酸激酶(NEB)以及含ATP(NEB)的T4DNA连接酶缓冲液在50μl反应体积中在室温下对随机片段化的DNA进行末端修复45分钟。末端修复后，使用3.2U的Taq DNA聚合酶(NEB)、100μM dATP(Invitrogen)和含1.5mM MgCl2的Taq缓冲液在80μl反应体积中在72℃下处理15分钟，以将腺嘌呤加到模板DNA的3’末端。在衔接子连接前，将反应使用PCR纯化试剂盒(Fermentas)纯化。
开发了OS-Seq的索引系统。测序文库衔接子包含任选的6个碱基的索引序列、测序引物1位点和12-mer序列供引物‘C’杂交（上表2，图5c）。设计了十六个索引衔接子。衔接子寡核苷酸在Stanford GenomeTechnology Center合成。在连接前，在温度斜坡下降过程中对衔接子寡核苷酸退火。对于NA18507的靶向重测序，我们使用了单重衔接子以及具有‘AACCTG’标签的多重衔接子。对于匹配的正常与肿瘤样品的索引，我们将‘TGCTAA’条形码用于正常组织，而将肿瘤样品用‘AGGTCA’标记。使用2,000U的T4DNA连接酶(NEB)和T4DNA连接酶缓冲液在室温下处理1小时，将具有T悬垂的双链DNA衔接子连接到A加尾模板。衔接子连接后，使用PCR纯化试剂盒(Fermentas)对反应物进行纯化，并使用PCR对文库进行扩增。制备了50μl以下物质的反应物：1UPhusion热启动DNA聚合酶(Finnzymes,Finland)、1μM文库扩增引物（补充表1）、Phusion HF缓冲液和200μM各dNTP(NEB)。将反应物在98℃下变性30s。之后，执行了22个PCR循环（98℃，10s；65℃，30s；以及72℃，30s），然后在72℃持续7min和4℃。接着，将PCR反应物使用PCR纯化试剂盒(Fermentas)进行纯化，并进行定量。以相等的浓度混合多重文库。
使用引物-探针捕获靶标.使用OS-Seq引物-探针（图1b和下文的寡核苷酸序列）在流通池上捕获靶标。我们将30μl基因组测序文库(30–42ng/μl)注入流通池。通过在流通池中在65℃下将测序文库孵育20分钟，将靶标DNA杂交到引物-探针。在基因组DNA文库杂交和后续延伸过程中，将流通池保持在恒定的65℃。将Illumina簇生成工作站用于执行引物-探针杂交和延伸步骤。在杂交到引物-探针前，将22.5μl测序文库(40-56.6ng/μl)在95℃变性5min。热休克后，使用4x杂交缓冲液将基因组DNA文库稀释到30μl的总体积。测序文库的最终DNA浓度在30至41.7ng/μl的范围内。由于测序文库的高浓度，将杂交体积保持在最小。因此，开发了一款定制的簇生成工作站应用程序(Cluster Stationprogram)，以便实现重现的低体积杂交。以下延伸、洗涤和变性步骤使用Illumina v4试剂执行。
流通池处理和测序.捕获靶标后，将流通池的温度降到40℃维持30min以允许捕获的基因组DNA文库片段的3’末端中的12个碱基杂交到引物‘C’（图1b和下文的寡核苷酸序列）。在桥联形成中，使用DNA聚合酶延伸文库片段和引物‘C’，以敲定并复制捕获的DNA片段。之后，执行桥式PCR以生成克隆扩增的测序簇。在Illumina基因组分析仪IIx上使用常规第4版测序试剂和方案(Illumina)通过40×40(OS-Seq-366)或60×60(OS-Seq-11k)双端循环对样品测序。使用SCS2.8和RTA2.8软件(Illumina)进行了图像分析和碱基读出(base calling)。
序列分析和变体检测.将序列读取(read)与人类基因组版本NCBI37–hg19使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)19进行比对。比对后，将中靶读取(Read1)定义为在引物-探针5’末端的1kb内。将脱靶读取定义为在引物-探针5’末端的1kb之外对齐，或从相关引物-探针的位置映射在不同染色体组上。对于索引通道的解多重化(de-multiplexing)，我们使用了perl脚本采用碱基读出文件生成7个碱基的标签的索引。将该索引文件和另一perl脚本用于对合并的碱基读出文件（使得可生成单独的fastq文件用于进一步处理）或对齐的文件解多重化。
为了消除变体读出的任何合成引物-探针序列，对末端配对(matepair)应用了插入物大小过滤。通过比较成对序列读取的对齐，确定了插入物大小。对于变体读出，提取的序列需要具有大于[40+Read1的长度]的插入物大小。在插入物大小过滤后，使用SAMtools和BCFtools进行了变体读出。使用SAMtools mpileup以50的映射质量阈值针对人基因组(hg19)进行了序列pileup。将BCFtools视图用于进行碱基位置的基因分型，使用vcfutils.pl（在SAMtools包中提供的变体过滤perl脚本）对数据过滤。vcfutils varFilter条件为：i)10或更大的覆盖度，ii)移除链偏差过滤器（因为OS-Seq是一种链特异性的捕获方法），iii)强制脚本输出参考和非参考位置。将参考和非参考读出用于与Affymetrix SNP6.0阵列数据进行比较。将基因分型的位置进行过滤以具有高于50的Phred样质量评分。我们使用了BEDtools intersectBed来限定各个引物-探针以及组合（其中探针在其靶标中重叠）的靶标区域。
