KR20080003422A - 종양 조직 내의 ｅｇｆｒ 유전자의 증가된 복제수에 기초한항-ｅｇｆｒ 항체 치료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특정 종양 환자 집단의 특정 종양 조직에서 발생하는 특정 분자 변형에 기초한 암의 개별화 및 개인화된 진단 및 치료에 관한 것이다. 치료 및 진단은 확대된 EGFR 유전자 복제수를 발현하는 특정 EGFR 보유 종양 조직의 증식 및 종양 성장이 항-EGFR 항체에 의해 중단될 수 있으며, 종양 조직에서 발생하는 돌연변이와 같은 기타 개별적인 분자 변형은 동일한 항-EGFR 항체 치료에 의해 영향을 받지 않는다는 발견에 기초한다.

Description

종양 조직 내의 ＥＧＦＲ 유전자의 증가된 복제수에 기초한 항-ＥＧＦＲ 항체 치료 {ANTI-EGFR ANTIBODY THERAPY BASED ON AN INCREASED COPY NUMBER OF THE EGFR GENE IN TUMOR TISSUES}
본 발명은 항-EGFR 항체에 의한, 더욱 높은 수준의 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 를 발현하는 종양의 진단 및 치료에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 특정 종양 환자 집단의 특정 종양 조직에서 발생하는 특정 분자 변형에 기초한, EGFR 발현 암의 개별화 및 개인화된 진단 및 치료에 관한 것이다. 치료 및 진단은 확대된 EGFR 유전자 복제수를 나타내는 특정 EGFR 보유 종양 조직의 증식 및 종양 성장이 항-EGFR 항체에 의해 중단될 수 있으며, 특정 유전자 돌연변이와 같은 종양 조직에서 발생하는 기타 개별적인 분자 변형은 동일 항-EGFR 항체 치료에 의해 영향을 받지 않는다는 발견에 기초한 것이다.
종양 세포의 표면 상의 다양한 수용체 및 기타 항원에 표적되는 단일클론 항체 (MAb) 또는 기타 단백질/폴리펩티드와 같은 생물학적 분자 및 작은 화학적 화합물은 20년 이상 동안 종양 치료에 적합한 것으로 알려져 있다. 항체 접근법에 대해, 상기 MAb 의 대부분은 키메라화 또는 인간화되어 인간 면역 체계로의 허용도를 개선한다. MAb 또는 상기 언급된 화학적 개체는 종양 세포 상의 그의 표적 구조에 특이적으로 결합하고, 대부분의 경우 정상 조직에도 결합하며, 그의 에피토프 (epitope) 특이성 및/또는 특정 항원의 기능적 특성에 의존하는 상이한 효과를 초래할 수 있다.
ErbB 수용체는 1980년대에 암에 연루된 전형적인 수용체 타이로신 키나아제이다. 타이로신 키나아제는 단백질 기질 내에서, 아데노신 트리포스페이트의 말단 포스페이트가 타이로신 잔기로 이동하는 것을 촉매화하는 효소의 부류이다. 타이로신 키나아제는 기질 인산화에 의해 몇 개의 세포 기능에 대한 신호 전달에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 신호 전달의 정확한 기작은 여전히 명백하지 않지만, 타이로신 키나아제는 세포 증식, 발암 및 세포 분화에서 중요한 기여 요소인 것으로 나타났다. 수용체 유형 타이로신 키나아제는 세포외, 트랜스막 (transmembrane) 및 세포내 부분을 가지며, 비수용체 유형 타이로신 키나아제는 전부 세포내의 것이다. 수용체-연결 타이로신 키나아제는 세포외 리간드 결합 도메인, 트랜스막 서열 및 세포질 타이로신 키나아제 도메인을 포함하는 트랜스막 단백질이다. 수용체-유형 타이로신 키나아제는 다양한 생물학적 활성을 갖는 다수의 트랜스막 수용체를 포함한다.
서로 다른 하위부류의 수용체-유형 타이로신 키나아제가 동정되었다. 관련된 타이로신 키나아제는 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 수용체, ErbB 주요 부류 패밀리 (family) 의 표피 성장 인자 (EGF) 수용체, 및 혈소판-유도 성장 인자 (PDGF) 수용체를 포함한다. 또한 관련된 것은 신경성장인자 (NGF) 수용체, 뇌-유도 향신경 인자 (BDNF) 수용체, 및 신경영양인자-3 (NT-3) 수용체 및 신경영양인자-4 (NT-4) 수용체이다.
erbB1 유전자에 의해 엔코딩되는 EGFR 는 인간 암에 원인적으로 관련된다. 특히, 증가된 EGFR 발현은 유방, 방광, 폐, 머리, 목 및 위 암뿐만 아니라 아교모세포종에서도 관찰되었다. 증가된 EGFR 수용체 발현은 흔히 자가분비적 자극성 경로에 의해 수용체 활성을 초래하는 동일 종양 세포에 의한, EGFR 리간드, 전환 성장 인자 알파 (TGF-α) 의 증가된 제조와 관련된다 (Baselga and Mendelsohn, Pharmac. Then 64:127-154 (1994)). EGF 수용체는 170,000 의 분자량을 갖는 트랜스막 글리코단백질이며, 다수의 표피 세포 유형에서 발견된다. 이는 적어도 3 개의 리간드 EGF, TGF-α (전환 성장 인자 알파) 및 암피레귤린에 의해 활성화된다. 표피 성장 인자 (EGF) 및 전환 성장 인자-알파 (TGF-α) 모두는 EGF 수용체에 결합하고 세포 증식 및 종양 성장을 초래하는 것으로 나타났다.
항-EGF 수용체 항체가 수용체로의 EGF 및 TGF-a 결합을 차단하는 한편 종양 세포 증식을 억제하는 것으로 보이는 것이 나타났다. 상기 결과로 보아, EGF 수용체에 대한 몇몇의 쥣과 및 래트 단일클론 항체가 개발되었고, 시험관내 및 생체내에서 그의 종양 세포 성장 억제 능력을 시험하였다 (Modjtahedi　and Dean, 1994, J. Oncology 4, 277). 인간화 단일클론 항체 425 (hMAb 425, 마투주마브 (matuzumab); US 5,558,864; EP 0531 472) 및 키메라성 단일클론 항체 225 (cMAb 225) (모두 EGF 수용체를 향함) 은 임상 실험에서 그의 효능을 나타내었다. C225 항체 (세툭시마브 (cetuximab)) 는 시험관내에서 EGF-매개 종양 세포 성장을 억제하고 누드 마우스중 생체내에서 인간 종양 형성을 억제하는 것으로 나타났다. 항체 및 일반적으로 모든 항-EGFR 항체는 특히 특정 화학치료제 (즉, 독소루비신, 아드리아마이신, 탁솔 및 시스플라틴) 와 공동으로 작용하여 이종이식 마우스 모델 (예를 들어, EP 0667165 참조) 에서 생체내 인간 종양을 박멸하는 것으로 나타난다. Ye et al. (1999, Oncogene 18, 731) 은 인간 난소암 세포가 HER2 수용체에 표적되는 키메라성 mAb 225 및 인간화 mAb 4D5 모두의 조합으로 성공적으로 치료될 수 있음을 보고하였다. 마투주마브 및 세툭시마브의 조합 또한 상승적인 항종양 반응을 일으킨다 (WO 04/32960). 또 다른 완전한 인간 항-EGFR 항체는 XenoMouse® 기법에 의해 개발된 파니투무마브 (panitumumab) (mAb ABX) 이다 (예를 들어, WO 98/50433, US 6,235,883).
항-표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 단일클론 항체 예컨대 키메라성 단일클론 항체 c225 (세툭시마브) 및 완전히 인간 항체인 파니투무마브는 화학 치료-내성 전이 직장결장암 (mCRC) 을 가진 환자의 약 10% 에서 현저한 임상적 활성을 나타냈다. 상기 작용제에 대한 임상적 반응성 또는 내성의 근원적인 분자 기전은 현재 알려지지 않았다.
암 사망의 제 3 의 가장 흔한 원인인 전이성 직장결장 암 (mCRC) 에 대한 모든 치료 설비는 최근에 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 의 세포외 도메인에 표적되는 단일클론 항체 (mAb) 로 강화되었다 (Erlichman and Sargent ; 2004, N Engl J Med 351 : 391-392). 항-EGFR mAb 중, 키메라성 항체 세툭시마브 (Erbitux®) 및 완전한 인간 항체 파니투무마브는 각각 화학치료-내성 mCRC 를 가진 환자의 약 10% 에서 현저한 임상적 활성을 나타냈으나, 임상적 반응성 또는 내성의 근원적인 분자 기전은 현재 알려지지 않았다. 면역조직화학법에 의해 평가되는 종양 EGFR 발현의 진단 특성 또는 정도 모두 임상적 반응과 연관이 없다 (Saltz et al ., 2004, J Clin Oncol 22 : 1201-1208; Cunningham et al ., 2004, N Engl J Med 351 : 337-345; Hecht et al ., 2004, Journal of Clinical Oncology , ASCO Annual Meeting Proceedings , Post - Meeting Edition). 항-EGFR moAb 에 대한 임상적 민감성 또는 저항성의 분자적 근거를 이해하는 것은 세툭시마브 또는 파니투무마브 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 환자의 확인을 허용할 수 있다.
EGFR 의 생물학은 유전학 및 생화학적 접근법 모두를 사용하여 상세하게 연구되었다 (Ciardiello et al ., 2003, Eur J Cancer 39 : 1348-1354; Holbro et al., 2004, Annu Rev Pharmacol Toxicol 44 : 195-217). 리간드를 수용체의 세포외 부분에 결합시키는 초기 단계는 수용체 2량체화 및 그의 효소적 활성의 활성화를 촉진함에 따라 세포내 도메인의 인산화를 초래한다. 이후, 세포성 효과기 (effector) 는 주로 형질막으로의 그의 재국부화(relocalization)를 통해 세포내 도메인의 인산화 잔기에 결합하고 활성화된다. 작은 G 단백질 Ras, 단백질 키나아제 Raf 및 지질 키나아제 PI3K 는 EGFR 신호의 세포내 매개체로서 중심적인 역할을 한다. EGFR 의 유전적 변형 및 그의 효과기는 이전에 다양한 암에서 발견되었다 (Bardelli et al., 2003, Science 300: 949; Vogelstein et al., 2004, Nat Med 10: 789-799; Bardelli et al, 2005, Curr Opin Genet Dev 15: 5-12).
