CN112029841A - 定量端粒长度和基因组基序的方法 - Google Patents
定量端粒长度和基因组基序的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112029841A CN112029841A CN202010494147.6A CN202010494147A CN112029841A CN 112029841 A CN112029841 A CN 112029841A CN 202010494147 A CN202010494147 A CN 202010494147A CN 112029841 A CN112029841 A CN 112029841A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- sequence
- dna
- mip
- repeat
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 title claims abstract description 176
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 title claims abstract description 176
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 title claims abstract description 159
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 140
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 257
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 161
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 151
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 124
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 123
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 52
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims description 21
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims description 21
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 18
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 17
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 16
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 15
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 15
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 14
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 claims description 11
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 11
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 9
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 claims description 9
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 claims description 9
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims description 9
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims description 8
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 8
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 8
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 claims description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 8
- 108010063905 Ampligase Proteins 0.000 claims description 5
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 54
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 95
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 82
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 79
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 79
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 55
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 54
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 52
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 35
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 34
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 29
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 25
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 19
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- -1 for example Chemical class 0.000 description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 12
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 11
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 10
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 10
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 10
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 10
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 8
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 8
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 4
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 4
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 241000576133 Alphasatellites Species 0.000 description 2
- 101000651036 Arabidopsis thaliana Galactolipid galactosyltransferase SFR2, chloroplastic Proteins 0.000 description 2
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 2
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000666730 Homo sapiens T-complex protein 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101710151805 Mitochondrial intermediate peptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710151803 Mitochondrial intermediate peptidase 2 Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102100038410 T-complex protein 1 subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 2
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 2
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- CJWXCNXHAIFFMH-AVZHFPDBSA-N n-[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r)-2-acetamido-4,5,6-trihydroxy-1-oxohexan-3-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-4-yl]acetamide Chemical compound C[C@H]1O[C@@H](O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@@H]1O CJWXCNXHAIFFMH-AVZHFPDBSA-N 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 2
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N thioacetamide Natural products CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical group C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYYIULNRIVUMTQ-UHFFFAOYSA-N 6-chloroguanine Chemical compound NC1=NC(Cl)=C2N=CNC2=N1 RYYIULNRIVUMTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 101100519158 Arabidopsis thaliana PCR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000244186 Ascaris Species 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 208000001914 Fragile X syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000009015 Human TaqMan MicroRNA Assay kit Methods 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101710147059 Nicking endonuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 244000203593 Piper nigrum Species 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 102100029812 Protein S100-A12 Human genes 0.000 description 1
- 101710110949 Protein S100-A12 Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282458 Ursus sp. Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003260 anti-sepsis Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008049 biological aging Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- UHZZMRAGKVHANO-UHFFFAOYSA-M chlormequat chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCCl UHZZMRAGKVHANO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006999 cognitive decline Effects 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000002616 endonucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 235000021056 liquid food Nutrition 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- BOKOVLFWCAFYHP-UHFFFAOYSA-L methoxy-dioxido-sulfanylidene-$l^{5}-phosphane Chemical compound COP([O-])([O-])=S BOKOVLFWCAFYHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003499 nucleic acid array Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- MWWATHDPGQKSAR-UHFFFAOYSA-N propyne Chemical compound CC#C MWWATHDPGQKSAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000007841 sequencing by ligation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 235000021055 solid food Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N thiouracil Chemical compound O=C1C=CNC(=S)N1 ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了使用专门设计的分子倒置探针(MIP)和反应条件来评估基因组内串联重复序列例如端粒的大小的新型组合物和方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年6月3日提交的美国临时专利申请第62/856,449号的优先权，所述临时申请通过引用以其整体并入本文。
发明背景
分子倒置探针或MIP是单链DNA探针，其具有靶向(互补)靶模板的同一条链的5’和3’末端。在所有先前的应用中，MIP测定的原理利用通过模板依赖性连接事件形成环化产物，所述连接事件对样品中的模板序列具有特异性，并且用于查询样品的序列内容。为了去除非特异性MIP，在连接步骤之后，例如通过DNA消化酶如核酸外切酶I和核酸外切酶III的组合，去除所有非环状产物。
然而，经典的MIP探针及其使用方法(例如用于核酸检测和定量)不适合用于串联重复序列，例如端粒。设计用于经典MIP探针的测定是基于MIP的5’和3’末端与模板DNA上的特异性不变位点的杂交，其中5’和3’序列与模板DNA上的不同靶序列杂交。在经典的基于MIP的方法中，5’和3’末端在与同一模板结合时彼此紧邻，从而允许它们的直接连接和环化，或者被一个或多个核苷酸隔开，从而允许它们在3’末端延伸(也称为“缺口填充”)和随后的连接之后环化。在所有这些情况下，在检测和/或定量之前，这些反应的环化产物随后从线性的，即未连接的MIP和非环化的连接的MIP中分离。
因为针对串联重复序列的MIP的5’和3’末端将必然靶向相同的重复序列，所以这种探针不适于传统的基于MIP的方法，因为它们将允许MIP末端与给定重复阵列内的许多重复序列中的任一个杂乱结合，通过模板DNA内高度可变数量的插入核苷酸将5’和3’末端隔开并产生不同的产物集合。鉴于产物的这种多样性，以及基于经典的MIP的测定涉及在检测或定量之前去除所有线性产物的事实，当与串联重复序列一起使用时，经典的基于MIP的方法将导致高度不准确且不可靠的结果。因此，对于端粒长度或其它串联重复序列的长度的基于MIP的查询，之前尚未显示出成功。
测量端粒或其它可变长度的串联重复序列的长度的能力可用于许多目的，包括作为生物衰老的生物标志物。人类端粒由位于每个染色体末端的6-碱基对重复基序组成。细胞分裂时的端粒缩短，它们的损耗率可能受到疾病和健康状况的影响。例如，它们的缩短率可能受生活方式因素如饮食、吸烟、身体活动和饮酒以及压力和心理社会因素的影响(Epel等人,2004；Starkweather等人,2013)。因此，端粒长度的测量可以用于指示个体的生物学年龄和个体为了享受更好的健康可以进行的生活方式变化的类型。
已经开发了多种方法来测量端粒长度，但是每种方法均有其自身的局限性和限制的集合。例如，用于测量端粒长度的经典方法是端粒限制性片段测定(TRF；Kimura等人,2010)，其涉及限制性消化来自外周血白细胞的端粒，随后进行Southern印迹。然而，TRF不适于处理大的DNA样品规格(Samani等人,2001,Valdes等人,2005)，并且结果容易受到例如所使用的凝胶电泳的类型、可获得的DNA的量、图像捕获装置的质量以及用于分析的计算机软件的影响(Samani等人,2001,Valdes等人,2005)。
用于测量端粒长度的另一种方法是T/S测定，其基于实时定量PCR并且与参考样品比较。然而，研究已经显示最初提供的变异系数被低估，并且DNA的质量，使用的PCR机器和分析软件可以影响结果(Aubert等人,2012,Cunningham等人,2013,Nussey等人,2014)。已使用的其它测定包括定量荧光原位杂交(Q-FISH)和流式细胞术FISH(Flow-FISH)；这些方法可以允许高的精度水平，但局限性在于必须新鲜抽取分析的血样，这在例如流行病学研究方面是不切实际的。
因此，需要用于测量端粒或其它串联重复序列的长度的新的、可靠的方法，其可以大规模应用于例如流行病学研究中或日常医院实验室实践中。本发明解决了这些和其它需求。
发明概述
在一个方面，本发明提供了用于确定端粒长度和/或串联重复序列的拷贝数的单链DNA探针，其中所述探针包含：i)5’同源区，其延伸至所述探针的5'末端并且包含与所述串联重复序列互补的核苷酸序列；ii)接头区；和iii)3’同源区，其延伸至所述探针的3’末端并且包含与所述串联重复序列互补的核苷酸序列，使得所述5’同源区和3’同源区能够结合包含所述串联重复序列的模板DNA的同一条链；其中在5’同源区和3’同源区与模板DNA的同一条链结合时，使得3’同源区紧接模板上单个重复单元内5’同源区的3’，并且因此所述3’同源区的3’末端和所述5’同源区的5’末端被模板DNA上小于一个完整重复单元的核苷酸缺口隔开，所述小于一个完整重复单元的核苷酸缺口包含至多2种不同的碱基。
在本发明的一些实施方案中，串联重复序列为端粒序列。在一些实施方案中，所述端粒为人类端粒。在一些实施方案中，5’和3’同源区的核苷酸序列与串联重复序列100％互补。在一些实施方案中，5’和3’同源区的长度各自为15-25个核苷酸。在一些实施方案中，串联重复序列的每个重复单元的长度为2-10个核苷酸。在一些实施方案中，所述接头区包含一个或多个序列元件，其选自通用引物序列、探针特异性引物序列、TaqMan探针序列和标签序列。