变体比较.对于提取的变体的质量评估，将NA18507数据的变体读出与从全基因组序列分析3中鉴定出的变体和Hapmap基因分型数据(www.hapmap.org)的读出进行了比较。使用perl脚本进行了OS-Seq数据和Affymetrix SNP6.0阵列数据的比较。将dbSNP131用于SNP注释。
另外的寡核苷酸序列
0)寡核苷酸
OS-Seq寡核苷酸：
5'                              -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAGACCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'（通用捕获寡核苷酸，N=唯一性40-mer序列；SEQ ID NO:37）
Ad_top_FC_capture_A_tail：
5'-CGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID NO:38)
Ad_bot_FC_capture_A_tail：
5'-GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3'(SEQ ID NO:39)
流通池引物‘C’：
5’-PS-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3’（U=2-脱氧尿苷）(SEQ ID NO:40)
流通池引物‘D’：
5’-PS-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGoxoAT-3’（Goxo=8-氧桥鸟嘌呤）(SEQ ID NO:41)
测序引物1：
5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ IDNO:42)
测序引物2：
5’-CGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO:43)
1)流通池修饰
退火
3'-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'（OS-Seq寡核苷酸）(SEQ IDNO:44)
FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3’（流通池引物‘D’）(SEQ ID NO:45)
延伸
3'-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'（OS-Seq寡核苷酸）(SEQ IDNO:46)
FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'（引物-探针）(SEQ ID NO:47)
变性
FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'（引物-探针）(SEQ ID NO:48)
2)文库制备
片段化、末端修复
5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'（基因组DNA）
3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'（基因组DNA）
A加尾
5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNA-3'（A加尾后的基因组DNA）
3'-ANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'（A加尾后的基因组DNA）
衔接子连接
OS-Seq dsAdapter
5'                                 -GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3'(Ad_bot_FC_capture_A_tail)(SEQ ID NO:49)
3'-TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC-5'(Ad_top_FC_capture_A_tail)(SEQ ID NO:50)
OS-Seq dsAd文库（这是OS-Seq-衔接子文库的结构，N=通过片段化限定的随机基因组DNA序列）
5'-CGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3'(SEQ ID NO:51)
3'-GCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC-5'(SEQ ID NO:52)
文库PCR
OS-Seq衔接子文库扩增（Ad_top_FC_capture_A_tail，将单引物PCR用于扩增衔接子文库）
5'-CGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(Ad_top_FC_capture_A_tail)(SEQ ID NO:53)
