BRPI0610440A2 - terapia com anticorpo anti-egfr baseada em um maior número de cópias do gene egfr em tecidos de tumores - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um diagnóstico individualizado e personalizado e terapia de câncer à base de alterações moleculares específicas que ocorrem em tecido tumoral específico de populações de pacientes com tumores específicos. A terapia e o diagnóstico são baseados nas descobertas de que a proliferação e o crescimento de tecido tumoral especifico que carrega EGFR que expressa um número de cópia de gene EGFR amplificado podem ser abolidos por anticorpos anti-EGFR, enquanto outras alterações moleculares individuais que ocorrem em tecidos de tumor não são afetadas pelo mesmo tratamento com anticorpo anti-EGFR.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERAPIACOM ANTICORPO ANTI-EGFR BASEADA EM UM MAIOR NÚMERO DECÓPIAS DO GENE EGFR EM TECIDOS DE TUMORES".

Campo Técnico da Invenção

A presente invenção refere-se ao diagnóstico e à terapia de tu-mores que expressam mais altos níveis de receptor de fator de crescimentoepidermal (EGFR) por meio de anticorpos anti-EGFR. A invenção refere-setambém a um diagnóstico individualizado e personalizado e à terapia decâncer que expressa EGFR, baseada em alterações moleculares específicasque ocorrem em tecido tumoral específico de populações de pacientes comtumores específicos.A terapia e o diagnóstico são baseados nas descober-tas de que a proliferação e o crescimento do tumor de tecido tumoral especí-fico que porta EGFR exibindo um número de cópias amplificado do geneEGFR podem ser abolidas por anticorpos anti-EGFR, enquanto outras alte-rações que ocorrem em tecidos tumorais, tais como mutações gênicas espe-cíficas, são inalteradas pelo mesmo tratamento com anticorpos anti-EGFR.Antecedentes Técnicos da Invenção

É sabido que moléculas biológicas, tais como anticorpos mono-clonais (MAbs) ou outras proteínas / polipeptídeos, assim como compostosquímicos pequenos direcionados contra vários receptores e outros antígenossobre a superfície de células tumorais, são adequadas para a terapia paratumores por mais de vinte anos. Em relação à abordagem do anticorpo, amaior parte destes MAbs é quimerizada ou humanizada para melhorar a to-lerabilidade com o sistema imunológico humano. Os MAbs ou as entidadesquímicas mencionadas antes especificamente se ligam às suas estruturasalvo sobre células de tumor e na maioria dos casos também em tecidosnormais e podem causar diferentes efeitos que dependem da sua especifici-dade do estopo e/ou de características funcionais do antígeno em particular.

Os receptores são tirosina quinases receptoras típicas que foramimplicadas em câncer nos anos 80. As tirosina quinases são uma classe deenzimas que catalisam a transferência do fosfato terminal de adenosina tri-fosfato para os resíduos de tirosina em substratos de proteína. Acredita-seque as tirosina quinases, por meio de fosforilação do substrato, representepapéis críticos em transdução de sinal para algumas funções da célula. Em-bora o mecanismo exato de transdução de sinal ainda não esteja claro, foidemonstrado que as tirosina quinases são importantes fatores de contribui-ção na proliferação da célula, carcinogênese e diferenciação da célula. Astirosina quinases do tipo receptoras têm uma transmembrana extracelular euma parte intracelular, embora as tirosina quinases do tipo não receptor se-jam totalmente intracelulares. As tirosina quinases ligadas a receptor sãoproteínas de transmembrana que contêm um domínio de ligação de ligandoextracelular, uma seqüência de transmembrana e um domínio de tirosinaquinase citoplásmica. As tirosina quinases do tipo receptoras consistem emum grande número de receptores de transmembrana com atividade biológicadiversa.

Foram identificadas diferentes subfamílias de tirosina quinasesdo tipo receptoras. As tirosina quinases implicadas incluem receptores dofator de crescimento de fibroblasto (FGF), receptores do fator de crescimen-to epidermal (EGF) da família da classe principal ErbB e receptores do fatorde crescimento derivados de plaqueta (PDGF). Também estão implicadosos receptores de fator de crescimento do nervo (NGF), receptores de Fatorneurotrófico derivados do cérebro (BDNF) receptores e receptores de neuro-trofina-3 (NT-3) receptores e receptores de neurotrofina-4 (NT-4).

O EGFR, codificado pelo gene erbB1, tem sido implicado casu-almente na malignidade humana. Em particular, foi observada maior expres-são de EGFR observada em câncer de mama, de bexiga, de pulmão, de ca-beca, de pescoço e de estômago, como glioblastomas.

Uma maior expressão de receptor EGFR freqüentemente estáassociada com a maior produção do ligando EGFR, transformando o fator decrescimento alfa (TGF-a), pelas mesmas células do tumor resultando na ati-vação do receptor por um percurso estimulador autócrino (Baselga e Men-delsohn, Pharmac. Ther. 64: 127-154 (1994)). O receptor EGF é uma glico-proteína de transmembrana que tem um peso molecular de 170,000 e é en-contrado em muitos tipos de célula epitelial. Ele é ativado por pelo menostrês ligandos, EGF, TGF-cc (fator de transformação de crescimento alfa) eanfirregulina. Foi demonstrado que tanto o fator de crescimento epidermal(EGF) como o fator de transformação de crescimento-alfa (TGF-a) se ligamao receptor EGF e levam à proliferação celular e crescimento do tumor.

Foi demonstrado que os anticorpos receptores anti-EGF emborabloqueando a ligação de EGF e TGF-a ao receptor parecem inibir a prolife-ração da célula de tumor. Em vista destas descobertas, alguns anticorposmonoclonais murinos e de rato contra o receptor EGF foram desenvolvidos etestados por sua capacidade de inibir o crescimento de células de tumor invitro e in vivo (Modjtahedi e Dean, 1994, J. Oncology 4, 277). O anticorpomonoclonal humanizado 425 (hMAb 425, matuzumab; US 5.558.864; EP0531 472) e o anticorpo monoclonal quimérico 225 (cMAb 225), ambos diri-gidos para o receptor EGF, demonstraram a sua eficiência em experimentosclínicos. Foi demonstrado que o anticorpo C225 (cetuximab) inibe o cresci-mento da célula de tumor mediado por EGF in vitro e inibe a formação detumor humano in vivo em um camundongo sem pelo. O anticorpo assim co-mo em geral todos os anticorpos anti-EGFR, parecem agir, acima de tudo,em sinergia com certos agentes quimioterápicos (isto é, doxorrubicina, adri-amicina, taxol e cisplatina) para erradicar tumores humanos in vivo em mo-delos de xenoenxerto em camundongos (ver, por exemplo, a EP 0667165).Ye e outros (1999, Oncogene 18, 731) relataram que as células de câncerovariano humano podem ser tratadas com sucesso com uma combinação detanto de mAb 225 quimérico como de mAb 4D5 humanizado que é dirigidoao receptor HER2. Além disso, uma combinação de matuzumab e cetuximabprovocam uma resposta sinergística antitumor (WO 04/32960). Um outroanticorpo anti-EGFR totalmente humano é panitumumab (mAb ABX) (porexemplo, WO 98/50433, US 6.235.883) desenvolvida pela tecnologia de Xe-noMouse®.

Os anticorpos monoclonais receptores de fator de crescimentoanti-epidermal (EGFR), tais como o anticorpo monoclonal quimérico c225(cetuximab) e o anticorpo totalmente humano panitumumab demonstraramuma notável atividade clínica em aproximadamente 10 % dos pacientes comcâncer colorretal metastásico resistente à quimioterapia (mCRC). Os meca-nismos moleculares básicos da sensibilidade clínica ou da resistência destesagentes são presentemente desconhecidos.

O "arsenal" terapêutico contra câncer colorretal metastásico (m-CRC), a terceira causa mais freqüente de mortes por câncer, tem sido recen-temente reforçado com anticorpos monoclonais (mAbs) dirigidos contra odomínio extracelular do receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR)(Erlichman e Sargent; 2004, N Engl J Med 351: 391-392). Entre os mAbsanti-EGFR, o anticorpo quimérico cetuximab (Erbitux®) e o anticorpo total-mente humano panitumumab cada um demonstrou uma notável atividadeclínica em aproximadamente 10 % dos pacientes com mCRC resistente aquimioterapia, porém os mecanismos moleculares básicos da sensibilidadeclínica ou da resistência são presentemente desconhecidos. Nem as carac-terísticas do diagnóstico nem o grau de expressão de EGFR do tumor avali-ado por imunohistoquímica, se correlacionam com a resposta clínica (Saltz eoutros, 2004, J Clin Oncol 22: 1201-1208; Cunningham e outros, 2004, NEngl J Med 351:337-345; Hecht e outros, 2004, Journal of Clinicai Oncology,ASCO Annual Meeting Proceedings, Post-Meeting Editiorí). A compreensãoda base molecular de sensibilidade clínica ou resistência a moAbs anti-EGFR pode permitir a identificação de pacientes que são propensos a sebeneficiar com o tratamento com cetuximab ou com panitumumab.

