CZ20002382A3

CZ20002382A3 - Syntetické opioidní peptidy s afinitou pro kappa-opiátový receptor

Info

Publication number: CZ20002382A3
Application number: CZ20002382A
Authority: CZ
Inventors: Jean Louis Junien; Pierre J. M. Riviere; Claudio D. Schteingart; Javier Sueiras Diaz; Jerzy A. Trojnar; Todd W. Vanderah
Original assignee: Ferring B. V.
Priority date: 1997-12-23
Filing date: 1998-12-22
Publication date: 2000-12-13
Also published as: KR100629548B1; EE04440B1; UA68366C2; NZ505183A; DE69831176T2; CZ297281B6; SK9602000A3; SK286135B6; HRP20000415B1; DE69831176D1; PL341308A1; CN1283201A; KR20010033450A; RU2217437C2; ZA9811801B; HUP0100626A2; PT1042359E; DK1042359T3; EP1042359A1; NO20003245D0

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně týká syntetických opioidních peptidů, přesněji opioidních peptidů, které jsou vysoce selektivními agonisty kappa-receptoru a které jsou - ještě přesněji - agonisty, (a) nepronikajícími do mozku, a (b) majícími dlouhodobou antinocicepční aktivitu in vitro.

Dosavadní stav techniky

Kappa-opiátové receptory (KOR) jsou přítomné v mozku, míše a na centrálních a periferních zakončeních a tělech buněk primárních sensorických aferentních neuronů (somatických a viscerálních), stejně jako na buňkách imunitního systému. Molekuly, které aktivují KOR, jsou společně označovány jako kappa-agonisté.

Bylo dokázáno, že aktivace KOR, které jsou lokalizovány v mozku, má analgetický účinek. Toto zjištění vedlo k pokusům o vývoj nepeptidových kappa-agonistů pronikajících do mozku, které by mohly být použity jako analgetika nemající nežádoucí vedlejší účinky (zácpu, respirační .depresi, závislost a návyk) morfinových analogů, které působí na opiátové receptory (MOR). Analgetická aktivita, stejně jako chybění mu-opiátových nežádoucích účinků této třídy sloučenin byla potvrzena jak u zvířat, tak u lidí. Nicméně, vývoj kappa-agonistů byl přerušen, protože bylo prokázáno, že také indukují specifické nežádoucí účinky, jako je diuresa, sedace a dysforie, které jsou zprostředkované kappa-receptory umístěnými v mozku.

• ··· · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· ··

Kromě supraspinálních KOR mohou analgesii vyvolávat také KOR umístěné na periferii nebo v míše. Nicméně, ani periferní, ani míšní KOR nejsou spojeny s jakýmikoliv vedlejšími účinky systémových kappa-agonistů. Proto pokud by bylo možné vytvořit agonistů opiátových kappa receptoru, který by nepronikal do mozku (po periferním nebo spinálním podání), tak by bylo možno získat bezpečné a nové analgetikum.

Kappa-agonisté vyvolávají periferní antinocicepci v modelech hyperalgesie tenkého, stejně jako tlustého střeva, která je indukována mírným a lokálním zánětem, a v modelu syndromu dráždivého tračníku (IBS), při které je přítomná významná víscerální bolest způsobená viscerální hypersensitivitou pravděpodobně spojenou s lokálním zánětem, je také léčitelný pomocí periferního kappa-agonisty. Kromě gastrointestinálního traktu jsou také jiné viscerální orgány postižené patologickým stavem, na kterém se účastní aktivace a/nebo desensitizace (.j. lokální zánět) primárních sensorických aferentních drah, vhodným cílem pro opiáty působící na kappa-receptory. Kappa-agonisté také blokují neurogenní zánět v somatických tkáních inhibici uvolňování substance P z primárních sensorických aferentních zakončení a také je známo, že působí na imunitní systém a mají inhibiční účinek na buňky imunitního systému.

Zejména vhodné jsou peptidy, které nepronikají do mozku, které mají vysokou afinitu ke KOR oproti MOR, které mají vysokou účinnost a které mají dlouhé trvání účinku in vivo.

U.S. patent č. 5610271 popisuje tetrapeptidy obsahující čtyři D-izomerové aminokyselinové zbytky, které se váží na KOR, ale tyto peptidy nesplňují všechny charakteristiky uvedené výše.

Podstata vynálezu • ·· · · «· · • · · · · · · * • · ·*»·*· · · · • · · · · · · ·· ·· ·· ··

Byla objevena třída peptidů, které mají vysokou selektivitu pro KOR a dlouhodobé trvání účinku in vivo a které nepronikají významně do mozku. Tyto peptidy obsahují sekvenci čtyř Daminokyselin a mají C-konec, kterým je buď mono-, nebo disubstituovaný amid. Tyto sloučeniny mají následující obecný vzorec:

H-Xaai-Xaa2-Xaa3-Xaa4-substituovaný amid kde Xaai je (A) D-Phe, (C_aMe)D-Phe, D-Tyr, D-Tic nebo D-Ala (cyklopentyl nebo thienyl), kde A je H, NO2, F, Cl nebo CH3; Xaa2 je (A')D-Phe, D-lNal, D-2Nal, D-Tyr nebo D-Trp, kde A' je A nebo 3,4Cl2; Xaa3 je D-Nle, (B)D-Leu, D-Hle, D-Met, D-Val, DPhe nebo D-Ala (cyklopentyl), kde B je H nebo C«Me; Xaa4 je DArg, D-Har, D-nArg, D-Lys, D-Ily, D-Arg(Et2), D-Har (Et2), DAmf, D-Gmf, D-Dbu, D-Orn nebo D-Ior. Mezí výhodné amidy patří ethylamid, morfolid, thiomorfolid, 4-pikolylamid, piperazid, propylamid, cyklopropylamid, diethylamid a substituovaný benzylamid.

V jednom aspektu vynález poskytuje syntetický amid opiodního peptidů nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, který má afinitu pro opiátové kappa-receptory alespoň 100-krát vyšší než afinitu pro opiátové mu receptory a který má dlouhodobý účinek po podání in vivo, kde uvedený peptid má vzorec:

H-Xaai-Xaa2-Xaa3-Xaa4~Q kde Xaai je (A) D-Phe, (C«Me)D-Phe, D-Tyr, D-Tic nebo D-Ala (cyklopentyl nebo thienyl), kde A je Η, NO2, F, Cl nebo CH3; Xaa2 je (A') D-Phe, D-lNal, D-2Nal, D-Tyr nebo D-Trp, kde A' je • · ··· · ·

A nebo 3,4012/ Xaa3 je D-Nle, (B)D-Leu, D-Hle, D-Met, D-Val, DPhe nebo D-Ala (cyklopentyl), kde B je H nebo C«Me; Xaa4 je DArg, D-Har, D-nArg, D-Lys, D-Ily, D-Arg(Et2), D-Har (Et2), DAmf, D-Gmf, D-Dbu, D-Orn nebo D-Ior; a Q je NR1R2, morfolinynl, thiomorfolinyl, (C)piperidinyl, piperazinyl, 4-mono- nebo 4,4disubstituovaný piperazinyl, nebo ε-lysyl, kde Ri je vybrán ze skupiny: nižší alkyl, substituovaný nižší alkyl, benzyl, substituovaný benzyl, aminocyklohexyl, 2-thiazolyl, 2-pikolyl, 3-pikolyl, 4-pikolyl, ω-(acylamino)-polymethylen nebo póly(oxyethylen) ; a R2 je H nebo nižší alkyl; a C je H, 4hydroxy nebo 4-oxo.

V dalším aspektu obsahuje vynález použití těchto sloučenin při léčbě lidí trpících viscerální bolestí a podobně, nestabilitou močového měchýře a podobně, nebo IBD nebo autoimunitním onemocněním, stejně jako podobnou léčbu jiných savců.

Názvosloví použité pro popis peptidů je názvosloví popsané v Schroder and Lubke, The Peptides, Academie Press, 1965, kde - v souladu s běžnou praxí - je N-konec uveden vlevo a C-konec vpravo. Pokud má aminokyselinový zbytek izomery, tak se jedná o L-izomer aminokyseliny, pokud není výslovně uvedeno jinak.

Jak bylo uvedeno výše, vynález poskytuje peptidy, které jsou selektivní pro KOR a nemají pouze silnou afinitu pro KOR, ale mají také dlouhodobou bioaktivitu in vivo. Tyto kappaselektivní opioidní peptidy mají alespoň 1000-krát vyšší vazebnou afinitu pro KOR než pro MOR, a mnoho sloučenin má alespoň 10000-krát vyšší afinitu a některé sloučeniny mají 20000-krát a vícekrát vyšší afinitu. Nicméně, pro mnoho indikací je významné to, aby kromě takové selektivity kappa• · · · · · · • ··· · · * · · • · · · · · • · ·· · · ·· • · agonista nepronikal do mozku a aby měl dlouhodobou antinocicepční aktivitu in vivo. Proto výhodné sloučeniny mají kromě výše uvedené selektivity tu vlastnost, že nepronikají významným způsobem do mozku a mají významnou aktivitu po dobu nejméně jedné hodiny, lépe po dobu alespoň dvou hodin a nejlépe po dobu alespoň tří hodin nebo déle.

