WO2012029986A1 - アンチセンス核酸 - Google Patents

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WO2012029986A1
WO2012029986A1 PCT/JP2011/070318 JP2011070318W WO2012029986A1 WO 2012029986 A1 WO2012029986 A1 WO 2012029986A1 JP 2011070318 W JP2011070318 W JP 2011070318W WO 2012029986 A1 WO2012029986 A1 WO 2012029986A1
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synthetic nucleic
antisense oligomer
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渡辺直樹
佐藤洋平
武田伸一
永田哲也
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日本新薬株式会社
独立行政法人国立精神・神経医療研究センター
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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Definitions

  • the present invention relates to an antisense oligomer that enables skipping of the 53rd exon of the human dystrophin gene and a pharmaceutical composition containing the oligomer.
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • the dystrophin gene is present on the X chromosome and is a huge gene composed of 2.2 million base pairs of DNA.
  • Dystrophin protein is involved in maintaining the membrane stability of muscle cells, and is necessary to make muscle cells difficult to break. Since the dystrophin gene of DMD patients has a mutation, dystrophin protein having a function in muscle cells is hardly expressed. Therefore, in the DMD patient body, the structure of the muscle cell cannot be maintained, and a large amount of calcium ions flows into the muscle cell. As a result, a reaction similar to inflammation occurs and fibrosis advances, making it difficult for muscle cells to regenerate.
  • Becker muscular dystrophy is also caused by mutations in the dystrophin gene, but its symptoms generally show weakness due to muscle atrophy, but are generally lighter than DMD, and the progression of weakness is slow, often in adulthood.
  • the difference in clinical symptoms between DMD and BMD is thought to be due to whether the amino acid reading frame when dystrophin mRNA is translated into dystrophin protein due to mutation is destroyed or maintained (non-patented). Reference 1).
  • DMD has a mutation that shifts the amino acid reading frame, so that almost no functional dystrophin protein is expressed.
  • BMD a part of the exon is deleted due to the mutation, but the amino acid reading frame is maintained. Therefore, a dystrophin protein having a function although it is incomplete is produced.
  • the exon skipping method is expected as a treatment method for DMD.
  • This method restores the amino acid reading frame of dystrophin mRNA by altering splicing and induces the expression of dystrophin protein partially restored in function (Non-patent Document 2).
  • the part of the amino acid sequence targeted for exon skipping will be lost.
  • the dystrophin protein expressed by this treatment is shorter than the normal one, but the function of stabilizing muscle cells is partially retained because the amino acid reading frame is maintained.
  • exon skipping is expected to cause DMD to exhibit symptoms similar to milder BMD.
  • the exon skipping method is undergoing clinical trials for human DMD patients through animal experiments with mice and dogs.
  • Exon skipping can be induced by binding of antisense nucleic acids that target either or both 5 'or 3' splice sites, or the interior of an exon. Exons are only included in mRNA if both splice sites are recognized by the spliceosome complex. Thus, exon skipping can be induced by targeting the splice site with an antisense nucleic acid. In addition, it is thought that the binding of SR protein to exon splicing enhancer (ESE) is necessary for exon to be recognized by splicing mechanism, and exon skipping can also be induced by targeting ESE. it can.
  • ESE exon splicing enhancer
  • Non-patent Document 3 Since the mutation of the dystrophin gene varies depending on the DMD patient, an antisense nucleic acid corresponding to the location and type of the gene mutation is required. So far, antisense nucleic acids that induce exon skipping for all 79 exons have been produced by Steve Wilton et al. Of the University of Western Australia (Non-patent Document 3), and 39 kinds of antisense nucleic acids have been produced by Annemieke Aartsma-Rus et al. Of the Netherlands. An antisense nucleic acid that induces exon skipping relative to an exon has been made (Non-patent Document 4).
  • exon 53 About 8% of all DMD patients are considered to be treatable by skipping the 53rd exon (hereinafter referred to as “exon 53”).
  • exon 53 the 53rd exon
  • Patent Documents 1 to 4 Non-Patent Document 5
  • International Publication WO 2006/000057 International Publication WO 2004/048570 US Patent Publication US 2010/0168212 International Publication WO 2010/048586 Monaco A. P. et al. Genomics 1988; 2: p. 90-95 Matsuo M.M. Brain Dev 1996; 18: p. 167-172 Wilton S.
  • an antisense oligomer that strongly induces the skipping of exon 53 of the dystrophin gene and a therapeutic agent for muscular dystrophy containing the oligomer are desired.
  • the present inventors have found that nucleotides around the 32nd to 56th nucleotides from the 5 ′ end of exon 53 in the mRNA precursor of the dystrophin gene (hereinafter referred to as “pre-mRNA”). It was found that the skipping of exon 53 can be induced with high efficiency by targeting the sequence consisting of an antisense oligomer.
  • pre-mRNA nucleotides around the 32nd to 56th nucleotides from the 5 ′ end of exon 53 in the mRNA precursor of the dystrophin gene
  • An antisense oligomer that enables skipping of the 53rd exon of the human dystrophin gene, the 31st to 53rd, 31st to 54th from the 5 'end of the 53rd exon of the human dystrophin gene 31st to 55th, 31st to 56th, 31st to 57th, 31st to 58th, 32nd to 53rd, 32nd to 54th, 32nd to 55th, 32nd to 56th, 32 to 57, 32 to 58, 33 to 53, 33 to 54, 33 to 55, 33 to 56, 33 to 57, 33 to 58, 34 to 53rd, 34th to 54th, 34th to 55th, 34th to 56th, 34th to 57th, 34th to 58th, 35th to 53rd, 35th to 54th, 35th to 55th 35th to 56th, 35th to 57th, 35th to 58th, Complementary to any one of the sequences consisting of nucleotides 36 to 53, 36,
  • An antisense oligomer consisting of a base sequence.
  • the sugar moiety of at least one nucleotide constituting the oligonucleotide has a 2′-position —OH group, OR, R, R′OR, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , N 3 ,
  • the above R represents alkyl or aryl, and the above R ′ represents alkylene.
  • the phosphate-binding portion of at least one nucleotide constituting the oligonucleotide is selected from the group consisting of a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond, an alkylphosphonate bond, a phosphoramidate bond, and a boranophosphate bond.
  • the antisense oligomer according to [1] which is a morpholino oligomer.
  • [7] The antisense oligomer according to [6], which is a phosphorodiamidate morpholino oligomer.
  • [8] The antisense oligomer according to any one of [1] to [7], wherein the 5 ′ end is any one of the following chemical formulas (1) to (3).
  • [9] The above [1] to [8], comprising a base sequence complementary to a sequence consisting of nucleotides 32 to 56 or 36 to 56 from the 5 ′ end of the 53 ′ exon of the human dystrophin gene. The antisense oligomer of any one of these.
  • a pharmaceutical composition for treating muscular dystrophy comprising the antisense oligomer according to any one of [1] to [12], a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof as an active ingredient.
  • the antisense oligomer of the present invention can induce skipping of exon 53 of the human dystrophin gene with high efficiency. Moreover, the symptoms of Duchenne muscular dystrophy can be effectively reduced by administering the pharmaceutical composition of the present invention.
  • RD cell rhabdomyosarcoma cell line
  • Antisense oligomer The present invention is an antisense oligomer that enables skipping of the 53rd exon of the human dystrophin gene, which is 31st to 53rd, 31st to 54th from the 5 'end of the 53rd exon of the human dystrophin gene.
  • “gene” includes not only genomic genes but also cDNAs, mRNA precursors and mRNAs. Preferably, the gene is an mRNA precursor, ie pre-mRNA.
  • the human dystrophin gene is present at locus Xp21.2.
  • the human dystrophin gene has a size of 3.0 Mbp, and is the largest known human gene.
  • the coding region of the human dystrophin gene is only 14 kb, and the coding region is dispersed in the dystrophin gene as 79 exons (Roberts, RG., Et al., Genomics, 16: 536-538 ( 1993)).
  • Pre-mRNA a transcript of the human dystrophin gene, is spliced to produce a 14 kb mature mRNA.
  • the base sequence of the human wild-type dystrophin gene is known (GenBank Accession No. NM_004006).
  • the nucleotide sequence of exon 53 of the human wild type dystrophin gene is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the oligomer of the present invention was prepared for the purpose of modifying a protein encoded by the DMD dystrophin gene into a BMD dystrophin protein by skipping exon 53 of the human dystrophin gene. Therefore, exon 53 of the dystrophin gene to be subjected to exon skipping of the oligomer of the present invention includes not only the wild type but also the mutant type.
  • the exon 53 of the mutant human dystrophin gene is specifically a polynucleotide described in (a) or (b) below.
  • A a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1;
  • B a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 90% or more identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • polynucleotide means DNA or RNA.
  • the “polynucleotide hybridizing under stringent conditions” means, for example, a colony high using, as a probe, all or part of a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the “complementary base sequence” is not limited to a base sequence that forms a Watson-Crick pair with the target base sequence, but a base that forms a wobble base pair. Includes sequences.
  • the Watson-Crick pair means a base pair in which a hydrogen bond is formed between adenine-thymine, adenine-uracil and guanine-cytosine
  • the fluctuation base pair means guanine-uracil, inosine-uracil, inosine.
  • the “complementary base sequence” may not have 100% complementarity with the target base sequence.
  • stringent conditions may be any of low stringent conditions, medium stringent conditions, and high stringent conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C.
  • Medium stringent conditions include, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C. or 5 ⁇ SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7. 5) The conditions are 50% formamide and 42 ° C.
  • “High stringent conditions” are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. or 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C. is there. Under these conditions, it can be expected that a polynucleotide having high identity can be efficiently obtained as the temperature is increased.
  • factors affecting the stringency of hybridization include multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration, and those skilled in the art can select these factors as appropriate. By doing so, it is possible to achieve the same stringency.
  • Alkphos Direct Labeling and Detection System (GE Healthcare) can be used, for example.
  • incubation with the labeled probe is performed overnight, and then the membrane is washed with a primary washing buffer containing 0.1% (w / v) SDS at 55 ° C. After washing, the hybridized polynucleotide can be detected.
  • a probe based on all or part of the base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1 using a commercially available reagent (for example, PCR labeling mix (Roche Diagnostics) etc.)
  • a commercially available reagent for example, PCR labeling mix (Roche Diagnostics) etc.
  • DIG digoxigenin
  • hybridization can be detected using a DIG nucleic acid detection kit (Roche Diagnostics).
  • polynucleotide other than the hybridizable polynucleotide 90% or more, 91% or more of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1, when calculated using the default parameters by BLAST, which is homology search software, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, A polynucleotide having 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more can be mentioned.
  • the identity of the base sequence is the algorithm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872624-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 93: 5873) by Carlin and Arthur. Can be determined.
  • Programs called BLASTN and BLASTX based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990).
  • the default parameters of each program are used.
  • the oligomer of the present invention is preferably 32 to 56, 33 to 56, 34 to 56, 35 to 56, or 36 to 36 from the 5 'end of the 53rd exon of the human dystrophin gene. It consists of a base sequence complementary to any one of the sequences consisting of the 56th nucleotide (for example, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, or SEQ ID NO: 35).
  • the oligomer of the present invention is a base sequence complementary to any one of the sequences consisting of nucleotides 32 to 56 or 36 to 56 from the 5 ′ end of the 53rd exon of the human dystrophin gene.
  • “Enabling the skipping of the 53rd exon of the human dystrophin gene” means that the oligomer of the present invention binds to a site corresponding to exon 53 of a transcript of the human dystrophin gene (eg, pre-mRNA).
  • a transcript of the human dystrophin gene eg, pre-mRNA.
  • the transcript is spliced, for example, in the case of a DMD patient in which exon 52 is deleted, the base corresponding to the 5 ′ end of exon 54 is located on the 3 ′ side of the base sequence corresponding to the 3 ′ end of exon 51. It means that a mature mRNA is formed in which the sequences are linked and no codon frameshift occurs.
  • the oligomer of the present invention may not have a base sequence that is 100% complementary to the target sequence as long as exon 53 of the human dystrophin gene can be skipped.
  • the oligomer of the present invention may contain 1 to 3, 1 to 2, or 1 non-complementary base with respect to the target sequence.
  • the “binding” means that when the oligomer of the present invention and the transcript of the human dystrophin gene are mixed, they hybridize to form a double strand under physiological conditions.
  • the “physiological condition” means a condition adjusted to a pH, salt composition, and temperature similar to those in a living body.
  • the conditions include 25 to 40 ° C., preferably 37 ° C., pH 5 to 8, preferably pH 7.4, and a sodium chloride concentration of 150 mM.
  • Whether or not the exon 53 of the human dystrophin gene skipped occurred was determined by introducing the oligomer of the present invention into a dystrophin-expressing cell (for example, human rhabdomyosarcoma cell), and from the total RNA of the dystrophin-expressing cell, It can be confirmed by performing RT-PCR amplification on the peripheral region of exon 53 of mRNA and performing nested PCR or sequence analysis on the PCR amplification product. The skipping efficiency was determined by recovering mRNA of the human dystrophin gene from the test cells.
  • a dystrophin-expressing cell for example, human rhabdomyosarcoma cell
  • the oligomer of the present invention include oligonucleotides, morpholino oligomers, and peptide nucleic acid (Peptide Nucleic Acid: PNA) oligomers having a length of 18 to 28 bases. A length of 21 to 25 bases is preferred, and a morpholino oligomer is preferred.
  • oligonucleotide of the present invention is an oligomer of the present invention having nucleotide as a structural unit, and such nucleotide may be any of ribonucleotide, deoxyribonucleotide, or modified nucleotide.
  • Modified nucleotides are those in which all or part of the nucleobase, sugar moiety, and phosphate binding moiety constituting ribonucleotide or deoxyribonucleotide are modified.
  • the nucleobase include adenine, guanine, hypoxanthine, cytosine, thymine, uracil, and modified bases thereof.
  • modified base examples include pseudouracil, 3-methyluracil, dihydrouracil, 5-alkylcytosine (eg, 5-methylcytosine), 5-alkyluracil (eg, 5-ethyluracil), 5-halouracil (5 -Bromouracil), 6-azapyrimidine, 6-alkylpyrimidine (6-methyluracil), 2-thiouracil, 4-thiouracil, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uracil, 5'-carboxymethylaminomethyl 2-thiouracil, 5-carboxymethylaminomethyluracil, 1-methyladenine, 1-methylhypoxanthine, 2,2-dimethylguanine, 3-methylcytosine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, N6-methyladenine 7-Methylguani 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, 5-methylaminomethyluracil, 5-methylcarbonylmethyluracil, 5-methyloxyurac
  • modification of the sugar moiety examples include modification of the 2 'position of ribose and modification of other parts of the sugar.
  • modification of the 2'-position of ribose examples include, for example, the -OH group at the 2'-position of ribose is OR, R, R'OR, SH, SR, NH 2 , NMR, NR 2 , N 3 , CN, F, Cl, Br, and I can be substituted.
  • R represents alkyl or aryl.
  • Examples of the modification of the other part of the sugar include, for example, those in which O at the 4′-position of ribose or deoxyribose is replaced with S, and those in which the 2′-position and 4′-position of the sugar are cross-linked, such as LNA (Locked Nucleic Acid ) Or ENA (2′-O, 4′-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids), but is not limited thereto.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • ENA (2′-O, 4′-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids
  • Examples of the modification of the phosphate binding moiety include a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond, an alkyl phosphonate bond, a phosphoramidate bond, a boranophosphate bond (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008). , 18, 9154-9160) (see, for example, Patent Reissue Publication Nos. 2006/129594 and 2006/038608).