3'-GCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC-5'（OS-Seq文库片段）(SEQ IDNO:54)
5'-CGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3'（OS-Seq文库片段）(SEQ IDNO:55)
3'-TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC-5'(Ad_top_FC_capture_A_tail)(SEQ ID NO:56)
5'                                 -CGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3'（OS-Seq文库片段，扩增的）(SEQ ID NO:57)
3'                                -GCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC-5'（OS-Seq文库片段，扩增的）(SEQ ID NO:58)
3)捕获
退火
OS-Seq衔接子文库退火（N=40-mer特异性捕获位点）
3'-GCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAgenomicdna(SEQ ID NO:59)
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC-5'（OS-Seq文库片段，扩增的）(SEQ ID NO:60)
FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'         （引物-探针）(SEQ ID NO:61)
延伸
OS-Seq捕获
3'-GCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAgenomicdna(SEQ ID NO:62)
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC-5'（OS-Seq文库片段，扩增的）(SEQ ID NO:63)
FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3'（捕获的DNA）(SEQ IDNO:64)
变性
OS-Seq文库
FC                                -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3'（捕获的DNA）(SEQ IDNO:65)
4)衔接子敲定
40℃杂交
OS-Seq_Library（在OS-Seq衔接子和寡核苷酸C之间存在12-mer同源性）
FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3'（捕获的DNA）(SEQ ID NO:66)
3'-CACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FC（寡核苷酸'C'）(SEQ ID NO:67)
延伸
FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3'（敲定的DNA）(SEQ ID NO:68)
3'                                 -GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FC（敲定的DNA）(SEQ ID NO:69)
变性
FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3'（敲定的DNA）(SEQ ID NO:70)
3'-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FC（敲定的DNA）(SEQ ID NO:71)
5)簇生成
退火
FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3'（敲定的DNA）(SEQ ID NO:72)
3'-CACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FC（寡核苷酸'C'）(SEQ ID NO:73)
FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3’(SEQ ID NO:74)（寡核苷酸'D'）
3'-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FC（敲定的DNA）(SEQ ID NO:75)
延伸
FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3'（敲定的DNA）(SEQ ID NO:76)
3'-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FC（敲定的DNA）(SEQ ID NO:77)
变性
