CN101948906A - 含有蛋白酶反应促进剂和/或色素稳定剂的试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有色素稳定剂的试剂。本发明提供一种添加含有环糊精的稳定剂以使用于酶反应检出的色素稳定化。另外，本发明提供一种通过使环糊精和所述色素共存来使色素稳定化的方法。此外，本发明还提供一种测定糖化蛋白质和糖化蛋白质比率的试剂及测定方法，所述试剂和测定方法使用含有上述环糊精的试剂。

Description

含有蛋白酶反应促进剂和/或色素稳定剂的试剂
本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/JP2005/014291，中国国家申请号为200580030020.2，申请日为2005年8月4日，发明名称为“含有蛋白酶反应促进剂和/或色素稳定剂的试剂”。
技术领域
本发明涉及一种蛋白酶反应促进剂以及一种促进蛋白酶反应的方法。而且，本发明涉及一种应用蛋白酶反应促进剂的试剂和测定方法。进一步具体地说，本发明涉及的应用蛋白酶反应促进剂的试剂和测定方法用于测定血红蛋白、糖化蛋白质或糖化蛋白质比率，本发明涉及准确、简便、迅速地对血红蛋白、血红蛋白Alc和糖化白蛋白进行定量测定的试剂及测定方法，该试剂和测定方法在临床检查中是有用的。
而且，本发明还涉及一种色素稳定剂、一种试剂和一种色素稳定化方法，所述色素稳定剂是用于酶反应检出的色素稳定剂且以含有环糊精为特征，所述试剂含有环糊精和用于酶反应检出的色素，所述色素稳定化方法在酶反应的检出中使用。此外，本发明还涉及一种用于测定糖化蛋白质或糖化蛋白质比率的试剂及方法，所述试剂和方法使用由环糊精稳定化的色素。
此外，本发明还涉及一种利用蛋白酶反应促进剂和色素来测定糖化蛋白质或糖化蛋白质比率的试剂及方法，所述色素用于酶反应的检出，且该色素由环糊精稳定化。本发明还涉及准确、简便、迅速地对糖化血红蛋白、血红蛋白Alc和糖化白蛋白进行定量的试剂及测定方法，该试剂和测定方法在临床检查中是有用的。
本申请要求特愿2004-229498号和特愿2004-281226号的优先权，并将上述申请的内容以引用方式包含于本申请中。
背景技术
在糖尿病的诊断和控制上，糖化蛋白质的测定非常重要，其中，糖化白蛋白和血红蛋白Alc在临床上经常作为不可缺少的指标来使用。对于糖化白蛋白和血红蛋白Alc的定量，一直使用电泳法、离子交换色谱法、亲和色谱法和免疫法来进行测定，不过，最近正在开发研究能够更简单地对大量试样进行大规模处理的酶法(非专利文献1和2)。
酶法中最为熟知的方法是利用蛋白酶分解试样中的糖化蛋白质而对产生的糖化氨基酸或糖化肽进行测定的方法，可是蛋白酶反应一般较慢，即使使用大量的蛋白酶，也很难在短时间内使蛋白质100％地分解。而且，对于所产生的过氧化氢可以通过利用过氧化酶使色素显色来进行定量，但此时存在的问题是，色素、尤其是无色型色素的稳定性较差。
有些已知的方法是使用四唑盐(非专利文献2和专利文献1～7)、磺酸化合物和/或硝基化合物(专利文献8和9)作为测定糖化蛋白质时使作为测定对象的蛋白质变性而促进蛋白酶反应的添加物。但是，四唑盐与诸如糖化蛋白质或抗坏血酸等具有还原性的化合物强烈反应而显色，由此导致在糖化蛋白质浓度高的试样或含有抗坏血酸的试样中出现异常值。而且磺酸化合物多为酶的抑制剂，特别是经常使用的十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸锂等是强效的抑制剂，以致于它们成为作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的反应终止剂。另外，硝基化合物本身显色，导致试剂空白值升高，测定准确度下降。
如上所述，现在所使用的“使作为测定对象的蛋白质变性而促进酶反应的添加物”不能令人满意。
此外，作为使用无色型色素进行测定的例子，已知有添加N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-双(二甲基氨基)联苯胺(下文中有时记为DA64)来测定血红蛋白Alc的文献(非专利文献2)，但该文献中没有关于试剂的稳定性和保存方面的描述。迄今为止对于一种形态为液态、长期稳定且含有无色型色素的试剂尚未见公开。
专利文献1：WO 02/27012号公报
专利文献2：WO 02/27330号公报
专利文献3：WO 2002/027331号公报
专利文献4：特开2000-93199号公报
专利文献5：特开2001-292795号公报
专利文献6：特开2003-232789号公报
专利文献7：JP 2000/210100号公报
专利文献8：WO 2004/007760号公报
专利文献9：WO 03/107011号公报
非专利文献1：Kouzuma et.al.，“An enzymatic method for the measurement of glycated albumin in biological sample”，Clinica Chimica Acta，2002，324，p.61-71.
非专利文献2：Ikunosuke Sakurabayashi et.al.，“New enzymatic assay for glycated hemoglobin”，Clinical Chemistry，2003，49，2，p.269-274.
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白酶反应促进剂，该蛋白酶反应促进剂比现有已知的蛋白酶反应促进剂更有用。而且，本发明的目的在于提供一种用于酶反应检出的色素稳定剂。
此外，本发明的目的还在于提供一种试剂，所述试剂利用上述蛋白酶反应促进剂和/或上述稳定剂，在临床生化检查、特别是血红蛋白Alc和糖化白蛋白的测定中所述试剂是有用的，而且，本发明也提供应用了上述试剂的测定方法。
为了解决上述课题，本发明人对四唑盐以外的、不与还原性物质反应的、难以对酶活性产生影响的且不显色的蛋白酶反应促进剂进行了研究。并且，通过使用含DA64的无色型色素，对具有与文献(Ikunosuke Sakurabayashi et.al.，“New enzymatic assay for glycated hemoglobin”，Clinical Chemistry，2003年，第49卷，第2期，p.269-274.)公开的相同组成的试剂的保存稳定性进行了研究，结果发现，于37℃保存3天后，色素明显显色，导致测定困难。于是，本发明人对于仍是未知化合物的、作为用于酶反应检出的色素稳定剂进行了研究。
本发明人还对用于测定血红蛋白、糖化蛋白质和糖化蛋白质比率的试剂及使用了该试剂的测定方法进行了研究，所述试剂的特征是使用上述酶反应促进剂和/或上述色素稳定剂。进而，还对一种在临床生化检查、特别是血红蛋白Alc和糖化白蛋白的测定中有用的测定用试剂及应用了该试剂的测定方法进行了研究。
本发明人着眼于选择一种化合物，该化合物能够使血红蛋白或糖化蛋白质变性，从而改变血红蛋白的颜色并且促进蛋白酶反应，并且本发明人用心选择出不受还原性物质的影响、不抑制酶的作用以及不会导致空白值升高的化合物并进行了专心的研究，结果发现，含有乙酸基的化合物、N-酰基牛磺酸盐或聚氧乙烯烷基醚硫酸盐具有蛋白酶反应促进作用，此外还发现，使用这些化合物可以准确地测定出血红蛋白、糖化蛋白质或糖化蛋白质比率。
此外，本发明人对筛选用于酶反应的检出的色素稳定剂进行了专心研究。结果发现，通常所知道的作为稳定剂有用的很多的糖类和表面活性剂的稳定效果较小，或者即使能够稳定色素，也会抑制显色。在这些化合物中，本发明人发现了环糊精，其对用于酶反应的检出的色素具有较强的稳定效果，且不抑制该色素的显色反应。然而，众所周知，环糊精是通过将化合物包起来的包合作用来使化合物保持稳定的。然而，还众所周知，在很多情况下，化合物一旦被包合就一直保持被包在环糊精内的状态。在本发明中，在化合物被包在环糊精内的情况下，虽然也曾担心不会发生显色反应，但却发现，色素、尤其是通过过氧化酶的作用而显色的无色型色素意外地得到稳定，并且发现显色反应也充分得到了保持。此外还发现，通过使过氧化氢酶共存且降低缓冲剂的浓度，会使在酶反应的检出中使用的色素更稳定；而且，使用本发明的色素稳定化方法和试剂能够更灵敏更准确地测定糖化蛋白质。
另外，本发明人还发现了使用上述蛋白酶反应促进剂和/或上述色素稳定剂的并且在临床生化检查、特别是在血红蛋白Alc和糖化白蛋白的测定中有用的试剂及使用该试剂的测定方法，进而完成了本发明。
即，本发明涉及下述内容：
1)一种蛋白酶反应促进剂，该蛋白酶反应促进剂包含下述物质中的至少一种：含有乙酸基的化合物或其盐、N-酰基牛磺酸或其盐、或者聚氧乙烯烷基醚硫酸或其盐；
2)如上述1)所述的蛋白酶反应促进剂，其中，所述含有乙酸基的化合物或其盐为N-酰基氨基酸或其盐，或是烷基醚羧酸或其盐；
3)如上述2)所述的蛋白酶反应促进剂，其中，所述N-酰基氨基酸或其盐为如下通式(1)所示的化合物或其盐；
R1-CO-R2    (1)
通式(1)中，R1表示烷基或烯基，R2表示从氨基酸或氨基酸衍生物的氨基上除去氢原子后得到的一价基团；
4)如上述3)所述的蛋白酶反应促进剂，其中，所述N-酰基氨基酸或其盐满足下述I)和/或II)：
I)R1为CH3(CH2)n-或十七碳-8-烯基，其中，n为10～14的整数；
II)氨基酸或氨基酸衍生物为N-甲基丙氨酸或肌氨酸；
5)如上述2)所述的蛋白酶反应促进剂，其中，所述烷基醚羧酸或其盐为如下通式(2)所示的化合物，
R3-O-(CH2-CH2-O)m-CH2COOM    (2)
通式(2)中，R3表示烷基，m表示3～10的整数，M表示氢原子或与羧酸形成盐的金属；
6)如上述5)所述的蛋白酶反应促进剂，其中，R3为CH3(CH2)Q-，此处，Q为10或11；
7)一种蛋白酶反应促进剂，其特征是，在对由蛋白酶反应生成的产物进行测定的方法中，所述蛋白酶反应促进剂将蛋白酶反应速率加快1.5倍以上，在所述蛋白酶反应中，蛋白酶至少与蛋白酶反应促进剂共存，以使反应得到促进；
8)一种试剂，其特征是，该试剂含有上述1)～7)任意一项所述的蛋白酶反应促进剂；
9)一种试剂，其特征是，该试剂含有下述i)～iii)：
i)如上述1)～7)任意一项所述的蛋白酶反应促进剂；
ii)蛋白酶；和
iii)作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶；
10)如上述8)或9)所述的试剂，其特征是，所述试剂还含有蛋白酶稳定剂、和/或作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的稳定剂；
11)如上述8)～10)任意一项所述的试剂，其特征是，所述试剂为液态，在冷藏下能保持6个月以上的稳定状态；
12)如上述9)～11)任意一项所述的试剂，其中，所述蛋白酶从糖化血红蛋白或其片段的糖化后的β链N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽，而不是实质性地从糖化血红蛋白或其片段的糖化后的α链N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽；
13)如上述9)～12)任意一项所述的试剂，其特征是，所述作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶对糖化缬氨酰-组氨酸的作用高于对糖化缬氨酰-亮氨酸的作用；
14)如上述8)～13)任意一项所述的试剂，其特征是，所述试剂还含有无色型色素和色素稳定剂；
15)如上述14)所述的试剂，其中，所述色素稳定剂为环糊精；
16)如上述8)～15)任意一项所述的试剂，其特征是，所述试剂还含有第一试剂和第二试剂；
所述第一试剂含有蛋白酶；和作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能够将不由血红蛋白的β链N末端产生的糖化氨基酸和/或糖化肽消除的酶；
所述第二试剂含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能够将由血红蛋白的β链N末端产生的糖化氨基酸和/或糖化肽检出的酶；
17)如上述8)～15)任意一项所述的试剂，其特征是，所述试剂含有第一试剂和第二试剂：
所述第一试剂含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶；
所述第二试剂含有蛋白酶；
18)如上述16)或17)所述的试剂，其特征是，所述第一试剂还含有过氧化氢酶和/或过氧化酶；
19)如上述8)～18)任意一项所述的试剂，其特征是，在由第一试剂和第二试剂构成的试剂盒中，在同一试剂中含有蛋白酶和过氧化氢酶，且在不含有过氧化氢酶的试剂中含有叠氮化钠；
20)一种促进蛋白酶反应的方法，所述方法利用上述1)～7)任意一项所述的蛋白酶反应促进剂来促进蛋白酶反应；
21)如上述20)所述的促进蛋白酶反应的方法，其特征是，利用上述7)所述的蛋白酶反应促进剂，将蛋白酶反应速率加快1.5倍以上；
22)一种测定血红蛋白、血红蛋白Alc或糖化白蛋白的方法，所述方法利用上述8)～19)任意一项所述的试剂来进行测定；
23)如上述22)所述的方法，其特征是，在同一反应槽中连续进行血红蛋白的测定和血红蛋白Alc的测定；
24)如上述23)所述的方法，其特征是，在同一波长下进行血红蛋白的测定和血红蛋白Alc的测定；
25)如上述24)所述的方法，其特征是，设定副波长以测定出一个值，然后从测定值中减去该值；
26)如上述22)～25)任意一项所述的方法，其特征是，特异性地测定血红蛋白Alc的β链N末端的糖化肽；
27)如上述22)～26)任意一项所述的方法，其特征是，以溶血液、血红蛋白溶液或血红蛋白的β链N末端的糖化肽为校正物质来测定血红蛋白Alc，然后由校准曲线计算出定量值；
28)如上述22)所述的方法，其特征是，在同一反应槽中连续进行白蛋白的测定和糖化白蛋白的测定；
29)如上述28)所述的方法，其特征是，在同一波长下进行白蛋白的测定和糖化白蛋白的测定。
本发明还涉及一种计算血红蛋白Alc值(％)的方法，其特征是，以选自糖化缬氨酰-组氨酸、糖化缬氨酰-组氨酰-亮氨酸、糖化缬氨酰-组氨酰-亮氨酰-苏氨酸、糖化缬氨酰-组氨酰-亮氨酰-苏氨酰-脯氨酸中的任意一个已知浓度的合成肽为校正物质，基于以上述校正物质所得到的测定值，求出试样中的血红蛋白Alc浓度，然后除以同时/或另外测定的总的血红蛋白浓度，由此求出血红蛋白Alc值(％)。