A biologia do EGFR foi estudada em detalhe usando abordagenstanto genéticas como bioquímicas (Ciardiello e outros, 2003, Eur J Câncer39: 1348-1354;

Holbro e outros, 2004, Annu Rev Pharmacol Toxicol 44: 195-217). Aetapa inicial de ligação de um ligando à parte extracelular do receptor, promovea dimerização do receptor e a ativação de sua atividade enzimática, resul-tando assim na fosforilação do domínio intracelular. Subseqüentemente, osefetores celulares se ligam aos resíduos fosforilados do domínio intracelulare se tornam ativados, principalmente por sua relocalização à membrana doplasma. A pequena proteína G Ras, a proteína quinase Raf e a lipídeo qui-nase PI3K representam papéis importantes como os mediadores intracelula-res da sinalização de EGFR. Foram encontrados alterações genéticas doEGFR e seus efetores em uma variedade de cânceres (Bardelli e outros,2003, Science 300: 949; Vogelstein e outros, 2004, Nat Med 10: 789-799;Bardelli e outros, 2005, Curr Opin Genet DeV\5: 5-12).

Portanto, podia surgir a hipótese de que a resposta clínica a cer-tos anticorpos anti-EGFR específicos tais como cetuximab, panitumumab oumatuzumab podia estar associada a alterações moleculares que afetam oEGFR ou seus transdutores de sinal intracelulares imediatos.

Em muitos cânceres, tal como mCRC nem as características dediagnóstico do tumor nem o grau de expressão de EGFR avaliado por imu-nohistoquímica, se correlacionam com a resposta clínica aos antagonistaspara EGFR, especialmente os anticorpos anti-EGFR, tais como cetuximab,matuzumab (hMab 425) ou panitumumab. Correntemente, portanto, a maio-ria dos pacientes tratados está exposta ao risco de terapia ineficaz com efei-tos colaterais indesejados. A eficácia do tratamento de pacientes com mCRCcom mAbs anti-EGFR tais como cetuximab, matuzumab ou panitumumabrepresenta um progresso significativo em medicina. No entanto, o tratamentocom mAbs anti-EGFR resultou em respostas objetivas apenas em uma fra-ção de pacientes em estudos clínicos que envolvem pacientes quimiorrefra-tários e não há ferramentas para diagnóstico para identificar aqueles quesão prováveis de se beneficiar com esta terapia. Como resultado, a maiorparte dos pacientes tratados é exposta ao risco de terapia ineficaz com efei-tos colaterais indesejados. Terapias não personalizadas também resultemem uma enorme carga financeira para os sistemas de saúde.

Portanto, há uma necessidade de explicar a resposta diferencialem pacientes a anticorpos mònoclonais anti-EGFR e desenvolver uma estra-tégia para identificar pacientes com câncer tais como pacientes com CRCprováveis de se beneficiar da terapia com anticorpo anti-EGFR.

Os mecanismos moleculares básicos da sensibilidade ou do po-der refratário das células de câncer que expressam EGFR a mAbs anti-EGFR são desconhecidos. Portanto, há uma outra necessidade de se forne-cer ferramentas para diagnóstico que demonstram se a resposta a mAbsanti-EGFR em câncer está correlacionada com previsores ou marcadoresbiológicos que incluem (i) mutações que afetam o domínio catalítico do geneEGFR, (ii) mutações que afetam o EGFR a jusante dos efetores de sinaliza-ção ou (iii) amplificação do local do gene EGFR.

Sumário da Invenção

Foi descoberto agora de acordo com esta invenção que o núme-ro de cópias do gene EGFR apresentado pelas células de tumor em pacien-tes com tumor que inclui pacientes quimiorrefratários é aumentado em apro-ximadamente 89 % dos pacientes que provocam uma resposta objetivo aodito tumor e em apenas aproximadamente 5,0 % dos pacientes com doençaestável ou progressiva. Desse modo, o status da mutação do domínio catalí-tico de EGFR e de seus efetores imediatos à jusante PI3K, RAS, RAF nãose correlaciona com a dita resposta.

De acordo com a invenção a mesma concentração de anticorposanti-EGFR específicos, tais como cetuximab, matuzumab ou panitumumabque impedia completamente a proliferação das células que apresentam umnúmero de cópia de gene EGFR amplificado em modelos celulares de cân-ceres específicos, tal como câncer colorretal, não afeta as células que nãoapresentam número de cópia de EGFR amplificado.

De acordo com a invenção, em pacientes que sofrem de cânce-res específicos, de preferência mCRC, a resposta ao tratamento com anti-corpos anti-EGFR específicos, como panitumumab, cetuximab ou matuzu-mab (ou qualquer fragmento imunologicamente eficaz ou proteína de fusãodo mesmo) pode estar significativamente associado à presença de um nú-mero de cópia de gene EGFR amplificado. Em outras palavras: aqueles pa-cientes que respondem ou são sensíveis a tratamento anti-EGFR têm ummaior número de cópias do gene EGFR comparado com aqueles pacientesque não respondem ao tratamento com o mesmo anticorpo na mesma dose.Além disso, pode ser observado que um maior número de cópias do geneEGFR está correlacionado com o encolhimento do tumor em pacientes ecom uma sobrevivência prolongada por tratamento com os ditos mAbs. Nes-tes pacientes, o crescimento do tumor é provável de ser dirigido predominan-temente pelo percurso de EGFR.

O número de cópia de gene EGFR amplificado pode ser medidode acordo com a presente invenção por determinação da razão dos genesEGFR por núcleo e / ou a razão definida pelo número de cópias do geneEGFR e de CEP7 (cromossomo 7 sonda de centrômero). Foi descobertoque, de acordo com a invenção, em sondas de tumor, em que a razão: có-pias de gene EGFR / núcleo é > 4, de preferência na faixa de entre 5,7 e 7,1e / ou as cópias de gene EGFR / CEP7 > 2, a administração de um anticorpoanti-EGFR a um paciente, do qual deriva a sonda do tumor, é mais eficaz doque em pacientes que têm razões de número de cópia como definido inferiorao indicado. Os pacientes que têm células de tumor que apresentam núme-ros de cópia de gene EGFR não amplificado ou apenas ligeiramente amplifi-cado (razões: 1 ou < 2) não ou não suficientemente respondem à terapia deanticorpo anti-EGFR.

Esta observação representa o primeiro paradigma para uma te-rapia direcionada personalizada de cânceres específicos, tal como câncercolorretal, baseado em uma alteração molecular específica. Para administraros ditos fármacos a um paciente mais eficazmente, é agora providenciadauma ferramenta para identificar aqueles pacientes mais prováveis de se be-neficiarem das mesmas .

Foi ainda descoberto que há uma nova mutação somática nodomínio cataiítico de EGFR e algumas mutações em seus efetores imediatosa jusante (tais como KRAS e PI3KCA), estas alterações não se correlacio-nam com a sensibilidade a mAbs anti-EGFR. Estas descobertas têm algu-mas clínicas e biológicas. Na expressão e superexpressão de câncer a res-posta a mAbs anti-EGFR esta provavelmente menos associada às mutaçõesdo gene EGFR porém, em vez disso, com seu número de cópia maior / am-plificado. Estes resultados sugerem que os tratamentos à base de anticorposanti-EGFR estão propensos a trabalhar mais eficientemente contra alvos quesão amplificados em vez de afetados por mutações no ponto. No entanto, asalterações genéticas tais como mutações no ponto podem contribuir para asua eficiência e eficácia do tratamento com anticorpo anti-EGFR.Em relação a CRC, em particular; a proliferação de células deCRC com número de cópia de gene EGFR amplificado é abolida por anticor-pos anti-EGFR, tal como cetuximab, ao passo que células de CRC com nú-mero de cópia de gene EGFR não amplificado são inafetadas pelas mesmasdoses do anticorpo monoclonal anti-EGFR. Isto indica que células de câncer,especialmente células de CRC, com gene EGFR amplificado são dependen-tes e até mesmo dependentes da alteração molecular para a sua prolifera-ção.

Os presentes dados também indicam que a medida de FISH (hi-bridização fluorescente in situ) do número de cópias do gene EGFR podiarepresentar uma ferramenta experimental para identificar pacientes commCRC e outros cânceres que são prováveis de responder aos mAbs anti-EGFR visados. Além disso, contrário aos ensaios semiquantitativos tal comoqPCR e Western blotting, no caso de superexpressão de proteína de EGFRe maior número de cópia de gene EGFR localizados em focos isolados den-tro do mesmo tumor (Figura 3), a análise FISH não é influenciada pela pre-sença concomitante de células dissômicas de tumor ou de contaminantesestromais normais. Desse modo, um padrão não homogêneo possível deexpressão de EGFR podia ser levado em conta para explicar a falta de cor-relação entre IHC e a resposta clínica para mAbs (Figura 3).