FC                                -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3'（集簇性DNA）(SEQ ID NO:78)
3'                                 -GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FC（集簇性DNA）(SEQ ID NO:79)
6)测序
FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3'（集簇性DNA）(SEQ ID NO:80)
3'-                         <----TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACA-5'（测序引物1）(SEQ ID NO:81)
5'-CGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT---->（测序引物2）(SEQ ID NO:82)
3'-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FC（集簇性DNA）(SEQ ID NO:83)
结果
本部分描述用于称为寡核苷酸选择性测序(OS-Seq)的靶向重测序的新方法，该方法解决了在靶向重测序方法中所见的许多限制。在概念上不同于其他方法，OS-Seq是一种集成的方法，其中基因组靶标的捕获和测序均在NGS固相载体上进行，诸如Illumina流通池上（图1a）。对于OS-Seq的制备，从基因组DNA制备单衔接子测序文库，并合成靶标特异性寡核苷酸然后用于在流通池上构建引物-探针。然后，将流通池上的固定的引物-探针用于从单衔接子基因组DNA文库捕获单分子靶标。
OS-Seq的处理涉及三个步骤，其中对Illumina测序系统进行改良以包含靶标特异性引物-探针，从单衔接子文库捕获靶标，以及敲定固定的片段用于测序（图1b）。为了制备捕获基底，我们通过将现有引物苔的子集修饰成变为靶标特异性引物-探针而在分子水平上对Illumina流通池进行重构。为了创建这些引物-探针，我们将寡核苷酸复合库的3’通用序列在流通池上杂交到其互补序列，并使用DNA聚合酶延伸反应使固定的引物延伸。结果为一套随机设置的、靶标特异性引物-探针，它们固定在流通池表面上。在65℃的高热孵育过程中，引物-探针特异性杂交到单衔接子基因组DNA文库内的靶标互补序列；杂交后，引物-探针然后作为另一DNA聚合酶延伸反应的引物。延伸步骤有效地捕获靶标序列。延伸后，执行变性步骤，然后在40℃低热杂交，以在流通池上使测序文库衔接子稳定到其互补序列上，其形成桥联结构。第三DNA聚合酶延伸反应将另外的序列结合到3’末端，从而形成能够固相扩增的两个分子。在OS-Seq特有的三个步骤后，将捕获的分子进行桥式扩增、处理以及使用Illumina NGS系统的标准测序方案进行测序。OS-Seq中的分子生物学步骤的详细说明在上文给出，相应地对用于OS-Seq的Illumina簇生成工作站应用程序进行修改。
作为概念验证展示，开发了两种捕获测定法。首先，设计了位于10个癌基因的外显子侧翼的366个OS-Seq引物-探针(OS-Seq-366)（图3）。该测定法旨在测试OS-Seq方法，不是针对确定的外显子覆盖度。我们使用基于柱的方法合成了OS-Seq-366寡核苷酸。其次，为了证实可扩展性，我们设计并合成了11,742个引物-探针以捕获344个癌基因的外显子(OS-Seq-11k)。这些引物-探针避免了重复，并在整个大外显子上拼接以实现改善的外显子覆盖度。对于OS-Seq-11k的高通量产生，我们在可编程微阵列上合成了寡核苷酸。这些阵列合成的寡核苷酸需要扩增以进行处理以及以获得用于OS-Seq的足量材料（图4）。处理后，OS-Seq寡核苷酸包含与靶向区域的5’末端互补的靶标特异性40-mer（图5）。这些寡核苷酸还包含退火双端测序引物以及杂交到流通池上的固定引物苔所需的序列。
为了评估OS-Seq-366和OS-Seq11k测定法的捕获性能，制备了得自之前已测序的约鲁巴人个体的DNA(NA18507)。通过所有靶向测定法进行双端测序。第一读取(Read1)来源于靶向基因组DNA，而第二读取(Read2)则来自合成的靶标特异性引物-探针（图1a）。使OS-Seq-366在GAIIx运行的单通道上运行。基于我们的索引机制，OS-Seq-11k的每个样品相当于在1.3个通道上运行。我们使用衔接子开发了索引机制，通过唯一性条形码序列（图5c）标记样品。条形码源于Read1的前七个碱基。总体而言，87.6%的OS-Seq-366读取和91.3%的OS-Seq-11k读取（包含合适的条形码）映射到人基因组参考（表1）。相比之下，使用之前报告的杂交体筛选方法得出的读取的58%可映射到人基因组参考。
Figure BDA00003232996600401
Figure BDA00003232996600411