따라서, 세툭시마브, 파니투무마브 또는 마투주마브와 같은 특정 특이적 항-EGFR 항체에 대한 임상적 반응은 EGFR 또는 그의 인접한 세포내 신호 전달자에 영 향을 미치는 분자 변형에 관련될 수 있다는 가정을 할 수 있다.
mCRC 와 같은 다수의 암에서 종양의 진단적 특성 또는 면역조직화학법에 의해 평가되는 EGFR 발현의 정도 중 어느 것도 EGFR 안타고니스트, 특히 항-EGFR 항체, 예컨대 세툭시마브, 마투주마브 (hMab 425) 또는 파니투무마브에 대한 임상적 반응와 관련되지 않는다. 따라서, 현재 대부분의 치료 환자는 원치 않는 부작용을 갖는 비효과적인 치료의 위험에 노출되어 있다. 세툭시마브, 마투주마브 또는 파니투무마브와 같은 항-EGFR mAb 로의 mCRC 환자의 치료 효능은 상당한 의학적 진보를 나타낸다. 그러나, 항-EGFR mAb 로의 치료는 화학저항성 (chemorefractory) 환자를 포함하는 임상 시험에서 소수의 환자만이 객관적인 반응을 나타냈으며, 이러한 치료로부터 이득을 얻을 수 있는 가능성이 있는 환자를 확인하는 진단 수단이 없다. 결과로서, 대부분의 환자는 원치 않는 부작용을 갖는 비효과적인 치료의 위험에 노출된다. 비-개인화된 치료는 또한 보건 체계에 막대한 재정적 부담을 초래한다.
따라서, 항-EGFR 단일클론 항체에 대한 환자에서의 차별적인 반응을 설명하고 항-EGFR 항체 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 CRC 환자와 같은 암 환자를 확인하기 위한 방법 개발에 대한 필요가 있다. 항-EGFR mAb 에 대한 EGFR-발현 암 세포의 근원적인 반응성 또는 저항성의 분자 기전은 알려져 있지 않다. 따라서, 하기를 포함하는, 암에서 항-EGFR mAb 에 대한 반응이 생물학적 예견자 (predictor) 또는 마커와 관련되는지를 나타내는 진단성 도구를 추가적으로 제공할 필요가 있다: (i) EGFR 유전자 촉매성 도메인에 영향을 미치는 돌연변이, (ii) EGFR 하부방향 신호 효과기에 영향을 미치는 돌연변이; 또는 (iii) EGFR 유전자자리의 확대.
발명의 개요
화학저항성 환자를 포함하는 종양 환자에서 종양 세포에 의해 나타나는 EGFR 유전자 복제수가 상기 종양에 대해 객관적 반응을 일으키는 환자의 약 89% 및 안정성 또는 진행성 질환을 갖는 환자의 오로지 약 5.0% 에서 증가하는 것이 본 발명에 따라 밝혀졌다. 이에 관해, EGFR 촉매성 도메인 및 그의 인접한 하부방향 효과기 PI3K, RAS, RAF 의 돌연변이 상태는 상기 반응과 관련되지 않는다.
본 발명에 따르면, 직장결장 암과 같은 특정 암의 세포 모델에서 확대된 EGFR 유전자 복제수를 나타내는 세포의 증식을 완전히 손상시킨 세툭시마브, 마투주마브 또는 파니투무마브와 같은 특이적 항-EGFR 항체의 동일한 농도는 확대된 EGFR 복제수를 나타내지 않는 세포에 영향을 미치지 않는다.
본 발명에 따르면, 특정 암, 바람직하게는 mCRC 를 앓는 환자에서, 파니투무마브, 세툭시마브 또는 마투주마브 (또는 임의의 면역학적 유효성 절편 또는 그의 융합 단백질) 와 같은 특이적 항-EGFR 항체로의 치료에 대한 반응은 EGFR 유전자의 확대된 복제수의 존재와 상당한 관련이 있을 수 있다. 즉: 항-EGFR 치료에 반응성 또는 민감성인 환자는 동일 용량에서 동일 항체로의 치료에 반응하지 않는 환자와 비교하여 증가된 복제수의 EGFR 유전자를 갖는다. 추가적으로, 증가된 EGFR 유전자 복제수는 환자에서 종양 축소 및 상기 mAb 로의 치료에 의한 연장된 생존과 관련되는 것을 관찰할 수 있다. 상기 환자에서, 종양 성장은 주로 EGFR 경로에 의해 유발될 가능성이 있다.
확대된 EGFR 유전자 복제수는 핵 당 EGFR 유전자 및/또는 EGFR 유전자 복제수 및 CEP7 (염색체 7 중심체 프로브 (probe)) 에 의해 정의된 비율을 결정하여 측정될 수 있다. 본 발명에 따라, EGFR 유전자 복제수/핵의 비율이 >4, 바람직하게는 5.7 내지 7.1 의 범위 및/또는 EGFR 유전자 복제본/CEP7 의 비율이 >2 인 종양 프로브에서, 종양 프로브가 유래되는 환자로의 항-EGFR 항체의 투여는 제시된 것보다 낮게 정의된 비율의 복제수를 갖는 환자에서 보다 더욱 효과적이다. 비(非)-확대되거나 또는 오로지 약간 확대된 EGFR 유전자 복제수 (비율: 1 또는 <2) 를 나타내는 종양 세포를 갖는 환자는 항-EGFR 항체 치료에 반응하지 않거나 또는 충분히 반응하지 않는다.
상기 관찰은 특이적 분자 변형에 기초하여 직장결장암과 같은 특이적 암의 개인화된 표적 치료를 위한 첫번째 패러다임을 나타낸다. 상기 약물을 환자에 가장 효과적으로 투여하기 위해, 가장 이익을 얻을 수 있는 가능성이 있는 환자를 확인하기 위한 수단이 제공된다.
EGFR 촉매성 도메인 내의 신규한 체세포 돌연변이 및 그의 인접한 하부방향 효과기 (예컨대 KRAS 및 PI3KCA) 에서의 몇몇의 돌연변이가 있음이 밝혀졌으며, 이들 변형은 항-EGFR mAb 에 대한 반응성과 관련되지 않는다. 상기 결과는 몇 개의 임상적 및 생물학적 의미를 갖는다. EGFR 발현 및 과발현 암에서 항-EGFR mAb 에 대한 반응은 EGFR 유전자의 돌연변이와 관련이 별로 없으며, 그보다는 그의 증가/확대된 복제수와 관련이 있을 것이다. 상기 결과는 항-EGFR 항체에 기초한 치료가 점 돌연변이에 의해서 보다는 확대된 표적에 대해 더욱 효과적으로 작용할 수 있음을 제시한다. 그러나, 점 돌연변이와 같은 유전자 변형은 항-EGFR 항체 치료의 효과 및 효능에 기여할 수 있다.
특히 CRC 에 대해, 확대된 EGFR 유전자 복제수를 가진 CRC 의 증식은 세툭시마브와 같은 항-EGFR 항체에 의해 파괴되며, 확대되지 않은 EGFR 복제수를 가진 CRC 세포는 항-EGFR 단일클론 항체의 동일 용량에 의해 영향을 받지 않는다. 이는 확대된 EGFR 유전자를 가진 암세포, 특히 CRC 세포가 그의 증식에 대해 이러한 분자 변형에 의존성이며 중독성이기까지임을 나타낸다.
본 데이터는 또한 EGFR 유전자 복제수의 FISH (형광동소보합법) 측정이 항-EGFR 표적 mAb 에 반응할 수 있는 mCRC 및 기타 암을 가진 환자를 확인하는 실험 수단을 나타낼 수 있음을 제시한다. 또한, 동일 종양 내의 분리된 병터에 국부화된, 증가된 EGFR 유전자 복제수 및 EGFR 단백질의 과발현의 경우 (도 3), 동일한 종양 내에서 qPCR 및 웨스턴 블로팅 (Western blotting) 과 같은 반-정량성 검정에 반해, FISH 분석은 2염색체 종양 세포 또는 정상 버팀질 오염물의 공존에 의해 영향을 받지 않는다. 따라서, EGFR 발현의 가능한 비-균등질 패턴을 고려하여 IHC 및 mAb 에 대한 임상 반응 사이의 관련 없음을 설명해야 한다 (도 3).
즉, 본 발명에 따라, 증가된 EGFR 유전자 복제수에 현저히 기초한, 세톡시마브, 마투주마브 또는 파니투무마브와 같은 항-EGFR mAb 의 투여에 대한 임상 반응을 나타내는 암 환자, 바람직하게는 mCRC 환자가 상기 환자의 개별적인 종양 샘플의 FISH 분석을 사용하여 선별되고 평가될 수 있음이 처음으로 나타났다. 즉, FISH 에 양성적인 환자는 FISH 에 음성적인 환자보다 높은 유전자 복제수를 갖는다. 따라서, FISH 에 의해 분석된 바와 같이 증가된 EGFR 복제수를 나타내는 환자가 낮은 유전자 복제수를 나타내는 환자보다 양호한 생존 예측을 갖는 것으로 결론지을 수 있다.
보다 일반적인 방법으로 요약하면, 본 발명은 하기 주제에 관련된다.
- 환자에서 EGF 수용체 (EGFR) 을 발현하는 종양 치료 방법으로서, 확대된 EGFR 유전자 복제수를 갖는 상기 종양 세포의 증식을 파괴하기에 충분한 양으로 상기 환자에 항-EGFR 항체를 투여하는 방법.
- 상기 치료가 확대된 EGFR 유전자 복제수를 유발하지 않는 종양 세포에 적용되는 동일 용량의 동일 항체로의 치료와 비교하여 더욱 효과적인, 상응하는 방법.
- 상기 종양 세포가 분자 변형 또는 유전자 돌연변이를 추가적으로 유발하는, 상응하는 방법.