另外作为本发明的其他方式，本发明涉及蛋白酶反应促进剂、促进蛋白酶反应的方法、含有该蛋白酶反应促进剂的试剂、以及测定血红蛋白、糖化蛋白质或糖化蛋白质比率的方法，这些试剂和方法在使用酶来对尤其是血液试样中的血红蛋白、糖化蛋白质和糖化蛋白质比率准确、简便、迅速、廉价地进行定量的方面是有用的。具体地说，本发明涉及一种试剂及应用该试剂的测定方法，所述试剂是通过以下方法得到的：将上述1)所述的蛋白酶反应促进剂添加到在同一反应槽中连续测定糖化蛋白质的方法中所使用的试剂中，从而得到所述试剂。更详细地说，通常通过分别进行蛋白质的测定和糖化蛋白质的测定来换算糖化蛋白质比率。然而，本发明人另外开发出在同一反应槽中连续进行这些测定的方法(参见特开2001-204495号公报等)。只要将该方法与本发明的蛋白酶反应促进剂相组合，则能够更快更准确地进行测定，本发明也包括这种组合等。
另外，本发明还涉及如下内容：
30)一种色素稳定剂，该色素用于酶反应的检出，所述色素稳定剂的特征在于含有环糊精；
31)如上述30)所述的稳定剂，其特征是，所述环糊精为β-环糊精类；
32)如上述31)所述的稳定剂，其特征是，所述β-环糊精类为甲基-β-环糊精或2-羟丙基-β-环糊精；
33)如上述30)～32)任意一项所述的稳定剂，其特征是，在酶反应的检出中使用的色素是通过过氧化酶的作用而显色的色素；
34)如上述33)所述的稳定剂，其特征是，通过过氧化酶的作用而显色的色素是无色型色素；
35)一种试剂，所述试剂含有上述30)～34)任意一项所述的稳定剂和在酶反应的检测中使用的色素；
36)如上述35)所述的试剂，其特征是，所述试剂含有过氧化氢酶；
37)如上述35)或36)所述的试剂，其特征是，所述试剂还含有测定时浓度为80mM以下的缓冲剂；
38)如上述35)～37)任意一项所述的试剂，其特征是，所述试剂还含有蛋白酶；
39)如上述38)所述的试剂，其特征是，所述试剂还含有蛋白酶反应促进剂；
40)如上述35)～39)任意一项所述的试剂，其特征是，在测定时，环糊精的浓度为0.5重量％以上；
41)如上述35)～40)任意一项所述的试剂，其特征是，所述试剂为液态，并且在冷藏下能保持6个月以上的稳定状态；
42)一种色素的稳定化方法，所述色素用于酶反应的检出，所述稳定化方法的特征是，利用上述30)～34)任意一项所述的稳定剂；
43)一种糖化蛋白质或糖化蛋白质比率的测定方法，其特征是，所述方法利用上述35)～41)任意一项所述的试剂；
44)如上述43)所述的方法，其特征是，所述糖化蛋白质是糖化白蛋白、糖化血红蛋白、或血红蛋白Alc，所述糖化蛋白质比率是糖化白蛋白值、糖化血红蛋白值、或血红蛋白Alc值；
45)环糊精的一种用途，其用途为稳定在酶反应的检出中使用的色素；
46)环糊精的一种用途，其用途为制造上述35)～41)任意一项所述的试剂。
此外，本发明涉及用于酶反应检出的色素的稳定化方法和使该色素稳定化的试剂，本发明还涉及使用上述试剂和方法来对尤其是血液试样中的糖化蛋白质和糖化蛋白质比率准确、简便、迅速、廉价地进行定量的试剂及测定方法。
本发明的含有酶反应促进剂的试剂，通过将其添加至用于测定糖化蛋白质和糖化蛋白质比率的试剂中，由此具有能够准确、简便、迅速地进行上述测定的效果，利用该效果，具有能够大量、廉价地提供测定用试剂的效果。
而且，通过提供用于酶反应的检出的色素稳定剂，由此能够提供：该色素的稳定化方法；含有该色素的试剂，其流通时的保存稳定性优异；以及使用上述试剂测定糖化蛋白质及糖化蛋白质比率的方法及测定用试剂。
本发明的试剂含有蛋白酶反应促进剂以及用于酶反应检出的色素稳定剂，由此所能够提供的试剂可以准确、简便、迅速地对临床检查中有用的血红蛋白、血红蛋白Alc和糖化白蛋白进行定量测定，并且该试剂在流通时的保存稳定性优异。
附图说明
图1是基于本发明的实施例9的血红蛋白的测定结果。
图2是基于本发明的实施例10的血红蛋白Alc的测定结果。
图3是基于本发明的实施例10的血红蛋白的测定结果。
图4是基于本发明的实施例12的糖化白蛋白的测定结果。
图5是基于本发明的实施例18的血红蛋白Alc的校准曲线。
图6是基于本发明的实施例18的血红蛋白的校准曲线。
图7是基于本发明的实施例19的糖化白蛋白的测定结果。图中，实心□表示白蛋白浓度，实心菱形表示糖化白蛋白浓度，实心△表示糖化白蛋白值。
具体实施方式
下面对本发明的构成及优选方式进行更详细的说明。
作为能够在本发明中使用的蛋白酶反应促进剂，只要其能够促进蛋白酶反应、且不受还原性物质的影响、对同时使用的酶活性没有抑制以及不会影响空白吸光率，就可以使用任意蛋白酶促进剂，例如优选阴离子型表面活性剂，其中更优选含有乙酸基的化合物或其盐、N-酰基牛磺酸或其盐、聚氧乙烯烷基醚硫酸或其盐。作为蛋白酶反应促进用试剂可以使用组合物，所述组合物含有至少一种能够用于本发明的蛋白酶反应促进剂。
作为含有乙酸基的化合物或其盐，优选N-酰基氨基酸或其盐、烷基醚羧酸或其盐、醋酸甜菜碱型两性表面活性剂、咪唑啉型两性表面活性剂，更优选N-酰基氨基酸或其盐、烷基醚羧酸或其盐，特别优选N-酰基氨基酸或其盐。而且，作为本发明的其他方式，有时更加优选烷基醚羧酸或其盐。另外，含有乙酸基的化合物不包括乙酸，其盐可以是任何盐，只要该盐具有可与羧酸形成盐的金属离子即可。
作为能够在本发明中使用的N-酰基氨基酸或其盐，优选如下通式(1)所示的化合物或其盐，
R1-CO-R2    (1)
通式(1)中，R1表示烷基或烯基，R2表示从氨基酸或氨基酸衍生物中的氨基上除去氢原子后得到的一价基团。
R1表示烷基或烯基。作为R1表示的烷基，优选直链状或分支状的碳原子数为11～15的烷基，特别优选直链状的碳原子数为11～15的烷基，即CH3(CH2)n-(其中，n为10～14的整数)，其中最优选直链状的碳原子数为11的烷基(CH3(CH2)10-，十一烷基)(或以CH3(CH2)10-CO-表示的月桂酰基)。作为R1表示的烯基，优选直链状或分支状的碳原子数为11～15的烯基，更优选直链状的碳原子数为17或19的烯基，特别优选直链状的碳原子数为17的烯基。作为双键的数量，优选2或1，特别优选1。即，优选C17H31-或C17H33-，特别优选C17H33-。作为双键的位置，优选至少在第8位碳上具有双键。作为R1表示的烯基的具体例子，可以举出从油酸中除去羧酸的基团(CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)7-、十七碳-8-烯基)、从亚油酸中除去羧酸的基团(CH3(CH2)4CH＝CH(CH2)CH＝CH(CH2)7-、十七碳-8，11-二烯基)等。
作为R1，优选CH3(CH2)n-(其中，n为10～14的整数)或十七碳-8-烯基，特别优选十七碳-8-烯基。而且作为本发明的其他方式，有时优选CH3(CH2)n-(其中，n为10～14的整数)，其中特别优选CH3(CH2)10-。
R2表示从氨基酸或氨基酸衍生物中的氨基上除去氢原子后得到的一价基团。从所述氨基上除去氢原子后得到的一价基团部分与通式(1)中的-CO-形成肽键。作为氨基酸或氨基酸衍生物，可以为任意化合物，只要是具有氨基和羧酸基的化合物即可，优选标准氨基酸或其衍生物。作为标准氨基酸，优选非极性侧链氨基酸。具体地说，优选甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸，更优选甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸，最优选甘氨酸或丙氨酸。
作为标准氨基酸的衍生物，优选标准氨基酸的N-烷基取代物，具体地说，优选N-甲基取代物。而且，作为标准氨基酸的衍生物，优选N-甲基丙氨酸或肌氨酸，特别优选肌氨酸。另外，作为本发明的其他方式，有时也优选N-甲基丙氨酸。
作为通式(1)所示的化合物，优选其游离体(free body)或其盐。作为形成盐的金属，可以是任何金属，只要该金属能够与羧酸形成盐即可，可以举出例如锂、钠、钾、镁、钙、钡或铯。作为形成盐的金属，优选锂、钠、钾、镁或钙，更优选钠或钾，特别优选钠。而且，作为本发明的其他方式，有时也优选钾。作为以通式(1)表示的化合物优选游离体。
作为以通式(1)表示的化合物，作为优选例，可以具体地举出椰油酰肌氨酸钠、月桂酰肌氨酸、月桂酰肌氨酸钠、月桂酰肌氨酸钾、肉豆蔻酰肌氨酸钠、棕榈酰肌氨酸钠、油酰肌氨酸、或月桂酰甲基丙氨酸钠等；作为更优选的例子，可以举出椰油酰肌氨酸钠、肉豆蔻酰肌氨酸钠、棕榈酰肌氨酸钠、或月桂酰甲基丙氨酸钠；作为最优选的例子，可以举出月桂酰甲基丙氨酸钠。
以通式(1)表示的化合物可以通过公知的方法合成，例如，可以在公知的肽化条件下使下述两种物质发生反应来得到：能够通过市售得到的长链脂肪酸R1-COOH(R1与上述意义相同)和能够通过市售得到的氨基酸R2-H(R2与上述意义相同)。而且，以通式(1)表示的化合物也可以使用市售品，例如，可以从Nikko Chemicals Co.，Ltd.获得后使用。也可以根据需要将这些化合物进行脱羧酸化后使用，或是使这些化合物与金属盐化之后使用。
而且，作为烷基醚羧酸或其盐，优选如下通式(2)所示的化合物，
R3-O-(CH2-CH2-O)m-CH2COOM    (2)
通式(2)中，R3表示烷基，m表示3～10的整数，M表示氢原子或与羧酸形成盐的金属。
R3为烷基。作为R3表示的烷基，优选直链状或分支状的碳原子数为11～12的烷基，特别优选直链状的碳原子数为11～12的烷基，即CH3(CH2)Q-(其中，Q为10或11)。
作为R3，优选CH3(CH2)10-。另外，作为本发明的其他方式，有时也优选CH3(CH2)11-。
m表示3～10的整数。作为m，优选3～10的整数，优选3、6、10，更优选6、10，特别优选6。另外，作为本发明的其他方式，有时优选m为10。
M表示氢原子或与羧酸形成盐的金属。作为形成盐的金属，可以是是任何金属，只要该金属能够与羧酸形成盐即可，可以举出例如锂、钠、钾、镁、钙、钡或铯。作为M，优选氢原子、锂、钠、钾、镁或钙，更优选氢原子、钠或钾，特别优选钠。另外，有时也优选氢原子。作为本发明的其他方式，有时也优选钾。
作为以通式(2)表示的化合物，作为优选例，具体地可以举出聚氧乙烯(3)十三烷基醚乙酸钠、聚氧乙烯(6)十三烷基醚乙酸钠、聚氧乙烯(3)十三烷基醚乙酸、聚氧乙烯(7)十三烷基醚乙酸、聚氧乙烯(4.5)月桂基醚乙酸钠、聚氧乙烯(4.5)月桂基醚乙酸、聚氧乙烯(10)月桂基醚乙酸钠、或聚氧乙烯(10)月桂基醚乙酸等，作为特别优选的例子，可以举出聚氧乙烯(3)十三烷基醚乙酸钠、聚氧乙烯(6)十三烷基醚乙酸钠、或聚氧乙烯(10)月桂基醚乙酸。
以通式(2)表示的化合物可以通过公知的方法合成，例如，可以在公知的醚化条件下使下述两种物质发生反应来得到：能够通过市售得到的R3-O-(CH2-CH2-O)m-1-CH2-CH2-OH(R3和m与上述意义相同)和能够通过市售得到的卤代乙酸衍生物X-CH2COOM(M与上述意义相同，X表示溴原子或氯原子)。而且，以通式(2)表示的化合物也可以使用市售品，例如，可以从Nikko Chemicals Co.，Ltd.获得后使用。也可以根据需要将这些化合物进行脱羧酸化后使用，或是使这些化合物与金属盐化之后使用。
作为能够在本发明中使用的N-酰基牛磺酸或其盐，可以举出N-椰油酰甲基牛磺酸钠、N-月桂酰甲基牛磺酸钠、N-肉豆蔻酰甲基牛磺酸钠、N-棕榈酰甲基牛磺酸钠或N-硬脂酰甲基牛磺酸钠等；作为特别优选的例子，可以举出N-月桂酰甲基牛磺酸钠或N-硬脂酰甲基牛磺酸钠，但是可以使用任意化合物，只要是N-酰基牛磺酸或其盐就可以，也可以使用游离N-酰基牛磺酸。
能够用于本发明的N-酰基牛磺酸或其盐可以通过公知的方法合成，例如，可以通过使下述两种物质发生反应来得到：能够通过市售得到的牛磺酸和能够通过市售得到的酰化剂。而且，能够用于本发明的N-酰基牛磺酸或其盐也可以使用市售品，例如，可以从Nikko Chemicals Co.，Ltd.获得后使用。也可以根据需要将这些化合物进行脱羧酸化后使用，或是使这些化合物与金属盐化之后使用。
另外，作为能够在本发明中使用的聚氧乙烯烷基醚硫酸或其盐，可以举出聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸钠、聚氧乙烯(3)月桂基醚硫酸钠、聚氧乙烯(4)月桂基醚硫酸钠、聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸三乙醇胺、聚氧乙烯(4)月桂基醚硫酸三乙醇胺、聚氧乙烯(3)烷基醚硫酸三乙醇胺、聚氧乙烯(3)烷基醚硫酸钠、或聚氧乙烯(4)壬基苯基醚硫酸钠等；作为特别优选的例子，可以举出聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸三乙醇胺、聚氧乙烯(4)月桂基醚硫酸三乙醇胺、或聚氧乙烯(3)烷基醚硫酸三乙醇胺。但是，可以使用任意化合物，只要是聚氧乙烯烷基醚硫酸或其盐就可以，也可以使用游离聚氧乙烯烷基醚硫酸。
能够在本发明中使用的聚氧乙烯烷基醚硫酸或其盐可以使用市售品，例如，可以从Nikko Chemicals Co.，Ltd.获得后使用。
结果，作为本发明的蛋白酶反应促进剂，具体地说，优选椰油酰肌氨酸钠、肉豆蔻酰肌氨酸钠、棕榈酰肌氨酸钠、月桂酰甲基丙氨酸钠、聚氧乙烯(3)十三烷基醚乙酸钠、聚氧乙烯(6)十三烷基醚乙酸钠、聚氧乙烯(10)月桂基醚乙酸、N-月桂酰甲基牛磺酸钠、N-硬脂酰甲基牛磺酸钠、聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸三乙醇胺、聚氧乙烯(4)月桂基醚硫酸三乙醇胺、或聚氧乙烯(3)烷基醚硫酸三乙醇胺。更优选月桂酰甲基丙氨酸钠、聚氧乙烯(3)十三烷基醚乙酸钠、聚氧乙烯(6)十三烷基醚乙酸钠、聚氧乙烯(10)月桂基醚乙酸、N-月桂酰甲基牛磺酸钠、N-硬脂酰甲基牛磺酸钠、聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸三乙醇胺、聚氧乙烯(4)月桂基醚硫酸三乙醇胺、或聚氧乙烯(3)烷基醚硫酸三乙醇胺，最优选月桂酰甲基丙氨酸钠。
这些蛋白酶反应促进剂的使用浓度，可以使用任意浓度，只要该浓度能够使蛋白酶对蛋白质的作用变大即可，例如，该浓度下限通常为0.01％以上，优选为0.05％以上，最优选为0.1％以上；该浓度上限为50％以下，优选为40％以下，最优选为30％以下。
另外，作为本发明的蛋白酶反应促进剂，只要该促进剂能将蛋白酶反应速率加快1.25倍以上即可。但所述蛋白酶反应促进剂用于血红蛋白Alc的测定时，优选所述蛋白酶反应速率加快1.5倍以上，更优选加快2倍以上，最优选加快2.5倍以上。在所述蛋白酶反应促进剂用于糖化白蛋白的测定时，由于蛋白酶容易发挥作用，所以只要能得到1.5倍以上的蛋白酶反应速率即可。
对于蛋白酶反应的促进程度可以通过使用实施例1的方法来判断：求出血红蛋白Alc值高的试样和血红蛋白Alc值低的试样的吸光度之差，计算所述吸光度之差是未添加反应促进剂时(对照)的倍数。顺便提及，在对照中，可以使用未添加反应促进剂的试验溶液，或是使用添加了未确认是否具有反应促进效果的糖类例如山梨糖醇等以代替反应促进剂的试验溶液。在对白蛋白进行蛋白酶反应促进剂的筛选中，可以将试样替换为糖化白蛋白值高的试样和糖化白蛋白值低的试样。
并且，在本发明中，至少使蛋白酶和蛋白酶反应促进剂共存从而使蛋白酶反应得到促进，由该蛋白酶反应产生的物质包括糖化氨基酸、糖化肽、氨基酸和肽等，其中优选糖化氨基酸或糖化肽。作为测定上述由蛋白酶反应产生的物质的方法，可以举出例如测定血红蛋白Alc和糖化白蛋白的方法，但是，所述测定上述由蛋白酶反应产生的物质的方法也可以应用于其他物质的测定方法。
作为能够在本发明中使用的蛋白酶，可以使用任意蛋白酶，只要该蛋白酶能够有效作用于糖化蛋白质且有效生成衍生自该蛋白质的糖化氨基酸和/或糖化肽即可。作为优选例，可以举出例如衍生自动物、植物的蛋白酶；衍生自芽孢杆菌(Bacillus)属、曲霉(Aspergillus)属、根霉(Rhizopus)属、青霉(Penicillium)属、链霉(Streptomyces)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢梭菌(Clostridium)属、溶杆菌(Lysobacter)属、奇果菌(Grifola)属、酵母(Yeast)、麦轴梗霉(Tritirachium)属、栖热菌(Thermus)属、假单胞菌(Pseudomonus)属、或无色杆菌(Achromobacter)属等微生物的蛋白酶等。作为衍生自芽孢杆菌属微生物的蛋白酶，例如可优选举出枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)和金属蛋白酶等。
并且，作为测定对象的糖化蛋白质为糖化白蛋白的情况下，更优选衍生自芽孢杆菌属和链霉属微生物的蛋白酶，因为这些蛋白酶对人体白蛋白的作用较大。特别优选衍生自芽孢杆菌属的蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)、蛋白酶型-VIII、蛋白酶型-IX、蛋白酶型-X、蛋白酶型-XV、蛋白酶型-XXIV、蛋白酶型-XXVII、蛋白酶型-XXXI(以上蛋白酶为Sigma Aldrich Japan K.K.制造)；嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)和枯草菌蛋白酶(Nagarse)(以上蛋白酶为Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)；Olientase-90N、Olientase-10NL、Olientase-22BF、Olientase-Y和Olientase-5BL、以及Nuclerisin(以上蛋白酶为HBI Enzymes Inc.制造)；枯草杆菌碱性蛋白酶(Proleather)、蛋白酶-N、蛋白酶-NL和蛋白酶-S″Amano″(以上蛋白酶为Amano Enzymes Inc.制造)；GODO-BNP和GODO-BAP(以上蛋白酶为GODO SHUSEI CO.，LTD.制造)；Protin-A、Protin-P、Deskin、Depireisu、Biosoak和高温蛋白酶(以上蛋白酶为DaiwaKasei K.K.制造)；Toyozyme NEP(Toyobo Co.，Ltd.制造)；中性蛋白酶(Neutrase)、Esperase、Savinase、Durazyme、Biofeed Pro、Alcalase、NUE、Pyrase、Clear Lens Pro、Everlase、Novozyme-FM和Novolan(以上蛋白酶为Novozymes制造)；Enzylon-NBS和Enzylon-SA(以上蛋白酶为Rakuto Kasei Industrial Co.，Ltd.制造)；碱性蛋白酶GL440、OptiClean-M375plus、OptiClean-L1000和OptiClean-ALP440(以上蛋白酶为Kyowa Hakko Co.，Ltd.制造)；Bioprase ALP-30、Sp-4FG、XL-416F和AL-15FG(以上蛋白酶为Nagase ChemteX Co.制造)；Aloase AP-10和蛋白酶YB(以上蛋白酶为Yakult Pharmaceutical Inc.Co.，Ltd.制造)；Corolase-N、Corolase-7089和Veron W(以上蛋白酶为Higuchi Shokai Co.，Ltd.制造)；和脂肪酶(Chirazyme)P-1(Roche Diagnostics K.K.制造)等。最优选枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、枯草菌蛋白酶(Nagarse)、蛋白酶型-XXVII、和脂肪酶P-1。
另外，作为测定对象的糖化蛋白质为血红蛋白Alc的情况下，优选衍生自芽孢杆菌属、曲霉属、链霉属、麦轴梗霉属和溶杆菌属(Lysobacter)的蛋白酶，因为这些蛋白酶对人体血红蛋白的作用较大。更优选衍生自芽孢杆菌属、曲霉属、链霉属和麦轴梗霉属的蛋白酶，在本发明的一些方式中更优选衍生白溶杆菌属的蛋白酶。进一步优选衍生自芽孢杆菌属或溶杆菌属的蛋白酶，所述蛋白酶从糖化血红蛋白或其片段的糖化后的β链N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽，而不是实质性地从糖化血红蛋白或其片段的糖化后的α链N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽。最优选衍生自芽孢杆菌(Bacillus sp.)、嗜热解朊芽孢杆菌(Bacillus thermoproteolyticus Rokko)、或溶杆菌属(Lysobacter enzymogenes)的蛋白酶。另外，作为蛋白酶的优选具体例，可以举出例如衍生自嗜热解朊芽孢杆菌(Bacillus thermoproteolyticus Rokko)的嗜热菌蛋白酶和高温蛋白酶(thermoase)(Daiwa Kasei K.K.制造)；Toyozyme NEP(Toyobo Co.，Ltd.制造)；衍生自芽孢杆菌(Bacillus sp.)的蛋白酶(芽孢杆菌ASP-842FERMBP-08641)、和衍生自溶杆菌属(Lysobacter enzymogenes)的蛋白酶(Lysobacter enzymogenes YK366 FERM BP-10010)等。优选嗜热菌蛋白酶和衍生自溶杆菌属(Lysobacter enzymogenes)的蛋白酶，特别优选嗜热菌蛋白酶。另外，在本发明的其他方式中也特别优选衍生自溶杆菌属(Lysobacter enzymogenes)的蛋白酶。
对于能够用于本发明的蛋白酶的活性，是通过采用酪蛋白-Folin法来进行测定的。而且，可以利用WO 2004/104203号公报或特开2003-344052号公报记载的方法确认如下的酶基质的特异性：从糖化血红蛋白或其片段的糖化后的β链N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽，而不是实质性地从糖化血红蛋白或其片段的糖化后的α链N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽。例如，WO 2004/104203号公报中记载的确认方法是使用例如在血红蛋白的α链N末端和β链N末端具有5个残基的糖化肽，若只能够生成诸如糖化缬氨酰-组氨酸、糖化缬氨酰-组氨酰-亮氨酸或糖化缬氨酰-组氨酰-亮氨酰-苏氨酸等β链N末端的糖化肽，而不产生糖化缬氨酰-亮氨酸、糖化缬氨酰-亮氨酰-丝氨酸或糖化缬氨酰-亮氨酰-丝氨酰-脯氨酸，则该蛋白酶可以利用。此外，特开2003-344052号公报记载的确认方法是，使用糖化缬氨酰-组氨酰-对硝基苯胺和糖化缬氨酰-亮氨酰-对硝基苯胺，若只能够从糖化缬氨酰-组氨酰-对硝基苯胺中分解出对硝基苯胺，则该蛋白酶可以利用。
作为能够用于本发明的作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶，可以使用任意酶，只要该酶能够对因上述蛋白酶的作用而由糖化蛋白质生成的糖化氨基酸和/或糖化肽产生有效作用、并且能够实质性地测定糖化蛋白质即可。作为作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的优选例，可以举出：良好地作用于具有糖化α氨基的氨基酸和/或具有糖化α氨基的肽的酶；和良好地作用于具有糖化ε氨基的氨基酸和/或具有糖化ε氨基的肽的酶等。酶的种类有脱氢酶、氧化酶和激酶等，其中优选被广泛研究的氧化酶。
作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶中，作为良好地作用于具有糖化ε氨基的氨基酸和/或具有糖化ε氨基的肽的酶的例子，可以举出衍生自赤霉(Gibberella)属、曲霉(Aspergillus)属、念珠菌(Candida)属、青霉(Penicillium)属、镰刀菌(Fusarium)属、枝顶孢(Acremonium)属、或德巴利酵母(Debaryomyces)属的氧化酶。
此外，作为即使在与蛋白酶共存的状态下也具有充分的活性、且能够廉价地制造的酶的例子，可以举出基因重组型酮胺氧化酶(KAOD，Asahi Kasei Pharma Co.制造；记载于Clinica Chimica Acta，2002，324，p.61-71)和变异型KAOD(KAOD-V，Asahi Kasei Pharma Co.制造，WO02/27330号公报中记载的含有FOD基因的转化体微生物JM109·pcmFOD5(FERM BP-7848)所产生的KAOD)，所述变异型KAOD使糖化缬氨酸的反应性显著降低。另外，按照文献(Clinia Chimica Acta，2002，324，p.61-71.)记载的方法测定作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的活性。
此外，作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶中，作为良好地作用于具有糖化α氨基的氨基酸和/或具有糖化α氨基的肽的酶的例子，可以举出衍生自棒状杆菌(Corynebacterium)的氧化酶、上述基因重组型酮胺氧化酶(KAOD，Asahi Kasei Pharma Co.制造；记载于Clinica Chimica Acta，2002，324，p.61-71)、以及在测定血红蛋白Alc时有用的、对糖化缬氨酰-组氨酸的作用高于对糖化缬氨酰-亮氨酸的酶，所述对糖化缬氨酰-组氨酸的作用高于对糖化缬氨酰-亮氨酸的酶衍生自Stephylium属、新赤壳属(Neocosmospora)、Achaetomium属、毛壳菌属(Chaetomium)、锥毛壳属(Coniochaeta)、Coniochaetidium属、节菱孢属(Arthrinium)、棘壳孢属(Pyrenochaeta)、Leptospheria属(Leptospira钩端螺旋体属)、格孢腔菌属(Pleospora)、蛇孢腔菌属(Ophiobolus)、弯孢霉菌属(Curvularia)、和茎点霉属(Phoma)。
此外，作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶中，作为在测定血红蛋白Alc时有用的、对糖化缬氨酰-组氨酸的作用高于对糖化缬氨酰-亮氨酸的酶的更优选的例子，可以举出衍生自下述菌株的酶：Stephylium sp.菌株、侵管新赤壳(Neocosmospora vasinfecta)IFO7590菌株、WO 2004/104203号公报中记载的侵管新赤壳(Neocosmospora vasinfecta)474菌株、Achaetomium sp.菌株、毛壳菌属菌株、锥毛壳属菌株或Coniochaetidiumsavoryi ATCC菌株、节菱孢属TO6、暗孢节菱孢NBRC31950、暗孢节菱孢NBRC6620、Arthrinium japonicum NBRC31098、棘壳孢属YH807、Pyrenochaeta gentianicola MAFF425531、Pyrenochaeta terrestris NBRC30929、Leptospheria nodorum(分生孢子名为Phoma hennebergii)NBRC7480、Leptospheria doriolum JCM2742、Leptospheria maculans(分生孢子名为Phoma lingum)MAFF726528、枯叶格孢腔菌NBRC32012、甜菜格孢腔(分生孢子名为甜菜茎点霉)NBRC5918、Ophiobolus herpotricus NBRC6158和棒弯孢(Curvulalia clavata)YH923(FERM BP-10009)等。特别优选举出衍生自侵管新赤壳IFO7590菌株、WO 2004/104203号公报中记载的侵管新赤壳(Neocosmospora vasinfecta)474菌株和棒弯孢(Curvulalia clavata)YH923(FERM BP-10009)的酶，最优选衍生自侵管新赤壳IFO7590菌株的酶。另外，在本发明的其他方式中，有时也最优选衍生自棒弯孢(Curvulalia clavata)YH923(FERM BP-10009)的酶。另外，对于基质特异性的确认，可以通过确认上述酶对作为基质的糖化缬氨酰-组氨酸和糖化缬氨酰-亮氨酸的作用来进行。
作为可以用于本发明的蛋白酶的稳定剂，可以使用任意稳定剂，只要是能够在试剂的保存中抑制蛋白酶活性降低的物质即可，特别优选能够在以液体状态保存试剂时抑制蛋白酶活性降低的物质。
作为蛋白酶稳定剂的优选例，可以举出二甲亚砜、醇、钙、食盐、季铵盐和季铵盐型阳离子表面活性剂。作为醇的例子，可以举出乙醇、丙醇、乙二醇和甘油等，作为季铵盐型阳离子表面活性剂的例子，可以举出月桂基硫酸三乙醇胺和十二烷基三甲基氯化铵等。
另外，作为这些蛋白酶稳定剂的使用浓度，可以以任意的浓度来使用，只要该浓度能够在试剂的保存中抑制蛋白酶的活性降低即可，特别优选能够在以液体状态保存试剂时抑制蛋白酶活性降低的浓度。作为优选浓度，添加例如DMSO作稳定剂时，下限浓度为5％以上，优选为10％以上；上限浓度为50％以下，优选为40％以下。
作为可以用于本发明、作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的稳定剂，可以使用任意稳定剂，只要是能够在试剂的保存中至少抑制作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的活性降低的物质即可，特别优选能够在以液体状态保存试剂时至少抑制作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的活性降低的物质。
作为作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的稳定剂的优选例，可以举出糖醇、蔗糖、镁、钙、硫酸铵、氨基酸和肌氨酸。作为糖醇的例子，可以举出山梨糖醇、甘露醇、海藻糖和甘油等。此外，作为氨基酸，虽然所有的氨基酸都具有较强的稳定效果，但特别优选标准氨基酸，其中更优选脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸和赖氨酸等。
而且，作为这些作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的稳定剂的使用浓度，可以以任意的浓度来使用，只要该浓度能够在试剂的保存中抑制作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的活性降低即可，特别优选能够在以液体状态保存试剂时抑制作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的活性降低的浓度。作为优选浓度，在添加例如山梨糖醇作稳定剂时，下限浓度为0.1％以上，优选为0.2％以上；上限浓度为30％以下，优选为20％以下。
可以以如下方式判断本发明的试剂的稳定性。将液体试剂在冷藏(2℃～10℃)下保存，优选在4℃保存6个月(或者以37℃下保存4天的条件来代替)。用保存后的试剂和保存前的试剂来进行测定，作为校正物质，测定浓度已知的糖化白蛋白或血红蛋白Alc(或糖化血红蛋白)，作为试样，测定血清或溶血液(经溶血处理的血液)，比较保存前的试剂和保存后的试剂的灵敏度。优选灵敏度差异小的情况，特别优选没有灵敏度差异的情况。
本发明的通过使用蛋白酶反应促进剂来促进蛋白酶反应的方法是非常有用的。
作为可以用于本发明的在酶反应的检出中使用的色素，可以举出辅酶、四唑盐、Trinder型试剂和无色型试剂等，优选辅酶、Trinder型试剂和无色型试剂，更优选Trinder型试剂和无色型试剂等通过氧化酶的作用而显色的色素，特别优选无色型试剂。
例如，当使用脱氢酶测定糖化氨基酸和/或糖化肽时，可以使用NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)等辅酶或以下述化合物为代表的各种四唑盐：氮蓝四唑、四唑蓝、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑：WST-1、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑：WST-3、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑：WST-8(以上化合物为Dojindo Laboratories制造)。
此外，当使用氧化酶测定糖化氨基酸和/或糖化肽时，可以使用Trinder型试剂或无色型试剂，这两种试剂能够在过氧化酶的存在下，通过过氧化氢、成色剂(coupler)和发色团的氧化缩合而生成色素，所述过氧化氢由氧化酶的作用产生，所述成色剂为4-氨基安替比林(4-AA)或3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)等，所述发色团为苯酚等。
作为Trinder型试剂的氢供体，可以使用苯酚衍生物、苯胺衍生物和甲苯胺衍生物等，作为具体例，可以举出N-(3-磺丙基)苯胺钠一氢化物(HALPS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠一氢化物(TOPS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠一氢化物(MAOS)、N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠一氢化物(HDAPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠(HDAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠一氢化物(DAPS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠(ALPS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠一氢化物(ADPS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠二氢化物(ADOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)间甲苯胺(TOOS)和N，N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠(TODB)(以上化合物为Dojindo Laboratories制造)等。
作为可以用于本发明的无色型色素，可以使用任意色素，例如，可以举出容易获得的N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-双(二甲氨基)联苯胺(DA64)、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪(DA67)(上述色素为Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)；2，2′-氨基双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)、双-(4-二乙氨基苯基)-2-磺基甲苯(BSPM)、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)、10-N-甲基氨基甲酰-3，7-二甲氨基-10H-吩噻嗪(MCDP)(上述色素为Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造等)；邻联甲苯胺、3，3′-二氨基联苯胺·4HCl(DAB)、3-(4-羟苯基)丙酸(HPPA)、N，N′-双(2-羟基-3-磺苯基)联甲苯胺·2Na·4H2O(SAT-3)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMBZ)、N-(3-磺丙基)-3，3′，5，5′-四甲基联苯胺·Na(TMBZ-PS)、和N，N′，N′，N″，N″-六(3-磺丙基)-4，4′，4″-三氨基三苯甲烷·6Na(TPM-PS)(以上色素为Dojindo Laboratories制造)等。
作为可以用于本发明的色素稳定剂，可以使用任意物质，只要该物质能提高色素的稳定性即可，但优选环糊精。可以使用任意的环糊精，只要能够取得用于酶反应的检出的色素的稳定效果即可。可以举出例如α-环糊精类、β-环糊精类和γ-环糊精类，优选β-环糊精类和γ-环糊精类，特别优选β-环糊精类。作为α-环糊精类，可以举出α-环糊精。作为γ-环糊精类，可以举出γ-环糊精和羧甲基-γ-环糊精，优选γ-环糊精，但有时也优选羧甲基-γ-环糊精。作为β-环糊精类，可以举出β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、二甲基-β-环糊精、单氨基-β-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精和甲基-β-环糊精，优选2-羟丙基-β-环糊精和甲基-β-环糊精，特别优选2-羟丙基-β-环糊精。另外，有时也非常优选甲基-β-环糊精。
其结果，作为环糊精，优选α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羧甲基-γ-环糊精、羧甲基-β-环糊精、二甲基-β-环糊精和单氨基-β-环糊精(以上环糊精可以从Sigma Aldrich Japan K.K.等获得)；2-羟丙基-β-环糊精和甲基-β-环糊精(以上环糊精可以从日本食品加工株式会社等获得)，更优选2-羟丙基-β-环糊精和甲基-β-环糊精，特别优选2-羟丙基-β-环糊精。另外，有时也非常优选甲基-β-环糊精。
作为用于酶反应的检出的色素稳定剂可以使用上述环糊精。而且，也可以使用环糊精以使用于酶反应的检出的色素稳定。此外，还可以使用环糊精以制造出用于酶反应检出的色素的稳定化试剂。
作为用于酶反应的检出的色素的使用浓度，可以使用任意浓度，只要是能够在试剂保存过程中保证充分显色的浓度即可，特别优选能够在以液体状态冷藏保存试剂时保证充分显色的浓度。作为优选浓度的例子，例如在使用DA67的情况下，下限浓度为1μM以上，优选为2μM以上；上限浓度为100mM以下，优选为50mM以下。
作为环糊精的使用浓度，可以使用任意浓度，只要是能够在试剂保存过程中抑制用于酶反应检出的色素劣化的浓度即可，特别优选能够在以液体状态保存试剂时抑制色素劣化的浓度。作为优选浓度的例子，例如在添加甲基-β-环糊精作为稳定剂的情况下，下限浓度为0.5％以上，优选为1.0％以上；上限浓度为50％以下，优选为40％以下。此外，对于色素和环糊精的重量比的优选例，色素∶环糊精的重量比下限为1∶0.01以上，优选为1∶0.04以上；色素∶环糊精的重量比上限为1∶500万以下，优选为1∶3300000以下。
作为可以用于本发明的缓冲剂的优选例，优选Good缓冲剂，可以举出例如，使用3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA)、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、N-环己基-2-羟基-3-氨基丙磺酸(CAPSO)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、3-[N，N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、2-吗啉基乙磺酸(MES)、3-吗啉基丙磺酸(MOPS)、2-羟基-3-吗啉基丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-1，4-双(2-羟基-3-丙磺酸)(POPSO)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、2-羟基-N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基丙磺酸(TES)、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)和三羟甲基氨基甲烷(Tris)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)和N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA)等化合物的缓冲剂；或硼酸、氨、甘氨酸、碳酸、乙酸、磷酸、二乙醇胺、对苯酚磺酸、2-氨基-2-甲基丙烷-1，3-二醇、二甲次胂酸、柠檬酸、马来酸、巴比妥和3，3-二甲基戊二酸等。
此外，作为缓冲剂，更优选在中性pH附近具有缓冲作用的缓冲剂，例如EPPS、HEPES、HEPPSO、ACES、ADA、BES、Bicine、Bis-Tris、CHES、DIPSO、MES、MOPS、MOPSO、PIPES、POPSO、TAPS、TAPSO、TES、Tricine、Tris、ACES、ADA、硼酸、氨、甘氨酸、磷酸、二乙醇胺、对苯酚磺酸、2-氨基-2-甲基丙烷-1，3-二醇、二甲次胂酸、柠檬酸、马来酸、巴比妥和3，3-二甲基戊二酸等，其中最优选3，3-二甲基戊二酸。
作为以稳定的状态含有本发明的用于酶反应检出的色素的试剂，没有任何限定，只要该试剂至少含有本发明的用于酶反应检出的色素稳定剂和用于酶反应检出的色素即可。
而且，对于上述本发明的试剂，特别优选还含有过氧化氢酶。含有过氧化氢酶是为了除掉在保存过程中产生的过氧化氢，从而尽量抑制保存中的色素显色。作为可以用于本发明的过氧化氢酶，可以使用任意的酶，只要其具有过氧化氢酶活性即可，优选例如衍生自黑曲霉的酶和衍生自牛肝的酶，特别优选衍生自黑曲霉的酶。此外，有时也特别优选衍生自牛肝的酶。另外，衍生自黑曲霉的酶和衍生自牛肝的酶可以从SigmaAldrich Japan K.K.等获得。
作为可以用于本发明的血红蛋白测定用试剂和测定方法，可以使用任意的试剂和测定方法，只要是利用本发明的蛋白酶反应促进剂来测定血红蛋白的试剂和测定方法即可。优选含有如下化合物的试剂和应用了该试剂的测定方法：上述含有乙酸基的化合物或其盐、N-酰基牛磺酸或其盐、或者聚氧乙烯烷基醚硫酸或其盐。特别优选含有如下化合物的试剂和应用了该试剂的测定方法：上述N-酰基牛磺酸或其盐、或者聚氧乙烯烷基醚硫酸或其盐，并且所述化合物作为所述含有乙酸基的化合物或其盐。作为这些蛋白酶反应促进剂的使用浓度，可以使用任意浓度，只要是能够测定血红蛋白的浓度即可。例如，通常，所述浓度的下限为0.01％以上，优选为0.05％以上，最优选为0.1％以上；所述浓度的上限为50％以下，优选为40％以下，最优选为30％以下。
对于可以用于本发明的血红蛋白测定的操作，可以以如下方式进行：向上述血红蛋白定量试剂中加入0.001ml～0.5ml的被测溶液，使其在37℃的温度下反应，在反应开始的一定时间后测定血红蛋白的色调(吸光度)。对于血红蛋白的色调，例如可以测定200nm～1000nm下的吸光度，优选测定280nm～800nm下的吸光度。此时，若利用浓度已知的血红蛋白进行测定并比较吸光度的变化，则可以求出被测溶液中的血红蛋白的量。
