ES2742208T3 - Derivados de polisacáridos sulfatados, método de preparación, modificación y uso de los mismos - Google Patents

Derivados de polisacáridos sulfatados, método de preparación, modificación y uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Un derivado de un polisacárido sulfatado que tiene como una parte de su cadena de polímero al menos un anillo degalactopiranosamodificado según la fórmula general I o II, conteniendo dicho anilloun doble enlace en la4ºy 5ºposición en una conjugación con un aldehídoenla6ºposición según la fórmula general I o adyacentea su forma hidratada según la fórmula general II.**Fórmula** donde R esOH, O-SO2-OH, O-SO2-ONa o NH-Ac.

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados de polisacáridos sulfatados, método de preparación, modificación y uso de los mismos
Campo de la invención
La invención se refiere a derivados de polisacáridos sulfatados que tienen un dobleenlace conjugado en la4° y 5°posicióndel anillo de galactopiranosa situado en la 6° posición conrespecto al aldehído. Además, la invención se refiere al método de preparación, modificación y uso de los mismos.
Antecedentes de la invención
Los glicosaminoglicanos son polisacáridos lineales que consisten en aminohexosa y ácido urónico, excepto el sulfato de queratina. Forman una gran parte de la matriz intracelular del tejido conectivo, encartílagos, ligamentos y tendones particulares. Los polisacáridos sulfatados, p. ej., el sulfato de condroitinao el sulfato de dermatán, también son, además del ácido hialurónico, ejemplos importantes deglicosaminglicanos.
El sulfato de condroitina es un glicosaminoglicano lineal, sulfatado y cargado negativamente,compuesto de unidades monoméricas recurrentes de N-acetil-D-galactosamina y ácido D-glucurónico unidos entre sí víaenlaces O-glicosídicos p(1
Figure imgf000002_0001
y P(1—4)(véase a continuación la fórmula estructural del sulfato de condroitina).
Figure imgf000002_0002
en donde
R1 es H o Na,
R2 es H, -SO2-OH, o-SO2-ONa
El sulfato de condroitina se deriva de los tejidos conjuntivos de animales, donde se une a las proteínas y así forma parte de los proteoglicanos. La sulfatación de la condroitina se realiza mediante sulfotransferasas en diversas posiciones y de diversos tipos. El patrón único de sulfatación de las posiciones particulares en la cadena del polímero codifica la actividad biológica específica de sulfato de condroitina. El sulfato de condroitina es un componente importante en la construcción del cartílago en las articulaciones, confiriéndoles resistencia a la compresión y restableciendo el equilibrio de la composición lubricante de la articulación (Baeurle S. A., Kiselev M. G., Makarova E. S., Nogovitsin E. A. 2009. Polymer50: 1805). Junto con la glucosamina, el sulfato de condroitina se utiliza como suplemento nutricional para tratar o prevenir la osteoartritis en humanos (p. ej., Flextor®, AdvanceNutraceutics, Ltd.) o animales (p. ej., Gelorendog®, Contipro Pharma, Ltd.). Desde elpunto de vista farmacéutico, el sulfato de condroitina se considera un fármaco de respuesta retardada para el control del dolor en enfermedades degenerativas de las articulaciones (Aubry-Rozier B. 2012. RevueMédicale Suisse 14: 571).
El sulfato de dermatán es un glicosaminoglicano lineal, sulfatado y cargado negativamente, compuesto deunidades monoméricas repetidas de N-acetil-D-galactosamina y ácido L-idurónico unidos entre sí vía los enlaces O-glicosídicos P(1—3) y P(1—4)(véase a continuación la fórmula estructural del sulfato de dermatán).
Figure imgf000002_0003
en donde
R1 es Ho Na,
R2 es H, -SO2-OH o -SO2-ONa
El sulfato de dermatán se diferencia del sulfato de condroitina por la presencia de ácido L-idurónico, que es un epímero C5 de ácido D-glucurónico. La configuración inversa del ácido idurónico permite una mejor flexibilidad de las cadenas de sulfato de dermatán y garantiza su interacción específica de glicosamina-glicoproteína en el área circundante. Estas interacciones contribuyen a la regulación de varios procesos celulares, como la migración, proliferación, diferenciación o angiogénesis. La transformación del sulfato de condroitina en sulfato de dermatán se proporciona por medio de tres enzimas: epimerasa del sulfato de dermatán 1 (DS-epi 1), epimerasa del sulfato de dermatán 2 (DS-epi2), y dermatán 4-O-sulfotransferasa (D4ST1). La reacción de epimerización del ácido glucurónico en ácido idurónico, junto con el modo de la sulfatación, no es aleatoria sino específicamente controlada enzimáticamente, lo que da como resultado la codificación de la información concerniente a la función del glicosaminoglicano construido (Thelin M., et al. 2013. FEBS Journal 280: 2431).
Los carrageninas son un grupo de polisacáridos linealmente sulfatados que se obtienen por la extracción de algas marinas rojas. La galactosa y su 3,6-anhidroderivado, que se asocian entre sí vialos enlacesO-glicosídicosa (1—3) o (3(1 —^4), son sus unidades básicas de construcción. Hay tres tipos principales de carragenina, que difieren en su grado de sulfatación y solubilidad en agua. La carragenina kappa tiene un sulfato por dímero y forma geles rígidos en el agua. La carragenina iola comprende dos sulfatos y forma geles blandos, mientras que la carragenina lambda con tres sulfatos no exhibe propiedades de formación de gel. La carragenina es una alternativa de la gelatina animal para vegetarianos y veganos. Se utiliza para el espesamiento y la estabilización de productos alimenticios y como un emulsionante en las industrias farmacéutica y textil.
Oxidación de glicosaminoglicanos
Debido a su diversidad funcional, los polisacáridos pueden oxidarse en varias posiciones (Cumpstey I., 2013. ISRN Organic Chemistry, 1). En el caso de los glicosamineglicanos haytres modos de oxidación. En el primero, el hidroxilo primario se oxida para formar un ácido carboxílico. La combinación de TEMPO/NaClO se usa para la oxidación con mayor frecuencia (Jiang B., et al. 2000. Carbohydrate Research 327: 455; Huang L. et al. 2006. Chemistry, 12: 5264). Debido al volumen estérico de TEMPO, este método es regioselectivo para hidroxilos primarios solamente. Por el contrario, el segundo modo conduce a la oxidación de los hidroxilos secundarios para formar compuestos de dicetona. En este caso, los óxidos de metales de transición basados en Cr(VI) (Hassan R., et al. 2013. Carbohydrate Polymers, 92: 2321) o Mn (VII) (Gobouri A. A., et al. 2013. International Journal of Sciences, 2: 1; Zaafarany I. A., et al. 2013. Journal of Materials of Science Research, 2: 23) se utilizan como agentes de oxidación.
El tercer tipo de oxidación se basa en la oxidación de periodato (IO4-) que también ataca los grupos hidroxilo secundarios, pero simultáneamente se rompe el anillo de piranosa (Dawlee S. et al.2005. Biomacromolecules, 6: 2040; Liang Y., et al. 2011. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 82: 1; Xu Y., et. al. 2012. Carbohydrate Polymers, 87: 1589). Durante la oxidación, el dialdehído primero se forma y luego se oxida a ácido dicarboxílico.
Todos los modos de oxidación mencionados anteriormente tienen varios inconvenientes. En el caso de la oxidación con el uso de TEMPO/NaClO, se favorece la formación de ácido poliurónico en lugar del aldehído-C6 deseado. Las condiciones de reacción para el nivel de aldehído necesitan optimizarse, comose demostró en el caso del ácido hialurónico (Buffa R., et al., WO2011069475, Sedová P., et al., 2013. Carbohydrate Research, 371:8). Además, un mayor contenido de los grupos carboxílicos en el polímero influyen significativamente en la conformación, la interacción y el reconocimiento del polisacárido con el entorno biológico (Zou X. H., et al. 2009. ActaBiomaterialia, 5: 1588).
A pesar de que puede lograrse un curso quimioselectivo de la reacción de oxidación de periodato, no se prefiere estemododebido a la dramática disminución del peso molecular del polímero yal clivaje irreversible del anillo de piranosa, que da como resultado la pérdida del carácter nativo del polisacárido.
En lo que respecta al uso de los agentes de oxidación derivados de los óxidos de metales de transición, los polisacáridos oxidados no pueden usarse para aplicaciones biomédicas debido a su alta toxicidad (Normandin L., et al. 2002. Metabolic Brain Disease, 17: 375; Katz S. A., et al. 2006. Journal of Applied Toxicology, 13: 217).
Reacciones de deshidratación de los derivados oxidados de polisacáridos.
La presencia de un aldehído en la estructura del polisacárido da como resultado elcarácter ácido delátomo de hidrógeno en la posición a adyacente. Este hidrógeno se vuelve fácilmente accesible bajo condiciones básicas para que las reacciones de eliminación formen un carbanión, que se estabiliza por laconjugación con el aldehído adyacente y así desplaza al grupo saliente en la posición P(modo a, esquema 1). La eliminación puede proceder también bajo condiciones ácidas, en donde la activación del grupo saliente ocurre primero para formar un carbanión en la posición p (modo b,Esquema 1). En la mezcla de reacción, el carbanión se neutraliza con un par de electrones libres en la posicióna . El tercer modo posible se puede realizar sin la adición de una base o un ácido,utilizando una eliminación simultánea de una molécula (modo c, Esquema 1).