- 확대된 EGFR 유전자 복제수가 상기 종양에 특이적인, 상응하는 방법.
- 확대된 EGFR 유전자 복제수가 환자의 개별적인 암 조직 프로파일에 특이적인, 상응하는 방법.
- 상기 개별적인 암 조직 프로파일이 분자 변형의 기초가 되는, 상응하는 방법.
- 상기 EGFR 발현 종양이 직장결장암 (CRC) 인, 상응하는 방법.
- 상기 직장결장암이 전이성 (mCRC) 인, 상응하는 방법.
- 상기 항-EGFR 항체가 쥣과, 키메라성 및 인간화 변형의 Mab 225 및 Mab 425 의 군으로부터 선택되는, 상응하는 방법.
- 확대된 EGFR 유전자 복제수를 갖는 EGFR 발현 종양 세포에 기초한, 암 치료용 액제 제조를 위한 항-EGFR 항체의 용도 (여기서, 상기 치료는 확대된 EGFR 유전자 복제수를 유발하지 않는 종양 세포에 적용된 동일 투여량의 동일 항체로의 치료와 비교하여 더욱 효과적이다).
- 상기 종양 세포가 분자 변형 또는 유전자 돌연변이를 추가적으로 유발하는, 항-EGFR 항체의 상응하는 용도.
- 상기 확대된 EGFR 유전자 복제수가 상기 종양에 특이적인, 상응하는 용도.
- 상기 확대된 EGFR 유전자 복제수가 환자의 개별적인 암 조직 프로파일에 특이적인, 상응하는 용도.
- 상기 개별적인 암 조직 프로파일이 분자 변형의 기초가 되는, 상응하는 용도.
- 상기 EGFR 발현 종양이 직장결장암 (CRC) 인, 상응하는 용도.
- 상기 직장결장암이 전이성 (mCRC) 인, 상응하는 용도.
- 상기 항-EGFR 항체가 쥣과, 키메라성 및 인간화 변형의 Mab 225 및 Mab 425 의 군으로부터 선택되는, 상응하는 용도.
- 형광동소보합법 (FISH) 을 사용하여 종양 조직의 EGFR 유전자 복제수를 시험관내에서 검출 및 측정하는 방법.
- 항-EGFR 항체에 반응하는 종양을 갖는 환자의 시험관내 확인을 위한 형광동소보합법 (FISH) 의 용도.
- 증가된 EGFR 유전자 복제수를 유발하는 종양을 갖는 환자의 시험관내 확인을 위한 형광동소보합법 (FISH) 의 용도.
- 상기 종양이 직장결장암 (CRC), 바람직하게는 전이성 CRC 인, 상응하는 용도.
- 상기 항체가 쥣과, 키메라성 및 인간화 변형의 225 및 424 인, 상응하는 용도.
- EGF 수용체 (EGFR) 를 과발현하는 암을 앓는 환자가 항-EGFR 항체 또는 면역학적으로 유효한 그의 절편의 투여에 양성적으로 반응하는지 여부를 검출 및 분석하기 위한 시험관내 방법으로서, 상기 환자로부터 수득된 종양 세포의 프로브에서 EGFR 유전자 복제수를 시험관내에서 측정하고, 상기 환자의 종양 세포가 확대된 복제수의 EGFR 유전자를 나타내는 경우, 상기 항-EGFR 항체로의 투여를 위해 상기 환자를 선별하는 방법.
- EGFR 유전자 복제수가 핵 당 EGFR 유전자의 수의 비율로 측정되는, 상응하는 방법.
- 상기 비율이 4.0 내지 8.2 의 범위인, 상응하는 방법.
- 상기 비율이 5.7 내지 7.1 의 범위인, 상응하는 방법.
- EGFR 유전자 복제수가 CEP7 당 EGFR 유전자의 수의 비율로 측정되는, 상응하는 방법.
- 상기 비율이 >2 인, 상응하는 방법.
- EGFR 유전자 복제수가 FISH 분석 (형광동소보합법) 에 의해 측정되는, 상응하는 방법.
- 상기 확대된 EGFR 유전자 복제수가 상기 종양에 특이적인, 상응하는 방법.
- 확대된 EGFR 유전자 복제수가 환자의 개별적인 암 조직 프로파일에 특이적인, 상응하는 방법.
- 상기 개별적인 암 조직 프로파일이 추가적인 분자 변형의 기초가 되는, 상응하는 방법.
- 상기 분자 변형이 EGFR 유전자 내의 점 돌연변이인, 상응하는 방법.
- 상기 항-EGFR 항체가 세툭시마브 (mAb c225), 마투주마브 (mAb h425) 및 파니투무마브 (mAb ABX) 또는 그의 특이적 쥣과, 키메라성 또는 인간화 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상응하는 방법.
- 암이 직장결장암 (CRC), 폐암, 두경부암 및 유방암인, 상응하는 방법.
- 환자에서의 암 치료용 약제의 제조를 위한, 항-EGFR 항체, 또는 면역학적으로 효과적인 그의 절편의 용도 (여기서, 상기 암은 EGFR 을 과발현하며 확대된 EGFR 유전자 복제수를 나타낸다).
- 상기 EGFR 유전자 복제수가 핵 당 EGFR 유전자의 수의 비율로 측정되고, 이러한 비율의 값은 4.0 내지 8.2 의 범위인, 상응하는 용도.
- 상기 비율의 값이 5.7 내지 7.1 의 범위인, 상응하는 방법.
- 상기 암의 치료는 암 세포가 확대된 EGFR 복제수를 나타내지 않는 경우 동일 용량의 동일 항체로의 암 환자 치료와 비교하여 더욱 효과적인, 상응하는 용도.
- 상기 확대된 EGFR 유전자 복제수는 상기 종양에 특이적인, 상응하는 용도.
- 확대된 EGFR 유전자 복제수가 환자의 개별적인 암 조직 프로파일에 특이적인, 상응하는 용도.
- 상기 개별적인 암 조직 프로파일이 유전자 돌연변이의 기초가 되는, 상응하는 용도.
- 상기 EGFR 발현 종양이 직장결장암 (CRC), 폐암, 유방암 또는 두경부암인, 상응하는 용도.
- 상기 항-EGFR 항체가 세툭시마브 (mAb c225), 마투주마브 (mAb h425) 및 파니투무마브 (mAb ABX) 또는 그의 특이적 쥣과, 키메라성 또는 인간화 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상응하는 용도.
- 항-EGFR 항체의 투여에 대한 암 환자의 반응을 결정하는 검정에서 형광동소보합법 (FISH) 을 사용하여, EGFR 을 과발현하는 종양 조직의 EGFR 유전자 복제수를 시험관내에서 검출 및 측정하는 방법.
도 1 - 환자 13 의 종양에서 발견된 엑손 21 (G857R) 내의 미세센스 이종접합 돌연변이 (또한 표 2 참조). 돌연변이는 EGFR 키나아제 도메인의 활성 루프에 위치한 중요한 잔기에 영향을 미친다. G857R 은 비소세포 폐암 (NSCLC) 내의 게피티니브 및 에르로티니브 반응자에서 발견되는 최근 기술된 L858R 돌연변이로부터 1 개의 아미노산 떨어져 있다 (Lynch et al., 2004, N Engl J Med 350: 2129-2139.; Paez et al., 2004, Science 304: 1497-1500; Pao et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101: 13306-13311). BRAF 유전자 (G595R) 내의 유사한 잔기에 영향을 미치는 돌연변이가 직장결장암 (CRC) 에서 이전에 검출되었다 (Wiley, Diaz , 2004, Jama 291: 2019-2020).
도 2 - EGFR 유전자 (적색) 및 염색체 7 (CEP7; 녹색) 의 프로브를 위한 2중 색채 형광동소합법 검정. (A) 정상 직장결장 점막에서의 안정된 이체성; (B) 환자 27 의 종양에서의 안정된 이체성; (C) 환자 3 의 종양에서의 안정된 다염색체성; (D) 환자 5 의 종양에서의 확대.
도 3 - 환자 10 의 종양에서의 EGFR 확대 및 단백질 발현. (A) 헤마토자일린 및 에오신 염색에 의한 통상적인 조직학. (B 및 C) 동일 종양의 상응하는 면적에서의 면역세포화학에 의한 EGFR 유전자 확대 및 단백질 과발현 (Moroni et al., 2001, Clin Cancer Res 7:2770-5 ).
도 4 - 환자 1 에서 관찰되는 분자성 EGFR 유전자 변형 및 임상적 반응. (A) 증가된 복제수를 나타내는 EGFR 유전자 (적색) 및 염색체 7 (CEP7; 녹색) 프로브에 대한 2중 색채 형광동소보합법 검정; (B) 환자 1 의 종양, A431 암세포주 (EGFR 유전자/핵 8.00; EGFR 유전자/CEP7 2.57) 및 비악성 RPE (EGFR 유전자/핵 1.60; EGFR 유전자/CEP7 0.86) 표피 세포 대조군에서 정량적 PCR 에 의해 측정되는 EGFR 유전자 복제수의 상대적인 양; (C) (D) 환자 1 에서 moAb 로의 처리 전 (가장 높은 지름, L 라인 4.4 cm) 및 후 (가장 높은 지름, M 라인 2.3 cm) CT 에 의한 간 전이의 측정.
도 5 - 세툭시마브에 의한 직장결장암 세포주 증식의 억제. (A) 증가하는 농도의 세툭시마브의 존재 하에서 3 개의 개별적인 실험 (평균 ± SD) 에서의 직장결장암 세포주의 증식. (B) 개별적인 세포주에서 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 EGFR 단백질의 수준. (C) 직장결장 암세포주에서 FISH 에 의해 평가되는 EGFR 유전자 복제수. (D) DiFi 세포주에서의 증가된 복제수를 나타내는 EGFR 유전자 (적색) 및 염색체 7 (CEP7; 녹색) 프로브에 대한 2중 색채 형광동소보합법 검정.
상세한 설명
용어 "복제수" 는 일반적으로 유전체 당 유전자의 수로 정의된다. 본 발명에 따라 용어 "EGFR 유전자 복제수" 는 핵 당 EGFR 유전자의 수의 비율을 의미한다. 본 발명에 따라, 상기 수는 1.0 내지 8.2, 또는 더욱 바람직하게 1.5 내지 7.9 에서 변화한다.