  • As the alkyl linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms is preferable.
  • cycloalkyl is preferably a cycloalkyl having 5 to 12 carbon atoms.
  • Alkoxy includes linear or branched alkoxy having 1 to 6 carbon atoms, such as methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, n- Examples include pentyloxy, isopentyloxy, n-hexyloxy, isohexyloxy and the like.
  • alkoxy having 1 to 3 carbon atoms is preferable.
  • aryl aryl having 6 to 10 carbon atoms is preferable. Specific examples include phenyl, ⁇ -naphthyl, and ⁇ -naphthyl. Particularly preferred is phenyl.
  • the aryl may be substituted, and examples of the substituent include alkyl, halogen, alkoxy, cyano, and nitro, and 1 to 3 of these may be substituted.
  • the alkylene is preferably a linear or branched alkylene having 1 to 6 carbon atoms.
  • acyl examples include linear or branched alkanoyl or aroyl.
  • alkanoyl examples include formyl, acetyl, 2-methylacetyl, 2,2-dimethylacetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, pentanoyl, 2,2-dimethylpropionyl, hexanoyl and the like.
  • aroyl examples include benzoyl, toluoyl, and naphthoyl.
  • the oligonucleotide of the present invention preferably has a group represented by the following general formula, wherein the —OH group at the 2′-position of ribose is substituted with methoxy, and the phosphate bond portion is a phosphorothioate bond. Oligomer. (In the formula, Base represents a nucleobase.)
  • the oligonucleotide of the present invention can be easily synthesized using various automatic synthesizers (for example, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)), or a third-party organization (for example, Promega or It can also be manufactured by consigning to Takara).
  • the morpholino oligomer of the present invention is an oligomer of the present invention having a group represented by the following general formula as a structural unit.
  • Base is as defined above; W represents a group represented by any of the following formulas.
  • X is —CH 2 R 1 , -O-CH 2 R 1 , -S-CH 2 R 1 , -NR 2 R 3 Or represents F;
  • R 2 And R 3 Are the same or different and each represents H, alkyl, cycloalkyl, or aryl;
  • Z represents O or S.
  • the morpholino oligomer is preferably an oligomer (a phosphorodiamidate morpholino oligomer (hereinafter referred to as “PMO”)) having a group represented by the following formula as a structural unit. (In the formula, Base, R 2 , R 3 Is as defined above. )
  • PMO phosphorodiamidate morpholino oligomer
  • the morpholino oligomer can be produced according to, for example, International Publication No. 1991/009033 or International Publication No. 2009/064471.
  • PMO can be produced according to the method described in International Publication No. 2009/064471, or can be produced according to the method described below.
  • PMO manufacturing method As one embodiment of PMO, for example, a compound represented by the following general formula (I) (hereinafter referred to as PMO (I)) can be mentioned. [Where each Base, R 2 , R 3 Is as defined above; N is an arbitrary integer in the range of 1 to 99, preferably an arbitrary integer in the range of 18 to 28. ] PMO (I) can be produced according to a known method, but can be produced, for example, by carrying out the following steps. The compounds and reagents used in the following steps are not particularly limited as long as they are generally used in the production of PMO.
  • n, R 2 , R 3 Is as defined above; Each B P Independently represents an optionally protected nucleobase; T represents a trityl group, a monomethoxytrityl group, or a dimethoxytrityl group; L represents hydrogen, acyl, or a group represented by the following general formula (IV) (hereinafter referred to as group (IV)). ]
  • B P Examples of the “nucleobase” include the same “nucleobase” as Base. However, B P The amino group or hydroxyl group of the nucleobase according to the above may be protected. The amino-protecting group is not particularly limited as long as it is used as a protecting group for nucleic acids.
  • the hydroxyl-protecting group include 2-cyanoethyl, 4-nitrophenethyl, phenylsulfonylethyl, methylsulfonylethyl, trimethylsilylethyl, substituted with 1 to 5 electron-withdrawing groups at any substitutable position.
  • the “solid phase carrier” is not particularly limited as long as it is a carrier that can be used for a solid phase reaction of nucleic acid.
  • a reagent that can be used for synthesis of a morpholino nucleic acid derivative for example, dichloromethane, acetonitrile, tetrazole, N-methylimidazole, pyridine, acetic anhydride, lutidine, trifluoroacetic acid
  • chemically stable to reagents that can be used to synthesize morpholino nucleic acid derivatives for example, dichloromethane, acetonitrile, tetrazole, N-methylimidazole, pyridine, acetic anhydride, lutidine, trifluoroacetic acid
  • chemical modification (Iv) can be loaded with the desired morpholino nucleic acid derivative, (v) has sufficient strength to withstand the high pressures during processing, and (vi) has a certain particle size range and distribution.
  • swellable polystyrene for example, aminomethylpolystyrene resin, 1% dibenzylbenzene crosslinked (200 to 400 mesh) (2.4 to 3.0 mmol / g) (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), Aminomethylated Polystyrene Resin ⁇ HCl [Dibenzylbenzene 1%, 100-200 mesh] (Peptide Laboratories)), non-swellable polystyrene (for example, Primer Support (GE, Healthcare)), PEG chain-bonded polystyrene (for example, NH 2 -PEG resin (manufactured by Watanabe Chemical), TentaGel resin, controlled pore glass (CPG) (for example, manufactured by CPG), oxalylated-constant glass (for example, Allul et al., Nucleic Acids Research, Vol.
  • CPG controlled pore glass
  • oxalylated-constant glass for
  • Examples of the “acid” that can be used in this step include trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid, and trichloroacetic acid.
  • the amount of the acid used is, for example, suitably in the range of 0.1 molar equivalent to 1000 molar equivalents, and preferably in the range of 1 molar equivalent to 100 molar equivalents, relative to 1 mole of compound (II).
  • an organic amine can be used together with the acid. Although it does not specifically limit as an organic amine, For example, a triethylamine can be mentioned.
  • the amount of the organic amine used is, for example, suitably in the range of 0.01 molar equivalent to 10 molar equivalents, and preferably in the range of 0.1 molar equivalents to 2 molar equivalents with respect to 1 mole of the acid. .
  • a salt or mixture of an acid and an organic amine in this step for example, a salt or mixture of trifluoroacetic acid and triethylamine can be mentioned, and more specifically, with respect to 2 equivalents of trifluoroacetic acid. What mixed 1 equivalent of triethylamine can be mentioned.
  • the acid that can be used in this step can be used by diluting with an appropriate solvent so that the concentration is in the range of 0.1% to 30%.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, alcohols (ethanol, isopropanol, trifluoroethanol, etc.), water, and mixtures thereof.
  • the reaction temperature in the above reaction is, for example, preferably within the range of 10 ° C. to 50 ° C., more preferably within the range of 20 ° C. to 40 ° C., and further preferably within the range of 25 ° C. to 35 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of acid used and the reaction temperature, but it is usually within the range of 0.1 minute to 24 hours. Preferably, it is within the range of 1 minute to 5 hours.
  • a base can be added as necessary to neutralize the acid present in the system.
  • the “base” is not particularly limited, and examples thereof include diisopropylamine.
  • the base can be used by diluting with a suitable solvent so that the concentration is within the range of 0.1% (v / v) to 30% (v / v).
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, alcohols (ethanol, isopropanol, trifluoroethanol, etc.), water, or a mixture thereof.
  • the reaction temperature is, for example, preferably in the range of 10 ° C.
  • reaction time varies depending on the type of base used and the reaction temperature, but is usually in the range of 0.1 minute to 24 hours, and preferably in the range of 1 minute to 5 hours.
  • the compound represented by the following general formula (IIa) (hereinafter referred to as compound (IIa)) is prepared by the following method. Can be manufactured according to. [Where B P , T, linker, and solid phase carrier are as defined above.
  • Step 1 The process of manufacturing the compound (henceforth a compound (VI)) represented by the following general formula (VI) by making an acylating agent act on the compound represented by the following general formula (V).
  • This step can be carried out by a known linker introduction reaction using compound (V) as a starting material.
  • the compound represented by the following general formula (VIa) can be produced by carrying out a method known as an esterification reaction using compound (V) and succinic anhydride.
  • B P , T are as defined above.
  • Step 2 A step of producing a compound (IIa) by reacting with a solid phase carrier by allowing a condensing agent or the like to act on the compound (VI).
  • This step can be produced by a method known as a condensation reaction using compound (VI) and a solid phase carrier.
  • n 2 to 99 and L is the group (IV)
  • the compound represented by the following general formula (IIa2) is obtained by using the compound (IIa) as a starting material, It can be manufactured by repeatedly performing Step A and Step B according to the method for producing PMO as described in the above.
  • the compound represented by the following general formula (IIb) is obtained by, for example, the method described in International Publication No. 1991/009033. Can be manufactured.
  • the compound represented by the following general formula (IIb2) is obtained by using the compound (IIb) as a starting material. It can be manufactured by repeatedly performing Step A and Step B according to the PMO manufacturing method a desired number of times.
  • Process B A step of producing a compound represented by the following general formula (VII) (hereinafter referred to as compound (VII)) by allowing a morpholino monomer compound to act on compound (III) in the presence of a base.
  • VII general formula
  • This step can be carried out by reacting compound (III) with a morpholino monomer compound in the presence of a base.
  • Examples of the morpholino monomer compound include a compound represented by the following general formula (VIII).
  • Examples of the “base” that can be used in this step include diisopropylamine, triethylamine, and N-ethylmorpholine.
  • the amount of the base used is, for example, suitably in the range of 1 molar equivalent to 1000 molar equivalents, preferably in the range of 10 molar equivalents to 100 molar equivalents, relative to 1 mole of compound (III).
  • the morpholino monomer compound and base that can be used in this step can be diluted with an appropriate solvent so as to have a concentration of 0.1% to 30%.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include N, N-dimethylimidazolidone, N-methylpiperidone, DMF, dichloromethane, acetonitrile, terahydrofuran, and mixtures thereof.
  • the reaction temperature is preferably in the range of 0 ° C. to 100 ° C., for example, and more preferably in the range of 10 ° C. to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of base used and the reaction temperature, but is usually within the range of 1 minute to 48 hours, and preferably within the range of 30 minutes to 24 hours. Further, after the completion of this step, an acylating agent can be added as necessary.
  • acylating agent examples include acetic anhydride, acetic chloride, and phenoxyacetic anhydride.
  • the acylating agent can be used by diluting with an appropriate solvent so that the concentration is within a range of 0.1% to 30%, for example.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, alcohols (ethanol, isopropanol, trifluoroethanol, etc.), water, and mixtures thereof.
  • a base such as pyridine, lutidine, collidine, triethylamine, diisopropylethylamine, N-ethylmorpholine can be used together with an acylating agent.
  • the amount of the acylating agent used is preferably in the range of 0.1 molar equivalent to 10,000 molar equivalents, and more preferably in the range of 1 molar equivalent to 1000 molar equivalents.
  • the amount of the base used is, for example, suitably in the range of 0.1 molar equivalent to 100 molar equivalents, preferably in the range of 1 molar equivalent to 10 molar equivalents per mole of acylating agent.
  • the reaction temperature of this reaction is preferably within the range of 10 ° C to 50 ° C, more preferably within the range of 10 ° C to 50 ° C, more preferably within the range of 20 ° C to 40 ° C, and even more preferably. Is in the range of 25 ° C to 35 ° C.
  • Process C A step of producing a compound represented by the general formula (IX) by removing a protecting group using a deprotecting agent in the compound (VII) produced in the step B.
  • This step can be carried out by allowing a deprotecting agent to act on compound (VII).
  • Examples of the “deprotecting agent” include concentrated aqueous ammonia and methylamine.
  • the “deprotecting agent” that can be used in this step is, for example, diluted with water, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, acetonitrile, tetrahydrofuran, DMF, N, N-dimethylimidazolidone, N-methylpiperidone, or a mixed solvent thereof. It can also be used. Of these, ethanol is preferred.
  • the amount of the deprotecting agent to be used is, for example, suitably in the range of 1 molar equivalent to 100,000 molar equivalents, preferably in the range of 10 molar equivalents to 1000 molar equivalents, relative to 1 mole of compound (VII). It is.
  • the reaction temperature is, for example, suitably in the range of 15 ° C.
  • Process D Process of manufacturing PMO (I) by making an acid act on the compound (IX) manufactured in the process C. [In the formula, Base, n, R 2 , R 3 , T are as defined above. ] This step can be carried out by adding an acid to compound (IX).
  • Examples of the “acid” that can be used in this step include trichloroacetic acid, dichloroacetic acid, acetic acid, phosphoric acid, and hydrochloric acid.
  • the amount of the acid used is, for example, suitably so that the pH of the solution is in the range of 0.1 to 4.0, more preferably in the range of 1.0 to 3.0.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include acetonitrile, water, and mixed solvents thereof.
  • the reaction temperature is preferably in the range of 10 ° C to 50 ° C, more preferably in the range of 20 ° C to 40 ° C, and still more preferably in the range of 25 ° C to 35 ° C.
  • the deprotection reaction time varies depending on the type of compound (IX), reaction temperature, etc., but is suitably in the range of 0.1 minute to 5 hours, preferably in the range of 1 minute to 1 hour, more preferably. Is in the range of 1 to 30 minutes.
  • PMO (I) is a conventional separation and purification means from the reaction mixture obtained in this step, such as extraction, concentration, neutralization, filtration, centrifugation, recrystallization, C 8 To C 18 Obtained by using reverse phase column chromatography, cation exchange column chromatography, anion exchange column chromatography, gel filtration column chromatography, high performance liquid chromatography, dialysis, ultrafiltration or the like alone or in combination.
  • the desired PMO (I) can be isolated and purified (see, for example, International Publication No. WO1991 / 09033).
  • a mixed solution of 20 mM triethylamine / acetic acid buffer and acetonitrile can be used as an elution solvent.
  • a mixed solution of 1 M saline and 10 mM sodium hydroxide aqueous solution can be used.
  • the peptide nucleic acid is an oligomer of the present invention having a group represented by the following general formula as a structural unit.
  • Peptide nucleic acid can be produced, for example, according to the following literature. 1) P.I. E. Nielsen, M.M. Egholm, R.A. H. Berg, O .; Buchardt, Science, 254, 1497 (1991) 2) M.M. Egholm, O .; Buchardt, P.M. E. Nielsen, R.A. H. Berg, Jacs. , 114, 1895 (1992) 3) K.K. L. Dueholm, M.M. Egholm, C.I. Behrens, L.M. Christensen, H.C. F. Hansen, T .; Vulpius, K.M. H.
  • the 5 ′ end may be any group represented by the following chemical formulas (1) to (3).
  • (3) -OH is preferred.
  • the groups represented by the above (1), (2) and (3) are referred to as “group (1)”, “group (2)” and “group (3)”, respectively.
  • Pharmaceutical composition The oligomer of the present invention enables exon 53 to be skipped with high efficiency as compared with the antisense oligomer according to the prior art.
  • the symptoms of muscular dystrophy can be alleviated with high efficiency by administering a pharmaceutical composition containing the oligomer of the present invention to a DMD patient.