在本发明的一些实施方案中，当结合在模板DNA上的单个重复单元内时，3’同源区的3’末端和5’同源区的5’末端被1个或2个核苷酸隔开。在一些实施方案中，1个或2个核苷酸包含碱基G。在一些实施方案中，当结合在模板DNA上的单个重复单元内时，3’同源区的3’末端和5’同源区的5’末端被3个核苷酸隔开。在一些实施方案中，3个核苷酸包含2种不同的碱基，并且其中2种不同的碱基为A和G。在一些实施方案中，5’同源区包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的核苷酸序列。在一些实施方案中，3’同源区包含SEQ ID NO:6-8中任一个的核苷酸序列。在一些实施方案中，探针包含SEQ ID NO:1-3中任一个的核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供了用于测定基因组内可变串联重复序列的拷贝数的试剂盒，其中所述试剂盒包含：如本文所述的第一单链DNA探针，其中所述第一DNA探针的5’和3’同源区与在基因组中的拷贝数在个体之间变化的串联重复序列互补；和如本文所述的第二单链DNA探针，其中所述第二DNA探针的5’和3’同源区与在基因组中的拷贝数在个体之间稳定的串联重复序列互补；其中所述第一探针的核苷酸缺口所包含的至多两种碱基也被所述第二探针的核苷酸缺口所包含。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含反应混合物，其包含DNA聚合酶，包含连接酶活性的酶以及对应于第一和第二探针的核苷酸缺口所包含的至多两种碱基的脱氧核糖核苷三磷酸。在一些实施方案中，DNA聚合酶为T4 DNA聚合酶。在一些实施方案中，连接酶活性由Amp连接酶提供。在一些实施方案中，反应混合物不包含核酸外切酶。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含测试样品基因组DNA。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含与第一和/或第二探针的接头区内的序列互补的通用引物、两种或更多种探针特异性引物和/或两种或更多种TaqMan探针。
在本发明试剂盒的一些实施方案中，由第一探针的5’和3’同源区识别的串联重复序列为端粒序列。在一些实施方案中，端粒为人类端粒。在一些实施方案中，由第二探针的5’和3’同源区识别的串联重复序列为4bp的短串联重复。在一些实施方案中，第一探针的5’和3’同源区的核苷酸序列与在基因组中的拷贝数在个体之间变化的串联重复序列100％互补。在一些实施方案中，第二探针的5’和3’同源区的核苷酸序列与在基因组中的拷贝数在个体之间稳定的串联重复序列100％互补。在一些实施方案中，第一和/或第二探针的5’和/或3’同源区的长度为15至25个核苷酸。在一些实施方案中，由第一和/或第二探针识别的串联重复序列的重复单元的长度为3-6个核苷酸。
在另一方面，本发明提供了测定个体基因组中可变长度的串联重复序列区的长度的方法，其中所述方法包括：i)提供如本文所述的第一单链DNA探针，其中所述第一DNA探针的5’和3’同源区与在基因组中的拷贝数在个体之间变化的串联重复序列互补；和ii)提供如本文所述的第二单链DNA探针，其中第二DNA探针的5’和3’同源区与在基因组中的拷贝数在个体之间稳定的串联重复序列互补；其中第一探针的核苷酸缺口所包含的至多两种碱基也被第二探针的核苷酸缺口所包含；iii)在有助于所述探针的3’末端的延伸和与结合至同一模板的探针的5’末端连接的条件下，在DNA聚合酶、连接酶活性和对应于第一和第二探针的核苷酸缺口所包含的碱基的至多两种脱氧核糖核苷三磷酸的存在下，使来自个体的生物样品与第一和第二探针接触；iv)定量在步骤iii)中产生的第一和/或第二探针的环化和连接的线性探针产物；以及v)使用第一和/或第二探针的环化和连接的线性探针产物的相对量来确定第一和/或第二探针的连接点的归一化丰度，其是对应于个体基因组中探针的串联重复长度的指标。
在本发明方法的一些实施方案中，第一和第二探针的5’和3’同源区的核苷酸序列分别与第一和第二串联重复序列100％互补。在一些实施方案中，探针的5’和3’同源区的长度为15-25个核苷酸。在一些实施方案中，可变串联重复序列区为端粒。在一些实施方案中，端粒为人类端粒。在一些实施方案中，每个探针的接头区包含一个或多个序列元件，其选自通用引物序列、探针特异性引物序列、TaqMan探针序列和标签序列。在一些实施方案中，当结合在串联重复序列上的单个重复单元内时，探针的3’同源区的3’末端和5’同源区的5’末端被1个或2个核苷酸的缺口隔开，其中所述1个或2个核苷酸包含单一碱基，并且其中在步骤iii)中仅提供对应于所述单一碱基的一个脱氧核糖核苷三磷酸。在一些实施方案中，单一碱基为G。在一些实施方案中，当结合在串联重复序列上的单个重复单元内时，步骤i)中的探针或步骤ii)中的探针的3’同源区的3’末端和5’同源区的5’末端被3个核苷酸的缺口隔开，其中所述3个核苷酸包含2种碱基，并且其中在步骤iii)中提供了对应于2种碱基的两种脱氧核糖核苷三磷酸。在一些实施方案中，2种碱基为A和G。
在本发明方法的一些实施方案中，步骤i)中的探针的5’同源区包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的核苷酸序列。在一些实施方案中，步骤i)中的探针的3’同源区包含SEQ IDNO:6-8中任一个的核苷酸序列。在一些实施方案中，步骤i)中的探针包含SEQ ID NO:1-3中任一个的核苷酸序列。在一些实施方案中，相对于生物样品中基因组DNA的量，提供了大量过量的步骤i)和ii)中的探针。在一些实施方案中，在步骤i)至v)期间不添加核酸外切酶。在一些实施方案中，在步骤i)至v)期间添加的唯一核酸外切酶为核酸外切酶I，并且其中核酸外切酶I的水平不超过20个单位/50ng基因组DNA并且存在最多1小时。在一些实施方案中，使用选自定量PCR、数字PCR和测序的方法测定探针的环化和连接的线性探针产物的量。在一些实施方案中，仅使用第一单链探针，而另一种方法用于定量输入样品DNA的量。
附图简述
图1A-1C.在常规MIP测定中形成环化的MIP产物以及在本发明中使用的新的连接的和线性的MIP(LL-MIP)产物。图1A显示了常规MIP测定中的简单的环化MIP。图1B显示了其它类型的连接产物LL-MIP。图1C显示了克隆PCR产物后的示例性LL-MIP产物的序列，其显示了在该LL-MIP中将6个MIP探针连接在一起。
图2.连接点的数目代表端粒长度或基因组基序数目的原理。连接点的丰度是表示端粒长度的指标。
图3.显示PCR后LL-MIP产物的凝胶。泳道1、3、4、5显示了～100bp(MIP的长度)倍数的条带。左边的大小标志物显示了100bp的间隔。
图4.现有的MIP测定和本发明中测定端粒长度的方法的比较。
图5.通过TRF测定测量的报道的端粒长度(kbp)与代表端粒基序的连接点相对于参考样品的丰度比率之间的相关性，所述比率由Δ-ΔCt值确定。
图6.显示了本发明的方法对加入的DNA模板的量具有成比例的响应(线性)的实例和数据。
图7.在效率(斜率)校正的Δ-ΔCt定量中使用的实例和数据。该Δ-ΔCt值可以用作端粒长度的另一种测量。在该实例中，在杂交反应中使用短的MIP。
图8.用于在杂交和连接反应后定量连接点的示意性工作流程。每个连接点代表靶串联重复的长度单位。使用例如qPCR的方法来定量连接点的丰度。然后可以将归一化丰度用作串联重复长度的生物标志物。还可以使用诸如实施例和图5中示出的回归方程，通过校准的样品，将其转换为长度单位(例如，在端粒的情况下，为kbp)。
图9.端粒长度的指标值不受用于杂交的不同起始DNA量的影响。
图10.将从本发明方法获得的指标值校准至TL(以kbp为单位)
图11.用于定量2种MIP的连接点的ddPCR的二维聚类图，其中通道1荧光(FAM，端粒连接点)相对通道2(HEX,α卫星连接点)作图。
发明详述
1.引言
本发明提供了通过定量样品中相应重复基序的丰度来确定串联重复长度的方法和组合物。本文感兴趣的一种特定类型的串联重复为端粒。所述方法和组合物涉及使用专门设计用于串联重复序列的分子倒置探针(MIP)。
本发明的方法和组合物提供了MIP，其专门设计用于基因组中的含串联重复的区域，并且利用了在这样的区域上基于MIP的测定中产生的连接产物的多样性，包括环化和连接的线性产物。所述方法对环化和连接的线性产物进行定量，以允许可靠和快速地评估在个体之间变化的串联重复序列(如端粒序列)的拷贝数。特别地，在优选的方法中，本发明涉及针对串联重复序列的MIP的使用，其中MIP的5’和3’末端包含相同的序列，其中当结合在模板DNA上的单个重复单元内时，它们通常与模板DNA序列100％互补，并且其中它们被设计成能够结合在MIP的3’和5’末端之间具有少量核苷酸的小缺口(例如，1-3个核苷酸)的模板DNA链。此外，本发明MIP的3’和5’末端之间的缺口通常仅包含1个或2个不同的核苷酸，允许在所述方法中使用一个或两个dNTP，并且从而确保末端的连接只能发生在串联重复的单个重复单元内，而不能跨越多个重复。在优选的实施方案中，所述方法省略了在检测和/或定量之前的去除线性产物的步骤，例如基于核酸外切酶的步骤，而是定量环化和连接的线性产物的连接点以确定样品中特定重复基序的丰度作为端粒长度或另一基因组基序的长度的指标参数。
2.定义
如本文所用，关于例如多核苷酸的大小、同源性百分比或任何其它定量测量的术语“约”意指在所提供的值中可能有小程度的变化。例如，“约”意指该值可以与所述值相差例如+/-1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸类似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸类似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选择的(或所有的)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
“分子倒置探针”(MIP)为核酸探针，其与感兴趣的靶核酸的互补序列杂交，其中MIP 5’末端从MIP 3’末端与靶标杂交的位置与靶标上的5’杂交，即此时5’和3’末端在单个重复内相邻结合。当与靶标杂交时，MIP形成从一端到另一端的回环，使得末端相对于彼此“倒置”，即3’末端位于MIP的5’末端的5’。位于MIP两端的MIP序列被配置成与靶序列杂交，并且在本文中被称为5’和3’同源区。在5’和3’同源区之间是接头区，其基本上不与靶DNA序列互补，因此不与模板DNA杂交，并且其含有一个或多个功能元件，如引物结合位点、标签序列等。通常，MIP需要5’磷酸化以使连接进行。
本文使用的“环化”是指将核酸的3’末端与核酸的5’末端连接，从而产生连续的未切割环状物或环。“连接的线性MIP”或“LL-MIP”或“连接的线性探针”是指两个或更多个彼此连接的MIP，即一个MIP的3’末端已经延伸(通过“缺口填充”)并连接到与同一DNA模板相邻结合(例如，就在模板上单个重复单元内3’)的不同MIP的5’末端。
本文使用的术语“互补的”是指核苷酸或核酸之间的杂交或Watson-Crick碱基配对，诸如例如双链DNA分子的两条链之间或者寡核苷酸引物与待测序或扩增的单链核酸上的引物结合位点之间的杂交或Watson-Crick碱基配对。互补核苷酸通常是A和T(或A和U)，或者C和G。当经过最佳比对和比较并且具有适当的核苷酸插入或缺失的一条链的核苷酸与另一条链的核苷酸至少约80％，通常至少约90％至95％，并且更优选约98至100％配对时，认为两个单链RNA或DNA分子是互补的。可选地，当RNA或DNA链在选择性杂交条件下与其互补物杂交时，存在互补性。通常，当在至少14至25个核苷酸的一段上有至少约65％的互补性，优选至少约75％，更优选至少约90％的互补性时，将发生选择性杂交。参见M.KanehisaNucleic Acids Res.12:203(1984)。通常，对于MIP的同源区，与感兴趣的靶核酸具有100％的互补性，尽管在某些实施方案中可能包括错配。
“缺口填充”是本文所述的反应，其中通过与互补靶核酸杂交的分子倒置探针的5’和3’末端之间的聚合酶作用填充缺口。缺口填充在本文中也称为结合MIP探针的3’末端的“延伸”，其中延伸覆盖缺口并允许延伸的3’末端和结合的5’端之间的连接。在优选的实施方案中，填充的缺口由1-3个核苷酸组成或被限制在单个重复基序单元内。
本文使用的“同源区”，例如“3’同源区”或“5’同源区”是分子倒置探针中与感兴趣的靶核酸互补的那些部分。MIP通常具有两个同源区(HR)，一个在探针的5’末端或附近，并且一个在3’末端或附近。在优选的实施方案中，本发明的HR适合于能够与感兴趣的含有串联重复的靶核酸杂交，从而使它们被靶DNA序列上的单个重复单元内的1-3个核苷酸的缺口隔开。在优选的实施方案中，同源区与靶序列100％互补，但在一些实施方案中，可以在给定同源区中存在错配，例如1个、2个、3个或更多个错配。
本文使用的术语“杂交”是指这样的过程，其中两个单链多核苷酸非共价地结合以形成稳定的双链多核苷酸；三链杂交在理论上也是可能的。所得(通常)双链多核苷酸为“杂交体”。杂交通常在严格条件下，例如，盐浓度不超过约1M并且温度为至少25℃进行。杂交可以在试剂如约0.1mg/ml的鲱鱼精DNA或约0.5mg/ml的(乙酰化的)BSA存在下进行。由于其它因素可能影响杂交的严格性，包括碱基组成和互补链的长度，参数的组合比单独的任何一个的绝对测量更重要。可以在例如Michael R.Green&Joseph Sambrook,MolecularCloning:A Laboratory Manual,(第4版，2012)中找到适用于各种测定的杂交条件的另外的指导。
“聚合酶链式反应”或“PCR”意指通过DNA互补链的同时引物延伸体外扩增特定DNA序列的反应，这在本领域是众所周知的。PCR是用于制备侧翼连接有引物结合位点的靶核酸的多拷贝或复制物的反应，这样的反应包括以下步骤的一次或多次重复：(i)使靶核酸变性，(ii)将引物退火至引物结合位点，和(iii)在三磷酸核苷的存在下通过核酸聚合酶延伸引物。通常，反应在热循环仪中通过针对每个步骤优化的不同温度进行循环。特定的温度、每个步骤的持续时间和步骤之间的变化率取决于本领域普通技术人员众所周知的许多因素，例如参考文献：McPherson等人编辑,PCR:A Practical Approach and PCR2:APractical Approach(IRL Press,Oxford,分别为1991年和1995年)所例示的。例如，在使用Taq DNA聚合酶的常规PCR中，双链靶核酸可以在>90℃的温度下变性，引物在50-75℃范围的温度下退火，以及引物在72-78℃范围的温度下延伸。术语“PCR”涵盖反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR等。“多重PCR”意指其中多个靶序列(或单个靶序列和一个或多个参考序列)在相同的反应混合物中同时进行的PCR，例如Bernard等人,Anal.Biochem.,273:221-228(1999)(双色实时PCR)。通常，对于每个被扩增的序列使用不同的引物组。“定量PCR”或“qPCR”意指设计用于测量样品或样本中一个或多个特定靶序列的丰度的PCR。定量PCR包括这种靶序列的绝对定量和相对定量。使用一个或多个参考序列进行定量测量，所述参考序列可以与靶序列分开测定或一起测定。对于样品或样本，参考序列可以是内源性的或外源性的，在后一种情况下，参考序列可以包括一个或多个竞争模板。典型的内源性参考序列包括以下基因的转录物的区段：β-肌动蛋白、GAPDH、β2-微球蛋白、核糖体RNA等。定量PCR的技术是本领域普通技术人员众所周知的，如以下参考文献中所例示的：Freeman等人,Biotechniques,26:112-126(1999)；Becker-Andre等人,Nucleic Acids Research,17:9437-9447(1989)；Zimmerman等人,Biotechniques,21:268-279(1996)；Diviacco等人,Gene,122:3013-3020(1992)；Becker-Andre等人,NucleicAcids Research,17:9437-9446(1989)。
本文使用的术语“引物”是指单链寡核苷酸，其能够在合适的条件(例如缓冲液和温度)下，在四种不同的三磷酸核苷和聚合试剂(例如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶)的存在下，作为模板指导的DNA合成的起始点。在任何给定的情况下，引物的长度取决于例如引物的预期用途，并且通常在15至30个核苷酸的范围。短的引物分子通常需要较冷的温度以与模板形成足够稳定的特异性杂交复合物。引物不需要反映模板的确切序列，但必须足够互补以与这样的模板杂交。引物位点为与引物杂交的模板区域。引物对为一组引物，包括与待扩增序列的5’末端杂交的5’上游引物和与待扩增序列的3’末端的互补物杂交的3’下游引物。
“样品”意指来自寻求靶核酸的检测或测量的生物、环境、医学、动物、细菌、植物或患者来源的一定量的材料。通常，样品是细胞的有机体组织的裂解物。通常，本发明上下文中的样品包括含有核酸的材料。生物样品可以是包括人在内的动物流体、固体(例如粪便)或组织，以及液体和固体食物及饲养产品和成分(如乳制品、蔬菜、肉和肉副产品)和废物。生物样品可以包括取自患者的材料，包括但不限于培养物、血液、唾液、脑脊液、胸膜液、乳汁、淋巴、痰、精液、针吸出物等。生物样品可以获自家畜的所有不同家族以及野化或野生动物，包括但不限于诸如有蹄类动物、熊、鱼、啮齿动物等的动物。生物样品也可以获自植物，如玉米、稻、小麦、莴苣和胡椒。
本文使用的术语“感兴趣的靶核酸”是指推定包括感兴趣的靶序列，例如含串联重复的区域，如端粒或基因组的含ATGG的区域的样品核酸。关于MIP，感兴趣的靶序列包括与MIP同源区互补的那些序列。
串联重复是指核苷酸序列，在所述核苷酸序列中，2-60个核苷酸长的短核苷酸序列单元重复多次，其中重复单元彼此直接相邻。每个重复单元的确切核苷酸序列被称为重复基序。重复基序(在本文中也被称为重复单元)的常见实例包括[CA]、[CAG]、[GATA]等。根据重复基序的长度，将串联重复分类为微卫星和小卫星。通常，微卫星的重复基序单元短且小于10个核苷酸。二核苷酸重复(例如[CA]n重复)是人类基因组中最有名的微卫星或短串联重复之一。小卫星中重复基序的长度范围为10至60个核苷酸。作为一个实例，人类端粒中的重复基序[TTAGGG]可以在每个染色体末端的端粒内重复成百上千次。因此，[TTAGGG]是对人类端粒重复特异的序列基序，并且[TTAGGG]n用于表示端粒中基序的重复性质。应理解，串联重复序列可以指含有串联重复的DNA的一条链或两条链。串联重复在基因组中可以是变化的，如在端粒的情况下，这意味着重复单元的数目、或拷贝数、或携带重复的基因组区域的总大小可以在个体之间、或者个体中的不同细胞或细胞类型之间以任何程度变化，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10倍或更高。串联重复在基因组中也可以是“稳定的”或相对“恒定的”，如例如在ATGG重复的情况下，这意味着重复单元的数目、或拷贝数、或携带重复的基因组区域的总大小的变化在个体之间、或者个体中的不同细胞或细胞类型之间不超过例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％或更多。
“杂交条件”为预期导致互补序列之间特异性杂交的条件，例如，关于完全匹配的互补靶标，当测试核酸也与探针至少50％杂交(例如，在相同的杂交条件下定量)时，即，在完全匹配的探针以与针对与任何未匹配的靶核酸杂交所观察到的信噪比高至少约5x-10x的信噪比结合完全匹配的互补靶标的条件下，至少为探针与靶标杂交的一半的信噪比，则认为测试核酸与探针核酸特异性杂交。
如本文所用，在描述两个或更多个多核苷酸序列的上下文中，术语“相同的”或“同一性百分比”是指两个或更多个相同的序列或指定的子序列。当在比较窗口或指定区域中比较和比对最大对应性时，“基本上相同的”两个序列具有至少60％的同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的同一性，如使用序列比较算法或通过手动比对和目测(如果未指定特定区域)所测量的。关于多核苷酸序列，该定义还指测试序列的互补物。
对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，将测试序列与该参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数，或者可以指定可选的参数。然后序列比较算法基于程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。对于核酸和蛋白质的序列比较，使用以下讨论的BLAST 2.0算法和默认参数。
本文使用的“比较窗口”包括提及的选自20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150个的连续位置数目中的任一个的片段，其中在将两个序列最佳比对后，可以将序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。
用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法为BLAST 2.0算法，其描述于Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。用于进行BLAST分析的软件可在国家生物技术信息中心网站(National Center for Biotechnology Information website,ncbi.nlm.nih.gov)公开获得。该算法涉及首先通过鉴定问询序列中的长度W的短字符来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字符比对时，所述短字符能匹配或满足一定的正值阈值得分T。T被称为邻近字符得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻近字符命中作为种子，用于起始搜索以找到含有它们的较长的HSP。然后沿着每个序列在两个方向延伸字符命中，直到能增加累积比对得分。对于核苷酸序列，利用参数M(匹配残基对的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当出现以下情形时，终止每个方向上字符命中的延伸：累积比对得分从其最大实现值掉落X的量；由于累积一个或多个负评分的残基比对而使累积得分达到0或低于0；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用：字长(W)为28、预期值(E)为10、M＝1、N＝-2以及两条链比较(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一个相似性的量度是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。
3.串联重复靶向分子倒置探针