본 발명에 따라 용어 "증가된 또는 확대된 EGFR 유전자 복제수" 는 상대적인 관점에서, 특정 환자 (항-EGFR 항체 치료에 반응하는 환자) 와 관련된 특정 종양의 세포에서의 상기 정의된 비율이 다른 특정 환자와 관련된 특정 종양의 세포에서의 특정 비율과 비교하여 더욱 높거나 확대된 것을 의미한다. 더욱 절대적인 관점에서, 용어는 상기 비율 (EGFR 유전자/핵) 이 4.0 내지 8.2, 또는 4.8 내지 8.2, 또는 4.8 내지 7.9, 또는 4.8 내지 7.1, 또는 4.8 내지 6.8, 또는 4.8 내지 5.7 인 것을 의미한다. 바람직하게는 상기 비율은 5.7 내지 8.2 이며, 더욱 바람직하게는 5.7 내지 6.8, 및 가장 바람직하게는 5.7 내지 7.1 이다.
"증가 또는 확대된" EGFR 유전자 복제수에 적용되는 이러한 상술된 값에 따라, 항-EGFR 항체로의 치료에 반응하게 않거나 효과적 또는 긍정적으로 반응하지 않는 환자의 종양 세포로 나타나는 비교적 감소되거나 보다 낮은 비-확대된 복제수에 대한 비율 값은 1.65 내지 2.0, 또는 1.7 내지 1.9 의 범위에 있다.
EGFR 유전자 복제수 또는 비율: EGFR 유전자 복제수/핵이 EGFR 유전자 복제본/염색체 7 중심체 프로브 (CEP7) 의 비율과 관련된다. 본 발명에 따르면 항-EGFR 항체 치료에 명백히 반응하는 환자 내의 EGFR 유전자/CEP7 비율은 >2 이며, 반응하지 않는 환자에서의 비율은 보통 약 1 이다.
"미스센스 이종접합 돌연변이" 는 본 발명에 따르면, 유전자의 2 개의 대립유전자 중 하나에서 발생하는, 하나의 아미노산에 대한 코돈을 다른 아미노산을 지정하는 코돈으로 변화시키는 돌연변이를 의미한다. 용어 "인프레임 (in-frame) 삭제" 는 본 발명에 따르면, 뉴클레오티드 삭제에 의해 mRNA 의 해독 프레임 (reading frame) 을 변화시키는 돌연변이를 의미한다.
"FISH (형광동소보합법)" 은 본 발명에 따르면, 클로닝된 DNA 와 완전한 염색체의 혼성화를 의미하며, 여기서 클로닝된 DNA 는 형광 염료로 표지화되었다. 이는 염색체 위치, 유전자 복제수 (증가 또는 감소 모두), 또는 염색체 재배치를 지정하는 방법이다.
세툭시마브 또는 파니투무마브로의 치료 후, 객관적인 반응, 안정성 질환 또는 진행성 질환이 달성된 mCRC 를 가진 환자 (31) 로부터의 종양이 EGFR 유전자 또는 그의 인접한 세포내 효과기의 유전자 변형에 대해 스크리닝되었다. 구체적 으로, EGFR 유전자 복제수 및 EGFR 촉매 도메인 및 mCRC 에서 돌연변이가 더욱 흔히 발생하는 KRAS, BRAF 및 PI3KCA 에서의 엑손의 돌연변이 프로파일이 측정될 수 있다.
EGFR 타이로신 키나아제 도메인의 돌연변이 분석
mCRC 에서 마투주마브, 파니투무마브 또는 세툭시마브에 대한 반응의 기초가 되는 분자적 기반을 확인하기 위해, 상기 mAb 로의 치료 후 다양한 임상적 결과를 갖는 환자의 종양 표본에서의 EGFR 유전자의 촉매 도메인에 상응하여, 그 부위의 돌연변이 상태를 평가하였다. EGFR 엑손 18, 19 및 21 의 서열 분석은, 24 주 동안 안정적 질환을 가진 1 명의 환자를 제외하고 체세포 돌연변이를 나타내지 않는다 (표 1 및 2). 상기 환자는 엑손 21 에서 미스센스 이종접합 돌연변이 (G857R) 를 나타내며, 촉매에 결정적인 부위인 활성화 루프에 위치한 잔기에 영향을 미친다 (도 1). G857R 돌연변이는 폐암에서의 게피티니브 및 에르로티니브 반응자에서 발견되는, 최근에 기술된 L858R 활성화 돌연변이로부터 1 아미노산 떨어져 있다 (Lynch et al, 2004; N Engl J Med 350: 2129-2139; Paez et al., 2004, Science 304: 1497-1500; Pao et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101: 13306-13311).
흥미롭게도, BRAF 유전자에서 유사한 잔기에 영향을 미치는 돌연변이 (G595R) 는 이전에 직장결장암 (도 1) 에서 검출되었다 (Rajagopalan et al., 2002, Nature 418: 934).
본 발견에 기초하여, mAb 치료에 대한 반응의 기초가 되는 주요 분자적 기전 은 EGFR 촉매성 도메인에서의 돌연변이가 아님이 명백하게 나타난다. 따라서, EGFR 유전자 복제수의 변형이, 관찰되는 항체 반응을 초래할 수 있음이 고려된다.
EGFR 세포내 효과기의 돌연변이 분석
EGFR 신호에 연루되는 3개의 세포내 분자 (KRAS, BRAF 및 PI3KCA) 는 직장결장암에서의 점 돌연변이에 의해 활성화될 수 있다. 본 발명에 따라, 상응하는 유전자의 돌연변이 현상이 세툭시마브, 마투주마브 또는 파니투무마브와 같은 항-EGFR 항체에 대한 임상적 반응과 관련되는지의 여부를 평가한다. 3 개 유전자 각각에 대해, 직장결장암에서 돌연변이가 가장 높은 빈도로 발생하는 엑손이 분석된다 (KRAS 엑손 2, BRAF 엑손 15, PI3KCA 엑손 9 및 20). 각 엑손에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 종양-추출된 유전제 DNA 로부터 증폭되고 직접 서열분석될 수 있다. 활성화 돌연변이가 KRAS 유전자 (G12V, G12D, G12S, 및 G13D), PI3KCA 유전자 (E545K, H1047R) 및 BRAF (E599V) 에서 동정될 수 있지만, 이들은 항-EGFR mAb 에 대한 임상적 반응과 관련되지 않는다 (RAS 엑손-2: p=0.675; PI3K 엑손-9: p=0.3; PI3K 엑손-20: p=1; BRAF 엑손-15: p=1; 상기 돌연변이 모두: p=0.44) (표 1 및 2).
FISH 분석에 의한 EGFR 유전자의 복제수 분석
mCRC 에서 면역조직화학법 (IHC) 에 의해 측정된 EGFR 단백질 발현 수준과 항-EGFR mAb 에 대한 임상적 반응 사이에 관련이 없는 것을 나타낼 수 있다. 상기 결과는 EGFR 및 그의 하부방향 효과기의 돌연변이 상태와의 무관과 함께 파니투무마브, 세툭시마브 또는 마투주마브에 대한 반응이 EGFR 유전자의 확대와 관련 될 수 있다는 가설을 초래할 수 있다.
표 2 및 도 2 에 기술된 바와 같이, 객관적인 반응을 갖는 10 명의 환자 중, 9 명이 FISH 에 의해 평가가능하며 8/9 (88.8%) 이 증가된 EGFR 유전자 복제수 (중앙값 EGFR 유전자/핵 비율 6.80, 범위 1.65 - 35) 를 나타내며; 21 명의 비-반응 환자 중, 20 명은 FISH 에 의해 평가가능했으며, 1/20 (5.0%) 명은 증가된 EGFR 복제수 (중앙값 EGFR 유전자/핵 비율 1.925) 를 가지며 상기 차는 통계적으로 유의한 것으로 밝혀질 수 있다.
반응자 중, 증가된 EGFR 유전자 복제수는 9 명의 FISH 평가가능한 환자 중 7 명에서 EGFR 유전자/ CEP7 비율 >2 와 관련될 수 있으며, 이에 따라 HER2 평가에 이용되는 표준을 사용한 EGFR 유전자의 확대를 나타낸다 (Wiley, Diaz, 2004, Jama 291: 2019-2020.). 환자 3 및 9 에서, 7.10 및 3.38 의 EGFR 유전자/핵 비율은 각각 1.46 및 1.19 의 EGFR 유전자/CEP7 비율과 관련될 수 있으며, 이에 따라 전체 유전체 7 의 가외의 복제본의 존재 (다염색체 7) 를 나타낸다 (도 2 C).
환자 10 의 종양은 개별적인 병소로 국부화될 수 있는 EGFR 유전자의 현저한 확대를 나타내는 한편, 기타 악성 부위는 숨김없이 이체성임을 나타낸다. 그 중에서도, EGFR 유전자 확대를 나타내는 부위는 또한 IHC 에 의해 평가되는 EGFR 단백질의 강한 발현을 나타내며; 반면, 이체성 EGFR 유전자를 나타내는 부위는 상응하는 단백질을 발현하지 않는다 (도 3).
정량적 PCR 에 의해 EGFR 유전자의 복제수 분석 ( qPCR )
증가된 EGFR 유전자 복제수는 세툭시마브, 마투주마브 또는 파니투무마브에 대한 반응을 갖는 환자에서 FISH 에 의해 관찰될 수 있다. 종양 표본에서 EGFR 유전자자리 상태의 독립적인 측정을 수득하기 위해, qPCR 분석이 사용될 수 있다. EGFR 유전자 복제수의 증가는 반응성 질환을 가진 환자 1 에서 관찰될 수 있다 (도 4). 3 미만의 유전자/유전체 비율의 환자로부터의 샘플 중 qPCR 에 의한 증가된 EGFR 유전자 복제수의 검출은 결론적이지 않다. 이는 이전에 보고된 바와 같이 상기 방법으로 일관되게 검출될 수 없는 제한된 EGFR 유전자 수에 기인할 수 있다 (Layfield et al., 2003, J Surg Oncol 83: 227-231; Yang et al., 2004, Gut 53(1): 123-129). 추가적으로, qPCR 검출은 파라핀이 함침된 샘플의 해부 동안 오로지 부분적으로 회피할 수 있는 정상 버팀질 오염물 DNA 의 동시 추출에 의해 부정적 영향을 받을 수 있다. 한편, FISH 분석에 의해 수득될 수 있는 것과 같은 유전자 복제수의 제자리 분석은 상기 기술적 제한에 의해 영향을 받지 않는다. 상기 qPCR 유전자 복제수 측정은 확대를 확인한다.