Em outras palavras: de acordo com a presente invenção, tam-bém foi demonstrado pela primeira vez que aqueles pacientes com câncer,de preferência pacientes com mCRC, que apresentam a resposta clínicapara a administração de mAbs anti-EGFR tais como cetuximab, matuzumabou panitumumab, que é significativamente baseada em um maior número decópias de EGFR, pode ser selecionada e avaliada por utilização da análiseFISH de amostras de tumor individuais dos ditos pacientes. Em outras pala-vras: os pacientes que são positivos para FISH têm um maior número decópia de gene do que os pacientes que são negativos para FISH. Dessemodo, pode ser concluído que os pacientes que apresentam um maior nú-mero de cópia de EGFR como analisado por FISH têm uma melhor previsãode sobrevivência do que aqueles pacientes que apresentam um baixo núme-ro de cópia de gene.

Para recapitular de uma maneira mais geral a invenção refere-seaos seguintes assuntos em questão.

- Um processo para tratamento de tumores que expressam oreceptor EGF (EGFR) em um paciente por administração ao dito paciente deum anticorpo anti-EGFR em uma quantidade que é suficiente para abolir aproliferação das ditas células de tumor que tenham um número de cópia degene EGFR amplificado.

- Um método correspondente, em que o dito tratamento é maiseficaz comparado a um tratamento com o mesmo anticorpo na mesma doseaplicada a células de tumor que não provocam um número de cópia de geneEGFR amplificado.

- Um método correspondente, em que as ditas células de tumoradicionalmente provocam alterações moleculares ou mutações genéticas.

- Um método correspondente, em que o número de cópia de ge-ne EGFR amplificado é específico para o dito tumor.

- Um método correspondente, em que o número de cópia de ge-ne EGFR amplificado é específico para o perfil do tecido de câncer individualdo paciente.

- Um método correspondente, em que o dito perfil do tecido decâncer individual expõe-se a alterações moleculares.

- Um método correspondente, em que o dito tumor que expressaEGFR é câncer colorretal (CRC).

- Um método correspondente, em que o dito câncer colorretal émetastásico (mCRC).

- Um método correspondente, em que o dito anticorpo anti-EGFR é selecionado do grupo de Mab 225 e Mab 425 em suas versões mu-rina, quimérica e humanizada.

- Um uso de um anticorpo anti-EGFR para a fabricação de ummedicamento para o tratamento de câncer, que é baseado nas células detumor que expressam EGFR que têm um número de cópia de gene EGFRamplificado, em que o dito tratamento é mais eficaz comparado a um trata-mento com o mesmo anticorpo na mesma dose aplicado a células de tumorque não provocam um número de cópia de gene EGFR amplificado.

- Um uso correspondente de um anticorpo anti-EGFR, em queas ditas células de tumor adicionalmente provocam alterações molecularesou mutações genéticas

- Um uso correspondente, em que o dito número de cópia degene EGFR amplificado é específico para o dito tumor.

- Um uso correspondente, em que o número de cópia de geneEGFR amplificado é específico para o perfil do tecido de câncer individual dopaciente.

- Um uso correspondente, em que o dito perfil do tecido de cân-cer individual expõe-se a alteração molecular.

- Um uso correspondente, em que o dito tumor que expressaEGFR é câncer colorretal (CRC).

- Um uso correspondente, em que o dito câncer colorretal é me-tastásico (mCRC).

- Um uso correspondente, em que o dito anticorpo anti-EGFR éselecionado do grupo de Mab 225 e Mab 425 em suas versões murina, qui-mérica e humanizada.

- Método para detectar e medir in vitro o número de cópia detecido de tumor do gene EGFR por utilização de hibridização fluorescente insitu (FISH).

- Um uso de hibridização fluorescente in situ (FISH) para a iden-tificação in vitro de pacientes que tenham tumores que respondem a anticor-pos anti-EGFR.

- Um uso de hibridização fluorescente in situ (FISH) para a iden-tificação in vitro de pacientes que tenham tumores que provoquem um maiornúmero de cópia de gene EGFR

- Um uso correspondente, em que o dito tumor é câncer colorre-tal (CRC), de preferência CRC metastásico.

- Um uso correspondente, em que o dito anticorpo é 225 ou 424em suas versões murina, quimérica ou humanizada.- Um método in vitro para detectar e analisar se um paciente quesofre de um câncer que superexpressa receptor EGF (EGFR), responde po-sitivamente à administração de um anticorpo anti-EGFR ou de um fragmentoimunologicamente eficaz do mesmo, o processo compreendendo a determi-nação in vitro do número de cópias do gene EGFR em uma sonda de célulasde tumor obtidas do dito paciente e selecionando o dito paciente para a ad-ministração do dito anticorpo anti-EFFR se as células de tumor do dito paci-ente apresentam um número de cópias amplificado de genes EGFR.

- Um método correspondente, em que o número de cópias dogene EGFR é medido como razão do número de genes EGFR por núcleo.

- Um método correspondente, em que a dita razão está na faixaentre 4,0 e 8,2.

- Um método correspondente, em que a dita razão está na faixaentre 5,7 e 7,1.

- Um método correspondente, em que o número de cópias dogene EGFR é medido como razão do número de genes EGFR por CEP7.

- Um método correspondente, em que a dita razão é > 2.

- Um método correspondente, em que o número de cópias dogene EGFR é medido por análise de FISH (hibridização fluorescente in situ).

- Um método correspondente, em que o número de cópias dogene EGFR amplificado é específico para o dito tumor.

- Um método correspondente, em que o número de cópias dogene EGFR amplificado é específico para o perfil individual do tecido decâncer do paciente.

- Um método correspondente, em que o dito perfil individual dotecido de câncer expõe-se também a alteração molecular.

- Um método correspondente, em que a dita alteração molecularé uma mutação pontual dentro do gene EGFR.

- Um método correspondente, em que o dito anticorpo anti-EGFR é selecionado do grupo que consiste em cetuximab (mAb c225), ma-tuzumab (mAb h425) e panitumumab (mAb ABX) ou de suas versões parti-culares murina, quimérica ou humanizada.- Um método correspondente, em que o câncer é câncer colorre-tal (CRC), câncer do pulmão, câncer da cabeça e do pescoço e câncer demama.

- Uso de um anticorpo anti-EGFR ou de um fragmento imunolo-gicamente eficaz do mesmo, para a fabricação de um medicamento para otratamento de câncer em um paciente, em que o dito câncer superexpressaEGFR e apresenta um número de cópia de gene EGFR amplificado.

- Um uso correspondente, em que o dito número de cópia degene EGFR é medido como razão de um erro de genes EGFR por núcleo eo valor desta razão está na faixa entre 4,0 e 8,2.

- Um uso correspondente, em que o valor da dita razão está nafaixa entre 5,7 e 7,1.

- Um uso correspondente, em que o tratamento do dito câncer émais eficaz comparado com o tratamento de um paciente com o câncer como mesmo anticorpo na mesma dose, em que as células de câncer não apre-sentam um número de cópia de gene EGFR amplificado.

- Um uso correspondente, em que o dito número de cópia degene EGFR amplificado é específico para o dito tumor.

- Um uso correspondente, em que o número de cópia de geneEGFR amplificado é específico para o perfil individual do tecido de câncer dopaciente.

- Um uso correspondente, em que o dito perfil individual do teci-do de câncer expõe-se a mutações genéticas.

- Um uso correspondente, em que o dito tumor que expressaEGFR é câncer colorretal (CRC), câncer do pulmão, câncer de mama oucâncer de cabeça e pescoço.

- Um uso correspondente, em que o dito anticorpo anti-EGFR éselecionado do grupo que consiste em cetuximab (mAb c225), matuzumab(mAb h425) e panitumumab (mAb ABX) ou de suas versões murina, quimé-rica e humanizada.

- Um método para detectar e medir in vitro o número de cópia degene EGFR de tecido de tumor, que superexpressa EGFR, pela utilização dehibridização fluorescente in situ (FISH) em um ensaio para determinar a res-posta de um paciente de câncer à administração com um anticorpo anti-EGFR.

Breves Descrições das Figuras

Figura 1 - Mutação heterozigótica com sentido errado no éxon21 (G857R) encontrada em tumor de paciente 13 (ver também a Tabela 2).

A mutação afeta um resíduo crítico localizado no circuito de ativação do do-mínio da EGFR quinase. O G857R é um aminoácido ao lado da mutaçãoL858R recém-descoberta encontrada em indivíduos com resposta gefitinib eerlotinib em câncer pulmonar de células sem ser pequenas (NSCLC) (Lynche outros, 2004, N Engl J Med 350: 2129-2139.; Paez e outros, 2004, Science304: 1497-1500; Pao e outros, 2004, Proc Natl Acad Sei USA 101: 13306-13311). Uma mutação que afeta o resíduo análogo no gene de BRAF(G595R) foi detectada anteriormente em câncer colorretal (CRC) (Wiley, Di-az , 2004, Jama 291: 2019-2020).