本发明的MIP为单链DNA探针，其包含三个区域：位于MIP的5’部分的5’同源区，位于MIP的3’部分的3’同源区以及位于5’和3’同源区之间的中心接头区。如下文更详细描述的，5’和3’同源区被设计成与包含串联重复序列的模板DNA的同一条链同源，使得3’末端能够与5’末端相邻的模板(即就在模板DNA的3’方向)结合，允许3’末端通过DNA聚合酶延伸并连接到相邻的5’末端。然而，应理解，由于模板DNA内重复序列的性质，5’和3’末端能够与串联重复内的任何重复单元结合，并且因此当结合时可以被多个重复单元隔开。相比之下，接头区在杂交的3’和5’同源区之间成环，并且不与模板DNA结合。
同源区的长度通常为15-25个核苷酸，例如长度为18-22个核苷酸，并且通常与模板内的串联重复序列100％互补(即，它们与模板DNA的非杂交链100％相同)，尽管也可以使用小于100％互补，例如90％、95％、96％、97％、98％或99％互补或者含有例如1个、2个、3个或更多个错配的同源区。5’和3’区通常延伸到MIP的相应末端，即5’同源区的5’末端也是MIP的5’末端，并且3’同源区的3’末端也是MIP的3’末端。在与模板串联重复序列小于100％互补的情况下，错配的核苷酸通常不包含MIP的末端5’和3’核苷酸(即，在本方法中将由DNA聚合酶延伸和/或连接的末端核苷酸)。与其它测定(例如实时PCR端粒T/S比测定)相比，本发明MIP的5’和3’末端的杂交序列优选与没有错配碱基的端粒重复基序[TTAGGG]n的区段100％相同。
中心接头区可以具有不同的大小，但长度通常为约30-200个核苷酸，例如长度为30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个或200个核苷酸，或者对应于该范围内的任何整数的数值，并且除了具有足够的长度以允许5’和3’同源区形成环从而结合相同的模板DNA之外，所述中心接头区还可以含有用于例如分离、纯化、检测、切割或定量本发明所述方法的产物的多种功能序列中的任一种。例如，接头区可以含有通用引物序列、MIP特异性引物序列、探针序列(例如TaqMan探针序列)、标签ID或条形码序列和限制酶识别或切割位点。
串联重复序列和同源区
本发明的组合物和方法可以用于检测基因组中任何包含串联重复序列的区域的拷贝数或长度，所述区域包括总长度或大小即重复的拷贝数在个体之间变化的区域，如端粒。可以使用本发明的方法和组合物评估任何这样的序列。在许多实施方案中，所述方法和组合物用于确定端粒，例如人类端粒的精确或近似拷贝数，即总长度。在许多实施方案中，还评估了以下的串联重复：其大小或拷贝数在个体之间基本上不变化，并且因此被称为是“稳定的”或“恒定的”，例如人类基因组内的4-bp短串联重复[ATGG]序列。
无论单个重复单元的长度和基因组中串联重复的拷贝数如何，均可以分析串联重复。例如，6-核苷酸的人类端粒序列(TTAGGG)可以重复成百上千次，覆盖例如基因组内1-11kb，但也可以评估重复次数比此重复次数少的串联重复序列的拷贝数，例如基因组中数十至数百次重复，或者重复次数比此重复次数多的串联重复序列的拷贝数，例如，基因组中成千上万次。
本发明的方法可以用于评估个体中端粒或其它串联重复区的总长度，例如，以在一次的基础上评估端粒是长于还是短于标准参考长度，例如，用于确定它是否指示与改变的端粒长度相关的病况的存在或缺乏，并且它们也可以用于评估单个个体中端粒或其它串联重复区的进化，例如，评估治疗方案对例如端粒长度的影响的功效。
使用本发明方法评估的串联重复内的单独重复序列单元的长度可以是任何大小，例如2-20个核苷酸，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个核苷酸或更多。在一些实施方案中，重复序列是6个核苷酸，如在人类端粒中，或者4个核苷酸，如在人类ATGG重复或AAGG重复中。在某些实施方案中，评估了与某些疾病状态一起扩展的重复，例如，随着脆性X综合征扩展的CGG三联体重复或随着亨廷顿病扩展的CAG三联体重复。
除了评估可变串联重复如端粒外，所述方法和组合物还可以用于评估个体之间相对恒定或稳定的重复序列的长度或拷贝数，例如，当评估基因组中可变区例如端粒的大小时用作内部对照。这种恒定序列的大小优选在个体之间的变化例如平均小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，或者个体之间的相对水平变化平均不超过例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍。在一些实施方案中，本发明方法中使用的恒定序列以大的拷贝数存在于基因组中，例如包含成百上千个串联重复，使得它们以与可变重复序列(例如端粒)类似的水平存在。这种高拷贝数对照序列的使用提供了优于评估串联重复(例如端粒长度)的传统方法的显著优点，所述传统方法倾向于使用非重复序列作为对照。
对于可变和恒定重复，所述方法可以用于评估基因组中含重复的区域的总大小，例如，所述区域的长度达到例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的精确度，或者大约或精确的重复数目达到例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的精确度。
在一个实施方案中，序列ATGG被用作恒定的对照重复序列。可以使用的其它串联重复包括AAGG、GAATG、AATGG、ACTCC、CAGC、AACGG、AACAT、ACAGAG、AGGGTC、AAAAT、AAAAG、GAGAGG和AACC等。可以使用许多串联重复中的任一种，条件是它们的量在所研究物种的个体(例如当评估人类端粒长度时在人类中)的基因组中是相对稳定的，并且可以设计适当的MIP以使用如本文所述的方法靶向串联重复。
5’和3’同源区
MIP的5’和3’同源区包含与模板DNA内的串联重复序列同源的核苷酸序列。在优选的实施方案中，5’和3’区与串联重复序列100％同源，虽然在一些实施方案中，5’和/或3’区可以含有错配，例如，相对于串联重复序列，在给定的同源区内有1个、2个、3个或更多个错配。5’同源区开始于MIP的5’末端并延伸例如15-25个核苷酸到MIP中，3’同源区开始于MIP的3’末端并延伸例如15-25个核苷酸到MIP中。5’和3’同源区与模板DNA的同一条链互补，即它们均包含相同的重复序列，例如包含2个、3个、4个、5个、6个或更多个重复单元(例如靶向人类端粒的18-碱基对同源区将包含3个6-碱基对重复)。设计5’和3’区，使得3’同源区能够就在与模板上相同重复单元内的5’同源区的5’结合模板，但被模板上的少量核苷酸(例如1-3个核苷酸)隔开，使得仅在用DNA聚合酶延伸3’末端以在缺口内添加1-3个核苷酸(即，“缺口填充”)后才发生连接。
当设计用于本发明的MIP，特别是5’和3’同源区时，一个重要的考虑因素是当两个末端在同一DNA模板上的单个重复单元内彼此相邻杂交时，将MIP的5’和3’末端隔开的缺口。通常，为了用于本发明的方法，MIP的5’和3’末端将被少量的核苷酸，例如1个、2个或3个核苷酸隔开。应理解，MIP的5’和3’末端之间缺口的大小可以在给定测定中使用的不同MIP之间不同，即，用于评估可变串联重复序列(例如端粒)的拷贝数的MIP可以是例如1个、2个或3个核苷酸，并且用于评估恒定串联重复序列(例如ATGG)的拷贝数的对照MIP可以是例如1个、2个或3个核苷酸，其中两个缺口中的核苷酸数目彼此独立。
应理解，可以将5’和3’同源区设计成与模板DNA的任一条链杂交，只要两个区共有相同的序列，即使得它们均靶向同一条链。
当结合在模板DNA链的单个重复单元内时，将MIP的3’和5’末端隔开的核苷酸数目的另外的考虑是对应于缺口内核苷酸的碱基的同一性。在设计端粒靶向MIP的优选实施方案中，不管缺口内核苷酸的数目如何，核苷酸将包含一种或两种碱基，使得本发明方法的延伸步骤可以在仅对应于缺口内一种或两种碱基的那些脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的存在下进行。以这种方式，如下所示，存在于反应混合物中的一种或两种dNTP足以允许跨越单个给定重复单元内的缺口延伸，但不足以允许跨越需要例如三种或四种dNTP的多个重复单元延伸。
出于说明的目的，由于人类端粒序列基序是GGGTTA，靶向该序列的MIP的模板(互补)DNA链将是[AATCCC]n或代表长度为3个基序的区段.....CCCAATCCCAATCCCAAT....。因此，靶向该序列的MIP的5’末端可以读取5’-GTTAGGGTTAGGGTTAGGGTT-，并且3’末端可以读取-TAGGGTTAGGGTTAGGGTTA-3’。以这种方式，如果两个末端相邻地结合同一模板，即，3’末端恰好在单个重复内5’末端的3’，则探针的5’末端的G可以杂交直至模板上的AATCCC重复基序中的最后一个(第六个碱基)C，并且探针的3’末端的A可以相邻地向下杂交至同一重复内的T(第三碱基)(即从左至右，在AATCCC内的第三核苷酸终止)。由此，两个末端将被基序中的前两个C(第四个和第五个碱基)隔开，因此，如果DNA聚合酶向MIP的3’末端添加两个G，并且如果第二个添加的G然后与MIP的5’末端的G连接，则所述两个末端从而能够连接在一起。在这种情况下，当两个末端属于相同的MIP时，MIP将被环化。可选地，如果两个末端属于不同的MIP，则将产生连接的线性MIP，其包含两个彼此连接的MIP。
类似地，对于可以用作对照MIP以评估基因组中恒定或稳定重复序列的拷贝数的人类ATGG 4-碱基对重复，模板将是[CCTA]n或....TACCTACCTACC....。在这种情况下，MIP的5’末端可以是5’-ATGGATGGATGGATGGATGGATGG-，并且MIP的3’末端可以是GGATGGATGGATGGATGGAT-3’。因此，如果两个末端相邻地结合同一模板，则5’末端的A可以杂交直至模板内重复单元之一中的T(即，从右至左，直至CCTACCTA中的第七个核苷酸)，并且3’末端的T可以向下杂交至模板内的A(即，从左至右，直至CCTACCTA中的第四个核苷酸)。在这种情况下，MIP的两个末端也将被单个重复内的两个C隔开，因此，如果DNA聚合酶向MIP的3’末端添加两个G，并且如果第二个G然后与相邻5’末端的A连接，则所述两个末端能够连接。
在上述两个实例中，即，利用靶向人类端粒序列的MIP和靶向ATGG重复的MIP，单个重复内两个MIP的3’和5’末端之间的缺口内的所有核苷酸包括模板上的碱基C。以这种方式，DNA聚合酶介导的MIP 3’末端的延伸可以在单独存在dGTP，而在反应混合物中不存在其它dNTP的情况下进行。由于这是利用两种MIP的情况，可以进行多重反应，其中两种MIP在同一反应中同时使用，有相同的基因组DNA模板。此外，如果仅使用dGTP，这也意味着延伸只能在单个重复内发生，并且跨越多个重复的延伸(即如果3’和5’末端结合彼此分开的多于一个重复单元的模板)是不可能的，因为这不仅需要dGTP，而且还需要dATP和dTTP。为此，在本发明方法和组合物的许多实施方案中，仅使用或包括一种或两种dNTP。
在一个实施方案中，反应中包括的唯一dNTP为dGTP。在其它实施方案中，所包括的仅两个核苷酸为dGTP和dATP。然而，应理解，可以设计MIP，使得可以使用一种或两种dNTP的任何组合，只要所使用的一种或多种dNTP允许在靶向端粒的MIP的串联重复单元内(但不能跨越串联重复单元)延伸。
接头区
接头区位于5’和3’同源区之间，不与模板DNA杂交，即不与模板DNA互补，并且它既提供间隔功能，也包括允许例如探针的鉴定、分离、切割或扩增的许多元件中的任一种，当5’和3’同源区结合同一模板DNA时，所述间隔功能允许探针呈现环状(环)构象。这种序列元件的实例包括在给定测定中使用的所有MIP通用的引物结合位点，例如通用正向引物结合位点；探针特异性引物结合位点，例如，对每个MIP特异性的反向引物结合位点；探针结合序列，例如由用于定量扩增反应的探针(如TaqMan探针)结合的序列；标签或条形码序列；和切割或限制位点，其可以用于例如在扩增反应之前使环化的MIP线性化。
接头区可以具有任何大小，例如20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个或更多个核苷酸，并且可以包括任何数目的元件，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个元件。
可以包含在接头区中的标签序列或条形码为可以编码任何期望信息的独特序列，例如样品鉴定序列、靶标信息序列、样品采集时间编码序列等，从而允许通过例如测序或杂交特性来进行它们的鉴定。通过包括这样的序列，可以在单个检测事件中明确地检测出来自多个样品的MIP产物。标签元件可以包括诸如在“条形码”核酸序列内的信息，其可以通过例如测序程序或特异性杂交来读取。可选地，一个或多个标签元件可以是可以将MIP特异性结合至可鉴定阵列位置的亲和部分。例如，可以通过具有与各种标签序列互补的多核苷酸探针的核酸阵列来查询标签。例如，标签可以包含与分支DNA(bDNA)程序的捕获探针互补的序列。bDNA捕获探针可以排列在固体支持物上的阵列中，每个位置对应于特定的标签和样品。任选地，标签可以与具有适当捕获和信号元件的珠粒相对应，例如，用于在FACS流动装置中检测或通过用电荷耦合装置成像。
可以例如通过将许多修饰的核苷酸或碱基中的任一个掺入到用于切割的期望位点的接头区，和/或通过待被例如尿嘧啶N-糖基化酶或本领域普通技术人员已知的其它适当的酶，例如限制酶切割的接头的配置来引入切割位点。
其它核酸衍生物也可以掺入到本发明的MIP中，例如以防止它们的消化，特别是当它们暴露于可能含有核酸酶的生物样品时。如本文所用，核酸衍生物为非天然存在的核酸或其单元。核酸衍生物可以含有非天然存在的元件，如非天然存在的核苷酸和非天然存在的主链键合(linkage)。
核酸衍生物可以含有主链修饰，诸如但不限于硫代磷酸酯键合、磷酸二酯修饰的核酸、硫代磷酸酯修饰、磷酸二酯和硫代磷酸酯核酸的组合、甲基膦酸酯、烷基膦酸酯、磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯(acetamidate)、羧甲基酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、对乙氧基以及以上的组合。核酸的主链组成可以是同质的或异质的。
核酸衍生物可以在糖和/或碱基中含有取代或修饰。例如，它们可以包含具有主链糖的核酸，所述主链糖共价连接至除了3’位的羟基和5’位的磷酸基以外的低分子量有机基团(例如，2'-O-烷基化核糖基团)。核酸衍生物可以包括非核糖的糖，如阿拉伯糖。核酸衍生物可以含有取代的嘌呤和嘧啶，如C-5丙炔修饰的碱基、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、2-硫尿嘧啶和假异胞嘧啶。在一些实施方案中，取代可以包括糖/碱基、与碱基连接的基团(包括生物素、荧光基团(荧光素、青色素、罗丹明等))、化学反应性基团(包括羧基、NHS、硫醇等)或它们的任何组合中的一个或多个取代/修饰。
在一些实施方案中，使用其它方法来增强LL-MIP产物的形成，如通过使用MIP的接头区中的锁核酸碱基来预形成内部自环。锁核酸(LNA)含有一个或多个核苷酸构建模块，其中额外的亚甲基桥将核糖部分固定在C3’-endo(β-D-LNA)或C2'-endo(α-L-LNA)构象中。可使用商业核酸合成仪和标准亚磷酰胺化学来合成LNA。
4.生物样品和基因组DNA的分离
为了实施本发明的方法，将一种或多种MIP探针例如在多重反应中与需要测定串联重复区(如端粒)的长度(例如，近似或精确的拷贝数)的来自个体的含有基因组DNA的生物样品杂交。在一些实施方案中，从以下个体中取样，所述个体具有与改变的端粒大小例如端粒损失相关的特征、生活方式因素或病况，如衰老及多种与衰老相关的病况、认知衰退、精神障碍如抑郁症、精神分裂症、应激-焦虑、癌症、心血管病、糖尿病以及各种生活方式因素如饮食、吸烟、身体活动和饮酒。所述方法可以在这样的个体中进行，或者在被认为易受这样的特征、因素或病况影响的个体中进行，用于例如筛选目的或诊断目的(即，在将端粒长度与参考端粒长度进行比较的一次性评估中)，或者监测对给定治疗方案的反应(即，其中随时间推移反复测量给定个体的端粒以监测其进展)。
在本发明中可以使用任何来源的基因组DNA，如来自外周血细胞的基因组DNA。也可使用其它细胞类型，例如特定细胞类型，例如癌细胞，以监测特定细胞类型中的端粒长度。合适的样品包括但不限于：生物样品，如组织和体液。例如，样品获自例如血液、尿液、血清、淋巴、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液和精液、皮肤、器官等。
使用本领域已知的方法从样品中获得靶核酸的分离物。从生物样品中分离核酸通常包括以提取样品中存在的基因组核酸并使其可用于分析的方式处理生物样品。产生提取/分离的基因组核酸的任何分离方法均可以用于本发明的实践中。
通常，使用诸如Sambrook,J.,Fritsch,E R和Maniatis,T.(1980))MolecularCloning:A Laboratory Manual.第2版.Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold Spring HarborLaboratory.)中描述的技术提取核酸。其它方法包括：盐析DNA提取(P.Sunnucks等人,Genetics,1996,144:747-756；S.M.Aljanabi and I.Martinez,Nucl.Acids Res.1997,25:4692-4693)、三甲基溴化铵盐DNA提取(S.Gustincich等人,BioTechniques,1991,11:298-302)和硫氰酸胍DNA提取(J.B.W.Hammond等人,Biochemistry,1996,240:298-300)。已经开发了几种方案以从血液中提取基因组DNA。
还存在许多试剂盒，其可以用于从组织和体液中提取DNA，并且可以从例如BDBiosciences Clontech(Palo Alto,Calif.)、Epicentre Technologies(Madison,Wis.)、Gentra Systems,Inc.(Minneapolis,Minn.)、MicroProbe Corp.(Bothell,Wash.)、Organon Teknika(Durham,N.C.)、Qiagen Inc.(Valencia,Calif.)、Autogen(Holliston,Mass.)；Beckman Coulter(Brea,Calif.),(AutoGenFlex STAR robot with QiagenFlexiGene chemistry商购获得。例如，Autogen生产FlexStar自动化提取试剂盒与QiagenFlexiGene Chemistry组合使用，以及Beckeman Coulter生产Agencourt GenFind试剂盒用于基于珠粒的提取化学。详细描述所遵循的方案的用户指南通常包括在所有这些试剂盒中，例如，标题为“Qiagen PureGene Handbook”，第3版，日期为2011年6月的关于其PureGene提取化学的Qiagen文献。
在从样品中获得细胞后，优选裂解细胞以分离基因组核酸。细胞提取物可以进行其它步骤以通过例如示差沉淀、柱层析、用有机溶剂萃取等来驱使核酸分离完成。然后可以通过例如过滤和/或离心和/或用离液盐如异硫氰酸胍或尿素或者用有机溶剂如苯酚和/或HCCl3进一步处理提取物，以使任何污染的和潜在干扰的蛋白质变性。基因组核酸也可以重悬于水合溶液中，如水性缓冲液。基因组核酸可以悬浮在例如水、Tris缓冲液或其它缓冲液中。在某些实施方案中，基因组核酸可以重悬浮于Qiagen DNA水合溶液或其它pH约7.5的基于Tris的缓冲液中。
根据用于提取的方法的类型，所获得的基因组核酸的大小可以变化。可以通过例如使用琼脂糖凝胶的脉冲场凝胶电泳(PFGE)来确定基因组核酸的完整性和大小。
在一些实施方案中，基因组DNA在用于本发明方法之前被片段化。核酸(包括基因组核酸)可以使用多种方法中的任一种，如机械片段化、化学片段化和酶片段化进行片段化。核酸片段化的方法是本领域已知的，并且包括但不限于DNase消化、超声处理、机械剪切等((J.Sambrook等人,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,1989,2.sup.nd Ed.,Cold Spring Harbour Laboratory Press:New York,N.Y.；P.Tijssen,“Hybridizationwith Nucleic Acid Probes--Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology(Parts I and II)”,1993,Elsevier；C.P.Ordahl等人,Nucleic Acids Res.,1976,3:2985-2999；P.J.Oefner等人,Nucleic Acids Res.,1996,24:3879-3889；Y.R.Thorstenson等人,Genome Res.,1998,8:848-855)。美国专利公开2005/0112590提供了本领域已知的各种片段化方法的一般概述。
在许多实施方案中，用限制酶，例如具有在测定中使用的MIP靶向的任何序列中均未发现的限制位点的酶消化基因组DNA。限制性内切酶识别双链核酸内的特定序列，并且通常切割识别位点内或接近识别位点的两条链，以使核酸片段化。基于天然存在的限制性内切酶的组成和酶辅因子需求、它们的靶序列的性质和它们的DNA切割位点相对于靶序列的位置，将它们分为四组(类型I、II、III和IV)。Bickle T A,Kruger D H(June 1993).“Biology of DNA restriction”.Microbiol.Rev.57(2):434-50；Boyer H W(1971).“DNArestriction and modification mechanisms in bacteria”.Annu.Rev.Microbiol.25:153-76；Yuan R(1981).“Structure and mechanism of multifunctional restrictionendonucleases”.Annu.Rev.Biochem.50:285-319。所有类型的酶均识别特定的短DNA序列，并进行DNA的核酸内切切割以产生具有末端5’-磷酸的特定片段。酶在其识别序列、亚基组成、切割位置和辅因子需求方面不同。Williams RJ(2003).“Restriction endonucleases:classification,properties,and applications”.Mol.Biotechnol.23(3):225-43.