  • a pharmaceutical composition for treating muscular dystrophy hereinafter referred to as “the composition of the present invention” comprising the oligomer of the present invention, a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof as an active ingredient.
  • Examples of the pharmaceutically acceptable salt of the oligomer of the present invention contained in the composition of the present invention include alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt and lithium salt, alkaline earth such as calcium salt and magnesium salt.
  • the oligomer of the present invention contained in the composition of the present invention may be in the form of its hydrate.
  • the dosage form of the composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable dosage form, and can be selected depending on the treatment method. From the viewpoint of ease of delivery to muscle tissue, intravenous administration is possible. Internal administration, intraarterial administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, oral administration, intratissue administration, transdermal administration and the like are preferred.
  • the dosage form that the composition of the present invention can take is not particularly limited, and examples thereof include various injections, oral preparations, instillations, inhalants, ointments, lotions and the like.
  • the composition of the present invention preferably contains a carrier that facilitates delivery of the oligomer to muscle tissue.
  • a carrier is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include cationic carriers such as cationic liposomes and cationic polymers, and carriers utilizing a viral envelope.
  • cationic liposomes include liposomes formed with 2-O- (2-diethylaminoethyl) carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol and phospholipid as essential components (hereinafter, “liposome A”).
  • Oligofectamine (registered trademark) (manufactured by Invitrogen), Lipofectin (registered trademark) (manufactured by Invitrogen), Lipofectamine (registered trademark) (manufactured by Invitrogen), Lipofectamine 2000 (registered trademark) (manufactured by Invitrogen) DMRIE-C (registered trademark) (manufactured by Invitrogen), GeneSilencer (registered trademark) (manufactured by Gene Therapy Systems), TransMessenger (registered trademark) (manufactured by QIAGEN) TransIT TKO (registered trademark) (manufactured by Mirus, Inc.), can be mentioned Nucleofector II (Lonza).
  • liposome A is preferable.
  • the cationic polymer include JetSI (registered trademark) (manufactured by Qbiogene) and Jet-PEI (registered trademark) (polyethyleneimine, manufactured by Qbiogene).
  • the carrier using the virus envelope include GenomeOne (registered trademark) (HVJ-E liposome, manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.).
  • a pharmaceutical device described in Japanese Patent No. 2924179, and a cationic carrier described in Japanese Patent Publication No. 2006/129594 and Japanese Patent Publication No. 2008/096690 can be used.
  • the concentration of the oligomer of the present invention contained in the composition of the present invention varies depending on the type of carrier and the like, but is suitably in the range of 0.1 nM to 100 ⁇ M, preferably in the range of 1 nM to 10 ⁇ M, and in the range of 10 nM to 1 ⁇ M. Within the range is more preferable.
  • the weight ratio of the oligomer of the present invention to the carrier contained in the composition of the present invention (carrier / oligomer of the present invention) varies depending on the properties of the oligomer and the type of the carrier, but is 0.1 to 100. The range is suitable, preferably in the range of 1-50, more preferably in the range of 10-20.
  • a pharmaceutically acceptable additive can be optionally added to the composition of the present invention.
  • additives include emulsification aids (for example, fatty acids having 6 to 22 carbon atoms and pharmaceutically acceptable salts thereof, albumin, dextran), stabilizers (for example, cholesterol, phosphatidic acid), and isotonicity.
  • Agents for example, sodium chloride, glucose, maltose, lactose, sucrose, trehalose
  • pH adjusters for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethanolamine.
  • hydrochloric acid sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethanolamine.
  • the content of the additive in the composition of the present invention is suitably 90% by weight or less, preferably 70% by weight or less, and more preferably 50% by weight or less.
  • the composition of the present invention can be prepared by adding the oligomer of the present invention to a carrier dispersion and stirring appropriately.
  • the additive can be added in an appropriate step before or after the addition of the oligomer of the present invention.
  • the aqueous solvent that can be used when the oligomer of the present invention is added is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include electrolyte solutions such as water for injection, distilled water for injection, and physiological saline, and glucose. Examples thereof include sugar liquids such as liquid and maltose liquid.
  • the composition of the present invention can be, for example, a solution or a lyophilized preparation thereof.
  • the lyophilized preparation can be prepared by lyophilizing the composition of the present invention having a liquid form according to a conventional method. For example, after appropriately sterilizing the composition of the present invention in the form of a liquid agent, a predetermined amount is dispensed into a vial and pre-freezing for about 2 hours at about ⁇ 40 to ⁇ 20 ° C. And primary drying under reduced pressure at about 0-10 ° C., followed by secondary drying under reduced pressure at about 15-25 ° C. and lyophilization.
  • the inside of the vial is replaced with nitrogen gas and stoppered to obtain a lyophilized preparation of the composition of the present invention.
  • the freeze-dried preparation of the composition of the present invention can be used by re-dissolving generally by adding any appropriate solution (re-dissolving solution). Examples of such redissolved solution include water for injection, physiological saline, and other general infusion solutions.
  • re-dissolving solution examples include water for injection, physiological saline, and other general infusion solutions.
  • the amount of the redissolved solution varies depending on the use and the like and is not particularly limited. However, an amount of 0.5 to 2 times the amount of the solution before lyophilization or 500 mL or less is appropriate.
  • the dose for administration of the composition of the present invention is determined in consideration of the type of oligomer of the present invention, dosage form, patient condition such as age and weight, administration route, nature and degree of disease.
  • the amount of the oligomer of the present invention for adults is generally within the range of 0.1 mg to 10 g / human, preferably within the range of 1 mg to 1 g / human. This value may vary depending on the type of target disease, dosage form, and target molecule. Therefore, in some cases, a lower dose may be sufficient, and conversely, a higher dose may be required.
  • it can be administered once to several times a day or at intervals of 1 day to several days.
  • composition of the present invention there can be mentioned a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a vector capable of expressing the oligonucleotide of the present invention and the above-mentioned carrier.
  • Such an expression vector may be capable of expressing a plurality of the oligonucleotides of the present invention.
  • a pharmaceutically acceptable additive can be added to the composition.
  • concentration of the expression vector contained in the composition varies depending on the type of carrier and the like, but is suitably in the range of 0.1 nM to 100 ⁇ M, preferably in the range of 1 nM to 10 ⁇ M, and in the range of 10 nM to 1 ⁇ M. More preferred.
  • the weight ratio (carrier / expression vector) between the expression vector and the carrier contained in the composition varies depending on the nature of the expression vector, the type of the carrier, etc., but is suitably within the range of 0.1 to 100. It is preferably in the range of ⁇ 50, more preferably in the range of 10-20. Further, the content of the carrier contained in the composition is the same as that of the composition of the present invention containing the oligomer of the present invention, and the preparation method thereof is the same as that of the composition of the present invention. It is.
  • the present invention will be described in more detail with reference to examples and test examples, but the present invention is not limited to the scope shown in the examples.
  • Step 2 4- ⁇ [(2S, 6R) -6- (4-Benzamido-2-oxopyrimidin-1-yl) -4-tritylmorpholin-2-yl] methoxy ⁇ -supported on aminomethylpolystyrene resin
  • 4-oxobutanoic acid 4- ⁇ [(2S, 6R) -6- (4-benzamido-2-oxopyrimidin-1 (2H) -yl) -4-tritylmorpholin-2-yl] methoxy ⁇ -4-oxobutanoic acid 23.5 g It melt
  • the resin was collected by filtration, washed with pyridine, methanol and dichloromethane in this order, and dried under reduced pressure to obtain 33.7 g of the desired product.
  • the loading amount of the target product was determined by measuring the UV absorbance at 409 nm of the molar amount of trityl per gram of resin using a known method. The resin loading was 397.4 ⁇ mol / g.
  • Step 2 N- ⁇ 9-[(2R, 6S) -6- (hydroxymethyl) -4-morpholin-2-yl] -6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-2-yl ⁇ - 2-phenoxyacetamide p-toluenesulfonate
  • 30 g of the compound obtained in Step 1 was suspended in 480 mL of methanol, and 130 mL of 2N hydrochloric acid was added under ice cooling. Subsequently, 56.8 g of ammonium tetraborate tetrahydrate and 16.2 g of sodium periodate were added in this order, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours.
  • the reaction solution was ice-cooled, insoluble matter was removed by filtration, and this was washed with 100 mL of methanol. The filtrate and the washing solution were combined and ice-cooled. After adding 11.52 g of 2-picoline borane and stirring for 20 minutes, 54.6 g of p-toluenesulfonic acid monohydrate was slowly added and stirred overnight at 4 ° C. . The precipitate was collected by filtration, washed with 500 mL of cold methanol, and dried to obtain 17.7 g of the target compound (yield: 43.3%).
  • Step 4 4-oxo-4- ⁇ [(2S, 6R) -6- (6-oxo-2- [2-phenoxyacetamide] -1H-purin-9-yl supported on aminomethylpolystyrene resin ) -4-Tritylmorpholin-2-yl] methoxy ⁇ butanoic acid
  • the title compound was produced in the same manner as in Reference Example 1.
  • N- ⁇ 9-[(2R, 6S) -6- (hydroxymethyl) -4-tritylmorpholin-2-yl] -6-oxo-6,9 -Dihydro-1H-purin-2-yl ⁇ -2-phenoxyacetamide was used.
  • 1-[(2R, 6S) -6- (hydroxymethyl) -4-tritylmorpholin-2-yl] -5-methylpyrimidine-2,4 (1H , 3H) -dione was used.
  • 2- [2- (2-hydroxyethoxy) ethoxy] ethyl 4-tritylpiperazine-1-carboxylic acid (a compound described in International Publication No. 2009/064471) )It was used.
  • PMO No. 12 was purchased from Gene Tools.
  • PMO No. 8 4- ⁇ [(2S, 6R) -6- (4-benzamido-2-oxopyrimidin-1 (2H) -yl) -4-tritylmorpholin-2-yl] methoxy ⁇ -supported on aminomethylpolystyrene resin 2 g (800 ⁇ mol) of 4-oxobutanoic acid (Reference Example 1) was transferred to a reaction vessel, 30 mL of dichloromethane was added, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes.
  • the neutralizing solution a solution obtained by dissolving N, N-diisopropylethylamine in a dichloromethane solution containing 25% (v / v) 2-propanol so as to be 5% (v / v) was used.
  • the coupling solution A the morpholino monomer compound was dissolved in 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone containing 10% (v / v) N, N-diisopropylethylamine so as to be 0.15 M. A thing was used.
  • N, N-diisopropylethylamine dissolved in 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone so as to be 10% (v / v) was used.
  • a capping solution 20% (v / v) acetic anhydride and 30% (v / v) 2,6-lutidine dissolved in dichloromethane were used.
  • the aminomethylpolystyrene resin carrying PMO synthesized above was collected from the reaction vessel and dried under reduced pressure at room temperature for 2 hours or more.
  • PMO supported on the dried aminomethylpolystyrene resin was placed in a reaction vessel, and 200 mL of 28% aqueous ammonia-ethanol (1/4) was added, followed by stirring at 55 ° C. for 15 hours.
  • the aminomethyl polystyrene resin was filtered off and washed with 50 mL of water-ethanol (1/4).
  • the obtained filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • the obtained residue was dissolved in 100 mL of a mixed solvent (4/1) of 20 mM acetic acid-triethylamine buffer (TEAA buffer) and acetonitrile, and filtered through a membrane filter.
  • the resulting filtrate was purified by reverse phase HPLC.
  • the conditions used are as follows.
  • each fraction was analyzed, and the target product was recovered with 100 mL of acetonitrile-water (1/1), 200 mL of ethanol was added, and the mixture was concentrated under reduced pressure. Furthermore, it dried under reduced pressure and obtained white solid. 300 mL of a 10 mM phosphoric acid aqueous solution was added to the obtained solid and suspended. 10 mL of 2M phosphoric acid aqueous solution was added and stirred for 15 minutes. Furthermore, 15 mL of 2M sodium hydroxide aqueous solution was added and neutralized. Furthermore, 15 mL of 2M sodium hydroxide aqueous solution was added to make it alkaline, and the mixture was filtered with a membrane filter (0.45 ⁇ m).
  • the target product was obtained as an aqueous solution by washing with 100 mL of 10 mM sodium hydroxide aqueous solution.
  • the obtained aqueous solution containing the target product was purified with an anion exchange resin column.
  • the conditions used are as follows. Each fraction was analyzed (HPLC) to obtain the target product as an aqueous solution.
  • the resulting aqueous solution was neutralized by adding 225 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0). It filtered with the membrane filter (0.45 micrometer). Subsequently, it desalted by performing ultrafiltration under the following conditions.
  • the filtrate was concentrated to obtain about 250 mL of an aqueous solution.
  • the obtained aqueous solution was filtered with a membrane filter (0.45 ⁇ m).
  • Example 5 The title compound was produced in the same manner as in Example 1. However, 4-((((2S, 6R) -6- (5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1 (2H) -yl) supported on aminomethylpolystyrene resin as a starting material ) -4-Tritylmorpholin-2-yl) methoxy) -4-oxobutanoic acid (Reference Example 3) was used.
  • ESI-TOF-MS calculated value: 8270.94 Measured value: 8270.20 [Example 7] PMO. No. 6
  • the title compound was produced in the same manner as in Example 1.
  • the concentration of the extracted total RNA was measured using NanoDrop ND-1000 (manufactured by LMS).
  • One-Step RT-PCR was performed on 400 ng of the extracted total RNA using a Titan One Tube RT-PCR Kit (Roche).
  • a reaction solution was prepared according to the protocol attached to the kit.
  • PTC-100 manufactured by MJ Research
  • the RT-PCR program used is as follows.
  • the base sequences of the forward primer and the reverse primer used in the nested PCR are as follows. 1 ⁇ l of the above-mentioned nested PCR reaction product was analyzed using Bioanalyzer (manufactured by Agilent). The amount of polynucleotide “A” in the band skipped by exon 53 and the amount of polynucleotide “B” in the band not skipped by exon 53 were measured.
  • Skipping efficiency (%) A / (A + B) x 100
  • PMO No. All of the oligomers of the present invention having 1 to 8 are PMO No. It was found that exon 53 was skipped with significantly higher efficiency compared to 11 antisense oligomers.
  • PMO No. The oligomers of the present invention of 3 and 8 are PMO No. Exon skipping efficiency is 4 times higher than 11 antisense oligomers.
  • DMEM F-12 Nutrient Mixture F-12
  • DMEM F-12 fetal calf serum
  • P / S Penicillin / Streptomycin
  • Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (DMEM F-12) (Invitrogen) did. After 24 hours, the medium was replaced with differentiation medium (DMEM / F-12 containing 2% horse serum (Invitrogen), 1% P / S, and ITS Liquid Media Supplement (Sigma)). The medium was changed every 2 or 3 days and incubated for 12 to 14 days to differentiate into myotube cells.
  • the oligomers of the present invention of 3 and 8 are PMO No. Exon skipping efficiency is more than twice as high as that of 12 antisense oligomers (FIG. 2).
  • PMO No. 3 and 8 to 10 oligomers of the present invention are both available in PMO No. 5 in 5017 cells. It was found that exon 53 was skipped with high efficiency compared to 12 antisense oligomers (FIG. 3).
  • PMO No. The oligomers of the present invention of 3 and 8 are PMO No. Exon skipping efficiency is more than 7 times higher than that of 12 antisense oligomers (FIG. 3).