Následující zkratky jsou použity v celém dokumentu. D-Nle označuje D-norleucin a D-Hle označuje D-homoleucin. D-Har označuje D-homoarginin a D-nArg označuje D-norarginin, který je o jeden uhlík kratší než D-Arg. D-Nal označuje D-izomer alaninu, který je substituovaný naftylem na β-uhlíku. Výhodně je použit D-2Nal, t.j. naftalen je navázán na kruh ve 2pozici; nicméně, může být použit také D-ÍNal. D-Cpa a D-Fpa označují, v příslušném pořadí, chlor-D-Phe a fluor-D-Phe, a výhodnými sloučeninami jsou D-4,Cpa, D-2Fpa, D-3Fpa a D-4Fpa. D-Npa označuje nitro-D-Phe a D-Mpa označuje methyl-D-Phe. D3,4Cpa označuje 3,4-dichlor-D-Phe. A-Acp označuje DAla(cyklopentyl). D-Orn označuje D-ornithin a D-Dbu označuje kyselinu alfa,gamma-diaminomáselnou. CML označuje C^amethyl-Leu a CMP označuje C«Me Phe. D-4Amf označuje D-4 (NH2CH2) Phe a D-Gmf označuje D-AMf(amidino) , což je D-Phe, ve kterém je 4-pozice substituovaná CH2NHC(NH)NH2. D-Tic označuje kyselinu D-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-karboxylovou. V Ala(Thi) představuje Thi thienylovou skupinu, která je výhodně navázaná svou 2pozicí na alanin, ačkoliv 3-thienyl je ekvivalentní. Ily a Ior jsou, v příslušném pořadí, isopropyl Lys a isopropyl Orn, kde vedlejší řetězec amino-skupiny je alkylován isopropylem.

Termín nižší alkyl označuje C1-C6 alkyl a zahrnuje cykloalkyl, kde výhodné jsou C1-C4 alkyly, včetně cyklopropylu a cyklobutylu. Me, Et, Pr, Ipr, Bu, Pn a Bzl označují methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, pentyl a benzyl. Cyp označuje • · 0 0 0 0 · · · · • · 9 9 9 999 9 9 9 9 9 • · · · · · 0 0 0 • · · · · · ·· 00 * · ₉ · cyklopropyl a Cyb označuje cyklobutyl. Ačkoliv je vazba výhodně přítomná na jednom konci alkylového řetězce, může být vazba kdekoliv na řetězci, například 3-pentyl může být také označován jako ethylpropyl. Ahx označuje 6-amino-hexyl, t.j. (CH2) 6-NH2. 4Acx označuje 4-aminocyklohexyl a hEt označuje hydroxyethyl, t.j. -CH2CH2OH. Termín substituovaný benzyl zahrnuje 4Nbz a 4Abz, což jsou 4-nitrobenzyl a 4-aminobenzyl, a Aeb označuje 4-(2-amino-2karboxyethyl)benzyl, t.j.

NHj,

4Pic) označuje navázány prostřednictvím 4-pozici. Mor označuje

2-, 3- a 4-pikolyl (2Pic, 3Pic a methylpyridinové skupiny, které jsou methylenové skupiny ve 2-, 3- a nebo morfolinyl, t.j.

/-\

-NO ^a \_/

Tmo označuje thiomorfolinyl,

-N

Pip označuje piperidinyl (piperidyl) a 4-HyP a OxP označují 4-hydroxypiperidin-l-yl a 4-oxo-piperidin-l-yl. Ppz označuje piperazinyl. Ecp označuje 4-fenylkarbamoylpiperazin-l-yl. Kvarterní amoniové skupiny, jako je 4,4-dimethyl-piperazin-lyl (Dmp) nebo jiné di-nižší alkylové substituce, mohou být také použity.

/ \

-C CH

2-Tzl označuje 2-thiazolyl, t.j. || ||

N - CH.

Ely označuje ε-lysyl, kde amino-skupina vedlejšího řetězce

L-lysinu je navázána amidovou vazbou na C-konec.

• 1 · · · · · · • » · · *··· • · · ··· · · · · ' • · · · · · · • · · · ·· · ·

Jak bylo uvedeno výše, Ri může být ω (acylamino)polymethylenová skupina nebo póly(oxyethylenová) skupina, jako je Aao, Aoo, Hoh, Ghx nebo Gao. Aao představuje 8(acetylamino) -3,6-dioxaokt-l-yl, t.j. CH2CH2-O-CH2-CH2-O-CH2CH2NH-Ac. Aoo představuje 8-amino-3,6-dioxaokt-l-yl, t.j. CH2CH2O-CH2-CH2-O-CH2CH2-NH2 . Hoh představuje 6- (L-hydroorotylamino) hex-l-yl, t.j. (CH2) 6-NH-(L-hydroorotyl); kyselina Lhydroorotová je C4N2H5 (0) 2-COOH. Ghx představuje 6—(D— glukonylamino)-hexyl, t.j. (CH2) 6-NH-CO- (CHOH) 4-CH2OH. Gao představuje 6-(D-glukonylamino)-3,6-dioxaokt-l-yl, t.j. CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-NH-CO (CHOH) 4CH2OH.

D-Phe nebo substituovaný D-Phe jsou výhodné v 1-pozici. Fenylový kruh může být substituovaný ve 2-, 3- a/nebo ve 4pozici a výhodné jsou běžné substituce chlorem nebo fluorem ve 2- nebo 4-pozici. α-uhlíkový atom může být také methylovaný. Mohou být také použity jiné ekvivalentní zbytky, které napodobují D-Phe, a mezi tyto zbytky patří D-Ala(thienyl), DAla(cyklopentyl), D-Tyr a D-Tic. Zbytkem ve 2-pozici je také výhodně D-Phe nebo substituovaný D-Phe a takové substituce výhodně zahrnují substituent na uhlíku ve 4-pozici fenylového kruhu nebo na 3- a 4- pozici. Alternativně může být použit Dalanin substituovaný naftylem, stejně jako D-Trp a D-Tyr. 3pozice je výhodně obsazena zbytkem jako je D-Nle, D-Leu, DCML, D-Hle, D-Met nebo D-Val; nicméně, také může být použit DAla(cyklopentyl) nebo D-Phe. D-Arg (který může být substituovaný diethylem) a D-Orn (který může být alkylovaný na své delta-amino skupině, například isopropylem), jsou obecně výhodné pro 4-pozici; nicméně, mohou být použity také D-nArg a jiné ekvivalentní zbytky, jako je D-Lys (který může být také alkylovaný na své ε-amino skupině) a D-Har (který může být substituovaný diethylem). Dále mohou být také použity D-Gmf, D-Dbu, D-4Amf a D-His.

• φ

Ačkoliv se předpokládalo, že dostatečné trvání biologického účinku bude dosaženo použitím sekvence 4 D-aminokyselin, bylo překvapivě zjištěno, že trvání účinku je dosti krátké pro nesubstituované amidy a že dlouhodobý účinek je získán pouze při použití substituovaného amidu na C-konci. Jednotlivé substituce mohou být ve formě ethylu, methylu, propylu, cykloopropylu a pikolylu, stejně jako jiných ekvivalentních zbytků, jako je hydroxyethyl, thiazolyl, aminocyklohexyl, benzyl a substituovaný benzyl. Obecně jsou jako substituenty pro jednou substituované amidy vhodné nižší alkyl nebo pikolyl. Alternativou k jednou substituovanému amidu je dialkylová substituce, například diethylamino; nicméně, výhodně je takový disubstituovaný C-konec obsazen morfolinylovou, thiomorfolinylovou nebo piperidinylovou skupinou, kde piperidinylová skupina je nesubstituovaná nebo je substituovaná 4-hydroxy-skupinou nebo 4-oxo-skupinou. Piperazinylová nebo 4-mono- nebo 4,4-di-substituovaná piperazinylová skupina může být také použita, stejně jako εlysyl.

Bylo zjištěno, že vazba je určována aminokyselinovou sekvencí tetrapeptidu a výhodně mají opioidní peptidy selektivní pro kappa receptor vazebnou afinitu ke kappa receptoru takovou, že jejich Ki je rovna přibližně 2 nM nebo nižší. Dlouhé trvání účinku, které je patrně primárně určováno strukturou amidu navázaného na C-konec, může být účinně testováno zde popsaným testem na antinocicepční aktivitu, a nej výhodnější peptidy mají významnou biologickou aktivitu po dobu 2 až 3 hodin a nemají významné účinky v mozku.

Výhodná podtřída opioidních peptidů podle předkládaného vynálezu má vzorec:

• ftftft · ·

H-Xaai-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q kde Xaai je D-Phe (nesubstituovaný nebo substituovaný C_aMe, 2F, 4F nebo 4C1) nebo D-Ala (cyklopentyl nebo thienyl); Xaa2 je (A')D-Phe, D-lNal, D-2Nal, nebo D-Trp, kde A' je H, 4F, 4C1, 4NO2 nebo 3,4Cl2; Xaa3 je D-Nle, D-Leu, D-CML, D-Met, nebo DAcp; Xaa4 je D-Arg, D-Arg(Et2), D-Lys, D-Ily, D-Har, DHar(Et2), D-nArg, D-Orn, D-Ior, D-Dbu, D-Amf, a D-Gmf; a Q je NR1R2, Mor, Tmo, Pip, 4-HyP, OxP nebo Ppz, kde Ri je Me, Et,

Pr, Bu, hEt, Cyp, Bzl nebo 4-pikolyl, a R2 je H nebo Et.