Figura 2- Ensaios de hibridização fluorescente in situ de duplacor para sondas de gene EGFR (vermelho) e cromossomo 7 (CEP7; verde).(A) Dissomia equilibrada em mucosa colorretal normal; (B) Dissomia equili-brada em tumor de paciente 27; (C) Polissomia equilibrada em tumor de pa-ciente 3; (D) Amplificação em tumor de paciente 5.

Figura 3 - EGFR amplificação e expressão de proteína em tumorde paciente 10, (A) histologia convencional por hematoxilina e formação demancha com eosina. (B e C) amplificação de gene EGFR e superexpressãode proteína por imunohistoquímica (Moroni e outros, 2001, Clin Câncer Res7:2770-5) em áreas correspondentes do mesmo tumor.

Figura 4 - Alterações moleculares no gene EGFR e resposta clí-nica observada no paciente 1. (A) Ensaios de hibridização fluorescente insitu de dupla cor para sondas de gene EGFR (vermelho) e cromossomo 7(CEP7; verde) que apresentam maior número de cópia; (B) Quantidade rela-tiva de cópias de gene EGFR medida por PCR quantitativo em tumor de pa-ciente 1, linhagem de célula A431 de câncer (gene EGFR / núcleo 8,00; ge-ne EGFR /CEP7 2,57) e RPE não-maligno (Gene EGFR/núcleo 1.60; GeneEGFR/CEP7 0,86) controles de célula epitelial; (C) (D) Medidas de metásta-se do fígado por CT antes (maior diâmetro, L linhagem 4,4 cm) e depois (di-âmetro mais alto, linhagem M 2,3 cm) tratamento com moAb no paciente 1.

Figura 5 - Inibição de proliferação da linhagem de célula de cân-cer colorretal por cetuximab. (A) Proliferação de linhagens de célula de cân-cer colorretal em três experimentos separados (média ± SD) na presença demaiores concentrações de cetuximab. (B) Níveis de proteína EGFR medidospor Western blot em linhagens de célula individuais. (C) Número de cópia degene EGFR avaliado por FISH em linhagens de célula de câncer colorretal.

(D) Ensaios de hibridização fluorescente in situ de dupla cor para sondas deGene EGFR (vermelho) e cromossomo 7 (CEP7; verde) que apresentammaior número de cópia na linhagem de célula DiFi.

Descrição Detalhada

O termo "número de cópia" é habitualmente definido como onúmero de genes por genoma. De acordo com a invenção o termo "Númerode cópia de gene EGFR' significa a razão de número de Gene EGFRs pornúcleo. De acordo com a invenção este número varia desde 1,0 até 8.2 oumais preferivelmente de desde 1,5 até 7,9.

De acordo com a invenção o termo "aumento de número de có-pia de gene EGFR amplificado" significa que, em uma perspectiva relativa, arazão definida acima em células de um tumor específico correlacionado aum paciente específico (que responde ao tratamento com anticorpo anti-EGFR) é maior ou amplificado comparado à razão em particular em célulasde um tumor específico correlacionado a um outro paciente específico. Emuma perspectiva mais absoluta, o termo significa que a razão (número deGene EGFR / núcleo) está entre 4,0 e 8,2 ou 4,8 e 8,2 ou 4,8 e 7,9 ou 4,8 e 7,1ou 4,8 e 6,8 ou 4,8 e 5,7. Preferivelmente a dita razão está entre 5,7 e 8,2 emais preferivelmente 5,7 e 6,8 e mais preferivelmente ainda entre 5,7 e 7,1.

De acordo com estes valores mencionados acima que podemser aplicados a um número de cópia de gene EGFR "aumentado ou amplifi-cado", os valores de razão para um número de cópia relativamente menorou mais baixo ou não amplificado apresentado por células de tumor de paci-entes, que não respondam ou não respondam eficazmente ou positivamenteao tratamento com anticorpos anti-EGFR estão na faixa entre 1,65 e 2,0 ou-1,7 e 1,9.

O número de cópia de gene EGFR ou a razão: cópias de geneEGFR / núcleo está associado com a razão de cópias de gene EGFR / son-da de centrômero de cromossomo 7 (CEP7). De acordo com a invenção estarazão de gene EGFR/CEP7 encontra-se em pacientes que respondem cla-ramente ao tratamento com anticorpo anti-EGFR > 2, ao passo que a razãoem pacientes que não respondem é habitualmente de aproximadamente 1.

Mutação heterozigótica com sentido errado" significa de acordocom a invenção uma mutação que muda um códon por um aminoácido emum códon que especifica um outro aminoácido que ocorre em um dos doisalelos de um gene.

O termo "Eliminação no quadro" significa de acordo com a in-venção uma mutação que muda o quadro de leitura de um mRNA por elimi-nação de nucleotídeos.

"FISH (hibridização fluorescente in situ)" significa de acordo coma invenção uma hibridização de DNA clonado a cromossomos intactos, emque o DNA clonado foi marcado com um corante fluorescente. Este é ummétodo geral para atribuir a locação cromossomal, o número de cópia degene (tanto aumentado como diminuído) ou rearranjos cromossomais

Os tumores de pacientes (31) com mCRC que conseguiram res-posta objetiva, doença estável ou doença progressiva depois do tratamentocom cetuximab ou panitumumab são selecionados para alterações genéticasno Gene EGFR ou seus efetores intracelulares imediatos. Especificamente,o número de cópia de gene EGFR e o perfil de mutação do domínio catalíti-co de EGFR podem ser determinados assim como os éxons nos genesKRAS, BRAF e PI3KCA onde as mutações ocorrem mais freqüentementeem mCRC.

Análise de mutações do domínio da EGFR tirosina quinase.

Para identificar a base molecular subjacente à resposta do ma-tuzumab, panitumumab ou cetuximab em mCRC, o status da mutação daregião é avaliado correspondente ao domínio cataiítico do gene EGFR emamostras de tumor de pacientes com vários resultados clínicos depois dotratamento com estes mAbs. O seqüenciamento de éxons de EGFR 18, 19 e21 não revela mutações somáticas com exceção de um paciente com doen-ça estável durante 24 semanas (Tabelas 1 e 2). Este paciente apresentauma mutação heterozigótica de falso sentido no éxon 21 (G857R) afetandoum resíduo localizado no circuito de ativação, uma região que é crítica paracatalise (Figura 1). A mutação de G857R é um aminoácido ao lado da re-cém-descrita mutação de ativação de L858R encontrada em indivíduos querespondem a gefitinib e erlotinib em câncer de pulmão (Lynch e outros,2004; N Engl J Med 350: 2129-2139;

Paez e outros, 2004 ,Science 304: 1497-1500; Pao e outros,2004, Proc Natl Acad Sei USA 101: 13306-13311)

Curiosamente, a mutação que afeta o resíduo análogo no genede BRAF (G595R) foi eliminada anteriormente em cânceres colorretais (Fi-gura 1) (Rajagopalan e outros, 2002, Nature 418: 934).

Baseado nas presentes descobertas, parece evidente que o me-canismo molecular principal básico da resposta à terapia com mAb não écausado por mutações no domínio catalítico de EGFR. Portanto, é conside-rado que as alterações no número de cópia de gene EGFR podiam ser res-ponsáveis pela resposta observada ao anticorpo.Análise das Mutações de efetores intracelulares de EGFR

Pelo menos três moléculas intracelulares (KRAS, BRAF e PI3KCA)envolvidas na sinalização de EGFR podem ser ativadas em mutações pon-tuais em cânceres colorretais. De acordo com esta invenção foi avaliado seo status da mutação dos genes correspondentes está correlacionado com aresposta clínica para os anticorpos anti-EGFR, tais como cetuximab, matu-zumab ou panitumumab. Para cada um dos três genes, são analisados oséxons em que ocorrem as mutações com as mais altas freqüências em cân-ceres colorretais (éxon KRAS 2, éxon BRAF 15, éxons PI3KCA 9 e 20). Aseqüência de nucleotídeo correspondente a cada éxon pode ser amplificadapartindo de DNA genômico extraído de tumor e diretamente seqüenciado.Embora possam ser identificadas mutações de ativação no gene de KRAS(G12V, G12D, G12S, e G13D), o gene PI3KCA (E545K, -H1047R) e BRAF(E599V), elas não se correlaciona com a resposta clínica para os mAbs antiEGFR (éxon RAS-2: p = 0,675; éxon PI3K-9: p = 0,3; éxon PI3K-20: p = 1;éxon BRAF-15: p = 1; todas estas mutações: p = 0,44) (Tabelas 1 e 2).Análise do número de cópias do Gene EGFR por análise de FISH

Pode ser demonstrado que em mCRC não há correlação entreos níveis de expressão de proteína de EGFR medidos por imunohistoquími-ca (IHC) e resposta clínica para mAbs anti-EGFR. Estes resultados, junta-mente com a falta de correlação com o status de mutação ao do EGFR eseus efetores a jusante, podem levar à hipótese que responda a panitumu-mab, cetuximab ou matuzumab pode estar associado com a amplificação doGene EGFR.