  • DMEM / F-12 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F-12) (Invitrogen) did. After 24 hours, the medium was replaced with a differentiation medium (DMEM / F-12 containing 2% horse serum (Invitrogen), 1% P / S and ITS Liquid Media Supplement (Sigma)). The medium was changed every two or three days and incubated for 12, 14 or 20 days to differentiate into myotube cells.
  • P / S Penicillin / Streptomycin
  • the oligomers of the present invention of Nos. 3 and 8 are PMO no. It was found that exon 53 was skipped with high efficiency compared to 15 antisense oligomers (FIG. 4).
  • Electrophoresis was performed with NuPAGE Novex Tris-Acetate Gel 3-8% (manufactured by Invitrogen) at 150V for 75 minutes, and transferred to a PVDF membrane (manufactured by Millipore) with a semi-drive lotter. After blocking the PVDF membrane with 5% ECL Blocking Agent (GE Healthcare), the membrane was incubated in an anti-dystrophin antibody (NCL-Dys1, Novokastra) solution. Further, after incubation in a solution of peroxidase-conjugated goat-antimouse IgG (model number, Bio-Rad), color was developed by ECL Plus Western blotting system (manufactured by GE Healthcare). Immunostaining PMO No.
  • oligomers of the present invention were added to the cells, and the cells after 72 hours were fixed in 3% paraformaldehyde for 10 minutes. Incubated with 10% Triton-X for 10 minutes. Blocking with PBS containing 10% goat serum, the membrane was incubated in an anti-dystrophin antibody (NCL-Dys1, Novocastra) solution, and further incubated in an anti-mouse IgG antibody (Invitrogen) solution. Mounted with Pro Long Gold Antifade Reagent (manufactured by Invitrogen) and observed with a fluorescence microscope. Experimental result The results are shown in FIG. 6 and FIG. From this experiment, PMO No. It was confirmed by Western blotting (FIG.
  • RD cells human rhabdomyosarcoma cell line 3 ⁇ 10 5
  • the seeds were seeded in a 6-well plate, Eagle's minimal essential medium (EMEM) medium containing 10% fetal calf serum (FCS) (manufactured by Invitrogen), 2 mL of 37 ° C., 5% in Sigma CO 2 Cultured overnight under conditions.
  • EMEM Eagle's minimal essential medium
  • FCS fetal calf serum
  • FCS fetal calf serum
  • FCS fetal calf serum
  • Various antisense oligomers for exon 53 skipping manufactured by Nippon Bioservice Co., Ltd.
  • Lipofectamine 2000 manufactured by Invitrogen
  • One-Step RT-PCR was performed on 400 ng of the extracted total RNA using a Titan One Tube RT-PCR Kit (Roche). A reaction solution was prepared according to the protocol attached to the kit.
  • the thermal cycler PTC-100 (manufactured by MJ Research) was used.
  • the RT-PCR program used is as follows. 50 ° C, 30 minutes: Reverse transcription reaction 94 ° C, 2 minutes: heat denaturation [94 ° C, 10 seconds; 58 ° C, 30 seconds; 68 ° C, 45 seconds] x 30 cycles: PCR amplification 68 ° C, 7 minutes: Thermal inactivation of polymerase
  • the base sequences of forward primer and reverse primer used for RT-PCR are as follows. Next, nested PCR was performed on the amplification product of the RT-PCR using Taq DNA Polymerase (Roche). The PCR program used is as follows.
  • the base sequences of the forward primer and the reverse primer used in the nested PCR are as follows. 1 ⁇ l of the above-mentioned nested PCR reaction product was analyzed using Bioanalyzer (manufactured by Agilent). The amount of polynucleotide “A” in the band skipped by exon 53 and the amount of polynucleotide “B” in the band not skipped by exon 53 were measured.
  • RD cell human rhabdomyosarcoma cell line
  • 0.3 to 30 ⁇ M of an antisense oligomer was introduced by Nucleofector II (Lonza) using Amaxa Cell Line Nucleofactor Kit L.
  • the program used was T-030. After the introduction, the cells were placed in 2 mL of Eagle's minimal essential medium (EMEM) medium (manufactured by Sigma, the same below) containing 10% fetal calf serum (FCS) (manufactured by Invitrogen) at 37 ° C., 5% CO 2. 2 Cultured overnight under conditions. The cells were washed twice with PBS (manufactured by Nissui, the same applies hereinafter), and then 500 ⁇ l of ISOGEN (manufactured by Nippon Gene) was added to the cells and left at room temperature for several minutes to lyse the cells. It was collected. Total RNA was extracted according to the protocol attached to ISOGEN.
  • EMEM Eagle's minimal essential medium
  • FCS 10% fetal calf serum
  • ISOGEN manufactured by Nippon Gene
  • the concentration of the extracted total RA was measured using NanoDrop ND-1000 (manufactured by LMS).
  • One-Step RT-PCR was performed on 400 ng of the extracted total RNA using QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (manufactured by Qiagen).
  • a reaction solution was prepared according to the protocol attached to the kit.
  • PTC-100 manufactured by MJ Research
  • the RT-PCR program used is as follows.
  • the base sequences of forward primer and reverse primer used for RT-PCR are as follows. 1 ⁇ l of the PCR reaction product was analyzed using Bioanalyzer (manufactured by Agilent). The amount of polynucleotide “A” in the band skipped by exon 53 and the amount of polynucleotide “B” in the band not skipped by exon 53 were measured.
  • Skipping efficiency (%) A / (A + B) x 100
  • FIGS. PMO No. No. 8 of the present invention is PMO No. It was found that exon 53 was skipped with significantly higher efficiency compared to 15 and 16 antisense oligomers (FIG. 18). Also, PMO No. The oligomers of the present invention of 3 and 8 are PMO No. It was found that exon 53 was skipped with significantly higher efficiency than the 13 and 14 oligomers of the present invention (FIG. 19). This result shows that skipping efficiency is higher when the 5 ′ end is an —OH group even in the same sequence.
  • the oligomer of the present invention (PMO No. 1 to 10) is remarkably higher in any cellular environment than the oligomer (PMO No. 11, 12, 15 and 16) according to the prior art. It has been shown to skip exon 53 with high efficiency.
  • the 5017 cells used in Test Example 2 are cells collected from DMD patients, and the fibroblasts used in Test Examples 3 and 5 are exon 53 skipping target cells derived from DMD patients.
  • the oligomer of the present invention exhibits an exon 53 skipping efficiency of 90% or more in cells derived from DMD patients to be exon 53 skipped. Therefore, the oligomer of the present invention is actually used in DMD patients. It can be said that exon 53 can be skipped with high efficiency even when administered in the same manner. Therefore, the oligomer of the present invention is very useful in the treatment of DMD.
  • Sequence number 2 Synthetic nucleic acid Sequence number 3: Synthetic nucleic acid Sequence number 4: Synthetic nucleic acid Sequence number 5: Synthetic nucleic acid Sequence number 6: Synthetic nucleic acid Sequence number 7: Synthetic nucleic acid Sequence number 8: Synthetic nucleic acid Sequence number 9: Synthetic nucleic acid Sequence number 10: Synthetic nucleic acid Sequence number 11: Synthetic nucleic acid Sequence number 12: Synthetic nucleic acid Sequence number 13: Synthetic nucleic acid Sequence number 14: Synthetic nucleic acid Sequence number 15: Synthetic nucleic acid Sequence number 16: Synthetic nucleic acid Sequence number 17: Synthetic nucleic acid Sequence number 18: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 19: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 20: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 21: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 22: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 23: Synthetic nucleic acid SEQ ID
  • Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 33 Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 34: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 35: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 36: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 37: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 38: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 39: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 40 : Synthetic nucleic acid Sequence number 41: Synthetic nucleic acid Sequence number 42: Synthetic nucleic acid Sequence number 43: Synthetic nucleic acid Sequence number 45: Synthetic nucleic acid Sequence number 46: Synthetic nucleic acid Sequence number 47: Synthetic nucleic acid Sequence number 48: Synthetic nucleic acid Sequence number 49: Synthesis Nucleic acid SEQ ID NO: 50: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 51: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 52: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 53: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO
  • Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 59 Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 60: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 61: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 62 : Synthetic nucleic acid Sequence number 63: Synthetic nucleic acid Sequence number 64: Synthetic nucleic acid Sequence number 65: Synthetic nucleic acid Sequence number 66: Synthetic nucleic acid Sequence number 67: Synthetic nucleic acid Sequence number 68: Synthetic nucleic acid Sequence number 69: Synthetic nucleic acid Sequence number 70: Synthesis Nucleic acid SEQ ID NO: 71: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 72: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 73: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 74: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 75: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 76: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO: 77: Synthetic nucleic acid SEQ ID NO

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Abstract

　本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第53番目のエクソンを高効率にスキッピングさせる薬剤を提供することを目的とする。　本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第53番目のエクソンのスキッピングを可能にするオリゴマーを提供する。

Description

アンチセンス核酸
　本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマー及び該オリゴマーを含む医薬組成物に関する。
　デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は出生男子約３，５００人に１人が発症する最も頻度の高い遺伝性進行性筋萎縮症である。乳幼児期には正常のヒトとほとんど変わらない運動機能を示すが、４~５歳頃から筋力低下がみられる。その後筋力低下は進行し１２歳頃までに歩行不能になり、２０歳代で心不全または呼吸器不全により死に至る重篤な疾患である。現在、ＤＭＤに対する有効な治療法はなく、新たな治療薬の開発が強く求められている。
　ＤＭＤはジストロフィン遺伝子の変異が原因であることが知られている。ジストロフィン遺伝子はＸ染色体に存在し、２２０万塩基対のＤＮＡから成る巨大な遺伝子である。ＤＮＡからｍＲＮＡ前駆体に転写され、さらにスプライシングによりイントロンが除かれ７９のエクソンが結合したｍＲＮＡが合成される。このｍＲＮＡから３，６８５のアミノ酸に翻訳され、ジストロフィンタンパク質が生成される。ジストロフィンタンパク質は筋細胞の膜安定性の維持に関与しており、筋細胞を壊れにくくするために必要である。ＤＭＤ患者のジストロフィン遺伝子は変異を有するため、筋細胞において機能を有するジストロフィンタンパク質が殆ど発現されない。そのため、ＤＭＤ患者体内では、筋細胞の構造を維持できなくなり、多量のカルシウムイオンが筋細胞内に流れ込む。その結果、炎症に似た反応が生じ、線維化が進むために筋細胞が再生されにくくなる。
　ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）もジストロフィン遺伝子の変異が原因であるが、その症状は筋萎縮による筋力低下を呈するものの一般にＤＭＤと比較して軽く、筋力低下の進行も遅く、多くの場合、成人期に発症する。ＤＭＤとＢＭＤとの臨床症状の違いは、変異によりジストロフィンのｍＲＮＡがジストロフィンタンパク質へと翻訳される際のアミノ酸読み取り枠が破壊されるか、あるいは維持されるかによるものと考えられている（非特許文献１）。つまり、ＤＭＤでは、アミノ酸読み取り枠がずれる変異を有することにより、機能を持つジストロフィンタンパク質がほとんど発現しないが、ＢＭＤでは変異によりエクソンの一部は欠失しているが、アミノ酸読み取り枠は維持されているために不完全ながらも機能を有するジストロフィンタンパク質が産生される。
　ＤＭＤの治療法として、エクソンスキッピング法が期待されている。この方法は、スプライシングを改変することでジストロフィンのｍＲＮＡのアミノ酸読み取り枠を修復し、部分的に機能を回復したジストロフィンタンパク質の発現を誘導する方法である（非特許文献２）。エクソンスキッピングの対象となるアミノ酸配列部分は失われることになる。そのためこの治療で発現されるジストロフィンタンパク質は正常のものより短くなるが、アミノ酸読み取り枠が維持されるために筋細胞を安定化する機能が部分的に保持される。従って、エクソンスキッピングにより、ＤＭＤは、より軽症のＢＭＤと同じような症状を呈するようになると期待されている。エクソンスキッピング法は、マウスやイヌによる動物実験を経て、ヒトＤＭＤ患者に対する臨床試験が行われている。
　エクソンスキッピングは、５’若しくは３’スプライス部位のいずれか若しくは両方、又はエクソンの内部を標的とするアンチセンス核酸の結合により誘導することができる。エクソンは両方のスプライス部位がスプライソソーム複合体によって認識された場合のみｍＲＮＡに包含される。従って、スプライス部位をアンチセンス核酸でターゲッティングすることにより、エクソンスキッピングを誘導することができる。また、エクソンがスプライシングの機構に認識されるためにはエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）へのＳＲタンパク質の結合が必要であると考えられており、ＥＳＥをターゲッティングすることでもエクソンのスキッピングを誘導することができる。