为了评估各引物-探针的总体覆盖度，我们测定了源于落在引物-探针3’末端的1kb内的Read1数据的读取数。OS-Seq引物-探针为链特异性的并且只捕获DNA靶标的5’末端（图6）。例如，OS-Seq-366中所有引物-探针的中位覆盖度特征图（图1a）展示了如何捕获直至引物-探针下游1kb的序列。一般来讲，检测到了偏向较小的插入物大小，对于OS-Seq-366，50%的靶向读取映射在引物-探针的283个碱基内。在两种测定法中，均鉴定出了超过1kb间隔并远至1.7kb的另外读取。超过1kb的序列读取代表从任何给定引物-探针的捕获分布的尾端，并小于OS-Seq-366和OS-Seq-11k总体序列数据的0.15%。还观察到，覆盖度分布的特性与文库创建过程中引入的片段大小相关联，并来自桥联形成和固相PCR固有的大小限制（图6）。另外，引入较高摩尔浓度的单衔接子文库、测序另外的通道或使用较长的读取可增加沿着靶标的覆盖度。
将中靶读取定义为映射在引物-探针1kb内的Read1序列。使用这些中靶覆盖度标准，OS-Seq-366中40个碱基读取的86.9%以及OS-Seq-11k中53个碱基读取的93.3%为中靶（表1）。鉴于对细化引物-探针的电子设计作出的努力，OS-Seq-11k显示了改善的特异性。具体地讲，对于电子引物-探针筛选中的OS-Seq-11k，使用了重复掩蔽过滤器，这导致了更少的脱靶读取。相比之下，在已公布的杂交体筛选方法中，76个碱基读取的89%和36个碱基读取的50%映射在探针附近，从而表明方法之间相似的中靶特异性，并且存在移向更长的读取可改善OS-Seq中靶特异性的倾向。OS-Seq的中外显子(on-exon)特异性也类似于已公布的杂交体筛选方法。使用OS-Seq-11K，我们观察到42.7%的读取映射在外显子内（表1），而杂交体筛选捕获技术报告了42%的读取映射到外显子。
作为典型基因覆盖度特征图的实例，我们在图1c中展示了KRAS基因的捕获序列数据。以相对于脱靶相邻区域的高倍数覆盖度对外显子靶标测序。如之前所述，OS-Seq-366经设计为位于外显子侧翼，并且不在整个大区域上拼接。外显子的平均倍数覆盖度见表1，覆盖度分类的详细分解（即，10X、20X）见表2。总体而言，OS-Seq-366中外显子碱基的83.9%被至少一个读取覆盖，而剩余的一部分在本试验测定中有意不靶向。相似地，在用OS-Seq-11k分析的三个样品中，94%至95.6%的外显子碱基被至少一个读取覆盖。与OS-Seq-366相比，OS-Seq-11k测定法显示了外显子上增加的序列覆盖度，因为引物-探针设计相对于OS-Seq-366设计作出了改进，具体地讲，OS-Seq-11k设计在大于500个碱基的整个外显子上拼接引物-探针。
还通过以下方式评价了测定法的靶标筛选均一性：将Read1数据按其相关引物-探针分箱(binning)，并对与其靶标对齐的读取计数。将OS-Seq引物-探针基于观测到的捕获产率分选，OS-Seq-366和OS-Seq-11k内的分布以重叠方式显示在图1d中。在OS-Seq-366中，据观察，100%的引物-探针具有一个序列读取的最低产率，引物-探针89.6%的产率在10倍范围内。相似地，对于OS-Seq-11k，95.7%的引物-探针具有一个序列读取的最低捕获产率，54%的引物-探针具有在10倍范围内的产率。将OS-Seq-366寡核苷酸进行柱合成并在混合前单独定量，这确保了每个靶标特异性序列在引物-探针构建步骤中处于等摩尔浓度。OS-Seq-11k的引物-探针产率的较大变化最可能归因于：在用于引物-探针创建的微阵列合成的寡核苷酸的PCR期间引入的扩增偏倚。
通过比较OS-Seq-11k测定法中个体引物-探针的序列产率，评价了OS-Seq的技术重现性（图7）。混合多重文库（NA18507、正常和肿瘤），在两个独立的Illumina GAIIx通道上进行了捕获和测序。在技术平行样之间比较了各个体引物-探针的序列产率，并计算了相关系数：R2=0.986。对于生物学重现性的评价，在同一通道中运行了两个不同的多重测序文库。生物学平行样的相关系数为R2=0.90。OS-Seq的高重现性可能与以下方面相关：使用NGS系统的固有自动化、在单个反应体积中执行捕获和测序步骤的能力以及不必应用捕获后PCR。
为了评估OS-Seq-366和OS-Seq-11k测定法的变体读出性能，进行了对NA18507（已接受了全基因组测序分析的约鲁巴人个体）的靶向测序分析。对于使用OS-Seq测定法的SNV读出，我们只分析了基因型质量评分大于50并且覆盖度最少10倍的中靶位置（表1）。对于OS-Seq-366和OS-Seq-11k数据，分别总共有191kb和1,541kb满足这些标准。从这些高质量靶向位置中，我们从OS-Seq-336读出了105个SNV并从OS-Seq-11k读出了985个SNV（表1）。我们提取了已公布的NA18507SNV和存在于这些相同高质量区域中的其他报告的SNP。相比之下，之前已报告了97%的OS-Seq-366和95.7%的OS-Seq-11k（表1）。对于OS-Seq-366和OS-Seq-11k，基于报告的SNP，变体检测的灵敏度分别为0.97和0.95（下表3）。
表3
Figure BDA00003232996600441