Como detalhado na Tabela 2 e na Figura 2, entre os 10 pacien-tes com respostas objetivas 9 podem ser avaliados por FISH e 8/9 (88,8 %)apresentam maior número de cópia de gene EGFR (Gene mediano de EG-FR/núcleo razão 6,80, faixa 1,65 - 35); entre os 21 pacientes que não res-pondem, 20 puderam ser avaliados por FISH e 1/20 (5,0 %) tinha aumentadoo número de cópia de gene EGFR (Gene mediano de EGFR/núcleo razão1,925) e pode ser descoberta que esta diferença é estatisticamente significa-tiva.

Entre os que responderam, o maior número de cópia de geneEGFR pode estar associado com uma razão de Gene EGFR/CEP7 > 2 emsete dos nove pacientes que podem ser avaliados por FISH, indicando assimuma amplificação do Gene EGFR empregando os critérios utilizados paraavaliação com HER2 (Wiley, Diaz, 2004, Jama 291: 2019-2020). Nos pacien-tes 3 e 9, uma razão de Gene EGFR/núcleo de 7,10 e 3,38 pode estar asso-ciada com uma razão de Gene EGFR/CEP7 de 1,46 e 1,19, respectivamen-te, indicando assim a presença de cópias extras do cromossomo 7 inteiro(polissomia 7) (Figura 2 C).

O tumor do paciente 10 exibe uma notável amplificação do GeneEGFR que pode estar localizado em focos isolados enquanto que outras á-reas de malignidade são francamente dissômicas. Notavelmente, as áreasque apresentam amplificaçao do Gene EGFR também apresenta expressãointensa da proteína de EGFR avaliada por IHC; em contraste, as áreas queexibem Gene EGFR dissômico não expressam a proteína correspondente(Figura 3).

Análise do número de cópias do Gene EGFR por PCR quantitativa (qPCR)

Um maior número de cópia de gene EGFR pode ser observadoem pacientes com resposta a cetuximab, matuzumab ou panitumumab porFISH. Para obter uma medida independente do status do local do Gene EG-FR em amostras de tumor, pode ser usada análise qPCR. Um aumento nonúmero de cópia de gene EGFR pode ser observado no paciente 1 com do-ença capaz de ter resposta (Figura 4). A detecção de maior número de cópiade gene EGFR por qPCR em amostras provenientes de pacientes com umarazão de gene / cromossomo abaixo de 3 não é conclusiva. Isto é prováveldevido aos números limitados de Gene EGFR que não podem ser coeren-temente detectados com este método como relatado anteriormente (Layfielde outros, 2003, J Surg Oncol 83: 227-231; Yang e outros, 2004, Gut 53(1):123-129). Adicionalmente, a detecção por qPCR pode ser afetada negativa-mente pela extração concomitante de DNA contaminante estromal normalque pode ser parcialmente evitada durante a dissecção de amostras incrus-tadas em parafina. Por outro lado, a análise in situ do número de cópia degene tal como aquela obtida por análise FISH não é afetada por estas limita-ções técnicas. Esta medida do número de cópia de gene por qPCR confirmaa amplificaçao

Efeitos de cetuximab sobre linhagens de célula com cópias do Gene EGFRnormais ou aumentadas

Estudos anteriores que usam modelos de câncer celular sugeri-ram que a resposta a cetuximab pode estar associada com (i) a superex-pressão do receptor de EGFR, (ii) fosforilação constitutiva do receptor, (iii)amplificaçao do gene correspondente e (iv) alteração de outros membros dafamília de genes.

Os presentes dados demonstram que a capacidade de respostaà sensibilidade a panitumumab, matuzumab ou cetuximab em mCRC se cor-relaciona com o maior número de cópias do local de EGFR. Isto incitou osinventores a avaliar o efeito de cetuximab sobre um conjunto de linhagensde célula de câncer colorretal que apresentam número de cópia de geneEGFR normal ou aumentado como medido por FISH (Figura 5).

A proliferação de células medida pelo ensaio de incorporação deBrdU é avaliada na presença de maiores concentrações de cetuximab. Aproliferação da linhagem de célula DiFi que contém o número mais alto decópias do Gene EGFR é inibida drasticamente por cetuximab e a concentra-ção de cetuximab que impede completamente a proliferação de células deDiFi não afeta as células que não possuem um número de cópia de geneEGFR amplificado. Curiosamente, a linhagem de célula SW620 tem 3 cópiasdo Gene EGFR e não expressa a proteína de EGFR como apresentado porWestern blot (Figura 5). As células SW620, portanto, representam um no-caute funcional do Gene EGFR e conseqüentemente a sua proliferação nãoé virtualmente afetada por cetuximab.

O termo "receptor antagonista / inibidor de ErbB' refere-se auma molécula biologicamente eficaz, que se liga e bloqueia ou inibe o recep-tor de ErbB. Desse modo, pelo bloqueio do receptor o antagonista evita aligação do ligando (agonista) de ErbB e ativação do complexo de agonista /ligando receptor. Os antagonistas a ErbB podem ser dirigidos a HER1(ErbB1, EGFR), HER2 (ErbB2) e ErbB3 e ErbB4. Os antagonistas preferidosda invenção são dirigidos para o receptor EGF (EGFR, HER1). O receptorantagonista de ErbB pode ser um anticorpo ou uma proteína de fusão deanticorpo (imunoconjugado) ou um fragmento imunoterapeuticamente eficazde um anticorpo ou de uma proteína de fusão de anticorpo. Os antagonistasreceptores de ErbB receptor, que são preferidos de acordo com a presenteinvenção, são anticorpos anti-EGFR, especialmente e de preferência os an-ticorpos anti-EGFR mencionados acima e a seguir: cetuximab, panitumumabe matuzumab em suas versões murina, quimérica e humanizada inclusive osseus fragmentos imunologicamente eficazes (Fab, Fv) e imunoconjugados,especialmente imunocitoquinas.O termo "anticorpo monoclonaf como usado neste caso, refere-se a um anticorpo obtido partindo de uma população de anticorpos substan-cialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendidos napopulação são idênticos exceto para possíveis mutações que ocorrem natu-ralmente que possam estar presentes em quantidades mínimas. Os anticor-pos monoclonais são altamente específicas, estando dirigidos contra um ú-nico sítio antigênico. Além disso, em contrastes com as preparações de anti-corpo policlonal que incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentesdeterminantes (epitppos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra umúnico determinante sobre o antígeno. Além de sua especificidade, os anti-corpos monoclonais são vantajosos pelo fato de que eles podem ser sinteti-zados não contaminados por outros anticorpos. Os processos para a obten-ção de anticorpos monoclonais incluem o processo do hibridoma descrito porKohler e Milstein (1975, Nature 256, 495) e em "Anticorpo monoclonal Tech-nology, The Production e Characterization of Rodent e Human Hybridomas"(1985, Burdon e outros, Eds, Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam) oupodem ser obtidos por métodos bem conhecidos de DNA recombinante (ver,por exemplo, a US 4.816.567). Os anticorpos monoclonais também podemser isolados de coleções de anticorpo de fago usando-se as técnicas descri-tas em Clackson e outros, Nature, 352:624-628 (1991) e Marks e outros, J.Mol. BioL, 222:58, 1-597(1991), por exemplo.

O termo "anticorpo quimérico" significa anticorpos em que umaparte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a ou homóloga a seqüênciascorrespondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular oupertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, enquan-to que o restante da (s) cadeia (s) é idêntico a ou homólogos a seqüênciascorrespondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie em particu-lar ou pertencentes a uma outra classe ou subclasse, assim como fragmen-tos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada(por exemplo: US 4.816.567; Morrison e outros, Proc. Nat. Acad. Sei. USA,81: 6851-6855 (1984)). Os métodos para obtenção de anticorpos quiméricose humanizados também são conhecidos na técnica. Por exemplo, os méto-dos para obtenção de anticorpos quiméricos incluem aqueles descritos naspatentes de Boss (Celltech) e de Cabilly (Genentech) (US 4.816.397; US4.816.567).

"Anticorpos humanizados" são formas de anticorpos quiméricosnão humanos (por exemplo, roedores) que contêm seqüência mínima deri-vada de imunoglobulina não humana. Em sua maioria, os anticorpos huma-nizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resí-duos provenientes de uma região hipervariável (CDRs) do receptor sãosubstituídos por resíduos provenientes de uma região hipervariável de umaespécie não humana (anticorpo doador) tais como camundongo, rato, coelhoou primata sem ser humano que tem a especificidade, a afinidade e a capa-cidade desejada. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) daimunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos corres-pondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreenderresíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpodoador. Estas modificações são feitas para aperfeiçoar ainda mais o desem-penho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreendersubstancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domíniosvariáveis, em que todos ou substancialmente todos dos circuitos hipervariá-veis correspondam àqueles de uma imunoglobulina não humana e todos ousubstancialmente todos dos FRs são aqueles de uma seqüência de umaimunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também irácompreender pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglo-bulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Os métodospara a obtenção de anticorpos humanizados estão descritos, por exemplo,por Winter (US 5.225.539) e Boss (Celltech, US 4.816.397).