在一个实施方案中，在使酶失活(通过在90℃下孵育20分钟)，离心DNA(例如，在7krpm持续10分钟)并收集上清液之前，用AluI(例如，来自New England Biolabs)消化DNA，例如，在37℃下，用10单位的AluI消化50ng DNA，持续2小时。然后可以将DNA保存在例如4℃，直到用于本发明的方法中。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的方法和组合物可以用于在基因组规模上评估，即定量甲基化程度。例如，在DNA样品预消化步骤中，可以向预消化的DNA样品中加入甲基化敏感的限制酶。然后即在甲基化敏感的限制酶(其切割DNA的能力取决于甲基化核苷酸的存在)存在下和在识别相同限制位点的甲基化不敏感的限制酶(同裂酶)存在下比较来自相同样品的两个反应的结果。例如，可以使用酶对HpaII(甲基化敏感的)和MspI。对于这种方法，被设计用于靶向CpG岛的另外的MIP可以与基因组参考MIP(如本文所述的4-碱基对(ATGG)MIP)一起使用。
在一些实施方案中，本发明的方法还提供了使基因组DNA变性以使其成为用于与本发明的MIP探针杂交的单链。变性可以由如上所述选择的片段化方法产生。例如，本领域技术人员将认识到，基因组核酸可以在基于pH的剪切或经由产生切口的内切核酸酶进行片段化期间变性。变性可以在片段化之前、期间或之后发生。此外，在片段化步骤期间使用pH或加热可产生变性的核酸片段。参见，例如，McDonnell,“Antisepsis,disinfection,andsterilization:types,action,and resistance”,pg.239(2007)。
基于热的变性是双链脱氧核糖核酸通过断裂碱基之间的氢键解旋并分离成单链的过程。未知序列的核酸的热变性通常使用足够高的温度，例如95-98℃，以确保在不存在任何化学变性剂的情况下使甚至具有非常高的GC含量的核酸变性。优化用于核酸变性的条件(例如，时间、温度等)在本领域普通技术人员的能力范围内。
利用pH使核酸变性也是本领域众所周知的，并且这种变性可以使用本领域已知的任何方法(如将核酸引入到高或低pH、低离子强度和/或热中)来完成，所述方法破坏了碱基配对，导致双链螺旋解离成单链。对于基于pH的变性方法，参见例如Dore等人,BiophysJ.1969November；9(11):1281-1311；A.M.Michelson The Chemistry of Nucleosides andNucleotides,Academic Press,London and New York(1963)。也可以经由电化学手段，例如通过电极向溶液中的核酸施加电压使核酸变性。
杂交、延伸和连接
应理解，本发明的方面可以涉及改变基因组核酸的量和改变MIP探针的量以达到定制的结果。在一些实施方案中，每个对象使用的基因组核酸的量的范围为1ng至10g(例如，500ng至5μg)。然而，可以使用更高或更低的量(例如，小于1ng、大于10μg、10-50μg、50-100μg或更高)。在一些实施方案中，对于每个感兴趣的串联重复，可以针对特定的应用优化每个测定所使用的探针的量。在一些实施方案中，MIP探针与基因组等价物(例如二倍体基因组等价物)的比率(摩尔比，例如以浓度比测量)的范围为1x106至1x1012或1e6至1e12。然而，可以使用更低的、更高的或中间的比率，特别是作为每个基因组的重复基序的丰度的函数。
在本发明的方法中，为了确保重复阵列内(如在端粒处)每个重复的最大覆盖，MIP通常相对于基因组DNA过量存在。以上提及的MIP探针与基因组等价物的比率高于常规MIP测定中所用的比率。例如，与传统MIP方法相比，所述比率高达1000x或更高，以使基因组内的潜在结合位点(例如重复序列)饱和，并使所产生的连接产物(无论是环状产物还是连接的线性产物)的数目最大化。在一个实施方案中，使用50ng基因组DNA(例如，5μl的10ng/μl溶液)，并加入2μl的每种MIP的10nM储备溶液。以这种方式，在DNA聚合酶活性和适当的dNTP的存在下以及在连接酶活性的存在下，将产生大量的连接产物，其反映了基因组中存在的重复数目。使用相对于基因组DNA过量的MIP与经典的MIP测定的传统教导形成对比，在经典的MIP测定中，使用相对于基因组DNA高水平的MIP只会增加产生非特异性和(不期望的)线性产物的可能性并降低产生(期望的)环化产物的可能性。
在试剂和酶的存在下温育MIP和基因组DNA，允许杂交的3’MIP延伸，并且将延伸的3’末端随后连接到与同一串联重复单元内同一模板结合的5’末端。在一个实施方案中，进行第一杂交步骤，其包括以下组分：基因组DNA、靶向感兴趣的串联序列的MIP(例如，靶向端粒的MIP和靶向ATGG重复的MIP)、适当的缓冲液(例如，10x Amp连接酶缓冲液)和至期望的最终体积的水。可以根据标准方法进行杂交步骤，例如使用具有以下温度循环的热循环仪：1.95℃，持续10分钟；2.72℃，持续1分钟，伴随着缓慢的变温速率(例如，0.1℃/s)；3.56℃，持续5分钟，伴随着缓慢的变温速率(例如，0.1℃/c)；4.转到步骤2，10x；和5.56℃，持续16小时。
杂交后，进行缺口填充和连接步骤，其中，例如，将以下试剂添加至杂交混合物中：连接酶(例如，5U的Amp连接酶；例如，来自Lucigen)、DNA聚合酶(例如，0.6U的T4聚合酶；例如，来自New England Biolabs)、适当的脱氧核糖核苷三磷酸(例如dGTP，例如2.5μl的2.5mM储备溶液)、BSA(例如1X)和缓冲液(例如Amp连接酶缓冲液)和至适当的最终缓冲液浓度和总体积的水。然后根据标准方法进行缺口填充和连接，例如使用具有以下温度循环的热循环仪：37℃持续30分钟；75℃持续20分钟。
提供以上实验条件是为了说明的目的，并且应理解，所用的实验条件和/或性质、量或者所用不同试剂的存在或不存在可以在所有本发明反应步骤中变化，例如，关于杂交、缺口填充/连接和扩增步骤的温度、持续时间或循环次数，以及关于所用的试剂。反应条件的这种优化完全在本领域普通技术人员的能力范围内。在一些实施方案中，在反应中使用比上述浓度更高浓度的MIP和/或dNTP。
如本文别处所述，本发明的方法通常省略了核酸外切酶步骤(与传统的基于MIP的测定相比)，尽管可以包括短的核酸外切酶处理以去除未连接的MIP或用于质量控制或比较目的。
5.使用新的实验设计产生的产物和控制措施
如上所述，当仅在覆盖单个重复内的结合至同一模板的3’和5’末端之间的缺口所需的那些脱氧核苷酸的存在下进行杂交、延伸和连接反应时，可以产生两种类型的产物。当5’和3’末端属于同一MIP时产生的第一产物是环化的连接产物。这样的环化产物对应于先前MIP测定的期望产物。当5’和3’末端属于不同的MIP时产生的第二产物是连接的线性产物(或“LL-MIP”)。在经典的MIP测定中，例如通过核酸外切酶活性去除所有线性产物，并且进行定量、检测或分析的产物仅为环状产物。
本发明的方法产生几种类型的产物，包括在多种经典MIP测定中描述的环化的MIP和称为LL-MIP的新的连接产物，其包含两个或更多个MIP。特别地，由于长串联重复内存在的大量MIP的结合位点，以及由于本发明方法中所用的MIP相对于基因组DNA浓度的高浓度，产生了多聚体形式，其中3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个MIP连接在一起。这些产物一起反映了基因组中串联重复的拷贝数。当环化探针反映一个连接事件(图1中的连接点)时，类似地，包含两个MIP的LL-MIP也反映一个连接点，并且均表示串联重复的一个长度单位。此外，包含多于两个MIP的LL-MIP反映了多个连接事件，并因此反映了靶标串联重复(例如端粒)的多个长度单位。通常，包含n个MIP的多聚体LL-MIP的连接事件的数目是n-1。因此，在本发明的许多实施方案中，保留和定量在所述方法中获得的所有连接的产物，包括环状产物以及包含连接在一起的2个或更多个单独MIP的连接的线性产物，以确定串联重复序列如端粒的总体大小，即拷贝数。连接点的总体丰度或这种基序的拷贝数表示端粒或其它串联重复的长度(图8)。
端粒重复基序[GGGTTA]由3种类型的核苷酸组成，即G、T和A。虽然MIP的5’和3’末端的结合位点为随机分布的，但一些可以结合相同的基序，如上文所述，而其它可以跨越多个重复。为了定量端粒长度，仅在相同的单独基序内发生的那些MIP连接进行随后的反应步骤并进行计数是必要的。这可以通过将缺口填充反应步骤中使用的dNTP的数目限制为至多两个dNTP来实现。在一个实施方案中，在缺口填充反应中仅使用一个dNTP(dGTP)。然而，应理解，这种要求对于其它参考(稳定)串联重复并不是关键的。例如，当[AAGG]串联重复用作端粒长度定量反应中的参考串联重复时，可以在缺口填充反应中提供dATP和dGTP。
6.产物的分离、检测和/或定量
如本文别处所述，在先前的基于MIP的测定中，通过酶促方法(使用例如核酸外切酶的组合，包括核酸外切酶III)或经由亲和结合(使用例如具有开放5’末端的生物素标记的MIP)来去除所有线性产物。在测量端粒长度或其它串联重复序列的背景下，这是不适当的，因为它将错误地降低端粒或其它重复序列的计算大小(即，拷贝数)。这是因为端粒长度与连接点的总数成比例，而不管这些点是在环化产物内还是在LL-MIP内。
因此，在一个实施方案中，在本发明方法中不使用核酸外切酶来定量端粒或其它串联重复的大小。然而，在一些实施方案中，仅使用核酸外切酶I，并且仅以有限的水平(例如，小于1、2、3、4、5、10、15或20个单位)且持续有限的持续时间(例如，长达1小时，或5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或55分钟)，以去除游离的(即，未连接的)MIP探针，而不降解连接的线性MIP。
使用本发明方法获得的连接产物(包括环化和线性产物(LL-MIP))中的连接点的丰度可以以多种方式中的任一种来定量，包括在具有或不具有参考样品和/或效率校正的情况下，通过qPCR进行相对定量；例如使用精确测量的量的克隆MIP产物作为基准样品(calibrator sample)，通过qPCR进行绝对定量；通过数字PCR，例如通过液滴数字PCR；或者通过测序，例如高通量测序来计数各种MIP产物的数目。
在一个实施方案中，使用PCR，例如使用TaqMan探针或其它标准方法的qPCR，定量环化和连接的线性MIP中的连接点的丰度。例如，可以使用反应中使用的所有MIP通用的引物(例如，通用正向引物)以及MIP特异性引物(例如，每个MIP特异性的反向引物)进行qPCR。在一个实施方案中，通用正向引物是为longGC_M13_F(ggcgcatggcTCA CAC AGG AAA CAGCTA TGA C)。当进行用于确定端粒长度时，在一个实施方案中，端粒-MIP特异性反向引物为longGC_Link_R_tel尾(gcgcatgtgaATC GGG AAG CTG AAG TAA CC)，并且ATGG-MIP特异性反向引物为longGC_Link_R_tel尾(gcgcatgtgaATC GGG AAG CTG AAG TAA CC)。此外，当在TaqMan测定中进行时，可以使用对每个MIP具有特异性的探针，如Taq-3-Telo(对于端粒MIP；/56-FAM/TA GGG TTA G/ZEN/G GTT AGG GTT/3IABkFQ)和Taq-3-ATGG(对于ATGGMIP；/5HEX/GG ATG GAT G/ZEN/G ATG GAT GGA T/3IABkFQ)。
这样的反应可以根据标准方法进行，例如，使用以下试剂进行：MIP产物(例如，5μl)；PCR预混合物(例如，7.5μl的2X储备溶液)；通用正向引物(例如，引物M13_F；0.375μl的20μM储备溶液)；MIP 1的反向引物(例如，端粒反向引物；0.375μl的20μM储备溶液)；MIP 2的反向引物(例如ATGG反向引物；0.375μl的20μM储备溶液)；用于MIP 1的TaqMan探针(例如Taqman-telo；0.3μl的10μM储备溶液)；用于MIP 2的TaqMan探针(例如Taqman-4bp；0.3μl的10μM储备溶液)；和加至最终体积为15μl的水。
可以在热循环仪，例如Roche LC480热循环仪上使用标准温度循环上进行定量PCR，所述标准温度循环例如1.95℃，持续10分钟；2.95℃，持续10秒；3.65℃，持续30秒；4.72℃，持续10秒；5.转到步骤2，40x。
然而，应理解，每个试剂(例如每个引物)的量和其它反应条件(例如所使用的温度循环)可以变化以获得最佳结果；这种反应条件的优化完全在本领域普通技术人员的能力范围内。
在一些实施方案中，使用下一代测序(NGS)评估MIP产物，所述下一代测序能够以大量平行的方式确定例如探针或探针产物的核酸序列。示例性NGS技术包括例如通过合成测序(Illumina,Inc.,San Diego,Calif.)、用零模波导的单分子实时测序(PacificBiosciences of California,Inc.,Menlo Park,Calif.)、焦磷酸测序、离子半导体测序(Thermo Fisher Scientific Corporation,Carlsbad,Calif.)和通过连接测序(ThermoFisher Scientific Corporation,Carlsbad,Calif.)。通常，对于通过NGS技术进行的基因组测序，全长核酸(例如，gDNA)被分裂成“模板”片段。然后通常在空间上分开的检测器位置捕获或固定模板，从而允许同时进行数百到数十亿个测序反应。在一些情况下，必须在测序之前扩增模板以允许足够的信号。
7.测定串联重复序列拷贝数
一旦已经使用例如qPCR对连接的MIP产物进行定量，就确定了基因组的可变串联重复序列区的长度。这种确定可以以多种方式中的任一种进行，例如基于通过连接的MIP产物的qPCR、数字PCR或高通量测序获得的靶标(例如端粒)的丰度与稳定的对照串联重复之间的关系从参数计算的。在以下实施例中概述和说明了这样的方法。
在一个实施方案中，通过计算两个qPCR的Δ-Δ-Ct(即，用于靶标MIP的qPCR和用于对照MIP的qPCR)并使用参考样本来进行确定。例如，通过确定每个qPCR的Ct，确定每个样品的Δ-Ct，即样品中可变串联重复序列的Ct和稳定对照重复序列的Ct之间的差值，以及在对给定样品的不同Δ-Ct求平均之后(如果，例如，以一式两份、一式三份等进行qPCR)，通过确定样品的Δ-Ct与参考样品的Δ-Ct之间的差值来计算Δ-Δ-Ct。参考样品可以是任何合适的样品，其中可变串联重复序列区的大小是已知的和/或根据讨论中的测定的目的是适当的；例如，对于测定患有或疑似患有癌症的患者的端粒长度的方法，参考样品可以来自没有癌症的健康个体。一旦确定了每个样品的Δ-Δ-Ct，就可以确定每个样品中串联重复序列的总长度。例如，假设效率值为2，可变串联重复序列(例如端粒)内的连接点数目与对照串联重复序列(例如含ATGG的串联重复序列)内的点数的比率为2^(Δ-ΔCt)。每个样品的Δ-Δ-Ct和比值均可以用作串联重复的生物标志物，例如端粒长度的新的指标参数。
在qPCR反应中定量PCR产物的多种其它方法包括相对和绝对定量方法。在一个实施方案中，定量参考样品的连续稀释液以获得Ct值以计算总测定效率。另外，参考样品可以用于所有qPCR批次，并且将样品与相同参考样品进行比较以去除由于qPCR Ct值中的板间变化而导致的批次影响。这些方法(被称为Δ-Δ-Ct方法和效率校正的Δ-Δ-Ct方法)可以在本文应用以定量两种MIP的连接点。