정상 또는 증가된 EGFR 유전자 복제본을 갖는 세포주에 대한 세툭시마브의 영향
세포성 암 모델을 사용한 이전의 연구는 세툭시마브에 대한 반응이 (i) EGFR 수용체의 과발현, (ii) 수용체의 구성적 인산화, (iii) 상응하는 유전자의 확대, 및 (iv) 유전자 패밀리의 기타 구성원의 변화와 관련될 수 있음을 제시하였다. 본 데이터는 mCRC 에서의 파니투무마브, 마투주마브 또는 세툭시마브 반응성이 EGFR 유전자자리의 증가된 유전자 복제수와 관련됨을 나타낸다. 이는 본 발명자들로 하여금 FISH 에 의해 측정된 바와 같은 정상 또는 증가된 EGFR 유전자 복제 수를 나타내는 직장결장암 세포주의 패널에 대한 세툭시마브의 효과를 평가하도록 하였다 (도 5). BrdU 혼입 검정에 의해 측정된 세포 증식은 증가하는 세툭시마브 농도의 존재 하에서 평가되었다. EGFR 유전자의 가장 많은 복제본을 지니는 DiFi 세포주의 증식은 세툭시마브에 의해 극적으로 억제되며, DiFi 세포의 증식을 완전히 손상시키는 세툭시마브의 농도는 확대되지 않은 EGFR 복제수의 세포에 영향을 미치지 않는다. 흥미롭게도, SW620 세포주는 3 개 복제본의 EGFR 유전자를 가지며, 웨스턴 블롯에 의해 나타난바, EGFR 단백질을 발현하지 않는다 (도 5). 따라서, SW620 세포는 EGFR 유전자의 기증적 녹아웃 (knock out) 을 나타내며, 이에 따라 그의 증식은 세툭시마브에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다.
용어 "ErbB 수용체 안타고니스트 /억제제" 는 ErbB 수용체에 결합 및 차단 또는 억제하는, 생물학적으로 유효한 분자를 의미한다. 따라서, 수용체를 차단함으로써 안타고니스트는 ErbB 리간드 (아고니스트) 의 결합 및 아고니스트/리간드 수용체 복합체의 활성을 막는다. ErbB 안타고니스트는 HER1 (ErbB1, EGFR), HER2 (ErbB2) 및 ErbB3 및 ErbB4 에 표적될 수 있다. 본 발명의 바람직한 안타고니스트는 EGF 수용체 (EGFR, HER1) 에 표적된다. ErbB 수용체 안타고니스트는 항체, 항체 융합 단백질 (면역접합체) 또는 항체 또는 항체 융합 단백질의 면역치료적 유효 절편일 수 있다. 본 발명에 따라 바람직한 ErbB 수용체 안타고니스트는 항-EGFR 항체이며, 특히, 그리고 바람직하게 상기 및 하기에 언급된 항-EGFR 항체이다: 쥣과, 키메라성 또는 인간화 변형의 세툭시마브, 파니투무마브 및 마투주마브 (그의 면역학적으로 효과적인 절편 (Fab, Fv) 및 면역접합체, 특히 면 역사이토카인 포함).
여기서 사용된 바와 같은 용어 "단일클론 항체" 는 실질적으로 균질성 항체의 집단으로부터 수득된 항체, 즉, 상기 집단을 포함하는 개별적인 항체는 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 표적된다. 추가적으로, 서로 다른 결정인자 (에피토프) 에 표적되는 서로 다른 항체를 포함하는 다중클론 항체에 반해, 각각 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 표적된다. 그의 특이성 이외에, 단일클론 항체는 기타 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있는 장점이 있다. 단일클론 항체의 제조 방법은 [Kohler and Milstein (1975, Nature 256, 495)] 및 ["Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" (1985, Burdon et al., Eds,　Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier　Science Publishers, Amsterdam)] 에 의해 기술된 하이브리도마 방법을 포함하며, 또는 널리 공지된 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 제 4,816,567 호 참조) 에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체는 또한 예를 들어 [Clackson et al. Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991)] 에 의해 기술된 기법을 사용하여 파아지 (phage) 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
용어 "키메라성 항체" 는 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정 종 (species) 으로부터 유래하는 항체 또는 특정 항체 부 류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 항체를 의미하며, 사슬(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유도되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 및 이러한 항체의 절편 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다 (예를 들어: US 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855　(1984)). 키메라성 및 인간화 항체를 제조하는 방법은 당업계에서도 공지되어 있다. 예를 들어, 키메라성 항체 제조 방법은 Boss (Celltech) 및 Cabilly (Genentech) (US 4,816,397; US 4,816,567) 에 의한 특허에 기술된 것을 포함한다.
"인간화 항체" 는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소의 서열을 포함하는 비인간 (예를 들어, 설치류) 키메라성 항체의 형태이다. 대개의 경우, 인간화 항체는 인간 면역글로불린 (수용자 항체) 이며, 여기서 수용자의 고변이 부위 (CDR) 로부터의 잔기는 목적하는 특이성, 친화성 및 수용력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종 (공여자 항체) 의 고변이 부위로부터의 잔기에 의해 대체된다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 골격 부위 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 추가적으로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형은 항체 성능를 추가적으로 개선시키기 위해 수행될 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로, 1 개 이상, 및 전형적으로 2 개 이상의 가변성 도메인 모두를 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 고변이성 루프는 비인간 면역글로불린의 것에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 면역글로불 린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 임의로 면역글로불린, 전형적으로 인간 면역글로불린 불변 부위 (Fc) 의 적어도 일부를 포함할 것이다. 인간화 항체 제조 방법은, 예를 들어 Winter (US 5,225,539) 및 Boss (Celltech, US 4,816,397) 에 의해 기술된다.
"항체 절편" 은 완전한 항체, 바람직하게는 그의 항원-결합 또는 가변성 부위를 포함하는 완전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 절편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 Fc 절편, 디아바디 (diabody), 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 절편(들) 로부터 형성되는 다중특이적 항체를 포함한다. "완전한" 항체는 항체-결합 가변성 부위뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3 을 포함하는 것이다. 바람직하게는, 완전한 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 갖는다. 항체의 파파인 소화는 "Fab" 절편으로 칭하는 2 개의 동일한 항원-결합 절편 (각각이 단일 항원-결합 부위 및 CL 및 CH1 부위를 포함함) 및 잔류 "Fc" 절편을 제조하며, 그 명칭은 쉽게 결정화될 수 있는 그의 능력을 반영한다. 항체의 "Fc" 영역은 일반적으로 CH2, CH3 및 IgG1 또는 IgG2 항체 주요 부류의 경첩 부위를 포함한다. 경첩 부위는 CH1 부위를 CH2-CH3 부위와 조합하는 약 15 아미노산 잔기의 군이다. "Fab" 절편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH1) 을 포함하며, 오로지 1 개의 항원 결합 부위를 갖는다.
"Fab'" 절편은 항체 경첩 부위로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는, 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇 개의 잔기의 첨가에 의해 Fab 절편과 상이 하다. F(ab')2 항체 절편은 원래 사이에 경첩 시스테인을 갖는 Fab' 절편의 쌍으로 제조되었다. 항체 절편의 기타 화학적 커플링 또한 공지되어 있다 (예를 들어,　Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic　Press, 1996; . US 4,342,566 참조). "단일 사슬 Fv" 또는 "ScFv" 항체 절편은 V, 및 항체의 V 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 이는 scFv 가 항원 결합을 위해 요망되는 구조를 형성할 수 있게 한다. 단일-사슬 FV 항체는, 예를 들어, [Pluckthun (The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg　 and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)), WO93/16185; US 5,571,894; US 5,587,458; Huston et al. (1988, Proc.Natl. Acad. Sci. 85, 5879)] 또는 [Skerra and Plueckthun (1988, Science 240, 1038)] 으로부터 공지되어 있다.
본 발명은 결장 또는 직장결장암 (CRC) 에 관한 것이지만, 이는 주로 EGFR 을 발현 또는 과발현하며, 상이한 EGFR 유전자 복제수를 가지며 기타 ErbB 안타고니스트 (예를 들어, IRESSA® 로 치료되는 폐암: 예, Cancer Biology 2005, 4) 로 치료되는 환자에서 발생하는 기타 암 및 종양에 적용가능하다.
따라서, 용어 "암" 및 "종양" 은 전형적으로 조절되는 않은 세포 성장을 특징으로하는 포유류에서의 생리학적 조건을 나타내거나 기술한다. 본 발명에 따른 약학 조성물에 의해, 종양, 예컨대 유방, 심장, 폐, 소장, 결장, 비장, 신장, 방광, 두경부, 난소, 전립선, 뇌, 췌장, 피부, 골, 골수, 혈액, 흉선, 자궁, 고환, 자궁경부 및 간의 종양이 치료될 수 있다. 본 발명의 항체 분자로 바람직하게 치료될 수 있는 종양은 ErbB 수용체, 특히 ErbB1 (EGFR) 수용체를 많은 양으로 발현하는 고형 종양 또는 종양 전이체, 예컨대 유방암, 전립선암, 두경부암, SCLC, 췌장암이다.
용어 "생물학적으로/기능적으로 유효한" 또는 "치료적으로 유효한 (양)" 은 생체내 또는 시험관내에서 생물학적 기능 또는 생물학적 기능의 변화를 초래하는 약물/분자를 나타내며, 이는 포유류, 바람직하게는 인간에서 질환 또는 장애를 치료하는 특정 양으로 유효하다. 암의 경우, 약물의 치료적 유효량은 암세포의 수 감소; 종양 크기 감소; 말초 장기로의 암세포 침투 억제 (즉, 다소 지연 및 바람직하게는 중단함); 종양 전이를 억제 (즉, 다소 지연 및 바람직하게는 중지함) 시킴; 종양 성장을 다소 억제함; 및/또는 암과 관련된 하나 이상의 증상을 다소 경감시킬 수 있다.