Figure imgf000004_0001
Esquema 1. Reacción de eliminación en la estructura del aldehido: (a) formación de un carbanión por el tratamiento con una base, mecanismo E1cb (b) formación de un carbanión por el tratamiento con un ácido, mecanismo E1 (c) eliminación simultánea, mecanismo E2.
Una deshidratación dirigida del aldehído de hialuronano en la 6° posición en el anillo de glucosamina se describió en la patente (Buffa et al.: CZ304512). Los autores describen la preparación de un aldehído a ,p-insaturado de hialuronano y su uso en reacciones de reticulación. La síntesis descripta implica el uso de bases orgánicas estéricamente voluminosas (p.ej., diisopropilamina, trimetilamina), bases inorgánicas, p. ej. Ca(OH)2en la mezcla de agua-disolvente orgánico del tipo de DMSO, sulfolano en la relación de 3/1 a 1/2 a temperaturas mayores que 50 -60°C. La deshidratación también se realiza en estado sólido al calentar el polímero a 50 - 100°C durante 4-5 días. Los autores describen la oxidación y la deshidratación del ácido hialurónico en dos pasos y no describen la deshidratación directa durante la etapa de oxidación. Esta disolución tiene un importante inconveniente en la síntesis de dos etapas y el uso de condiciones de reacción inadecuadas en la presencia de agentes de eliminación cáusticos (corrosivos), la presencia de un disolvente orgánico, la necesidad de una temperatura elevada, y un tiempo prolongado de reacción. Todos estos parámetros hacen que la síntesis será más costosa y más complicada desde el punto de vista tecnológico (p. ej., la corrosión de los aparatos de producción, la difícil purificación del producto, el mayor preciode los disolventes apróticos dipolares tales como DMSo , sulfolano, y los agentes de eliminación tales como Et3N yDIPEA, un alto consumo de energía y agua de refrigeración, un mayor riesgo de residuos peligrososen el producto, la biocompatibilidad del producto en riesgo, una mayor tasa de degradación del polímero debidoal medioambiente básico y la mayor temperatura). Dichos inconvenientes de la síntesis de unaaldehído a ,p-insaturado de HA en CZ304512 son, según esta invención, exitosamentesuperados, ya que la síntesis procede en un recipiente sin la necesidad de aislar el producto intermedio en la forma de un aldehído C6 saturado, sin añadir el agente de eliminación, sin añadir el disolvente orgánico, a temperatura ambiente y con los tiempos de reacción en el orden de horas.
Reacción de reticulación de polisacáridos oxidados
La introducción de un aldehído en la estructura del polisacárido permite una modificación adicional de la cadena de polímero con la ayuda de la adición nucleofílica. Se conocen varios documentos de patentes que describen la unión de aminas a aldehídos. Un ejemplo típico de la reacción de los glicosaminoglicanos es la reacción del dialdehído formado por la oxidación con periodato con varios N-nucleófilos de bajo peso molecular (aminas, hidrazidas, alcoxiaminas, semicarbazidas) o poliméricos (gelatina, quitosán), o S-nucleófilos (tioles, aminotioles) para preparar hidrogeles biocompatibles (Dawlee S., et al. 2005. Biomacromolecules, 6: 2040; Weng L., et al. 2008. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 85: 352, Bergman K., et al.: WO2009/108100, Hilborn J., et al.: WO2010/138074). La reticulación del aldehído de ácido hialurónico preparado con el uso de periodinano Dess-Martin o con el uso de la combinación de TEMPO/NaClO con varias aminas se describió en documentos de patente (Buffa R., et al.: WO2011069474; Buffa R., et al.: WO2011069475). El aldehído a ,p-insaturado del ácido hialurónico se preparó mediante la deshidratación del aldehído C6 en la subunidad de W-acetil-D-glucosamina (Buffa R., et al: CZ304512). Además de los derivados oxidados deácido hialurónico, los autores describen también su uso en reacciones con aminas aromáticas alifáticas que tienen un contenido opcional de átomos N, S u O. Sin embargo, se preparana altas temperaturas y con el uso de agentes de eliminación corrosivos, lo que es considerablementedesfavorable para mantener su actividad biológica debido a su posible desnaturalización ya la presencia de subproductos. Además, las reacciones de reticulación de un aldehído a ,p-insaturado de ácido hialurónico con polisacáridos desacetilados como un enlazador amino multifuncional se mencionan para ilustrar las ventajas de la conjugación del aldehído a partir del polisacárido que influye en las propiedades reológicas de los hidrogeles preparados. Sin embargo, los hidrogeles preparados de esta manera no muestran propiedades mecánicas satisfactorias, especialmente en lo que se refiere a la rigidez del hidrogel.
Compendio de la invención
El objetivo de la invención es la preparación de polisacáridos sulfatados bajo condiciones de reacción moderadas, en un tiempo más corto, y sin el uso de impurezas no deseadas de agentes de eliminación o disolventes orgánicos. Este método evita la degradación y pérdida significativas depropiedades biológicas de los polisacáridos sulfatados, que son importantes para la ingeniería de tejidos, la medicina regenerativa, o aplicaciones biomédicas. El objeto de la invención consiste en los derivados de polisacáridos sulfatados que tienen, como parte de su cadena de polímero, al menos unanillo de galactopiranosa modificado según la fórmula general I o II, conteniendo dicho anillo un doble enlace en la 4° y 5° posición con un aldehido conjugado o su forma hidratadarespectivamente (fórmula general II)
polisacárido sulfatado
Figure imgf000005_0001
polisacárido sulfatado
OH
polisacárido sulfatado — “ 5 - , o — polisacárido sulfatado
R
en donde
R es OH, O-SO2-OH, O-SO2-ONa, o NH-C (O) -CH3.
Una condición necesaria es el uso de polisacáridos sulfatados que contengan al menos un anillo de galactopiranosa en su cadena, estando este anillo en la 4° posición, y simultáneamente unido en la cadena vía un enlace O-glicosídicoa (1^3) o p(1^-3)según la fórmula estructural general III.
Figure imgf000005_0002
en donde
R es OH, O-SO2-OH, O-SO2-ONa o NH-C(O)-CH3
R1 es H, o Na.
El polisacárido se selecciona preferiblemente del grupo que comprende sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, carragenina y sus derivados y/o sales farmacéuticamente aceptables, y su peso molecular está preferiblemente en el intervalo de 1x103 a 5x104 g.mol-1, y el grado de sustitución en el intervalo de 1 a 40%, preferiblemente de 10 a 25%. En la fórmula I o II respectivamente, el término "grado de sustitución" se refiere al grado de modificación de unaldehído insaturado, o su forma hidratada respectivamente.
Esta disolución permite estabilizar los conjugados de polisacáridos sulfatados con aminas por medio del enlace múltiple del aldehído, por lo que una gama sustancialmente más amplia de aminas puede estar unida de manera más estable en los polisacáridos modificados de este modo (Esquema 2), bajo condiciones fisiológicas.
polisacárido sulfatado
Figure imgf000006_0001
polisacarido sulfatado
Figure imgf000006_0002
polisacarido sulfatado
Figure imgf000006_0003
polisacarido sulfatado
en donde
R es OH, O-SO2-OH, O-SO2-ONa o NH-C(O)CH3
R2 es alquilo, arilo, hetarilo.
Esquema 2. Unión de amina a un aldehído a ,p-insaturado de polisacárido sulfatado
Además, la invención se refiere al método de preparación de un derivado de la fórmula estructural general I o II, en donde el polisacárido sulfatado, que es soluble en agua en su forma nativa y contiene, en su estructura, al menos una unidad de galactopiranosa sulfatada en la 4° posición, estando esta unidad unida en la cadena del polímero vía un enlace O-glicosídico a (1—3) o p(1 —»3), primero se oxida a un aldehído en la 6° posición e inmediatamente después de la oxidación en la mezcla de reacción actual proporciona un aldehído a ,p-insaturado vía la eliminación directa (Esquema 3).
polisacarido sulfatad
Figure imgf000007_0001
polisacárido sulfatado
Figure imgf000007_0002
oxidación
t . „ .O R 03S0 #
polisacarido sulfatado —
Figure imgf000007_0003
O- polisacarido sulfatado
Figure imgf000007_0004
iminacion directa
polisacárido sulfatado
Figure imgf000007_0005
polisacarido sulfatado
Figure imgf000007_0006
polisacárido sulfatado
Figure imgf000007_0007
polisacárido sulfatado
en donde
R es OH, O-SO2-OH, O-SO2-ONa, o NH-C(O)CH3
R1 es H o Na.