　ジストロフィン遺伝子の変異はＤＭＤ患者によって異なるため、遺伝子変異の場所や種類に応じたアンチセンス核酸が必要になる。これまでに、西オーストラリア大学のＳｔｅｖｅＷｉｌｔｏｎらによって７９個全てのエクソンに対してエクソンスキッピングを誘導するアンチセンス核酸が作製されており（非特許文献３）、オランダのＡｎｎｅｍｉｅｋｅ　Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓらによって３９種類のエクソンに対してエクソンスキッピングを誘導するアンチセンス核酸が作られている（非特許文献４）。
　全ＤＭＤ患者の８％程度は、第５３番目のエクソン（以下、「エクソン５３」という）をスキッピングすることで治療可能と考えられている。近年では、ジストロフィン遺伝子のエクソン５３をエクソンスキッピングのターゲットとした研究について、複数の研究機関から報告がなされている（特許文献１~４；非特許文献５）。しかしながら、エクソン５３を高効率にスキッピングさせる技術は、いまだに確立されていない。
国際公開公報　ＷＯ　２００６／００００５７ 国際公開公報　ＷＯ　２００４／０４８５７０ 米国特許公開公報　ＵＳ　２０１０／０１６８２１２ 国際公開公報　ＷＯ　２０１０／０４８５８６ Ｍｏｎａｃｏ　Ａ．Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１９８８；２：ｐ．９０−９５ Ｍａｔｓｕｏ　Ｍ．，Ｂｒａｉｎ　Ｄｅｖ　１９９６；１８：ｐ．１６７−１７２ Ｗｉｌｔｏｎ　Ｓ．Ｄ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　２００７：１５：ｐ．１２８８−９６ Ａｎｎｅｍｉｅｋｅ　Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ　ｅｔ　ａｌ．，（２００２）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ　１２：Ｓ７１−Ｓ７７ Ｌｉｎｄａ　Ｊ．Ｐｏｐｐｌｅｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，（２０１０）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｖｏｌ．２０，ｎｏ．２，ｐ．１０２−１０
　上記のような状況において、ジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピングを強く誘導するアンチセンスオリゴマー及びそのオリゴマーを含む筋ジストロフィー治療薬が望まれている。
　本発明者らは、ジストロフィン遺伝子の構造を詳細に研究した結果、ジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡ前駆体（以下、「ｐｒｅ−ｍＲＮＡ」という）のうちエクソン５３の５’末端から第３２~５６番目周辺のヌクレオチドからなる配列をアンチセンスオリゴマーでターゲッティングすることにより、高効率にエクソン５３のスキッピングを誘導できることを見出した。本発明者らは、この知見に基づき、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は、以下のとおりである。
［１］　ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーであって、ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３１~５３番目、第３１~５４番目、第３１~５５番目、第３１~５６番目、第３１~５７番目、第３１~５８番目、第３２~５３番目、第３２~５４番目、第３２~５５番目、第３２~５６番目、第３２~５７番目、第３２~５８番目、第３３~５３番目、第３３~５４番目、第３３~５５番目、第３３~５６番目、第３３~５７番目、第３３~５８番目、第３４~５３番目、第３４~５４番目、第３４~５５番目、第３４~５６番目、第３４~５７番目、第３４~５８番目、第３５~５３番目、第３５~５４番目、第３５~５５番目、第３５~５６番目、第３５~５７番目、第３５~５８番目、第３６~５３番目、第３６~５４番目、第３６~５５番目、第３６~５６番目、第３６~５７番目又は第３６~５８番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つに相補的な塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー。
［２］　オリゴヌクレオチドである、前記［１］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［３］　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドの糖部分及び／又はリン酸結合部分が修飾されている、前記［２］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［４］　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドの糖部分が、２’位の−ＯＨ基が、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、前記［３］に記載のアンチセンスオリゴマー。
（上記Ｒは、アルキル又はアリールを示し、上記Ｒ’は、アルキレンを示す。）
［５］　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合のからなる群より選択されるいずれか１つのものである、前記［３］又は［４］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［６］　モルホリノオリゴマーである、前記［１］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［７］　ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、前記［６］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［８］　５’末端が、下記化学式（１）~（３）のいずれかの基である、前記［１］~［７］のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
［９］　ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３２~５６番目又は第３６~５６番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなる、前記［１］~［８］のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１０］　配列番号２~３７からなる群より選択されるいずれか１つの塩基配列からなる、前記［１］~［８］のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１１］　配列番号１１、１７、２３、２９及び３５からなる群より選択されるいずれか１つの塩基配列からなる、前記［１］~［８］のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１２］　配列番号１１又は３５のいずれか１つの塩基配列からなる、前記［１］~［８］のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１３］　前記［１］~［１２］のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
　本発明のアンチセンスオリゴマーにより、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピングを高効率に誘導することが可能である。また、本発明の医薬組成物を投与することにより、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの症状を、効果的に軽減することができる。
ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５３のスキッピング効率を示す図である。 ヒト正常組織由来線維芽細胞（ＴＩＧ−１１９細胞）にヒトｍｙｏＤ遺伝子を導入して筋肉細胞に分化誘導した細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率を示す図である。 ヒトＤＭＤ患者由来線維芽細胞（５０１７細胞）にヒトｍｙｏＤ遺伝子を導入して筋肉細胞に分化誘導した細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率を示す図である。 ヒトＤＭＤ患者（エクソン４５−５２欠失）由来線維芽細胞にヒトｍｙｏＤ遺伝子を導入して筋肉細胞に分化誘導した細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率を示す図である。 ヒトＤＭＤ患者（エクソン４８−５２欠失）由来線維芽細胞にヒトｍｙｏＤ遺伝子を導入して筋肉細胞に分化誘導した細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率を示す図である。 ヒトＤＭＤ患者（エクソン４８−５２欠失）由来線維芽細胞にヒトｍｙｏＤ遺伝子を導入して筋肉細胞に分化誘導した細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率を示す図である。 ヒトＤＭＤ患者（エクソン４５−５２欠失またはエクソン４８−５２欠失）由来線維芽細胞にヒトｍｙｏＤ遺伝子を導入して筋肉細胞に分化誘導した細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率を示す図である。 ヒトＤＭＤ患者（エクソン４５−５２欠失）由来線維芽細胞にヒトｍｙｏＤ遺伝子を導入して筋肉細胞に分化誘導した細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率（２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡ）を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率（２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡ）を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率（２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡ）を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率（２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡ）を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率（２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡ）を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率（２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡ）を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率（２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡ）を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率（２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡ）を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率（２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡ）を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のオリゴマー濃度別のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のオリゴマー濃度別のスキッピング効率を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１０年９月１日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１０−１９６０３２号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
１．アンチセンスオリゴマー
　本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーであって、ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３１~５３番目、第３１~５４番目、第３１~５５番目、第３１~５６番目、第３１~５７番目、第３１~５８番目、第３２~５３番目、第３２~５４番目、第３２~５５番目、第３２~５６番目、第３２~５７番目、第３２~５８番目、第３３~５３番目、第３３~５４番目、第３３~５５番目、第３３~５６番目、第３３~５７番目、第３３~５８番目、第３４~５３番目、第３４~５４番目、第３４~５５番目、第３４~５６番目、第３４~５７番目、第３４~５８番目、第３５~５３番目、第３５~５４番目、第３５~５５番目、第３５~５６番目、第３５~５７番目、第３５~５８番目、第３６~５３番目、第３６~５４番目、第３６~５５番目、第３６~５６番目、第３６~５７番目又は第３６~５８番目のヌクレオチドからなる配列（以下、「標的配列」ともいう。）のいずれか１つに相補的な塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー（以下、「本発明のオリゴマー」という）を提供する。
［ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソン］
　本発明において、「遺伝子」には、ゲノム遺伝子以外に、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体及びｍＲＮＡも含まれる。好ましくは、遺伝子は、ｍＲＮＡ前駆体、即ち、ｐｒｅ−ｍＲＮＡである。
　ヒトゲノムにおいて、ヒトジストロフィン遺伝子は遺伝子座Ｘｐ２１．２に存在する。ヒトジストロフィン遺伝子は、３．０Ｍｂｐのサイズを有しており、既知のヒト遺伝子としては最大の遺伝子である。但し、ヒトジストロフィン遺伝子のコード領域はわずか１４ｋｂに過ぎず、該コード領域は７９個のエクソンとしてジストロフィン遺伝子内に分散している（Ｒｏｂｅｒｔｓ，ＲＧ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１６：５３６−５３８（１９９３））。ヒトジストロフィン遺伝子の転写物であるｐｒｅ−ｍＲＮＡは、スプライシングを受けて１４ｋｂの成熟ｍＲＮＡを生成する。ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子の塩基配列は公知である（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００４００６）。
　ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン５３の塩基配列を配列番号１に示す。
　本発明のオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピングにより、ＤＭＤ型ジストロフィン遺伝子でコードされるタンパク質を、ＢＭＤ型ジストロフィンタンパク質に改変することを目的として作製されたものである。従って、本発明のオリゴマーのエクソンスキッピングの対象となるジストロフィン遺伝子のエクソン５３には、野生型だけではなく、変異型も含まれる。
　変異型のヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３は、具体的には、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
　本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
　本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、″Ｓａｍｂｒｏｏｋ　＆　Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　２００１″及び″Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　１９８７−１９９７″などに記載されている方法を利用することができる。
　本明細書中、「相補的な塩基配列」とは、対象となる塩基配列とワトソン・クリック対を形成する塩基配列に限定されるものではなく、揺らぎ塩基対（Ｗｏｂｂｌｅ　ｂａｓｅ　ｐａｉｒ）を形成する塩基配列も含む。ここで、ワトソン・クリック対とは、アデニン−チミン、アデニン−ウラシル及びグアニン−シトシン間に水素結合が形成される塩基対を意味し、揺らぎ塩基対とは、グアニン−ウラシル、イノシン−ウラシル、イノシン−アデニン及びイノシン−シトシン間に水素結合が形成される塩基対を意味する。また、「相補的な塩基配列」とは、対象となる塩基配列と１００％の相補性を有していなくてもよく、例えば、対象となる塩基配列に対して、１~３個、１~２個又は１個の非相補的塩基が含まれていてもよい。
　本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃又は５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃又は０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを検出することができる。あるいは、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列の全部又は一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
　上記のハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドとしては、相同性検索ソフトウェアであるＢＬＡＳＴにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１のポリヌクレオチドと９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
　なお、塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ，ｅｔ　ａｌ：Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、Ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　エクソン５３の５’末端から第３１~５３番目、第３１~５４番目、第３１~５５番目、第３１~５６番目、第３１~５７番目、第３１~５８番目、第３２~５３番目、第３２~５４番目、第３２~５５番目、第３２~５６番目、第３２~５７番目、第３２~５８番目、第３３~５３番目、第３３~５４番目、第３３~５５番目、第３３~５６番目、第３３~５７番目、第３３~５８番目、第３４~５３番目、第３４~５４番目、第３４~５５番目、第３４~５６番目、第３４~５７番目、第３４~５８番目、第３５~５３番目、第３５~５４番目、第３５~５５番目、第３５~５６番目、第３５~５７番目、第３５~５８番目、第３６~５３番目、第３６~５４番目、第３６~５５番目、第３６~５６番目、第３６~５７番目及び第３６~５８番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列の例を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　本発明のオリゴマーは、好ましくは、ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３２~５６番目、第３３~５６番目、第３４~５６番目、第３５~５６番目又は第３６~５６番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つに相補的な塩基配列（例えば、配列番号１１、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９又は配列番号３５）からなる。
　好ましくは、本発明のオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３２~５６番目又は第３６~５６番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つに相補的な塩基配列（例えば、配列番号１１又は配列番号３５）からなるものである。
　「ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンのスキッピングを可能にする」とは、ヒトジストロフィン遺伝子の転写物（例えば、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）のエクソン５３に相当する部位に本発明のオリゴマーが結合することにより、該転写物がスプライシングを受けた際に、例えばエクソン５２が欠失したＤＭＤ患者の場合、エクソン５１の３’末端に相当する塩基配列の３’側にエクソン５４の５’末端に相当する塩基配列が連結し、コドンのフレームシフトが起こっていない成熟ｍＲＮＡが形成されることを意味する。
　従って、本発明のオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピングを可能にする限り、ターゲット配列に対して１００％相補的な塩基配列を有していなくてもよい。例えば、本発明のオリゴマーには、ターゲット配列に対して、１~３個、１~２個又は１個の非相補的塩基が含まれていてもよい。
　ここで、前記「結合」は、本発明のオリゴマーとヒトジストロフィン遺伝子の転写物とを混合した場合に、生理的条件下で両者がハイブリダイズして二本鎖を形成することを意味する。上記「生理的条件下」とは、生体内と類似のｐＨ、塩組成、温度に調節された条件を意味する。例えば、２５~４０℃、好ましくは３７℃、ｐＨ５~８、好ましくは、ｐＨ７．４であって、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭの条件が挙げられる。
　ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピングが生じたか否かは、ジストロフィン発現細胞（例えば、ヒト横紋筋肉腫細胞）に本発明のオリゴマーを導入し、前記ジストロフィン発現細胞のｔｏｔａｌ　ＲＮＡから、ヒトジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡのエクソン５３の周辺領域をＲＴ−ＰＣＲ増幅し、該ＰＣＲ増幅産物に対してｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ又はシークエンス解析を行うことにより確認することができる。
　スキッピング効率は、ヒトジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡを被検細胞から回収し、該ｍＲＮＡのうち、エクソン５３がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン５３がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を測定し、これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って計算することができる。
　スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）×１００
　本発明のオリゴマーとしては、例えば、１８~２８塩基の長さを有する、オリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマー、又はペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ：ＰＮＡ）オリゴマーを挙げることができる。２１~２５塩基の長さが好ましく、モルホリノオリゴマーが好ましい。
　前記オリゴヌクレオチド（以下、「本発明のオリゴヌクレオチド」という）は、ヌクレオチドを構成単位とする本発明のオリゴマーであり、かかるヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドのいずれであってもよい。
　修飾ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを構成する核酸塩基、糖部分、及びリン酸結合部分の全部又は一部が修飾されているものをいう。
　核酸塩基としては、例えば、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、チミン、ウラシル又はそれらの修飾塩基を挙げることができる。かかる修飾塩基としては、例えば、シュードウラシル、３−メチルウラシル，ジヒドロウラシル、５−アルキルシトシン（例えば、５−メチルシトシン）、５−アルキルウラシル（例えば、５−エチルウラシル）、５−ハロウラシル（５−ブロモウラシル）、６−アザピリミジン、６−アルキルピリミジン（６−メチルウラシル）、２−チオウラシル、４−チオウラシル、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、１−メチルアデニン、１−メチルヒポキサンチン、２，２−ジメチルグアニン、３−メチルシトシン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メチルカルボニルメチルウラシル、５−メチルオキシウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、２−チオシトシン、プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　糖部分の修飾としては、例えば、リボースの２’位の修飾及び糖のその他の部分の修飾を挙げることができる。リボースの２’位の修飾としては、例えば、リボースの２’位の−ＯＨ基をＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＭＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉに置換する修飾を挙げることができる。ここで、Ｒはアルキル又はアリールを表す。Ｒ’はアルキレンを表す。