此外，如果在具有测试样品的相同qPCR中使用具有已知(给定)量的连接点的校准器，则可以进行qPCR的绝对定量。这样的方法被称为qPCR结果的绝对定量。在其它实施方案中，可以进行连接点丰度的其它定量方法，包括数字PCR和测序。
此外，如以下实施例部分所述，可以进行另外的测定以确定用不同MIP进行的qPCR的总效率，以及反应的线性(例如，不同的起始DNA浓度)和特异性。此外，可以通过例如常规PCR扩增产物，并且对产物进行克隆和测序，或通过凝胶电泳分离产物，例如以评估获得的LL-MIP产物的大小和性质。这样的程序可以例如由试剂盒制造商在试剂盒开发阶段的期间进行。
可以用给定的MIP，合并MIP杂交-缺口填充-连接反应和qPCR反应的效率来计算测定的总效率，并且计算的总效率可以用于校正测定中使用的两种(或更多种)MIP的Ct值的斜率差，允许获得对应于效率(斜率)校正的相对比率的指标值。该值可以用于将串联重复的长度表示为与参考样品相比的比率。例如，鉴于具有给定端粒长度的样品，如图5中示出的癌细胞系，其它样品可以使用它们的比值作为独立变量(x-轴)，基于图5中的回归线读出它们的端粒长度值(依赖变量，y-轴)。
实施例
将通过具体实施例更详细地描述本发明。提供以下实施例仅用于说明目的，而不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改多种非关键参数以产生基本上相同的结果。
实施例1：用于确定端粒长度或其它可变串联重复序列的新的基于MIP的方法。
在本实施例中，使用端粒基序MIP探针研究了端粒重复长度，该探针在其5’和3’末端均包含被接头序列隔开的端粒重复序列(GGGTTA)。端粒MIP两端的端粒重复基序的序列靶向长度的范围可以为例如15个碱基对至25个碱基对的长度。
为了归一化样品中输入DNA的量，使用第二MIP来定量样品DNA中的二倍体基因组等价物的数目。在另一个实施方案中，也可以使用其它方法来代表样品DNA中的二倍体基因组等价物。例如，单拷贝基因可以通过qPCR定量为该目的的指标。
由本发明的优选MIP提供的精确匹配/互补，例如在5’和3’同源区与模板DNA的靶序列之间具有100％互补，使得检测重复基序(如端粒)是可行的，并且常见的串联重复序列，例如常见的4碱基对序列ATGG可以用作归一化对照。ATGG或另外类似的4-bp串联重复对于这样的归一化是合适的对照重复，因为它在人类基因组中是丰富的，并且在取自不同个体的样品中以每二倍体基因组等价物大致类似(稳定)的水平存在。
用于定量该4-碱基对串联重复的MIP在其5’和3’末端由被接头序列隔开的4-碱基对重复基序(本实施例中为ATGG)组成。如同靶向端粒的MIP，靶向4-碱基对基序MIP两端的ATGG重复基序的序列长度(即5’和3’同源区)范围可以为例如15个碱基对至25个碱基对。
由于端粒和4-碱基对重复基序都是串联重复，其中相同的6-碱基对或4-碱基对基序是串联重复的，这种特殊的序列构型对常规的MIP测定方法提出了新的挑战，常规的MIP测定方法均是基于连接后对环化的MIP的专一检测。
因为MIP的3’和5’末端可以与相同的重复靶向基序杂交，所以用常规的MIP测定，无法控制同一MIP分子的两个末端杂交的距离。也就是说，3’和5’末端的杂交位置之间的缺口是随机的，并且不能确定，即它可以在单个重复基序内，或者它可以跨越多个重复。
因此，为了定量端粒或其它串联重复序列的长度的特定目的，如果与模板DNA杂交的MIP的3’和5’末端之间的缺口距离是随机的，则作为端粒长度指标的连接产物的定量将是有问题的，因为一些连接产物将代表一个基序单元，而其它连接产物将代表2个、3个或6个或甚至更多的基序单元。例如，如果两个末端杂交彼此分离的多个基序，则定量将低估端粒的丰度，并因此低估端粒长度，因为多个重复单元将被计数为一个重复单元。因此，理想的测定应为每个基序重复提供一个连接信号(图2)。这在本发明的方法和组合物中以多种方式实现，尤其包括通过使用(1)专门设计的MIP探针，和(2)在缺口填充/延伸步骤中使用有限数量的脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)。在一个实施方案中，端粒MIP的3’和5’末端之间的缺口为“GG”。类似地，在一个实施方案中，4-碱基对(ATGG)串联重复MIP的3’和5’末端之间的缺口为“GG”。
这种MIP的设计，即其中端粒MIP和4-碱基对重复MIP的缺口均为GG，使得能够在MIP延伸步骤中使用单独的dGTP，而不添加其它dNTP。在延伸程序期间，仅有dGTP存在于反应混合物中，因此仅有两端彼此相邻杂交的MIP分子，即具有隔开两端的2个核苷酸GG缺口的MIP分子被连接。相比之下，当端粒MIP的5’和3’末端之间的缺口大于2个核苷酸时，即它们被多于一个的重复基序单元隔开，因此该缺口包括“GGGTTAGG”、“GGGTTAGGGTTAGG”或(GGGTTA)nGG等，其中‘n’为任何整数时，末端不能完成延伸，并且也无法连接。
类似地，当4-碱基对(ATGG)串联重复MIP的3’和5’末端之间的缺口大于2个核苷酸时，即它们被多于一个基序(重复)单元隔开，因此该缺口包括“GGATGG”、“GGATGGATGG”或(GGAT)nGG等，其中n’为任何整数时，末端杂交多个分开的单元的任何MIP不能完成延伸，并且也无法连接。
在一个实施方案中，使用另一种端粒MIP(称为MIP-TelF)，其中3’和5’末端之间的缺口为“AGG”。在这种情况下，MIP延伸反应仅包括2种脱氧核糖核苷三磷酸，即dATP和dGTP，以便将连接产物的形成限制到其3’和5’末端在单个重复单元内杂交并防止跨越多个重复单元延伸的那些MIP。
MIP-TelF的序列：5'/Phos/GTT AGG GTT AGG GTT AGG GTT ACTTCAGCTTCCCGATCCGACGGTAGTGTTCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA CTAG GGT TAG GGT TAG GGT T。
基序单元的重复性质导致连接后形成连接的和线性的MIP产物(称为LL-MIP)(图1-3)。在以前的MIP测定中，这样的线性MIP会通过酶促方法(例如，使用核酸外切酶的组合，包括靶向线性双链DNA的核酸外切酶III)或基于亲和力结合的方法(例如，具有开放5’末端的生物素标记的MIP)被全部去除。
然而，出于测量端粒长度的目的，这是不适当的，因为它将错误地降低端粒或其它串联重复序列的基序计数(即，计算的拷贝数)。实际上，我们发现在与样品模板的端粒基序结合后，相当大比例的端粒MIP形成LL-MIP(图1-3)。克隆这些LL-MIP并对其进行测序以证实其序列含有多个MIP并且它们的靶向序列连接在一起(图1C)。
在本发明方法的优选实施方案中，同时定量环化的MIP(传统的MIP产物)和LL-MIP(本文特别保留的MIP产物的新形式，包括包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个单独MIP连接在一起的LL-MIP)。因此，每个连接点或信号代表端粒长度的特定单元(即，串联重复内的一个重复单元)。
可以通过多种方法进行定量，所述方法包括但不限于：
1.在有或没有参考样品和/或效率校正的情况下，通过qPCR进行相对定量；
2.使用精确测量的量的克隆MIP产物作为基准样品通过qPCR进行绝对定量；
3.数字PCR，例如通过液滴数字PCR
4.测序，例如，高通量测序以计数各种MIP产物的数目。
实施例2：杂交、延伸和连接反应
限制酶预处理DNA样品
向50ng DNA样品中加入多达10单位的限制酶，例如AluI(New England Biolab)，并将样品在37℃温育1小时。然后将酶在80℃灭活20min。在7,000rpm离心10min并收集上清液后，可以将消化后的样品保持在4℃。
MIP杂交步骤
使用一种靶向人端粒重复的MIP探针，其具有GG的缺口，以及靶向ATGG重复基序的第二MIP，其也具有GG的缺口。对于所有的MIP探针，均需要5’磷酸化。
靶向端粒重复基序的探针(缺口为“GG”)：
MIP-TelF+A:/5Phos/GT TAG GGT TAG GGT TAG GGT TAC TTC AGC TTC CCG ATCCGA CGG TAG TGT TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA CTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA
靶向4bp(ATGG)重复基序的探针(缺口为“GG”)：
MIP-ATGG:/5Phos/AT GGA TGG ATG GAT GGA TGG ATG GCT TCA GCT TCC CGATCC GAC GGT TAG GTT CAC ACA GGA AAC AGC TAT GAC GGA TGG ATG GAT GGA TGG AT
两种探针均被设计成当相邻地结合在模板DNA上时，在3’和5’末端之间留下“GG”的缺口；在模板依赖性连接可以发生之前，必须通过DNA聚合酶填充这两个核苷酸缺口。
如下进行杂交程序过夜(括号中的值为储备浓度)：
杂交方案在热循环仪中利用以下温度循环进行，但同样可以使用本领域众所周知的其它合适的设备进行：
在杂交程序后，添加以下试剂至上述的25μl中，得到总共30μl(括号中的值为储备浓度)：
如下进行缺口填充和连接温度方案：
37℃，持续30分钟，然后
75℃，持续20分钟。
在本实施例中，不进行核酸外切酶处理，但可以在本文将其添加作为任选步骤。如本公开内容中的别处所强调的，该方法被专门设计成检测环化的MIP(其也被称为典型的或常规的MIP产物)和新的LL-MIP产物。因此，不需要核酸外切酶处理。
然而，出于质量控制或比较目的，例如，如试剂盒制造商所进行的，可以添加核酸外切酶消化步骤。这在一些实例中也进行以表明使用核酸外切酶会不利地影响测定性能。在一些实施方案中，可以添加有限量的核酸外切酶1(例如，对于50ng基因组DNA，为20U)，持续有限的时间，例如，长达1小时，以去除未连接的探针，但不消除连接的线性产物。
实施例3：环化的MIP和LL-MIP产物的定量
定量环化的MIP和LL-MIP产物中的连接点的总数目(或丰度)以计算端粒长度的新指标。定量可以以多种方式中的任一种进行，包括例如通过(1)使用相对定量或绝对定量方法进行的定量PCR(qPCR)，(2)数字PCR，(3)测序或(4)任何其它合适的定量方法。
在典型的实施方案中，将3种或4种引物用于扩增和定量端粒MIP和基因组参考MIP(例如4-bp MIP-ATGG)的连接点的丰度。在该实施例中，总共使用3种引物，因为正向引物(称为longGC_M13_F)对于端粒MIP和基因组参考(对照)4bp-MIP-ATGG是通用的，并且使用对端粒特异性探针或对照ATGG探针具有特异性的两种另外的引物。将富含5’GC的尾添加到所有三种引物中。
使用的通用引物和MIP特异性引物：
longGC_M13_F:ggcgcatggcTCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C
longGC_Link_R_tel尾:gcgcatgtgaATC GGG AAG CTG AAG TAA CC
longGC_Link_R_ATGG:gcatggcgcaATC GGG AAG CTG AAG CCA tccat
在本实施方案中，在qPCR中使用两种TaqMan探针以区分由两种类型的MIP探针形成的连接产物。
Taq-3-Telo:/56-FAM/TA GGG TTA G/ZEN/G GTT AGG GTT/3IABkFQ/
Taq-3-ATGG:/5HEX/GG ATG GAT G/ZEN/G ATG GAT GGA T/3IABkFQ/
PCR反应管制备物(总体积为15μl)如下：
qPCR在Roche LC480热循环仪中以如下PCR温度循环方案进行：
典型实验步骤的变化和扩展
根据样品模板或靶向基序的特性，可以实施以上步骤中呈现的典型实验步骤的变化，以提高测定精度和特异性。
这样的变化包括但不限于：
1.进一步增加MIP水平，如以上提及的给定浓度的1.5x、2x、4x等。
2.进一步增加dGTP或所提供的特定核苷三磷酸的浓度，如以上提及的浓度的2x、4x等。
3.可以在其它实施方案中使用其它方法代替使用查询对照串联重复的第二MIP作为样品中存在的二倍体基因组等价物的指标。例如，单拷贝基因或其它遗传标志物的qPCR可以直接用输入样品进行，以使端粒MIP结果归一化。
实施例4：结果
端粒长度的目前指标来源于端粒MIP形成的连接点的数目(丰度)和基因组参考MIP(即本实施例中使用的4-bp(ATGG)MIP)形成的连接点的数目(丰度)。在该实施例中，使用2个qPCR的Δ-Δ-Ct。来自成年男性样品的qPCR的Ct值用作参考样品(表中最后三个样品)。研究了三种癌细胞系，即MCF-7、HepG2和K562。还包括罗氏端粒长度测定试剂盒(目录号1220913600,Roche Diagnostics GmbH,Germany)中的对照样品和女性样品。所有反应均以一式三份进行，因为三个不同的样品和一个反应对于K562细胞系失败。计算ΔCT(FAM、端粒重复和HEX之间的差值，4bp重复Ct值)，并获得每个样品的平均值。然后，从获自男性对象的参考样品的ΔCt减去每个样品的ΔCt，以计算Δ-Δ-Ct值。假设效率值为2，端粒基序连接点与基因组4-碱基对(ATGG)基序连接点的比率可以通过2^(Δ-ΔCt)计算。
Δ-ΔCt或每个样品的比值(下表1中的第7列)可以用作端粒长度的新指标。
在文献中已经报道了几种癌细胞系的端粒长度，如通过末端限制性片段(TRF)测定所测量的。图5显示了TRF和相对定量比率之间的高度相关性。图5中的回归线用于从任何给定的比值(x-轴)读取端粒长度(y-轴)。根据图5中显示的回归线，女性样品的比值为1.39，并且估计的端粒长度为8.98kbp。
表I
实施例5：本发明的线性响应的证实
将来自实施例2-4中的男性样品的相同参考样品稀释成一系列不同的DNA浓度，使得样品中存在不同量(丰度)的端粒重复。将它们制备成具有这些总DNA量的样品：50ng、37.5ng、25ng、12.5ng和6.25ng。将这5种浓度中的每一种的一式三份用于本发明的端粒测定。也就是说，总共进行15个单独的反应。结果显示在以下表II中。
将输入的DNA量进行log转化，并且结果显示在图6的X轴上。在该相对定量分析中，将2种MIP靶标的qPCR的阈值循环(Ct值，在其它参考文本中也称为Cq)相对于输入DNA输入量作图。
通过qPCR对两个靶标(端粒和ATGG MIP的连接点)的丰度的定量显示在输入DNA量和相应的阈值循环之间的良好的线性。测定系数(r2)为0.96和0.98。
2条回归线的斜率分别为-2.96和-2.75。可以以类似于使用连续稀释样品计算qPCR效率的方式来计算分析的总效率。然而，MIP测定的这种总体组合效率合并了2个单独反应(即MIP杂交-缺口填充-连接反应和qPCR定量反应)的效率。
总效率计算为10^(-1/斜率)。因此，对端粒长度和4-碱基对(ATGG)重复基序的MIP测定的效率分别为2.2和2.3。
表II通过连续稀释一个样品得到的不同输入DNA量的结果
实施例6：针对靶向基序的测定的特异性的证实
水空白对照样品和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(秀丽隐杆线虫(C.elegans)，通常被称为蛔虫)的DNA(其端粒重复基序与人类不同)均被用于表明本发明可以区分来自非特异性DNA(秀丽隐杆线虫)的靶基序或水空白。