용어 "면역학적으로 유효한" 은 포유류에서 면역 반응을 초래하는 생물학적 분자를 나타낸다. 더욱 구체적으로, 용어는 항원을 인식하고 결합할 수 있는 분자를 의미한다. 전형적으로, 항원 결합 부위 (상보성 결정 부위, CDR) 를 포함하는 항체, 항체 절편 및 항체 융합 단백질은 면역치료적으로 유효하다.
전형적으로, 항-EGFR 항체 또는 그의 절편의 치료적 유효량은 생리학적으로 허용되는 조성물로 투여되는 경우, 밀리리터 (ml) 당 약 0.01 마이크로그램 (㎍) 내지 약 100 ㎍/ml, 바람직하게는 약 1 ㎍/ml 내지 약 5 ㎍/ml 및 보통 약 5 ㎍/ml 의 플라즈마 농도를 달성하기에 충분한 양이다. 달리 설명하면, 투여량은 1 일 또는 수일 동안 1 일 당 1 개 이상의 용량 투여 중, 약 0.1 mg/kg 내지 약 300 mg/kg, 바람직하게는 약 0.2 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg 에서 변화할 수 있다. 몰농도로의 바람직한 플라즈마 농도는 약 2 마이크로몰 (μM) 내지 약 5 밀리몰 (mM) 이며, 바람직하게는 약 100 μM 내지 1 mM 항체 안타고니스트이다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 조합 치료 ("보조 치료") 와 관련된 부작용을 감소 또는 방지하는 작용제 (이는 예를 들어, 골 흡수 억제제, 심장보호제와 같은, 항암 약물의 독성 효과를 감소시키는 작용제를 포함하나 그에 제한되지는 않음) 로의 대상의 상 포함 치료 (phase encompasses treatment) 를 포함할 수 있다. 상기 보조제 (adjunctive agent) 는 화학치료, 방사선치료 또는 수술과 관련된 메스꺼움 및 구토의 발생을 예방 또는 감소시키거나, 골수기능억제성 항암 약물의 투여와 관련된 감염의 발생률을 감소시킨다. 보조제는 당업계에 널리 공지되어 있다. 본 발명에 따른 면역치료제는 추가적으로 BCG 와 같은 보조제 및 면역계 자극제와 함께 투여될 수 있다. 추가적으로, 조성물은 면역치료제 또는 세포독성 유효 방사성표지 동위원소 등을 포함하는 화학치료제, 또는 세포독성 펩티드 (예를 들어, 사이토카인) 또는 세포독성 약물 등과 같은 기타 세포독성제를 포함할 수 있다.
본 발명의 기타 특징 및 장점은 본 발명의 원리를 예로서 나타내는 하기의 더욱 상세한 실시예로부터 명백해질 것이다. 특히, 상기 및 하기에 나타난 특 정 값 또는 용어는 본 발명을 제한하지 않으며, 당업자가 필요에 따라 외삽할 수 있다.
실시예 1 : 환자 및 항- EGFR 단일클론 항체로의 치료
EGFR-발현 mCRC 의 치료를 위한 항-EGFR moAb 파니투무마브 또는 세툭시마브의 Ospedale Niguarda Ca' Gramda 임상 시험에 등록된 환자 중, 본 치료에 대해 방사선학적으로 종양 민감성 또는 저항성을 나타내는 31 명의 환자를 평가하였다 (표 1). 환자는 본 연구를 위한 충분한 종양 조직의 이용가능성에 기초하여 선별하였다. 모든 환자는 EGFR-발현 mCRC 를 가졌고, 각 임상 프로토콜의 중심 실험실에서 DAKO EGFRPharmDX 키트를 사용하여 IHC 에 의해 평가되는 EGFR 에 대해 착색된 ≥1% 악성 세포를 나타내었다 (Cunningham et al., 2004, N Engl J Med 351: 337-345). 세툭시마브 (키메라성 IgG1 moAb; Erbitux®, Merck, Milan, Italy) 및 파니투무마브 (완전한 인간 IgG2 moAb; Amgen, Thousand Oaks, CA, USA) 모두는 EGFR 의 리간드-결합 도메인을 표적한다. 그의 임상 활성은 완전한 인간 파니투무마브로 나타나는 주입 반응의 감소된 발생률을 제외하고 유사할 것으로 예상되며, 그에 따라 어느 한 쪽의 moAb 로 치료되는 환자를 본 실험에서 함께 분석하였다. 항-EGFR moAb 로의 치료는 세툭시마브 단일치료 (n=12), 세툭시마브 및 이리노테칸 (Campto®; Aventis, Milan, Italy) 기재 화학치료 (n=9), 또는 파니투무마브 단일치료 (n=10) 으로 이루어진다. 특히, 단일 작용제 세툭시마브 (400 mg/m2 iv 로딩 용량 및 이후 진행까지 매주 250 mg/m2) 을, EMR 202-600 제 II 상 시험에서 제 1 선 치료 또는 이라노테칸-저항성 환자를 위한 BOND 제 II 상의 단일치료 무기 (arm) 에서 제 3 선으로 제공하였다. 세툭시마브 (단일치료에서와 같은 동일 용량 및 스케줄) 및 이리노테칸 (mCRC 가 저항성인 것으로 개별적으로 나타난 동일 용량 및 스케줄) 은 이리노테칸-저항성 환자를 위한 MABEL 제 II 상 시험 및 BOND 시험의 조합 무기에서 제 3 선 치료로 진행될 때까지 제공하였다. 후자 프로토콜에서, 이리노테칸에 대한 저항성은 이리노테칸 요법 후 3 개월 동안 또는 이내에 보고된 질환 진행으로 기록하였다. 단일 작용제 파니투무마브 (진행시까지 6 mg/kg iv 2 주 1 회) 는 제 III 상 ABX-EGF 20020408 및 교차 ABX-EGF 20020194 시험에서 옥살리플라틴- 및 이리노테칸-포함 요법 모두에서 저항성인 환자를 위해 제 3 선 또는 제 4 선 치료로 제공하였다. Institutional Ethics Committee 가 치료 프로토콜을 승인하였고, 환자는 EGFR 의 분석 및 시험 치료 수용에 대한 사전동의서를 제공하였다. 종양 반응은 임상 프로토콜에 따라 기관 및 독립적 방사선학자에 의한 RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) 표준을 사용하여 일관된 이미지화 기법 (CT 또는 MRI) 으로 평가하였다.
실시예 2 : 돌연변이 분석
DNA 는 파라핀 함침 샘플로부터 추출하였다. 각 환자에 대해, 10 개의 절편을 제조하였다. 추가의 대표적인 절편은 탈파라핀화하고, 헤마톡실린-에오신으로 착색시키고, 상세한 형태학을 위해 분석하였다. 종양 조직을 나타내는 부위를 표시하고 0.2M NaOH/ 1mM EDTA 로 추출한 후, 100mM Tris-TE 로 중성화시켰다. 추출 후, DNA 는 제조사 설명서에 따라 Qiagen PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) 을 사용하여 정제하였다. 엑손 특이적 및 서열분석 프라이머는 Primer3 소프트웨어 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) 를 사용하여 설계하고, InvitrogenTM 에 의해 합성하였다. 프라이머 서열: 각 엑손에 대한 전방, 후방 및 서열분석 프라이머는 하기와 같았다:
EGFR - Ex18
GCTGAGGTGACCCTTGTCTC;ACAGCTTGCAAGGACTCTGG; TGGAGCCTCTTACACCCAGT;
EGFR - Ex19
CCCAGTGTCCCTCACCTTC; CCACACAGCAAAGCAGAAAC; GCTGGTAACATCCACCCAGA;
EGFR - Ex21
TGATCTGTCCCTCACAGCAG;TCAGGAAAATGCTGGCTGAC;TTCAGGGCATGAACTACTTGG;
PI3K CA - Ex9
GGGAAAAATATGACAAAGAAAGC; CTGAGATCAGCCAAATTCAGTT;
TAGCTAGAGACAATGAATTAAGGGAAA;
PI3K CA - Ex20
CTCAATGATGCTTGGCTCTG; TGGAATCCAGAGTGAGCTTTC; TTGATGACATTGCATACATTCG
Ras ex2
GGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACC; AGAATGGTCCTGCACCAGTAA;
TCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTG.
종양 유전체 DNA 로부터의 PCR 에 의해 엑손-특이적 부위를 증폭시키고 돌연변이를 동정하기 위한 조건은 이전에 기술되었다 (Bardelli et al ., 2003, Science 300: 949). PCR 은 이전에 기술된 바와 같이 터치다운 (touchdown) PCR 프로그램을 사용하여 20 μL 의 부피로 수행하였다 (Pao et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101: 13306-13311). 정제된 PCR 생성물은 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) 를 사용하여 서열분석하고 3730 ABI 모세관 전기영동 시스템으로 분석하였다. 돌연변이 분석은 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다. 환자 13 으로부터의 종양 조직은 양이 제한되어 돌연변이 분석이 모든 엑손에 대해 기술적으로 가능하지 않았다.
실시예 3 : 형광동소보합법 ( FISH ) 에 의한 EGFR 유전자의 분석
조직 절편은 Her2 FISH 검출 키트 (Dakocytomation, Glostrup, DK) 에 대해 사용된 절차에 따라 처리하였다. 샘플은 96℃ 에서 30 분 동안 전처리 용액에 넣은 후, 실온에서 펩신 용액으로 30 분 동안 소화시켰다. 2중-색채, 2중-표적 FISH 검정은 LSI EGFR Spectrum Orange/CEP7 Spectrum Green Probe (Vysis, Downers Grove, IL) 를 사용하여 수행하였다. 10 μL 프로브 용액이 덮힌 조직 절편을 5 분간 잠시 75℃ 에서 인큐베이션하여, EGFR 및 CEP7 프로브를 동시-변성화(co-denaturation)시키고 37℃ 에서 밤새 혼성화시켰다. 동시-변성화 및 혼 성화 모두 마이크로프로세서-제어된 시스템 (Hybridizer, Dakocytomation, Glostrup, DK) 으로 순차적으로 수행하였다. 후-혼성화 엄중도 세척을 65℃ 에서 10 분 동안 수조에서 수행하였다. 2 회 세척 및 실온에서 15 분간 건조 후, 크로마틴 대조염색을 위해 조직 절편을 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI II, Vysis) 로 덮고 현미경으로 조사하였다. 분석은 Chromowin 워크스테이션 (Amplimedical, Milan, Italy) 이 장착된 형광 현미경 (Zeiss Axioskop, Gottingen, Germany) 으로 수행하였다. EGFR 유전자는 테트라메틸-로다민 이소티오시아네이트 (TRITC) 필터에 의해 적색 신호, 염색체 7α-중심체 (CEP7) 서열은 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 필터에 의해 녹색 신호, 및 핵은 DAPI 필터에 의해 청색 신호로 시각화되었다. 각 표본의 전형적인 이미지는 이후 Casti Imaging FISH Multicolor 소프트웨어 (Amplimedical) 에 의해 융합된 단색 층으로 Hamamatsu C5895 냉각된 CCD 카메라 (Upstate Technical Equipment Co., New York, USA) 로 수득하였다. 2 명의 독립적인 관찰자 (SMV 및 RB) 는 사전정의된 점수 지침을 사용하여 200 개 이상의 중복되지 않는 간기핵을 기록하였다. 상기 관찰자는 환자의 임상적 특성 및 표본에 대한 서로의 평가 및 점수에 대해 알 수 없도록 하였다. 각 핵에서, EGFR 의 복제수 및 염색체 7 프로브를 독립적으로 평가하였다. EGFR 유전자 상태는 EGFR/핵 및 EGFR/CEP7 비율로 기록하였다. 정상 대조군은 배양된 망막 색조 표피 (RPE) 세포주 및 개별적인 암에 인접한 정상 직장결장 점막으로 이루어진다. 확대된 EGFR 유전자 대조군은 A431 인간 표피유사 암종 세포주로 이루어진다. 증가된 EGFR 유전자 복제수는 임의로 EGFR 유전자 복제수/핵 ≥ 3 으로 정의된다. 환자 4 및 15 로부터의 표본은 10μ 절편으로만 이용가능했으며, 수차례의 시도에도 불구하고, FISH 분석은 과도한 조직 두께로 인해 결론적이지 않았다.
실시예 4 : 정량적 폴리머라제 사슬 반응 ( qPCR ) 에 의한 EGFR 유전자의 분석
EGFR 유전자자리에 상응하는 복제수는 ABI PRISM®7900HT 장치 (Applied Biosytems) 를 사용하여 실시간 PCR 에 의해 측정하였다. DNA 함량은 이전에 기술된 바와 같이 (Wang et al ., 2002, Proc Natl Acad Sci USA 99: 16156-16161), 배수 유전체 당 복제수가 모든 인간 세포 (정상 또는 악성) 사이에 유사한 반복 구성요소인 Line-1 의 것으로 표준화하였다. 복제수 변화는 화학식 2( Dt - Dline )-( Nt -Nline) 를 사용하여 계산하였고, 여기서 Dt 는 종양 세포로부터 추출된 DNA 중 실험 프라이머에 대해 관찰된 평균 임계 사이클 수이며, 실험 프라이머 Dline 은 종양 세포로부터 추출된 DNA 중 Line-1 프라이머에 대해 관찰된 평균 임계 사이클 수이며, Nt 는 RPE 세포로부터 추출된 정상 표준 DNA 에서 관찰된 임계 사이클 수이며, Nline 은 RPE 세포로부터 추출된 정상 표준 DNA 에서 Line-1 프라이머에 대해 관찰된 임계 사이클 수 이다. 증폭에 대한 조건은 하기와 같다: 10 분간 95℃ 에서 1 사이클, 이후 15 초간 95℃ 에서 45 사이클, 60℃ 에서 1 분. 임계 사이클 수는 ABI PRISM® 7900HT Sequence Detection System 소프트웨어를 사용하여 수득하였다. 각 프라이머 세트에 대한 PCR 을 3 중으로 수행하였고, 임계 사이클 수 를 평균하였다. EGFR 유전자를 위한 프라이머 (100 내지 200-bp 비-반복성 부위에 걸치도록 설계됨) 는 하기와 같았다: 전방 GAATTCGGATGCAGAGCTTC 및 후방 GACATGCTGCGGTGTTTTC. Line-1 반복 구성요소를 위한 프라이머는 하기와 같았다: 전방 AAAGCCGCTCAACTACATGG 및 후방 TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG.
실시예 5 : 세포 증식 억제 검정 및 웨스턴 블로팅
직장결장암 세포주 (HT-29, HCT-116, DLD-1, SW48, SW480, 및 LoVo 세포) 를 ATCC 저장소로부터 수득하였다; DiFi 세포는 Jose Baselga (Vall d'Hebron University, Barcelona, E) 가 증여하였다. 10% 우태아 혈청 (FCS) 및 항생체가 보충된 F-12 배지에서 성장시킨 DiFi 세포를 제외하고, 세포는 10% FCS 및 항생체가 보충된 DMEM 에서 성장시켰다. 세포 증식 억제 검정을 위해, 세포를 96-웰 흑색 플래이트 (Culture PlateTM 96F Packard Bioscience) 에서 2% FBS 가 보충된 DMEM 중 성장시키고 0.01-100 nM 세툭시마브 (Komtur Pharmaceuticals, Freiburg, D 로부터 구입함) 와 5 일 동안 배양하였다. 세포 증식은 화학발광 ELISA 방법 (Roche Cat. No. 1 669 915) 을 사용하여 BrdU 의 혼입에 의해 측정하였다.
웰 당 세포 접종 밀도는 하기와 같았다: DiFi, 4000; LoVo, 4000; DLD, 500; HCT116, 1000; HT29, 1000; SW480, 1000; SW387, 4000; SW48, 500; SW620, 500. BrdU 검정은 제조사의 설명서에 따라 수행하고, 표지화 용액의 첨가 20 시간 후 종결하였다. 각 세포주에 대해 3 개의 개별적인 실험을 3 중으로 설정하였다. 각 세툭시마브 농도 (실험) 에서 세포 증식의 백분율을 하기 식을 사용하여 계산하였다: (실험 - 바탕값)/(대조군-바탕값) x 100 (여기서 대조군은 배지에서만 (약물 없음) 성장시킨 세포를 나타내며 바탕값은 DMEM 중 0.02% Triton X 에서 성장시킨 세포를 나타낸다. 웨스톤 블로팅을 이전에 기술한 바와 같이 수행하였다 (Lynch and Yang, 2002, Semin Oncol 29: 47-50).
표 1 - mCRC 를 가진 환자의 종양에서 관련된 임상적 특징 및 EGFR 유전자 분자 변형
환자 번호 및 UPN 항- EGFR 항체로의 치료 종양 반응 EGFR 의 분자적 분석
최적의 반응 반응 기간 (주) 복제수b 서열*
1 - MR120653 세툭시마브 및 CT a PR 48 증가 WT
2 - LM090846 세툭시마브 및 CT PR 36 증가 WT
3 - RP180336 세툭시마브 및 CT PR 36+ 증가 WT
4 - LS250848 세툭시마브 PR 30 평가가능하지 않음c WT
5 - AC201146 파니투무마브 PR 33 증가 WT
6 - GL240243 파니투무마브 PR 24 증가 WT
7 - FC151048 파니투무마브 PR 16 증가 WT
8 - PA260526 세툭시마브 PR 16+ 정상 WT
9 - AM180627 파니투무마브 PR 12+ 증가 WT
10 - GM281120 세툭시마브 PR 8+ 증가 WT
11 - SM070445 세툭시마브 SD 30 정상 WT
12 - LC280946 세툭시마브 및 CT SD 24 정상 WT
13 - AG080530 세툭시마브 및 CT SD 24 정상 엑손 21G857R
14 - MM180625 세툭시마브 SD 36+ 정상 WT
15 - GM160553 파니투무마브 SD 32 평가가능하지 않음 c WT
16 - CC090234 파니투무마브 SD 16+ 정상 WT
17 - GT030547 세툭시마브 PD N.A. 증가 WT
18 - SM140851 세툭시마브 및 CT PD N.A. 정상 WT
19 - AC230643 세툭시마브 PD N.A. 정상 WT
20 - DS010731 세툭시마브 및 CT PD N.A. 정상 WT
21 - RV110964 세툭시마브 및 CT PD N.A. 정상 WT
22 - CC041133 세툭시마브 PD N.A. 정상 WT
23 - GT050933 세툭시마브 PD N.A. 정상 WT
24 - RT161027 세툭시마브 PD N.A. 정상 WT
25 - CB280630 세툭시마브 PD N.A. 정상 WT
26 - FL020230 세툭시마브 PD N.A. 정상 WT
27 - PC020849 파니투무마브 PD N.A. 정상 WT
28 - CF141238 파니투무마브 PD N.A. 정상 WT
29 - WB030428 세툭시마브 PD N.A. 정상 WT
30 - GA240151 파니투무마브 PD N.A. 정상 WT
31 - IM100640 파니투무마브 PD N.A. 정상 WT
a 화학요법 (CT) 는 이리노테칸-기재 치료로 이루어진다 (상세한설명을 위해 본문 참조); b 증가된 EGFR 유전자 복제수는 사례 3 및 9 에서 안정된 다염색체 및 기타에서 유전자 증폭으로 이루어진다 (결과 참조); c다중 FISH 시도는 기술적 이유로 인해 결론적이지 않았다. FISH 형광동소보합법; PR, 부분적 반응; SD, 안정적 질환; PD, 진행성 질환; UPN, 유일한 환자 번호; WT, 야생형; + 는 본 문헌 제출시 (2005년 2월) 지속되는 반응을 나타낸다. * EGFR 유전자, 엑손 18, 19 및 21 의 돌연변이 현상.