　糖のその他の部分の修飾としては、例えば、リボース又はデオキシリボースの４’位のＯをＳに置換したもの、糖の２′位と４′位を架橋したもの、例えば、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）又はＥＮＡ（２′−Ｏ，４′−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　リン酸結合部分の修飾としては、例えば、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノフォスフェート結合（Ｅｎｙａ　ｅｔ　ａｌ：Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　＆　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，１８，９１５４−９１６０）に置換する修飾を挙げることができる（例えば、特許再公表公報第２００６／１２９５９４号及び第２００６／０３８６０８号を参照）。
　アルキルとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１~６のアルキルが好ましい。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１~３個置換されていてもよい。
　シクロアルキルとしては、炭素数５~１２のシクロアルキルが好ましい。具体的には、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、シクロドデシルが挙げられる。
　ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
　アルコキシとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１~６のアルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数１~３のアルコキシが好ましい。
　アリールとしては、炭素数６~１０のアリールが好ましい。具体的には、例えば、フェニル、α−ナフチル、β−ナフチルを挙げることができる。とりわけフェニルが好ましい。当該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１~３個置換されていてもよい。
　アルキレンとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１~６のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２−（エチル）トリメチレン、１−（メチル）テトラメチレンを挙げることができる。
　アシルとしては、直鎖状若しくは分枝鎖状のアルカノイル、又はアロイルを挙げることができる。アルカノイルとしては、例えば、ホルミル、アセチル、２−メチルアセチル、２，２−ジメチルアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、２，２−ジメチルプロピオニル、ヘキサノイル等が挙げられる。アロイルとしては、例えば、ベンゾイル、トルオイル、ナフトイルを挙げることができる。かかるアロイルは置換可能な位置において置換されていてもよく、アルキルで置換されていてもよい。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、リボースの２’位の−ＯＨ基がメトキシで置換され、リン酸結合部分がホスホロチオエート結合である、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のオリゴマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
（式中、Ｂａｓｅは、核酸塩基を表す。）
　本発明のオリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置（例えば、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三者機関（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社又はＴａｋａｒａ社）等に委託して作製することもできる。
　本発明のモルホリノオリゴマーは、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のオリゴマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
（式中、Ｂａｓｅは、前記と同義であり；
　Ｗは、以下のいずれかの式で表わされる基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
（式中、Ｘは、−ＣＨ２Ｒ１、−Ｏ−ＣＨ２Ｒ１、−Ｓ−ＣＨ２Ｒ１、−ＮＲ２Ｒ３又はＦを表し；
　Ｒ１は、Ｈ、アルキルを表し；
　Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、又は、アリールを表し；
　Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２又はＮＲ１を表し；
　Ｙ２は、Ｏ、Ｓ又はＮＲ１を表し；
　Ｚは、Ｏ又はＳを表す。））
　モルホリノオリゴマーは、好ましくは、以下の式で表わされる基を構成単位とするオリゴマー（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（以下、「ＰＭＯ」という））である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
（式中、Ｂａｓｅ、Ｒ２、Ｒ３は、前記と同義である。）
　モルホリノオリゴマーは、例えば、国際公開公報第１９９１／００９０３３号、又は国際公開公報第２００９／０６４４７１号に従って製造することができる。特に、ＰＭＯは、国際公開公報第２００９／０６４４７１号に記載の方法に従って製造するか、又は以下に示す方法に従って製造することができる。
［ＰＭＯの製法］
　ＰＭＯの１つの態様として、例えば、次の一般式（Ｉ）で表される化合物（以下、ＰＭＯ（Ｉ）という）を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
［式中、各Ｂａｓｅ、Ｒ２、Ｒ３は、前記と同義であり；
　ｎは、１~９９の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、１８~２８の範囲内にある任意の整数である。］
　ＰＭＯ（Ｉ）は、公知の方法に従い製造することができるが、例えば、下記工程の操作を実施することにより製造することができる。
　下記工程に使用されている化合物及び試薬は、ＰＭＯの製造に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。
　また、下記のすべての工程は、液相法又は固相法（マニュアル又は市販の固相自動合成機を用いる）で実施することができる。固相法でＰＭＯを製造する場合、操作手順の簡便化及び合成の正確性の点から自動合成機を用いる方法が望ましい。
（１）工程Ａ：
　次の一般式（ＩＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩ）という）に酸を作用させることによって、次の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩＩ）という。）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
［式中、ｎ、Ｒ２、Ｒ３は、前記と同義であり；
　各ＢＰは，独立して、保護されていてもよい核酸塩基を表し；
　Ｔは、トリチル基、モノメトキシトリチル基、又はジメトキシトリチル基を表し；
　Ｌは、水素、アシル、又は次の一般式（ＩＶ）で表される基（以下、基（ＩＶ）という。）を表す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
　ＢＰに係る「核酸塩基」としては、Ｂａｓｅと同じ「核酸塩基」を挙げることができる。但し、ＢＰに係る核酸塩基のアミノ基又は水酸基は保護されていてもよい。
　かかるアミノ基の保護基としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。水酸基の保護基としては、例えば、２−シアノエチル、４−ニトロフェネチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチル、トリメチルシリルエチル、置換可能な任意の位置で１~５個の電子吸引性基で置換されていてもよいフェニル、ジフェニルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、メチルフェニルカルバモイル、１−ピロリジニルカルバモイル、モルホリノカルバモイル、４−（ｔｅｒｔ−ブチルカルボキシ）ベンジル、４−［（ジメチルアミノ）カルボキシ］ベンジル、４−（フェニルカルボキシ）ベンジルを挙げることができる（例えば、国際公開公報第２００９／０６４４７１号公報参照）。
　「固相担体」としては、核酸の固相反応に使用しうる担体であれば特に制限されないが、例えば、（ｉ）モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬（例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、ピリジン、無水酢酸、ルチジン、トリフルオロ酢酸）にほとんど溶解せず、（ｉｉ）モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬に対して化学的に安定であり、（ｉｉｉ）化学修飾ができ、（ｉｖ）望ましいモルホリノ核酸誘導体の装填ができ、（ｖ）処理中にかかる高圧に耐える十分な強度をもち、（ｖｉ）一定の粒径範囲と分布であるものが望ましい。具体的には、膨潤性ポリスチレン（例えば、アミノメチルポリスチレン樹脂　１％ジベンジルベンゼン架橋（２００~４００メッシュ）（２．４~３．０ｍｍｏｌ／ｇ）（東京化成社製）、Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　Ｒｅｓｉｎ・ＨＣｌ［ジベンジルベンゼン１％，１００~２００メッシュ］（ペプチド研究所社製））、非膨潤性ポリスチレン（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｕｐｐｏｒｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製））、ＰＥＧ鎖結合型ポリスチレン（例えば、ＮＨ２−ＰＥＧ　ｒｅｓｉｎ（渡辺化学社製）、ＴｅｎｔａＧｅｌ　ｒｅｓｉｎ）、定孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｅ　ｇｌａｓｓ；ＣＰＧ）（例えば、ＣＰＧ社製）、オキサリル化−定孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１９，１５２７（１９９１）を参照）、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体−アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈｔら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３４，３３７３（１９９３）を参照）、Ｐｏｒｏｓ−ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーを挙げることができる。
　「リンカー」としては、通常核酸やモルホリノ核酸誘導体を連結するために使用される公知のものを用いることができるが、例えば、３−アミノプロピル、スクシニル、２，２’−ジエタノールスルホニル、ロングチェーンアルキルアミノ（ＬＣＡＡ）を挙げることができる。
　本工程は、化合物（ＩＩ）に酸を作用させることにより実施することができる。
　本工程に使用しうる「酸」としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸又はトリクロロ酢酸を挙げることができる。酸の使用量としては、例えば、化合物（ＩＩ）１モルに対して０．１モル当量~１０００モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは１モル当量~１００モル当量の範囲内である。
　また、前記酸と一緒に、有機アミンを使用することができる。有機アミンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、トリエチルアミンを挙げることができる。有機アミンの使用量は、例えば、酸１モルに対して、０．０１モル当量~１０モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは、０．１モル当量~２モル当量の範囲内である。
　本工程において酸と有機アミンとの塩又は混合物を使用する場合には、例えば、トリフルオロ酢酸とトリエチルアミンの塩又は混合物を挙げることができ、より具体的には、トリフルオロ酢酸２当量に対してトリエチルアミン１当量を混合したものを挙げることができる。
　本工程に使用しうる酸は、０．１％~３０％の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。
　上記反応における反応温度は、例えば、１０℃~５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃~４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃~３５℃の範囲内である。
　反応時間は、使用する酸の種類、反応温度によって異なるが、通常０．１分~２４時間の範囲内が適当である。好ましくは、１分~５時間の範囲内である。
　また、本工程が終了した後、必要に応じて、系中に存在する酸を中和するために塩基を添加することができる。「塩基」としては、特に限定されないが、例えば、ジイソプロピルアミンが挙げられる。塩基は、０．１％（ｖ／ｖ）~３０％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。
　本工程に用いる溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。反応温度は、例えば、１０℃~５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃~４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃~３５℃の範囲内である。
　反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常０．１分~２４時間の範囲内が適当であり、好ましくは、１分~５時間の範囲内である。
　なお、化合物（ＩＩ）において、ｎ＝１であって、Ｌが基（ＩＶ）である、次の一般式（ＩＩａ）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩａ）という）は、以下の方法に従って製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
［式中、ＢＰ、Ｔ、リンカー、固相担体は、前記と同義である。］
工程１：
　次の一般式（Ｖ）で表される化合物にアシル化剤を作用させることによって、次の一般式（ＶＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＶＩ）という。）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
［式中、ＢＰ、Ｔ、リンカーは、前記と同義であり；
　Ｒ４は、水酸基、ハロゲン、又は、アミノを表す。］
　本工程は、化合物（Ｖ）を出発原料として、公知のリンカーの導入反応により実施することができる。
　特に、次の一般式（ＶＩａ）で表される化合物は、化合物（Ｖ）と無水コハク酸とを用いてエステル化反応として知られた方法を実施することにより製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
［式中、ＢＰ、Ｔは、前記と同義である。］
工程２：
　化合物（ＶＩ）に縮合剤等を作用させることによって、固相担体と反応させ、化合物（ＩＩａ）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
［式中、ＢＰ、Ｒ４、Ｔ、リンカー、固相担体は、前記と同義である。］
　本工程は、化合物（ＶＩ）と固相担体とを用いて縮合反応として知られた方法により製造することができる。
　化合物（ＩＩ）において、ｎ＝２~９９であって、Ｌが基（ＩＶ）である、次の一般式（ＩＩａ２）で表される化合物は、化合物（ＩＩａ）を出発原料とし、本明細書に記載のＰＭＯの製法にかかる工程Ａ及び工程Ｂを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
［式中、ＢＰ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔ、リンカー、固相担体は、前記と同義であり；
　ｎ’は、１~９８を表す。］
　また、化合物（ＩＩ）において、ｎ＝１であって、Ｌが水素である、次の一般式（ＩＩｂ）で表される化合物は、例えば、国際公開公報第１９９１／００９０３３号に記載の方法により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
［式中、ＢＰ、Ｔは、前記と同義である。］
　化合物（ＩＩ）において、ｎ＝２~９９であって、Ｌが水素である、次の一般式（ＩＩｂ２）で表される化合物は、化合物（ＩＩｂ）を出発原料とし、本明細書に記載のＰＭＯの製法にかかる工程Ａ及び工程Ｂを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
［式中、ＢＰ、ｎ’、Ｒ２、Ｒ３、Ｔは、前記と同義である。］
　また、化合物（ＩＩ）において、ｎ＝１であって、Ｌがアシルである、次の一般式（ＩＩｃ）で表される化合物は、化合物（ＩＩｂ）に対してアシル化反応として知られた方法を実施することにより製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
［式中、ＢＰ、Ｔは、前記と同義であり；
　Ｒ５は、アシルを表す。］
　化合物（ＩＩ）において、ｎ＝２~９９であって、Ｌがアシルである、次の一般式（ＩＩｃ２）で表される化合物は、化合物（ＩＩｃ）を出発原料とし、本明細書に記載のＰＭＯの製法にかかる工程Ａ及び工程Ｂを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
［式中、ＢＰ、ｎ’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｔは、前記と同義である。］
（２）工程Ｂ：
　化合物（ＩＩＩ）に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることによって、次の一般式（ＶＩＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＶＩＩ）という。）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
［式中、各ＢＰ、Ｌ、ｎ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔは、前記と同義である。］
　本工程は、化合物（ＩＩＩ）に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることにより実施することができる。
　モルホリノモノマー化合物としては、例えば、次の一般式（ＶＩＩＩ）で表される化合物を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
［式中、ＢＰ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔは前記と同義である。］
　本工程に使用しうる「塩基」としては、例えば、ジイソプロピルアミン、トリエチルアミン、又は、Ｎ−エチルモルホリンを挙げることができる。塩基の使用量としては、例えば、化合物（ＩＩＩ）１モルに対して、１モル当量~１０００モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは１０モル当量~１００モル当量の範囲内である。
　本工程に使用しうるモルホリノモノマー化合物および塩基は、０．１％~３０％の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルイミダゾリドン、Ｎ−メチルピペリドン、ＤＭＦ、ジクロロメタン、アセトニトリル、テロラヒドロフラン、又はこれらの混合物を挙げることができる。
　反応温度は、例えば、０℃~１００℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、１０℃~５０℃の範囲内である。
　反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常１分~４８時間の範囲内が適当であり、好ましくは、３０分~２４時間の範囲内である。
　さらに本工程の終了後、必要に応じて、アシル化剤を添加することができる。「アシル化剤」としては、例えば、無水酢酸、酢酸クロライド、フェノキシ酢酸無水物を挙げることができる。アシル化剤は、例えば、０．１％~３０％の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。
　また、必要であれば、アシル化剤と一緒に、例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−エチルモルホリン等の塩基を使用することができる。アシル化剤の使用量としては、０．１モル当量~１００００モル当量の範囲内が好ましく、１モル当量~１０００モル当量の範囲内がより好ましい。塩基の使用量としては、例えば、アシル化剤１モルに対して、０．１モル当量~１００モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは１モル当量~１０モル当量の範囲内である。
　本反応の反応温度は、１０℃~５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、１０℃~５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃~４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃~３５℃の範囲内である。反応時間は、例えば、使用するアシル化剤の種類、反応温度によって異なるが、通常０．１分~２４時間の範囲内が適当であり、好ましくは、１分から５時間の範囲内である。
（３）工程Ｃ：
　工程Ｂにおいて製造される化合物（ＶＩＩ）において、脱保護剤を用いて保護基を脱離し、一般式（ＩＸ）で表される化合物を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
［式中、Ｂａｓｅ、ＢＰ、Ｌ、ｎ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔは、前記と同義である。］
　本工程は、化合物（ＶＩＩ）に脱保護剤を作用させることにより実施することができる。
　「脱保護剤」としては、例えば、濃アンモニア水、メチルアミンを挙げることができる。本工程に使用しうる「脱保護剤」は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチルイミダゾリドン、Ｎ−メチルピペリドン又はこれらの混合溶媒で希釈して使用することもできる。なかでも、エタノールが好ましい。脱保護剤の使用量としては、例えば、化合物（ＶＩＩ）１モルに対して、例えば、１モル当量~１０００００モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは１０モル当量~１０００モル当量の範囲内である。
　反応温度は、例えば、１５℃~７５℃の範囲内が適当であり、好ましくは４０℃~７０℃の範囲内であり、より好ましくは５０℃~６０℃の範囲内である。脱保護反応時間は、化合物（ＶＩＩ）の種類、反応温度等によって異なるが、１０分~３０時間の範囲内が適当であり、好ましくは３０分~２４時間の範囲内であり、より好ましくは５時間~２０時間の範囲内である。
（４）工程Ｄ：
　工程Ｃにおいて製造される化合物（ＩＸ）に酸を作用させることによって、ＰＭＯ（Ｉ）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
［式中、Ｂａｓｅ、ｎ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔは、前記と同義である。］
　本工程は、化合物（ＩＸ）に酸を加えることによって実施することができる。
　本工程において使用しうる「酸」としては、例えば、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、酢酸、リン酸及び塩酸等を挙げることができる。酸の使用量としては、例えば、溶液のｐＨが０．１~４．０の範囲内になるように使用するのが適当であり、より好ましくは１．０~３．０の範囲内になるように使用する。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、水、又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。