表III
在测定中使用3个秀丽隐杆线虫DNA样品(各50ng)。使用实施例2-3中的标准方案。
表IV
结果显示，水空白对照中的连接点的丰度仅为用于该端粒测定的典型人样品(50ng)的约1/32(多于5个循环的Ct值的差值，例如24.32-18.88＝5.44)。因此，该方法对靶向基因组基序显示出30x特异性。秀丽隐杆线虫具有与水空白对照类似的结果。
实施例7：连接的和线性的MIP(LL-MIP)产物的证实
将6个样品用于实施例2-3中的端粒MIP方案，除了步骤5中不添加TaqMan探针外。相反，进行常规PCR。使用较高的杂交温度(69.3℃)，并且在该常规PCR反应中仅存在靶向两种类型的端粒MIP连接产物的一对引物(即longGC_M13_F和longGC_Link_R_tel尾)。然后，在4％琼脂糖凝胶上按大小分离PCR产物。最小条带(～100bp)代表具有一个连接点的典型环化MIP产物。然后，～200bp的条带代表具有连接在一起的2个MIP的LL-MIP，以此类推。
凝胶结果显示在图3中。左侧显示了100bp间隔大小的标志物。显示了省略核酸外切酶消化步骤以及不同量的核酸外切酶I(New England Biolab)的效果。结果显示，可以省略核酸外切酶消化步骤。当仅使用小于20个单位的核酸外切酶I不超过1小时的时候，也获得了类似的结果。如果超过该量和/或持续时间，则观察到LL-MIP的降解(PCR产物长于～100bp)。其它核酸外切酶(如常规MIP测定中的核酸外切酶III或核酸外切酶VII)的加入引起LL-MIP产物的降解，并不利地影响本发明的测定性能的结果。
表V
实施例8：克隆来自实施例4的PCR产物以确认LL-MIP代表靶基因组基序。
从类似于实施例7的常规PCR获得的PCR产物用于克隆和DNA测序以确认LL-MIP产物对靶基因组基序具有特异性。直接克隆PCR产物的TA克隆试剂盒(Invitrogen,USA)用于直接克隆由引物(longGC_M13_F和longGC_Link_R_tel尾)产生的PCR产物。
选择具有插入物的阳性克隆进行测序，并且具有LL-MIP插入物的那些克隆比常规环化MIP产物的～100bp的预期插入物大小更长。两个较长克隆的插入物大小比400bp更长。一个插入物代表具有连接在一起的6个MIP的LL-MIP，如图1B示意性示出的。靶基因组基序显示为TAACCC，其为GGGTTA端粒基序的确切互补序列。
该克隆插入物的测序结果显示在图1C中。
实施例9：具有与靶基序较少杂交碱基(17bp)的替代MIP探针设计(图7)。
还设计并成功测试了靶向端粒和4bp基序的另一组MIP。两种MIP的序列为：
ShortMIPtelo:/5Phos/G GT TAG GGT TAG GGT TAC TTC AGC TTC CCG ATC CGACGG TAG TGT TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C GG TTA GGG TTA GGG TTA
ShortMIP4bp:/5Phos/G ATG GAT GGA TGG ATG GCT TCA GCT TCC CGA TCC GACGGT TAG GTT CAC ACA GGA AAC AGC TAT GAC TGG ATG GAT GGA TGG AT。
两种MIP均与各自的靶重复杂交，有长度为17个碱基对的杂交末端。其它条件与典型的实验步骤相同，除了使用50℃的较低杂交温度以外。将参考人类DNA样品用作模板。将不同输入量的模板DNA用作测试样品，以检查连接点的测量作为样品中存在的端粒基序的量的指标的线性和精度。评价了50ng、37.5ng、25ng和12.5ng的输入DNA的四个样品。还包括水空白对照。所有样品以一式三份进行以评价测定精度。
这对短MIP显著增强了测定中使用的典型DNA量(50ng)和作为模板对照的水之间的区别。端粒基序和4bp(ATGG)基序的Ct的差值分别为>8.5个循环和～6个循环。这些差值对应于>60倍的特异性。
表VI使用短的MIP设计，通过连续稀释一个样品得到的不同输入DNA量的结果(结果绘制在图7中)
如以上实施例中所述，可以计算2种MIP测定的总效率。与基于效率校正的qPCR中的相对定量方法类似，在MIP测定中使用总效率来校正2种基序的Ct值的斜率差。因此，可以分析总效率(斜率)校正的相对比率。首先，计算图7中两条回归线的效率(斜率)。端粒基序和4bp(ATGG)基序的斜率分别为-3.06和-2.46。
然后，基于2条回归线，将37.5ng样品的Ct值用作基准样品。效率计算为10^(-1/斜率)。
端粒连接点与4bp(ATGG)基序连接点相对于基准样品的丰度的效率(斜率)校正的相对比率等于：
[端粒基序的效率^(参考样品与测试样品之间的ΔCt)]/[4bp基序的效率^(参考样品与测试样本之间的ΔCt)]
利用该指标值，即效率(斜率)校正的相对比率，端粒长度被表示为与参考样品相比的比率。一式三份的平均值范围为0.985至1.038。这是由这种新方法产生的端粒长度的新指标的实例。它代表端粒长度相对于参考样品的比率。例如，50ng样品的端粒长度是参考样品(37.5ng样品)的0.99x。期望值为1，因为所有样品均来源于还用作参考样品的相同人类对象。结果显示，效率(斜率)校正的相对比率消除了由于输入DNA量的差异而引起的任何偏差效应。
实施例10：基于端粒MIP和基因组参考MIP的连接点丰度得出端粒长度指标值的其
它计算方法
多种方法可以用于定量qPCR中PCR产物的确切量，包括相对和绝对定量方法。在另一个实施方案中(参见以上实施例)，可以对参考样品的连续稀释液进行定量以获得Ct值来计算总测定效率。参考样品可以用于所有qPCR批次和样品中，并与相同参考样品进行比较以去除由于qPCR Ct值中的板间变化引起的批次影响。这些方法被称为Δ-Δ-Ct方法和效率校正的Δ-Δ-Ct方法。它们在本文用于定量两种MIP的连接点。
此外，如果将具有已知(给定)连接点数量的校准物与测试样品一起用于同一qPCR中，则可以进行qPCR的绝对定量。这样的方法被称为qPCR结果的绝对定量。
在其它实施方案中，可以进行连接点丰度的其它定量方法，包括数字PCR和测序。
实施例11：用于定量表观遗传标志物的进一步扩展
在DNA样品预消化步骤中，向预消化的DNA样品中加入甲基化敏感的限制酶使得能够在基因组规模上定量甲基化的程度。比较来自相同样品的两个反应的结果，即甲基化敏感的限制酶(其切割DNA的能力取决于甲基化核苷酸的存在)和识别相同限制位点的甲基化不敏感的限制酶(同裂酶)。例如，可以使用酶对HpaII(甲基化敏感的)和MspI。将设计用于靶向CpG岛的新MIP与基因组参考MIP，如本文使用的4bp(ATGG)MIP一起使用。
在一个实施方案中，首先通过靶标富集方法分离感兴趣的特定靶基因组区，所述方法中的许多方法是本领域已知的。例如，基于阵列的捕获或溶液中捕获是有用的捕获方法，其可以用于分离感兴趣的靶基因组区。在靶标富集后，可以处理样品以定量重复基序，以检测基序的扩增(长度)。该方法可以用于例如检测与多种疾病相关的三核苷酸重复扩增。
实施例12：替代实施方案
在端粒长度的估计中所用的实验步骤、MIP靶标、探针、引物和酶使用可能存在变化。这样的变化包括：
(a)更短的杂交步骤持续时间，例如2小时的杂交
(b)更简单的杂交温度方案
(c)使用其它稳定的短串联重复作为第二MIP的靶标。例如，[AAGG]n串联重复可以用作靶标。查询[AAGG]n的相应MIP为：5’-GAA GGAA GGAA GGAA GGAA GGGGCGCTTCAGCTTCCCGATCCGACGGTAGTGTTCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA CAA GGAA GGAA GGAA GGAA GG-3’。末端的磷酸化和羟基化要求与典型方案中的相同。
(d)可以使用与典型方案中的那些酶具有类似特性的其它酶。
(e)在扩大生产阶段测定的实验中，杂交步骤的持续时间可以缩短至16小时。
(f)使用如表VII中所示的另外的探针和引物。
表VII另外的探针和引物
实施例13：杂交、延伸和连接反应的替代实施方案的方案
DNA样品的限制酶预处理
50-500ng DNA可以用于单独样品中以定量端粒长度(TL)。向DNA样品中加入多达10单位的两种限制酶，例如AluI和DdeI(New England Biolabs)，并将样品在37℃下温育1小时。然后将酶在80℃灭活20min。以7,000rpm离心10min并收集上清液后，消化后的样品可以保持在4℃。
MIP杂交步骤
使用与实施例2中相同的靶向人端粒重复的MIP探针，其中MIP探针靶向(AAGG)重复基序。
靶向端粒重复基序的探针(缺口为“GG”)：
MIP-TelF+A:/5Phos/GT TAG GGT TAG GGT TAG GGT TAC TTC AGC TTC CCG ATCCGA CGG TAG TGT TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA CTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA。
靶向(AAGG)重复基序的另一种探针(缺口为“GAA”)：
MIP-AAGGpure:/5Phos/GG AAGG AAGG AAGG AAGG AAGG TCG ATC CGA CAG CTTCCG TAG CGG TTT CAC ACA GGA AAC AGC TAT GAC TCA CAG AAGG AAGG AAGG AAGG AAGGAAG。
在杂交混合物中如下进行杂交程序过夜：(括号中的值为储备浓度)：
以以下温度循环，在热循环仪中进行杂交方案，但同样可以使用本领域已知的其它合适的设备进行杂交方案：
在杂交程序后，将5μl杂交混合物加入至15μl缺口填充和连接反应试剂(以下所示)中，将其预热至50℃。
缺口填充和连接步骤
在37℃下制备带有dGTP和dATP的缺口填充和连接反应试剂，或在制备后将其预温并保持在37℃(括号中的值为储备浓度)：
将5μl的杂交混合物预热至50℃，持续30分钟，然后加入15μl预温的缺口填充和连接反应试剂。
然后，如下进行缺口填充和连接反应以产生具有2种MIP探针的连接点的MIP产物：
37℃，持续30分钟，然后
45℃，持续5分钟，然后
95℃，持续10分钟，然后
4℃并保持。
连接点步骤的定量
缺口填充和连接后的MIP产物可以用于连接点的定量，作为基因组基序数量的量度。在该实施方案中，使用了qPCR，但也可以容易地使用其他技术。
qPCR中使用了四种引物和两种TaqMan探针。
Long GC_Telo_F GGTCCGAGCCAGC TAT GAC TAG GGT TAG GG
LongGC_Link_R_tel尾GCGCATGTGA ATC GGG AAG CTG AAG TAA CC
LongGC_M13F+6GCTGCCTCGC AGG AAA CAG CTA TGA CTC ACA G
LongGC_AAGG_R GGTGCGTCGC GCT GTC GGA TCG ACC TTC CTT
Taqman_long_Telo/56-FAM/TA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGGT/3IABkFQ/
Taqman_AAGG/5HEX/AAG GAA GGA AGG AAG GAA GG/3IABkFQ/
在qPCR之前，将所有样品、标准品和校准品的缺口填充和连接的产物用水稀释100倍。因此，所有样品、标准品和校准品均具有相同的稀释倍数。
qPCR反应管制备(总体积为15μl)如下：
在Roche LC480热循环仪中按照如下PCR温度循环方案进行qPCR：
5.转到2，40个循环
实施例14：端粒长度的线性反应和指标值不受用于杂交的不同起始DNA量的影响
的证实
将参考样品稀释成一系列不同的DNA浓度，以使样品中存在不同量(丰度)的端粒重复和AAGG重复。将它们制备成样品，并向杂交反应中加入这些总DNA量：160ng、80ng、40ng和20ng。在实施例13中所述的端粒测定方案中，这四个量中的每一个重复使用。结果显示在以下表VIII中。使用Δ-Ct(2种MIP探针的两个Ct值之差)得出的端粒长度的平均指标值为0.945，变异系数为6.32％。
将输入的DNA量进行对数转换，并且结果显示在图9的X轴上。在此相对定量分析中，将2种MIP靶标(MIP-TelF+A和MIP-AAGGpure)的qPCR的阈值循环(Ct值，在其他参考文本中也称为Cq)针对输入DNA量(对数标尺)作图。
通过qPCR对两种靶标(分别代表由MIP-TelF+A和MIP-AAGGpure形成的连接点)的丰度的定量显示了输入DNA量和相应阈值循环(Ct值)之间的良好线性。测定系数(r2)为0.999和0.997。
两条回归线的斜率分别为-3.05和-3.021。可以使用系列稀释样品以类似于计算qPCR效率的方式来计算测定的总效率。然而，MIP测定的总的综合效率并入了如实施例13中所述的所涉及的所有反应步骤的效率，即MIP杂交步骤、缺口填充-连接步骤和定量连接点步骤。相比之下，在典型的qPCR测定中通常提及的qPCR的效率仅描述了qPCR的效率。
将总效率计算为图9中结果的10^(-1/斜率)。因此，针对MIP-TelF+A(端粒探针)和MIP-AAGGpure(AAGG探针)的MIP测定效率均为2.1。它们接近理想效率值2。
利用这些接近理想的总效率值，通过使用给定或已知的端粒长度值(以kbp计)的样品可以容易地校准端粒长度。通过本发明的方法一起测定这些基准样品和未知TL的样品，然后通过定量基准样品和未知样品的连接点获得的指标值可以转化到以kbp为单位的TL。
如先前的实施例所示，可以通过以下计算方法中的一种获得指标值：Δ-Ct方法、Δ-Δ-Ct方法和效率校正的Δ-ΔCt方法。
表VIII具有不同输入DNA量的实施例13方案的结果
实施例15：使用基准样品将连接点的指标值转化到以kbp为单位的TL
通过使用一个或多个具有给定已知TL的基准样品，可以将本发明测定法产生的指标值转化到以kbp为单位的TL。在使用类似于实施例13的程序的实验中，测定了四个已知TL的样品。它们的指标值和用于两种探针的连接点的qPCR的原始数据显示在表IX中。
TL的指标值基于如实施例V中给出的端粒(MIP-TelF+A)连接点与AAGG基序(MIP-AAGGpure)连接点的丰度的效率校正的相对比率。该批次中的参考样品分别具有23.7和24.2的相应Ct值，并且反应效率分别为1.88和1.85。
这些基准样品的TL与指标值之间的相关性显示在图10中。测定的相关性(r2)接近1。基准样品的TL覆盖人类样品中的TL的典型值。
基于图10中所示的回归公式，可以通过线性回归方法推导出其它未知TL的样品的TL。
表IX基准样品的连接点的定量结果
实施例16：使用数字液滴PCR(ddPCR)定量2种MIP探针的连接点
可以通过数字液滴PCR定量实施例2、实施例13或类似实施方案的缺口填充和连接步骤后形成的MIP产物中的连接点，以确定用于评估端粒长度的指标值。
该实施方案使用通过以下MIP探针产生的MIP产物；
靶向端粒重复基序的探针：
MIP-TelF:/5Phos/GT TAG GGT TAG GGT TAG GGT TAC TTC AGC TTC CCG ATCCGA CGG TAG TGT TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA CTA GGG TTA GGG TTA GGG TT