"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma parte de um anti-corpo intacto, de preferência compreendendo a ligação com antígeno ou re-gião variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluemfragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv e Fc, dianticorpos, anticorpos lineares,moléculas de anticorpo de cadeia simples e anticorpos multiespecíficos for-macios partindo de fragmento (s) de anticorpo. Um anticorpo "intacto" é umque compreende uma região variável de ligação com antígeno assim comodomínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pe-sada, CH1, CH2 e CH3. Preferivelmente, o anticorpo intacto tem uma oumais funções efetoras. A digestão com papaína dos anticorpos produz doisfragmentos idênticos de ligação com antígeno, chamados fragmentos "Fab",cada um compreendendo um sítio único de ligação com antígeno e uma re-gião CL e a CH1 e um fragmento residual11 Fc", cujo nome reflete a sua ca-pacidade de cristalizar facilmente.

A região "Fc" dos anticorpos compreende, como regra, um CH2,CH3 e a região de junta de uma classe principal de anticorpo lgG1 ou lgG2.

A região de dobra é um grupo de aproximadamente 15 resíduos de aminoá-cido que combinam a região CH1 com a região CH2-CH3. O fragmento "Fab"também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínioconstante (CH1) da cadeia pesada e tem apenas um sítio de ligação comantígeno.

Os fragmentos "Fab" diferem dos fragmentos Fab pela adição dealguns resíduos no terminal carbóxi do domínio CH1 da cadeia pesada queinclui uma ou mais cisteínas provenientes da região de dobra do anticorpo.

Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 produzidos originalmente foram produzi-dos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas da dobra entre eles.

Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo também são co-nhecidos (ver, por exemplo, Hermanson, Bioconjugate Techniques, Acade-mic Press, 1996; . US 4.342.566). Os fragmentos "Fv de cadeia simples" oufragmentos de anticorpo "scFv" compreendem os domínios de anticorpo V eV, em que estes domínios estão presentes em uma cadeia simples de poli-peptídeo. Preferencialmente, o polipeptídeo Fv compreende também um li-gante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite que o scFvforme a estrutura desejada para ligação de antígeno. Os anticorpos FV decadeia simples são conhecidos, por exemplo, por Plückthun (The Pharmaco-logy of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova York, pp. 269-315 (1994)), WO 93/16185; US 5.571.894; US5.587.458; Huston e outros (1988, Proc.Natl. Acad. Sei. 85, 5879) ou Skerrae Plueckthun (1988, Science 240, 1038).

Embora a invenção se refira de preferência o câncer de cólon oua câncer colorretal (CRC) ela pode ser principalmente aplicada a outros cân-ceres e tumores, que expressam ou superexpressam EGFR e ocorrem empacientes com diferente número de cópia de gene EGFRs e tratados comoutros antagonistas a ErbB (por exemplo, câncer do pulmão tratado comIRESSA®: por exemplo, Câncer Biology 2005, 4).

Desse modo, os termos "câncer" e "tumor" referem-se a ou des-crevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizadapor crescimento desregulado da célula. Por meio de composições farmacêu-ticas de acordo com a presente invenção podem ser tratados tumores taiscomo tumores de mama, do coração, do pulmão, do intestino delgado, docólon, do baço, dos rins, da bexiga, da cabeça e pescoço, do ovário, dapróstata, do cérebro, do pâncreas, da pele, dos osso, da medula óssea, dosangue, do timo, do útero, dos testículos, do colo do útero e do fígado. Ostumores que podem de preferência ser tratados com as moléculas de anti-corpo de acordo com a invenção são tumores sólidos ou metástases de tu-mor que expressam receptores de ErbB, especialmente receptores de ErbB1(EGFR), em grandes quantidades, tais como câncer de mama, câncer dapróstata, câncer da cabeça e pescoço, SCLC, câncer do pâncreas.

O termo "biologicamente / funcionalmente eficaz" ou "terapeuti-camente eficaz (quantidade)" refere-se a um fármaco / uma molécula quecause uma função biológica ou uma variação de uma função biológica invivo ou in vitro e que seja eficaz em uma quantidade específica para trataruma doença ou um distúrbio em um mamífero, de preferência em um serhumano. No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz do fár-maco pode reduzir o número de células cancerosas; reduzir o tamanho dotumor; inibir (isto é, retardar até certa extensão e de preferência interromper)a infiltração da célula cancerosa em órgãos periféricos; inibir (isto é, retardaraté certa extensão e de preferência interromper) o crescimento do tumore/ou aliviar até certo ponto um ou mais sintomas associados ao câncer.O termo "imunoterapeuticamente eficaz!' refere-se a moléculasbiológicas que provocam uma resposta imunológica em um mamífero. Maisespecificamente, o termo refere-se a moléculas que possam reconhecer e seligar a um antígeno. Tipicamente, os anticorpos, os fragmentos de anticorpoe as proteínas de fusão que compreendem seus sítios de ligação de antíge-no (regiões determinantes complementares, CDRs) são imunoterapeutica-mente eficazes.

Tipicamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz da quan-tidade de um anticorpo anti-EGFR ou um fragmento do mesmo é uma quan-tidade tal que, quando administrada em composição fisiologicamente tolerá-vel, seja suficiente para conseguir uma concentração de plasma de desdeaproximadamente 0,01 micrograma (u,g) por mililitro (ml) até aproximada-mente 100 |ig/ml, de preferência desde aproximadamente 1 |ig/ml até apro-ximadamente 5 |ig/ml e habitualmente aproximadamente 5 |ig/ml. Afirmadodiferentemente, a dosagem pode variar de desde aproximadamente 0,1mg/kg até aproximadamente 300 mg/kg, de preferência de desde aproxima-damente 0,2 mg/kg até aproximadamente 200 mg/kg, mais preferivelmenteainda de desde aproximadamente 0,5 mg/kg até aproximadamente 20mg/kg, em uma ou mais administrações de dose diária durante um ou váriosdias. Uma concentração preferida no plasma em molaridade é de desde a-proximadamente 2 micromolar (uJvl) até aproximadamente 5 milimolar (mM)e preferivelmente, aproximadamente 100 |iM até 1 mM de antagonista a an-ticorpo.

As composições farmacêuticas da invenção podem compreen-der o tratamento que abrange expressão de um sujeito com agentes quereduzam ou evitam efeitos colaterais associados com a terapia de combina-ção da presente invenção ("terapia adjunta"), inclusive, porém não limitadoàqueles agentes, por exemplo, que reduzem o efeito tóxico de fármacos an-ticâncer, por exemplo, inibidores de reabsorção de osso, agentes cardiopro-tetores. Os ditos agentes adjuntos evitam ou reduzem a incidência de náu-sea e de vômitos associados à quimioterapia, à radioterapia ou à operaçãoou reduzem a incidência de infecção associada com a administração de fár-maços anticâncer mielossupressores. Os agentes adjuntos são bem conhe-cidos na técnica. Os agentes imunoterápicos de acordo com a invenção po-dem adicionalmente ser administrados com adjuvantes como BCG e estimu-lantes do sistema imunológico. Além disso, as composições podem incluiragentes imunoterápicos ou agentes quimioterápicos inclusive tais que con-têm isotopos radiomarcados citotóxicos eficazes ou outros agentes citotóxi-cos, tais como peptídeos citotóxicos (por exemplo, citocinas) ou fármacoscitotóxicos e similares.

Outras características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes pelos Exemplos mais detalhados a seguir, que ilustram, pormeio de exemplo, os princípios da invenção. Especialmente, os valores es-pecíficos ou os termos indicados acima e a seguir, não são limitativos dainvenção e podem ser extrapolados se um versados na técnica observar ra-zão para isso.