표 1b - 본 실험에서 평가된 mCRC 를 가진 환자의 추가적인 임상적 특징
환자 번호 및 UPN 성별 나이 PS a No 전이성 질환을 위한 요법 b
1 - MR120653 F 52 0 3 5-FU/FA, FOLFOX, 이리노테칸
2 - LM090846 M 59 0 3 5-FU/FA, FOLFOX, FOLFIRI
3 - RP180336 M 69 0 2 FOLFOX, FOLFIRI
4 - LS250848 M 57 1 3 5-FU/FA, FOLFOX, FOLFIRI
5 - AC201146 M 59 0 3 FOLFOX, 카페시타빈, FOLFIRI
6 - GL240243 F 62 1 2 FOLFOX, FOLFIRI
7 - FC151048 M 57 1 2 FOLFIRI, FOLFOX
8 - PA260526 M 79 1 0 해당 없음
9 - AM180627 F 78 1 3 FOLFOX, 카페시타빈, FOLFIRI
10 - GM281120 M 85 1 0 해당 없음
11 - SM070445 M 60 0 1 이리노테칸
12 - LC280946 M 59 0 2 FOLFOX, FOLFIRI
13 - AG080530 M 75 0 2 FOLFOX, FOLFIRI
14 - MM180625 F 80 1 0 해당 없음
15 - GM160553 F 52 0 4 FOLFOX, 이리노테칸, 카페시타빈, FOLFIRI
16 - CC090234 M 71 1 2 FOLFOX, FOLFIRI
17 - GT030547 M 58 0 0 해당 없음
18 - SM140851 M 54 1 2 FOLFOX, 이리노테칸 + 1주 1회의 고용량 5-FU/AF
19 - AC230643 M 62 1 0 해당 없음
20 - DS010731 M 74 0 3 이리노테칸 + 카페시타빈, FOLFOX, FOLFIRI
21 - RV110964 M 41 0 3 FOLFOX, FOLFIRI, 이리노테칸
22 - CC041133 F 72 1 0 해당 없음
23 - GT050933 M 72 1 0 해당 없음
24 - RT161027 M 78 1 0 해당 없음
25 - CB280630 F 75 1 0 해당 없음
26 - FL020230 M 75 1 0 해당 없음
27 - PC020849 M 56 1 1 옥살리플라틴-이리노테칸-5-FU/FA
28 - CF141238 F 67 0 2 FOLFOX, FOLFIRI
29 - WB030428 M 77 1 0 해당 없음
30 - GA240151 M 54 0 2 FOLFOX, FOLFIRI
31 - IM100640 F 65 1 3 5-FU/FA, FOLFOX, FOLFIRI
No : 전이성 질환을 위한 이전의 화학치료 요법의 수
a 항-EGFR 단일클론 항체 치료 시작시 효율 상태 (ECOG).
b 화학치료 요법은 하기로 이루어진다: 5-FU/FA: 5-플루오로우라실 + 폴린산 (다양한 스케줄); FOLFOX: 옥살리플라틴 + 5-플루오로우라실 + 폴린산; FOLFIRI: 이리노테칸 + 5-플루오로우라실 + 폴린산.
표 2 - mCRC 를 가진 환자의 종양에서 발견되는 분자적 변형
환자 UPN 유전자 복제수 돌연변이 분석
종양 반응 EGFR 유전자 / CEP7 EGFR 유전자/핵 EGFR 엑손 -18 EGFR 엑손 -19 EGFR 엑손 -21 Ras 엑손 -2 PI 3 K 엑손 -9 PI 3 K 엑손 -20 BRAF 엑손 -15
1 - MR120653 PR 3.37 7.90 WT WT WT WT E545K WT WT
2 - LM090846 PR 2.28 5.70oo WT WT WT WT WT WT WT
3 - RP180336 PR 1.42 7.10 WT WT WT WT WT WT WT
4 - LS250848 PR n.e. a n.e. a WT WT WT WT WT WT WT
5 - AC201146 PR 2.50 4.80 WT WT WT WT WT WT WT
6 - GL240243 PR 2.13 6.80 WT WT WT G13D WT WT WT
7 - FC151048 PR 3.27 8.20 WT WT WT G12D WT WT WT
8 - PA260526 PR 1.03 1.65 WT WT WT WT WT WT WT
9 - AM180627 PR 1.19 3.38 WT WT WT WT WT WT WT
10 - GM281120 PR 8.75 병소 밀집 (focal clustered) 35 병소 밀집 WT WT WT WT WT WT WT
11 - SM70445 SD 0.98 1.8 WT WT WT WT WT WT WT
12 - LC280946 SD 1.05 1.9 WT WT WT WT WT WT WT
13 - AG080530 SD 0.95 1.75 WT WT G857R WT WT WT n.e. a
14 - MM180625 SD 1.06 1.80 WT WT WT WT WT WT WT
15 - GM160553 SD n.e. a n.e. a WT WT WT G13D WT WT WT
16 - CC090234 SD 1.04 1.88 WT WT WT G12V WT WT WT
17 - GT030547 PD 4.68 밀집 20.2 밀집 WT WT WT WT WT H1047R WT
18 - SM140851 PD 1.04 2.00 WT WT WT G13D WT WT WT
19 - AC230643 PD 0.70 1.72 WT WT WT WT WT WT WT
20 - DS010731 PD 0.99 1.95 WT WT WT G12V WT WT WT
21 - RV110964 PD 0.95 2.00 WT WT WT WT WT WT WT
22 - CC041133 PD 1.00 1.90 WT WT WT G12S WT WT WT
23 - GT050933 PD 1.20 2.10 WT WT WT WT WT WT WT
24 - RT161027 PD 1.16 1.98 WT WT WT G12D WT WT WT
25 - CB280630 PD 0.90 1.75 WT WT WT WT WT WT WT
26 - FL020230 PD 0.96 1.85 WT WT WT G12D WT WT WT
27 - PC020849 PD 0.91 1.70 WT WT WT WT WT WT WT
28 - CF141238 PD 1.02 2.00 WT WT WT G13D WT WT WT
29 - WB030428 PD 1.00 2.05 WT WT WT WT WT WT WT
30 - GA240151 PD 1.03 2.00 WT WT WT WT WT WT WT
31 - IM100640 PD 1.18 2.10 WT WT WT WT WT H1047R E599V
a FISH 및 돌연변이 분석 측정은 기술적 이유로 확정적이지 않았다 (방법 참조); WT, 야생형; PR, 부분적 반응; SD, 안정적 질환; PD, 진행성 질환; UPN, 유일한 환자 번호; n.e., 평가가능하지 않음. oo 증가된 EGFR 유전자 복제수가 moAb 치료 전 원발성 직장결장 종양 및 moAb 치료 후 진행성 질환시에 수득된 간 전이 모두에서 나타났다.

Claims (23)

  1. EGF 수용체 (EGFR) 를 과발현하는 암을 앓는 환자가 항-EGFR 항체 또는 면역학적으로 유효한 그의 절편의 투여에 양성적으로 반응하는지 여부를 검출 및 분석하기 위한 시험관내 방법으로서, 상기 환자로부터 수득된 종양 세포의 프로브에서 EGFR 유전자 복제수를 시험관내에서 측정하고, 상기 환자의 종양 세포가 확대된 복제수의 EGFR 유전자를 나타내는 경우, 상기 항-EGFR 항체로의 투여를 위해 상기 환자를 선별하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, EGFR 유전자 복제수가 핵 당 EGFR 유전자의 수의 비율로 측정되는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 비율이 4.0 내지 8.2 의 범위인 방법.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 비율이 5.7 내지 7.1 의 범위인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, EGFR 유전자 복제수가 CEP7 당 EGFR 유전자의 수의 비율로 측정되는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 비율이 >2 인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, EGFR 유전자 복제수가 FISH 분석 (형광동소보합법) 에 의해 측정되는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 EGFR 유전자 복제수가 상기 종양에 대해 특이적인 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭된 EGFR 유전자 복제수가 환자의 개별적인 암 조직 프로파일에 대해 특이적인 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 개별적인 암 조직 프로파일이 추가적인 분자적 변형의 기초가 되는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 분자적 변형이 EGFR 유전자 내의 점 돌연변이인 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체가 세툭시마브 (mAb c225), 마투주마브 (mAb h425) 및 파니투무마브 (mAb ABX) 또는 그의 특정 쥣과, 키메라성 또는 인간화 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 직장결장암 (CRC), 폐암, 두경부암 및 유방암인 방법.
  14. 환자에서의 암 치료용 약제 제조를 위한 항-EGFR 항체, 또는 그의 면역학적으로 유효한 절편의 용도 (여기서, 상기 암은 EGFR 을 과발현하며 확대된 EGFR 유전자 복제수를 나타낸다).
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 EGFR 유전자 복제수가 핵 당 EGFR 유전자 수의 비율로 측정되고, 상기 비율의 값은 4.0 내지 8.2 의 범위인 용도.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 비율의 값이 5.7 내지 7.1 의 범위인 용도.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암의 치료는 암세포가 확대된 EGFR 복제수를 나타내지 않는 동일 용량의 동일 항체로의 암 환자 치료와 비교하여 더욱 효과적인 용도.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 EGFR 유전자 복제수가 상기 종양에 대해 특이적인 용도.
  19. 제 14 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 확대된 EGFR 유전자 복제 수가 환자의 개별적인 암 조직 프로파일에 대해 특이적인 용도.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 개별적인 암 조직 프로파일이 유전자 돌연변이의 기초가 되는 용도.
  21. 제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EGFR 발현 종양이 직장결장암 (CRC), 폐암, 유방암 또는 두경부암인 용도.
  22. 제 14 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체가 세툭시마브 (mAb c225), 마투주마브 (mAb h425) 및 파니투무마브 (mAb ABX), 또는 그의 특정 쥣과, 키메라성 또는 인간화 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도.
  23. 항-EGFR 항체로의 투여에 대한 암 환자의 반응을 결정하는 검정에서 형광동소보합법 (FISH) 를 사용하여, EGFR 을 과발현하는 종양 조직의 EGFR 유전자 복제수를 시험관내에서 검출 및 측정하는 방법.
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