靶向着丝粒的α卫星序列的探针：
MIP-Centv2:5'/Phos/gtc TAG GTT TGA TGT GAA GAT Ata ccc gCT TCA GCTTCC CGA TCC GAC GGT agg ttT CAC ACA GGA AAC AGC TAT GAC tca cag aaA ACG TTCTGA GAA TGC
在缺口填充和连接步骤后，将MIP产物稀释50倍，并且在每个ddPCR反应中使用5μl。
在ddPCR中使用四种引物和两种TaqMan探针。
M13_MIP_L2:GCGGGCAGGGCGGCtctagaTCACACAGGAAA CAGCTATGAC
MIP_LinkC-2Ls:GGCCCTACCGTCGGATCGGGAAGC
M13_Cent_v2-s:GGCCTATGACTCACAGAAAACGTTCTGAG
Linker_v2-s:CTACCGTCGGATCGGGAAG
TaqMan探针:
Taqman-3-Telo:/56-FAM/TAG GGT TAG GGT TAG GGT T/3IABkFQ/
Taq-cent:/5HEX/GTC TAG GTT TGA TGT GAA GAT ATA CCC G CTT/3IABkFQ/
在20μl的总反应体积中用以下试剂进行数字PCR(ddPCR)(括号中的值为储备浓度):
ddPCR热循环方案如下：
由MIP-TelF形成的端粒连接点的数字计数(图11)为551和567个拷贝/μl(一个样品二次重复反应)，并且由MIP-Centv2形成的着丝粒α卫星连接点的数字计数为95和97个拷贝/μl(一个样品二次重复反应)。因此，这些二次重复物的指标值分别为5.8和5.85。
序列信息
SEQ ID NO:1(MIP-TelF)
5'/Phos/GT TAG GGT TAG GGT TAG GGT TAC TTC AGC TTC CCG ATC CGA CGGTAG TGT TCACAC AGG AAA CAG CTA TGA CTA GGG TTA GGG TTA GGG TT
SEQ ID NO:2(MIP-TelF+A)
5’Phos/GT TAG GGT TAG GGT TAG GGT TAC TTC AGC TTC CCG ATC CGA CGG TAGTGT TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA CTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA
SEQ ID NO:3(ShortMIPtelo)
5’Phos/G GT TAG GGT TAG GGT TAC TTC AGC TTC CCG ATC CGA CGG TAG TGTTCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C GG TTA GGG TTA GGG TTA
SEQ ID NO:4(MIP-TelF,MIP-TelF+A的5’同源区)
GT TAG GGT TAG GGT TAG GGT TA
SEQ ID NO:5(ShortMIPtelo的5’同源区)
G GT TAG GGT TAG GGT TA
SEQ ID NO:6(MIP-TelF的3’同源区)
TA GGG TTA GGG TTA GGG TT
SEQ ID NO:7(MIP-TelF+A的3’同源区)
TA GGG TTA GGG TTA GGG TTA
SEQ ID NO:8(ShortMIPtelo的3’同源区)
GG TTA GGG TTA GGG TTA
靶向(AAGG)n的序列的4-bp基序的MIP探针
SEQ ID NO:9(AAGG:MIP-2019AAGGpure)
/5Phos/ggaaggaaggaaggaaggaaggTCGATCCGACAGCTTCCGTagCGgttTCACACAGGAAACAGCTATGACtcacagaaggaaggaaggaaggaaggaag
qPCR中使用的另外的引物
SEQ ID NO:10(Long GC_Telo_F G)
GGTCCGAGCCAGC TAT GAC TAG GGT TAG GG
SEQ ID NO:11(longGC_Link_R_tel尾)
gcgcatgtgaATC GGG AAG CTG AAG TAA CC
SEQ ID NO:12(longGC_M13F+6)
GCTGCCTCGC AGG AAA CAG CTA TGA CTC ACA G
SEQ ID NO:13(longGC_AAGG_R)
GGTGCGTCGC GCT GTC GGA TCG ACC TTC CTT
Taqman探针
SEQ ID NO:14(Taqman_long_Telo(FAM))
5’FAM-TA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGGT
SEQ ID NO:15(Taqman_AAGG(HEX))
5’HEX-AAG GAA GGA AGG AAG GAA GG
SEQ ID NO:16(longGC_M13_F)
ggcgcatggcTCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C
SEQ ID NO:17(longGC_Link_R_ATGG)
gcatggcgacaATC GGG AAG CTG AAG CCA tccat
SEQ ID NO:18(Taq-3-Telo(对于端粒MIP))
/56-FAM/TA GGG TTA G/ZEN/G GTT AGG GTT/3IABkFQ
SEQ ID NO:19(Taq-3-ATGG(对于ATGG MIP))
/5HEX/GG ATG GAT G/ZEN/G ATG GAT GGA T/3IABkFQ
SEQ ID NO:20(MIP-ATGG)
/5Phos/AT GGA TGG ATG GAT GGA TGG ATG GCT TCA GCT TCC CGA TCC GAC GGTTAG GTT CAC ACA GGA AAC AGC TAT GAC GGA TGG ATG GAT GGA TGG AT
SEQ ID NO:21(ShortMIP4bp)
/5Phos/G ATG GAT GGA TGG ATG GCT TCA GCT TCC CGA TCC GAC GGT TAG GTTCAC ACA GGA AAC AGC TAT GAC TGG ATG GAT GGA TGG AT
SEQ ID NO:22(查询[AAGG]n的MIP)
5’-GAA GGAA GGAA GGAA GGAA GGGGCGCTTCAGCTTCCCGATCCGACGGTAGTGTTCA CACAGG AAA CAG CTA TGA CAA GGAA GGAA GGAA GGAA GG-3’
SEQ ID NO:23(MIP-AAGGpure)
/5Phos/GG AAGG AAGG AAGG AAGG AAGG TCG ATC CGA CAG CTT CCG TAG CGGTTT CAC ACA GGA AAC AGC TAT GAC TCA CAG AAGG AAGG AAGG AAGG AAGG AAG
SEQ ID NO:24(MIP-Centv2)
5'/Phos/gtc TAG GTT TGA TGT GAA GAT Ata ccc gCT TCA GCT TCC CGA TCCGAC GGT agg ttT CAC ACA GGA AAC AGC TAT GAC tca cag aaA ACG TTC TGA GAA TGC
SEQ ID NO:25(M13_MIP_L2)
GCGGGCAGGGCGGCtctagaTCACACAGGAAACAGCTATGAC
SEQ ID NO:26(MIP_LinkC-2Ls)
GGCCCTACCGTCGGATCGGGAAGC
SEQ ID NO:27(M13_Cent_v2-s)
GGCCTATGACTCACAGAAAACGTTCTGAG
SEQ ID NO:28(Linker_v2-s)
CTACCGTCGGATCGGGAAG
SEQ ID NO:29(Taq-cent)
/5HEX/GTC TAG GTT TGA TGT GAA GAT ATA CCC G CTT/3IABkFQ/
SEQ ID NO:30(图1示例的LL-MIP产物序列)
GCGCATGTGAATCGGGAAGCTGAAGTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAACACTACCGTCGGATCGGGAAGCTGAAGTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAACACTACCGTCGGATCGGGAAGCTGAAGTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAGTCATAGCTGTTTCCCGTGTGAACACTACCGTCGGATCGGGAAGCGAAGTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAACACTACCGTCGGATCGGAAGCTGAATAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAACACTACCGTCGGATCGGGAAGCTGAAGTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAGCCATGCGCC
尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例的方式相当详细地描述了上述发明，但本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。此外，本文提供的每个参考文献通过引用以其整体并入，其程度如同每个参考文献单独通过引用并入。
引用的参考文献
Absalan,Farnaz,and Mostafa Ronaghi.2007.“Molecular Inversion ProbeAssay.”Methods in Molecular Biology.doi.org/10.1385/1-59745-515-6:315.
Cawthon,Richard.2012.Methods of predicting mortality risk bydetermining telomere length.EP2474822A1.
Cawthon,Richard M.2009.“Telomere Length Measurement by a NovelMonochrome Multiplex Quantitative PCR Method.”Nucleic Acids Research.doi.org/10.1093/nar/gkn1027.
Cawthon,Richard M.2010.Monochrome multiplex quantitativepcr.WO2010075413A1.
Cawthon,Richard M.2010.Reducing non-target nucleic acid dependentamplifications:amplifying repetitive nucleic acid sequences.US7695904.
Cawthon,Richard M.,Richard A.Kerber,Sandra J.Hasstedt,and ElizabethO’Brien.2011.Methods and kits for determining biological age and longevitybased on gene expression profiles.US20110207128A1.
Cawthon,R.M.2002.“Telomere Measurement by Quantitative PCR.”NucleicAcids Research.doi.org/10.1093/nar/30.10.e47.
Hardenbol,Paul,Johan Banér,Maneesh Jain,Mats Nilsson,EugeniA.Namsaraev,George A.Karlin-Neumann,Hossein Fakhrai-Rad,et al.2003.“Multiplexed Genotyping with Sequence-Tagged Molecular Inversion Probes.”Nature Biotechnology.doi.org/10.1038/nbt821.
Harley,Calvin.2014.Saliva-derived measures of telomere abundance andsample collection device.US20140370505A1
Harley,Calvin,Jue Lin,and Karl Guegler.2018.Multiplex quantitativePCR.US9944978.
Keefe,David,Sherman Weissman,Lin Liu,Fang Wang,and Xinghua Pan.2016.Amethod for a single cell analysis of telomere length.US20160032360A1.
Litterst,Claudia,Austin P.SO,and Duc Do.2014.Digital assays with areporter for amplicon length.WO2014031908A1.
Litterst,Claudia,and Luis A.Ugozzoli.2016.Digital assay for telomerelength.US9347094B2.
Martin-Ruiz,Carmen M.,Duncan Baird,Laureline Roger,Petra Boukamp,Damir Krunic,Richard Cawthon,Martin M.Dokter,et al.2015.“Reproducibility ofTelomere Length Assessment:An International Collaborative Study.”International Journal of Epidemiology.doi.org/10.1093/ije/dyu191.
Nilsson,Mats,Helena Malmgren,Martina Samiotaki,Marek Kwiatkowski,Bhanu P.Chowdhary,and Ulf Landegren.1994.“Padlock Probes:CircularizingOligonucleotides for Localized DNA Detection.”Science.doi.org/10.1126/science.7522346.
Syvanen,Ann Christine.2005.“Toward Genome-Wide Snp Genotyping.”NatureGenetics.doi.org/10.1038/ng1558.