Esquema 3. Método de preparación de un aldehido a ,p-insaturado en la estructura del polisacárido sulfatado La oxidación selectiva del grupo hidroxilo primario en la 6° posición de galactopiranosa se puede realizar, p. ej., por medio del sistema de oxidación del radical2,2,6,6-tetrametil-1 -piperidiniloxilo R3-TEMPO/NaClO, en donde R3 es hidrógeno o N-acetilo, en agua o en una disolución acuosa de sales inorgánicas. Preferiblemente, esta etapa se realiza en agua, a una temperatura de 5 a 25°C, más preferiblemente de 5 a 10°C, la cantidad molar de NaClO está dentro del intervalo de 0,1 a 2,0equivalente, y la cantidad molar de R3-TEMPO está dentro del intervalo de 0,01 a 0,2 equivalente,con respecto a un dímero de polisacárido sulfatado. El peso molecular del polisacárido sulfatado inicial está dentro del intervalo de 1x104 a 5x106 g.mol-1, y debe contener las unidades de galactopiranosa sulfatadas en la 4° posición y se une vía los enlaces O-glicosídicos a (1—3) o p(1 —»3) en la cadena de polímero. Preferiblemente, el polisacárido sulfatado inicial essulfato de condroitina, sulfato de dermatán, carragenina o su derivado y/o salfarmacéuticamente aceptables. La disolución acuosa de sales puede ser p. ej. una disolución acuosaque comprende una sal de metal alcalino y/o un tampón, p. ej., PBS.
La reacción de eliminación del polisacárido oxidado y sulfatado procede inmediatamente después de la etapa oxidativa en la misma mezcla de reacción sin la necesidad de añadir unagente de eliminación, especialmente un ácido o una base, un disolvente orgánico o sin elevación de latemperatura de reacción, y sin el aislamiento del aldehido C6 saturado en la subunidad de galactopiranosa que es sulfatada en la 4a posición. La reacción de eliminación procede enagua o en soluciones acuosas de sales inorgánicas (p. ej., sales de metales alcalinos), o tampones (p. ej., PBS)a la temperatura de 5 - 25°C, y no hay necesidad de un tiempo de reacción adicional. Además, la etapa de eliminación es proporcional a la etapa de oxidación lograda en la mezcla de reacción.El método de preparación del aldehídoa ,p-insaturado integra dos etapas de reacción(oxidación y eliminación) en un recipiente sin el aislamiento del intermedio de la etapa de oxidación. La oxidación da como resultado un aldehído a ,pinsaturado en lugar de un aldehído C6 saturadoen la estructura del polisacárido sulfatado. En comparación con el método de lapreparación de un aldehído a ,p-insaturado de ácido hialurónico (Buffa R et al.: CZ304512), elenfoque presentado es diferente y definitivamente ventajoso en los parámetros enumerados en la Tabla1.
Tabla 1: Diferencias en la preparación de los aldehídos a ,p-insaturados encomparación con la técnica anterior
Figure imgf000008_0001
La Tabla 1 anterior muestra claramente que el método de preparación de los derivados de polisacárido sulfatado según la invención da como resultado directamente la formación de aldehídosa ,p-insaturados en lugar de sus análogos saturados. Otra diferencia del presente método de la invención consiste en que no es aplicable a los polisacáridos mencionados en la técnica anterior, debido a que la presencia del sulfato es necesaria para el proceso. Otras ventajas están referidas a que la reacción procede exclusivamente en agua, sin la necesidad de añadir otrodisolvente orgánico o agente de eliminación. Además, la reacción procede a temperatura ambiente (20-25°C) con tiempos de reacción cortos (1-2 h) sin aislamiento del aldehído C6 saturado.El método antes mencionado da como resultado derivados de derivados sulfatados que tienen las fórmulas generales I y/o II, con un DS (grado de sustitución) dentro del intervalo de 20 a 25%. El método de preparación es tecnológicamente interesante y sustancialmente más preferible desde el puntode vista de tiempo y costo en comparación con los métodos conocidos.
Considerando la modificación química, el aldehído a ,p-insaturado en los polisacáridos sulfatados se puede utilizar principalmente para reacciones de condensación con varios N-nucleófilos.El aldehído, en la función del centro electrofílico reactivo, mantiene su estabilidad yreactividad también en agua, que puede usarse preferiblemente para la unión mencionada (conjugación)de aminas biocompatibles con los derivados de las fórmulas generales I y II. El termino"amina" es bien conocido por los expertos en la técnica, y puede representar, pero no se limita a, alquilamina, arilamina, hetarilamina, aminoácido, péptido o polímero con un grupo amino libre. Este último se puede incorporar directamente al polímero o se une vía un enlazador adecuado que puede ser lineal o ramificado, que opcionalmente contiene átomos de N, S u O. El término "polímero con un grupo amino" se entiende como un polisacárido desacetilado,proteína, péptido u otro biopolímero o polímero sintético biocompatible.
Por lo tanto, la invención se refiere además al método de modificación del derivado de la fórmula general I o II, en donde el derivado reacciona con una amina de la fórmula general R2-NH2, en donde R2 es alquilo, arilo, hetero arilo, cadena C1 a C30 lineal o ramificada, que opcionalmente contiene átomos de N, S u O. La amina es preferiblemente una amina biológicamente activa, particularmente aminoácido o péptido, o un polímero biológicamente aceptable que contiene un grupo amino libre, en donde este grupo amino es una parte inherente del polímero (p. ej., gelatina, quitosano, ácido hialurónico desacetilado, sulfato de condroitina desacetilado, etc.) o está unido al polímero vía un enlazador que contiene ungrupo amino, hidrazina, hidrazida, amino alcoxi, hidroxilo, carboxilo, tiol o cualquier combinación de los mismos. La cantidad molar de amina puede estar, preferiblemente, dentro del intervalo de 0,05-3 equivalentes con respecto a un dímero del polisacárido sulfatado. Launión de la amina puede proceder en agua, tampón fosfato o un sistema de agua-disolvente orgánico a una temperatura en el intervalo de 20 a 60°C durante 10 minutos a 150 h. Se entiende que un disolvente orgánico adecuadoes un alcohol miscible en agua, preferiblemente isopropanol o etanol, y disolventes apróticos miscibles en agua, preferiblemente dimetilsulfóxido, en donde su contenido en la mezcla de reacción no excede el 50% (v/v). La reacción con amina se puede realizar preferiblemente bajo condiciones fisiológicas (pH = 7,4 y T = 37°C). Además de las aminas, la reacción también procede con otros N-nucleófilos que contienen un grupo amino en su estructura, comohidrazinas, hidroxilaminas, hidrazidas, semicarbazidas o tiosemicarbazidas. En el caso de una reacción con N-nucleófilos monofuncionales, estos se unen al polímero, en donde el usode N-nucleófilos bi y polifuncionales proporcionan la reticulación de cadenas de polímero, es decir, la formación de hidrogeles. Dependiendo del tipo de N-nucleófilo empleado, su cantidad conrespecto a la relación de los sitios de unión, la estructura del polímero, la concentración de la disolución , el grado desustitución y el peso molecular del polímero, pueden prepararse polímeros reticulados con una amplia gama de propiedades viscoelásticas y mecánicas exactamente según las necesidades de las aplicaciones previstas en ingeniería de tejidos o medicina regenerativa. En algunos casos específicos,la reacción del derivado de la invención con una amina puede proceder dentro del rango total de pH, en donde en otros casos el valor de pH es importante para la reacción. Un experto en la técnica puede reconocerlo con anticipación o determinarlo por mediciones de rutina.
Las aplicaciones previstas son principalmente las preparaciones de armazones como materiales de soporte bioactivos y biodegradables que imitan la matriz extracelular.Estos materiales pueden servircomo portadores de células o sustancias biológicamente activas, atrayentes celulares, como el medio portador para el suministro de células al sitio de un defecto del tejido, como relleno de tejido, un sustituto de tejido adecuado, o una barrera protectora.Otras demandas sobre los armazones funcionales comprenden asegurarun ambiente químico y fisiológico adecuado para la proliferación y diferenciación celular, y el transporte de nutrientes y productos de desecho del metabolismo celular.Dependiendo del modo de aplicación del armazón, es posible preparar armazones de inyección a partir de lospolisacáridossulfatadosreticulados en forma de soluciones formadoras de gel, en donde el armazón yeltejido nuevo se formanin vivo,o los armazones sólidos, que se implantan en un organismo después del cultivocelulary la formación del tejido nuevoin v/'tro.Además, la correcta elección de los parámetrosde la reacción de reticulación (relación de concentración y sitios de unión) permitenlograrcortos tiempos de gelificación, en el orden de segundos (véase el Ejemplo 30), que pueden utilizarsepreferiblementepara la gelificaciónin sitúen presencia de un material biológico, la llamada encapsulación celular.La reacción de reticulación se ilustra en el Esquema 4:
Figure imgf000009_0001
en donde
Res OH, O-SO2-OH, O-SO2-ONa o NH-C(O)CHa
Esquema 4.Reticulación de un polisacárido sulfatado por medio de un aldehído a ,p-insaturadoy una diamina La mayor estabilidad del enlace de una amina conunaldehídoa ,p-insaturadoen comparación con unaldehído saturado convencional se asegura mediante la conjugación del aldehído conel doble enlace adyacente.Así, se pueden preparar materiales más estables y mejor reticulados en base a lospolisacáridossulfatados, como se muestra en el ejemplo del polisacárido no sulfatado deácidohialurónico(Buffa R., et al: CZ304512).
Lareticulación se realiza haciendo reaccionar el derivado con un N-nucleófilobiypolifuncional biocompatible soluble en agua, seleccionado del grupo que comprende alquilaminas, arilaminas, heteroalquilaminas, hetarilaminas, aminoácidos, péptidos, polímero con un grupo amino libre, hidrazidas, hidroxilaminas, hidrazidas, semicarbazidas o tiosemicarbazidas, en donde procede la reticulación del derivado. Los nucleófilos preferidos comprenden hidrazidas, dihidrazidas, polisacáridos desacetilados o alcoxiaminas. La reacción puede preferiblemente proceder en tampón fosfato.
Sin embargo, el análisis comparativo de las propiedades mecánicas (módulo de elasticidad de Youngencompresión, límite elástico en compresión y tasa de deformación de los geles reticulados)demostróuna mayor densidad de los geles preparados a partir del sulfato de condroitina oxidado (véase el Ejemplo 31 de la invención) en comparación con los geles basados en elhialuronanooxidado.La mayor rigidez de los geles refleja la mayor densidad de reticulación en la estructura delpolisacárido, y por lo tanto se asegura una mejor estabilidad del volumen y la forma del material reticulado.Además, los mejores materiales reticulados muestranmenos cambiosen las propiedades mecánicasconel transcurso del tiempo y así satisfacen las necesidades a cubrir por el armazón celularfuncional.Eneste caso,se puede lograr una reticulaciónmásefectiva mediante un mayor grado de sustitución del aldehídoa ,p-insaturadoen la estructura del polisacárido sulfatado (véase la Tabla 1 anterior),que es una de las ventajas importantes de la invención en comparación con la técnica anterior.
La segunda ventaja de los geles reticulados de manera más eficaz consiste en una menor tasa de hinchamientoen un medio fisiológico. Esto se puede utilizar preferiblemente para armazones en ingeniería de tejidos, en donde es conveniente el desempeñocontrolado del material en un organismo vivo en contacto con el tejido, sin cambios importantesen sus propiedades mecánicas o forma o volumen.
La tercera ventaja del mayor grado de sustitución delaldehído a ,p-insaturadoen la estructura del polisacárido sulfatado es la posibilidad de unir una mayor cantidad de, p. ej., una amina biológicamente activa.De esta forma, una mayor concentración de la sustancia biológicamente activapuede lograrse en el sitio del efecto para aplicaciones de sistemas de soporte, para las que la invención descrita también se puede utilizar preferiblemente. Además, el método propuesto permite la unión de una variedad más amplia de aminas biológicamente activas (p. ej., aminoácidos, péptidos)que se pueden liberar naturalmente en su forma nativa (activa). Se encontró repetitivamente en diversos ejemplos (butilamina,lisina,péptidoRGD)que a un pH más bajo, la unión de amina-aldehídoa ,pinsaturado es menos estable (Esquema 5), por lo que los conjugados preparados se pueden utilizar preferiblemente para sistemas de suministro de fármacos basados en biomateriales sensibles al pH.
Figure imgf000010_0001
pH % DS Imina
4,22 0
7,22 4
10,49 20
Esquema 5.Estabilidad deiminade sultafo de condroitina de aldehídoa ,p-insaturado (DS=20%) con péptido RGD (ácidoaminohexano-Gly-Arg-Gly-Asp-NH2) en agua
Más particularmente, esta estabilidad de una imina basada en alquil, aril, o hetaril amina en agua puedeutilizarse de la siguiente manera: cuando el conjugado (imina), formado por una amina biológicamente activa (p.ej.,medicamento, preparación antiséptica, péptido, aminoácido, etc.) y un polisacárido (portador) estable en condiciones moderadamente básicas, se incorpora al sitio objetivo de un organismo,cuyo pH es diferente (neutro o moderadamente ácido), este conjugado se descompone y se libera sustancia biológicamente activa en este sitio. Secomprobó que elaldehídoa ,p-insaturadoen la estructura de sulfato de condroitina no esen sí mismo citotóxico (véase el Ejemplo 32 según la invención), por lo que los conjugados y los productos reticulados de aldehídosa ,pinsaturados de la fórmula I o II con aminas biocompatibles son adecuados para aplicaciones específicas en biomedicina e ingeniería de tejidos.Se asume que estas sustancias no influyen negativamente en la viabilidad celular, no inducenuna reacción inmune enel organismo, y que son enzimáticamente degradables, mientras que los productos de su degradación son también biocompatibles.Así, los derivados de las fórmulas I o II se pueden utilizar para lapreparación de soportes de sustancias biológicamente activas en el campo de la cosméticaola farmacia, o como los soportes de sustancias biológicamente activas con liberación controlada pormedio del cambio depH.Con respecto a la reacción que procedefluidamenteen condiciones fisiológicas y con materiales iniciales biocompatibles, los productos reticulados de los polisacáridos sulfatadostambién pueden considerarse un material prometedor para los armazones celularesen ingeniería de tejidos o medicina regenerativa, donde se pueden usar preferiblemente para laincorporación de las células y su posterior cultivo.El método descrito en esta invención se puede realizar fácilmente en la industria, ya que no es costoso ni demanda mucho tiempo.Esto se debe a la combinación de las dos etapas en un solo recipiente sin la necesidaddelaislamiento deun intermedio.Otra ventaja consiste en la ausencia de sustancias químicas tóxicas, corrosivas, ocostosas en la función de un agente de eliminación, así como la ausencia de un disolvente orgánico, ya que la reacción procede exclusivamente en agua.Los tiempos de reacción son cortos,y,además, la reacción procede a temperatura ambiente. Los productos finales son aislados porprecipitación con alcoholes o soluciones de sales inorgánicas sin ningún efecto perjudicial sobre el medioambiente.Además,se lograngrados de sustitución relativamente altos (20-25%)medianteel método propuesto en condiciones sustancialmente más moderadas que en Buffa R., et al: CZ304512 (véase la Tabla 1 anterior).
Los polisacáridos sulfatados modificados por el método descrito de la invención son adecuadoscomoprecursores para las reacciones de conjugación o reticulación con varios N-nucleófilos que dan como resultado materiales biocompatibles adecuados para aplicaciones biomédicas, de ingeniería de tejidos ymedicina regenerativa.Más particularmente, los derivados preparados por el método dela invenciónse pueden utilizar como soporte de sustancias biológicamente activas deliberación controlada para uso en el cambio del valor de pH, en el campo de cosmética y farmacia.Los derivados modificados por el método de la invención se pueden utilizar como materiales biocompatibles para aplicaciones biomédicas y la formación de armazones para ingeniería de tejidos, o para medicinaregenerativa.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 ilustra la formación de un hidrogel a base de sulfato de condroitina oxidado condihidrazidaadípica(Ejemplo 21): (a) disolución dealdehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina enPBS, (b) gelificación de la disolución después de la adición dela disolución de dihidrazida adípica en PBS,(c)el hidrogel después de 1 h en PBS (pH=7,4, c=0,9% p/v), (d) el uso de una forma ilustrativa parala preparación del hidrogel, (e) el uso de una forma definida para lapreparacióndel hidrogel, (f) una vista detallada de un segmento del hidrogel.
Fig.2.Fotografías del hidrogel liofilizado en base al sulfato de condroitina oxidado condihidrazida adípicatomadas por el microscopio electrónico de barrido: (a) una detección transversal con magnificación 200x de los electrones secundarios, (b) una sección ampliada de la estructura porosa del hidrogel con el diámetro medido.
La Fig. 3 ilustra los resultados de los ensayos de viabilidad celular de los fibroblastos 3T3 en un aldehído a ,pinsaturado de sulfato de condroitina (Mw=4 x 104g/mol, DS=20%).La curva de activaciónvs.inhibiciónse expresa en%, con respecto al control en tiempo T =0 h (100%).Evaluación mediantemétodoMTT, seis repeticiones.
Fig. 4. Cinética de la gelificación en el Ejemplo 30, con la determinación del punto de gelificación (Tg= 97 s, T =45°C).Representación gráfica de la dependencia de los módulos elástico(G')y viscoso (G")en el tiempo.
Ejemplos
El término "equivalente" (eq), como se utilizaen esta memoria, se refiere a la unidad dímera del polisacárido sulfatado, si no se indica de otro modo.El porcentaje se expresa como porcentaje en peso, si no se indica de otro modo.El peso molecular del sulfato de condroitina inicial (Fuente:Sigma Aldrich, Ltd., Praga, CZ) es el peso molecular promedio en peso dentro del intervalode4x104a5x104g.mol-1.
La relación de condroitin-4-sulfato (tipo A) y condroitin-6-sulfato (tipo C) fue de 3:2.El materialse aisló de un material animal.
La sal de sodio del sulfato de dermatán (sal de sodio del sulfato de condroitina B) de solubilidad de 5 mg/mlen agua se adquirió de Sigma Aldrich.El material se aisló de un material animal.
La carragenina lambda de solubilidad de 10 mg/ml en agua se adquirió de SigmaAldrich y se aisló de algas marinas sin propiedades de gelificación en la forma nativa.
El grado de sustitucióndelaldehídoa ,p-insaturado en la estructura del polisacárido sulfatado se determinó según el siguiente cálculo:
DS = el grado de sustitucióndealdehídoa ,p-insaturado= 100%* (la cantidad molar del dímero modificado del polisacárido sulfatado / (la cantidad molar de todos los dímeros delpolisacárido sulfatado).
El grado de sustitución de la reacción de aminación en la estructura del polisacárido sulfatado se determinó según el siguiente cálculo:
DS=el grado de sustitución para la aminación=100%*(la cantidad molar del dímero modificadodel polisacárido sulfatado / (la cantidad molar de todos los dímeros del polisacáridosulfatado).
Los espectros FT-IR se midieron dentro del intervalo de 4000-400 cm"1enKBr, por medio del espectrómetroNicolet 6700FTIR.Los espectros UV-VIS se midieron mediante el aparato Shimadzu UV-2401PC dentro del intervalo de 200­ 600 nm y se procesaron por medio del software UV Probe, versión 2.00.
La cinética de gelificación se determinó mediante el aparato AR-G2 y el análisis TAse utilizócomo el software de evaluación.El punto de gelificación (Tg) se determinó a partir de la dependencia del tiempo de los módulos elástico y viscoso.
Las propiedades mecánicas de los geles seleccionados se midieron mediante la prueba de compresión por medio del aparato Instron 3433 y se evaluaron mediante el software Bluehill. Los parámetros determinados para cada muestra fueron los siguientes: Módulo de Young para compresión, resistencia a lacompresión, deformación al límite elástico, y tenacidad.
La morfología superficial de los materiales liofilizados se analizó mediante el microscopio electrónico Zeiss Ultra Plus.
Elácido hialurónico desacetilado se preparó mediante desacetilación con hidrazina según BuffaR., et al CZ304512. El aminopropoxiloy el derivado de hidrazina delácidohilaurónicose prepararon por aminaciónreductiva según Buffa R., et al.: WO2011069474.
Lista de abreviaturas
TEMPO - radical 2,2,6,6-tetrametil-1 -piperidiniloxi
4-AcNH-TEMPO- TEMPO con ungrupoacetamidaen la4°posición
PBS - disolución salina tamponada con fosfato
PéptidoRGD- péptido de la secuencia delácidoaminohexano-Gly-Arg-Gly-Asp-NH2
AMK- aminoácido
IPA - alcohol isopropílico
DMSO- dimetilsulfóxido
Ejemplo 1
Preparacióndealdehídoa ,p-insaturado de sulfato de condroitina
Método 1: Una disolución acuosa de hipoclorito de sodio (0,8eq, 11% de cloro activo) se añadió gradualmente a una disolución acuosa de sulfato de condroitina al 2% (200 mg, Mw=4,5x104g.mol-1)enfriadoa 5°C, que contenía dedocahidrato de fosfato disódico(2,2eq), bromuro de sodio (0,8eq) y 4-AcNH-TEMPO (0,01%).La mezcla se agitó durante 2 ha5°C.Luegose añadióetanol (10eq) a la reacción, que se agitó durante una hora adicional a temperatura ambiente.
El producto se aisló por precipitación con IPA y seanalizópor RMN.
DS=23% (determinado por RMN), Mw=2,1x104g.mol' 1 (determinado por SEC MALLS)
Método 2: Una disolución acuosa de hipoclorito de sodio (0,8eq, 11% de cloro activo) se añadió gradualmente a una disolución acuosa de sulfato de condroitina al 2% (200 mg, Mw = 4,5x104g.mol'1) enfriada a 5°C, que contiene bromuro de sodio (0,8eq) y 4-AcNH-TEMPO (0,01%). La mezcla se agitó durante 2 h a 5°C.Luegose añadióetanol (10eq) a la reacción, quese agitó durante una hora adicional a temperatura ambiente.El producto se aisló por precipitación con IPA y se analizó por RMN.
DS = 20%(determinadopor RMN)
Análisis espectraldealdehídoa ,p-insaturadode sulfato de condroitina: RMN1H (500 MHz, D2O, 8 ppm): 2,02 (3H, AcNH-, bs), 4,31 (1H, H2, bs), 4,49 (1H, H3, bs), 5,20 (1H, H1, bs), 6,34 (1H, H4, bs), 9,21 (1H, H6, bs);
RMN1H-1H COSY (D2O), picos de cruce, 8 ppm: 4,31-4,49,4,31-5,20,4,49-6,34; RMN1H-13C HSQC
(D2O), picos de cruce, 8 ppm: 2,02-25,1, 4,31-51,0, 4,49-73,1, 5,20-98,6, 6,34-122,0, 9,21-189,0;
RMN DOSY (D2O), log D ((2,02, Ac-NH-), (4,31, H2), (4,49, H3), (5,20, H1), (6,34, H4), (9,21, H6)) ~ -10,3 m V , log D (4,72, H2O) ~ -8,6 m2 s-1;
IR (KBr, cm'1): 1725, 1650 (v C=O st), 1615, 1663 (v C=C st);
UV/Vis (0,1%, H2O); Amax1,2 (Cp=Ca-C=O) = 254 nm (n^n*), 300-350 (n^n*).
Ejemplo 2
Preparacióndealdehídoa ,p-insaturadode sulfato de condroitina
Se añadiógradualmenteuna disolución acuosa de hipoclorito de sodio (0,4eq, 11% de cloro activo)en una disolución acuosa al 2% de sulfato de condroitina (200 mg, Mw = 4,5x104g.mol-1) enfriada a 5°C, que contenía dodecahidrato de fosfato disódico(2,2eq), bromuro de sodio (0,4eq) y 4-AcNH-TEMPO (0,01%).La mezcla se agitó durante 2 horas a 5°C.Después se añadióetanol (10eq) a la reacción, que se agitó durante una hora adicional a temperatura ambiente.El producto se aisló por precipitación con IPA y seanalizópor RMN.
DS=2% (determinado por RMN), Mw=2,8x104g.mol-1(determinado por SEC MALLS).Elanálisisestructuraldel producto se presenta en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3
Preparacióndealdehídoa ,p-insaturado de sulfato de condroitina
Se añadiógradualmenteuna disolución acuosa de hipoclorito de sodio (1eq, 11% de cloro activo)en una disolución acuosa al 2% de sulfato de condroitina (200 mg, Mw=4,5x104g.mol-1) enfriada a 5°C, que contienefosfato disódico dodecahidrato(2,2eq), bromuro de sodio (1eq) y 4-AcNH-TEMPO (0,01%).La mezcla se agitó durante 2 horas a 5°C.Se añadió después etanol(10eq) a la reacción, que se agitó durante una hora adicional a temperatura ambiente.El producto se aisló por precipitación con IPA y seanalizópor RMN.
DS=21% (determinado por RMN), Mw=2,0x104g.mol-1(determinado por SEC MALLS).El análisis estructural del producto se presenta en el Ejemplo 1.
Ejemplo 4
Preparacióndealdehídoa ,p-insaturadode sulfato de condroitina
Se añadió gradualmente una disolución acuosa de hipoclorito de sodio (2eq, 11% de cloro activo)en una disolución acuosa al 2% de sulfato de condroitina (200 mg, Mw=4,5x104g.mol-1) enfriada a 5°C, que conteníafosfato disódico dodecahidrato(2,2eq), bromuro de sodio (2eq) y 4-AcNH-TEMPO (0,01%).La mezcla se agitó durante 2 horas a 5°C.Después se añadió etanol(10eq) a la reacción, que se agitó durante una hora adicional a temperatura ambiente.El producto se aisló por precipitación con IPA y seanalizópor RMN.
DS=21% (determinado por RMN), Mw=1,8x104g.mol-1(determinado por SEC MALLS).El análisis estructural del producto se presenta en el Ejemplo 1.
Ejemplo 5
Preparacióndealdehído a ,p-insaturadode sulfato de dermatán
Se añadiógradualmenteuna disolución acuosa de hipoclorito de sodio (0,8eq, 11% de cloro activo) en una disolución acuosa al 2% de sulfato de dermatán (200 mg, 0,42mol) enfriada a 5°C,que contienefosfato disódico dodecahidrato(2,2eq), bromuro de sodio (0,8eq) y 4-AcNH-TEMPO (0,01%).La mezcla se agitó durante 2 horas a 5°C.Después se añadió etanol (10 eq) a la reacción, que se agitó durante una hora adicional a temperatura ambiente.El producto se aisló por precipitación con IPA y seanalizópor RMN.
DS=20%(deteririinadopor RMN)
Análisis espectraldealdehído a ,p-insaturado de sulfato de dermatán: RMN1H (500 MHz, D2O,8 ppm): 2,01 (3H, Ac-NH-,bs), 6,30 (1H, H4,bs), 9,20 (1H, H6,bs).