　反応温度は、１０℃~５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃~４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃~３５℃の範囲内である。脱保護反応時間は、化合物（ＩＸ）の種類、反応温度等によって異なるが、０．１分~５時間の範囲内が適当であり、好ましくは１分~１時間の範囲内であり、より好ましくは１分~３０分の範囲内である。
　ＰＭＯ（Ｉ）は、本工程で得られた反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、Ｃ８からＣ１８の逆相カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を単独若しくは組み合わせて用いることにより得ることができ、所望のＰＭＯ（Ｉ）を単離精製することができる（例えば、国際公開公報ＷＯ１９９１／０９０３３を参照）。
　逆相クロマトグラフィーを用いてＰＭＯ（Ｉ）を精製する場合には、溶出溶媒として、例えば２０ｍＭのトリエチルアミン／酢酸緩衝液とアセトニトリルの混合溶液を使用することができる。
　また、イオン交換クロマトグラフィーを用いてＰＭＯ（Ｉ）を精製する場合には、例えば、１Ｍの食塩水と１０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液の混合溶液を使用することができる。
　ペプチド核酸は、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のオリゴマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
（式中、Ｂａｓｅは、前記と同義である。）
　ペプチド核酸は、例えば、以下の文献に従って製造することができる。
１）Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１４９７（１９９１）
２）Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｊａｃｓ．，１１４，１８９５（１９９２）
３）Ｋ．Ｌ．Ｄｕｅｈｏｌｍ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｃ．Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｌ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｈ．Ｆ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｔ．Ｖｕｌｐｉｕｓ，Ｋ．Ｈ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９，５７６７（１９９４）
４）Ｌ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｒ．Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，Ｂ．Ｇｉｌｄｅａ，Ｋ．Ｈ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｈ．Ｆ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｔ．Ｋｏｃｈ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｃｏｕｌｌ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，１，１７５（１９９５）
５）Ｔ．Ｋｏｃｈ，Ｈ．Ｆ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｐ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ｌａｒｓｅｎ，Ｈ．Ｇ．Ｂａｔｚ，Ｋ．Ｏｔｔｅｓｏｎ，Ｈ．Ｏｒｕｍ，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．，４９，８０（１９９７）
　また、本発明のオリゴマーは、５’末端が、下記化学式（１）~（３）のいずれかの基であってもよい。好ましくは（３）−ＯＨである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
　以下、上記（１）、（２）及び（３）で示される基を、それぞれ「基（１）」、「基（２）」及び「基（３）」と呼ぶ。
２．医薬組成物
　本発明のオリゴマーは、従来技術に係るアンチセンスオリゴマーと比較して、高効率にエクソン５３のスキッピングを可能にする。従って、本発明のオリゴマーを含む医薬組成物をＤＭＤ患者に投与することにより、高効率に筋ジストロフィーの症状を緩和することができると予測される。例えば、本発明のオリゴマーを含む医薬組成物を用いる場合、従来技術に係るオリゴマーと比べて少量の投与量でも同程度の治療効果を得られるため、副作用を軽減することができ、かつ経済的である。
　そこで、別の実施態様として、本発明のオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物（以下、「本発明の組成物」という）を提供する。
　本発明の組成物に含まれる本発明のオリゴマーの医薬的に許容可能な塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩；ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩；酢酸塩、りんご酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などが挙げられる。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。あるいは、本発明の組成物に含まれる本発明のオリゴマーは、その水和物の形態にあってもよい。
　本発明の組成物の投与形態は、医薬的に許容可能な投与形態であれば特に制限されず、治療方法に応じて選択することができるが、筋組織への送達容易性の観点から、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、組織内投与、経皮投与等が好ましい。また、本発明の組成物が取り得る剤型としては、特に制限されないが、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤等を挙げることができる。
　本発明のオリゴマーを筋ジストロフィー患者に投与する場合、本発明の組成物は、該オリゴマーの筋組織への送達を促進する担体を含むことが好ましい。このような担体は、医薬的に許容可能なものであれば特に制限されず、その例として、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー等のカチオン性担体、またはウイルスエンベロープを利用した担体を挙げることができる。カチオン性リポソームとしては、例えば、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須構成成分として形成されるリポソーム（以下、「リポソームＡ」という）、オリゴフェクトアミン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、リポフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、リポフェクトアミン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＴｒａｎｓＩＴ　ＴＫＯ（登録商標）（Ｍｉｒｕｓ社製）、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　ＩＩ（Ｌｏｎｚａ）を挙げることができる。それらの中で、リポソームＡが好ましい。カチオン性ポリマーとしては、例えば、ＪｅｔＳＩ（登録商標）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）、Ｊｅｔ−ＰＥＩ（登録商標）（ポリエチレンイミン、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を挙げることができる。ウイルスエンベロープを利用した担体としては、例えば、ＧｅｎｏｍｅＯｎｅ（登録商標）（ＨＶＪ−Ｅリポソーム、石原産業社製）を挙げることができる。あるいは、特許２９２４１７９号に記載の医薬デバイス、特許再公表公報第２００６／１２９５９４号及び特許再公表公報第２００８／０９６６９０号に記載のカチオン性担体を用いることもできる。
　本発明の組成物に含まれる本発明のオリゴマーの濃度は、担体の種類等によって異なるが、０．１ｎＭ~１００μＭの範囲内が適当であり、１ｎＭ~１０μＭの範囲内が好ましく、１０ｎＭ~１μＭの範囲内がより好ましい。また、本発明の組成物に含まれる本発明のオリゴマーと担体との重量比（担体／本発明のオリゴマー）は、該オリゴマーの性質及び該担体の種類等によって異なるが、０．１~１００の範囲内が適当であり、１~５０の範囲内が好ましく、１０~２０の範囲内がより好ましい。
　本発明の組成物には、本発明のオリゴマーと上述した担体以外に、任意に医薬的に許容可能な添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数６~２２の脂肪酸やその医薬的に許容可能な塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明の組成物中の当該添加剤の含有量は、９０重量％以下が適当であり、７０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましい。
　本発明の組成物は、担体の分散液に本発明のオリゴマーを加え、適当に攪拌することにより調製することができる。また、添加剤は、本発明のオリゴマーの添加前でも添加後でも適当な工程で添加することができる。本発明のオリゴマーを添加させる際に用い得る水性溶媒としては、医薬的に許容可能なものであれば特に制限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。また、かかる場合のｐＨ及び温度等の条件は、当業者が適宜選択することができる。
　本発明の組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。当該凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明の組成物を凍結乾燥処理することにより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明の組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約−４０~−２０℃の条件で予備凍結を２時間程度行い、約０~１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５~２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明の組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。
　本発明の組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５~２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。
　本発明の組成物を投与する際の用量としては、含有される本発明のオリゴマーの種類、剤形、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度を考慮した上で調製することが望ましいが、成人に対して本発明のオリゴマーの量として、１日当たり０．１ｍｇ~１０ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは１ｍｇ~１ｇ／ヒトの範囲内が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また１日１回から数回の投与又は１日から数日間の間隔で投与することができる。
　本発明の組成物の別の態様として、本発明のオリゴヌクレオチドを発現し得るベクターと上述した担体とを含む医薬組成物を挙げることができる。かかる発現ベクターは、複数の本発明のオリゴヌクレオチドを発現し得るものであってもよい。当該組成物には、本発明のオリゴマーを含有する本発明の組成物と同様に、医薬的に許容可能な添加剤を添加することができる。当該組成物中に含まれる発現ベクターの濃度は、担体の種類等によって異なるが、０．１ｎＭ~１００μＭの範囲内が適当であり、１ｎＭ~１０μＭの範囲内が好ましく、１０ｎＭ~１μＭの範囲内がより好ましい。当該組成物中に含まれる発現ベクターと担体との重量比（担体／発現ベクター）は、発現ベクターの性質、担体の種類等によって異なるが、０．１~１００の範囲内が適当であり、１~５０の範囲内が好ましく、１０~２０の範囲内がより好ましい。また、当該組成物中に含まれる担体の含有量は、本発明のオリゴマーを含有する本発明の組成物の場合と同様であり、その調製方法等に関しても、本発明の組成物の場合と同様である。
　以下に、実施例及び試験例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。
［参考例１］
アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸
工程１：４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸の製造
　アルゴン雰囲気下、Ｎ−｛１−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル｝ベンズアミド２２．０ｇと４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ）７．０４ｇをジクロロメタン２６９ｍＬに懸濁し、無水コハク酸５．７６ｇを加え、室温で３時間撹拌した。反応液にメタノール４０ｍＬを加え、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチルと０．５Ｍのリン酸二水素カリウム水溶液を用いて抽出操作を行った。得られた有機層を０．５Ｍのリン酸二水素カリウム水溶液、水、飽和食塩水の順で洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮し、２５．９ｇの目的物を得た。
工程２：アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸の製造
　４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸２３．５ｇをピリジン（脱水）３３６ｍＬに溶解し、４−ＤＭＡＰ４．２８ｇ、１−エチル−３‐（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩４０．３ｇを加えた。次いで、アミノメチルポリスチレン樹脂　１％ＤＶＢ架橋（東京化成工業社製、Ａ１５４３）２５．０ｇ、トリエチルアミン２４ｍＬを加え、室温で４日間振とうした。反応後、樹脂をろ取した。得られた樹脂をピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥した。得られた樹脂にテトラヒドロフラン（脱水）１５０ｍＬ、無水酢酸１５ｍＬ、２，６−ルチジン１５ｍＬを加え、室温で２時間振とうした。樹脂をろ取し、ピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥し、３３．７ｇの目的物を得た。
　当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂１ｇ当たりのトリチルのモル量を４０９ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、３９７．４μｍｏｌ／ｇであった。
　ＵＶ測定条件
　機器：Ｕ−２９１０（日立製作所）
　溶媒：メタンスルホン酸
　波長：２６５ｎｍ
　ε値：４５０００
［参考例２］
アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４−オキソ−４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−オキソ−２−［２−フェノキシアセタミド］−１Ｈ−プリン−９−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝ブタン酸
工程１：Ｎ２−（フェノキシアセチル）グアノシンの製造
　グアノシン１００ｇを８０℃で減圧下、２４時間乾燥した。ピリジン（脱水）５００ｍＬ、ジクロロメタン（脱水）５００ｍＬを加え、アルゴン雰囲気下、０℃にてクロロトリメチルシラン４０１ｍＬを滴下し室温で３時間撹拌した。再度氷冷し、フェノキシアセチルクロライド６６．３ｇを滴下し、氷冷下、更に３時間撹拌した。反応液にメタノール５００ｍｌを加え、室温で終夜撹拌後、減圧下溶媒を留去した。残渣にメタノール５００ｍＬを加え、減圧下濃縮することを３回行った。残渣に水４Ｌを加え氷冷下１時間撹拌し、析出物をろ取した。このものを、水、次いで、冷メタノールで洗浄し、乾燥して目的化合物を１５０．２ｇ得た（収率：１０２％）（参考：Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２００４），Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１５，２５５５−２５５７）。
工程２：Ｎ−｛９−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−モルホリン−２−イル］−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル｝−２−フェノキシアセタミド　ｐ−トルエンスルホン酸塩
　工程１で得られた化合物３０ｇをメタノール４８０ｍＬに懸濁し、氷冷下、２Ｎ塩酸１３０ｍＬを加えた。次いで、四ほう酸アンモニウム４水和物５６．８ｇ、過ヨウ素酸ナトリウム１６．２ｇをこの順で加え、室温で３時間撹拌した。反応液を氷冷し、不溶物をろ過して除き、これをメタノール１００ｍＬで洗浄した。ろ液と洗浄液を合わせて氷冷し、２−ピコリンボラン１１．５２ｇを加えて２０分間撹拌後、ｐ−トルエンスルホン酸・１水和物５４．６ｇをゆっくり加えて、４℃で終夜撹拌した。析出物をろ取し、冷メタノール５００ｍＬで洗浄後、乾燥して目的化合物を１７．７ｇ得た（収率：４３．３％）。
１Ｈ　ＮＭＲ（δ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：９．９−９．２（２Ｈ，ｂｒ）、８．３５（１Ｈ，ｓ）、７．５５（２Ｈ，ｍ）、７．３５（２Ｈ，ｍ）、７．１０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８２Ｈｚ）、７．００（３Ｈ，ｍ）、５．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．６４，２．４２Ｈｚ）、４．８５（２Ｈ，ｓ）、４．００（１Ｈ，ｍ）、３．９０−３．６０（２Ｈ，ｍ）、３．５０−３．２０（５Ｈ，ｍ）、２．９０（１Ｈ，ｍ）、２．２５（３Ｈ，ｓ）
工程３：Ｎ−｛９−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル｝−２−フェノキシアセタミドの製造
　工程２で得られた化合物２．０ｇをジクロロメタン３０ｍＬに懸濁し、氷冷下、トリエチルアミン１３．９ｇ、トリチルクロリド１８．３ｇを加えて、室温で１時間撹拌した。反応液を飽和重曹水、次いで水で洗浄後乾燥し、有機層を減圧濃縮した。残渣に０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３）／メタノール（１：４（ｖ／ｖ））４０ｍＬを加えて撹拌し、次いで水４０ｍＬを加えて氷冷下１時間撹拌した。これをろ取し、冷メタノールで洗浄、乾燥して目的化合物を１．８４ｇ得た（収率：８２．０％）。
工程４：アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４−オキソ−４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−オキソ−２−［２−フェノキシアセタミド］−１Ｈ−プリン−９−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝ブタン酸の製造
　参考例１と同様の方法で標記化合物を製造した。但し、参考例１の工程１で用いたＮ−｛１−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル｝ベンズアミドの代わりに、本工程では、Ｎ−｛９−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル｝−２−フェノキシアセタミドを使用した。
［参考例３］
アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸
　参考例１と同様の方法で標記化合物を製造した。但し、参考例１の工程１で用いたＮ−｛１−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル｝ベンズアミドの代わりに、本工程では、１−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンを使用した。
［参考例４］
アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された１，１２−ジオキソ−１−（４−トリチルピペラジン−１−イル）−２，５，８，１１−テトラオキサ−１５−ペンタデカン酸
　参考例１と同様の方法で標記化合物を製造した。但し、参考例１の工程１で用いたＮ−｛１−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル｝ベンズアミドの代わりに、本工程では、２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エチル　４−トリチルピペラジン−１−カルボン酸（国際公開公報第２００９／０６４４７１号に記載の化合物）を使用した。
　以下の実施例１~１２、比較例１~３の記載に従い、表２　ＰＭＯ　Ｎｏ．１−１１，１３−１６に示す各種ＰＭＯを合成した。合成したＰＭＯを注射用水（大塚製薬工場社製）で溶解した。なお、ＰＭＯ　Ｎｏ．１２はジーンツールズ社から購入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
［実施例１］
ＰＭＯ 　 Ｎｏ．８
　アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸（参考例１）２ｇ（８００μｍｏｌ）を反応槽に移し入れ、ジクロロメタン３０ｍＬを添加し、３０分間静置した。さらに、ジクロロメタン３０ｍＬで２回洗浄した後、下記合成サイクルを開始した。標記化合物の塩基配列になるよう、各サイクルにおいて所望のモルホリノモノマー化合物を添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
　なお、デブロック溶液としては、トリフルオロ酢酸（２当量）とトリエチルアミン（１当量）の混合物を３％（ｗ／ｖ）になるように、１％（ｖ／ｖ）のエタノールと１０％（ｖ／ｖ）の２，２，２−トリフルオロエタノールを含有するジクロロメタン溶液で溶解したものを用いた。中和溶液としては、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを５％（ｖ／ｖ）になるように、２５％（ｖ／ｖ）の２−プロパノールを含有するジクロロメタン溶液で溶解したものを用いた。カップリング溶液Ａとしては、モルホリノモノマー化合物を０．１５Ｍになるように、１０％（ｖ／ｖ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを含有する１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンで溶解したものを用いた。カップリング溶液Ｂとしては、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを１０％（ｖ／ｖ）になるように、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンで溶解したものを用いた。キャッピング溶液としては、ジクロロメタンに対して２０％（ｖ／ｖ）の無水酢酸と３０％（ｖ／ｖ）の２，６−ルチジンを溶解したものを使用した。
　上記で合成したＰＭＯが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂を反応容器から回収し、２時間以上室温で減圧乾燥した。乾燥したアミノメチルポリスチレン樹脂に担持されたＰＭＯを反応容器に入れ、２８％アンモニア水−エタノール（１／４）２００ｍＬを加え、５５℃で１５時間撹拌した。アミノメチルポリスチレン樹脂をろ別し、水−エタノール（１／４）５０ｍＬで洗浄した。得られたろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を２０ｍＭの酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ＴＥＡＡ緩衝液）とアセトニトリルの混合溶媒（４／１）１００ｍＬに溶解し、メンブレンフィルターでろ過した。得られたろ液を逆相ＨＰＬＣにて精製した。使用した条件は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