序列表
<110> 香港中文大学(The Chinese University of Hong Kong)
<120> 定量端粒长度和基因组基序的方法
<150> 62/856,449
<151> 2019-06-03
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 91
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化
<400> 1
gttagggtta gggttagggt tacttcagct tcccgatccg acggtagtgt tcacacagga 60
aacagctatg actagggtta gggttagggt t 91
<210> 2
<211> 92
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化
<400> 2
gttagggtta gggttagggt tacttcagct tcccgatccg acggtagtgt tcacacagga 60
aacagctatg actagggtta gggttagggt ta 92
<210> 3
<211> 84
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化
<400> 3
ggttagggtt agggttactt cagcttcccg atccgacggt agtgttcaca caggaaacag 60
ctatgacggt tagggttagg gtta 84
<210> 4
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttagggtta gggttagggt ta 22
<210> 5
<211> 17
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttagggtt agggtta 17
<210> 6
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tagggttagg gttagggtt 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tagggttagg gttagggtta 20
<210> 8
<211> 17
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggttagggtt agggtta 17
<210> 9
<211> 99
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化
<400> 9
ggaaggaagg aaggaaggaa ggtcgatccg acagcttccg tagcggtttc acacaggaaa 60
cagctatgac tcacagaagg aaggaaggaa ggaaggaag 99
<210> 10
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggtccgagcc agctatgact agggttaggg 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcgcatgtga atcgggaagc tgaagtaacc 30
<210> 12
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gctgcctcgc aggaaacagc tatgactcac ag 32
<210> 13
<211> 31
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggtgcgtcgc gctgtcggat cgaccttcct t 31
<210> 14
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> FAM
<400> 14
tagggttagg gttagggtta gggt 24
<210> 15
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> HEX
<400> 15
aaggaaggaa ggaaggaagg 20
<210> 16
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggcgcatggc tcacacagga aacagctatg ac 32
<210> 17
<211> 34
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcatggcgac aatcgggaag ctgaagccat ccat 34
<210> 18
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 6-FAM
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> ZEN
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> IABkFQ
<400> 18
tagggttagg gttagggtt 19
<210> 19
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> HEX
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> ZEN
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> IABkFQ
<400> 19
ggatggatgg atggatggat 20
<210> 20
<211> 94
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化
<400> 20
atggatggat ggatggatgg atggcttcag cttcccgatc cgacggttag gttcacacag 60
gaaacagcta tgacggatgg atggatggat ggat 94
<210> 21
<211> 84
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化
<400> 21
gatggatgga tggatggctt cagcttcccg atccgacggt taggttcaca caggaaacag 60
ctatgactgg atggatggat ggat 84
<210> 22
<211> 95
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gaaggaagga aggaaggaag gggcgcttca gcttcccgat ccgacggtag tgttcacaca 60
ggaaacagct atgacaagga aggaaggaag gaagg 95
<210> 23
<211> 99
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化
<400> 23
ggaaggaagg aaggaaggaa ggtcgatccg acagcttccg tagcggtttc acacaggaaa 60
cagctatgac tcacagaagg aaggaaggaa ggaaggaag 99
<210> 24
<211> 102
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化
<400> 24
gtctaggttt gatgtgaaga tatacccgct tcagcttccc gatccgacgg taggtttcac 60
acaggaaaca gctatgactc acagaaaacg ttctgagaat gc 102
<210> 25
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gcgggcaggg cggctctaga tcacacagga aacagctatg ac 42
<210> 26
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggccctaccg tcggatcggg aagc 24
<210> 27
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggcctatgac tcacagaaaa cgttctgag 29
<210> 28
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ctaccgtcgg atcgggaag 19
<210> 29
<211> 31
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> HEX
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> IABkFQ
<400> 29
gtctaggttt gatgtgaaga tatacccgct t 31
<210> 30
<211> 556
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gcgcatgtga atcgggaagc tgaagtaacc ctaaccctaa ccctaaccct aaccctaacc 60
ctaaccctag tcatagctgt ttcctgtgtg aacactaccg tcggatcggg aagctgaagt 120
aaccctaacc ctaaccctaa ccctaaccct aaccctagtc atagctgttt cctgtgtgaa 180
cactaccgtc ggatcgggaa gctgaagtaa ccctaaccct aaccctaacc ctaaccctaa 240
ccctaaccct agtcatagct gtttcccgtg tgaacactac cgtcggatcg ggaagcgaag 300
taaccctaac cctaacccta accctaaccc taaccctagt catagctgtt tcctgtgtga 360
acactaccgt cggatcggaa gctgaataac cctaacccta accctaaccc taaccctaac 420
cctaacccta gtcatagctg tttcctgtgt gaacactacc gtcggatcgg gaagctgaag 480
taaccctaac cctaacccta accctaaccc taaccctaac cctagtcata gctgtttcct 540
gtgtgagcca tgcgcc 556
Claims (46)
1.用于测定端粒长度和/或串联重复序列的拷贝数的单链DNA探针，所述探针包含：
i)5’同源区，其延伸至所述探针的5’末端并且包含与所述串联重复序列互补的核苷酸序列；
ii)接头区；和
iii)3’同源区，其延伸至所述探针的3’末端并且包含与所述串联重复序列互补的核苷酸序列，使得所述5’同源区和3’同源区能够结合包含所述串联重复序列的模板DNA的同一条链；其中
在所述5’同源区和所述3’同源区与模板DNA的同一条链结合时，使得所述3’同源区紧接所述模板上单个重复单元内所述5’同源区的3’，并且因此所述3’同源区的3’末端和所述5’同源区的5’末端被所述模板DNA上小于一个完整重复单元的核苷酸缺口隔开，
所述小于一个完整重复单元的核苷酸缺口包含至多2种不同的碱基。
2.如权利要求1所述的探针，其中所述串联重复序列为端粒序列。
3.如权利要求2所述的探针，其中所述端粒为人类端粒。
4.如权利要求1所述的探针，其中所述5’同源区和3’同源区的核苷酸序列与所述串联重复序列100％互补。
5.如权利要求1所述的探针，其中所述5’同源区和3’同源区的长度各自为15-25个核苷酸。
6.如权利要求1所述的探针，其中所述串联重复序列的每个重复单元的长度为2-10个核苷酸。
7.如权利要求1所述的探针，其中所述接头区包含一个或多个序列元件，其选自通用引物序列、探针特异性引物序列、TaqMan探针序列和标签序列。
8.如权利要求1所述的探针，其中当结合在所述模板DNA上的单个重复单元内时，所述3’同源区的3’末端和所述5’同源区的5’末端被1个或2个核苷酸隔开。
9.如权利要求8所述的探针，其中所述1个或2个核苷酸包含碱基G。
10.如权利要求1所述的探针，其中当结合在所述模板DNA上的单个重复单元内时，所述3’同源区的3’末端和所述5’同源区的5’末端被3个核苷酸隔开。
11.如权利要求10所述的探针，其中所述3个核苷酸包含2种不同的碱基，并且其中所述2种不同的碱基为A和G。
12.如权利要求1所述的探针，其中所述5’同源区包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
13.如权利要求1所述的探针，其中所述3’同源区包含SEQ ID NOs:6-8中任一个的核苷酸序列。
14.如权利要求1所述的探针，其中所述探针包含SEQ ID NOs:1-3中任一个的核苷酸序列。
15.用于测定基因组内可变串联重复序列的拷贝数的试剂盒，其包含：
权利要求1所述的第一单链DNA探针，其中所述第一DNA探针的5’和3’同源区与在基因组中的拷贝数在个体之间变化的串联重复序列互补；和
权利要求1所述的第二单链DNA探针，其中所述第二DNA探针的5’和3’同源区与在基因组中的拷贝数在个体之间稳定的串联重复序列互补；其中
所述第一探针的核苷酸缺口所包含的至多两种碱基也被所述第二探针的核苷酸缺口所包含。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其还包含反应混合物，所述反应混合物包含DNA聚合酶、包含连接酶活性的酶以及对应于所述第一和第二探针的核苷酸缺口所包含的至多两种碱基的脱氧核糖核苷三磷酸。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述DNA聚合酶为T4DNA聚合酶。
18.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述连接酶活性由Amp连接酶提供。
19.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述反应混合物不包含核酸外切酶。
20.如权利要求15所述的试剂盒，其还包含测试样品基因组DNA。
21.如权利要求15所述的试剂盒，其还包含通用引物、两种或更多种探针特异性引物、或者与所述第一和/或第二探针的接头区内的序列互补的两种或更多种TaqMan探针。
22.如权利要求15所述的试剂盒，其中由所述第一探针的5’和3’同源区识别的串联重复序列为端粒序列。
23.如权利要求22所述的试剂盒，其中端粒为人类端粒。
24.如权利要求15所述的试剂盒，其中由所述第二探针的5’和3’同源区识别的串联重复序列为4bp的短串联重复。
25.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述第一探针的5’和3’同源区的核苷酸序列与在基因组中的拷贝数在个体之间变化的串联重复序列100％互补。
26.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述第二探针的5’和3’同源区的核苷酸序列与在基因组中的拷贝数在个体之间稳定的串联重复序列100％互补。
27.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述第一和/或第二探针的5’和/或3’同源区的长度为15至25个核苷酸。
28.如权利要求15所述的试剂盒，其中由所述第一和/或第二探针识别的串联重复序列的重复单元的长度为3-6个核苷酸。
29.测定个体基因组中可变长度的串联重复序列区的长度的方法，所述方法包括：
i)提供权利要求1所述的第一单链DNA探针，其中所述第一DNA探针的5’和3’同源区与在基因组中的拷贝数在个体之间变化的串联重复序列互补；和
ii)提供权利要求1所述的第二单链DNA探针，其中所述第二DNA探针的5’和3’同源区与在基因组中的拷贝数在个体之间稳定的串联重复序列互补；其中
所述第一探针的核苷酸缺口所包含的至多两种碱基也被所述第二探针的核苷酸缺口所包含；
iii)在有助于所述探针的3’末端的延伸和与结合至同一模板的探针的5’末端连接的条件下，在DNA聚合酶、连接酶活性和对应于所述第一和第二探针的脱核苷酸缺口所包含的碱基的至多两种脱氧核糖核苷三磷酸的存在下，使来自所述个体的生物样品与所述第一和第二探针接触；
iv)定量在步骤iii)中产生的所述第一和/或第二探针的环化和连接的线性探针产物；以及
v)使用所述第一和/或第二探针的环化和连接的线性探针产物的相对量来确定所述第一和/或第二探针的连接点的归一化丰度，其是个体基因组中的探针靶向的串联重复长度的指标。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述第一和第二探针的5’和3’同源区的核苷酸序列分别与第一和第二串联重复序列100％互补。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述探针的5’和3’同源区的长度为15-25个核苷酸。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述可变串联重复序列区为端粒。
33.如权利要求32所述的方法，其中端粒为人类端粒。
34.如权利要求29所述的方法，其中每个探针的接头区包含一个或多个序列元件，其选自通用引物序列、探针特异性引物序列、TaqMan探针序列和标签序列。
35.如权利要求29所述的方法，其中当结合在所述串联重复序列上的单个重复单元内时，所述探针的3’同源区的3’末端和5’同源区的5’末端被1个或2个核苷酸的缺口隔开，其中所述1个或2个核苷酸包含单一碱基，并且其中在步骤iii)中仅提供对应于单一碱基的一个脱氧核糖核苷三磷酸。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述单一碱基为G。
37.如权利要求29所述的方法，其中当结合在所述串联重复序列上的单个重复单元内时，步骤i)中的探针或步骤ii)中的探针的3’同源区的3’末端和5’同源区的5’末端被3个核苷酸的缺口隔开，其中3个核苷酸包含2种碱基，并且其中在步骤iii)中提供了对应于所述2种碱基的两个脱氧核糖核苷三磷酸。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述2种碱基为A和G。
39.如权利要求29所述的方法，其中步骤i)中的探针的5’同源区包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
40.如权利要求29所述的方法，其中步骤i)中的探针的3’同源区包含SEQ ID NOs:6-8中任一个的核苷酸序列。
41.如权利要求29所述的方法，其中步骤i)中的探针包含SEQ ID NOs:1-3中任一个的核苷酸序列。
42.如权利要求29所述的方法，其中相对于所述生物样品中基因组DNA的量，提供了大量过量的步骤i)和ii)中的探针。
43.如权利要求29所述的方法，其中在步骤i)至v)期间不添加核酸外切酶。
44.如权利要求29所述的方法，其中在步骤i)至v)期间添加的唯一核酸外切酶为核酸外切酶I，并且其中核酸外切酶I的水平不超过20个单位/50ng基因组DNA并且存在最多1小时。
45.如权利要求29所述的方法，其中使用选自定量PCR、数字PCR和测序的方法测定所述探针的环化和连接的线性探针产物的量。
46.如权利要求29所述的方法，其中仅使用所述第一单链探针，并且其中另一种方法用于定量输入样品DNA的量。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201962856449P | 2019-06-03 | 2019-06-03 | |
| US62/856,449 | 2019-06-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112029841A true CN112029841A (zh) | 2020-12-04 |
| CN112029841B CN112029841B (zh) | 2024-02-09 |
Family
ID=73579686
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010494147.6A Active CN112029841B (zh) | 2019-06-03 | 2020-06-03 | 定量端粒长度和基因组基序的方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11639521B2 (zh) |
| CN (1) | CN112029841B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103228798A (zh) * | 2010-09-24 | 2013-07-31 | 斯坦福大学托管董事会 | 使用固定的引物直接捕获、扩增及测序靶标dna |
| CN103642944A (zh) * | 2013-12-17 | 2014-03-19 | 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 | 用于检测乙型肝炎病毒yvdd耐药突变的分子倒置探针及其应用 |
| WO2014143994A2 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Good Start Genetics, Inc. | Methods and compositions for evaluating genetic markers |
| CN105283559A (zh) * | 2013-05-22 | 2016-01-27 | 端粒诊断公司 | 短端粒丰度的量度 |
| CN105934523A (zh) * | 2013-12-02 | 2016-09-07 | 瓦纳迪斯诊断公司 | 核酸的多重检测 |
| CN106244578A (zh) * | 2015-06-09 | 2016-12-21 | 桑特里莱恩科技控股公司 | 用于对核酸进行测序的方法 |
| CN106661631A (zh) * | 2014-06-06 | 2017-05-10 | 康奈尔大学 | 使用组合的核酸酶、连接酶、聚合酶和测序反应识别和枚举核酸序列、表达、拷贝或dna甲基化变化的方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4515767B2 (ja) | 2002-01-31 | 2010-08-04 | ユニバーシティ・オブ・ユタ | 非標的核酸依存性増幅の低減：反復核酸配列の増幅 |
| CA2513747C (en) | 2003-01-24 | 2017-03-07 | University Of Utah | Methods of predicting mortality risk by determining telomere length |
| US9702822B2 (en) | 2012-08-23 | 2017-07-11 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital assays with a reporter for amplicon length |
| EP2379747B1 (en) | 2008-12-22 | 2013-07-03 | University of Utah Research Foundation | Monochrome multiplex quantitative pcr |
| US20130337447A1 (en) * | 2009-04-30 | 2013-12-19 | Good Start Genetics, Inc. | Methods and compositions for evaluating genetic markers |
| US20110207128A1 (en) | 2010-02-16 | 2011-08-25 | Cawthon Richard M | Methods and kits for determining biological age and longevity based on gene expression profiles |
| AU2012362210A1 (en) | 2011-12-31 | 2014-08-21 | Telomere Diagnostics, Inc. | Saliva-derived measures of telomere abundance and sample collection device |
| US9347094B2 (en) | 2013-02-01 | 2016-05-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital assay for telomere length |
| WO2014152676A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | New York University | A method for a single cell analysis of telomer length |
| US9944978B2 (en) | 2014-12-30 | 2018-04-17 | Telomere Diagnostics, Inc. | Multiplex quantitative PCR |
-
2020
- 2020-06-03 US US16/891,452 patent/US11639521B2/en active Active
- 2020-06-03 CN CN202010494147.6A patent/CN112029841B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103228798A (zh) * | 2010-09-24 | 2013-07-31 | 斯坦福大学托管董事会 | 使用固定的引物直接捕获、扩增及测序靶标dna |
| WO2014143994A2 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Good Start Genetics, Inc. | Methods and compositions for evaluating genetic markers |
| CN105283559A (zh) * | 2013-05-22 | 2016-01-27 | 端粒诊断公司 | 短端粒丰度的量度 |
| CN105934523A (zh) * | 2013-12-02 | 2016-09-07 | 瓦纳迪斯诊断公司 | 核酸的多重检测 |
| CN103642944A (zh) * | 2013-12-17 | 2014-03-19 | 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 | 用于检测乙型肝炎病毒yvdd耐药突变的分子倒置探针及其应用 |
| CN106661631A (zh) * | 2014-06-06 | 2017-05-10 | 康奈尔大学 | 使用组合的核酸酶、连接酶、聚合酶和测序反应识别和枚举核酸序列、表达、拷贝或dna甲基化变化的方法 |
| CN106244578A (zh) * | 2015-06-09 | 2016-12-21 | 桑特里莱恩科技控股公司 | 用于对核酸进行测序的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| KEISHA D. CARLSON ET AL.: "MIPSTR: a method for multiplex genotyping of germline and somatic STR variation across many individuals", GENOME RESEARCH, vol. 25, no. 5, pages 750 - 761 * |
| YUKER WANG等: "Molecular inversion probes: a novel microarray technology and its application in cancer research", 《CANCER GENET》, vol. 205, no. 7, pages 341 - 355, XP028411264, DOI: 10.1016/j.cancergen.2012.06.005 * |
| 罗志梅等: "分子倒置探针技术的研究进展及应用", 生物技术通报, vol. 34, no. 10, pages 49 - 57 * |
| 黄伟;邓亮生;王玉丽;高钟镐;宋影文;陈晓旋;冯来武;郭凯琪;: "人胰岛素样生长因子-I基因P1启动子区域单核苷酸多态性-705T>C和-603T>A对启动子活性的影响(英文)", 《解放军医学杂志》, vol. 37, no. 01, pages 34 - 39 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112029841B (zh) | 2024-02-09 |
| US11639521B2 (en) | 2023-05-02 |
| US20210010069A1 (en) | 2021-01-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220073909A1 (en) | Methods and compositions for rapid nucleic library preparation | |
| CN111849965B (zh) | 用于减少偏向性的多核苷酸衔接子设计 | |
| KR20110106922A (ko) | 단일 세포 핵산 분석 | |
| WO2007067719A2 (en) | Diagnosing human diseases by detecting dna methylation changes | |
| KR20210112350A (ko) | 다중 복제수 변이 검출 및 대립 유전자 비율 정량화를 위한 정량적 앰플리콘 서열분석 | |
| KR20220083700A (ko) | 표적 핵산의 검출 방법, 핵산 결합 분자의 검출 방법 및 핵산 결합능의 평가 방법 | |
| US9394557B2 (en) | Linear amplification of short nucleic acids | |
| CN107267615A (zh) | G形夹用于改进的等位基因特异性pcr的用途 | |
| AU2006226873B2 (en) | Nucleic acid detection | |
| EP2585615B1 (en) | Highly sensitive method for detection of a target nucleic acid in a sample | |
| US11174511B2 (en) | Methods and compositions for selecting and amplifying DNA targets in a single reaction mixture | |
| CN112029841B (zh) | 定量端粒长度和基因组基序的方法 | |
| WO2017060316A1 (en) | A novel method for the preparation of bar-coded primer sets | |
| EP3682027A1 (en) | Hybridization-extension-ligation strategy for generating circular single-stranded dna libraries | |
| KR102275038B1 (ko) | 대립 유전자의 구분성을 높이는 pcr 방법 및 pcr 킷트 | |
| CN114144188B (zh) | 放大及检测核糖核酸(rna)片段的方法 | |
| EP4310195A1 (en) | Method for nucleic acid detection using signal-mediated amplification of rna technology and rna aptamers | |
| US10081832B2 (en) | Hyperprimers | |
| KR20180104135A (ko) | 과도한 세포 사멸을 수반하는 질환을 진단하는 방법 및 이를 수행하기 위한 키트 | |
| WO2023175434A1 (en) | Detection of methylation status of a dna sample | |
| KR20240072309A (ko) | 새꼬막 원산지 판별용 단일 핵산염기 다형 마커 및 이의 용도 | |
| CN116287159A (zh) | 小rna的新型检测方法及其应用 | |
| CN113789399A (zh) | 一种基于多重pcr飞行时间质谱的幽门螺杆菌耐药位点的检测方法、引物对与试剂盒 | |
| CN114761578A (zh) | 测定亚硫酸氢盐全局转化率的方法 | |
| Mukherjee et al. | Advances in PCR based molecular markers and its application in biodiversity conservation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40032105 Country of ref document: HK |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |