BR112017027030B1 - derivado de um polissacarídeo sulfatado, método de preparação de derivados de polissacarídeos sulfatados, método de modificação de derivado, uso de derivados e uso de derivados modificados - Google Patents
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Abstract
DERIVADO DE UM POLISSACARÍDEO SULFATADO, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS, MÉTODO DE MODIFICAÇÃO DE DERIVADO, USO DE DERIVADOS E USO DE DERIVADOS MODIFICADOS. A invenção refere-se à preparação e uso de aldeídos alfa,beta-insaturados na estrutura de polissacarídeos sulfatados. Está relacionada a derivados com ligação dupla conjugada na 4a e 5a posições do anel de galactopiranose situado na 6a posição em relação ao aldeído, de acordo com a fórmula estrutural geral (I) ou sua forma hidratada de acordo com a fórmula estrutural (II). As preparações desses derivados origina-se de polissacarídeos sulfatados que contêm um anel de galactopiranose sulfatado na 4a posição, que é ligado à cadeia polimérica através de uma ligação (1-3) ou beta(1-3) O-glicosídica. Na solução descrita, os polissacarídeos sulfatados passam por uma oxidação régio- e quimiosseletiva, formando aldeído saturado C6, o qual, através de eliminação direta do grupo sulfato, produz o derivado alfa,beta-insaturado de acordo com a fórmula geral (I) ou (II). A solução descrita é tecnicamente vantajosa, pois leva diretamente a aldeídos alfa,beta-insaturados, sem nenhum agente de eliminação, temperatura mais alta, ou isolamento de intermediários durante a síntese. A conjugação na estrutura de aldeído alfa,beta-insaturado,(...).
Description
[001] A invenção refere-se a derivados de polissacarídeos sulfatados com ligação dupla conjugada na 4a e 5a posições do anel de galactopiranose situado na 6a posição em relação ao aldeído. E também, a invenção refere- se ao seu método de preparação, modificação e uso.
[002] Glicosaminoglicanos são polissacarídeos lineares consistindo de amino-hexoses e ácido urônico, com exceção de sulfato de queratina. Eles formam uma grande parte da matriz intracelular do tecido conjuntivo, em particular cartilagem, ligamentos e tendões. Polissacarídeos sulfatados, por exemplo, sulfato de condroitina ou sulfato de dermatan são também, além do ácido hialurônico, importantes exemplos de glicosaminoglicanos.
[003] O sulfato de condroitina é um glicosaminoglicano linear, sulfatado e carregado negativamente composto de unidades monoméricas recorrentes de N-acetil-D-galactosamina e ácido D-glicurônico, ligadas uma a outra por ligações β(1^3) e β(1^4) O-glicosídicas (vide a fórmula estrutural do sulfato de condroitina abaixo).
ondeR1 é H ou Na,R2 é H, -SO2-OH, ou -SO2-ONa.
[004] O sulfato de condroitina deriva de tecidos conjuntivos animais, onde se liga a proteínas, formando assim uma parte de proteoglicanos. A sulfatação da condroitina é realizada por meio de sulfotransferase em várias posições e de vários tipos. O padrão único de sulfatação de determinadas posições na cadeia polimérica codifica a atividade biológica específica do sulfato de condroitina. O sulfato de condroitina é um componente de construção importante da cartilagem das juntas, conferindo a elas a resistência à compressão e restaurando o equilíbrio da composição do lubrificante da junta (Baeurle S. A., Kiselev M. G., Makarova E. S., Nogovitsin E. A. 2009. Polymer 50: 1805). Juntamente com a glicosamina, osulfato de condroitina é usado como suplemento nutricional para tratamento ou prevenção de osteoartrite em humanos (por exemplo, Flextor®, Advance Nutraceutics, Ltd.) ou animais (por exemplo, Gelorendog®, Contipro Pharma, Ltd.).Do ponto de vista farmacêutico, o sulfato de condroitina é considerado uma droga com resposta tardia para controle de dor em doenças degenerativas de juntas (Aubry-Rozier B. 2012. Revue Médicale Suisse 14: 571).
[005] O sulfato de dermatan é umglicosaminoglicano linear, sulfatado e carregado negativamente, composto de unidades monoméricas recorrentes de N-acetil-D-galactosamina e ácido L-idurônico, ligadas uma a outra por ligações β(1^3) e β(1^4) O-glicosídicas (vide a fórmula estrutural do sulfato de dermatan abaixo).
ondeR1 é H ou Na,R2 é H, -SO2-OH, ou -SO2-Ona.
[006] O sulfato de dermatan difere do sulfato de condroitina pela presença de ácido L-idurônico, que é um epímero C5 de ácido D-glicurônico. A configuração inversa do ácido idurônico permite uma melhor flexibilidade das cadeias de sulfato de dermatan, e garante sua interação específica de glicosamina-glicoproteína na área de entorno. Essas interações contribuem para regulação de vários processos celulares, como por exemplo, migração,proliferação, diferenciação ou angiogênese. A transformação de sulfato de condroitina em sulfato de dermatan ocorre através de três enzimas: dermatan sulfato epimerase 1 (DS- epi1), dermatan sulfato epimerase 2 (DS-epi2), e dermatan 4-O-sulfotransferase (D4ST1). A reação de epimerização do ácido glicurônico em ácido idurônico, juntamente com a via de sulfatação, não é aleatória, mas sim especificamente enzimaticamente controlada, o que resulta na codificação das informações relacionadas à função do glicosaminoglicano construído (Thelin M., et al. 2013. FEBS Journal 280: 2431).
[007] As carragenas são um grupo depolissacarídeos linearmente sulfatados obtidos pela extração de algas marinhas vermelhas. A galactose e seu 3,6-anidro derivado, que estão associados um ao outro através de ligações α(1—>3) ou β (1—>4) O-glicosídicas, são suas unidades de construção básicas. Existem três tipos de carragena, que diferem em grau de sulfatação e solubilidade em água. A kappa-carragena tem um sulfato por dímero e forma géis rígidos em água. A iota-carragena compreende dois sulfatos e forma géis moles, enquanto a lambda- carragena com três sulfatos não apresenta propriedades formadoras de gel. A carragena é uma alternativa de gelatina animal para vegetarianos e veganos. Ela é utilizada para espessamento e estabilização de produtos alimentícios e como emulsificante na indústria farmacêutica e têxtil.
[008] Graças à sua diversidade funcional, os polissacarídeos podem ser oxidados em várias posições (Cumpstey I., 2013. ISRN Organic Chemistry, 1). No caso deglicosaminoglicanos, existem três maneiras de oxidação. Na primeira, a hidroxila primária é oxidada formando um ácido carboxílico. A combinação de TEMPO/NaClO é usada para a oxidação com mais frequência (Jiang B., et al. 2000. Carbohydrate Research 327: 455; Huang L. et al. 2006.Chemistry, 12: 5264). Devido ao volume estérico do TEMPO, este método é regiosseletivo somente para hidroxilas primárias.
[009] Diversamente, a segunda maneira leva à oxidação de hidroxilas secundárias, formando compostos de dicetonas. Neste caso, como agentes de oxidação, são usados os óxidos de metais de transição à base de Cr(VI) (Hassan R., et al. 2013. Carbohydrate Polymers, 92: 2321) ou Mn(VII) (Gobouri A. A., et al. 2013. International Journal of Sciences, 2:1; Zaafarany I. A., et al. 2013. Journal ofMaterials Science Research, 2: 23).
[010] O terceiro tipo de oxidação baseia-se em oxidação de periodato (IO4-), que também ataca grupos de hidroxila secundários, porém simultaneamente, o anel piranosídico se quebra (Dawlee S. et al. 2005. Biomacromolecules, 6: 2040; Liang Y., et al. 2011. Colloidsand Surfaces B: Biointerfaces, 82: 1; Xu Y., et al. 2012.Carbohydrate Polymers, 87: 1589). Durante a oxidação, odialdeído se forma primeiro e depois continua a ser oxidado em ácido dicarboxílico.
[011] Todas as maneiras de oxidação mencionadas acima apresentam várias desvantagens. No caso da oxidação com uso de TEMPO/NaClO, a formação de ácido poliurônico é favorecida, ao invés do aldeído C6 desejado. As condições de reação para o nível de aldeído precisam ser otimizadas, como foi demonstrado no caso do ácido hialurônico (Buffa R., et al., WO2011069475, Sedová P., et al., 2013. Carbohydrate Research, 371: 8). Além disso, um teor maisalto de grupos carboxílicos no polímero influencia significativamente a conformação, interação e reconhecimento do polissacarídeo com o entorno biológico (Zou X. H., et al. 2009. Acta Biomaterialia, 5: 1588).
[012] Apesar de ser possível obter um andamento quimiosseletivo da reação com oxidação com periodato, essa maneira não é a preferida, devido à redução dramática do peso molecular do polímero e clivagem irreversível do anel piranosídico, resultando na perda do caráter nativo do polissacarídeo.
[013] Em relação ao uso dos agentes de oxidação derivados dos óxidos de metal de transição, os polissacarídeos oxidados não podem ser usados para aplicações biomédicas, devido à sua alta toxicidade (Normandin L., et al. 2002. Metabolic Brain Disease, 17: 375; Katz S. A., et al. 2006. Journal of Applied Toxicology, 13: 217).Reações de desidratação de derivados oxidados de polissacarídeos
[014] A presença de um aldeído na estrutura do polissacarídeo resulta em um caráter ácido do átomo de hidrogênio na posição α adjacente. Esse hidrogênio fica facilmente acessível sob condições básicas para reações de eliminação, formando um carbânion, que é estabilizado pela conjugação com o aldeído adjacente, deslocando assim o grupo que está saindo na posição β (maneira a, Esquema 1). A eliminação pode prosseguir também sob condições ácidas, onde a ativação do grupo que está saindo ocorre primeiro, formando um carbânion na posição β (maneira b, Esquema 1). Na mistura de reação, o carbânion é neutralizado com um par de elétrons livres na posição α. A terceira maneira possível pode ser executada sem a adição de uma base ou deum ácido, usando-se uma eliminação simultânea de umamolécula (maneira c, Esquema 1).
Esquema 1. Reação de eliminação na estrutura de aldeído: (a) formação de um carbânion pelo tratamento com uma base, mecanismo E1 cb (b) formação de um carbânion pelo tratamento com um ácido, mecanismo E1 (c) eliminação simultânea, mecanismo E2.
[015] Uma desidratação direcionada de aldeído de hialuronano na 6a posição do anel de glicosamina foi descrita na patente (Buffa et al.: CZ304512). Os autores descrevem a preparação de aldeído α,β-insaturado de hialuronano e seu uso em reações de reticulação. A síntese revelada envolve o uso de bases orgânicas estericamente volumosas (por exemplo, di-isopropilamina, trimetilamina), bases inorgânicas, por exemplo, Ca(OH)2 na mistura de água- solvente orgânico do tipo de DMSO, sulfolano na proporção de 3/1 a 1/2 sob altas temperaturas de 50-60°C. A desidratação também é realizada em estado sólido, aquecendo-se o polímero até 50-100°C por 4-5 dias. Os autores descrevem a oxidação e desidratação de ácido hialurônico em duas etapas, e não descrevem a desidratação direta durante a etapa de oxidação. Essa solução apresenta uma desvantagem importante de síntese em duas etapas, e o uso de condições de reação inadequadas na presença de agentes de eliminação cáusticos (corrosivos), presença de um solvente orgânico, necessidade de uma temperatura elevada, e um tempo de reação longo. Todos esses parâmetros tornam a síntese mais cara e mais complicada, do ponto de vista tecnológico (por exemplo, a corrosão do equipamento de produção, dificuldade na purificação do produto, preço mais alto de solventes apróticos dipolares como o DMSO, sulfolano, e agentes de eliminação como Et3N e DIPEA, um alto consumo de energia e água de resfriamento, um risco mais alto de resíduos perigosos no produto, a biocompatibilidade do produto em risco, um índice mais alto de degradação de polímero devido ao ambiente básico e temperatura mais alta). As referidas desvantagens da síntese de aldeído α,β-insaturado de HA na CZ304512 são, de acordo com a presente invenção, superadas com sucesso, pois a síntese ocorre em um recipiente sem a necessidade de isolar o produto intermediário na forma de um aldeído C6 saturado, sem adicionar o agente de eliminação, sem adicionar o solvente orgânico, em temperatura ambiente e com os tempos de reação na ordem de horas.Reação de reticulação de polissacarídeos oxidados
[016] A introdução de um aldeído na estrutura polissacarídea permite uma modificação adicional da cadeia polimérica com a ajuda de adição nucleofílica. Vários documentos de patente que descrevem a ligação de aminos a aldeídos são conhecidos. Um exemplo típico de reação de glicosaminoglicanos é a reação de dialdeído formado pela oxidação com periodato com vários N-nucleófilos moleculares (aminas, hidrazidas, alcoxiaminas, semicarbazidas) ou poliméricas (gelatina, quitosana), ou S-nucleófilos (tiois, aminotiois), para a preparação de hidrogéis biocompatíveis (Dawlee S., et al. 2005. Biomacromolecules, 6: 2040; WengL., et al. 2008. Journal of Biomedical Materiasl Research part A, 85: 352, Bergman K., et al.: WO2009/108100, HilbornJ., et al.: WO2010/138074). A reticulação de aldeído do ácido hialurônico preparado com uso de periodinano de Dess-Martin ou com uso da combinação de TEMPO/NaClO com váriasaminas foi descrita em documentos de patente (Buffa R., etal.: WO2011069474; Buffa R., et al.: WO2011069475). Aldeídoα,β-insaturado de ácido hialurônico foi preparado pela desidratação de aldeído C6 em subunidade de N-acetil-D-glicosamina (Buffa R., et al: CZ304512). Além dos derivados oxidados de ácido hialurônico, os autores descrevem também seu uso em reações com aminas alifáticas e aromáticas, comteor opcional de átomos de N, S ou O. No entanto, eles sãopreparados sob altas temperaturas, e com uso de agentes de eliminação corrosivos, o que é consideravelmentedesfavorável para manter sua atividade biológica, devido à sua possível desnaturação e à presença de subprodutos. E ainda, as reações de reticulação de aldeído α,β-insaturadode ácido hialurônico com polissacarídeos desacetilados como agente de ligação amino multifuncional são mencionadas parailustrar as vantagens da conjugação do aldeído do polissacarídeo influenciar as propriedades reológicas dos hidrogéis preparados. Porém, os hidrogéis preparados dessa maneira não apresentam propriedades mecânicas satisfatórias, especialmente no que diz respeito à rigidez do hidrogel.
[017] O objetivo da invenção é a preparação de polissacarídeos sulfatados sob condições de reação suaves, em um período mais curto, e sem o uso de impurezas indesejáveis de agentes de eliminação ou solventes orgânicos. Este método impede a degradação significativa e perda de propriedades biológicas de polissacarídeos sulfatados, que são importantes para engenharia de tecidos, medicina regenerativa, ou aplicações biomédicas. O objeto da invenção consiste nos derivados de polissacarídeos sulfatados terem, como parte de sua cadeia polimérica, pelo menos um anel de galactopiranose modificado de acordo com a fórmula geral (I) ou (II), sendo que o referido anel contém uma ligação dupla na 4a e 5a posições com um aldeído conjugado ou sua forma hidratada, respectivamente (fórmula geral II)
ondeRé OH, O-SO2-OH, O-SO2-ONa, ou NH-C(O)-CH3.
[018] Uma condição necessária é o uso de polissacarídeos sulfatados que contenham pelo menos um anel de galactopiranose em sua cadeia, sendo esse anel sulfatado na 4a posição, e simultaneamente ligado na cadeia através de uma ligação α (1 —>3) ou β (1—>3) O-glicosídica de acordo com a fórmula estrutural geral III.
ondeRé OH, O-SO2-OH, O-SO2-ONa, ou NH-C(O)-CH3R1 é H, ou Na.
[019] O polissacarídeo é preferivelmenteselecionado no grupo que compreende sulfato de condroitina,sulfato de dermatan, carragena, e seus derivadosfarmaceuticamente aceitáveis e/ou sais, e seu peso molecular fica preferivelmente na faixa de 1x103 a 5x104 g.mol-1, e o grau da substituição na faixa de 1 a 40%, preferivelmente 10 a 25%. Na fórmula (I) ou (II) respectivamente, o termo “grau de substituição” refere-se ao grau da modificação para um aldeído insaturado, ou sua forma hidratada, respectivamente.
[020] Esta solução permite estabilizar os conjugados de polissacarídeos sulfatados com aminas através da ligação múltipla do aldeído, assim, uma faixa substancialmente mais ampla de aminas pode ser ligada mais estavelmente nos polissacarídeos modificados desta maneira (Esquema 2), sob condições fisiológicas.
ondeRé OH, O-SO2-OH, O-SO2-ONa, ou NH-C(O)CH3 R2 é alquil, aril, hetaril.Esquema 2. Ligação de amina a um aldeído α,β-insaturado de polissacarídeo sulfatado.
[021] E ainda, a invenção refere-se ao método de preparação de um derivado da fórmula estrutural geral (I) ou (II), onde o polissacarídeo sulfatado, que é solúvel em água em sua forma nativa e contém, em sua estrutura, pelo menos uma unidade de galactopiranose sulfatada na 4a posição, estando essa unidade ligada na cadeia polimérica através de uma ligação α (1 —>3) ou β (1—>3) O-glicosídica, éprimeiramente oxidado em um aldeído na 6a posição e imediatamente depois da oxidação na mistura de reação atual, fornece um aldeído α,β-insaturado através da eliminação direta (Esquema 3).
onde Ré OH, O-SO2-OH, O-SO2-ONa, ou NH-C(O)CH3 R1 é H ou Na.Esquema 3. Método de preparação de um aldeído α,β- insaturado na estrutura do polissacarídeo sulfatado.
[022] A oxidação seletiva do grupo hidroxila primário na 6a posição de galactopiranose pode ser realizada, por exemplo, através do sistema de oxidação do radical 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxil R3-TEMPO/NaClO, onde R3 é hidrogênio ou N-acetil, em água ou uma solução aquosa de sais inorgânicos. Preferivelmente, esta etapa ocorre em água, sob a temperatura de 5 a 25°C, mais preferivelmente 5 a 10°C, a quantidade molar de NaClO fica dentro da faixa de 0,1 a 2,0 equivalente, e a quantidade molar de R3-TEMPO fica dentro da faixa de 0,1 a 0,2 equivalete, em relação a um dímero de polissacarídeo sulfatado. O peso molecular do polissacarídeo sulfatado inicial fica dentro da faixa de 1x104 a 5x106 g.mol-1, e precisa conter unidades de galactopiranose sulfatadas na 4a posição, e é ligado através de ligações α(1 —>3) ou β (1—>4) O- glicosídicas na cadeia polimérica. Preferivelmente, o polissacarídeo sulfatado inicial é o sulfato de condroitina, sulfato de dermatan, carragena, ou seus derivados farmaceuticamente aceitáveis e/ou sais. A solução aquosa de sais pode ser, por exemplo, uma solução aquosa que compreende um sal de metal alcalino e/ou um tampão, por exemplo, PBS.
[023] A reação de eliminação do polissacarídeo oxidado e sulfatado ocorre imediatamente após o estágio oxidante na mesma mistura de reação sem a necessidade de adicionar um agente de eliminação, especialmente um ácido ou uma base, um solvente orgânico, ou sem elevação da temperatura de reação, e sem o isolamento do aldeído C6 saturado na subunidade de galactopiranose sendo sulfatada na 4a posição. A reação de eliminação ocorre em água ou em solução aquosa de sais inorgânicos (por exemplo, sais de metal alcalino), ou tampões (por exemplo, PBS), à temperatura de 5-25°C, e não há necessidade de um tempo de reação adicional. E também, o estágio de eliminação é proporcional ao estágio de oxidação obtido na mistura de reação. O método de preparação do aldeído α,β-insaturado integra duas etapas de reação (oxidação e eliminação) em um recipiente, sem isolamento do intermediário do estágio de oxidação. A oxidação resulta em um aldeído α,β-insaturado, ao invés de um aldeído C6 saturado na estrutura de polissacarídeo sulfatado. Em comparação ao método da preparação de um aldeído α,β-insaturado de ácido hialurônico (Buffa R et al.: CZ304512), a abordagemapresentada é diferente e definitivamente vantajosa nos parâmetros listados na Tabela 1.Tabela 1: Diferenças na preparação de aldeídos α,β-insaturados em comparação ao método anterior
[024] A Tabela 1 acima demonstra claramente que o método de preparação dos derivados de polissacarídeos sulfatados de acordo com a invenção resulta diretamente na formação de aldeídos α,β-insaturados, ao invés de seus análogos saturados. Outra diferença do método da invenção apresentado consiste em que ele não é aplicável aos polissacarídeos mencionados na técnica anterior, pois a presença do sulfato é necessária para o processo. Outras vantagens referem-se à reação ocorrendo exclusivamente em água, sem a necessidade de adição de algum solvente orgânico ou algum agente de eliminação. E ainda, a reação ocorre em temperatura ambiente (20-25°C) com tempos de reação curtos (1-2h), sem isolamento do aldeído C6 saturado. O método mencionado acima resulta em derivados de derivados sulfatados com as fórmulas gerais (I) e/ou (II), DS dentro da faixa de 20 a 25%. O método de sua preparação é tecnologicamente interessante e substancialmente mais preferível do ponto de vista de tempo e custo, em comparação aos métodos conhecidos.
[025] Considerando-se a modificação química, o aldeído α,β-insaturado dos polissacarídeos sulfatados pode ser usado principalmente para reações de condensação com vários N-nucleófilos. O aldeído, no papel do centro eletrofílico reativo, mantém sua estabilidade e reatividade também em água, o que pode ser preferivelmente utilizado para a ligação mencionada (conjugação) de aminas biocompatíveis com os derivados das fórmulas gerais (I) e (II). O termo “amina” é bem conhecido dos técnicos no assunto, e pode representar, sem nenhuma limitação, alquil- amina, aril-amina, hetaril-amina, aminoácido, peptídeo ou polímero com um grupo amino livre. Este último pode ser diretamente incorporado ao polímero, ou é ligado através de um agente de ligação adequado que pode ser linear ou ramificado, opcionalmente contendo átomos de N, S ou O. O termo “polímero com um grupo amino” é entendido como um polissacarídeo desacetilado, proteína, peptídeo, ou outro biopolímero ou polímero sintético biocompatível.
[026] Assim, a invenção refere-se também ao método de modificação do derivado da fórmula geral (I) ou (II), onde o derivado reage com uma amina da fórmula geral R2_NH2, onde R2 é alquil, aril, hetero-aril, cadeia C1 a C30linear ou ramificada, opcionalmente contendo átomos de N, S ou O. A amina é preferivelmente uma amina biologicamente ativa, particularmente aminoácido ou peptídeo, ou um polímero biologicamente aceitável contendo um grupo amino livre, onde esse grupo amino é uma parte inerente do polímero (por exemplo, gelatina, quitosana, ácidohialurônico desacetilado, sulfato de condroitinadesacetilado, etc.), ou está ligado ao polímero através de um agente de ligação que contém grupo amino, hidrazina, hidrazida, aminoalquil, hidroxila, carboxila, tiol, ou qualquer combinação deles. A quantidade molar de amina pode ficar, preferivelmente, dentro da faixa de 0,05 a 3 equivalentes em relação a um dímero do polissacarídeo sulfatado. A ligação da amina pode ocorrer em água, tampão de fosfato, ou sistema água-solvente orgânico, com a temperatura na faixa de 20 a 60°C por 10 minutos a 150 horas. Um solvente orgânico adequado é entendido como um álcool miscível em água, preferivelmente isopropanol ou etanol, e solventes apróticos miscíveis em água, preferivelmente dimetilsulfóxido, onde seu teor na mistura de reação não ultrapassa 50% (v/v). A reação com a amina pode ser preferivelmente realizada sob condições fisiológicas (pH = 7,4 e T = 37°C). Além das aminas, a reação ocorre também com outros N-nucleófilos que contêm um grupo amino em sua estrutura, como as hidrazinas, hidroxilaminas, hidrazidas, semicarbazidas ou tiosemicarbazidas. No caso de uma reação com N-nucleófilos monofuncionais, eles são ligados ao polímero, onde o uso de N-nucleófilos bi- ou polifuncionais promove reticulação de cadeias poliméricas, isto é, a formação de hidrogéis. Dependendo do tipo de N-nucleófilo usado, sua quantidade em relação à proporção dos locais de ligação, estrutura do polímero, concentração da solução, grau de substituição e peso molecular do polímero, polímeros reticulados com ampla faixa de propriedades viscoelásticas e mecânicas, podem ser preparados exatamente de acordo com as necessidades das aplicações pretendidas em engenharia de tecidos ou medicina regenerativa. Em alguns casos específicos, a reação do derivado da invenção com uma amina pode ocorrer dentro de toda faixa de pH, onde em outros casos o valor do pH é importante para a reação. Um técnico no assunto pode reconhecer isso antecipadamente, ou pode determinar através de medições de rotina.
[027] As aplicações pretendidas devem ser principalmente as preparações de estruturas como materiais de suporte bioativo e biodegradável que imitam a matriz extracelular. Esses materiais podem servir de veículos para células ou substâncias biologicamente ativas, atrativos de células, como meio-veículo para transporte da célula ao local do defeito no tecido, como preenchedor de tecido, como substituto adequado para tecido, ou barreira protetora. Outras demandas para as estruturas funcionais compreendem a garantia de um ambiente químico e fisiológico adequado para proliferação e diferenciação celular, transporte de nutrientes e produtos residuais do metabolismo celular. Dependendo da maneira da aplicação da estrutura, é possível preparar estruturas de injeção a partir dos polissacarídeos sulfatados reticulados na forma de soluções formadoras de gel, onde a estrutura e o novo tecido se formam in vivo, ou estruturas sólidas, que são implantados em um organismo após o cultivo celular e formação do novo tecido in vitro. E também, a escolha correta de parâmetros da reação de reticulação (proporção entre concentração e locais de ligação) permite obter tempos curtos de formação de gel, na ordem de segundos (vide Exemplo 30), que podem ser preferivelmente utilizados para a formação de gel in situ na presença de um material biológico, o assim chamado encapsulamento celular. A reação de reticulação está ilustrada no Esquema 4:
ondeRé OH, O-SO2-OH, O-SO2-ONa ou NH-C(O)CH3Esquema 4. Reticulação de um polissacarídeo sulfatado através de um aldeído α,β-insaturado e uma diamina.
[028] A maior estabilidade da ligação de uma amina com um aldeído α,β-insaturado, em comparação ao aldeído saturado convencional, é garantida através da conjugação do aldeído com a ligação dupla adjacente. Assim, podem ser preparados materiais reticulados mais estáveis e melhores, à base de polissacarídeos sulfatados, como mostra o exemplo do polissacarídeo não sulfatado de ácido hialurônico (Buffa R., et al: CZ304512).
[029] A reticulação é realizada reagindo-se o derivado com um N-nucleófilo bi- e polifuncional biocompatível solúvel em água selecionado no grupo que compreende alquil-aminas, aril-aminas, heteroalquil-aminas, hetaril-aminas, aminoácidos, peptídeos, polímeros com grupo amino livre, hidrazinas, hidroxil-aminas, hidrazidas, semicarbazidas ou tiosemicarbazidas, onde a reticulação do derivado ocorre. Os nucleófilos preferidos compreendem hidrazidas, di-hidrazidas, polissacarídeos desacetilados, ou alcoxi-aminas. A reação pode preferivelmente ocorrer em tampão de fosfato.
[030] Porém, a análise comparativa de propriedades mecânicas (módulo de elasticidade em compressão de Young, limite elástico em compressão, e índice de deformação dos géis reticulados) revelou uma densidade maior dos géis preparados a partir do sulfato de condroitina oxidado (vide Exemplo 31 da invenção), em comparação aos géis à base do hialuronano oxidado. A maior rigidez dos géis reflete a maior densidade de reticulação na estrutura do polissacarídeo, garantindo assim, um melhor volume e estabilidade de formato do material reticulado. Além disso, os melhores materiais reticulados apresentam menos alterações de propriedades mecânicas com o tempo, atendendo as necessidades atribuídas à estrutura celular funcional. Neste caso, uma reticulação mais eficiente pode ser obtida através de um grau de substituição mais alto do aldeído α,β-insaturado na estrutura do polissacarídeo sulfatado (vide Tabela 1 acima), o que é uma das vantagens importantes da invenção em comparação à técnica anterior.
[031] A segunda vantagem de géis reticulados com mais eficiência consiste em um índice menor de inchaço em um meio fisiológico. Isto pode ser preferivelmente utilizado para estruturas em engenharia de tecido, onde o desempenho do material controlado em um organismo vivo em contato com o tecido é desejado, sem alterações dramáticas em suas propriedades mecânicas ou formato ou volume.
[032] A terceira vantagem do grau de substituição mais alto do aldeído α,β-insaturado na estrutura do polissacarídeo sulfatado é a possibilidade de ligação de uma quantidade maior de, por exemplo, uma amina biologicamente ativa. Desta maneira, uma concentração mais alta da substância biologicamente ativa pode ser obtida no local do efeito, para aplicações de sistemas de suporte, para os quais a invenção descrita pode ser também preferivelmente utilizada. E ainda, o método proposto permite a ligação de uma maior variedade de aminas biologicamente ativas (por exemplo, aminoácidos, peptídeos), que podem ser naturalmente liberadas em sua forma nativa (ativa). Foi repetidamente observado em vários exemplos (butil-amina, lisina, peptídeo RGD) que em pH mais baixo, a ligação amina-aldeído α,β-insaturado é menos estável (Esquema 5), então, os conjugados preparados podem ser preferencialmente utilizados para sistemas de distribuição de fármaco à base de biomateriais responsivos ao pH.
Esquema 5. Estabilidade da imina do sulfato de condroitina com aldeído α,β-insaturado (DS = 20%) com peptídeo RGD (ácido amino-hexano-Gli-Arg-Gli-Asp-NH2) emágua.
[033] Mais particularmente, essa estabilidade de uma imina à base de alquil-, aril- ou hetaril-amina em água pode ser usada como segue: quando o conjugado (imina), formado por uma amina biologicamente ativa (por exemplo, fármaco, preparado antisséptico, peptídeo, aminoácido, etc.) e polissacarídeo (veículo) estáveis sob condições moderadamente básicas, é incorporado ao local alvo de um organismo, cujo pH é diferente (neutro ou moderadamente ácido), esse conjugado é decomposto e a substância biologicamente ativa é liberada nesse local.
[034] Foi comprovado que o aldeído α,β-insaturado em si da estrutura de sulfato de condroitina não é citotóxico (vide Exemplo 32 de acordo com a invenção), assim, os conjugados e os produtos reticulados de aldeídos α,β-insaturados da fórmula (I) ou (II) com aminas biocompatíveis são adequados para aplicações direcionadas em biomedicina e engenharia de tecido. Considera-se que essas substâncias não influenciam negativamente a viabilidade celular, não induzem reação imunológica no organismo, são enzimaticamente degradáveis, e os produtos de sua degradação também são biocompatíveis. Assim, os derivados das fórmulas (I) ou (II) podem ser utilizados para a preparação de suportes de substâncias biologicamente ativas no campo de cosméticos ou farmácia, ou como suportes de substâncias biologicamente ativas com a liberação controlada através da alteração de pH. Em relação à reação ocorrer fluentemente sob condições fisiológicas e com materiais iniciais biocompatíveis, os produtos reticulados de polissacarídeos sulfatados podem também ser considerados um material promissor para estruturas celulares em engenharia de tecido ou medicina regenerativa, onde podem ser preferivelmente usados para incorporar as células e sua subsequente cultura. O método descrito nesta invenção pode ser facilmente executado na indústria, pois não é caro e nem demorado. Isso ocorre devido à combinação das duas etapas em um recipiente sem a necessidade de isolar um intermediário. Outra vantagem apresenta a ausência de substâncias químicas tóxicas, corrosivas ou caras no papel de agente de eliminação, bem como a ausência de um solvente orgânico, pois a reação ocorre exclusivamente em água. Os tempos de reações são curtos; e ainda, a reação ocorre em temperatura ambiente. Os produtos finais são isolados por precipitação com álcoois ou soluções de sal inorgânico sem nenhum efeito prejudicial no ambiente. Além disso, graus de substituição relativamente altos (20-25%) são obtidos pelo método proposto sob condições substancialmente mais suaves que em Buffa R., et al: CZ304512 (vide Tabela 1 acima).
[035] Os polissacarídeos sulfatados modificados pelo método da invenção descrito são adequados como precursores de reações de conjugação ou reticulação com vários N-nucleófilos, resultando em materiais biocompatíveis adequados para aplicações biomédicas, engenharia de tecido e medicina regenerativa. Mais particularmente, os derivados preparados pelo método da invenção podem ser utilizados como suportes de substâncias biologicamente ativas com sua liberação controlada com uso de alteração do valor do pH, no campo de cosméticos e farmácia. Os derivados modificados pelo método da invenção podem ser usados como materiais biocompatíveis para aplicações biomédicas e formação de estruturas para engenharia de tecido, ou para medicina regenerativa.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[036] A Figura 1 ilustra a formação de um hidrogel à base de sulfato de condroitina oxidada com di- hidrazida adípica (Exemplo 21): (a) solução de aldeído α,β- insaturado de sulfato de condroitina em PBS, (b) formação de gel da solução após a adição de solução de di-hidrazida adípica em PBS, (c) o hidrogel após 1h em PBS (pH = 7,4, c = 0,9% p/v), (d) o uso de uma forma ilustrativa para a preparação do hidrogel, (e) o uso de uma forma definida para a preparação do hidrogel, (f) uma vista detalhada de um segmento do hidrogel.
[037] A Figura 2 trata de fotografias do hidrogel liofilizado à base do sulfato de condroitina oxidado com di-hidrazida adípica, tirada pelo microscópio eletrônico de varredura: (a) vista transversal, ampliação 200x, detecção de elétrons secundários, (b) seção ampliada da estrutura porosa do hidrogel com o diâmetro medido.
[038] A Figura 3 ilustra os resultados dos testes de viabilidade celular de fibroblastos 3T3 em um aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina (Pm = 4x104 g/mol, DS = 20%). A ativação x curva de inibição, expressa em %, em relação ao controle do tempo T = 0h (100%). Avaliação pelo método MTT, seis repetições.
[039] A Figura 4 apresenta a cinética da formação de gel do Exemplo 30, com determinação do ponto de gel (Tg = 97s, T = 45°C). Uma representação gráfica da dependência do módulo elástico (G’) e vicoso (G”) no tempo.Exemplos
[040] O termo “equivalente” (eq), utilizado no presente documento, refere-se à unidade de dímero do polissacarídeo sulfatado, se não constar de outra maneira. A porcentagem é expressa como porcentagem de peso, se não constar de outra maneira. O peso molecular do sulfato de condroitina inicial (fonte: Sigma Aldrich, Ltd., Praga, CZ) é o peso molecular de média de peso dentro da faixa de 4x104 to 5x104 g.mol-1.
[041] A proporção de sulfato de condroitina-4 (tipo A) e sulfato de condroitina-6 (tipo C) foi 3:2. O material foi isolado de um material animal.
[042] O sal sódico de sulfato de dermatan (sal sódico B de sulfato de condroitina) com solubilidade de 5 mg/ml foi comprado da Sigma Aldrich. O material foi isolado de um material animal.
[043] Lambda-carragena com solubilidade de 10 mg/ml em água foi comprada da Sigma Aldrich e foi isolada de algas marinhas sem propriedades de formação de gel na forma nativa.
[044] O grau de substituição de aldeído α,β- insaturado na estrutura do polissacarídeo sulfatado foi determinado de acordo com o seguinte cálculo:DS = grau de substituição de aldeído α,β-insaturado = 100% * (quantidade molar do dímero modificado do polissacarídeo sulfatado / quantidade molar de todos os dímeros do polissacarídeo sulfatado)
[045] O grau de substituição da reação de aminação na estrutura do polissacarídeo sulfatado foi determinado de acordo com o seguinte cálculo:DS = grau de substituição de aminação = 100% * (quantidade molar do dímero modificado do polissacarídeo sulfatado / quantidade molar de todos os dímeros do polissacarídeo sulfatado)
[046] Os espectros FT-IR foram medidos dentro da faixa de 4000 - 400 cm-1 em Kbr, com uso do espectrômetro Nicolet 6700 FTIR. Os espectros UV-VIS foram medidos com uso do equipamento Shimadzu UV-2401PC, dentro da faixa de 200-600 nm, e processados pelo software UV Probe, versão 2,00.
[047] A cinética de formação de gel foi determinada com uso do equipamento AR-G2 e o TA Analysis foi usado como software de avaliação. O ponto de gel (Tg) foi determinado com base na dependência de tempo do módulo elástico e viscoso.
[048] As propriedades mecânicas dos géisselecionados foram medidas pelo teste de compressão com uso do equipamento Instron 3433, e avaliadas através do software Bluehill. Os parâmetros determinados para cada amostra foram os seguintes: módulo para compressão deYoung, resistência compressiva, deformação na resistência máxima, e tenacidade.
[049] A morfologia de superfície dos materiais liofilizados foi analisada com uso do microscópio Zeiss Ultra Plus.
[050] O ácido hialurônico desacetilado foi preparado por desacetilação com hidrazina de acordo com Buffa R., et al CZ304512.
[051] A aminopropoxila e derivado de hidrazina do ácido hialurônico foram preparados por aminação redutora de acordo com Buffa R., et al.: WO2011069474.Lista de abreviaçõesTEMPO radical 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi4-AcNH-TEMPO TEMPO com um grupo de acetamida na 4 aposição PBS salina tamponada com fosfatoPeptídeo RGD peptídeo da sequência de ácido amino-hexano-Gli-Arg-Gli-Asp-NH2AMK aminoácidoIPA álcool isopropílicoDMSO dimetilsulfóxidoExemplo 1Preparação de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[052] Método 1: Uma solução aquosa de hipoclorito de sódio (0,8 eq, 11% de cloro ativo) foi gradualmente adicionada a uma solução aquosa a 2% de sulfato de condroitina (200 mg, Pm = 4,5x104 g.mol-1) resfriada a 5°C,contendo fosfato dissódico dodeca-hidratado (2,2 eq), brometo de sódio (0,8 eq) e 4-AcNH-TEMPO (0,01%). A mistura foi agitada por 2h a 5°C. Depois, etanol (10 eq) foi adicionado à reação, que foi agitada por mais uma hora em temperatura ambiente.
[053] O produto foi isolado por precipitação com IPA e analisado por RNM.DS = 23% (determinado por RNM), Pm = 2,1x104 g.mol-1(determinado por SEC MALLS)
[054] Método 2: Uma solução auosa de hipoclorito de sódio (0,8 eq, 11% de cloro ativo) foi gradualmente adicionada a uma solução aquosa a 2% de sulfato de condroitina (200 mg, Pm = 4,5x104 g.mol-1) resfriada a 5°C,contendo brometo de sódio (0,8 eq) e 4-AcNH-TEMPO (0,01%). A mistura foi agitada por 2h a 5°C. Depois, foi adicionado etanol (10 eq) à reação, que foi agitada por mais uma hora em temperatura ambiente. O produto foi isolado por precipitação com IPA e analisado por RNM.DS = 20% (determinado por RNM)Análise espectral de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina: RNM 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 2,02 (3H, Ac-NH- , bs), 4,31 (1H, H2, bs), 4,49 (1H, H3, bs), 5,20 (1H, H1,bs), 6,34 (1H, H4, bs), 9,21 (1H, H6, bs);NMR 1H-1H COSY (D2O), picos cruzados, δ ppm: 4,31-4,49,4,31-5,20, 4,49-6,34; NMR 1H-13C HSQC(D2O), picos cruzados, δ ppm: 2,02-25,1, 4,31-51,0, 4,4973,1, 5,20-98,6, 6,34-122,0, 9,21-189,0;RNM DOSY (D2O), log D ((2,02, Ac-NH-), (4,31, H2), (4,49,H3), (5,20, H1), (6,34, H4), (9,21, H6)) ~ -10,3 m2s-1, logD (4,72, H2O) ~ -8,6 m2 s-1;IR (KBr, cm-1): 1725, 1650 (v C=O st), 1615, 1663 (v C=Cst);UV/Vis (0,1%, H2O); Àmax1,2 (Cβ=Cα-C=O) = 254 nm (π^π*),300-350 (n^π*),Exemplo 2Preparação de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[055] Uma solução aquosa de hipoclorito de sódio (0,4 eq, 11% de cloro ativo) foi gradualmente adicionada a uma solução aquosa a 2% de sulfato de condroitina (200 mg, Pm = 4,5x104 g.mol-1) resfriada a 5°C, contendo fosfatodissódico dodeca-hidratado (2,2 eq), brometo de sódio (0,4 eq) e 4-AcNH-TEMPO (0,01%). A mistura foi agitada por 2h a 5°C. Depois, etanol (10 eq) foi adicionado à reação, que foi agitada por mais uma hora em temperatura ambiente. O produto foi isolado por precipitação com IPA e analisado por RNM.DS = 2% (determinado por RNM), Pm = 2,8x104 g.mol-1(determinado por SEC MALLS). A análise estrutural do produto é apresentada no Exemplo 1.Exemplo 3Preparação de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[056] Uma solução aquosa de hipoclorito de sódio (1 eq, 11% de cloro ativo) foi gradualmente adicionada a uma solução aquosa a 2% de sulfato de condroitina (200 mg, Pm = 4,5x104 g.mol-1) resfriada a 5°C, contendo fosfatodissódico dodeca-hidratado (2,2 eq), brometo de sódio (1 eq) e 4-AcNH-TEMPO (0,01%). A mistura foi agitada por 2h a 5°C. Depois, etanol (10 eq) foi adicionado à reação, que foi agitada por mais uma hora em temperatura ambiente. O produto foi isolado por precipitação com IPA e analisado por RNM.DS = 21% (determinado por RNM), Pm = 2,0x104 g.mol-1(determinado por SEC MALLS). A análise estrutural do produto é apresentada no Exemplo 1.Exemplo 4Preparação de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[057] Uma solução aquosa de hipoclorito de sódio (2 eq, 11% de cloro ativo) foi gradualmente adicionada a uma solução aquosa a 2% de sulfato de condroitina (200 mg, Pm = 4,5x104 g.mol-1) resfriada a 5°C, contendo fosfato dissódico dodeca-hidratado (2,2 eq), brometo de sódio (2 eq) e 4-AcNH-TEMPO (0,01%). A mistura foi agitada por 2h a 5°C. Depois, etanol (10 eq) foi adicionado à reação, que foi agitada por mais uma hora em temperatura ambiente. O produto foi isolado por precipitação com IPA e analisado por RNM.DS = 21% (determinado por RNM), Pm = 1,8x104 g.mol-1(determinado por SEC MALLS). A análise estrutural do produto é apresentada no Exemplo 1.Exemplo 5Preparação de aldeído α,β-insaturado de sulfato de dermatan Uma solução aquosa de hipoclorito de sódio (0,8 eq, 11% de cloro ativo) foi gradualmente adicionada a uma solução aquosa a 2% de sulfato de dermatan (200 mg, 0,42 mol) resfriada a 5°C, contendo fosfato dissódico dodeca- hidratado (2,2 eq), brometo de sódio (0,8 eq) e 4-AcNH- TEMPO (0,01%). A mistura foi agitada por 2 horas a 5°C. Depois, etanol (10 eq) foi adicionado à reação, que foi agitada por mais uma hora em temperatura ambiente. O produto foi isolado por precipitação com IPA e analisado por RNM.DS = 20% (determinado por RNM)Análise espectral de aldeído α,β-insaturado de sulfato de dermatan: RNM 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 2,01 (3H, Ac-NH-,bs), 6,30 (1H, H4, bs), 9,20 (1H, H6, bs).Exemplo 6Preparação de aldeído α,β-insaturado de carragena
[058] Uma solução aquosa de hipoclorito de sódio (0,8 eq, 11% de cloro ativo) foi gradualmente adicionada a uma solução aquosa a 1% de carragena (200 mg, 0,31 mol) resfriada a 10°C, contendo fosfato dissódico dodeca- hidratado (2,2 eq), brometo de sódio (0,8 eq) e 4-AcNH- TEMPO (0,01%). A mistura foi agitada por 2 horas a 10°C. Depois, etanol (10 eq) foi adicionado à reação, que foi agitada por mais uma hora em temperatura ambiente. O produto foi isolado por precipitação com IPA e analisado por RNM.DS = 10% (determinado por RNM)Análise espectral de aldeído α,β-insaturado de carragena: RNM 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 6,30 (1H, H4, bs), 9,20 (1H,H6, bs).Exemplo 7Ligação de hidrazina a aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[059] Hidrato de hidrazina (2 eq) foi adicionado a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 2% (20 mg, DS = 23%, Pm = 2,1x104 g.mol-1) emD2O. A reação foi agitada por 24h em temperatura ambiente. O produto foi analisado na forma de uma mistura de reação crua.DS = 20% (determinado por RNM)RNM 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 5,40 (1H, —CH=C—CH=N—, bs),7,38 (1H, -CH=C-CH=N-, bs)Exemplo 8 Ligação de butilamina a aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[060] Método 1: Butilamina (0,2 eq) foiadicionada a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 2% (20 mg, DS = 23%, Pm = 2,1x104g.mol-1) em D2O. A reação foi agitada por 24h em temperatura ambiente e pH = 11,20. O produto foi analisado na forma deuma mistura de reação crua.DS = 20% (determinado por RNM)RNM 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 5,67 (1H, -CH=C-CH=N-, bs),7,74 (1H, -CH=C-CH=N-, bs)
[061] Método 2: ácido acético deuterado (14,5 μl) foi adicionado a uma amostra de RNM do método 1. O pH medido foi 4,10 e a amostra foi então analisada por RNM.DS = 0% (determinado por RNM)Exemplo 9Ligação de butilamina a aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[062] Butilamina (0,2 eq) foi adicionada a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 2% (20 mg, DS = 23%, Pm = 2,1x104 g.mol-1) em PBSdeuterado. A reação foi agitada por 24h em temperatura ambiente e pH = 7,30. O produto foi analisado na forma deuma mistura de reação crua.DS = 0% (determinado por RNM)Exemplo 10Ligação de hexano-1,6-diamina a aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[063] Hexano-1,6-diamina (0,5 eq) foi adicionado a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 2% (20 mg, DS = 23%, Pm = 2,1x104 g.mol-1) emD2O. A reação foi agitada por 24h em temperatura ambiente e pH = 11,60. O produto foi analisado na forma de uma misturade reação crua.DS = 20% (determinado por RNM)RNM 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 5,68 (1H, -CH=C-CH=N-, bs),7,74 (1H, -CH=C-CH=N-, bs)Exemplo 11Ligação de propoxiamina a aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[064] Cloridrato de propoxiamina (0,5 eq) foi adicionado a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 2% (20 mg, DS = 23%, Pm = 2,1x104g.mol-1) em D2O. A reação foi agitada por 24h em temperatura ambiente e pH = 3,90. O produto foi analisado na forma de uma mistura de reação crua.DS = 20% (determinado por RNM)RNM 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 5,57 and 6,88 (1H, -CH=C-CH=N-, bs), 7,52 e 7,70 (1H, -CH=CCH=N-, bs)Exemplo 12Ligação de lisina a aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[065] Cloridrato de lisina (0,5 eq) foiadicionado a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 2% (20 mg, DS = 23%, Pm = 2,1x104g.mol-1) em PBS deuterado. A reação foi agitada por 24h em temperatura ambiente e pH = 7,46. O produto foi analisadona forma de uma mistura de reação crua.DS = 4% (determinado por RNM)RNM 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 5, 69-5, 75 (1H, —CH=C—CH=N—,bs), 7,70-7,75 (1H, -CH=CCH=N-, bs)Exemplo 13Ligação de lisina a aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[066] Cloridrato de lisina (0,5 eq) foiadicionado a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 2% (20 mg, DS = 23%, Pm = 2,1x104g.mol-1) em D2O. O pH da reação foi ajustado para 8,40 adicionando-se bicarbonato de sódio (2 eq). A reação foi agitada por 24h em temperatura ambiente. O produto foi analisado na forma de uma mistura de reação crua.DS = 7% (determinado por RNM)A análise estrutural está apresentada no Exemplo 12.Exemplo 14Ligação de peptídeo RGD a aldeído α,β-insaturado de sulfatode condroitina
[067] Peptídeo RGD (0,2 eq, sequência Ahx-Gli- Arg-GliAsp-NH2) foi adicionado a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 2% (20 mg, DS =23%, Pm = 2,1x104 g.mol-1) em D2O. A reação foi agitada por24h em temperatura ambiente e pH = 4,22. O produto foianalisado na forma de uma mistura de reação crua.DS = 0% (determinado por RNM)Exemplo 15 Ligação de peptídeo RGD a aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[068] Peptídeo RGD (0,2 eq, sequência Ahx-Gli- Arg-GliAsp-NH2) foi adicionado a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 2% (20 mg, DS =23%, Pm = 2,1x104 g.mol-1) em PBS deuterado. A reação foiagitada por 24h em temperatura ambiente e pH = 7,22. Oproduto foi analisado na forma de uma mistura de reação crua.DS = 4% (determinado por RNM)RNM 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 5,68 (1H, -CH=C-CH=N-, bs),7,74 (1H, -CH=C-CH=N-, bs)Exemplo 16Ligação de peptídeo RGD a aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[069] Peptídeo RGD (0,2 eq, sequência Ahx-Gli- Arg-GliAsp-NH2) foi adicionado a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 2% (20 mg, DS =23%, Pm = 2,1x104 g.mol-1) em D2O. O pH da reação foiajustado para 10,49 adicionando-se bicarbonato de sódio (2 eq). A reação foi agitada por 24h em temperatura ambiente. O produto foi analisado na forma de uma mistura de reação crua.DS = 20% (determinado por RNM)A análise estrutural está apresentada no Exemplo 15.Exemplo 17Ligação de anilina a aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[070] Anilina (0,3 eq) foi adicionada a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 2% (20 mg, DS = 23%, Pm = 2,1x104 g.mol-1) em D2O. O pH dareação foi ajustado para 4,22 adicionando-se ácido acético deuterado (8,8 μl). A reação foi agitada por 24h em temperatura ambiente. O produto foi analisado na forma de uma mistura de reação crua.DS = 20% (determinado por RNM)Exemplo 18Ligação de anilina a aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[071] Anilina (0,3 eq) foi adicionada a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 2% (20 mg, DS = 23%, Pm = 2,1x104 g.mol-1) em PBSdeuterado. A reação foi agitada por 24h em temperatura ambiente e pH = 7,42. O produto foi analisado na forma deuma mistura de reação crua.DS = 5% (determinado por RNM)RNM 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 5,93 (1H, -CH=C-CH=N-, bs),8,03 (1H, -CH=C-CH=N-, bs)Exemplo 19Ligação de anilina a aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[072] Anilina (0,3 eq) foi adicionada a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 2% (20 mg, DS = 23%, Pm = 2,1x104 g.mol-1) em D2O. O pH dareação foi ajustado para 10,73 adicionando-se carbonato de sódio. A reação foi agitada por 24h em temperatura ambiente. O produto foi analisado na forma de uma mistura de reação crua.DS = 25% (determinado por RNM)A análise estrutural está apresentada no Exemplo 18.Exemplo 20Ligação de adipato de di-hidrazida a aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[073] Adipato