作为可以用于本发明的糖化蛋白质测定用试剂，可以使用任意试剂，只要是利用本发明的蛋白酶反应促进剂和/或本发明的用于酶反应检出的色素稳定剂来测定糖化蛋白质的试剂即可，所述本发明的用于酶反应检出的色素稳定剂以环糊精为代表。优选含有上述的蛋白酶、和作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的试剂。蛋白酶和作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶可以混合在同一溶液中，但优选使用由蛋白酶试剂和检出试剂构成的试剂，所述蛋白酶试剂含有蛋白酶，所述检出试剂含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶。蛋白酶反应促进剂可以混合于上述蛋白酶试剂和检出试剂中的任意一种试剂，只要蛋白酶反应促进剂在蛋白酶作用于糖化蛋白质之时或之前存在即可。而且，更优选在含有蛋白酶的试剂中添加蛋白酶稳定剂，在含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的试剂中添加作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶稳定剂。
此外，更优选如下方式：将用于酶反应检出的色素、以环糊精为代表的本发明的用于酶反应检出的色素稳定剂和过氧化氢酶混合，将过氧化酶添加于其他试剂中，在测定时将二者混合。这是因为，若色素与过氧化酶共同存在，则可能在保存过程中发生反应而显色。
作为可以用于本发明的具体的蛋白酶试剂，可以以如下方式得到：确定pH、缓冲剂和蛋白酶的浓度，以使蛋白质的分解反应能够有效进行，然后适当制备蛋白酶反应促进剂和蛋白酶稳定剂，并且以有效的浓度将所制备的蛋白酶反应促进剂和蛋白酶稳定剂添加至蛋白酶试剂中。
作为可以用于本发明的缓冲剂，可以使用任意的缓冲剂，只要该缓冲剂不会影响到用于酶反应检出的色素的稳定性即可，具体例与上述相同。作为测定时的缓冲剂浓度，设定缓冲剂的使用浓度是重要的，测定时的缓冲剂浓度的上限为80mM以下，更优选为50mM以下；并且其下限为0.1mM以上，优选为1mM以上。
例如，当蛋白质为白蛋白、测定对象为糖化白蛋白的情况下，使用蛋白酶型XXIV(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)时，蛋白质分解活性在pH7～10附近较强，因此优选反应的pH为7～10。
此外，当蛋白质为血红蛋白、测定对象为糖化血红蛋白或血红蛋白Alc的情况下，使用上述Toyozyme NEP(TOYOBO Co.，Ltd.制造)时，蛋白质分解活性在pH6.0～9.0附近较强，因此优选反应的pH为6.0～9.0。
对于蛋白酶浓度，只要是能够在实际使用的反应时间内充分分解被测溶液中的蛋白质的浓度即可。所述蛋白酶浓度的下限为10U/ml以上，优选为100U/ml以上，最优选为500U/ml以上；所述蛋白酶浓度的上限为1.0×106U/ml以下，优选为5.0×105U/ml以下，最优选为3.0×105U/ml以下。
作为蛋白酶反应促进剂，可以使用任意的蛋白酶反应促进剂，只要是本发明的蛋白酶反应促进剂即可。作为蛋白酶反应促进剂的使用浓度，可以使用任意浓度，只要该浓度能够有效地使蛋白质变性，且能提高蛋白酶对蛋白质的作用即可。例如，通常，所述蛋白酶反应促进剂的使用浓度下限为0.01％以上，优选为0.05％以上，最优选为0.1％以上；其上限为50％以下，优选为40％以下，最优选为30％以下。
作为蛋白酶稳定剂的使用浓度，可以使用任意浓度，只要该浓度能使所述蛋白酶在冷藏下以液体状态保存6个月还显示出稳定的试剂性能即可。例如在使用二甲亚砜的情况下，通常，所述浓度下限为1％以上，优选5％以上；所述浓度上限为60％以下，优选为50％以下。
作为过氧化氢酶的使用浓度，可以使用任意浓度，只要该浓度为能够除去使在酶反应的检出中使用的色素变得不稳定的过氧化氢等的浓度即可。例如，通常，所述浓度下限为0.1U/ml以上，优选为1U/ml以上，最优选为2U/ml以上；所述浓度上限为3000U/ml以下，优选为1500U/ml以下，最优选为1500U/ml。
对于可以用于本发明的含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的测定试剂，可以以如下方法确定其组成：关于作用于所使用的糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的最佳pH，应选择能使反应有效进行的pH，然后决定作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶量。接下来，还可以添加过氧化酶、作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的稳定剂和叠氮化钠等叠氮化物，当蛋白酶试剂中使用过氧化氢酶时，添加叠氮化钠可以阻止过氧化氢酶的作用。
例如，在蛋白质为白蛋白、测定对象为糖化白蛋白的情况下，使用例如上述KAOD或KAOD-V(Asahi Kasei Pharma Co.制造)时，由于在pH为6.5～10的宽区域内显示出最大活性的50％以上的活性，因此优选反应的pH为6.5～10。另外，例如在蛋白质为血红蛋白、测定对象为糖化血红蛋白或血红蛋白Alc的情况下，使用例如上述衍生自棒弯孢YH923的KAOD时，在pH为6.0～10的宽区域内显示出最大活性的50％以上的活性，因此优选反应的pH为6.0～10。
作为作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的使用浓度，可以使用任意浓度，只要是能够测定糖化蛋白质的浓度即可，通常所述浓度下限为0.5U/ml以上，优选为1U/ml以上；所述浓度上限为1000U/ml以下，优选为500U/ml以下。
作为过氧化酶的使用浓度，可以使用任意浓度，只要是能够测定由测定体系产生的过氧化氢的浓度即可。通常所述浓度下限为0.01U/ml以上，优选为0.1U/ml以上；所述浓度上限为100U/ml以下，优选为50U/ml以下。
作为作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的稳定剂的使用浓度，可以使用任意浓度，只要该浓度能使上述酶在冷藏下以液体状态保存6个月还显示出稳定的试剂性能即可。例如在使用山梨糖醇的情况下，通常所述浓度下限为0.1％以上，优选1％以上；所述浓度上限为30％以下，优选为20％以下。
为了阻止过氧化氢酶反应而使用叠氮化物时，作为所使用的叠氮化物的浓度，可以使用任意浓度，只要该浓度能充分阻止过氧化氢酶的活性即可。例如使用叠氮化钠时，作为其使用浓度，通常下限为0.01％以上，优选0.05％以上；上限为10％以下，优选为5％以下。
在基于本发明的糖化蛋白质的测定方法中，使用作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶时，例如在使用脱氢酶作为所述酶的情况下，对于所述酶的作用的检出可以以下述方式测定辅酶的变化量来进行。例如在使用NAD作为所述辅酶时，对于由该辅酶所产生的变化量，可以利用公知技术(例如，使用比色计在作为还原型辅酶的还原型NAD的最大吸收波长区域、即340nm附近的波长下测定还原型NAD)来直接定量，或者使用各种心肌黄酶、诸如吩嗪硫酸甲酯等电子受体、或各种四唑盐等还原性显色试剂来间接定量NAD，所述四唑盐以以下四唑盐为代表：硝基四唑盐、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑单钠盐(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑单钠盐(WST-3)(上述四唑盐由Dojindo Laboratories制造)。此外，还可以利用其他公知的方法直接或间接地测定。
此外，例如使用氧化酶时，优选测定氧的消耗量或反应生成物的量。例如使用酮胺氧化酶的情况下，作为反应生成物，是由反应生成的过氧化氢和葡糖醛酮，该过氧化氢和葡糖醛酮都可以以公知的方法直接或间接地测定。
对于上述过氧化氢的量，可以通过如下方法进行定量。例如，既可以使用过氧化酶等来生成色素等，然后根据显色、发光和荧光等来定量，也可以利用电化学的方法来定量，还可以使用过氧化氢酶等以使醇生成醛，然后定量所生成的醛的量。
过氧化氢的显色体系可以使用Trinder试剂和无色型试剂等。所述Trinder试剂在过氧化酶的存在下，通过成色剂和发色团的氧化缩合而生成色素，所述成色剂为4-氨基安替比林(4-AA)或3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)等，所述发色团为苯酚等；所述无色型试剂在过氧化酶的存在下直接氧化而显色，所述无色型试剂例如有N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-双(二甲氨基)联苯胺(DA64)和10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪(DA67)(上述化合物为Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)。
另外，在使用电极测定过氧化氢时，对于电极材料没有特别限制，只要该材料是能够与过氧化氢交换电子的材料即可，例如可以举出铂、金、或银等。作为使用电极的测定方法，可以使用电流测定法、电位测定法、库伦分析法等公知的方法，还可以使电子传递体介于氧化酶或基质与电极之间，以对所得到的氧化还原电流或氧化还原电量进行测定。作为电子传递体，可以使用具有电子转移功能的任意物质，例如二茂铁衍生物或苯醌衍生物等物质。此外，还可以使电子传递体介于由氧化酶反应生成的过氧化氢与电极之间，以测定所得的氧化还原电流或氧化还原电量。
另外，在本发明的测定方法和测定试剂中，当然也可以单独使用蛋白酶，还可以在蛋白酶的反应前后或反应的同时，使其他内蛋白酶或其他外蛋白酶产生作用。
此外，在基于本发明的测定糖化蛋白质的酶反应试剂的组成中，也可以适当选择添加例如表面活性剂、盐类、和防腐剂等。
可以适当添加0.01％～10％、优选0.05％～5％的表面活性剂，例如聚氧乙烯烷基醚类、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯类和聚乙烯醇等；可以适当添加1mM～5M、优选10mM～1M的各种金属盐类，例如氯化锂、氯化钠、氯化钾、氯化锰、氯化钴、氯化锌和氯化钙等；可以适当添加0.01％～10％、优选0.05％～1％的各种防腐剂，例如叠氮化钠。proclin(SUPELCO制造)作为上述各种防腐剂中的一种防腐剂，可以适当添加0.01％～10％、优选0.02％～5％。
可以用于本发明的糖化蛋白质的测定方法包括下述内容：向上述本发明的用于测定糖化蛋白质的酶反应试剂的组合物中添加0.001ml～0.5ml被测溶液，在37℃的温度下反应，在进行比率测定时，可以以上述方法直接地或间接地对反应开始一定时间后的两点间的几分钟至几十分钟(例如反应开始3分钟后和4分钟后的1分钟，或是反应开始3分钟后和8分钟后的5分钟)内变化的辅酶、溶解氧、过氧化氢或其他生成物的量进行测定；在进行终点测定时，也可以同样地对检出反应开始一定时间后变化的辅酶、溶解氧、过氧化氢或其他生成物的量进行测定。此时可以与使用浓度已知的糖化蛋白质进行测定时得到的吸光度等的变化进行比较，由此求出被测溶液中糖化蛋白质的量。
作为可以在本发明的测定方法中使用的校正物质，除了上述浓度已知的蛋白质外，也可以使用浓度已知的糖化氨基酸、或糖化肽。作为糖化氨基酸、或糖化肽的例子，可以使用市售的合成肽，在测定血红蛋白Alc时，可以使用糖化缬氨酰-组氨酸、糖化缬氨酰-组氨酰-亮氨酸、糖化缬氨酰-组氨酰-亮氨酰-苏氨酸或糖化缬氨酰-组氨酰-亮氨酰-苏氨酰-脯氨酸等。对于校正物质中肽的浓度，只要该浓度能足以测定由试样产生的肽的浓度即可。
作为可以用于本发明的测定糖化蛋白质比率用试剂的组合物，可以向上述糖化蛋白质测定用试剂组合物中，另外或同时添加测定蛋白质的组分。例如，蛋白质为糖化白蛋白时，可以另外测定白蛋白；蛋白质为糖化血红蛋白或血红蛋白Alc时，可以另外测定血红蛋白。可以利用公知的方法测定白蛋白或血红蛋白。
作为另外测定白蛋白的方法，可以使用任意方法，只要是公知的测定白蛋白的方法即可。在这种方法中，可以举出利用白蛋白特异性色素的方法等，所述白蛋白特异性色素有溴甲酚绿(以下缩写为BCG)、溴甲酚紫(以下缩写为BCP)、溴酚蓝(以下缩写为BPB)、甲基橙(以下缩写为MO)、或2-(4′-羟偶氮苯)苯甲酸(以下缩写为HABA)等。此外，当作为测定对象的蛋白质为血红蛋白时，可以使用任意方法，只要是公知的测定血红蛋白的方法即可。在这种方法中，可以举出例如正铁血红蛋白法、氰化正铁血红蛋白法、叠氮化正铁血红蛋白法、绿色发色团形成法、或氧合血红蛋白法等。所谓绿色发色团形成法，是使绿色发色团形成试剂与血红蛋白反应，从而形成稳定的生成物(绿色发色团)的方法，所述绿色发色团与英国专利公开第2052056号公报中记载的碱性正铁血红素D-575具有同样的吸收光谱。
作为可以用于本发明的在同一反应槽中连续进行血红蛋白的测定和血红蛋白Alc的测定的方法，可以使用任意方法，只要该方法使用本发明的含有蛋白酶反应促进剂的试剂即可。具体方法如下：向含有蛋白酶反应促进剂的第1反应试剂中添加试样，一定时间后(例如3分钟后或5分钟后等)测定血红蛋白在具有特殊吸收的波长下(例如220nm～900nm，优选280nm～800nm)的吸光度，然后添加含有酮胺氧化酶的第2反应试剂，一定时间后(例如3分钟后或5分钟后等)测定显色色素在具有最大吸收的波长附近的吸光度。此时，蛋白酶可以包含于第1反应试剂和第2反应试剂中的任意一种试剂中。而且，通过将上述测定的血红蛋白的吸光度和血红蛋白Alc的吸光度与另外的血红蛋白浓度和血红蛋白Alc浓度已知的试样的吸光度进行比较，可以换算出血红蛋白浓度和血红蛋白Alc浓度。通常以血红蛋白Alc浓度对总血红蛋白浓度的比率来表示血红蛋白Alc值，因此，可以用血红蛋白Alc浓度除以总血红蛋白浓度，将血红蛋白Alc浓度换算成比率。
进而，作为本发明以在同一反应槽中连续进行血红蛋白的测定和血红蛋白Alc的测定为特征的方法，优选使用同一波长测定血红蛋白和血红蛋白Alc，然后测定副波长下的值，并从测定波长的值中减去副波长的值，测定副波长的目的是为了扣除其他来自试样的杂质等的影响。作为测定波长可以使用任意波长，优选显色色素具有最大吸收的波长附近，例如使用上述DA67时，作为测定波长，可以在500nm～700nm下测定，优选550nm～660nm，作为副波长，可以在600nm～800nm下测定，优选650nm～750nm。
本发明的试剂可以以液态制品、液态制品的冷冻品、液态制品的冷冻干燥品、或液态制品的干燥品(通过加热干燥和/或风干和/或减压干燥等方法)的剂型来提供，优选剂型为液态制品。
作为成为本发明的测定对象的试样，可以使用任意试样，只要是至少含有血红蛋白或糖化蛋白质的被测溶液即可，作为优选的被测溶液可以举出血液成分，例如血清、血浆、血球、全血或经过分离的红血球等。此外，预先以蛋白酶将经过分离的红血球或糖化血红蛋白进行切断，所得到的蛋白酶处理液(溶血液)也可以用作优选的被测溶液。另外，红血球的分离可以通过公知的离心分离法进行分离，例如在3000转的速度下离心3分钟左右来进行分离。此外，作为经过分离的红血球的溶血方法，用蒸馏水溶血即可。
在本发明的用于测定糖化蛋白质的试剂和方法中，作为测定对象的糖化蛋白质，可以举出例如糖化白蛋白或血红蛋白Alc(也可以包括糖化血红蛋白)，但作为测定对象的糖化蛋白质不受这些例子的任何限制，可以测定任意糖化蛋白质。
试样中除了作为测定目标的糖化蛋白质(例如血红蛋白Alc或糖化白蛋白)以外，含有原本就存在的糖化氨基酸和/或糖化肽，从而影响到测定，在这种情况下，例如在对接受高能量氨基酸输液的患者的试样进行测定时或是对血红蛋白Alc进行测定时，由于分子内存在大量的糖化氨基酸，因此仅凭酶的特异性是无法特异性地测定出作为目标的β链N末端的糖化，在这种情况下，需要将这些目标以外的成分消除后再进行测定。
可以使用作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶来进行消除反应，例如在上述含有原本存在的糖化氨基酸和/或糖化肽而影响测定的情况下，可以使用含有下述第一试剂和第二试剂的试剂：所述第一试剂中含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶，所述第二试剂中含有蛋白酶。
对于含有第一试剂和第二试剂的试剂的组成(所述第一试剂中含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶，所述第二试剂中含有蛋白酶)，可以通过使用不含有用于上述消除反应的试剂的蛋白酶试剂和用于测定糖化氨基酸的试剂来进行混合调制。当第一试剂和第二试剂的混合比不是1∶1，而是例如1∶3、1∶4、或1∶5等情况时，可以在混合时进行适当调整，以使各成分成为能够有效发挥作用的浓度。即，当第一试剂与第二试剂的混合比为1∶4时，可以使第一试剂中混合的成分处于5/4的浓度范围，使第二试剂中混合的成分处于所述第一试剂浓度范围的5倍的浓度范围。
而且，关于含有第一试剂和第二试剂的试剂的组成(所述第一试剂含有蛋白酶、和作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能够将不由血红蛋白的β链N末端产生的糖化氨基酸和/或糖化肽消除的酶；所述第二试剂含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能够将由血红蛋白的β链N末端产生的糖化氨基酸和/或糖化肽检出的酶)，可以通过使用在不含有用于所述消除反应的试剂的蛋白酶试剂中添加下述酶、和用于测定糖化氨基酸的试剂来进行混合制备，所述酶为作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能够将不由血红蛋白的β链N末端产生的糖化氨基酸和/或糖化肽消除的酶，所述酶的添加量为0.5U/ml～1000U/ml，优选为1.0U/ml～500U/ml。当第一试剂和第二试剂的混合比不是1∶1，而是例如1∶3、1∶4、或1∶5等情况时，可以在混合时进行适当调整，以使各成分成为能够有效发挥作用的浓度。即，当第一试剂与第二试剂的混合比为1∶4时，可以使第一试剂中混合的成分处于5/4的浓度范围，使第二试剂中混合的成分调整至所述第一试剂浓度范围的5倍的浓度范围。
此外，由于通过消除反应生成的过氧化氢给检出反应带来不好的影响，因此可以在第一试剂中混合过氧化氢酶和/或过氧化酶来进行分解该过氧化氢。可以混合1U/ml～2000U/ml、优选5U/ml～1000U/ml的过氧化氢酶，也可以混合其他的量。可以向第二试剂中混合0.001％～0.1％、优选0.02％～0.09％的叠氮化钠。此外，可以混合0.1U/ml～100U/ml、优选0.2U/ml～50U/ml的过氧化酶，也可以混合其他的量。
实施例
基于实施例对本发明进行说明，但本发明并不限于如下实施例。
[实施例1]蛋白酶反应促进剂的筛选
<试剂>
1)R-1蛋白质分解试剂
50mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.0
4000U/ml 中性蛋白酶(TOYOBO Co.，Ltd.制造)
1.5mM CaCl2(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
+试验样品
2)R-2糖化氨基酸检出试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
30U/ml KAOD(衍生自棒弯孢(Curvularia clavata)YH923，Asahi Kasei Pharma Co.制造，在特开2004-275013号公报中记载有制造方法)
80U/ml 过氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)
80μM DA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
作为试验样品分别独立使用如下物质。其中，()内的浓度为试剂R1中的最终浓度。
Tween-20(1％)、Brij35(1％)、Triton X-100(1％)、脱氧胆酸(1％)、亚氨基二乙酸(IDA，1mM)、ZnSO4(0.1mM)、AlCl3(0.1mM)、亚铁氰化钾(0.01mM)、山梨糖醇(5％)、葡萄糖(5％)、亚硝酸钠(2mM)、二甲亚砜(10％)、5’-三磷酸腺苷(ATP，2mM)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，2mM)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD，2mM)(以上试剂为Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，椰油酰肌氨酸钠(肌氨酸盐CN-30，1％)、肉豆蔻酰肌氨酸钠(肌氨酸盐MN，1％)、棕榈酰肌氨酸钠(肌氨酸盐PN，1％)、月桂酰甲基丙氨酸钠(丙氨酸盐LN-30，1％)、聚氧乙烯(3)十三烷基醚乙酸钠(ECTD-3NEX，1％)、聚氧乙烯(6)十三烷基醚乙酸钠(ECTD-6NEX，1％)、聚氧乙烯(10)月桂基醚乙酸(AKYPO-RLM100，1％)、磷酸月桂酯(Phosten HLP，1％)、N-月桂酰甲基牛磺酸钠(LMT，1％)、N-硬脂酰甲基牛磺酸钠(SMT，1％)、月桂基硫酸钠(SLS，1％)、聚氧乙烯(2)月桂基醚硫酸三乙醇胺(SBL-2T-36，1％)、聚氧乙烯(4)月桂基醚硫酸三乙醇胺(SBL-4T，1％)、或聚氧乙烯(3)烷基醚硫酸三乙醇胺(SBL-203-27，1％)、月桂基二甲氨基乙酸甜菜碱(AM-301，1％)、单硬脂酸聚氧乙烯(15)甘油酯(TMGS-15，1％)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲氨]丙磺酸内盐(CHAPS，1％)(以上试剂为Nikko Chemicals Co.，Ltd.制造)，WST-3(2mM，Dojindo Laboratories制造)。
<操作方法>
向在37℃下保温的180μl R-1中添加20μl HbAlc测定用试剂标准品(一次校正物质JDS HbAlc Lot2，福祉医疗技术振兴会制造，30倍稀释品)，于37℃引发反应，准确地在5分钟后添加45μl R-2。在660nm下测定添加R-2前的吸光度和添加R-2后5分钟的吸光度。将上述试验样品的蛋白酶反应促进效果的评价结果示出于表1。表1中表示的AH-AL是吸光度AH减去吸光度AL的差，所述吸光度AH从等级为4(9.88％)的一次校正物质得到，所述吸光度AL从等级为2(5.38％)的一次校正物质中得到。此处，只要AH-AL大，就可以判断为具有蛋白酶反应促进效果。尤其是当AH-AL为20以上时，说明具有优异的促进效果。
由表1可知，在以下物质中具有效果：作为N-酰基氨基酸盐的肌氨酸盐CN-30、肌氨酸盐MN、肌氨酸盐PN、丙氨酸盐LN-30、作为烷基醚羧酸盐的ECTD-3NEX、ECTD-6NEX、AKYPO-RLM100、作为N-酰基牛磺酸盐的LMT、SMT、作为聚氧乙烯烷基醚硫酸盐的SBL-2T-36、SBL-4T和SBL-203-27。
由此表明含有乙酸基的化合物或其盐、N-酰基牛磺酸或其盐、或者聚氧乙烯烷基醚硫酸或其盐具有蛋白酶反应促进效果。此外还表明，N-酰基氨基酸或其盐、或者烷基醚羧酸或其盐作为含有乙酸基的化合物或其盐，具有蛋白酶反应促进效果。
由表1的结果可知，作为N-酰基氨基酸或其盐，如下通式(1)所示的化合物或其盐具有蛋白酶反应促进效果；
R1-CO-R2    (1)
通式(1)中，R1表示烷基或烯基，R2表示从氨基酸或氨基酸衍生物中的氨基上除去氢原子后得到的一价基团。其中，优选满足如下条件的化合物：R1为CH3(CH2)n-(此处，n为10～14的整数)或十七碳-8-烯基，和/或R2为标准氨基酸、N-甲基丙氨酸或肌氨酸。
由表1可知，作为烷基醚羧酸或其盐，如下通式(2)所示的化合物具有蛋白酶反应促进效果；
R3-O-(CH2-CH2-O)m-CH2COOM    (2)
通式(2)中，R3表示烷基，m表示3～10的整数，M表示氢原子或与羧酸形成盐的金属。其中，优选R3为CH3(CH2)Q-(此处，Q为10或11)的化合物。另外，使用TPM-PS代替DA67也会得到大致相同的结果。而且，虽然添加糖不会促进蛋白酶反应，但是当使用添加有山梨糖醇的试剂作为对照时，对照的吸光度变化为6.5mAbs，而且，在N-酰基氨基酸、烷基醚羧酸、N-酰基牛磺酸和聚氧乙烯烷基醚硫酸盐中，观察到了大约4.3倍的反应促进效果。另外，当吸光度的变化为10mAbs以上时也能够进行测定，这种情况下，计算出的反应促进效果为1.5倍，因此，能够得到1.5倍以上的反应促进效果就可以。
[表1]
Figure BSA00000232201700361
[实施例2]含有蛋白酶反应促进剂的试剂
<试剂>
血红蛋白测定试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.0
1％ 肌氨酸盐MN
0.05％ 叠氮化钠
在上述试剂中，另外还制备了使用AKYPO-RLM100、SMT、或SBL-2Z-36来代替肌氨酸盐MN的试剂。
[实施例3]含有蛋白酶反应促进剂和蛋白酶的试剂
<试剂>
1)R-1蛋白质分解试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.0
4000U/ml 中性蛋白酶(TOYOBO Co.，Ltd.制造，Toyozyme NEP)
1.5mM CaCl2(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
1％ 丙氨酸盐LN-30
0.05 ％叠氮化钠
使用糖化缬氨酰-组氨酰-亮氨酰-苏氨酰-脯氨酸和糖化缬氨酰-亮氨酰-丝氨酰-脯氨酰-丙氨酸对本试剂的蛋白酶特异性进行确认，结果发现，本试剂对血红蛋白的β链N末端具有较高的特异性，而实际上对α链N末端不起作用。进而，对衍生自嗜热解朊芽孢杆菌(Bacillus thermoproteolyticusRokko)的嗜热菌蛋白酶和高温蛋白酶(thermoase)(Daiwa Kasei K.K.制造)、衍生自芽孢杆菌(Bacillus sp.ASP-842FERM BP-08641)的蛋白酶、以及衍生自溶杆菌属(Lysobacter enzymogenesYK366FERM BP-10010)的蛋白酶也同样地确认了基质特异性，结果发现也可以使用这些蛋白酶以替代中性蛋白酶(TOYOBO Co.，Ltd.制造，Toyozyme NEP)。
[实施例4]含有蛋白酶反应促进剂、蛋白酶、作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶、蛋白酶稳定剂和/或作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的稳定剂的试剂(HbAlc用)
<试剂>
1)R-1蛋白质分解试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.0
4000U/ml 中性蛋白酶(TOYOBO Co.，Ltd.制造)
1.5mM CaCl2(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
1％ 丙氨酸盐LN-30
6％ DMSO
0.05％ 叠氮化钠
2)R-2糖化氨基酸检出试剂
2-1)R-2-A
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
60U/ml KAOD(衍生自棒弯孢YH923，Asahi Kasei Pharma Co.制造，在特开2004-275013号公报中记载有制造方法或衍生自WO2004/104203中记载的侵管新赤壳(Neocosmospora vasinfecta)474菌株)
160U/ml 过氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)
10％ 山梨糖醇
0.1％ 叠氮化钠
2-1)R-2-B
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
160μM DA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
[实施例5]含有蛋白酶反应促进剂、蛋白酶、作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶、蛋白酶稳定剂和/或作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的稳定剂的试剂(HbAlc用)
<试剂>
1)R-1蛋白质分解试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.0
4000U/ml 中性蛋白酶(TOYOBO Co.，Ltd.制造)
1.5mM CaCl2(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
1％ 丙氨酸盐LN-30
6％ DMSO
0.05％ 叠氮化钠
2)R-2糖化氨基酸检出试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
60U/ml KAOD(衍生自棒弯孢YH923，Asahi Kasei Pharma Co.制造，在特开2004-275013号公报中记载有制造方法或衍生自WO2004/104203中记载的侵管新赤壳(Neocosmospora vasinfecta)474菌株)
160U/ml 过氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)
10％ 山梨糖醇
0.1％ 叠氮化钠
160μM DA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
2％ 2-羟丙基-β-环糊精(日本食品加工株式会社制造)
[实施例6]含有第一试剂和第二试剂的试剂(第一试剂含有蛋白酶、和作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能够将不由血红蛋白的β链N末端产生的糖化氨基酸和/或糖化肽消除的酶；第二试剂含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽、能够将由血红蛋白的β链N末端产生的糖化氨基酸和/或糖化肽检出的酶)
<试剂>
1)R-1蛋白质分解试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.0
4000U/ml 中性蛋白酶(TOYOBO Co.，Ltd.制造)
1.5mM CaCl2(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
1％ 丙氨酸盐LN-30
6％ DMSO
0.05％ 叠氮化钠
10U/ml KAOD(Asahi Kasei Pharma Co.制造)
2)R-2糖化氨基酸检出试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
60U/ml KAOD(衍生自棒弯孢YH923，Asahi Kasei Pharma Co.制造，在特开2004-275013号公报中记载有制造方法)
160U/ml 过氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)
10％ 山梨糖醇
0.1％ 叠氮化钠
160μM DA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
2％ 2-羟丙基-β-环糊精(日本食品加工株式会社制造)
[实施例7]含有第一试剂和第二试剂的试剂(第一试剂含有作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶，第二试剂含有蛋白酶)
<试剂>
1)R-1蛋白质分解试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.0
12U/ml KAOD(衍生自棒弯孢YH923，Asahi Kasei Pharma Co.制造，在特开2004-275013号公报中记载有制造方法)
32U/ml 过氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)
6％ 山梨糖醇
0.05％ 叠氮化钠
32μM DA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
2％ 2-羟丙基-β-环糊精(日本食品加工株式会社制造)
1％ 丙氨酸盐LN-30
2)R-2糖化氨基酸检出试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
20000U/ml 中性蛋白酶(TOYOBO Co.，Ltd.制造)
1.5mM CaCl2(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
30％ DMSO
0.05％ 叠氮化钠
[实施例8]含有蛋白酶反应促进剂、蛋白酶、作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶、蛋白酶稳定剂和/或作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶的稳定剂的试剂(GA用)
1)R-1蛋白质分解试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.0
8mM 4-AA
10％ DMSO
10000U/ml 衍生自地衣芽孢杆菌的蛋白酶(Sigma Aldrich JapanK.K.制造)(所使用的是经过DEAE-琼脂糖树脂提纯并脱盐的蛋白酶)
0.001675％ BCP(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
0.05％ 叠氮化钠
0.5％ Tween20
(±1％ 丙氨酸盐LN-30)
2)R-2糖化氨基酸检出试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
5％ 山梨糖醇
20U/ml KAOD(Asahi Kasei Pharma Co.制造)
5U/ml 过氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)
10mM N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐二氢化物(TOOS，Dojindo Laboratories制造)
0.05％ 叠氮化钠
[实施例9]血红蛋白的测定和试剂的稳定性
使用实施例2的试剂对血红蛋白浓度已知的标准品进行测定。
<血红蛋白测定试剂的反应步骤>
使用自动分析计(日立7170S型自动分析计，日立制作所制造)进行测定。向20μl试样中添加180μl试剂，测定660nm下的吸光度变化。使用水作为对照，5分钟后计算试样和水的吸光度之差。使用经过5级稀释的血红蛋白标准品作为试样。
结果示于图1。如图1所示，使用本发明的蛋白酶反应促进剂(肌氨酸盐MN、AKYPO-RLM100、SMT和SBL-2Z-36)能够定量血红蛋白。而且，于37℃对使用肌氨酸盐MN作为蛋白酶反应促进剂的试剂进行了4天的保存试验。将HbAlc测定用标准物质(一次校正物质JDS HbAlcLot2，福祉医疗技术振兴会制造，等级1，血红蛋白浓度为135g/L)稀释30倍，以此作为校正物质对5.5g/dl血红蛋白标准品进行测定，血红蛋白的测定值在保存试验前为54mAbs(4.5g/L)，在保存试验后为50mAbs(4.6g/L)。由这些结果可以推断本试剂在冷藏下能保持6个月以上的稳定状态。
[实施例10]血红蛋白Alc的测定和血红蛋白Alc比率的计算
使用实施例4、5的试剂对试样进行了测定。
<试样>
1)HbAlc测定用试剂标准品(一次校正物质JDS HbAlc Lot2，福祉医疗技术振兴会制造)，30倍稀释物
2)向9容积的一次校正物质JDS HbAlc Lot2的30倍稀释物中添加1容积的乳糜(2000度，干涉检查，Sysmex Co.制造)而得到的含乳糜血红蛋白
<R-2试剂的制备>在使用实施例4的试剂时，在使用前将R-2-A试剂和R-2-B试剂以1∶1的比例进行混合。实施例5的试剂直接使用。
<血红蛋白Alc测定试剂的反应步骤>
使用自动分析计(日立7170S型自动分析计，日立制作所制造)进行测定。向20μl试样中添加180μl试剂R-1，于37℃保温，然后测定660nm的主波长和700nm的副波长下的吸光度变化。5分钟后添加45μl试剂R-2，于37℃保温，测定660nm的主波长和700nm的副波长下的吸光度变化。通过使用HbAlc测定用标准物质(一次校正物质JDS HbAlc Lot2，福祉医疗技术振兴会制造，等级1；血红蛋白浓度为135g/L，HbAlc值为4.04％；和等级5；血红蛋白浓度为132g/L，HbAlc值为12.63％)作为校正物质，将得到的值换算为测定值。通过在即将添加R-2试剂之前的测光来定量血红蛋白，通过在添加R-2试剂5分钟之后的测光来定量HbAlc。
血红蛋白和HbAlc的校准曲线于图2和图3中示出。由HbAlc测定用标准物质的HbAlc％和HbAlc浓度计算出HbAlc浓度。由图2可知，使用本发明的蛋白酶反应促进剂可以对血红蛋白Alc进行定量。此外，由图3可知，也可以同时对血红蛋白进行定量。由此表明，通过利用本发明可以在同一反应槽中连续测定血红蛋白和HbAlc。
而且，在含乳糜血红蛋白的测定中，在不减去副波长的情况下，在试样和R-1混合时所算出的吸光度较高，对于一次校正物质(JDS HbAlcLot2，福祉医疗技术振兴会制造，等级1，HbAlc值为4.04％)测定5次后的重现性，其CV值为3.5％，另一方面，对于在减去副波长的情况下的重现性，其CV值为1.5％，准确性得到了提高。由此表明，在同一波长下测定血红蛋白和HbAlc，可以通过减去副波长来准确地测定HbAlc。并且，使用衍生自棒弯孢YH923(Asahi Kasei Pharma Co.制造，在特开2004-275013号公报中记载有制造方法)或衍生自WO 2004/104203中记载的侵管新赤壳(Neocosmospora vasinfecta)474菌株的酮胺氧化酶时，也得到了同样的结果。
此外，将本试剂R-1和R-2-A在液体状态下于37℃保存4天，对其稳定性进行了评价。将实施例4的试剂R-2-B在冷藏下保存，在即将使用前混合R-2-A和R-2-B。测定的结果如下：对于等级为3的一次校正物质JDS HbAlc Lot2(血红蛋白浓度为145g/L，HbAlc值为7.32％)的30倍稀释物中的血红蛋白定量值，在保存试验前，实施例4的试剂为58mAbs、4.8g/L，实施例5的试剂为55mAbs、4.8g/L，在保存试验后，实施例4的试剂为56mAbs、4.7g/L，实施例5的试剂为54mAbs、4.7g/L。另外，对于HbAlc的计算值，在保存试验前，实施例4的试剂为7.5％，实施例5的试剂为7.6％；在保存试验后，实施例4的试剂为7.6％，实施例5的试剂为7.5％。此外，在冷藏保存3个月的数据中也未发现测定值中出现差异。由这些结果可以推断，实施例4的试剂R-1、R-2-A、和实施例5的试剂在冷藏下能保持6个月以上的稳定状态。一般来说，无色型色素的反应性虽高但不稳定，在实施例4的试剂中，需要将无色型色素与其他成分分开保存，但是由于添加环糊精而使色素变得稳定，从而能够使之与其他成分共存于同一个容器中。
并且，在实施例4和实施例5的试剂中使用了具有如下特征的酶：作为蛋白酶，是从糖化血红蛋白或其片段的糖化后的β链N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽的蛋白酶，而不是实质性地从糖化血红蛋白或其片段的糖化后的α链N末端切掉糖化氨基酸和/或糖化肽的蛋白酶，以该蛋白酶作为作用于糖化氨基酸和/或糖化肽的酶，该蛋白酶对糖化缬氨酰-组氨酸的作用高于对糖化缬氨酰-亮氨酸的作用。由于等级为3的JDSHbAlc Lot2的定量值与表示值一致，所以表明血红蛋白Alc得到了准确的测定。
[实施例11]引入了消除体系(elimination system)的试剂的性能
<试剂>
使用实施例6、7的试剂。
<试样>
向9容积的HbAlc测定用试剂标准品(一次校正物质JDS HbAlcLot2，等级3(HbAlc值为7.32％)，福祉医疗技术振兴会制造)的30倍稀释物中添加1容积的糖化氨基酸，以此作为试样。并且，作为对照物使用以蒸馏水代替糖化氨基酸的上述稀释物。作为添加的糖化氨基酸的浓度，使用2mM的糖化Z-赖氨酸水溶液(FZL)和2mM的糖化缬氨酸水溶液(FV)(糖化氨基酸以Hashiba等人的方法(Hashiba H，J.Agric.Food Chem.24：70，1976)来合成和提纯)。
<反应步骤>
按照与实施例10相同的步骤测定试样。
测定的结果中，等级为3的一次校正物质JDS HbAlc Lot2(HbAlc值为7.32％)的HbAlc定量值为：在使用实施例6的试剂的情况下，对照物、添加FZL的试样和添加FV的试样的依次为7.2％、7.3％和7.1％，在使用实施例7的试剂的情况下，依次为7.3％、7.4％和7.1％，确认了进行了消除反应，测定到了准确的值。
[实施例12]糖化白蛋白的测定、糖化白蛋白比率的计算和试剂的稳定性
<糖化白蛋白测定试剂的反应步骤>
使用实施例5的试剂。向240μl于37℃保温后的R-1中添加8μl对照血清H(BML Inc.制造，根据用法制备并以蒸馏水进行5级稀释)，测定其在546nm的主波长(副波长为700nm)下的吸光度。于37℃开始反应，准确地在5分钟后添加80μl的R-2。测定添加R-2前和添加R-25分钟后的吸光度。并且使用蒸馏水代替基质溶液来测定，以此作为空白，用由对照基质溶液得到的吸光度变化减去空白试样的吸光度变化，求出ΔA0。同时对Lucica GA用校正物质(Asahi Kasei Pharma Co.制造)进行测定并比较吸光度，由此进行值的换算。用刚刚添加试样之后的吸光度减去即将添加R-2之前的吸光度，根据得到的吸光度差来求出白蛋白的测定值。用添加R-25分钟之后的吸光度减去即将添加R-2之前的吸光度，根据得到的吸光度差来求出糖化白蛋白的测定值。
在不含有蛋白酶反应促进剂(丙氨酸盐LN-30)的情况下，蛋白酶的反应慢，对照血清(BML Inc.制造，未稀释)的GA测定的灵敏度为32mAbs，该灵敏度是含有蛋白酶反应促进剂时(48mAbs)的66％。反应速率加快了1.5倍。
而且，经过5级稀释的对照血清的测定值于图4示出。由图4可知，使用本试剂可以在同一反应槽中、在同一波长下，对白蛋白和糖化白蛋白进行定量，能够良好地测定出糖化白蛋白值(％)。
进而，将本试剂在液体状态下于37℃保存4天，作为结果，对照血清(BML Inc.制造，未稀释)的测定值如下：GA测定的灵敏度为48mAbs，白蛋白测定的灵敏度为60mAbs、GA值为44.8％；而保存后，GA测定的灵敏度为46mAbs，白蛋白测定的灵敏度为61mAbs、GA值为44.5％。由这些结果可以推断，本试剂在冷藏下能保持6个月以上的稳定状态。
[实施例13]用于酶反应检出的色素的稳定剂的筛选
<试剂>
1)R-1含色素试剂
200mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