Další výhodná podtřída opioidních peptidů podle předkládaného vynálezu má vzorec:

H-Xaai-Xaa2-Xaa₃-Xaa4-Q kde Xaai je D-Phe, D-4Fpa, D-2Fpa, D-4Cpa, D-Acp nebo DAla(Thi); Xaa2 je D-Phe, D-4Fpa, D-4Cpa, D-3,4Cpa, D-lNal, D2Nal, nebo D-Trp; Xaa₃ je D-Nle, D-CML, D-Met, nebo D-Leu;

Xaa4 je D-Arg, D-Lys, D-Har, D-nArg nebo D-Orn; a Q je NR1R2, Mor, Tmo, Pip, 4-HyP nebo Ppz, kde Ri je Et, Pr, Bu, Cyp, hEt, Bzl nebo 4-Pic; a R2 je H nebo Et.

H-Xaai-Xaa2-Xaa₃-Xaa4-Q kde Xaai je D-Phe, D-4Fpa, D-2Fpa, D-Acp nebo D-Ala(2Thi); Xaa2 je (A)D-Phe, D-lNal, D-2Nai, nebo D-Trp, kde A je 4F nebo 4C1; Xaa₃ je D-Nle, D-Met, nebo D-Leu; Xaa4 je D-Arg, D-Har, DnArg, D-Lys, D-Orn nebo D-Gmf; a Q je NHRi, Mor, Tmo, Pip nebo Ppz, kde Ri je Et, Pr nebo 4-Pic.

• · · · • ·♦· · 4

H-Xaai-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q kde Xaai je D-Phe, D-4Fpa, D-2Fpa nebo D-Ala(2Thi); Xaa2 je (A)D-Phe, D-lNal, D-2Nal nebo D-Trp, kde A je 3,4Cl2 nebo 4C1; Xaa3 je D-Nle nebo D-Leu; Xaa4 je D-Arg D-Orn nebo D-Gmf; a Q je NHRi, Mor, Tmo, Pop, Ppz nebo N(Et)2, kde Ri je Et, Pr, Cyp, 4Pie, Aeb nebo Hoh.

Bylo zjištěno, že uvedené· třídy a podtřídy opioidních peptidů mají prodloužené trvání antinocicepční aktivity in vivo v důsledku toho, že obsahují substituovaný amid na Ckonci aminokyselinového zbytku v pozici 4. Tato neočekávaná vlastnost činí takové peptidy zejména hodnotnými, protože některé z nich zůstávají in vivo aktivní po dobu tří hodin a déle. Některé peptidy mající výše uvedenou sekvenci, ale mající prostý C-koncový amid, mají také vysokou selektivitu pro KOR oproti MOR; nicméně, mají pouze krátkodobý účinek. Předpokládá se, že takové opioidní peptidy budou mít dlouhodobý účinek tehdy, když budou syntetizovány tak, aby měly substituovaný amid, jako je například morfolid, na Ckonci. V souladu s tím bylo zjištěno, že pokud má tetrapeptidový primární amid vysokou selektivitu vazby na KOR, tak bude mít příslušný substituovaný amid, například ethylamid a morfolid, antinocicepční aktivitu po delší dobu měřenou v hodinách, t.j. alespoň po dobu 1 hodiny, bez významnějšího průniku do mozku.

Ačkoliv jsou výhodné aminokyselinové sekvence uvedeny v předešlých vzorcích, mělo by být odborníkům v oboru peptidové ···· ··«· • · · ··· · · · « «

chemie jasné, že jeden nebo více z uvedených aminokyselinových zbytků může být substituován konzervativními aminokyselinovými substitucemi, například substitucí jedné bazické aminokyseliny za jinou, nebo jedné hydrofobní aminokyseliny za jinou, například D-Ile za D-Leu. Podobně, různé zbytky mohou být také modifikovány běžnými způsoby, například D-Phe může být modifikován obsažením halogenu nebo nitro-skupiny obvykle ve 3- nebo 4-pozici, nebo v obou pozicích, nebo může být a-uhlík methylován. Takové modifikace vedou ke vzniku ekvivalentních opioidních peptidů aktivních na kappa-receptorech.

Peptidy mohou být syntetizovány jakoukoliv vhodnou metodou, jako je syntéza pouze na pevné fázi nebo klasická syntéza v roztoku, nebo alternativně technikou částečné syntézy na pevné fázi nebo technikou kondenzace fragmentů. Například, techniky syntézy pouze na pevné fázi (SPPS) jsou uvedeny v učebnici Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. vydání, Pierce Chemical Company, Rocford, Illinois, 1984, a dále jsou uvedeny v popisu U.S. patentu č. 4105603. Technika syntézy pomocí kondenzace fragmentů je uvedena v U.S. patentu č. 3972859 a další možné techniky syntézy jsou uvedeny v U.S. patetech č. 3842067 a 3862925. Klasická syntéza adicí v roztoku je podrobně popsána v Bodanzsky et al., Peptide Synthesis, 2.vydání, John Wiley and Sons, New York, 1976.

Pro chemické syntézy peptidů kopulačního typu je běžné chránění jakéhokoliv labilního vedlejšího řetězce navazované aminokyseliny a obvykle také chránění α-amino skupiny tak, že adice probíhá na karboxylové skupině jednotlivé aminokyseliny nebo dipeptidu nebo tripeptidu, který je přidáván. Takové chránící skupiny jsou dobře známé v oboru a t-butyloxykarbonyl (Boc), benzyloxykarbonyl (Z) a 9-fluorenylraethoxykarbonyl (Fmoc) jsou často používány jako výhodné α-amino chránící • 0 « 0

0·0 0 0 ♦ 0 • 0 0 0 0 0

0· 00 90 • 0 skupiny při SPPS nebo klasické syntéze v roztoku, ačkoliv existuje značné množství α-amino chránících skupin, které mohou být alternativně použity.

Je-li použito SPPS, tak je C-koncový aminokyselinový zbytek navázán na pevný pryskyřicový nosič, jako je O-CH2polystyrenový nosič, 0-CH2-benzyl-polyamidový pryskyřicový nosič, -NH-benzhydrylaminový (BHA) pryskyřicový nosič nebo NH-paramethylbenzhydrylaminový (MBHA) pryskyřicový nosič. Použití BHA nebo MBHA pryskyřice je často výhodné tehdy, je-li žádoucí zisk nesubstituovaného amidu, protože při štěpení přímo vzniká C-koncový amid. Pokud je žádoucí zisk Nmethylamidu, tak může být tato sloučenina získána z N-methyl BHA pryskyřice. Jiné jednou substituované amidy mohou být syntetizovány postupem popsaným v W. Kornreich et al., Int. J. Peptide Protein Res., 25: 414-420, 1985, a také v U.S. patentu č. 4701499. Peptidy mající di-substituované amidy na C-konci, jako je N-morfolinyl nebo N-piperidinyl, jsou výhodně připraveny klasickou syntézou v roztoku nebo kondenzací fragmentů v roztoku.

Po syntéze jsou tyto tetrapeptidy snadno přečištěny za použití dobře známých technik pro přečištění krátkých peptidů, jako je například vysoce účinná kapalinová chromatografie s reversní fází (RP-HPLC) nebo jiné vhodné techniky. Takové přečištění je podrobně popsáno v J. Rivier et al.,

J.Chromatography, 288: 303-328, 1984, a C.Miller aj.Rivier, Peptide Science, Biopolymers, 40: 265-317 (1996), a konkrétní příklady takového přečištění po syntéze na pevné fázi a podobně jsou uvedeny v U.S. patentu č. 5098995.

Různé testy mohou být použity pro testování toho, zda mají tyto tetrapeptidy vysokou selektivitu pro KOR, silnou • » • · ·· 9· ·· • · ·· * ·· · · · « · • · · · φ · ·«·» ί* 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9

9 9 99 9 9999

999 999 99 99 99 99 antinocicepční aktivitu, dlouhé trvání biologické aktivity in vivo a toho, zda nepronikají hematoencephalickou barierou. Receptorové testy jsou dobře známé v oboru a myší, krysí, morčecí a lidské KOR byly nedávno klonovány. S výjimkou gpKOR jsou všechny klonované KOR velmi podobné a všechny obsahují 380 aminokyselin. Aminokyselinová sekvence hKOR má 93,9% a 93,4% homologii s rKOR a mKOR, v příslušném pořadí. Naopak, hKOR se významně liší od hMOR a od lidských delta-opíoídních receptorů (hDOR), které mají, v příslušném pořadí, pouze 60,2% a 59,1% identitu aminokyselinové sekvence. KOR jsou, stejně jako jiné opiátové receptory, klasickými, receptory spřaženými s G-proteinem (Gi) překlenujíčími membránu v sedmi pozicích. Tyto klonované receptory umožňují snadné testování vybraného peptidů;. například, vyšetřování na účinky na KOR a MOR může být provedeno pro stanovení selektivity. Lidské KOR, MOR a DOR byly stabilně exprimovány v myší nádorové buněčné linii odvozené od hippokampálního neuroblastomu (HN.9.101) a jsou dostupné pro skríning in vitro. Existuje také mnoho všeobecně přijímaných testů in vivo, které se staly standardy pro stanovení antinocicepční aktivity opioidních sloučenin. Tyto testy obecně využívají myší a patří mezi ně test ocasní citlivosti, test tlaku na tlapku, test dráždění kyselinou octovou, test píchnutí do ocasu a test ponoření ocasu. Vonvoigtlander, P.F. et al., J. Pharm. Therapeutics, 224: 7-12 (1983), popisuje mnoho takových testů pro opiodní sloučeniny.

Vazebná afinita označuje sílu interakce mezi ligandem a receptorem. Pro demonstrování vazebné afinity pro opiodní receptory byly peptidy podle předkládaného vynálezu hodnoceny za použití testu kompetitivní vazby. Tyto testy byly provedeny za použití klonovaných lidských kappa (hKOR) a mu opiodních (hMOR) receptorů exprimovaných ve stabilně transfektovaných buněčných liniích (HN.9.10, odvozená od myšího hippokampálního

44*4 44

444 444

44 4 4 4« 4

44 4 4 44 4

4 44444 44 4 • 4 4 4 4 4 4

44 44 44 neuroblastomu). V těchto testech jsou testované sloučeniny (neznačené nebo značené neradioaktivně) použity ve zvyšujících se koncentracích pro odstranění radioaktivně značeného ligandu s vysokou afinitou a selektivitou pro studované receptory z vazby. ³H-U-69,593 a ³H-DAMGO byly použity jako ligandy v testech s hKOR a hMOR, v příslušném pořadí. Oba ligandy jsou komerčně dostupné (NEN-DuPont). DAMGO je akronym pro [D-Ala , MePhe⁴, Gly-ol⁵] -enkephalin. Afinita radioaktivně značeného ligandu je definována koncentrací radioaktivně značeného ligandu, která vede k polovině maximální specifické vazby (Kd) v saturačních testech. Kd pro ³H-U-69593 na hKOR a pro ³H DAMGO na hMOR jsou přibližně 0,3 nM a 3,0 nM, v příslušném pořadí. Afinita testované sloučeniny (neznačené nebo neradioaktivně značené) je stanovena v testech kompetitivní vazby výpočtem inhibiční konstanty (Ki) za použití následujícího vzorce:

IC₅o _Ki =-:— + (F/Kd) kde

IC50 = koncentrace neradioaktivně značeného ligandu, která inhibujé 50% specifické aktivity radioaktivně značeného ligandu;

F = koncentrace volného radioaktivně značeného ligandu;

Kd - afinita radioaktivně značeného ligandu stanovena v saturačních testech.

Při provádění těchto testů za specifických podmínek s relativně nízkými koncentracemi receptoru je vypočítaná Ki pro testovanou sloučeninu dobrým přiblížením její dissociační konstantě Kd, která představuje koncentraci ligandu nezbytnou pro obsazení jedné poloviny (50%) vazebných míst. Nízká

• ft ftft	ftft	ft»	« »
							•
ft	ft	ft	• · ·	«	ft	»	•
•	ft	• ·	ft ftftft	• ·	•	•	«
•	•	•	• ·	•	ft	ft	•
• ft ·	• ftft	• ·	* ·		» ·	ft	ft

hodnota Ki v řádu nanomolů a nižších se považuje v oblasti opiátů za charakteristickou pro vysoce afinitní ligandy. Výhodné analogy mají Ki pro KOR přibližně 2 nM nebo nižší, zatímco výhodnější analogy mají Kipřibližně 1 nM nebo nižší. Protože jsou KOR receptory distribuovány v různých místech těla, budou mít opioidní peptidy aktivní na kappa-receptorech významný efekt na modulování mnoha periferních účinků, a pokud jsou tyto peptidy vysoce KOR-selektivní, tak budou mít minimální nežádoucí účinky a budou dobrými fyziologicky působícími léčivy.

Tyto vazebné testy využívající KOR a MOR jsou snadno proveditelné a mohou být provedeny s nově identifikovanými nebo syntetizovanými peptidy pro stanovení toho, zda jsou takové peptidy KOR-selektivní a zda mají vysokou afinitu. Takové vazebné testy mohou být provedeny různými způsoby známými v oboru a jeden příklad takovéhoto testu je uveden v Perrin et al., Endocrinology, 118: 1171-1179, 1986.

Předkládaný vynález je dále popsán v následujících příkladech. Tyto příklady neomezují žádným způsobem rozsah předkládaného vynálezu, který je definován pouze připojenými patentovými nároky.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1:

Peptid vzorce: H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NHEt je syntetizován způsobem dobře známým v oboru peptidové syntézy. Například, tripeptid: (α-amino skupinu chránící skupina)-DPhe-D-Phe-D-Nle (karboxylovou skupinu chránící skupina) je nejprve syntetizován klasickou syntézou v roztoku. Například ♦ · · · · • e · · · • · * ♦ · **· · · • · · · • · ·« • ♦ · může být tripeptid připraven rozpuštěním H-D-Nle-Ome v DMF a přidáním N-ethylmorfolinu (NEM) nebo podobného činidla pro úpravu pH. Tento roztok.se potom smísí s roztokem Bocchráněného D-Phe-OH v DMF obsahujícím NEM. Do této reakční směsi se potom přidá aktivační nebo kopulační činidlo, jako je benztriazol-l-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfonium hexafluorfosfat (BOP) nebo směs Ν,N'-diisopropylkarbodiimidu (DIC) a N-hydroxybenztriazolu (HOBt). Po dokončení reakce se medium odpaří a získaný materiál se vhodným způsobem přečistí a rekrystalizuje se. Boc chránící skupina se potom odstraní pomocí kyseliny trifluoroctové (TFA) a dipeptid se rozpustí v DMF. Potom se přidá roztok Boc-chráněného D-Phe rozpuštěného v DMF, s NEM. Reakce se opakuje za použití BOP, jak bylo popsáno výše, za vzniku tripeptidu, který se - po odpaření roztoku do sucha - přečistí a rekrystalizuje se. Získaným materiálem je Boc-D-Phe-D-Phe-D-Nle-OCHb. Methylester se potom vhodným způsobem přemění na volnou kyselinu, například rozpuštěním ve směsi dioxanu nebo DMSO a vody a přidáním hydroxidu sodného. Po dokončení reakce, separaci, přečištění a rekrystalizací se získá tripeptid Boc-D-Phe-D-Phe-D-Nle-OH.

Tripeptid se rozpustí v DMF obsahujícím NEM a reaguje s DArg(Tos)-NHEt, opět za použití BOP jako kopulačního čindila. Alternativně může být tripeptid-methyl ester přeměněn na azid, pokud je to vhodném, reakcí s 80% roztokem hydrazinhydratu za vzniku hydrazidu, který se izoluje a potom reaguje s dusitanem sodným a anorganickou kyselinou v DMF. Azid ihned reaguje s DArg(Tos)-NHEt v roztoku DMF obsahujícím triethylamin. Po dokončení reakce se směs odpaří do sucha, potom se vhodným způsobem přečistí a rekrystalizuje se. N-konec a vedlejší řetězec D-Arg se potom zbaví chránící skupiny a opět se provede přečištění a rekrystalizace, čímž se získá požadovaný ethylamid tetrapeptidu (peptid č. 1).

4 ·· ·· · · • · · · · · · *

4 4 4 4 4 4 ·

4 4 4 4 4 4 ·· ·

Homogenita peptidu se potvrdí HPLC s reversní fází za použití dvou různých mobilních fází: gradientu acetonitrilu ve vodě obsahující 0,1% kyselinu trifluoroctovou a gradientu acetonitrilu v triethylamin-fosfatovém pufru s pH 7, a také kapilární elektroforesou na oxidu křemičitém za použití fosfátového pufru s pH 2,5. Čistota peptidu je podle těchto metod > 98%. Analýza hmotnostní spektrometrií za použití elektrospray-ionizace a záchytu iontů ukázala přítomnost pseudomolekulového iontu [MH] ⁺ při m/z 609,4, což je v souladu s vypočítanou hmotností m/z 609,5 pro tento tetrapeptid. Fragmentační analýza pseudomolekulového iontu ukázala sérii iontů při m/z poměrech, které odpovídají sekveci aminokyselin předpokládané pro připravenou sloučeninu.

Vazebné testy s buňkami exprimujícími lidský KOR a MOR se provedly způsobem popsaným výše. Afinity testovaného peptidu ke hKOR a hMOR stabilně exprimovaným na myších buňkách hippokampálního neuroblastomu (HN.9.10) byly stanoveny kompetitivním vytěsněním ³H-U-69,593 pro hKOR a nebo ³H-DAMGO pro hMOR, jak bylo popsáno výše. Data alespoň ze tří pokusů byla shrnuta a hodnoty inhibiční disociační konstanty (Ki) (95% interval spolehlivosti) byly vypočítány za použití vhodného programu, jako je LIGAND program od Mundson a Rodbard, Anal. Biochem. 107: 220-239, 1980. Klonované KOR váží peptid č. 1 s vysokou afinitou, jak bylo stanoveno kompetitivním vytěsněním navázaného radioaktivně značeného ligandu, a Ki byla určena na přibližně 0,05 ± 0,02 nM. Rozdíl v afinitě je výrazný ve srovnání s podobně stabilně transfektovanými nádorovými buňkami exprimuj ícími lidské MOR, kde je Ki 1890 ± 990 nM. Peptid č. 1 se tedy váže přibližně 38000-krát silněji na hKOR než na hMOR.

Testování peptidu na myších v testu podráždění kyselinou • · φφ φφ φφ φ ·· φ · · φ · φ φφ φ φ φφ · φφ φ ΦΦΦΦΦ φφ φ φ φ φ φφφφ φ φ φ φ φ φ φφ φφ φφ φφ octovou (jak je popsán dále) určilo ED50 přibližně na 0,09 mg/kg a ukiázalo, že peptid vykazuje více než 50% antinocicepční účinnost po 3 hodinách. Peptid č. 1 má tedy velmi dlouhé trvání účinku.

Příklad 2

Oplodní peptidy mající obecný vzorec: H-D-Phe-D-Phe-D-NleD-Arg-Q, jak jsou uvedeny v tabulce A, byly syntetizovány a testovány způsobem popsaným v příkladu 1.

Tabulka A

Tabulka A
č.	Q	K KOR (nM)	k MOR (nM)	poměr μ/κ	Hmotnostní spektroskopie	WT-ED„ mgůig
vypočítáno změřeno
2	NHMe	0.06	3,620	60,000	395.4	595.5	0.14
3	NHPr	0.09	1,640	18,000	623.4	623.5	0,078
4	NHBu	0.19	1U70	7,200	637.4	637.5	OSO
5	NH(Cyp)	0.18	3,320	20,000	621.4	621.5	0.04
6	Mor	0.06	2,510	42.000	631.4	651.4	0.014
7	N(Et!)	0.11	1,900	17,000	637.4	637.5	0.02
8	NH(4Pic)	0.14	3,640	26,000	672.4	672.4	0.01
9	NHhEt	0.40	1,010	2,300	625.4	625.5	0.03
10	Tmo	0.09	2S60	23.000	667.4	667.3	0.067
11	4-HyP	0.06	3,700	62,000	665.4	665.4	0.073
12	Pip	0.13	1,050	7,000	649.4	649.5	0.07
13	NH(2Tzl'i	0.39	1,590	2.700	664.3	664.4	0.44
14	NHBzl	0.44	890	2,000	671.4	671.4	0.14
15	Ppz	0.16	9,300	37,000	650.4	630.5	0.017

Peptidy 2 až 15 jsou považovány za peptidy s dlouhým trváním antinocicepční biologické aktivity.

···· ···· • · · · · · · · · · ·

Příklad 3

Opiodní peptidy mající obecný vzorec: H-Xaai-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q, jak jsou uvedeny v tabulce B, byly syntetizovány a testovány způsobem popsaným v příkladu 1.

		Tabulka B
č.	Xaa,	3ÚU4	X*»,	Xia,	Q
16	D-4Fpa	D-Phe	D-Nle	D-Arg	NHEt
17	D-Acp	D-Phe	D-Nle	D-Arg	NHEt
18	D-Ala(2Thi)	D-Phe	D-Nle	D-Arg	NHEt
19	D-Tyr	D-Phe	D-Nle	D-Arg	Mor
20	D-Phe	D-Trp	D-Nle	D-Arg	Mor
21	D-Phe	D-4Npa	D-Nle	D-Arg	Mor
22	D-Phe	D-4Cpa	D-Nle	D-Arg	Mor
23	D-Phe	D-lNal	D-Nle	D-Arg	NH(4Pic)
24	D-Phe	D-2Nal	D-Nle	D-Arg	NH(4Pic)
25	D-Phe	D-Tyr	D-Nle	D-Arg	NH(4Pic)
26	D-Phe	D-Phe	D-Leu	D-Arg	Mor
27	D-Phe	D-Phe	D-Val	D-Arg	Mor
28	D-Phe	D-Phe	D-Acp	D-Arg	Mor
29	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Lys	Mor
30	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Har	NHEt
31	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-HarCEt^	NHEt
32	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Om	NHEt
33	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Amf	NH(4Pic)
34	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Dbu	NH(4Pie)
35	D-Phe	D-Phe	D-Leu	D-Orn	Ppz
36	D-Phe	D-Pbe	D-Phe	D-Arg	NH(4Pic)
37	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-IIy	NH(4Pic)
38	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Ior	NH(4Pic)
39	D-Phe	D-4Mpa	D-Nle	D-nArg	Mor

Peptidy 16 až 39 jsou považovány za peptidy s dlouhým trváním antinocicepční biologické aktivity.

• · fcfcfcfc · · · · • · · · ······ fcfc · • · fc · ····· • fc· fcfcfc · · ' fc · fcfc ··

Příklad 4

Opiodní peptidy mající obecný vzorec: H-Xaai-Xaa2-Xaa3-Xaa4~ -Q, jak jsou uvedeny v tabulce C, byly syntetizovány a testovány způsobem popsaným v příkladu 1.

Vazba

Tabulka C Hmotnostní spektroskopie (p_Omg_r μ/κ)

č.	Xu,	Xaa,	Xaa,	Xaa,	Q vypočítáno změřeno
40	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Arg	NH(4Nhz)	716.4	716.5	3,800
41	D-Phe	D-Phe	D-Nte	D-Arg	NH(4Abz)	686.4	686.4	1X000
42	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Arg	Ecp	721.4	721.5	27,000
43	D-CMP	D-Phe	D-Nle	D-Arg	NH(4Pie)	686.4	686.5	2,500
44	D-Phe	D-Phe	D-Acp	D-Arg	NH(4Pic)	698.4	698.5	8,300
45	D-Phe	D-Phe	D-Hle	D-Arg	NH(4Pic)	686.4	686.5	11,000
46	D-Phe	D-Phe	D-CML	D-Om	Mor	623.4	623.4	14,000
47	D-Phe	D-Phe	D-Leu	D-Lys	NH(4Pic)	644.4	644.3	30,000
48	D-Phe	D-Phe	D-Leu	D-Lys	NHPr	595.4	595.3	18,000
49	D-Phe	D-Phe	D-Leu	D-Lys	Mor	623.4	623.3	92,000
50	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Har	NH(4Píc)	686.4	686.5	9,300
51	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Har	Mor	665.4	665.5	12,000
52	D-Phe	D-Phe	D-Leu	D-Dbu	NH(4Pic)	616.4	616.3	92.000
53	D-Phe	D-Phe	D-Leu	D-Dbu	Mor	595.4	595.3	85.000

Peptidy 40 až 53 jsou považovány za peptidy s dlouhým

trváním antinocicepční biologické aktivity.

Příklad 5

Opiodní peptidy mající obecný vzorec: H-D-Phe-Xaa2~Xaa3Xaa₄-Q, jak jsou uvedeny v tabulce D, byly syntetizovány a testovány způsobem popsaným v příkladu 1.

Tabulka D
č.	Xaa,	Xaa,	Xaa,	Q	K, KOR (nM)	k MOR (nM)	poměr * μ/κ	Hmotnostní spektroskopie	%t.ed_m mg/kg
1 vypočítáno změřeno
54	D-Phí	D-NIe	D-Arg	NH(3Pic)	0.39	1,220	3,100	672.4	672.5
55	D-Phe	D-Nle	D-Amf	NHEi	0.14	1.750	12,500	629.4	629.3	0.083
56	D-Phe	D-teu	D-Om	NHEt	0.31	4,150	13,000	567.4	567.4	0.057
57	O-Phe	D-Líu	D-Om	Mor	0.19	5,260	28,000	609.4	609.3	0.026

Peptidy 54 až 58 jsou považovány za peptidy s dlouhým trváním antinocicepční biologické aktivity.

Příklad 6

Opiodní peptidy mající obecný vzorec: H-Xaai~Xaa2~Xaa3-DArg-Q, jak jsou uvedeny v tabulce E, byly syntetizovány a testovány způsobem popsaným v příkladu 1.

Tabulka Ε

• « φ « · · · • · · » φ φ · • φ · φ φ φ φφ φ φ φ· φφ φ φ φ· ·φ

č.	X»t		X«,	Q	K, KOR (nM)	k MOR (nM)	poměr μ/κ	Hmotnostní spektroskopie	WT-ED» m§'kg
vypočítáno	změřeno
39	D-Ala(2Thi)	D-4Cpa	D-Leu	Mor	0.23	3,360	13,000	691.3	691.1	0.052
60	D-Ala(2Thi)	D-3,4Cpa	D-Leu	NH(4Pic)	0.4	769	1,900	746.3	746.3	0.083
61	D-Ala(2Thi)	D-3.4Cpa	D-Leu	Mor	0.13	1.560	10,400	725.3	725.4	0.019
62	D-Phe	D-Phe	D-Nle	OxP	0.11	X970	27,000	663.4	663.5	0.18
63	D-AU(2Thi)	D-2N*i	D-Leu	Mor	0.2	3.170	16,000	707.4	707.4	0.04
64	D-Phe	D-Phe	D-Nle	Dmp	0.21	7,680	37,000	678.4	678.5	0.032
65	D-4Fpa	D-4Cpt	D-Leu	Mor	0.17	1.900	11,000	703.4	703.4	0.15

Peptidy 5 9 až 65 jsou považovány za peptidy s dlouhým trváním antinocicepční biologické aktivity.

Příklad 7

Opiodní peptidy mající obecný vzorec: H-Xaai-Xaa2-Xaa3-Xaa4~ -Q, jak jsou uvedeny v tabulce F, byly syntetizovány a testovány způsobem popsaným v příkladu 1.

Tabulka F 1
č.	X»,	Xix,	Xaa,	Xu.	Q
66	D-4Cpa	D-4£pa	D-Leu	D-Lyi	NHPr
67	D-4Fpa	D-2N*1	D-Met	D-Amf	NHBu
68	5-tCpa	D-Trp	D-Acp	D-Amf	Pip
69	D-Phe	D-Phe	D-Val	D-Om	Ecp
70	D-Ala<2Thi)	D-4Fpa	D-Nle	D-Dbu	NH(4Abz)
71	D-Acp	D-Phe	D-Leu	D-Har	4-HyP
72	D-CMP	D-Trp	D-Phe	D-ArglEit)	NHBzl
73	D-4Cpa	D-3,4Cpa	D-Met	D-Om	Tmo
74	D-Acp	D-lNaJ	D-Nle	D-HirfEy	NH(3Pic)
75	D-4Fpa	O-4Cpa	D-Leu	D-Gmf	NHhEt
76	D-CMP	D-Tyr	D-Acp	D-Dbu	NHlpr
77	D-Phe	D-2Nal	D-Acp	D-Ily	NHPn
78	D-Tic	0-4 F pa	D-Phe	D-Lys	NH(4Pic)
79	D-4Npa	D-Trp	D-CML	D-Ior	NfEl),
80	D-CMP	D-Phe	D-Met	D-Ior	Mor
81	D-AiipThi)	D-lNal	D-Nle	D-Lys	NH(2Tzll
82	D-Phe	D-4Npa	D-Nle	D-Arg	NHCyp

·· 4 4 · · ·· • ♦ · · ···· • · · · 4 * 4 · · · · · · · · · · · · · · · »

83	D-Acp	D-2Nal	D-Hle	D-Har	NHCvb
84	D-Tyr	D-2Nal	D-Phe .	D-Lys	Ppz
Sí	D-Phe	D-lNal	D-Met	D-Ior	OxP
86	D-Phe	D-Trp	D-Met	D-Arg	Dmp
87	D-Phe	D-Trp	D-Nle	D-Orn	Mor

Opiodní peptidy z tabulky F jsou považovány za peptidy vykazující vysokou selektivitu pro KOR oproti MOR a vykazují antinocicepční biologickou aktivitu in vivo.

Příklad 8

Opiodní peptidy mající obecný vzorec: H-Xaai~Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q, jak jsou uvedeny v tabulce G, byly syntetizovány a testovány způsobem popsaným v příkladu 1.

Tabulka G	poměr μ/κ	WT-EDj, mg/kg
č.	Xaa,	Xaa.	Xaa,		Q
88	D-4Fpa	D-Phe	D-Nle	D-Arg	NH(4Pic)	16.000	0.04
89	D-3Fpa	D-Phe	D-Nle	D-Arg	NH(4Pic)	24,000	0.11
90	D-2Fpa	D-Phe	D-Nle	D-Arg	NH(4Pie)	38,000	0.14
91	D-4Fpa	D-Phe	D-Nle	D-Har	NH(4Pic)
92	D-4Opa	D-Phe	D-Nle	D-Arg	NH(4Pic)	2,900
93	D-4Fpa	D-4Npa	D-Nle	D-Arg	NH(4Pic)	uoe
94	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Arg	Ely	70,000	0.02
95	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-nArg	NH(4Pic)	16,000	0.08
96	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Arg	Pep	12,000	0.09S
97	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Arg	NH(4Acx)	6,400
98	D-Phe	D-Phe	D-Leu	D-Om	NH(Aeb)	24,000	0.014
99	D-Ala<2Thi)	D-3,4Cpa	D-Leu	D-Orn	Mor	19,000	0.083
100	D-Ala(2Thi)	D-2Nal	D-Leu	D-Om	Mor	3i;ooo	0.079
101	D-Ala<2TW)	D-4Cpa	D-Leu	D-Om	Mor	38,000	0.112

• · · · · · 0 0 ·· • · · 0 · · * 0 · · · · • · 0 0 0 0 · » · » • · · 0 0 000 90 ·· 0 • 0 99 0 0 · 0 0

000 ··· 00 ·0 0· 00

102	D-Ala(2Thi)	D-4Cpi	D-Leu	D-Cm	NH(4Pic)	24,000	0.032
103	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Arg	NH(A»o)	140,000	0.101
104	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Arg	NH(Aoo)	6,300
103	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Arg	NH(Hoh)	66,000	0.015
106	D-Phe	D-Phe	D-Nie	D-Arg	NH(Ahx)	10,000	0.055
107	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Arg	NH(Ghx)	22,000	0.032
108	D-Phe	D-Phe	D-Nle	D-Arg	NH(Gao)	67,000	0.034

Peptidy 88 až 108 jsou považovány za peptidy s dlouhým trváním antinocicepční biologické aktivity.

Příklad 9

Vybrané peptidy, které jsou identifikovány v tabulkách A-G, byly dále testovány in vivo pro stanovení trvání účinku jejich opiodních vlastností, a výsledky těchto testů jsou uvedeny v tabulce H. Číslování peptidů odpovídá číslování v předešlých tabulkách a μ/κ poměry jsou uvedeny pro srovnání. Testování in vivo se provede pomocí dráždivého testu na myších, který je vhodný pro stanovení trvání antinocicepční biologické aktivity, tento tes je podrobně popsán v G.A. Bentley et al., Br. J. Pharmac., 73: 325-322, 1981, a využívá samců ICR myší v bdělém stavu, kteří jsou získáni od Harlan a které mají hmotnost mezi 20 a 30 gramy. Před zahájením testu se myši ponechají 12 - 16 hodin na lačno. Nocicepční chování, tj. škubání, které je sledováno, se indukuje intraperitoneálním podáním (i.p.) ředěné kyseliny octové. Použije se 10 ml 0,6% vodného roztoku kyseliny octové na kg tělesné hmotnosti. Škubání se hodnotí v průběhu 15 minut po podání kyseliny octové. V prvním kroku se sloučeniny testují ve 3 až 4 zvyšujících se dávkách, které jsou podány intravenosně, jednou před podáním kyseliny octové (přibližně 5 minut před podáním kyseliny octové). Tento krok se použije pro stanovení • φ

Φ φφ · φ φ · · φφ · φ φ φ φ φ ·· · φφφ φφφ φφ φφ φφ φφ účinnosti (WT-ED50) , stejně jako submaximální účinné dávky (přibližně 80-90% antinocicepce). Ve druhém stupni se tato submaximální účinná dávka pro každý určitý peptid podá v různou dobu před aplikací kyseliny octové (tj. -5 minut, -60 minut, -120 minut a -180 minut) před podáním kyseliny octové, což umožní stanovení trvání účinku. V testu se použije kontrolní skupina myší, kterým je podáno pouze vehikulum bez testovaného peptidů. Počítá se počet záškubů během 15 minut, od podání kyseliny octové, a biologická aktivita, tj . antinocicepční aktivita, se vyjádří v procentech a vypočítá se následujícím způsobem:

(záškuby v kontrolní skupině - záškuby v léčené skupině)

100 _χ ------záškuby v kontrolní skupině

Protože se bude každá submaximální dávka s velkou pravděpodobností lišit tak, že tyto hodnoty nebudou přímo srovnatelné, jsou výsledky normalizovány matematicky, jak je známo v oboru, za zisku srovnatelných hodnot, které jsou uvedeny v tabulce Η. V tabulce H je antinocicepční aktivita zůstávající po 1, 2 a 3 hodinách vyjádřena jako procento aktivity zjištěné v -5 minutách. Hodnoty vyšší než 100% ukazují na vyšší antinocicepční aktivitu nežna začátku pokusu. Aby mohl být opiodní peptid považován za dlouhodobě účinný in vivo, měl by být účiny v redukci záškubů o alespoň 25% v čase 1 hodina.

Kromě použití pro stanovení trvání antinocicepční aktivity je tento test také použit pro měření biologického potenciálu peptidů in vivo (krátkodobého). Tato hodnota jev tabulce uvedena ve sloupci WT-ED50 v miligramech na kg tělesné hmotnosti. Hodnota uvádí dávku nutnou pro redukci počtu záškubů u testované myši o 50% (ve srovnání s kontrolní myší) • ft · · ·· · · ftft • · · · ♦ ftft · · · v * • · ftftftft ftftftft • · · · ftftftftftft ftft · • · ftft ft ftftft· ftftft ftftft ftft ftft ·» ftft během 15 minutového období.

		Tabulka H
Peptid č.	Poměr μ/κ		%Antinocicepce	i
WT-EDje mg/kg	1 h	2 h:	3 hr
1	38,000	0.09	83.9	75.5	61.3
2	60,000	0.14	70.5	29.8
3	18,000	0.078	48.6	39.8
4	7,200	0.3	49.3
5	20,000	0.04	66.0	34.5
6	42,000	0.014 .	105.7	52.7
7	17,000	0.02	67.5	36.8
8	26,000	0.01	66.9	45.1
9	2,500	0.03	72.5	39.5
10	25,000	0.07	81.6	47.5
11	62,000	0.07	61.8	36.9
12	7,000	0.07	60.5	53.6
13	2,700	0.44	30.7
14	2,000	0.14	36.0
15	57,000	0.017	60.0
42	27,000	0.06	45.3	29.4
43	2,500	0.2
44	8,300	0.2
46	14,000	0.083
47	30,000	0.09
48	18,000	0.065	53.7
49	92,000	0.02	65.5	69.2	38.3
50	9,300	0.077	35.6
51	12,000	0.018	32.5
52	92,000	0.019	30.6
53	85,000	0.026	47.7	32.6
56	13,000	0.057	77.4	59.3
57	28,000	0.026	100	67.2	58.2
58	6,500	0.04	93.4	45.7
59	13,000	0.052	83.3	59.7
60	1,900	0.083	83.8	35.5
61	10,400	0.019	57.5	60.3

Tabulka Η - pokračování

62	27,000	0.18	38
63	16,000	0.04	51.8	36.1
64	37,000	0.032	74.7
65	11,000	0.031	39.5
88	16,000	0.04	56.6	28.9
94	70,000	0.02	58.8
95	16,000	0.08	45.8
96	12,000	0.098	56.7
98	24,000	0.014	85.5	40.8
99	19,000	0.083	50.3	69.3
100	31,000	0.079	82.8	27.6
101	38,000	0.112	89.9	45.6
102	24,000	0.032	63.9
103	140,000	0.101	37.1
105	66,000	0.015	48.2
106	0.055	46.7
107	22,000	0.032	29.0
108	67,000	0.034	84.3	32.9

Opiodní peptidy jsou použitelné jako analgetika a pro jiné farmaceutické účely pro léčbu stavů spojených s KOR systémem. Mají určité výhody ve srovnání s analegtiky agonistickými na μ receptorech, jako je například morfin, které mají nežádoucí účinky, jako je zácpa, respirační deprese a svědění. Značně výhodné je to, že tyto peptidy nepřekonávají významným způsobem hematoencephalickou barieru, což přispívá k omezení nežádoucích účinků. Bezpečnost těchto sloučenin s ohledem na pronikání do mozku je hodnocena pomocí srovnání jejich schopnosti vyvolat periferní účinky a jejich schopnosti vyvolat centrální účinky. Periferní účinky jsou měřeny pomocí dráždivého testu na myších (WT), který byl popsán dříve. Centrální účinky způsobené působením na kappa-receptory v mozku jsou měřeny za použití testu měřícího škubnutí ocasu na myších (TF).

• * 4 4

4 444

4 4

4 4 · ·4 ·

Test měřící škubnutí ocasu je test na akutní somatickou bolest, který je určen pro hodnocení účinnosti a trvání účinku centrálně působících analgetik. Nocicepce indukovaná ponořením ocasu do horké vody (52 °C) vede k rychlému škubnutí ocasu. Předpokládá se, že centrálně působící analgetika budou v závislosti na dávce zvyšovat latenci škubnutí ocasu. Test je popsán ve Vanderah, T.W. et al., J. Pharm. Exper.

Therapeutics, 262: 190-197, 1992.

Bezpečnost je měřena za použití indexu penetrace do mozku (BPI), který je definován jako:

TF - ED50

BPI = WT — ED50 kde EDsojsou dávky, které vyvolávají poloviční maximální účinek v testu dráždění u myší (WT-ED50) a v testu měřícího škubnutí ocasem na myších (TF-ED50) , v příslušném pořadí, jsou-li podány i.v. Vyšší hodnota BPI ukazuje na nízký průnik do mozku a ukazujem sloučenina bude pravděpodobně mít široký bezpečnostní interval (chybění centrálních nežádoucích účinků), když bude použita pro účely popsané v předkládaném vynálezu. Výhodné opiodní peptidy mají BPI rovný nebo vyšší než 100 a nejvýhodnější opiodní peptidy mají BPI vyšší než 300.

Systémový nepeptidový kappa agonisté (například Enadolin a U69593) mají BPI nižší než 5, což ukazuje na významné pronikání do mozku, které se také odráží v nežádoucích účincích (diuresa, dysforie a sedace, které vyvolávají při klinickém použití. BPI hodnoty pro některé representativní peptidy jsou uvedeny v tabulce I:

Tabulka I
peptid č.	WT-ED_So mg/kg	TF-EDjo ng/kg	BPI
1	0.09	9.7	108
3	0.078	13.82	177
5	0.04	4.4	110
6	0.014	6.4	457
7	0.020	3.1	155

• 4 • · · » 4

4 *·· 4 4

s	0.01	__s_ 444 9.84	t 4 · · · · _L 444 44 «4 4 984
15	0.017	2.86	168
49	0.020	1.62	81
53	0.026	2.1	81
57	0.026	5.6	215
58	0.034	4.34	128
61	0.019	>10	>526
88	0.040	12	300
96	0.098	>10	>102
98	0.014	3.5	250
99	0.083	16	193
102	0.032	>10	>313
105	0.015	12.6	840

Protože se tyto peptidy váží silně na KOR, jsou talce použitelné v testech in vitro pro studium receptorů a pro stanovení toho, které receptory mohou být přítomny v určitém vzorku tkáně. Tak jsou tyto peptidy použitelné pro diagnostiku a potenciálně také pro diagnostiku in vivo.

Obecně mohou být tyto peptidy použity pro dosažení antinocicepce při léčbě viscerální bolesti a také pro léčbu revmatoidní artritidy. Jsou zejmény vhodné pro léčbu břišních příznaků po chirurgických výkonech, jako jsou trávicí problémy a bolest. Jsou také považovány za účinné při léčbě IBS, nestability močového měchýře, inkontinence a jiných stavů, při kterých dochází v důsledku lokálního zánětu k bolesti střev nebo jiných orgánů, jak je tomu například při zánětlivých střevních onemocněních (IBD) a dysmenorhee. Schopnost opiodního peptidu snižovat imunitní odpověď může být výhodná při léčbě IBD a jiných stavů, jako jsou autoimunitní onemocnění. Podání těchto peptidů může být použito pro dosažení lokální analgesie jak při akutních, tak při chronických zánětlivých onemocněních. Mohou být použity pro léčbu ileosního stavu s příznaky jako je vzedmuté břicho, nevolnost, nebo pro léčbu přechodné inhibice střeva spojené

00 0 0 00 ·

00 0 0 00 0

000000 00 0

0· 0 0 0 0 0

000 000 00 «· 00 00 s bolestí, jak je tomu například při obstrukci střeva způsobené spastickými kontrakcemi. Opiodní peptidy jsou také účinné v dosažení periferní analgesie a mohou být podány pro zmírnění pooperační bolesti, stejně jako pro zmírnění chronické bolesti, která může být způsobena například zánětem gastrointestinální či viscerální tkáně, a také mohou být použity pro léčbu abstinenčních příznaků při návyku.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být podány ve formě farmaceuticky přijatelných netoxických solí, jako jsou adiční soli s kyselinami, které jsou dobře známé v oboru. Příklady takových adičních solí s kyselinami jsou hydrochlorid, hydrobromid, síran, fosforečnan, dusičnan, šťavelan, fumarat, glukonat, tannat, pamoat, maleinan, octan, citrát, benzoat, jantaran, alginat, jablečnan, askorbat, vinan a podobně. Pokud je aktivní složka podána ve formě tablety, tak může tableta obsahovat farmaceuticky přijatelné, netoxické ředidlo, které obsahuje pojivo, jako je tragant, kukuřičný škrob nebo želatina. Také může být provedeno intravenosní podání izotonického salinického roztoku, fosfátového pufru, roztoku manitolu nebo glukosy.

Farmaceutické prostředky budou obvykle obsahovat účinné množství peptidu spolu s běžným, farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem. Obyčejně bude prostředek obsahovat antinocicepční množství, tj. množství, které je účinné pro blokování bolesti. Obvyklá dávka bude od přibližně 1 gg do přibližně 10 mg peptidu na kilogram tělesné hmotnosti pacienta při intravenosním podání. Prostředek může být podáván podle potřeby; například může být podání opakováno v 3-6 hodinových intervalech. Charakter těchto sloučenin umožňuje účinné orální podání; nicméně, orální dávky jsou vyšší. Pokud je žádoucí podávání opioidního peptidu po delší dobu, například po dobu 1 ··· 9 9 9 • · · • · · • · © 9 9 9 9

99 9 · 9 9 týdne nebo déle, za použití jedné aplikace, tak je možno použít depotní nebo implantovatelné dávkové formy s pomalým uvolňováním. Například, vhodný depotní prostředek se zpomaleným uvolňováním pro injekční podání může obsahovat peptid nebo jeho sůl dispergovaný nebo obalený v pomalu degradovatelném, netoxickém nebo neantigenním polymeru, jako je polymer kyseliny polymléčné/kyseliny polyglykolové, jak je popsán v U.S. patentu č. 3773919. Je také známo, že pomalého uvolňování může být dosaženo pomocí silastických implantátů.