de di-hidrazida (3 eq) foi adicionada a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 2% (20 mg, DS = 23%, Pm = 2,1x104 g.mol-1) em D2O. A reação foi agitada por 24h em temperatura ambiente e pH = 7,50. O produto foi analisado na forma deuma mistura de reação crua.DS = 20% (determinado por RNM)RNM 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 1,64 (4H, DHA2,3, bs), 2,04 (3H, Ac-NH-, bs), 2,34 (4H, DHA1,4, bs), 4,28 (1H, H2, bs),4,36 (1H, H3, bs), 5,20 (1H, H1, bs), 5,62 (1H, H4cis, bs),5,68 (1H, H4trans, bs), 7,52-7,48 (1H, H6cis, bs), 7,61(1H, H6trans, bs);RNM 1H-1H COSY (D2O), picos cruzados, δ ppm: 1,64-2,34,4,28-5,20, 4,36-5,68; RNM 1H-13C HSQC(D2O), picos cruzados, δ ppm: 1,64-24,9, 2,34-34,1, 4,2851,0, 4,36-73,6, 5,20-98,8, 5,68-111,3, 7,61148,5;RNM DOSY (D2O), log D ((2,04, Ac-NH-), (4,28, H2), (4,36,H3), (5,20, H1), (5,62 and 5,68,H4cis/trans), (7,52 and 7,68, H6cis/trans)) ~ -10,4 m2s-1, log D (4,72, H2O) ~ -8,6 m2s-1;IR (KBr, cm-1): 1640-1650 (v -C=N- st);UV/Vis (0.1%, H2O); Àmaxi,2 (-C=N-) = 280 nm (π^π*). Exemplo 21Reticulação de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina com adipato de di-hidrazida
[074] Adipato de di-hidrazida (0,12 eq, proporção de locais de ligação 1:1) em PBS foi adicionada a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 8% (40 mg, DS = 23%, Pm = 2,1x104 g.mol-1) em PBS (pH =7,40, c = 0,9% p/v). Depois da adição da solução de adipatode di-hidrazida, a formação de gel ocorreu no tempo (Tg = 34 s). O gel elástico foi fotografado (Figura 1),liofilizado e analisado por SEM (Figura 2).Módulo de elasticidade em compressão de Young = 9x103 PaResistência máxima em compressão = 64x103 PaDeformação em resistência máxima = 64%Tenacidade = 3668 J.m-3Exemplo 22Reticulação de aldeído α,β-insaturado de sulfato de dermatan com adipato de di-hidrazida
[075] Adipato de di-hidrazida (0,1 eq, proporção de locais de ligação 1:1) em PBS foi adicionada a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 8% (40 mg, DS = 20%, Pm < 40 kDa) em PBS (pH = 7,40, c =0,9% p/v). Depois da adição da solução de adipato de di- hidrazida, ocorreu formação de gel.Exemplo 23Reticulação de aldeído α,β-insaturado de carragena com adipato de di-hidrazida
[076] 40 μl de adipato de di-hidrazida (0,05 eq)em PBS foram adicionados a uma solução de aldeído α,β- insaturado de carragena a 8% (40 mg, DS = 10%, Pm < 50 kDa)em PBS (pH = 7,40, c = 0,9% p/v). Depois da adição dasolução de adipato de di-hidrazida, a viscosidade aumentou.Exemplo 24Reticulação de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina com derivado de hidrazida de ácido hialurônico.
[077] Uma solução de derivado de hidrazida de ácido hialurônico a 4% (9,2 mg, DS = 25%, Pm = 138x103g.mol-1) em PBS (pH = 7,4, c = 0,9% p/v) foi adicionada auma solução de aldeído α,β-insaturado de carragena a 4% (10mg, DS = 23%, Pm = 2,1x104 g.mol-1) em PBS. Depois damistura das soluções, ocorreu formação de gel no tempo (Tg = 109s).Módulo de elasticidade em compressão de Young = 6x103 PaResistência máxima em compressão = 840x103 PaDeformação em resistência máxima = 96%Tenacidade = 11978 J.m-3Exemplo 25Reticulação de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina com ácido hialurônico desacetilado.
[078] Uma solução de ácido hialurônicodesacetilado a 2% (2 eq, DS = 11%, Pm = 116 kDa, proporçãoentre locais de ligação 1:1) em PBS (pH = 7,4, c = 0,9%p/v) foi adicionada a uma solução de aldeído α,β-insaturado de carragena a 4% (10 mg, DS = 23%, Pm = 2,1x104 g.mol-1) emPBS (pH = 7,40, c = 0,9% p/v). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente, onde foi observado um aumento de viscosidade após 0,5h, e um gel elástico foi formado após 1h.Módulo de elasticidade em compressão de Young = 3x103 PaResistência máxima em compressão = 395x103 PaDeformação em resistência máxima = 95%Tenacidade = 14670 J.m-3Exemplo 26Preparação da forma ácida de sulfato de condroitina
[079] Foi preparada uma solução de sulfato de condroitina a 1% (500 mg, 1,1 mmol) em água destilada. Asolução foi resfriada a 5°C e 1,2 ml de Amberlite IR 120 Na (H+) Catex foi adicionado. A mistura de reação foi agitadapor 24h a 5°C. O Catex foi retirado por filtração, o produto foi congelado e liofilizado. Sua solubilidade em DMSO foi testada e determinada como satisfatória.Exemplo 27Preparação de sulfato de condroitina desacetilado
[080] Foi preparada uma solução da forma ácida de sulfato de condroitina a 1% (200 mg, 0,44 mmol, Pm < 40kDa) em DMSO. A solução foi degaseificada por uma corrente de nitrogênio. Foram adicionados 10,6 ml de hidrato de hidrazina e 3 eq de sulfato de hidrazina. A mistura de reação foi agitada por 24h a 60°C sob nitrogênio. Depois, foi adicionado NaHCO3 à mistura de reação. O produto foi isolado por precipitação com IPA.DS = 10% (determinado por RNM), Pm = 1,8x104 g.mol-1(determinado por SECMALLS) RNM 1H (500 MHz, 1% NaOD v D2O, δ ppm): 3,01 (1H, -CH=C-CH=N-, bs) HSQC (500 MHz, D2O, δ ppm): pico cruzado: 3,4252,2 ppmExemplo 28Reticulação de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina com sulfato de condroitina desacetilado.
[081] Uma solução de sulfato de condroitina desacetilado (2 eq, DS = 10%, Pm = 1,8x104 g.mol-1,proporção entre locais de ligação 1/0,85) em PBS (pH = 7,4,c = 0,9% p/v) foi adicionada a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 8% (20 mg, DS = 23%,Pm = 2,1x104 g.mol-1) em PBS (pH = 7,40, c = 0,9% p/v). Amistura de reação foi agitada em temperatura ambiente, onde foi observado um aumento de viscosidade após 0,5h, e um gel elástico foi formado após 3h.Módulo de elasticidade em compressão de Young = 3x103 PaResistência máxima em compressão = 774x103 PaDeformação em resistência máxima = 95%Tenacidade = 16489 J.m-3Exemplo 29Reticulação de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina com propoxiamina.
[082] Uma solução PBS de cloridrato de propoxiamina (0,12 eq, proporção entre locais de ligação 1/1) foi adicionada a uma solução de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina a 10% (50 mg, DS = 23%, Pm =2,1x104 g.mol-1) em PBS (pH = 7,40, c = 0,9% p/v), onde foiformado um gel no tempo Tg = 110s. Módulo de elasticidade em compressão de Young = 8x103 PaResistência máxima em compressão = 74x103 PaDeformação em resistência máxima = 65%Tenacidade = 3768 J.m-3Exemplo 30Medição da cinética de formação de gel da reação de reticulação de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina com derivado aminopropoxil de ácido hialurônico
[083] A medição da cinética de formação de gel foi realizada através de uma amostra a 4% aldeído α,β- insaturado de sulfato de condroitina (10 mg, DS = 23%, Pm =2,1x104 g.mol-1) in PBS (pH = 7,40, c = 0,9% w/v) com umasolução a 4% de derivado aminopropoxil de ácido hialurônico(1 eq, DS = 25%, Pm = 66 kDa) em PBS (pH = 7,4, c = 0,9%w/v). O tempo de formação de gel, isto é, o estágio em que a primeira rede macroscópica de gel foi formada, foi determinado como Tg = 97s (Figura 4).Exemplo 31Comparação das propriedades mecânicas de hidrogéis com base no aldeído α,β-insaturado reticulado de sulfato de condroitina e aldeído α,β-insaturado de hialuronano
[084] Solução 1: solução a 4% de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina (DS = 23%, Pm =2,1x104 g.mol-1, Exemplo 1) em PBS (pH = 7,40, c = 0,9%p/v).
[085] Solução 2: aldeído α,β-insaturado dehialuronano a 4% (DS = 7%, Pm = 2,5x104 g.mol-1) em PBS (pH= 7,40, c = 0,9% w/v).
[086] Solução 3: solução de derivado aminopropoxil de ácido hialurônico a 4% (DS = 25%, Pm = 66 kDa) em PBS (pH = 7,40, c = 0,9% w/v).