200μM DA-64、DA-67或0.04％的MBTH(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
+试验样品
2)R-2含过氧化酶试剂
200mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
10U/ml 过氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)
0.04％ TOOS(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造，但只在R-1中使用MBTH的情况下添加)
作为试验样品使用如下物质。其中，( )内的浓度为R-1中的最终浓度。
Tween-20(1％)、Brij35(1％)、Triton X-100(1％)、脱氧胆酸(1％)、亚氨基二乙酸(IDA，1mM)、ZnSO4(0.1mM)、AlCl3(0.1mM)、亚铁氰化钾(0.1mM)、山梨糖醇(5％)、葡萄糖(5％)、亚硝酸钠(2mM)、二甲亚砜(DMSO，10％)(以上试剂为Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，2-羟丙基-β-环糊精(2HPβCD，0.5％，2％，5％)、甲基-β-环糊精(MβCD，0.5％，2％，5％)(以上试剂为日本食品加工株式会社制造)。
<操作方法>
将在37℃下保温的500μl R-1和500μl R-2混合，于37℃加热2分钟，测定吸光度(A0)，添加10μl 500μM的过氧化氢或蒸馏水。于37℃加热，准确地在添加过氧化氢5分钟后测定吸光度(A1)，计算吸光度的变化ΔA(A1-A0)。在使用DA64作为色素时，在750nm下测定吸光度，在使用DA67作为色素时，在660nm下测定吸光度，在使用4-AA-TOOS作为色素时，在570nm下测定吸光度。
在制备试剂后立即将其分别于37℃保存2天后、于37℃保存9天，然后，对蒸馏水的空白的灵敏度以及过氧化氢的灵敏度进行测定。
表2-1和表2-2表示空白和用于酶反应检出的色素在保存上的关系。由表2-1和表2-2可知，金属盐和2-羟丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精对空白具有抑制效果。此外，表3表示测定500μM的过氧化氢时，该色素与金属盐以及该色素与环糊精浓度在保存上的关系。应用金属盐时，从表2-2中未观察到空白的上升，但是，从表3可知，过氧化氢本身的灵敏度没有表现出来。此外，由表3可以看出，浓度为0.5％以上的环糊精对该色素具有稳定效果。
[表2-1]                       单位Abs
[表2-2]                    单位Abs
Figure BSA00000232201700481
[表3]
Figure BSA00000232201700482
[实施例14]过氧化氢酶的添加对含有环糊精和用于酶反应检出的色素的试剂的影响效果
<试剂>
1)R-1含色素试剂
200mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
200μM DA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
2％ 2-羟丙基-β-环糊精(日本食品加工株式会社制造)
±500U/ml过氧化氢酶(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
2)R-2含过氧化酶试剂
200mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
10U/ml 过氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)
0.05％ 叠氮化钠(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
<操作方法>
操作方法与实施例13相同。在制备试剂后立即将其分别于37℃保存2天后、于37℃保存9天，然后对蒸馏水的空白的灵敏度以及过氧化氢的灵敏度进行测定。结果于表4示出。由表4可知，由于添加了过氧化氢酶，使保存后的空白显著降低，用于酶反应检出的色素的稳定性得到上升。
[表4]
Figure BSA00000232201700491
[实施例15]缓冲溶液的浓度对含有环糊精和用于酶反应检出的色素的试剂的影响效果
<试剂>
1)R-1含色素试剂
50mM、80mM、100mM、200mM Tris缓冲液(Wako PureChemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
10μM DA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
2％ 2-羟丙基-β-环糊精(日本食品加工株式会社制造)
4000U/ml Toyozyme NEP(TOYOBO Co.，Ltd.制造)
500U/ml 过氧化氢酶(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
1％ 肌氨酸盐LN(Nikko Chemicals Co.，Ltd.制造)
2)R-2含过氧化酶试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
78U/ml 过氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)
26U/ml 衍生自棒弯孢YH923的KAOD(Asahi Kasei PharmaCo.制造，在特开2004-275013号公报中记载有制造方法)
0.05％ 叠氮化钠(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
<操作方法>
使用自动分析计(日立7170S型自动分析计，日立制作所制造)进行测定。向20μl试样中添加180μl试剂R-1，于37℃保温，然后测定660nm的主波长和700nm的副波长下的吸光度变化。5分钟后添加45μl试剂R-2，于37℃保温，测定660nm的主波长和700nm的副波长下的吸光度变化。另外，试样中使用HbAlc测定用标准物质(一次校正物质JDSHbAl c Lot2，福祉医疗技术振兴会制造，等级1；135g/L，4.04％和等级5；132g/L，12.63％)的30倍稀释物。
在制备试剂后立即将其分别于37℃保存2天、4天和9天，然后测定并计算等级5的灵敏度～等级1的灵敏度。
结果于表5示出。由表5可知，将缓冲剂的浓度控制在80mM以下时，用于酶反应检出的色素的稳定性显著提高。
[表5]
[实施例16]含有环糊精和用于酶反应检出的色素的试剂(HbAlc用)
<试剂>
1)R-1含色素试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
10μM DA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
2％ 2-羟丙基-β-环糊精(日本食品加工株式会社制造)
4000U/ml Toyozyme NEP(TOYOBO Co.，Ltd.制造)
500U/ml 过氧化氢酶(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
1％ 肌氨酸盐LN(Nikko Chemicals Co.，Ltd.制造)
2)R-2含过氧化酶试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
78U/ml 过氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)
26U/ml 衍生自棒弯孢YH923的KAOD(Asahi Kasei Pharma Co.制造，在特开2004-275013号公报中记载有制造方法)
0.05％ 叠氮化钠(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
[实施例17]含有环糊精和用于酶反应检出的色素的试剂(GA用)
<试剂>
1)R-1含色素试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.0
10μM DA-67(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
2％ 2-羟丙基-β-环糊精(日本食品加工株式会社制造)
10％ DMSO
10000U/ml 衍生自地衣芽孢杆菌的蛋白酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)(所使用的蛋白酶是经过DEAE-琼脂糖树脂提纯并脱盐的蛋白酶)
500U/ml过 氧化氢酶(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)
2)R-2糖化氨基酸检出试剂
50mM Tris缓冲液(Wako Pure Chemical Industries，Inc.制造)，pH为7.5
5％ 山梨糖醇
20U/ml KAOD(Asahi Kasei Pharma Co.制造)
5U/ml 过氧化酶(Sigma Aldrich Japan K.K.制造)
0.05％ 叠氮化钠
[实施例18]血红蛋白Alc的测定、血红蛋白Alc比率的计算和试剂的稳定性
使用实施例16的试剂对试样进行了测定。
<试样>
1)HbAlc测定用试剂标准品(一次校正物质JDS HbAlc Lot2，福祉医疗技术振兴会制造)的30倍稀释物
<血红蛋白Alc测定试剂的反应步骤>
使用自动分析计(日立7170S型自动分析计，日立制作所制造)进行测定。向20μl试样中添加180μl试剂R-1，于37℃保温。在添加试样5分钟后，添加45μl试剂R-2，于37℃保温5分钟。试样在即将添加试剂R-2之前(A1)和添加试剂R-25分钟后(A2)测定660nm的主波长和700nm的副波长下的吸光度变化。此外，以HbAlc测定用标准物质(一次校正物质JDS HbAlc Lot2，福祉医疗技术振兴会制造，等级1；血红蛋白浓度为135g/L，HbAlc值为4.04％和等级5；血红蛋白浓度为132g/L，HbAlc值为12.63％)作为校正物质，将得到的值换算为测定值。通过使用A1的计算来定量血红蛋白，根据使用A2-A1的值的计算来定量HbAlc。
血红蛋白和HbAlc的校准曲线于图5和图6中示出。由图5和图6可知，利用本发明的用于酶反应检出的色素的稳定化方法，能够对血红蛋白Alc和血红蛋白进行定量。显然，由于能够对血红蛋白Alc和血红蛋白进行定量，因此，可以计算出血红蛋白Alc比率。
进而，将本试剂在液体状态下于37℃保存4天，其结果如下：等级为3的一次校正物质JDS HbAlc Lot2(血红蛋白浓度为145g/L，HbAlc值为7.32％)的30倍稀释物的血红蛋白定量值在保存试验前为40mAbs、4.8g/L，在保存试验后为38mAbs、4.7g/L。而且HbAlc的计算值在保存试验前为7.2％，在保存试验后为7.3％。此外，在冷藏保存3个月的数据中也未发现测定值中出现差异。由这些结果可以推断出，本试剂在冷藏下能保持6个月以上的稳定状态。
[实施例19]糖化白蛋白的测定、糖化白蛋白比率的计算和试剂的稳定性
<糖化白蛋白测定试剂的反应步骤>
使用实施例17的试剂。向240μl于37℃保温后的R-1中添加8μl对照血清H(BML Inc.制造，根据用法制备并以蒸馏水进行5级稀释)，于37℃开始反应，准确地在5分钟后添加80μl R-2。在660nm的主波长和70nm的副波长下，测定添加R-2前和添加R-25分钟后的吸光度。并且使用蒸馏水代替基质溶液来测定，以此作为空白，用由对照基质溶液得到的吸光度变化减去空白试样的吸光度变化，求出ΔA0。同时对LucicaGA用校正物质(Asahi Kasei Pharma Co.制造)进行测定并比较吸光度，由此进行值的换算。使用Aquaauto Kaonos ALB试剂(Kainos，Inc.制造)并按照该试剂的用量来进行白蛋白的测定。经过5级稀释的对照血清的测定值于图7示出。由图7可知，使用本试剂可以对白蛋白和糖化白蛋白进行定量，能够良好地测定出糖化白蛋白值(％)。
进而将本试剂在液体状态下于37℃保存4天，作为结果，对照血清L(BML Inc.制造，未稀释)的测定值是，GA测定的灵敏度为150mAbs，GA值为18.3％；而保存后，GA测定的灵敏度为146mAbs，GA值为18.2％。由这些结果可以推断出，本试剂在冷藏下能保持6个月以上的稳定状态。
工业实用性
本发明的测定用试剂和测定方法可以用于临床检查。

Claims (15)

1.一种色素稳定剂，该色素用于酶反应的检出，所述色素稳定剂的特征在于含有环糊精。
2.如权利要求1所述的稳定剂，其特征是，所述环糊精为β-环糊精类。
3.如权利要求2所述的稳定剂，其特征是，所述β-环糊精类为甲基-β-环糊精或2-羟丙基-β-环糊精。
4.如权利要求1～3任意一项所述的稳定剂，其特征是，在酶反应的检出中使用的色素是通过过氧化酶的作用而显色的色素。
5.如权利要求4所述的稳定剂，其特征是，通过过氧化酶的作用而显色的色素是无色型色素。
6.一种试剂，所述试剂含有权利要求1～5任意一项所述的稳定剂和在酶反应的检出中使用的色素。
7.如权利要求6所述的试剂，其特征是，所述试剂还含有过氧化氢酶。
8.如权利要求6或7所述的试剂，其特征是，所述试剂还含有测定时浓度为80mM以下的缓冲剂。
9.如权利要求6～8任意一项所述的试剂，其特征是，所述试剂还含有蛋白酶。
10.如权利要求9所述的试剂，其特征是，所述试剂还含有蛋白酶反应促进剂。
11.如权利要求6～10任意一项所述的试剂，其特征是，在测定时，环糊精的浓度为0.5重量％以上。
12.如权利要求6～11任意一项所述的试剂，其特征是，所述试剂为液态，并且在冷藏下能保持6个月以上的稳定状态。
13.一种色素的稳定化方法，所述色素用于酶反应的检出，所述稳定化方法的特征是，利用权利要求1～5任意一项所述的稳定剂。
14.一种糖化蛋白质或糖化蛋白质比率的测定方法，其特征是，所述方法利用权利要求6～12任意一项所述的试剂。
15.如权利要求14所述的方法，其特征是，所述糖化蛋白质是糖化白蛋白、糖化血红蛋白、或血红蛋白Alc，所述糖化蛋白质比率是糖化白蛋白值、糖化血红蛋白值、或血红蛋白Alc值。
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