Tyto sloučeniny mohou být podány savcům, včetně lidí, intravenosně, subkutánně, intramuskulárně, perkutánně, intranasálně, intrapulmonálně, orálně, lokálně, rektálně, intarvaginálně nebo intraspinálně pro dosažení antinocicepčního účinku, například při léčbě přechodné gastrointestinální inhibice indukované peritoneálním drážděním. Mohou být také použity pro zmírnění pooperační bolesti. Účinné dávky závisí na formě podání a na druhu léčeného savce. Příkladem jedné typické dávkové formy je bakteriostatický vodný roztok s pH mezi 3 a 8, například s pH přibližně 6, obsahující peptid, kde tento roztok je podáván kontinuálně parenterálně v dávce v rozmezí od přibližně 0,3 flg až 3 mg/kg tělesné hmotnosti za den. Tyto sloučeniny jsou dobře tolerovány in vivo a jsou vhodné hlavně pro podání subkutánní injekcí v bakteriostatickém vodném roztoku nebo v podobném vehikulu.

Je třeba si uvědomit, že ačkoliv byl vynález popsán s ohledem na jeho výhodná provedení, existují různé jeho obměny a modifikace, které spadají do rozsahu vynálezu, jak je definován v připojených patentových nárocích. Například mohou být v peptidech podle předkládaného vynálezu přítomny jiné substituce známé v oboru, které nemění významně účinnost • fc ·· · ·· · · ·· · fc fc fcfcfcfc ···· ~~ fc · · · · fc·· · · fc · · □2 ·* ····«·· ·«· «·· ·· ·· *« · · peptidů. Jiné substituované D-Phe zbytky, jako je (4Br)D-Phe nebo (2,40)-D-Phe, mohou být použity ve 2-pozici. D-Lys(Bu) a D-Lys(Et2) jsou považovány za ekvivalenty D-Ily a D-Arg(Et2>. N-konec tetrapeptidu může být permethylován, jak je známo v oboru, pokud je to vhodné. Diaminové sloučeniny mohou být použity jako spojovací skupiny pro vytvoření dimerů 2tetrapeptidových amidů. Mezi spojovací skupiny, které byly úspěšně použity, patří 1,6-diaminohexan, 1,5-diamino-3oxapentan a 1,8-diamino-3,6-dioxaoktan. Výsledné dimery se považují za ekvivalenty příslušných monomerů.

• · · · ·»·» • · · · · » · » • · · ····* ·· « • ♦ · · · · ·

9 · * »» · 9 rv im-luz

U Mory

Claims

1. Syntetický amid opioidního peptidů nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, který má afinitu pro kappa-opiátové receptory alespoň 1000-krát vyšší než afinitu pro mu opiátové receptory a který má dlouhé trvání účinku při podání ijn vivo, kde tento peptid má vzorec:

H-Xaai-Xaa2-Xaa3-Xaa4~Q kde Xaai je (A)D-Phe, (c“Me)D-Phe, D-Tyr, D-Tic nebo D-Ala (cyklopentyl nebo thienyl) , kde A je Η, NO2, F, Cl nebo CH3;

Xaa₂ je (A')D-Phe, D-lNal, D-2Nal, D-Tyr nebo D-Trp, kde A' je

A nebo 3,4Cl2; Xaa3 je D-Nle, (B)D-Leu, D-Hle, D-Met, D-Val, DPhe nebo D-Ala (cyklopentyl) , kde B je H nebo C^e; Xaa4 je DArg, D-Har, D-nArg, D-Lys, D-Ily, D-Arg (Et2), D-Har (Et2), DAmf, D-Gmf, D-Dbu, D-Orn nebo D-Ior; a Q je .NR1R2, morfolinyl, thiomorfolinyl, (C)piperidinyl, piperazinyl, 4-mono- nebo 4,4disubstituovaný piperazinyl, nebo ε-lysyl, kde Ri je vybrán ze skupiny: nižší alkyl, substituovaný nižší alkyl, benzyl, substituovaný benzyl, aminocyklohexyl, 2-thiazolyl, 2-pikolyl, 3-pikolyl, 4-pikolyl, ω-(acylamino)-polymethylen nebo póly(oxyethylen); a R2 je H nebo nižší alkyl; a C je H, 4hydroxy nebo 4-oxo.

2. Syntetický peptid podle nároku 1, ve kterém Xaa2 je D-Phe,

Xaa3 je D-Leu nebo D-Nle, Xaa4 je D-Arg nebo D-Orn, Q je NHRi a

Ri je ethyl, propyl, butyl, cyklopropyl nebo cyklobutyl.

3. Syntetický peptid podle nároku 1, kde Q je morfolinyl nebo thiomorfolinyl neb NH(4-pikolyl).

4. Syntetický peptid podle nároku 1, kde Q je N(Et)2, NH(Aeb), a · · ··# · * ·· * • · · · · · ft • ftft ··· »9 ftft ftft ftft

Ppz, Pcp nebo NHRi, kdy Ri je Aao, Aoo, Hoh, Ghx nebo Gao.

5. Syntetický peptid podle jakéhokoliv z nároků 1-4, kde Xaai je D-Phe, D-Ala(2-thienyl) nebo D-4Fpa.

6. Syntetický peptid podle nároku 1, kde buď Xaa2 je D-4Cpa nebo D-3,4-Cpa, nebo Xaa4 je D-Gmf.

7. Syntetický opioidní peptid podle nároku 1 mající WT-EDso přibližně 0,5 mg/kg nebo nižší, který má vzorec:

H-Xaai~Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q kde Xaai je D-Phe (nesubstituovaný nebo substituovaný CaMe, 2F, 4F nebo 4C1) nebo D-Ala (cyklopentyl nebo thienyl); Xaa2 je (A')D-Phe, D-lNal, D-2Nal, nebo D-Trp, kde A' je H, 4F, 4C1, 4NO2 nebo 3,4Cl2; Xaa₃ je D-Nle, D-Leu, D-CML, D-Met, nebo DAcp; Xaa4 je D-Arg, D-Arg(Et2) , D-Lys, D-Ily, D-Har, DHar(Et2), D-nArg, D-Orn, D-Ior, D-Dbu, D-Amf, a D-Gmf; a Q je NRiR2< Mor, Tmo, Pip, 4-HyP, OxP, Pcp nebo Ppz, kde Ri je Me, Et, Pr, Bu, hEt, Aeb, Cyp, Bzl, Hoh nebo 4-píkolyl, a R2 je H nebo Et.

8. Syntetický opioidní peptid podle nároku 1 mající ED50 přibližně 0,5 mg/kg nebo nižší, který má vzorec:

H-Xaai-Xaa2~Xaa3-Xaa4-Q kde Xaai je D-Phe, D-4Fpa, D-2Fpa, D-Acp nebo D-Ala(2Thi); Xaa2 je (A)D-Phe, D-lNal, D-2Nal, nebo D-Trp, kde A je 4F nebo 4C1; Xaa₃ je D-Nle, D-Met, nebo D-Leu; Xaa4 je D-Arg, D-Har, D-nArg, D-Lys, D-Orn nebo D-Gmf; a Q je NHRi, Mor, Tmo, Pip nebo Ppz, kde Ri je Et, Pr nebo 4-Pic.

• · · · · · « 0 • 0 »····> ·· tt • · 0 ·000

9. Syntetický opioidní peptid podle nároku 1 mající ED50 přibližně 0,5 mg/kg nebo nižší, který má vzorec:

H-Xaai-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q kde Xaai je D-Phe, D-4Fpa, D-2Fpa nebo D-Ala(2Thi); Xaa2 je (A)D-Phe, D-lNal, D-2Nal nebo D-Trp, kde A je 3,4Cl2 nebo 4C1;

Xaa3 je D-Nle nebo D-Leu; Xaa4 je D-Arg D-Orn nebo D-Gmf; a Q je NHRi, Mor, Tmo, Pop, Ppz nebo N(Et)2, kde Ri je Et, Pr, Cyp, 4Pic, Aeb nebo Hoh.

10. Syntetický opioidní peptid podle nároku 1 mající jeden z následujících vzorců:

H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NHEt;

H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-morfolinyl;

H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NH-4-pikolyl;

H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NHPr;

H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-thiomorfolinyl;

H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NEt₂;

H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NHMe;

H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Orn-morfolinyl;

H-D-4Fpa-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NH-4-pikolyl;

H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NH-cyklopropyl;

H-D-Ala (2Thi) -D-3,4Cpa-D-Leu-D-Arg-morfolinyl;

H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Gmf-morfolinyl;

H-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Orn-NH(Aeb);

H-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Lys-morfolinyl;

H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-piperazinyl; a

H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NH(Hoh).

11. Farmaceutický prostředek vyznačující se • 00 • 0 • 0

0 0 • 0 ··« • 0 0 0 • 0 0 0

0 ·0 0

0 0 0 <

00 00 tím, že obsahuje antinocicepční množství syntetického peptidů podle jakéhokoliv z nároků 1-10 a farmaceuticky přijatelný kapalný nebo pevný nosič.