Exemplos

Exemplo 1: Pacientes e tratamento com anticorpos monoclonais anti-EGFR

Entre os pacientes inscritos no Ospedale Niguarda Ca' Grandaem experimentos clínicos de moAbs anti-EGFR panitumumab ou cetuximabpara tratamento de mCRC que expressa EGFR, foram avaliados 31 pacien-tes com sensibilidade ao tumor radiologicamente demonstrada ou resistênciaa esta terapia (Tabela 1). Os pacientes foram selecionados à base da dispo-nibilidade de suficiente tecido de tumor para os presentes estudos. Todos ospacientes tinham mCRC que expressa EGFR, apresentando £ 1 % de célu-las malignas coradas para EGFR avaliadas por IHC usando-se o kit DAKOEGFRPharmDX em laboratórios centrais de cada protocolo clínico (Cunnin-gham e outros, 2004, N EnglJ Med 351: 337-345). Cetuximab (lgG1 moAbquimérico; Erbitux®, Merck, Milão, Itália) e panitumumab (lgG2 moAb total-mente humano; Amgen, Thousand Oaks, CA, USA) ambos visam o domíniode ligação de ligando do EGFR. Espera-se que as suas atividades clínicaspossam ser comparadas exceto para a reduzida incidência de reações deinfusão observadas com o panitumumab totalmente humano, e assim os pa-cientes tratados com moAb são analisados juntos neste estudo. O tratamen-to com moAbs anti-EGFR consistiu em monoterapia com cetuximab (n = 12),de quimioterapia à base de cetuximab mais irinotecan (Camptò®; Aventis,Milão, Itália) (n = 9) ou de monoterapia com panitumumab (n = 10). Em parti-cular, o agente cetuximab simples (dose de carga iv de 400 mg/m2 e então250 mg/m2 semanalmente até progressão) foi administrado seja como tera-pia de primeira linhagem em experimento EMR 202-600 fase-ll ou como ter-ceira linhagem na ramificação da monoterapia de experimento BOND fase IIpara pacientes refratários a irinotecan. Cetuximab (a mesmas doses e mes-ma programação como na monoterapia) mais irinotecan (e mesma progra-mação aos quais foi individualmente demonstrado que mCRC é resistente)foram administrados até progressão como terapia de terceira linhagem naramificação de combinação do teste BOND de combinação em experimentoMABEL fase-ll para pacientes refratários a irinotecan. Nestes últimos proto-colos, a refratoriedade a irinotecan foi definida como progressão documen-tada da doença durante ou dentro de 3 meses depois do regime como irino-tecan. O agente simples panitumumab (6 mg/kg iv de 2 em 2 semanas atéprogressão) foi administrado como terapia de terceira linhagem ou de quartalinhagem para pacientes resistentes a regimes tanto contendo oxaliplatin-como e irinotecan nos teste de ABX-EGF 20020408 de fase III e teste ABX-EGF 20020194 recombinante. O Institutional Ethics Committee aprovou oprotocolo de tratamento e os pacientes forneceram consentimento por escri-to informado para análise de EGFR assim como para receber terapia emestudo. A resposta ao tumor foi avaliada com técnicas coerentes de forma-ção de imagem (CT ou MRI) que empregam critérios RECIST ("ResponseEvaluation Criteria in Solid Tumors" - Critérios de Avaliação de Resposta emTumores Sólidos") por radiologistas institucionais assim como independen-tes de acordo com protocolos clínicos.

Exemplo 2: Análise de mutação

O DNA foi extraído de amostras incrustadas em parafina. Paracada paciente, foram preparadas 10 seções. Uma seção representativa adicio-nal foi desparafinizada, corada com hematoxilina-eosina e analisada para mor-fologia detalhada. As regiões que apresentam tecidos de tumor foram marcadase o tecido foi extraído com NaOH 0,2 M / EDTA 1 mM e então neutralizadocom Tris-TE 100 mM. Depois da extração o DNA foi purificado usando-se oKit de Purificação Qiagen PCR (N° do Cat. 28104) seguindo-se as instru-ções do fabricante. Foram designados iniciadores Exon específicos e de se-qüenciamento usando-se software Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/ primer3_www.cgi) e sintetizados por Invitrogen™. As seqüências deiniciadores eram: iniciadores para adiante, reversos e de seqüenciamentopara cada éxon foram como a seguir:

EGFR-EX18

GCTGAGGTGACCCTTGTCTC;ACAGCTTGCAAGGACTCTGG; TGGAGCCTCTTACACCCAGT;

EGFR-EX19

CCCAGTGTCCCTCACCTTC; CCACACAGCAAAGCAGAAAC; GCTGGTAACATCCACCCAGA;

EGFR-EX21

TGATCTGTCCCTCACAGCAG;TCAGGAAAATGCTGGCTGAC;TTCAGGGCATGAACTACTTGG;

PI3K CA-Ex9

GGGAAAAATATGACAAAGAAAGC; CTGAGATCAGCCAAATTCAGTT ;TAGCTAGAGACAATGAATTAAGGGAAA;

PI3K CA -Ex20

CTCAATGATGCTTGGCTCTG;TGGAATCCAGAGTGAGCTTTC;TTGATGACATTGCATACATTCG

Ras ex2

GGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACC;AGAATGGTCCTGCACCAGTAA;TCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTG.

As condições para amplificar as regiões éxon-específicas porPCR de DNA genômico de tumor e para identificar mutações foram descritasanteriormente {Bardelli e outros, 2003, Science 300: 949). Foi realizada umaPCR em um volume de 20 uL usando-se um programa "touchdown PCR"como descrito anteriormente (Pao e outros, 2004, Proc Natl Acad Sei USA101: 13306-13311). Os produtos de PCR purificados foram seqüenciadosusando-se o Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosys-tems) e analisados com um sistema de eletroforese capilar 3730 ABI. A aná-lise da mutação foi realizada como descrito anteriormente. O tecido de tumordo paciente 13 foi limitado em quantidade e a análise da mutação não foitecnicamente possível para todos os éxons.Exemplo 3: Análise de Gene EGFR por hibridização fluorescente in situ(FISH)Seções de tecido foram tratadas seguindo-se o procedimentousado para o Kit de detecção Her2 FISH (Dakocytomation , Glostrup, DK).

As amostras foram colocadas em uma solução de pré-tratamento durante 30minutos a 96°C e então digeridas com solução de pepsina durante 30 minu-tos à temperatura ambiente. Foram realizados ensaios FISH de dupla cor, dealvo duplo usando-se LSI EGFR Spectrum Orange/CEP7 Spectrum GreenProbe (Vysis, Downers Grove, IL). Em resumo, seções de tecido, recobertascom 10 U.L de solução de sonda, foram incubadas a 75°C durante 5 minutospara co-desnaturar as sondas de EGFR e CEP 7 e deixadas hibridizar du-rante toda à noite a 37°C. Tanto a co-desnaturação como a hibridização fo-ram realizadas seqüencialmente em um sistema controlado por um micro-processador (Hybridizer, Dakocytomation, Glostrup, DK). Foi realizada lava-gem rigorosa pós-hibridização em banho-maria a 65°C durante 10 minutos.

Depois de lavar duas vezes e secar à temperatura ambiente durante 15 mi-nutos, as seções de tecido foram recobertas com 4'6-diamidino-2-iofenilindol(DAPI II, Vysis) para a contra coloração da cromatina e examinada por mi-croscopia. A análise foi realizada com um microscópio com fluorescência(Zeiss Axioskop, Gottingen, Alemanha) equipado com Chromowin workstati-on (Amplimedical, Milão, Itália.) O gene EGFR foi visualizado como um sinalvermelho com um filtro de isotiocianato de tetrametil-rodamina (TRITC), aseqüência 7 a-centromérica do cromossomo (CEP7) como sinal verde comum filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) e os núcleos como um sinalazul com um filtro DAPI. Imagens representativas de cada amostra foramcaptadas com uma câmera Hamamatsu C5895 resfriada CCD (Upstate Te-chnical Equipment Co., Nova York, USA) em camadas monocromáticas queforam subseqüentemente recuperadas pelo software Casti Imaging FISHMulticolor (Amplimedical). Dois observadores independentes (SMV e RB)avaliaram pelo menos 200 núcleos de interfase não em sobreposição usan-do linhas guia de avaliação predefinidas. Foram escondidas dos observado-res as características clínicas dos pacientes e a avaliação e a classificaçãodos espécimes um do outro. Em cada núcleo, o número de cópias de EGFRe das sondas de cromossomo 7 foram avaliados independentemente. O sta-tus do Gene EGFR foi avaliado como razões de EGFR/núcleo e de EG-FR/CEP7. Os Controles normais consistiram de linhagem de célula de pig-mento epitelial da retina cultivada (RPE) e de mucosa colorretal normal con-tígua às malignidades individuais. O controle de Gene EGFR amplificadoconsistiu em linhagem de célula de carcinoma A431 epidermóide humano. Omaior número de cópia de gene EGFR foi definido arbitrariamente como onúmero de cópia de gene EGFR/núcleo > 3. As amostras dos pacientes 4 e15 foram disponíveis apenas como seções de 10fx e apesar de múltiplas ten-tativas, a análise FISH não foi conclusiva em virtude de excessiva espessurado tecido.