Ejemplo 6
Preparacióndealdehído a ,p-insaturadode carragenina
Se añadiógradualmenteuna disolución acuosa de hipoclorito de sodio (0,8eq, 11% de cloro activo) en una disolución acuosa al 1% de carragenina (200 mg, 0,31mol) enfriada a 10°C,que contienefosfato disódico dodecahidrato(2,2eq), bromuro de sodio (0,8eq) y 4-AcNH-TEMPO (0,01%).La mezcla se agitó durante 2 horas a 10°C.Después se añadió etanol (10 eq) a la reacción, que se agitó durante una hora adicional a temperatura ambiente.El producto se aisló por precipitación con IPA y seanalizópor RMN.
DS=10%(determinadopor RMN)
Análisis espectraldealdehído a ,p-insaturadode carragenina: RMN1H (500 MHz, D2O, 8ppm): 6,30 (1H, H4,bs), 9,20 (1H, H6,bs)
Ejemplo 7
Unión de hidrazinaaaldehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina
Se añadió hidrato de hidrazina (2eq) a una disolución al 2% de aldehído a ,p-insaturadode sulfato decondroitina (20 mg, DS = 23%, Mw = 2,1x104 g.mol"1 ) en D2O.La reacciónse agitó durante 24 h a temperatura ambiente.El producto se analizó en la forma de una mezcla de reacción cruda.
DS = 20% (determinado por RMN)
RMN1H(500 MHz, D2O,8ppm): 5.40(1H.-CH=C-CH=N-.bs).7.38(1H. -CH=C-CH= N-, bs)
Ejemplo 8
Unión debutilaminaaaldehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina
Método 1: Se añadió butilamina(0,2eq) a una disolución al 2% de aldehídoa ,p-insaturadode sulfato de condroitina(20 mg, DS = 23%, Mw = 2,1x104 g.moE)en D2O.La reacciónse agitódurante 24 horas a temperatura ambiente y pH = 11,20.El producto se analizó en la forma de una mezcla de reacción cruda.
DS = 20%(determinadopor RMN)
RMN1H (500 MHz, D2O,8ppm): 5,67(1H,-CH= C-CH=N-,bs),7,74(1H, -CH = C-CH = N-, bs)
Método 2: Se añadió ácido acético deuterado (14,5pL) a una muestra de RMN del Método1.ElpH medidofue de 4,10 y la muestra seanalizópor RMN.
DS = 0% (determinado por RMN)
Ejemplo 9
Unión debutilaminaaaldehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina
Se añadióbutilamina(0,2eq) a una disolución al 2%dealdehído a ,p-insaturadode sulfato de condroitina(20 mg, DS = 23%, Mw = 2,1x104g.mol-1)en PBS deuterado.La reacciónse agitódurante 24 h a temperatura ambiente y pH = 7,30.El producto se analizóen la formade una mezcla de reacción cruda.
DS = 0%(determinadopor RMN)
Ejemplo 10
Unión de hexano-1,6-diamina aaldehído a ,p-insaturadode sulfato de condroitina
Se añadió hexano-1,6-diamina (0,5 eq) a una disolución al 2% de aldehídoa ,p-insaturadodesulfato decondroitina(20 mg, DS = 23%, Mw = 2,1x104g.mol-1)en D2O.La reacciónse agitó durante 24 h a temperatura ambiente y pH = 11,60.El producto se analizóen la formade una mezcla de reacción cruda.
DS = 20%(determinadopor RMN)
RMN1H (500 MHz, Ü2O,8ppm): 5,68(1H, -CH=C-CH=N-.bs).7.74(1H. -CH=C-CH =N-,bs)
Ejemplo 11
La unión depropoxiaminaaaldehído a ,p-insaturadode sulfato de condroitina
Se añadióclorhidrato depropoxiamina(0,5eq) a una disolución al 2%dealdehído a ,p-insaturadode sulfato de condroitina (20 mg, DS = 23%. Mw = 2,1x104g.mol'1 )en Ü2O.La reacciónse agitó durante 24 h a temperatura ambiente y pH = 3.90.EI producto se analizóen la formade una mezcla de reacción cruda.
DS = 20%(determinadopor RMN)
RMN1H (500 MHz, Ü2O,8ppm): 5.57 y6,88(1H, -CH = C-CH = N-,bs),7,52 y 7.70(1H, -CH = CCH = N-.bs) Ejemplo 12
Unión delisinaaaldehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina
Se añadióclorhidratode lisina (0,5eq) a una disolución al 2%dealdehído a ,p-insaturadodesulfato decondroitina(20 mg. DS = 23%. Mw = 2,1x104g.mol-1)en PBS deuterado.La reacciónse agitó durante 24 h a temperatura ambiente y pH = 7,46.El producto se analizóen la forma de una mezcla de reacción cruda.
DS = 4% (determinado por RMN)
RMN1H (500 MHz, D2O,8ppm):5.69-5,75(1H,-CH=C-CH = N-,bs).7.70-7,75(1H,-CH=CCH= N-.bs)
Ejemplo 13
Unión de lisinaaaldehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina
Seañadióclorhidrato de lisina (0,5eq) a una disolución al 2%dealdehído a ,p-insaturadode sulfato decondroitina(20 mg. DS = 23%. Mw = 2,1x104g.mol-1)en D2O.El pHde la reacciónseajustó a 8,40 añadiendo bicarbonato de sodio (2eq).La reacción se agitó durante 24 h atemperatura ambiente.El producto seanalizóen la forma de una mezcla de reacción cruda.
DS = 7%(determinadopor RMN)
El análisis estructural se presenta en el Ejemplo 12.
Ejemplo 14
Unión delpéptidoRGDaaldehídoa ,p-insaturado de sulfato de condroitina
Se añadiópéptidoRGD(0,2eq, secuencia Ahx-Gly-Arg-GlyAsp-NH2) a una disolución al 2% dealdehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina (20 mg. DS = 23%. Mw = 2,1x104g.mol-1)enD2O.La reacción se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente y pH = 4,22.El productoseanalizóen la forma de una mezcla de reacción cruda.
DS = 0% (determinado por RMN)
Ejemplo 15
Unión depéptidoRGDaaldehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina
Se añadiópéptidoRGD(0,2eq, secuencia Ahx-Gly-Arg-GlyAsp-NH2) a una disolución al 2% de aldehído a ,pinsaturado de sulfato de condroitina (20 mg. DS = 23%. Mw = 2,1x104g.mol-1)enPBSdeuterado.La reacción se agitó durante 24 h a temperatura ambiente y pH = 7,22. El producto seanalizóen la forma de una mezcla de reacción cruda.
DS = 4%(determinadopor RMN)
RMN1H (500 MHz, D2O, 3 ppm): 5,68(1H, -CH=C-CH=N-,bs),7,74(1H, -CH=C-CH=N-,bs)
Ejemplo 16
Unión depéptidoRGDaaldehído a ,p-insaturadode sulfato de condroitina
Se añadiópéptidoRGD(0,2eq, secuencia Ahx-Gly-Arg-GlyAsp-NH2) a una disolución al 2% dealdehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina (20 mg. DS = 23%. Mw = 2,1x104g.mol-1)enD2O.El pHde la reacción se ajustó a 10,49 añadiendo bicarbonato de sodio (2eq).La reacción se agitó durante 24 h a temperatura ambiente.El producto seanalizóen la formadeunamezcla de reacción cruda.
DS = 20%(determinadopor RMN)
El análisis estructural se presenta en el Ejemplo 15.
Ejemplo 17
Unión de anilinaa aldehido a ,p-insaturado de sulfato de condroitina
Se añadióanilina (0,3eq) a una disolución al 2%dealdehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina(20 mg, DS = 23%, Mw = 2,1x104g.mol"1 )en D2O.El pHde la reacción se ajustó a4,22 añadiendo ácido acético deuterado (8,8pL).La reacción se agitó durante 24h a temperatura ambiente.El producto seanalizóen la forma de una mezcla de reacción bruta.
DS = 0% (determinado por RMN)
Ejemplo 18
Unión de anilinaaaldehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina
Se añadióanilina (0,3eq) a una disolución al 2% dealdehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina(20 mg, DS = 23%, Mw = 2,1x104g.mol' 1 ) en PBS deuterado.La reacción se agitódurante 24 h a temperatura ambiente y pH = 7,42.El producto fueanalizadoen la forma deuna mezcla de reacción cruda.
DS = 5%(determinadopor RMN)
RMN1H (500 MHz, D2O,8ppm): 5,93 (1H, -CH=C-CH=N-,bs), 8,03 (1H, -CH=C-CH=N-,bs)
Ejemplo 19
Unión de anilina aaldehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina
Se añadióanilina (0,3eq) a una disolución al 2% de aldehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina(20 mg, DS = 23%, Mw = 2,1x104g.mol'1 ) en D2O.Se ajustó elpHde la reacción a10,73 añadiendo carbonato de sodio.La reacción se agitó durante 24 h a temperatura ambiente.El producto seanalizóen la forma de una mezcla de reacción cruda. DS = 25%(determinadopor RMN)
El análisis estructural se presenta en el Ejemplo 18.
Ejemplo 20
Unión de adipato dedihidrazidaaaldehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina
Se añadió adipato de dihidrazida(3eq) a una disolución al 2% dealdehído a ,p-insaturado desulfatodecondroitina(20 mg, DS = 23%, Mw = 2,1x104g.mol-1) en D2O.La reacciónse agitódurante 24 h a temperatura ambiente y pH = 7,50.El producto se analizóen la forma deuna mezcla de reacción cruda.
DS = 20%(determinadopor RMN)
RMN1H (500 MHz, D2O,8ppm): 1,64 (4H, DHA23,bs),2,04 (3H, Ac-NH-,bs),2,34 (4H, DHA14,bs),4,28 (1H, H2,bs), 4,36 (1H, H3,bs), 5,20 (1H, H1,bs), 5,62 (1H, H4cis,bs), 5,68 (1H, H4trans,bs), 7,52-7,48 (1H, H6cis,bs), 7,61 (1H, H6trans,bs);
RMN1H-1HCOSY(D2O),picosde cruce, 8ppm: 1,64-2,34,4,28-5,20, 4,36-5,68;RMN1H-13CHSQC
(D2O),picos de cruce,8ppm: 1,64-24,9, 2,34-34,1, 4,28-51,0, 4,36-73,6, 5,20-98,8, 5,68-111,3,7.61148.5;
RMNDOSY(D2O), log D ((2,04, Ac-NH-), (4,28, H2), (4,36, H3), (5,20, H1), (5,62 y5,68,H4cis/trans), (7,52 y 7,68, H6cis/trans))~-10,4 m V ,log D (4,72, H2O)~-8,6 m V ;IR (KBr, cm'1 ):1640-1650 (v -C=N-st);
UV/Vis (0,1%, H2O);Xmax1,2(-C=N-) = 280nm (n^n*).
Ejemplo 21
Reticulación de aldehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina conadipato de dihidrazida
Se añadió adipato de dihidrazida(0,12eq, relación de sitios de unión 1:1) en PBS a una disolución al 8%dealdehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina (40 mg, DS = 23%, Mw = 2,1x104g.mol'1 )enPBS (pH = 7,40, c = 0,9% p/v).Después de la adición de la disolución deadipato de dihidrazida, la gelificación tuvo lugar en tiempo (Tg= 34 s).El gel elástico se fotografió (Fig. 1), se liofilizó,y se analizó por SEM (Fig. 2).
Módulo de elasticidad de Young en compresión = 9x103Pa
Máxima resistencia en compresión = 64x103Pa
Deformación al límite elástico = 64%
Tenacidad = 3668 J.m-3
Ejemplo 22
Reticulacióndealdehídoa ,p-insaturadode sulfato de dermatán con adipato de dihidrazida
Se añadióadipatode dihidrazida (0,1eq,relación de sitios de unión 1:1) en PBS a una disolución al 8% de aldehído a ,p-insaturado de sulfato de dermatán(40mg, DS = 20%, Mw<40kDa) en PBS (pH = 7,40, c = 0,9% p/v).Después de la adición de la disolución de adipato dedihidrazida, procedió la gelificación.
Ejemplo 23
Reticulacióndealdehído a ,p-insaturado de carragenina conadipato de dihidrazida
Se añadió 40|j L deadipatode dihidrazida (0,05eq)en PBS a una disolución al 8%dealdehído a ,p-insaturado de carragenina (40 mg, DS = 10%, Mw < 50kDa)en p Bs (pH = 7,40, c=0,9% p/v).Después de la adición de la disolución deadipato de dihidrazida, la viscosidadaumentó.
Ejemplo 24
Reticulacióndealdehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina con un derivado de hidrazida deácido hialurónico Una disolución al 4%de derivado de hidrazida de ácido hialurónico (9,2 mg, DS = 25%, Mw = 138x103g.mol-1)en PBS (pH = 7,4, c = 0,9% p/v) se añadió a una disolución al 4% de unaldehído a ,p-insaturadode sulfato de condroitina (10 mg, DS = 23%, Mw = 2,1x104g.mol-1)en PBS.Después de mezclarlas soluciones, la gelificación tuvo lugar en tiempo (Tg= 109 s).
Módulo de elasticidad de Young en compresión = 6x103Pa
Máxima resistencia en compresión = 840x103 Pa
Deformación al límite elástico = 96%
Tenacidad = 11978 J.m-3
Ejemplo 25
Reticulacióndealdehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina con ácido hialurónico desacetilado
Una disolución al 2% deácido hialurónicodesacetilado(2eq, DS =11%, Mw = 116kDa, relación de sitios de unión 1:1) en PBS (pH = 7,4, c = 0,9% p/v) se añadió a una disolución al 4% dealdehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina (10 mg, DS = 23%, Mw = 2,1x104g.mol-1)en PBS (pH =7,40, c = 0,9% p/v).La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente, en dondese observó un aumento de la viscosidad después de 0,5 h, y se formó un gel elástico después de 1 h.
Módulo de elasticidad de Young en compresión = 3x103 Pa
Máxima resistencia en compresión = 395x103 Pa
Deformación al límite elástico = 95%
Tenacidad = 14670 J.m-3
Ejemplo 26
Preparación de la forma ácida del sulfato de condroitina
Sepreparó una disolución al 1% de sulfato de condroitina (500 mg, 1,1mmol) en agua destilada.La disolución se enfrió a 5°Cy 1,2mlyse añadiócatexAmberliteIR 120Na (H+).Lamezcla dereacciónse agitó durante 24 h a 5°C.Se filtrócatex, y el producto se congeló y se liofilizó. Su solubilidad enDSMOse sometió a ensayo y se encontró satisfactoria.
Ejemplo 27
Preparación desulfato de condroitinadesacetilado
Se preparó una disolución al 1% de la forma ácida delsulfato de condroitina (200 mg, 0,44mmol,Mw< 40 kDA) en DMSO. La disolución se desgasificó mediante una corriente de nitrógeno.Se añadieron 10,6mlde hidrato de hidrazinay 3 eq de sulfato de hidrazina.La mezcla de reacción se agitó durante 24 ha 60°Cen nitrógeno.Luego se añadió NaHCO3 a la mezcla de reacción.El producto se aisló por precipitación con IPA.
DS = 10% (determinado por RMN), Mw = 1,8x104g.mor1 (determinado porSECMALLS)
RMN1H (500 MHz, 1%NaODv D2O,8ppm): 3,01(1H, -CH = C-CH = N-,bs)HSQC (500MHz, D2O,8ppm):pico de cruce:3,42-52,2 ppm
Ejemplo 28
Reticulación dealdehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina consulfato de condroitinadesacetilado
Una disolución al 8% desulfato de condroitinadesacetilado(2eq,DS = 10%, Mw = 1,8x104g.mol"1 en una relación de sitios deunión= 1/0,85) en PBS (pH = 7,4, c = 0,9% p/v) se añadió a una disolución al 8% de aldehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina (20 mg, DS = 23%, Mw = 2,1x104g.mol'1 )enPBS (pH = 7,4, c = 0,9% p/v).La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente, en dondese observó un aumento de la viscosidad después de 0,5 h, y se formó un gel elástico después de3 h.
Módulo de elasticidad de Young en compresión = 3x103 Pa
Máxima resistenciaencompresión = 774x103Pa
Deformación al límite elástico = 95%
Tenacidad = 16489 J.m-3
Ejemplo29
Reticulacióndealdehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina conpropoxiamina
Una disolución PBS declorhidrato de propoxiamina(0,12eq,relación de sitios de unión = 1/1) se añadióauna disolución al 10%dealdehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina (50 mg, DS = 23%, Mw = 2,1x104g.mol-1)en PBS (pH = 7,40, c = 0,9% p/v), en donde se formó un gel en tiempo (Tg=110s).
Módulo de elasticidad de Young en compresión = 8x103Pa
Máxima resistenciaencompresión = 74x103Pa
Deformación al límite elástico = 65%
Tenacidad = 3768 J.m-3
Ejemplo 30
Medición de la cinética de gelificación de la reacción de reticulacióndealdehído a ,p-insaturado desulfato decondroitinaconderivado aminopropoxilo delácidohialurónico
La medición de la cinética de gelificación se realizó mediante una muestra al 4% dealdehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina (10 mg, DS = 23%, Mw = 2,1x104g.mol-1)enPBS (pH = 7,40, c = 0,9% p/v) con una disolución al 4% dederivadoaminopropoxilodel ácido hialurónico (1 eq, DS = 25%, Mw = 66kDa)enPBS (pH = 7,4, c = 0,9% p/v).Se determinó que el tiempo de gelificación, es decir, laetapa, cuando se formó la primera red macroscópica de gel, fue (Tg= 97s, Fig. 4).
Ejemplo 31
Comparación de las propiedades mecánicas de loshidrogeles basados en el aldehído a ,p-insaturado reticuladode sulfato de condroitina yel aldehído a ,p-insaturadoreticulado dehialuronano
Solución 1: disolución al 4% dealdehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina (DS = 23%, Mw = 2,1x104g.mol-1, Ejemplo 1) en PBS (pH = 7,40, c = 0,9% p/v).
Solución 2: disolución al 4%dealdehído a ,p-insaturado de ácido hialurónico (DS = 7%, Mw =2,5x104g.mol-1)en PBS (pH = 7,40, c = 0,9% p/v).
Solución 3: disolución al 4% dederivadodeaminopropoxilode ácido hialurónico (DS = 25%, Mw = 66kDa) en PBS (pH = 7,40, c = 0,9% p/v).
Los hidrogeles se prepararon a partir de dichas soluciones mezclando sus relaciones de volumen equivalentes enlas siguientes combinaciones: disolución 1+ disolución 3 (muestra A) y disolución 2+ disolución 3(muestra B).Las muestras A y B se dejaron madurar a temperatura ambiente durante 3 horas. Despuésse midieron las propiedades mecánicas de los materiales, a saber, el módulo de Young deelasticidad en compresión, máxima resistencia en compresión, y la deformación al límite elástico(Tabla 2).
Tabla 2: Comparación de las propiedades mecánicas de los hidrogeles basados enaldehídosa ,p-insaturados reticuladosderivados de sulfato de condroitina y ácido hialurónico
Figure imgf000020_0001
Los datos medidos indican las ventajas del uso del material de un mayor grado desustitución en el derivado de sulfato de condroitina (muestra A), debido a que los hidrogeles preparados apartir de este derivado tienen una mayor rigidez y muestran una menor tasa de deformación en comparacióncon el derivado del ácido hialurónico (muestra B).Como las muestras eran del mismo peso molecular y seanalizaronen las mismas condiciones, este hecho parece ser la consecuencia deuna mayor densidad de reticulación y se correlaciona directamente, mientras se mantiene el mismo peso molecular, con el mayor grado de sustitución del aldehído a ,p-insaturadoen la estructuradel polisacárido modificado.
Ejemplo 32
Ensayos de viabilidad de fibroblastos 3T3 en presenciadealdehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina
La sustancia ensayada,aldehído a ,p-insaturado de sulfato de condroitina (DS=20%, Mw=40kDa), se disolvió en un medio 3T3 completo.La disolución se filtró a través de un filtro de 0,22pm.Las concentraciones de ensayo finales de la disolución ensayada fueron 10, 100, 500 y1000pg.mL'\ Se inocularon células 3T3 de la densidad de 3000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Antes del tratamiento, las células se cultivaron durante 24 horas en un medio completo.Laviabilidadcelularse evaluó por espectrofotometría por medio debromurode 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio (métodoMTT) en los intervalos de 0, 24, 48,72 horas. El experimento se complementó con un conjunto de controles no tratados y muestras en blanco.
Los datos de densidad óptica medida se convirtieron en porcentaje de formulación con relación al control en las horas de tiempo T0 (la relación de la densidad óptica de la muestra tratada con respecto a la densidad óptica del control no tratado T0, multiplicada por 100) y se calculó el error estándarde la media (SEM).Los resultados de la prueba se presentan gráficamente en la Fig. 3.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un derivado de un polisacárido sulfatado que tiene como una parte de su cadena de polímero al menos un anillo degalactopiranosamodificado según la fórmula general I o II, conteniendo dicho anilloun doble enlace en la4°y 5°posición en una conjugación con un aldehídoenla6°posición según la fórmula general I o adyacentea su forma hidratada según la fórmula general II.
Figure imgf000021_0001
donde
R esOH, O-SO2-OH, O-SO2-ONa o NH-Ac.
2. El derivado de un polisacárido sulfatadosegún la reivindicación 1,caracterizado porque el polisacárido se selecciona del grupo que comprende sulfato de condroitina,sulfato de dermatán, carragenina y sus derivados y/o sales farmacéuticamente aceptables.
3. El derivado de un polisacárido sulfatado según la reivindicación 1 o 2,caracterizado porqueel polisacárido tiene el peso molecular dentro del intervalo de 1x103a5x104g.mol-1y el grado de sustitución dentro del intervalo de 1 a 40%, preferiblemente10 a 25%.
4.Un método de preparación de los derivados de polisacáridos sulfatados según las reivindicaciones1 a 3, caracterizado porqueel polisacárido sulfatado, que es soluble enaguaen su forma nativa y que contiene al menos una unidad de galactopiranosa sulfatada en la4°posición que se une vía enlace 0-glicosídicoa (1—3) o p( 1 —^3) en la cadena de polímero, según la fórmula estructural general (III).
Figure imgf000021_0002
donde
R esOH, O-SO2-OH, O-SO2-ONa o NH-C(O)CH3, R1 es HoNa, se oxida a unaldehídoen la6posición, e inmediatamente después de la oxidación la mezcla de reacción sesomete a eliminación en la misma mezcla de reacción para formar el derivado del polisacáridosulfatadodefinido en las reivindicaciones 1 a 3.
5.El método de preparación según la reivindicación 4,caracterizadoporquese utilizaun polisacárido sulfatadodel peso molecular dentro del intervalo de 1x104a5x106g.mol-1.
6. El método de preparación según las reivindicaciones 4 o 5, caracterizado porque se utiliza un polisacárido sulfatado seleccionado del grupo que comprende sulfato de condroitina,sulfato de dermatán, carragenina y sus derivados y/osales farmacéuticamente aceptables.
7. El método de preparación según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6,caracterizado porque laoxidación se realiza mediante el sistema R3-TEMPO/NaClO, en donde R3 eshidrógenoo N-acetilo, en agua o en una disolución acuosa de sales inorgánicas, a una temperatura de 5 a25°C.
8. El método de preparación según la reivindicación 7,caracterizado porquela cantidad molar de R3-TEMPO es de 0,01 a 0,2 equivalentes y la cantidad molar deNaClOestá dentrodel intervalo de 0,1 a 2,0 equivalentes con respecto a un dímero del polisacárido sulfatado, y/o la disolución acuosa de sales inorgánicas es una disolución acuosaquecontiene una sal de metal alcalino y/o un tampón, p. ej., el tampón fosfato.
9. El método de preparación según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizado porquelaeliminación se desarrollaa una temperatura de 5 a 25°C, y sin el aislamiento del aldehído C6 saturado en la subunidad de galactopiranosasulfatada en la4°posición.
10. Un método de modificación del derivado definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,caracterizadoporqueel derivado reacciona con una amina según la fórmula generalR2-NH2,en donde R2 es una cadena de alquilo, arilo,hetarilo, lineal o ramificada deC1aC30, que opcionalmente contiene átomos de N, S u O.
11. El método de modificación según la reivindicación 10,caracterizado porquelaaminaesuna amina biológicamente activa, principalmente un aminoácido o un péptido, o un polímero biológicamente aceptable con un grupo amino libre.
12. El método de modificación según la reivindicación 11,caracterizado porqueel grupo aminodel polímero biológicamente aceptable con un grupo amino libre es una parte directadelpolímero seleccionado del grupo que comprendegelatina, quitosano,ácidohialurónico desacetiladoysulfato de condroitinadesacetilado, y/o porque el grupo amino delpolímero biológicamente aceptable con un grupo amino libre está unido al polímero vía un enlazador que contiene un grupo amino, hidrazina, hidrazida,aminoalcoxi, hidroxilo,carboxilo, tiol, o cualquier combinación de los mismos.
13. El método de modificación según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12,caracterizado porquela cantidad de amina, aminoácido, péptido o grupos amino libres del polímero está dentro del intervalo de 0,05 a 3,0 equivalentes con respecto a un dímero delpolisacáridosulfatado.
14. El método de modificación según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13,caracterizado porque lareacción con amina, aminoácido, péptido o polímero que contiene un grupo amino libre se desarrolla en agua, tampón fosfato o sistema de agua-disolvente orgánico a la temperatura dentro del intervalo de 20 a 60°C, durante 10 min a 150 h.
15. El método de modificación según la reivindicación 14,caracterizado porqueel disolventeorgánico se selecciona del grupo que comprende alcoholes miscibles en agua, en particular isopropanolo etanol, y disolventes apróticos polares miscibles en agua, en particulardimetilsulfóxido, en donde el contenido de agua en la mezcla es al menos 50% en vol.
16. El método de modificación del derivado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,caracterizadoporqueel derivado reacciona con N-nucleófilo bi y polifuncional biocompatible e hidrosolubleseleccionado del grupo que comprende alquilaminas, arilaminas,heteroalquilaminas,hetarilaminas, aminoácidos, péptidos, polímeros con ungrupo aminolibre,hidrazinas,hidroxilaminas, hidrazidas,semicarbazidasotiosemicarbazidas, en donde se produce la reticulación del derivado.
17. El método de modificación según la reivindicación 16,caracterizado porque el nucleófilo es hidrazida, polisacárido desacetilado,oalcoxiamina, y porquela reacción procede entampón fosfato.
18. El uso de los derivados según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, como portadores desustanciasbiológicamenteactivas con liberación controlada mediante el cambio de valor depH, en el campo de la cosmética y la farmacia.
19. El uso de los derivados modificados por el método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17,comomateriales biocompatibles para aplicaciones biomédicas y la formación de armazones para ingeniería detejidos, o para medicina regenerativa.
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