还将OS-Seq-11k分析应用于来源于匹配的正常样品-结直肠癌肿瘤对的基因组DNA。使用NA18507分析的相同质量和覆盖度标准，从正常样品中鉴定出了871个SNV，从肿瘤中鉴定出了727个（表4）。为了比较，通过Affymetrix SNP6.0阵列对两个样品进行了基因分型。根据之前的分析，使用Affymetrix SNP6.0阵列和Birdseed算法的基因分型准确性很高，因为SNP的平均成功读出率为99.47%，读出的SNP与得自其他平台的HapMap基因型具有99.74%的一致性。在OS-Seq SNV与Affymetrix SNP的比较中，观察到正常样品99.8%以及肿瘤99.5%的高一致性。通过过滤正常的组织变体并考虑覆盖度大于40的新型癌特异性变体，鉴定并验证了清楚的SMAD4(S144*)致病无义突变。该基因通常在结直肠癌和结肠癌驱动基因中突变。
表4
调查了在OS-Seq-366和OS-Seq-11k测定法中个体引物-探针的捕获效率，并对各引物-探针的性能进行了评估。OS-Seq的独特特征在于捕获的基因组序列在双端测序时可与其相应的引物-探针匹配。Read1源于捕获的靶标的3’末端，而Read2始于OS-Seq引物-探针合成序列。因此，Read1始终代表捕获的基因组DNA序列，而Read2在功能上用作不同引物-探针的分子条形码。这使得能够鉴定介导靶向的精确OS-Seq引物探针，并有利于评估个体引物-探针的性能。例如，我们观察到了引物-探针GC含量与靶标序列产率之间的强势关系（数据未示出）。极低的GC（低于20%）或极高的GC含量（>70%）与引物-探针捕获其靶标序列的失败率升高相关（图8）。据信，直接评估捕获性能的能力将是有用的引物-探针质量控制措施。
开发了OS-Seq技术以实现简化和可高度扩展的靶向重测序。与测序前靶标富集的传统捕获方法不同，OS-Seq通过NGS系统固相载体上的杂交和筛选将靶标DNA的捕获和测序相集成。该原理验证研究表明，OS-Seq测定法以良好的均一性和高特异性有效并重现地捕获靶标基因组区域。NA18507参考基因组的变体分析证实了SNV测定的高特异性和低错误发现率。匹配的结直肠肿瘤和正常样品的靶向重测序证实了OS-Seq适用于癌基因组的高通量遗传分析。
OS-Seq技术使得能够创建定制的靶向重测序测定法。引物-探针寡核苷酸的设计和产生相对简单直接，只需使用平衡的GC和非重复序列即可筛选靶标区域。可编程的微阵列合成资源可用于大批地生成定制的和复杂的寡核苷酸文库。同样，传统的寡核苷酸合成方法也可用于创建针对较小靶基因集的定制测定法。虽然我们最大的靶向测定法覆盖了344个基因的外显子和相邻序列，但是我们相信OS-Seq可以显著放大到更大的靶标量。从OS-Seq-366数据中，我们估计在流通池内的杂交混合物中与靶标片段相比引物-探针过量超过2,000倍。在20小时的杂交过程中，我们估计文库内所有潜在靶标的4.9%被捕获可用于测序。我们还测试了寡核苷酸浓度可提高至少10倍并且测序文库的浓度可提高5倍（数据未示出），而不影响簇形成。
OS-Seq样品制备简单直接：其可以在一天内完成并且易于自动化（图9）。至于劳动力，使用OS-Seq优于执行鸟枪测序实验。由于残余的衔接子在捕获期间不杂交到流通池，因此OS-Seq文库可使用各种大小的DNA片段，而不必通过物理分离方法进行窄尺寸纯化。只需要将单个衔接子添加到基因组DNA片段的5’末端。单衔接子设计还可容易地适用于与分子条形码的引入建立索引。该功能允许直接进行测序测定法的样品多重化，并具有许多潜在的应用。例如，匹配的正常样品与肿瘤分析在同一捕获反应中发生，这可减少偏差。
鉴于对“个体化医学”的兴趣不断增加，明确需要开发快速简单的人类基因组重测序方法。这包括分析生殖系变体以及存在于癌基因组中的体细胞突变。作为靶向重测序的实用且高效的方法，OS-Seq通过使得能够进行候选基因的高通量分析以及临床可行靶标区域的鉴定而尤其可用于翻译研究和临床诊断。
对于上述方法，使用了Illumina基因组分析仪。然而，预计该系统将广泛适用于任何平行测序平台。
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Claims (22)

1.一种捕获和扩增所选序列的方法，所述方法包括：
a)获得包含第一群表面结合寡核苷酸和第二群表面结合寡核苷酸的基底，其中所述第一和第二群表面结合寡核苷酸的成员不在所述基底上空间寻址；
b)将所述第一群表面结合寡核苷酸的第一成员杂交到筛选寡核苷酸，所述筛选寡核苷酸包含与所述第一成员杂交的区域以及包含基因组序列的区域；
c)延伸所述第一群表面结合寡核苷酸的所述第一成员以产生载体结合筛选引物，所述载体结合筛选引物包含与所述基因组序列互补的序列；
d)将所述载体结合筛选引物杂交到包含所述基因组序列的核酸片段；
e)延伸所述载体结合筛选引物以产生包含位于所述基因组序列侧翼的序列的延伸产物；
f)使用所述第一和第二群表面结合寡核苷酸的未延伸成员在所述基底上扩增所述延伸产物，以产生PCR产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸片段为包含5’末端衔接子的衔接子连接基因组片段，其中所述延伸产生在其3’末端包含与所述衔接子互补的序列的延伸产物，并且其中所述第二群所述表面结合寡核苷酸的成员在所述桥式PCR期间杂交到与所述衔接子互补的所述序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述5’末端衔接子包含在所述末端连接到所述基因组片段的测序引物的结合位点。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在步骤e)与f)之间包括将衔接子连接到所述延伸引物的3’末端上，并且其中所述第二群表面结合寡核苷酸的成员在所述扩增期间杂交到所述衔接子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述衔接子包含在所述末端连接到所述核酸片段的测序引物的结合位点。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二群表面结合寡核苷酸通过以下方式制备：
