“PEPTÍDEO AMIDA OPIÓIDE SINTÉTICO OU UM SAL
FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEL DO MESMO, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”. A presente invenção refere-se geralmente a peptídeos opióides sintéticos, particularmente a peptídeos opióides que são agonistas de receptor kappa altamente seletivos e mais particularmente a estes agonistas que (a) não penetram no cérebro e (b) demonstram uma atividade antinociceptiva de longa duração in vivo.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Os receptores de opióides kappa (KORs) estão presentes no cérebro, medula espinhal, e nos terminais centrais e periféricos e corpos celulares dos aferentes sensoriais primários (somáticos e viscerais), assim como em células imunes. As moléculas que ativam KORs são comumente referidas como agonistas kappa. A ativação de KORs que estão localizados no cérebro foi mostrada como produzindo um efeito analgésico. Esta descoberta leva a tentativas de desenvolver agonistas kappa, não peptídicos, penetrantes no cérebro, para uso como analgésicos originais que seriam isentos de efeitos laterais indesejados (constipação, depressão respiratória, dependência e adicção) de análogos morfinicos que atuam em receptores opióides mu (MORs). A atividade analgésica, assim como a falta de "efeitos laterais "semelhantes a opióide-mu, desta classe de compostos, foi estabelecida tanto em animais como em humanos. No entanto, o desenvolvimento de agonistas kappa sistêmicos foi descontinuado porque eles também foram demonstrados como induzindo efeitos laterais específicos como diurese, sedação e disforia, mediada através dos receptores kappa localizados no cérebro.
Além de KOR's supraespinhais, os KORs localizados ou na periferia ou na medula espinha também podem produzir analgesia. No entanto, nem KORs periféricos, nem espinhais, foram associados com qualquer um dos efeitos laterais de agonistas kappa sistêmicos. Assim, desde que seja possível criar agonistas opióides de receptor kappa que não entrem no cérebro (seguindo administração periférica ou espinhal), seria possível obter analgésicos seguros e originais.
Os agonistas kappa produzem antinocicepção periférica em modelos de hiperalgesia intestinal, assim como colônica, induzida por inflamação local e suave, e síndrome do intestino irritável (IBS), que inclui dor visceral exagerada devido a hipersensibilidade visceral possivelmente ligada a inflamação local, é também um alvo para o agonista kappa periférico. Além do trato gastrointestinal, outras vísceras mostrando uma condição patológica que envolve ativação e/ou sensibilização (isto é, inflamação local), de aferentes sensoriais primários são também considerados como representando alvos apropriados para este opióide de receptor kappa. Os agonistas kappa também bloqueiam a inflamação neurogênica em tecidos somáticos por inibição da liberação de substância P de aferentes sensoriais primários e são também conhecidos como atuando no sistema imune e tem primariamente um papel inibitório em células imunes.
Os peptídeos que não entram no cérebro, que demonstram alta afinidade para o KOR versus o MOR, que tem alta potência e eficácia, e que demonstram longa duração de ação in vivo são particularmente desejados. A patente US 5 610 271 descreve tetra-peptídeos contendo quatro resíduos de aminoácidos D-isômero que ligam a KORs, mas estes peptídeos não demonstram todas as características desejáveis especificadas acima.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Um gênero de peptídeos foi descoberto que demonstra alta seletividade para o KOR e longa duração de ação in vivo e que não demonstra qualquer penetração no cérebro significante. Estes peptídeos compreendem uma sequência de quatro aminoácidos de D-isômero tendo um término C que é ou uma amina mono- ou di-substituída. Estes compostos tem a seguinte fórmula geral: H-Xaa, -Xaa2-Xaa3-Xaa4-amida substituída em que Xaa, é (A)D-Phe, (C aMe)D-Phe, D-Tyr, D-Tic ou D- Ala (ciclopentila ou tienila), com A sendo H, N02, F, Cl ou CH3, Xaa2 é (A')D- Phe, D-INal, D-2NA1, D-Tyr, ou D-Trp, com A' sendo A ou 3,4C12; Xaa3 é D- Nle, (B)D-Leu, D-Hle, D-Met, D-Val, D-Phe ou D-Ala (ciclopentila) com B sendo H ou C aMe; Xaa4 é D-Arg, D-Har, D-nArg, D-Lys, D-Ily, D-Arg(Et2), D-Har(Et2), D-Amf, D-Gmf, D-Dbu, D-Om ou D-Ior. As amidas preferidas incluem etilamida, morfolídeo, tiomorfolídeo, 4-ppicolilamida, piperazida, propilamida, ciclopropilamida, dietilamida e benzilamida substituída.
Em um aspecto particular, a invenção provê amida de peptídeo opióide sintético ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tendo uma afinidade para o receptor de opióide kappa que tem pelo menos 1.000 vezes sua afinidade para o receptor de opióide mu e que demonstra longa duração de ação quando administrado in vivo, cujo peptídeo tem a fórmula: H-Xaa, -Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q em que Xaai é (A)D-Phe, (C aMe)D-Phe, D-Tyr, D-Tic ou D- Ala (ciclopentila ou tienila), com A sendo H, N02, F, Cl ou CH3, Xaa2 é (A')D- Phe, D-INal, D-2NA1, D-Tyr, ou D-Trp, com A' sendo A ou 3,4C12; Xaa3 é D- Nle, (B)D-Leu, D-Hle, D-Met, D-Val, D-Phe ou D-Ala (ciclopentila) com B sendo H ou C aMe; Xaa4 é D-Arg, D-Har, D-nArg, D-Lys, D-Ily, D-Arg(Et2), D-Har(Et2), D-Amf, D-Gmf, D-Dbu, D-Om ou D-Ior; e Q é NR,R2, morfolinila, tiomorfolinila, (C) piperidinila, piperazinila, 4-mono-ou 4,4-di- substituída piperazinila, ou e-lisila, com R, sendo alquila inferior, alquila inferior substituída, benzila, benzila substituída, aminociclohexila, 2-tiazolila, 2-picolila, 3-picolila, 4-picolila, um 0-(acilamino)-polimetileno ou um grupo poli( oxietileno), e R2 sendo H ou alquila inferior, e C sendo H, 4-hidroxi ou 4- 0X0.