Exemplo 4: Análise de Gene EGFR por reação em cadeia da polimerasequantitativa (qPCR)

O número de cópias correspondente ao local de EGFR foi de-terminado por PCR em tempo real usando-se uma aparelho ABI PRISM®7900HT (Applied Biosystems). O teor de DNA foi normalizado com aquele daLinha-1, um elemento repetitivo para o qual os números de cópia por geno-ma diplóide são similares entre todas as células humanas (normais ou ma-lignas) como descrito anteriormente (Wang e outros, 2002, Proc Natl AcadSei USA 99: 16156-16161). As variações do número de cópia foram calcula-das utilizando-se a fórmula 2<Dt-Dlinha>-<Nt-N,inha> em que Dt é o número médio dociclo limite observado para o iniciador experimental em DNA extraído de cé-lulas de tumor e um iniciador experimental Dlinha é o número médio do ciclolimite observado para o iniciador da Linha-1 em DNA extraído de célula detumor e Nt é o número médio do ciclo limite observado para o DNA de refe-rência normal extraído de células RPE, Nlinha é o número do ciclo limite ob-servado para um iniciador de Linha-1 no DNA de referência normal extraídode células RPE. As condições para amplificação foram as seguintes: um ci-clo de 95°C durante 10 minutos, seguido por 45 ciclos de 95°C durante 15segundos, 60°C durante 1 minuto. Os números do ciclo limite foram obtidospor utilização do software ABI PRISM® 7900HT Sequence Detection System.PCRs para cada conjunto de iniciador foram realizados em triplicata e foicalculada a média dos números do ciclo limite. Os iniciadores (projetadospara abranger uma região não repetitiva de 100 to 200-bp) para o GeneEGFR foram: Para frente GAATTCGGATGCAGAGCTTC e ReversoGACATGCTGCGGTGi i i.iC. Os iniciadores para o elemento repetitivo daLinha-1 foram: para frente AAAGCCGCTCAACTACATGG e ReversoTGCTTTGAATGCGTCCCAGAG.

Exemplo 5: Ensaio de inibição de proliferação da célula e Western blottingLinhagens de célula de câncer colorretal (HT-29, HCT-116, DLD-1, SW48, SW480 e células LoVo) foram provenientes de repositório ATCC;as células DiFi foram uma doação de Jose Baselga, Vali d'Hebron Univer-sity, Barcelona, E). As células foram cultivadas em DMEM suplementadocom soro fetal de bezerro (FCS) a 10 % e anticorpos, exceto para célulasDiFi que foram cultivadas em Meio F-12 suplementado com FCS a 10 % eantibióticos. Para ensaio de inibição de proliferação da célula, as células fo-ram cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 2 % em placas pretascom 96 cavidades (Culture Plate™ 96F Packard Bioscience) e incubadasdurante 5 dias com cetuximab 0,01 - 100 nM (adquirido da Komtur Pharma-ceuticals, Freiburg, D). A proliferação da célula foi medida por incorporaçãode BrdU que usa um método ELISA quimiluminescente (Roche Cat. No. 1669 915). A densidade de semeadura da célula foi como a seguir: DiFi,4000; LoVo, 4000; DLD, 500; HCT116, 1000; HT29, 1000; SW480, 1000;SW387, 4000; SW48, 500; SW620, 500. O ensaio BrdU foi realizado de a-cordo com as instruções do fabricante e terminado 20 horas depois da adi-ção da solução de marcação. Foram montados três experimentos separadosem triplicata para cada linhagem de célula. A percentagem de proliferaçãoda célula em cada concentração de cetuximab (Teste) foi calculada usando-se a fórmula a seguir: (Teste - ensaio em branco) / (Controle - ensaio embranco) x 100, em que o controle indica células cultivadas em meio apenas(sem fármaco) e ensaio em branco indica células cultivadas em Triton X a0,02 % em DMEM. Western blotting foi realizado como descrito anteriormen-te (Lynch e Yang, 2002, Semin Oncol 29: 47-50).Tabela 1 - Características clínicas relevantes e alterações moleculares de Gene EGFR em tumores de pacientes com mCRC

<table>table see original document page 32</column></row><table>Tabela 1 - continuação-

<table>table see original document page 33</column></row><table>Tabela 1 - continuação-

<table>table see original document page 34</column></row><table>

a A quimioterapia (CT) consistiu em tratamento à base de irinotecan (ver o texto para detalhes);b Número de cópia de gene EG-FR aumentado consistiu em polissomia equilibrada no caso 3 e 9 e amplificação do gene nos outros (ver resultados);c múltiplastentativas de FISH foram inconclusivas por razões técnicas (ver Métodos). FISH hibridização fluorescente in situ; PR, respostaparcial; SD, doença estável; PD, doença progressiva; UPN, único número do paciente; WT, do tipo selvagem; + representa res-posta mantida por ocasião da apresentação deste artigo (Fevereiro de 2005). * Status de mutação do Gene EGFR, éxons 18,19e21.Tabela 1 b - Características clínicas adicionais de pacientes com mCRC avaliado neste estudo

<table>table see original document page 35</column></row><table>Tabela 1 b -continuação-

<table>table see original document page 36</column></row><table>Tabela 1b -continuação-

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N2: Número de regimes de quimioterapia anteriores para doença metastática

- Status de Desempenho (ECOG) por ocasião da terapia com anticorpo monoclonal anti-EGFR.

- Os regimes de quimioterapia consistiram em: 5-FU/FA: 5-fluorouracila + ácido folínico (vários protocolos); FOLFOX: Oxaliplatina + 5-fluorouracila + ácido folínico; FOLFIRI: Irinotecan + 5-fluorouracila + ácido folínico.Tabela 2 - Alterações moleculares encontradas em tumores de pacientes com mCRC

<table>table see original document page 38</column></row><table>Tabela 2 - continuação-

<table>table see original document page 39</column></row><table>Tabela 2 - continuação-

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a FISH e as medidas da análise de mutação foram inconclusivos por razões técnicas (ver Métodos); WT, do Tipo Selvagem; PR,resposta parcial; SD, doença estável; PD, doença progressiva; UPN, único número do paciente; n.e., não avaliável. 00 Foi demonstrado Número de cópia de gene EGFR aumentado tanto no tumor colorretal primário antes do tratamento com moAb comona metástase no fígado obtida na ocasião da doença progressiva depois do tratamento com moAb.

Claims (23)

1. Método in vitro para detectar e analisar se um paciente quesofre de um câncer, que superexpressa receptor de EGF (EGFR), respondepositivamente à administração de um anticorpo anti-EGFR ou de um frag-mento imunologicamente eficaz do mesmo, o processo compreendendo de-terminar in vitro o número de cópia de gene EGFR em uma sonda de célulasde tumor obtida do dito paciente e selecionando o dito paciente para admi-nistração com o dito anticorpo anti-EFFR se as células de tumor do dito pa-ciente apresentarem um número de cópia amplificado do Gene EGFR.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o número decópia de gene EGFR é medido como razão do número de Gene EGFRs pornúcleo.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a dita razãoestá na faixa de entre 4,0 e 8,2.

4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, em que a ditarazão está na faixa de entre 5,7 e 7,1.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o número decópia de gene EGFR é medido como razão do número de Gene EGFRs porCEP7.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a dita razãoé>2.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 6,em que o número de cópia de gene EGFR é medido por análise FISH (hibri-dização fluorescente in situ).

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 7em que o número de cópia de gene EGFR amplificado é específico para odito tumor.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 7em que o número de cópia de gene EGFR amplificado é específico para operfil individual do tecido de câncer do paciente.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o dito perfilindividual do tecido de câncer subentende também alteração molecular.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a dita al-teração molecular é uma mutação no ponto dentro do Gene EGFR.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11,em que o dito anticorpo anti-EGFR é selecionado do grupo que consiste emcetuximab (mAb c225), matuzumab (mAb h425) e panitumumab (mAb ABX)ou de suas versões murina, quimérica e humanizada.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12,em que o câncer é câncer colorretal (CRC), câncer do pulmão, câncer da ca-beça e do pescoço e câncer de mama.

14. Uso de um anticorpo anti-EGFR ou de um fragmento imuno-logicamente eficaz do mesmo, para a fabricação de um medicamento para otratamento de câncer em um paciente, em que o dito câncer superexpressaEGFR e apresenta um número de cópia de gene EGFR amplificado.

15. Uso de acordo com a reivindicação 14, em que o dito númerode cópia de gene EGFR é medido como a razão do número de Gene EGFRspor núcleo e o valor desta razão está na faixa de entre 4,0 e 8,2.

16. Uso de acordo com a reivindicação 15, em que o valor dadita razão está na faixa de entre 5,7 e 7,1.

17. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 - 16,em que o tratamento do dito câncer é mais eficaz comparado ao tratamento deum paciente com câncer com o mesmo anticorpo na mesma dose, em queas células de câncer não apresentam um número de cópia de gene EGFRamplificado.

18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 - 17,em que o dito número de cópia de gene EGFR amplificado é específico para odito tumor.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 - 18,em que o número de cópia de gene EGFR amplificado é específico para o perfilindividual do tecido de câncer do paciente.

20. Uso de acordo com a reivindicação 19, em que o dito perfilindividual do tecido de câncer subentende mutações genéticas.

21. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-20,em que o dito tumor que expressa EGFR é câncer colorretal (CRC), câncerdo pulmão, câncer de mama ou câncer da cabeça e do pescoço.

22. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-21,em que o dito anticorpo anti-EGFR é selecionado do grupo que consiste emcetuximab (mAb c225), matuzumab (mAb h425) e panitumumab (mAb ABX)ou de suas versões murina, quimérica e humanizada.

23. Método para detectar e medir in vitro o número de cópia degene EGFR de tecido de tumor, que superexpressa EGFR, por utilização dehibridização fluorescente (FISH) in situ em um ensaio para a determinaçãoda resposta de um paciente com câncer à administração com um anticorpoanti-EGFR.