[087] Foram preparados hidrogéis a partir da referida solução, misturando-se suas proporções de volume equivalente nas seguintes combinações: solução 1 + solução 3 (amostra A) e solução 2 + solução 3 (amostra B). As amostras A e B foram deixadas para maturar em temperatura ambiente por 3 horas. Depois, as propriedades mecânicas dos materiais foram medidas, a saber, módulo de elasticidade em compressão de Young, resistência máxima em compressão e deformação em resistência máxima (Tabela 2).Tabela 2: Comparação das propriedades mecânicas dos hidrogéis à base de aldeídos α,β-insaturados reticulados derivados de sulfato de condroitina e ácido hialurônico
[088] Os dados medidos indicam as vantagens do uso do material com um maior grau de substituição no derivado de sulfato de condroitina (amostra A), pois os hidrogéis preparados a partir desse derivado apresentam maior rigidez e demonstram índice de deformação mais baixo, em comparação ao derivado de ácido hialurônico (amostra B). Como as amostrar tinham o mesmo peso molecular e foram analisadas sob as mesmas condições, este fato parece ser a consequência da maior densidade de reticulação, e isso correlaciona-se diretamente, apesar de manter o mesmo peso molecular, com o maior grau de substituição do aldeído α,β- insaturado na estrutura do polissacarídeo modificado.Exemplo 32Testes de viabilidade de fibroblastos 3T3 na presença de aldeído α,β-insaturado de sulfato de condroitina
[089] A substância testada, aldeído α,β- insaturado de sulfato de condroitina (DS = 20%, Pm = 40 kDa), foi dissolvida em um meio 3T3 completo. A solução foi filtrada por um filtro de 0,22 μm. As concentrações de teste finais da solução testada foram 10, 100, 500, e 1000 μg.mL-1. As células 3T3 com densidade de 3000 células por poço foram inoculadas em placas de 96 poços. Antes do tratamento, as células foram cultivadas por 24 horas em um meio completo. A viabilidade celular foi avaliada por espectrofotometria com uso de 3-[4,5-dimetilthiazol-2-il]- 2,5-difenil brometo de tetrazólio (método MTT) nos intervalos de 0, 24, 48, 72 horas. O experimento inteiro foi suplementado com um conjunto de controles não tratados e amostras de branco. Os dados de densidade ótica medidos foram convertidos em porcentagem de inibição relacionada ao controle no tempo T0 horas (a proporção da densidade ótica da amostra tratada em relação à densidade ótica do controle não tratado T0, multiplicada por 100) e o erro padrão da média (SEM) foi calculado. Os resultados do teste estão graficamente apresentados na Figura 3.
Claims (22)
1. DERIVADO DE UM POLISSACARÍDEO SULFATADO, caracterizado por ter como parte de sua cadeia polimérica pelo menos um anel de galactopiranose modificado de acordo com a fórmula geral (I) ou (II), sendo que o referido anel contém uma ligação dupla na 4a e 5a posições em uma conjugação com um aldeído na 6a posição de acordo com a fórmula geral (I) ou ao lado de sua forma hidratada de acordo com a fórmula geral (II)
ondeRé OH, O-SO2-OH, O-SO2-ONa ou NH-Ac.
2. DERIVADO DE UM POLISSACARÍDEO SULFATADO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo é selecionado do grupo que compreende sulfato de condroitina, sulfato de dermatan, carragena e seus derivados farmaceuticamente aceitáveis e/ou sais.
3. DERIVADO DE UM POLISSACARÍDEO SULFATADO de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo tem peso molecular dentro da faixa de 1x103 a 5x104 g.mol-1 e grau de substituição dentro da faixa de 1 a 40%.
4. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS conforme definidos nas reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo sulfatado, que é solúvel em água em sua forma nativa, e que contém pelo menos uma unidade de galactopiranose sulfatada na 4a posição que é ligada por ligação α(1—>3) ou β(1—>3) O-glicosídica na cadeia polimérica, de acordo com a fórmula estrutural geral (III)
ondeRé OH, O-SO2-OH, O-SO2-ONa ou NH-C(O)CH3, R1 é H ou Na, é oxidado em um aldeído na 6a posição e imediatamente depois da oxidação, a mistura de reação é submetida a eliminação na mesma mistura de reação, formando o derivado do polissacarídeo sulfatado definido nas reivindicações 1 a 3.
5. MÉTODO DE PREPARAÇÃO de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que um polissacarídeo sulfatado com peso molecular dentro da faixa de 1x104 a 5x106 g.mol-1 é utilizado.
6. MÉTODO DE PREPARAÇÃO de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que um polissacarídeo sulfatado selecionado do grupo que compreende sulfato de condroitina, sulfato de dermatan, carragena e seus derivados farmaceuticamente aceitáveis e/ou sais é utilizado.
7. MÉTODO DE PREPARAÇÃO de acordo com qualquer das reivindicações de 4 a 6, caracterizado pelo fato de que a oxidação é realizada através do sistema R3-TEMPO/NaClO, onde R3 é hidrogênio ou N-acetil, em água ou em uma solução aquosa de sais inorgânicos, a 5 a 25°C.
8. MÉTODO DE PREPARAÇÃO de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a quantidade molar de R3-TEMPO é de 0,01 a 0,2 equivalente, e a quantidade molar de NaClO fica dentro da faixa de 0,1 a 0,2 equivalentes, em relação a um dímero do polissacarídeo sulfatado.
9. MÉTODO DE PREPARAÇÃO de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa de sais inorgânicos é uma solução aquosa que contém um sal metálico alcalino ou um tampão, por exemplo, tampão de fosfato.
10. MÉTODO DE PREPARAÇÃO de acordo com qualquer das reivindicações de 4 a 9, caracterizado pelo fato de que a eliminação ocorre a 5 a 25°C, e sem o isolamento do aldeído C6 na subunidade de galactopiranose sulfatada na 4a posição.
11. MÉTODO DE MODIFICAÇÃO DE DERIVADO definido em qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o derivado reage com uma amina, de acordo com a fórmula geral R2-NH2, onde R2 é um alquil, aril, hetaril, cadeia linear ou ramificada de C1 a C30, opcionalmente contendo átomos de N, S ou O.
12. MÉTODO DE MODIFICAÇÃO de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a amina é uma amina biologicamente ativa, principalmente um aminoácido ou peptídeo.
13. MÉTODO DE MODIFICAÇÃO de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o derivado reage com uma amina que é um polímero biologicamente aceitável com um grupo amino livre.
14. MÉTODO DE MODIFICAÇÃO de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o grupo amino é uma parte direta do polímero selecionado no grupo que compreende gelatina, quitosana, ácido hialurônico desacetilado e sulfato de condroitina desacetilado.
15. MÉTODO DE MODIFICAÇÃO de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o grupo amino está ligado ao polímero por um agente de ligação que contém um grupo amino, hidrazina, hidrazida, aminoalquil, hidroxila, carboxila, tiol, ou qualquer combinação deles.
16. MÉTODO DE MODIFICAÇÃO de acordo com qualquer das reivindicações de 11 a 15, caracterizado pelo fato de que a quantidade de amina, aminoácido, peptídeo ou grupo amino livre do polímero fica dentro da faixa de 0,05 a 3,0 equivalentes em relação a um dímero do polissacarídeo sulfatado.
17. MÉTODO DE MODIFICAÇÃO de acordo com qualquer das reivindicações de 11 a 16, caracterizado pelo fato de que a reação com a amina, aminoácido, peptídeo ou polímero que contêm um grupo amino livre ocorre em água, tampão de fosfato, ou sistema de água-solvente orgânico, à temperatura dentro da faixa de 20 a 60°C, por 10 minutos a 150h.
18. MÉTODO DE MODIFICAÇÃO de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico é selecionado no grupo que compreende álcoois miscíveis em água, em particular isopropanol ou etanol, e solventes polares apróticos miscíveis em água, em particular dimetil sulfóxido, onde o teor de água na mistura é de pelo menos 50% vol.
19. MÉTODO DE MODIFICAÇÃO DE DERIVADO de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o derivado reage com um N-nucleófilo bi- e polifuncional biocompatível solúvel em água selecionado do grupo que compreende alquil-aminas, aril-aminas, heteroalquil-aminas, hetaril-aminas, aminoácidos, peptídeos, polímeros com grupo amino livre, hidrazinas, hidroxil-aminas, hidrazidas, semicarbazidas ou tiosemicarbazidas, onde a reticulação do derivado ocorre.
20. MÉTODO DE MODIFICAÇÃO de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o N- nucleófilo é hidrazida, polissacarídeo desacetilado, ou alcoxiamina, e de que a reação ocorre em tampão de fosfato.
21. USO DE DERIVADOS definidos em qualquer das reivindicações de 1 a 3 caracterizado por ser como veículos de substâncias biologicamente ativas com sua liberação controlada através da alteração do valor do pH, no campo de cosméticos e farmácia.
22. USO DE DERIVADOS MODIFICADOS definidos em qualquer das reivindicações de 11 a 20 caracterizado por ser como materiais biocompatíveis para aplicações biomédicas e formação de estruturas para engenharia de tecido, ou para medicina regenerativa.
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