Em outro aspecto, a invenção inclui o uso destes compostos no tratamento de pacientes humanos sofrendo de dor visceral e outras, instabilidade da bexiga ou outros, ou IBD ou doenças autoimunes, assim como em tratamento similar de mamíferos não humanos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS A nomenclatura usada para definir os peptídeos é a especificada por Schroder & Lubke, The Peptides, Academic Press, 1965, em que de acordo com a representação convencional, o N-término aparece à esquerda eoC- término à direita. Onde um resíduo de aminoácido tem formas isoméricas, é a forma L-isômero do aminoácido que está sendo representada aqui, salvo indicado em contrário expressamente.
Como indicado acima, a invenção provê peptídeos que são seletivos para o KOR e não somente demonstram uma afinidade forte para o KOR, mas demonstram longa duração de bioatividade in vivo. Estes peptídeos opióides seletivos kappa tem pelo menos 1.000 vezes maior afinidade de ligação para KOR do que o MOR, com muitos compostos tendo pelo menos 10.000 vezes maior afinidade, e com alguns compostos demonstrando uma afinidade de 20.000 ou mais vezes maior. No entanto, para muitas indicações, é importante que, junto com esta seletividade elevada, os agonistas kappa devem demonstrar tanto uma falta de penetração no cérebro significante como uma duração prolongada de atividade antinociceptiva in vivo. Assim, além da seletividade acima descrita, os compostos preferidos não demonstram significante penetração no cérebro enquanto conservando atividade substancial durante pelo menos cerca de uma hora, com os compostos mais preferidos permanecendo significativamente ativos durante pelo menos cerca de 2 h, e com os compostos mais preferidos demonstrando esta atividade significante durante três horas ou mais.
As abreviaturas especificadas abaixo são usadas em todo deste documento. Por D-Nle, significa D-norleucina, e D-Hle representa D- homoleucina. D-Har representa D-homoarginina, e D-nArg representa D- norarginina que é um carbono mais curto do que D-Arg. Por D-Nal, significa- se o D-isômero de alanina que é substituído por naftila no β-carbono.
Preferivelmente, D-2Nal é empregado, isto é, a fixação a naftaleno está na posição 2 na estrutura do anel, no entanto, D-INal também pode ser usado. D- Cpa e D-Fpa são usados para representar, respectivamente, cloro-D-Phe e fluoro-D-Phe, com D-4Cpa, D-2Fpa, D-3Fpa, e D-4Fpa sendo preferidos. D- Npa significa nitro-D-Phe, e D-Mpa é usado para representar metil-D-Phe. D- 3,4Cpa significa 3,4-dicloro-D-Phe. D-Acp representa D-Ala (ciclopentila). D- Om representa D-omitina, e D-Dbu representa ácido alfa, gama-diamino butírico. CML representa C α metil Leu, e CMP representa C aMe Phe. Por D- 4Amf significa-se D-4 (NH2CH2)Phe, e por D-Gmf significa-se D-Amf (amidino) que representa D-Phe onde a posição 4 é substituída com CH2NHC(NH)NH2. POr D-Tic, significa-se ácido D-1,2,3,4- tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico. Em Ala (Thi), Thi representa o grupo tienila, que é preferivelmente ligado em sua posição 2 a alanina, apesar de 3- tienila ser um equivalente. Por Ily e Ior significa-se respectivamente isopropil Lys e isopropil Om onde o grupo amino de cadeia lateral é alquilado com isopropila.
Por alquila inferior, significa-se C, a C6, e inclui cicloalquila, e C,-C4 são preferidos incluindo ciclopropila e ciclobutila. Me, Et, Pr, Ipr, Bu, Pn e Bzl são usados para representar metila, etila, propila, isopropila, butila, pentila e benzila. Por Cyp, significa-se ciclopropila e por Cyb significa-se ciclobutila. Apesar da ligação ser preferivelmente a uma extremidade de uma cadeia alquila, a ligação pode ser em outro ponto na cadeia, por exemplo 3- pentila que pode também ser referida como etilpropila. Ahx representa 6- amino-hexila, isto é (CH2)6-NH2. 4Acx é usado para representar 4- aminociclohexila, e hEt é usado para representar hidroxietila, isto é- CH2CH2OH. Benzila substituída inclui 4Nbz e 4Abz, que representa 4- nitrobenzila, e 4-aminobenzila, e Aeb é usado para representar 4-(2-amino-2- carboxietila) benzila, isto é, Por 2-, 3-e 4-picolila (2Pic, 3Pic e 4Pic), significa-se grupos metilpiridina com a fixação sendo via um metileno na posição 2-, 3-ou 4. Por Mor, significa-se morfolinila, isto é, Por Pip significa-se piperidinil (piperidil), e por 4-HyP e OxP significa-se 4-hidroxipiperidin-l-ila e 4-oxo-piperidin-l-ila. Por Ppz, significa- se piperzinila. Ecp representa 4-etilcarbamoil-piperazin-l-ila; Pcp representa 4- fenilcarbamoilpiperazin-l-ila. Porções de amônio quaternário, como 4,4- dimetil piperazin-l-ila (Dmp) ou outras substituições de alquila di-inferior também podem ser usadas.
Por 2Tzl significa-se 2-tiazolila, isto é Por Ely significa-se ε-lisila, onde o grupo amina de cadeia lateral de L-lisina é conectado por uma ligação amida para o C-término.
Como indicado acima, R, pode ser um grupo co-(acilamino) polimetileno ou um grupo poli(oxietileno) como Aao, Aoo, Hoh, Ghx ou Gao.
Aao representa 8-(acetilamino)-3,6-dioxaoct-l-ila, isto é CH2CH2-0-CH2CH2- 0-CH2CH2-NH-Ac. Aoo representa 8-amino-3,6-dioxaoct-l-ila, isto é CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2-NH2. Hoh representa 6-(l-hidroorotilamino)- hex-l-ila, isto é, (CH2)6NH-(L-hidroorotil); ácido L-hidroorótico é C4N2H5(0)2-C00H. Ghx representa 6-(D-gluconilamino)-hexila, isto é (CH2)6- NH-CO-(CHOH)4-CH2OH. Gao representa 6-(D-gluconilamino)3,6-dioxaoct- 1-ila, isto é, CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2-NH-C0 (CHOH)4-CH2OH. D-Phe ou D-Phe substituído é preferido na posição 1. O anel fenila pode ser substituído nas posições 2-, 3-e/ou 4, e comumente substituições por cloro ou flúor, na posição 2 ou 4, são preferidas. O átomo de carbono α também pode ser metilado. Outros resíduos equivalentes que se parecem com D-Phe também podem ser usados, e estes incluem D-Ala (tienila), D-Ala (ciclopentila), D-Tyr e D-Tic. O resíduo na posição 2 é também preferivelmente D-Phe ou D-Phe substituído com estas substituições preferivelmente incluindo um substituinte na posição 4 carbono do anel fenila ou as posições 3-e 4. Altemativamente, D-alanina substituída por naftila pode ser usada, assim como D-Trp e D-Tyr. A posição 3 é preferivelmente ocupada por um resíduo como D-Nle, D-Leu, D-CML, D-Hle, D-Met ou D-Val; no entanto, D-Ala (ciclopentila) ou D-Phe também podem ser usados. D-Arg (que pode ser substituído com dietila) e D-om (que pode ser alquilado em seu grupo delta-amino, ou com isopropila) são geralmente preferidos para a posição 4, no entanto, D-nArg e outros resíduos equivalentes podem ser usados, como D-Lys (que pode ser também alquilado em seu grupo epsilon-amino), e D-Har (que pode ser substituído com dietila)> Além disso, D-Gmf, D-Dbu, D-4Amf, e D- His também podem ser usados.
Apesar de se poder esperar que boa duração de ação biológica possa provir do emprego de uma sequência de 4 aminoácidos D-isômero, foi surpreendente verificar que a duração de ação foi geralmente bem curta para a amida não substituída e que uma longa duração de ação foi obtida somente através da incorporação de uma amida substituída no C-término. As substituições únicas podem estar na forma de etila, metila, propila, ciclopropila, e picolila, assim como outros resíduos equivalentes como hidroxietila, tiazolila, aminociclohexila, benzila e benzila substituída. Em geral, substituintes picolila ou alquila inferior são preferidos para amidas substituídas únicas. Em vez de uma única amida substituída, uma substituição de dialquila, por exemplo dietilamino, é uma alternativa; no entanto, preferivelmente este C-término di-substituído é ocupado por uma porção morfolinila, tiomorfolinila ou piperidinila, com o último sendo não substituído ou substituído por 4-hidroxi ou 4-oxo. Uma piperazinila ou 4-mono-ou 4,4-di- substituída porção piperazinila também pode ser usada, como pode e-lisila.
Verificou-se que a ligação é geralmente um atributo de sequência de aminoácido de tetrapeptídeo, e preferivelmente os peptídeos opióides de receptor kappa seletivos devem demonstrar uma afinidade de ligação para o receptor kappa, de modo que seu Kj é igual a cerca de 2 nM ou menos. A longa duração de ação, que se acredita seja primariamente um atributo da estrutura da amida fixada ao C-término, pode ser efetivamente testada pelo teste antinociceptivo descrito abaixo, e os peptídeos mais preferidos demonstram atividade biológica substancial durante duas ou três horas e não tem efeito significante sobre o cérebro.
Um sub-gênero preferido do gênero peptídeos opióides especificados acima tem a fórmula: H-Xaa, -Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q
Em que Xaa, é D-Phe (não substituído ou substituído por CaMe, 2F, 4F ou 40) ou D-Ala (ciclopentila ou tienila), Xaa2 é (A') D-Phe, D- lNal, D-2Nal, ou D-Trp, com A' sendo H, 4F, 40,4N02, ou 3,4C12; Xaa3 é D- Nle, D-Leu, D-CML, D-Met ou D-Acp; Xaa4 é D-Arg, D-Arg(Et2), D-Lys, D- Ily, D-Har, D-Har(Et2), D-nArg, D-Om, D-Ior, D-Dbu, D-Amf, e D-Gmf, e Q é NR,R2, Mor, Tmo, Pip, 4-HyP, OxP ou Ppz, com R, sendo Me, Et, Pr, Bu, hEt, Cyp, Bzl, ou 4-picolila, e R2 sendo H ou Et.
Um subgênero preferido adicional de peptídeos opióides kappa tem a fórmula: H-Xaa , -Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q
Em que Xaa, é D-Phe, D-4Fpa, D-2Fpa, D-4Cpa, D-Acp ou D- Ala (Thi),; Xaa2 é D-Phe, D-4Fpa, D-4Cpa, D-3,4Cpa, D-INal, D-2Nal, ou D- Trp; Xaa3 é D-Nle, D-Met, D-CML ou D-Leu; Xaa4 é D-Arg, D-Lys, D-Har, D-nArg ou D-Om; e Q é NR,R2, Mor, Tmo, Pip, 4-HyP, ou Ppz, com R, sendo Et, Pr, Bu, Cyp, hEt, Bzl ou 4Pic e R2 sendo H ou Et.
Um outro subgênero preferido de peptídeos opióides kappa tem a fórmula: H-Xaa,-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q
Em que Xaa, é D-Phe, D-4Fpa, D-2Fpa, D-Acp, D-Ala (2Thi),;
Xaa2 é (A) D-Phe, D-INal, D-2Nal, ou D-Trp com A sendo 4F ou 4C1; Xaa3 é D-Nle, D-Met, ou D-Leu; Xaa4 é D-Arg, D-Har, D-nArg, D-Lys ou D-Om ou D-Gmf; e Q é NHR,, Mor, Tmo, Pip, ou Ppz, com R, sendo Et, Pr ou 4Pic.
Outro subgênero preferido de peptídeos opióides kappa tem a fórmula: H-Xaa, -Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q em que Xaa, é D-Phe, D-4Fpa, D-2Fpa, ou D-Ala (2Thi),; Xaa2 é (A) D-Phe, D-INal, D-2Nal, ou D-Trp com A sendo 3,4C12 ou 4C1; Xaa3 é D- Nle, ou D-Leu; Xaa4 é D-Arg, D-Om ou D-Gmf; e Q é NHR,, Mor, Tmo, Pcp, Ppz ou N(Et)2, com R, sendo Et, Pr, Cyp, 4Pic, Aeb ou Hoh.
Os gêneros e subgêneros acima de peptídeos opióides foram verificados como tendo duração estendida de atividade in vivo antinociceptiva como um resultado da incorporação de uma amida substituída no C-término do resíduo de aminoácido de posição 4. Este atributo inesperado particular toma estes peptídeos particularmente valiosos com alguns dos mesmos permanecem ativos in vivo durante períodos de três horas e mais. Alguns tetra-peptídeos tendo a sequência acima descrita mas tendo uma amida C-terminal simples também demonstraram alta seletividade para o KOR, como comparado com o MOR; no entanto, eles geralmente demonstram somente duração de ação a curto prazo. Espera-se completamente que estes peptídeos opióides irão demonstrar prazo prolongado de duração quando sintetizados de modo a ter uma amida substituída, como morfolídeo, no término C. Foi verificado de modo consistente que, quando uma amida primária de tetra-peptídeo mostra ligação alta e seletiva para KOR, amidas substituídas correspondentes como, por exemplo, a etilamida e o morfolídeo, irão, quando sintetizados, demonstrar atividade antinociceptiva durante um período prolongado medido em horas, isto é, durante pelo menos 1 hora, sem entrada significante no cérebro.
Apesar das sequências de aminoácidos preferidas serem fixadas nas fórmulas acima, deve-se entender pelos versados na arte de química de peptídeo que um ou mais dos resíduos de aminoácidos descritos pode ser substituído por uma substituição de aminoácido conservativa, por exemplo um aminoácido básico por outro, ou um aminoácido hidrófobo por outro, por exemplo D-Ile por D-Leu. Do mesmo modo, vários dos resíduos também podem ser modificados como geralmente conhecido na arte, por exemplo, D- Phe (como acima indicado) pode ser modificado por incorporação de um grupo nitro ou halogênio geralmente na posição 3 ou 4, ou ambos, ou o alfa-carbono pode ser metilado. Estas modificações são consideradas como produzindo peptídeos opióides de receptor kappa equivalentes.
Os peptídeos podem ser sintetizados por qualquer processo apropriado, como por técnicas exclusivamente em fase sólida, ou adição de solução clássica ou altemativamente por técnicas em fase sólida parcial ou por técnicas de condensação de fragmentos. Por exemplo, as técnicas de síntese de peptídeo em fase sólida exclusivamente (SPPS) são especificadas no livro Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a. ed, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 1984, e são exemplificados pela descrição da patente US no. 4 105 603. O processo de condensação de fragmento de síntese é exemplificado na patente US 3 972 859 e outras sínteses apropriadas são exemplificadas pelas patentes US nos. 3 842 067 e 3 862 925. A síntese de adição de solução clássica é descrita em detalhes em Bodanzsky et al, Peptide Synthesis, 2a. ed, John Wiley & Sons, NY, 1976.
Com à síntese química de tipo de copulação de peptídeos é a proteção de qualquer cadeia lateral lábil de um aminoácido sendo copulado, e geralmente a proteção também do grupo α-amino, de modo que a adição ocorre no grupo carboxila do aminoácido individual ou di-peptídeo ou tri- peptídeo que está sendo adicionado. Estes grupos de proteção são bem conhecidos dos versados na arte, e terc-butiloxicarbonila (Boc), benziloxicarbonila (Z) e 9-fluorenilmetoxi carbonila (Fmoc) são com freqüência usados como grupos de proteção α-amino preferidos em SPPS ou síntese em solução clássica apesar de se ter uma grande variedade de outros de proteção α-amino que podem ser altemativamente usados.
Quando se usa SPPS, o resíduo de aminoácido C-terminal é copulado a um suporte de resina sólido como suporte de 0-CH2-poliestireno, suporte de resina 0-CH2-benzil-poliamida, suporte de resina-NH- benzhidrilamina (BHA), ou suporte de resina-NH- para metilbezhidrilamina (MBHA). O uso de resinas BHA ou MBHA é com freqüência preferido quando a amida não substituída é desejada devido à divagem dar diretamente a amida C-terminal. Quando uma N-metilamida é desejada, esta pode ser gerada de uma resina N-metil BHA. Outras amidas substituídas únicas podem ser sintetizadas pelo procedimento especificado em W. Komreich et al, Int. J.
Peptide Protein Res., 25: 414-420, 1985, e também na patente US no. 4 701 499. Os peptídeos tendo amidas di-substituídas no C-término, como N- morfolinil ou N-piperidinila, são preferivelmente preparados via síntese de solução clássica ou por condensação de fragmento em solução.
Uma vez sintetizados estes tetra-peptídeos são prontamente purificados usando os processos da arte bem conhecidos para purificação de peptídeo curto, por exemplo cromatografia de líquido de alto desempenho em fase reversa (RP_HPLC), ou outros processos apropriados. Esta purificação é descrita em detalhes em J. Rivier et al, J. Chromatography, 288. 303-328, 1984, e C. Miller e J. Rivier Pepíide Science, Biopolymers, 40: 265-317 (1996), e exemplos específicos desta purificação após síntese em fase sólida ou outros são mostrados na patente US no. 5 098 995. Vários testes podem ser empregados para testar se os tetra- peptídeos demonstram alta seletividade para o KOR, forte bio-atividade antinociceptiva, longa duração de bio-atividade in vivo, e falta de penetração no cérebro. Os testes de receptor são bem conhecidos dos versados na arte, e os KORs de camundongos, ratos, porquinhos da índia e humanos foram recentemente clonados. Com a exceção de gpKOR, os KORs clonados foram muito similares, todos contendo cerca de 380 aminoácidos. A sequência de aminoácido de hKOR foi de 93,9% e 93,4% de homologia com o rKOR e mKOR, respectivamente. Em contraste, o hKOR diferente de modo signifícante de hMOR e de receptor opióide delta humana (hDOR) tendo respectivamente somente 60,2% e 59,1% de identidade de sequência de aminoácido. KORs assim como outros receptores de opióide são clássicos receptores copulados a proteína G de leque de sete transmembranas (Gi). Estes receptores clonados prontamente permitem a um peptídeo candidato particular ser triado; por exemplo, a triagem contra tanto KOR como MOR pode ser realizada a fim de determinar a seletividade. O KOR, MOR e DOR humanos foram estavelmente expressos em uma linhagem de célula de câncer de camundongo derivada de um neuroblastoma hipocampo (HN.9.10) e são disponíveis para uso em triagem in vitro. Também se tem vários testes in vivo bem aceitos, que se tomaram geralmente padrões para a determinação de atividade antinociceptiva de um composto opióide. Estes testes geralmente empregam camundongos e incluem teste de batida leve no rabo, teste de pressão na pata, teste de contorção com ácido acético, o teste de pega do rabo, e o teste de imersão no rabo. Vonvoigtlander, P.F. et al, J. Pharm. Exper.
Therapeutics, 224: 7-12 (1983) descreve vários destes testes para compostos opióides. A afinidade de ligação se refere à força de interação entre ligando e receptor. Para demonstrar afinidade de ligação para receptores opióides, os peptídeos da invenção foram avaliados usando estudos de ligação de competição. Estes estudos foram realizados usando receptores kappa humanos (hKOR) e mu opióides (hMOR) expressos em linhagens de célula transfectadas estáveis (HN.9.10, derivados de um neuroblastoma hipocampo de camundongo). Nestes estudos, os compostos de teste (ligando frio ou não rotulado) são usados em concentrações crescentes para deslocar a ligação específica de um ligando radio-rotulado que tem alta afinidade e seletividade para o receptor estudado. 3H-U-69.593 e 3H-DAMGO foram usados como ligandos em estudos hKOR e hMOR, respectivamente. Ambos ligandos são comercialmente disponíveis (NEN-Dupont). DAMGO é um acronimo para [D- Ala2, MePhe4, Gly-ol5] encefalina. A afinidade dos radioligandos é definida pela concentração de radioligando que resulta em ligação específica meio- máxima (KD) em estudos de saturação. O KD para 3H-U-69.593 em hKOR e para 3H-DAMGO em hMOR são cerca de 0,3 nM e 3,0 nM, respectivamente. A afinidade do composto de teste (ligando frio ou não rotulado) é determinada em estudos de ligação de competição por cálculo da constante inibitória (KQ de acordo com a seguinte fórmula: onde IC50 = concentração de ligando frio que inibe 50% de ligação específica de radioligando F = concentração de radioligando livre KD = afinidade de radioligando determinada em estudos de saturação.
Quando realizando estes testes sob condições específicas com concentrações relativamente baixas de receptor, o K, calculado para o composto de teste é uma boa aproximação de sua constante de dissociação KD, que representa a concentração de ligando necessária para ocupar uma metade (50%) dos sítios de ligação. Um baixo valor K, na faixa nanomolar e subnanomolar é considerado para identificar um alto ligando de afinidade no campo de opióides. Os análogos preferidos tem um K, de cerca de 2 nanomolar (nM) ou menos, enquanto análogos mais preferidos tem um de cerca de 1 nM ou menos. Porque os receptores KOR são distribuídos amplamente em todo o corpo, os peptídeos opióides de receptor kappa terão um efeito substancial na modulação de muitas ações periféricas, e sele eles são altamente seletivos para KOR, eles terão efeitos laterais mínimos e devem ser boas drogas fisiologicamente.
Estes testes de ligação empregando KORs e MORs são diretos de realizar e podem ser prontamente realizados com peptídeos inicialmente identificados ou sintetizados para determinar se estes peptídeos são seletivos para KOR e tem alta afinidade. Estes testes de ligação podem ser realizados em vários modos, como bem conhecidos dos versados na arte, e um exemplo detalhado de um teste deste tipo geral é especificado em Perrin, M. et al, Endocrinology, 118: 1171-1179, 1986. A presente invenção é ainda descrita pelos exemplos que seguem. Estes exemplos, no entanto, não são construídos como sendo limitados de alguma forma ao espírito ou escopo da presente invenção que é descrita nas reivindicações no final dos mesmos. EXEMPLO 1 O peptídeo tendo a fórmula H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg- NHEt é sintetizado de modo apropriado com bem conhecido na arte de síntese de peptídeo. Por exemplo, o tri-peptídeo: (grupo de proteção ex- amino) D-Phe-D-Phe-D-Nle (grupo de proteção carboxila) é inicialmente sintetizado usando química de solução clássica. Por exemplo, o tri-peptídeo pode ser preparado por dissolução de H-D-Nle-OMe em DMF e adição de N- etilmorfolina (NEM) ou outro para ajustar o pH. Esta solução é então combinada com uma solução de Boc-protegido D-Phe-OH em DMF contendo NEM. A esta mistura de reação, adiciona-se um agente de ativação ou copulação, como hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris- (dimetilamino) fosfônio (BOP) ou uma mistura de N,N'- diisopropilcarbodiimida (DIC) e N-hidroxi benzotriazol (HOBt). Após completar a reação, o meio é evaporado até secura, e o produto é então purificado de modo apropriado e recristalizado. O grupo de proteção Boc é então removido com ácido trifluoroacético (TFA), e o dipeptídeo é redissolvido em DMF. Uma solução de D-Phe protegido com Boc dissolvido em DMF, com NEM, é adicionada. A reação é repetida usando BOP, como descrito acima, para criar o tri-peptídeo que, após a solução é evaporado até secura, é purificado e recristalizado. O produto que resulta é Boc-D-Phe-D- Phe-D-Nle-OCH3. O éster metílico é então convertido de modo apropriado no ácido livre, como por dissolução em uma mistura de dioxano ou DMSO e água e adição de hidróxido de sódio. Após completar a reação, separação , purificação e recristalização provêem o tripeptídeo Boc-D-Phe-D-Phe-D-Nle- OH. O tripeptídeo é dissolvido em DMF contendo NEM, e reagido com D-Arg(Tos)-NHEt, novamente usando BOP como um agente de copulação. Altemativamente, o tripeptídeo éster metílico pode ser convertido para a azida, se desejado, por tratamento com uma solução a 80% de hidrazina hidratada para produzir a hidrazida, que é isolada e então tratada com nitrito de sódio e ácido mineral em DMF. A azida é imediatamente reagida com D-Arg(Tos)-NHEt em solução DMF contendo trietilamina. Após completar a reação, a mistura é evaporada até secura, então purificada de modo apropriado e recristalizada. O N-término de cadeia lateral de D-Arg são então desprotegidos, e purificação e recristalização são novamente realizadas, produzindo o tetrapeptídeo etilamina desejado (peptídeo no. 1). O peptídeo é julgado como sendo homogêneo por HPLC de fase reversa usando duas diferentes fases móveis: um gradiente de acetonitrila em água contendo 0,1% de ácido trifluoroacético e um gradiente de acetonitrila em tampão fosfato trietilamina pH 7, e também por sílica fundida, eletroforese capilar usando um tampão fosfato de pH 2,5. A pureza do peptídeo por estes processos é estimada como sendo > 98%. A espectrometria de massa usando ionização eletro-pulverização e análise de coletor de íons mostrou um íon pseudomolecular [mH]+ a m/z 609,4 que é consistente com a massa calculada de m/z 609,5 para este tetra-peptídeo. A análise de fragmentação de íon pseudomolecular mostrou uma série de íons em relações de m/z consistentes com a sequência de aminoácidos esperada para a estrutura preparada.
Os testes de ligação com células expressando KOR e MOR humano são realizados como mencionado acima. As afinidades do peptídeo de teste para hKOR e hMOR, expressadas de modo estável em neuroblastoma de hipocampo de camundongos (HN.9.10) células, são determinadas por deslocamento competitivo de 3H-U-69.593 para hKOR e de 3H-DAMGO para hMOR, como descrito. Os dados de pelo menos 3 experiências são reunidos, e valores de constante de dissociação inibitória (Kj) (95% limites de confidência) são calculados usando um programa apropriado, como programa LIGAND de Munson e Rodbard, Anal. Biochem. 107: 220-239, 1980. O KOR clonado liga peptídeo no. 1 com alta afinidade como determinado pelo deslocamento competitivo de radioligando ligado, e o Kj é determinado como sendo cerca de 0,05 + 0,02 nM. A diferença em afinidade é dramática comparada com células de câncer estavelmente transfectadas, similares, expressando MOR humano onde o Kj é 1890 ± 990 nM. Assim, peptídeo no. 1 liga mais fortemente a hKOR do que a hMOR por um fator de cerca de 38.000. O teste do peptídeo em teste com ácido acético em camundongos (como descrito abaixo) mostra um ED50 de cerca de 0,09 mg/kg e o de peptídeo continua a demonstrar acima de 50% de antinocicepção após 3 h. Assim, peptídeo no. 1 é considerado como demonstrando duração muito longa de ação.
Exemplo 2 Os peptídeos opióides tendo a fórmula geral: H-D-Phe-D-Phe- D-Nle-D-Arg-Q, como indicado na tabela A, são sintetizados e testados como descrito no exemplo 1.
Os peptídeos 2 a 15 são considerados como demonstrando duração longa de bio-atividade antinociceptiva. EXEMPLO 3 Os peptídeos opióides tendo a fórmula geral H-Xaa,-Xaa2- Xaa3-Xaa4-Q, como indicado na TABELA B, são sintetizados e testados como descrito no EXEMPLO 1.
Os peptídeos 16 a 39 são considerados como demonstrando duração longa de bio-atividade antinociceptiva. EXEMPLO 4 Os peptídeos opióides tendo a fórmula geral: H-Xaa,-Xaa2- Xaa3-Xaa4-Q, como indicado na tabela C, são sintetizados e testados como descrito em EXEMPLO 1.
Os peptídeos 40 a 53 são considerados como demonstrando longa duração de bio-atividade antinociceptiva. EXEMPLO 5 Os peptídeos opióides tendo a fórmula geral: H-D-Phe-Xaa2- Xaa3-Xaa4-Q, como indicado na TABELA D, são sintetizados e testados como descrito no EXEMPLO 1. tabela/espectroscopia de massa/calculado/medido Os peptídeos 54 a 58 são considerados como demonstrando longa duração de bio-atividade antinociceptiva. EXEMPLO 6 Os peptídeos opióides tendo a fórmula geral: H-XaarXaa2- Xaa3-D-Arg-Q, como indicado na tabela E, são sintetizados e testados como descrito no EXEMPLO 1.
Os peptídeos 59 a 65 são considerados como demonstrando longa duração de bio-atividade antinociceptiva. EXEMPLO 7 Os peptídeos opióides tendo a fórmula geral: H-Xaat-Xaa2- Xaa3-Xaa4-Q, como indicado na tabela F, são sintetizados e testados como descrito no EXEMPLO 1.
Os peptídeos opióides de tabela F são considerados como mostrando alta seletividade para KOR, como comparado com MOR, e para demonstrar bio-atividade antinociceptiva in vivo. EXEMPLO 8 Os peptídeos opióides tendo a fórmula geral: H-Xaa,-Xaa2- Xaa3-Xaa4-Q, como indicado na tabela G, são sintetizados e testados como descrito no EXEMPLO 1.
Os peptídeos 88 a 108 são considerados como mostrando duração longa de bio-atividade antinociceptiva. EXEMPLO 9 As proteínas selecionadas que são identificadas nas tabelas A- G foram ainda especificamente submetidas a um teste in vivo para determinação de duração de ação de suas propriedades opióides, e os resultados são dados na tabela H abaixo. Os membros de peptídeo correspondem aos nas tabelas anteriores e figuras com aspecto para a relação μ/κ são simplesmente realizados para fins de referência. O teste in vivo é realizado usando um teste de contorção de camundongos (WT) que é bem apropriado para determinar a extensão de duração de bio-atividade antinociceptiva. Este teste é descrito em detalhes pelo artigo por G.A. Bentley et al, Br. J. Pharmac. 73: 325-332, 1981, e ele emprega camundongos ICR machos conscientes que foram adquiridos de Harlan e que pesam entre 20 e 30 g. Os camundongos foram deixados sem comer durante 12 a 16 horas antes de começar o teste. O comportamento nociceptivo isto é, contorção, a ser monitorado é induzido pela administração intraperitoneal (i.p.) de ácido acético diluído. 10 mililitros de 0,6% ácido acético aquoso é usado por kg de peso do corpo. A contorção é classificada durante os 15 min após administração de ácido acético. Em uma primeira etapa, os compostos são testados em 3 a 4 doses crescentes, dadas por via intravenosa, e o tempo de pré-tratamento único (-5 min antes de injeção de ácido acético). Esta etapa é usada para determinar a potência (WT-ED50) assim como uma dose efetiva sub-máxima (cerca de 80- 90% antinocicepção). Em uma segunda etapa, esta dose efetiva sub-máxima para cada peptídeo específico é administrada em vários tempos de pré tratamento (isto é,-5 min,-60 min,-120 min, e-180 min) antes da administração do ácido acético a fim de determinar a duração de ação. Em todo o teste, um grupo de controle de camundongos é usado que são administrados somente com o veículo sem o peptídeo candidato. O número de contrações são contadas em um período de 15 min, partindo do tempo de injeção de ácido acético, e bioatividade, isto é, antinocicepção, é expressa como uma porcentagem, e é calculada como a seguir: lOOx (contrações em grupo controle-contrações em grupo tratado) contrações em grupo controle Porque cada dose submáxima irá muito provavelmente variar de modo a não ser diretamente comparável, os resultados são normalizados matematicamente, como conhecido nesta arte, para prover valores comparáveis que são especificados na tabela H. Na tabela H, a atividade antinociceptiva permanecendo após 1, 2, e 3 h é expressa como a porcentagem de atividade encontrada em-5 min. Valores maiores que 100% indicam maior antinocicepção do que no começo da experiência. Pensa-se que o peptídeo opióide deve ser efetivo para reduzir a contração em pelo menos cerca de 25% em um tempo de 1 hora a ser considerado como tendo longa duração de ação in vivo.
Além de usar este teste para determinar a duração de atividade antinociceptiva, ele é também usado para medir a biopotência in vivo (tempo curto) do peptídeo. Este valor é dado em tabela sob o cabeçalho WT-ED50 em miligramas por kg de peso do corpo. O valor é uma medida da dose necessária para reduzir o número de contrações no camundongo sendo testado em 50% (como comparado com um camundongo de controle) durante um período de 15 min.
Os peptídeos opióides são utilizáveis como analgésicos e para outras aplicações farmacológicas para tratar patologias associadas com o sistema KOR. Eles demonstram vantagens sobre exterminadores de dor agonistas μ, por exemplo morfina que tem efeitos indesejáveis, como r constipação, depressão respiratória e coceira. E altamente desejável que estes peptídeos opióides não cruzem de modo significante a barreira sangue/cérebro, para guardar contra efeitos laterais potenciais que podem resultar. A segurança destes compostos com relação a penetração no cérebro é avaliada por comparação de sua potência para elicitar efeitos periféricos versus sua potência para elicitar efeitos centrais. Os efeitos periféricos são medidos usando o teste de contração de camundongo (WT) descrito previamente. Os efeitos centrais devido à ação em receptores kappa localizados no cérebro são medidos usando o teste de batida leve no rabo do camundongo (TF). O teste de batida leve no rabo é um teste de dor somática aguda, projetado para avaliar a potência e duração de ação de analgésicos de atuação central. A nocicepção induzida por imersão do rabo em água quente (52 °C ) resulta em uma rápida retirada do rabo, também conhecido como batida leve no rabo. Os compostos analgésicos atuando centralmente são esperados para aumentar em um modo relacionado com dose da latência para retirada do rabo. O teste é descrito em Vanderah. T.W. et al, J. Pharm. Exper. Therapeuíics, 262: 190-197, 1992. A segurança é avaliada através do uso de um índice de penetração no cérebro (BPI) que é definido como : em que os valores ED50 são as doses que produzem meio efeito máximo no teste de contração de camundongos WT-ED50) e o teste de batida leve no rabo do camundongo (TF-ED50), respectivamente, quando dados por via i.v. Um valor BPI alto assinala baixa penetração no cérebro e indica que o composto provavelmente demonstra uma ampla margem de segurança (falta de efeitos laterais no cérebro) quando usado para os fins descritos nesta aplicação.
Os peptídeos opióides preferidos tem valores BPI iguais a ou maiores que 100, com peptídeos opióides mais preferidos tendo um BPI maior que 300. Os agonistas kappa não peptídicos sistêmicos (por exemplo Enadoline e U- 69.593) tem valores BPI menores que 5, que indica penetração no cérebro significante está ocorrendo como também evidenciado pelos efeitos laterais (diurese, disforia, e sedação), que eles produzem quando usados clinicamente.
Os valores BPI para alguns peptídeos opióides representativos são mostrados na tabela I que segue: Porque estes peptídeos liga fortemente a KOR, eles também são utilizáveis em testes in vitro para estudar receptores e para determinação de quais receptores podem estar presentes em um uma amostra de tecido particular. Assim, eles são utilizáveis para diagnóstico neste aspecto e potencialmente também para diagnóstico in vivo.
Em geral, estes peptídeos opióides também podem ser usados para obter antinocicepção no tratamento de dor visceral e também para tratar artrite reumatóide. Eles são particularmente utilizáveis no tratamento de sintomas pós-cirurgia abdominais como distúrbios digestivos e dor. Eles também são considerados para ser efetivos para tratar IBS, instabilidade da bexiga, incontinência, e outras indicações onde inflamação local resulta em estados de dor no intestino ou em outras vísceras, por exemplo doença de intestino inflamatório (IBD) e dismenorréia. A capacidade do peptídeo opióide de abaixar a resposta imune pode ser vantajosa para combater IBD e outras indicações, como doenças autoimunes. A administração dos peptídeos pode ser empregada para produzir atividade analgésica crônica, em relação a tanto condições de inflamação agudas como crônicas. Eles podem ser usados para tratar ileo digestivo tendo sintomas como timpanite, náusea e inibições do trânsito intestinal associadas com dor, por exemplo obstrução do intestino possivelmente causada por contrações espásticas. Os peptídeos opióides são também efetivos para produzir analgesia periférica, e eles podem ser marcados para aliviar dor pós-operatória, assim como dor crônica, como a causada por inflamação de tecidos do trato gastrointestinal e visceral, e também para dar alívio durante retirada de drogas pelos viciados.
Os compostos da invenção podem ser administrados em forma de sais não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, como sais de adição de ácido, como bem conhecido na arte. Ilustrativos destes sais de adição de ácido são hidrocloreto, hidrobrometo, sulfato, fosfato, nitrato, oxalato, fumarato, gluconato, tannato, palmoato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, alginato, malato, ascorbato, tartarato, e outros. Se o ingrediente ativo foram administrado em forma de comprimido, o comprimido pode conter um diluente não tóxico, farmaceuticamente aceitável, que inclui um aglutinante, como tragacanto, amido de milho ou gelatina. A administração intravenosa em solução salina isotônica, tampão fosfato, manitol ou soluções de glucose também pode ser efetuada.
As composições farmacêuticas irão geralmente conter uma quantidade efetiva de peptídeo em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável ou diluente, convencional. Em geral, a composição irá conter uma quantidade antinociceptiva, isto é uma quantidade que é efetiva para bloquear dor. Em geral, a dosagem seTá de cerca de 1 micrograma a cerca de 10 miligramas do peptídeo por quilograma de peso do corpo do hospedeiro quando dada intravenosamente. As composições podem ser administradas como necessário, por exemplo, elas podem ser administradas repetidas vezes em intervalos de 3-6 horas. A natureza destes compostos pode possivelmente permitir efetiva administração oral; no entanto, dosagens orais podem ser maiores. Se desejável liberar o peptídeo opióide durante períodos prolongados de tempo, por exemplo, durante períodos de uma semana ou mais de uma única administração, liberação lenta, depósito ou formas de dosagem de implante podem ser usadas. Por exemplo, uma formulação de depósito de lenta liberação, apropriada, para injeção pode conter o peptídeo ou um sal do mesmo disperso ou encapsulado em um polímero de lenta degradação, não tóxico ou não antigênico, como polímero de ácido poliláctico/ ácido poliglicólico, como descrito na patente US 3.773.919. Também se sabe que a administração de lenta liberação pode ser obtida via um implante silástico.
Estes compostos podem ser administrados para mamíferos, incluindo humanos, de modo intravenoso, subcutâneo, intramuscular, percutâneo, intranasal, intrapulmonar, oral, tópico, intraretal, intravaginal, ou por dosagem espinhal para obter antinocicepção, como inibição de trânsito do trato gastrointestinal reverso, induzida por irritação peritoneal. Eles também podem ser assim usados para aliviar dor pós-operativa. AS dosagens efetivas irão variar com a forma de administração e da espécie particular de mamífero sendo tratado. Um exemplo de uma forma de dosagem típica é uma solução de água bacteriostática a um pH de cerca de 3 a 8, por exemplo cerca de 6, contendo o peptídeo, cuja solução é continuamente administrada parenteralmente para prover uma dose na faixa de cerca de 0,3 pg a 3 mg/kg de peso do corpo por dia. Estes compostos são considerados como sendo bem tolerados in vivo, e eles são considerados como sendo particularmente bem apropriados para administração por injeção subcutânea em uma solução de água bacteriostática ou semelhante.
Apesar da invenção ter sido descrita com relação a suas formas de realização preferidas, deve-se entender que mudanças e modificações como seriam óbvias para um sendo versado na arte podem ser feitas sem sair do escopo da invenção que é especificada nas reivindicações que são anexas. Por exemplo, outras substituições conhecidas na arte que não afetem de modo signifícante a eficácia dos peptídeos, podem ser empregadas nos peptídeos da invenção. Outros resíduos D-Phe substituídos como (4Br)D-Phe ou (2,4C12)-D- Phe, podem ser usados na posição 2. Tanto D-Lys(Bu) como D-Lys(ET2) são considerados como equivalentes de D-Ily e D-Arg (Et2). O N-término do tetra- peptídeo pode ser permetilado, como conhecido na arte, se desejado. Os compostos diamino podem ser usados como ligadores para criar dímeros de 2 tetra-peptídeo amidas. Os ligadores que foram usados com sucesso incluem 1,6-diaminohexano, l,5-diamino-3-oxapentano, e l,8-diamino-3,6- dioxaoctano. Os dímeros resultantes são considerados como sendo equivalentes de monômeros respectivos.
LISTAGEM DE ABREVIAÇÕES