i.将初始第二群表面结合寡核苷酸的成员杂交到一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与所述第二群表面结合寡核苷酸的成员杂交的区域以及与所述核酸片段的序列互补的区域；以及
ii.延伸所述初始第二群表面结合寡核苷酸的所述成员以产生所述第二群表面结合寡核苷酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述筛选寡核苷酸包含介于与所述第一成员杂交的所述区域与包含所述基因组序列的所述区域之间的测序引物的结合位点。
8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括对所述PCR产物的第一链测序，以获得位于所述基因组序列侧翼的所述序列的核苷酸序列的至少一部分。
9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括对所述PCR产物的第二链测序，以获得位于所述基因组序列侧翼的所述序列的核苷酸序列的至少一部分。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括使哺乳动物基因组片段化以产生片段化基因组，任选地将衔接子添加到所述片段化基因组，并将所述片段化基因组施加到所述基底。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述片段化以物理方式、化学方式或使用限制性酶完成。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述片段化通过声波或剪切完成。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述杂交通过以下方式完成：从多个不同的个体制备多个片段化基因组，混合所述多个片段化基因组以产生库，将片段化基因组的所述库施加到所述基底，以及获得包含位于所述不同个体中的所述基因组序列侧翼的序列的PCR产物。
14.根据权利要求13所述的方法，进一步包括对所述PCR产物的至少第一链测序，以获得位于所述不同个体中的所述基因组序列侧翼的所述序列的核苷酸序列的至少一部分。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，在混合前，将不同的衔接子连接到来自所述不同个体的所述片段化基因组，其中所述衔接子包含条形码序列，所述条形码序列允许在对所述PCR产物测序后鉴定所述衔接子连接的基因组片段的来源。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法包括：
使用包含第一条形码序列的第一衔接子用衔接子连接来自第一受试者的片段化基因组DNA以产生第一产物；
使用包含第二条形码序列的第二衔接子用衔接子连接来自第二受试者的片段化基因组DNA以产生第二产物；
将所述第一和第二产物合并以产生混合模板；以及
使用所述混合模板执行权利要求1所述的方法以提供各自包含所述条形码序列的第一和第二PCR产物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述混合模板包含来自至少1,000个受试者的片段化基因组DNA。
18.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：
i.将所述核酸片段连接到包含测序引物的位点以及与所述第二表面结合寡核苷酸相同的核苷酸序列的衔接子，
ii.将所述衔接子连接片段杂交到所述第一群表面结合寡核苷酸的第一成员，
iii.延伸所述衔接子连接片段所杂交到的所述第一群表面结合寡核苷酸的所述第一成员，以及
iv.将所述延伸产物的含所述衔接子的末端杂交到第二载体结合多核苷酸，从而产生桥并有利于桥式PCR。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二群表面结合寡核苷酸通过以下方式制备：将包含与所述核酸片段的序列互补的区域的寡核苷酸连接到初始第二群表面结合寡核苷酸，以产生所述第二群表面结合寡核苷酸。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增通过桥式PCR进行。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸片段为基因组片段或cDNA。
22.一种系统，所述系统包含：
a)包含第一群表面结合寡核苷酸和第二群表面结合寡核苷酸的基底，其中所述第一和第二群表面结合寡核苷酸不在所述基底上空间寻址；
b)包含与所述第一群的第一成员杂交的区域以及含基因组序列的区域的筛选寡核苷酸；
c)衔接子；以及
e)执行权利要求1所述的方法的说明。
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