　各フラクションを分析して、アセトニトリル−水（１／１）１００ｍＬで目的物を回収し、エタノール２００ｍＬを添加し、減圧濃縮した。さらに、減圧乾燥し、白色固体を得た。得られた固体に１０ｍＭのリン酸水溶液３００ｍＬを加え、懸濁させた。２Ｍのリン酸水溶液１０ｍＬを加え、１５分間攪拌した。さらに、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液１５ｍＬを加えて中和した。さらに、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液１５ｍＬを加えてアルカリ性とし、メンブレンフィルター（０．４５μｍ）でろ過した。１０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬで洗いこみ、水溶液として目的物を得た。
　得られた目的物を含有する水溶液を陰イオン交換樹脂カラムで精製した。使用した条件は下記の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
 　各フラクションを分析（ＨＰＬＣ）し、目的物を水溶液として得た。得られた水溶液に０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２２５ｍＬを添加し中和した。メンブレンフィルター（０．４５μｍ）でろ過した。次いで、下記条件で限外ろ過を行い脱塩した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
　ろ液を濃縮し、約２５０ｍＬの水溶液を得た。得られた水溶液をメンブレンフィルター（０．４５μｍ）でろ過した。得られた水溶液を凍結乾燥して、白色綿状固体として１．５ｇの目的化合物を得た。
　ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ　計算値：６９２４．８２
　測定値：６９２３．５４
［実施例２］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１
　実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
　ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ　計算値：８２９１．９６
　測定値：８２９６．２４
［実施例３］
ＰＭＯ．Ｎｏ．２
　実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
　ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ　計算値：７３１０．１３
　測定値：７３０９．２３
［実施例４］
ＰＭＯ．Ｎｏ．３
　実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
　ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ　計算値：８２７０．９４
　測定値：８２７０．５５
［実施例５］
ＰＭＯ．Ｎｏ．４
　実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）−４−オキソブタン酸（参考例３）を使用した。
　ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ　計算値：７３１０．１３
　測定値：７３１０．１７
［実施例６］
ＰＭＯ．Ｎｏ．５
　実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）−４−オキソブタン酸（参考例３）を使用した。
　ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ　計算値：８２７０．９４
　測定値：８２７０．２０
［実施例７］
ＰＭＯ．Ｎｏ．６
　実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
　ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ　計算値：５９６４．０１
　測定値：５９６３．６８
［実施例８］
ＰＭＯ．Ｎｏ．７
　実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
　ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ　計算値：６６０９．５５
　測定値：６６０８．８５
［実施例９］
ＰＭＯ．Ｎｏ．９
　実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４−オキソ−４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−オキソ−２−（２−フェノキシアセタミド）−１Ｈ−プリン−９（６Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）ブタン酸（参考例２）を使用した。
　ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ　計算値：７２８０．１１
　測定値：７２７９．４２
［実施例１０］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１０
　実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４−オキソ−４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−オキソ−２−（２−フェノキシアセタミド）−１Ｈ−プリン−９（６Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）ブタン酸（参考例２）を使用した。
　ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ　計算値：８２９５．９５
　測定値：８２９５．９１
［実施例１１］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１３
　実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料としてアミノメチルポリスチレン樹脂に担持された１，１２−ジオキソ−１−（４−トリチルピペラジン−１−イル）−２，５，８，１１−テトラオキサ−１５−ペンタデカン酸（参考例４）を使用した。
　ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ　計算値：７２７６．１５
　測定値：７２７６．６９
［実施例１２］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１４
　実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料としてアミノメチルポリスチレン樹脂に担持された１，１２−ジオキソ−１−（４−トリチルピペラジン−１−イル）−２，５，８，１１−テトラオキサ−１５−ペンタデカン酸（参考例４）を使用した。
　ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ　計算値：８６２２．２７
　測定値：８６２２．２９
［比較例１］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１１
　実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
　ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ　計算値：１０２７４．６３
　測定値：１０２７３．７１
［比較例２］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１５
　実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
　ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ　計算値：９９４１．３３
　測定値：９９４０．７７
［比較例３］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１６
　実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
　ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ　計算値：８２３８．９４
　測定値：８２３８．６９
［試験例１］
Ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ
　ＲＤ細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞株）４×１０５個に対して、ＰＭＯ　Ｎｏ．１~８の本発明のオリゴマー及びＰＭＯ　Ｎｏ．１１のアンチセンスオリゴマー１０μＭをＡｍａｘａ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　Ｋｉｔ　Ｌを用いてＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　ＩＩ（Ｌｏｎｚａ）により導入した。プログラムはＴ−０３０を用いた。
　導入後、細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（インビトロジェン社製）を含むＥａｇｌｅ′ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地（シグマ社製、以下同じ）２ｍＬ中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。細胞をＰＢＳ（ニッスイ社製、以下同じ）で２回洗浄した後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）５００μｌを細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、該溶解物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに回収した。ＩＳＯＧＥＮに添付のプロトコールに従ってｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡの濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ　ＮＤ−１０００（エル・エム・エス社製）を用いて測定した。
　抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　４００ｎｇに対し、Ｔｉｔａｎ　Ｏｎｅ　Ｔｕｂｅ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いてＯｎｅ−Ｓｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲを行った。キットに添付のプロトコールに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはＰＴＣ−１００（ＭＪ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた。用いたＲＴ−ＰＣＲのプログラムは、以下の通りである。
　５０℃、３０分間：逆転写反応
　９４℃、２分間：熱変性
　［９４℃、１０秒間；５８℃、３０秒間；６８℃、４５秒間］ｘ３０サイクル：ＰＣＲ増幅
　６８℃、７分間：ポリメラーゼの熱失活
　ＲＴ−ＰＣＲに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036
　次に、上記ＲＴ−ＰＣＲの増幅産物に対し、Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロシュ社製）を用いてｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行った。用いたＰＣＲプログラムは、以下の通りである。
　９４℃、２分間：熱変性
　［９４℃、１５秒間；５８℃、３０秒間；６８℃、４５秒間］ｘ３０サイクル：ＰＣＲ増幅
　６８℃、７分間：ポリメラーゼの熱失活
　上記ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
　上記ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲの反応産物１μｌをＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント社製）を用いて解析した。
　エクソン５３がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン５３がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を測定した。これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
　スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）ｘ１００
実験結果
　結果を図１に示す。本実験により、ＰＭＯ　Ｎｏ．１~８の本発明のオリゴマーは、いずれもＰＭＯ　Ｎｏ．１１のアンチセンスオリゴマーと比べて、著しく高い効率でエクソン５３をスキッピングさせることが判明した。特に、ＰＭＯ　Ｎｏ．３及び８の本発明のオリゴマーは、ＰＭＯ　Ｎｏ．１１のアンチセンスオリゴマーと比べて、４倍以上高いエクソンスキッピング効率を示す。
［試験例２］
ヒト線維芽細胞を用いたＩｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ
　ＺｓＧｒｅｅｎ１共発現レトロウイルスベクターによりＴＩＧ−１１９細胞（ヒト正常組織由来線維芽細胞、医薬基盤研究所）又は５０１７細胞（ヒトＤＭＤ患者由来線維芽細胞、Ｃｏｒｉｅｌｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）にヒトｍｙｏＤ遺伝子（配列番号４４）を導入した。
　４から５日間インキュベートした後に、ＦＡＣＳによりＺｓＧｒｅｅｎ陽性のＭｙｏＤ転換線維芽細胞を回収し、５×１０４個／ｃｍ２になるように１２穴プレートに播種した。増殖培地は１０％ＦＣＳ及び１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ）（シグマ　アルドリッチ社）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ−１２（ＤＭＥＭ・Ｆ−１２）（インビトロジェン社）を１ｍＬ使用した。
　２４時間後に分化培地（２％ウマ血清（インビトロジェン社）、１％Ｐ／Ｓ及びＩＴＳ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｍｅｄｉａ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（シグマ社）含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）に交換した。２、３日ごとに培地交換を行い１２から１４日間インキュベートし、筋管細胞に分化させた。
　その後、分化培地を６μＭのＥｎｄｏ−Ｐｏｒｔｅｒ（ジーンツール社）含有分化培地に交換し、終濃度１０μＭになるようにモルホリノオリゴマーを添加した。４８時間インキュベート後に、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）により、細胞からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　５０ｎｇに対し、ＱＩＡＧＥＮ　ＯｎｅＳｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｋｉｔを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。添付のプロトコールに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いた。用いたＲＴ−ＰＣＲのプログラムは、以下の通りである。
　５０℃、３０分間：逆転写反応
　９５℃、１５分間：熱変性
　［９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１分間］ｘ３５サイクル：ＰＣＲ増幅
　７２℃、７分間：ポリメラーゼの熱失活
　プライマーはｈＥＸ５１Ｆ及びｈＥＸ５５Ｒを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
　上記ＲＴ−ＰＣＲ反応の反応産物を２％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＧｅｎｅＦｌａｓｈ（Ｓｙｎｇｅｎｅ社）によりゲル写真を撮影した。Ｉｍａｇｅ　Ｊ（アメリカ国立衛生研究所製）により、エクソン５３がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン５３がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を測定した。これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
　スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）ｘ１００
実験結果
　結果を図２及び図３に示す。本実験により、ＰＭＯ　Ｎｏ．３、８及び９の本発明のオリゴマー（図２）は、ＴＩＧ−１１９細胞において、いずれもＰＭＯ　Ｎｏ．１２のアンチセンスオリゴマーと比べて、高い効率でエクソン５３をスキッピングさせることが判明した（図２）。特に、ＰＭＯ　Ｎｏ．３及び８の本発明のオリゴマーは、ＰＭＯ　Ｎｏ．１２のアンチセンスオリゴマーと比べて、２倍以上高いエクソンスキッピング効率を示す（図２）。
　また、本実験により、ＰＭＯ　Ｎｏ．３及び８~１０の本発明のオリゴマー（図３）は、５０１７細胞において、いずれもＰＭＯ　Ｎｏ．１２のアンチセンスオリゴマーと比べて、高い効率でエクソン５３をスキッピングさせることが判明した（図３）。特に、ＰＭＯ　Ｎｏ．３及び８の本発明のオリゴマーは、ＰＭＯ　Ｎｏ．１２のアンチセンスオリゴマーと比べて、７倍以上高いエクソンスキッピング効率を示す（図３）。
［試験例３］
ヒト線維芽細胞を用いたＩｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ
　エクソン４５から５２が欠失したＤＭＤ患者またはエクソン４８から５２が欠失したＤＭＤ患者の左上腕内側より生検し、皮膚線維芽細胞株（ヒトＤＭＤ患者（エクソン４５−５２またはエクソン４８−５２）由来線維芽細胞）を樹立した。ＺｓＧｒｅｅｎ１共発現レトロウイルスベクターにより線維芽細胞にヒトｍｙｏＤ遺伝子（配列番号４４）を導入した。
　４から５日間インキュベートした後に、ＦＡＣＳによりＺｓＧｒｅｅｎ陽性のＭｙｏＤ転換線維芽細胞を回収し、５×１０４個／ｃｍ２になるように１２穴プレートに播種した。増殖培地は１０％ＦＣＳ及び１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ）（シグマ　アルドリッチ社）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）（インビトロジェン社）を１ｍＬ使用した。
　２４時間後に分化培地（２％ウマ血清（インビトロジェン社）、１％Ｐ／Ｓ及びＩＴＳ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｍｅｄｉａ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（シグマ社）含有　ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）に交換した。２、３日ごとに培地交換を行い１２、１４または２０日間インキュベートし、筋管細胞に分化させた。
　その後、分化培地を６μＭのＥｎｄｏ−Ｐｏｒｔｅｒ（ジーンツール社）含有分化培地に交換し、終濃度１０μＭになるようにモルホリノオリゴマーを添加した。４８時間インキュベート後に、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）により、細胞からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　５０ｎｇに対し、ＱＩＡＧＥＮ　ＯｎｅＳｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｋｉｔを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。添付のプロトコールに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いた。用いたＲＴ−ＰＣＲのプログラムは、以下の通りである。
　５０℃、３０分間：逆転写反応
　９５℃、１５分間：熱変性
　［９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１分間］ｘ３５サイクル：ＰＣＲ増幅
　７２℃、７分間：ポリメラーゼの熱失活
プライマーはｈＥｘ４４Ｆ及びｈ５５Ｒを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
　上記ＲＴ−ＰＣＲ反応の反応産物を２％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＧｅｎｅＦｌａｓｈ（Ｓｙｎｇｅｎｅ社）によりゲル写真を撮影した。Ｉｍａｇｅ　Ｊ（アメリカ国立衛生研究所製）により、エクソン５３がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン５３がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を測定した。これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
　スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）ｘ１００
実験結果
　結果を図４及び図５に示す。本実験により、ＰＭＯ　Ｎｏ．３及び８の本発明のオリゴマーは、エクソン４５−５２欠失（図４）またはエクソン４８−５２欠失（図５）ＤＭＤ患者由来細胞において、８０％以上の高い効率でエクソン５３をスキッピングさせることが判明した。また、ＰＭＯ　Ｎｏ．３及び８の本発明のオリゴマーは、エクソン４５−５２欠失ＤＭＤ患者由来細胞において、ＰＭＯ　Ｎｏ．１５のアンチセンスオリゴマーと比較して高い効率でエクソン５３をスキッピングさせることが判明した（図４）。
［試験例４］
ウェスタンブロッティング
　ＰＭＯ　Ｎｏ．８の本発明のオリゴマーを１０μＭの濃度で細胞に添加し、７２時間後の細胞からＣｏｍｐｌｅｔｅ　Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）含有ＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）でタンパク質を抽出し、ＢＣＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）でタンパク質を定量した。ＮｕＰＡＧＥ　Ｎｏｖｅｘ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ　Ｇｅｌ３−８％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で１５０Ｖ、７５分間電気泳動、セミドライブロッターでＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）へ転写した。ＰＶＤＦ膜を５％　ＥＣＬ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）でブロッキング後、抗ジストロフィン抗体（ＮＣＬ−Ｄｙｓ１，Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社製）溶液中で膜をインキュベートした。さらに、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｇｏａｔ−ａｎｔｉｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（型番、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）溶液中でインキュベートした後、ＥＣＬ　Ｐｌｕｓ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により発色した。
免疫染色
　ＰＭＯ　Ｎｏ．３またはＮｏ．８の本発明のオリゴマーを細胞に添加し、７２時間後の細胞を３％　ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、１０分間で固定化した。１０％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで１０分間インキュベートした。１０％ヤギ血清含有ＰＢＳでブロッキング、抗ジストロフィン抗体（ＮＣＬ−Ｄｙｓ１，Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）溶液中で膜をインキュベート、さらに抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）溶液中で膜をインキュベートした。Ｐｒｏ　Ｌｏｎｇ　Ｇｏｌｄ　Ａｎｔｉｆａｄｅ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）でマウントし、蛍光顕微鏡で観察した。
実験結果
　結果を図６及び図７に示す。本実験により、ＰＭＯ　Ｎｏ．３及び８の本発明のオリゴマーはジストロフィンタンパク質の発現を誘導することがウェスタンブロッティング（図６）及び免疫染色（図７）により確認できた。
［試験例５］
ヒト線維芽細胞を用いたＩｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ
　試験例３と同様の方法で実験を行った。
実験結果
　結果を図８に示す。本実験により、ＰＭＯ　Ｎｏ．３及び８の本発明のオリゴマーは、エクソン４５−５２欠失ＤＭＤ患者由来細胞において、ＰＭＯ　Ｎｏ．１３及び１４の本発明のオリゴマーよりも高い効率でエクソン５３をスキッピングさせることが判明した（図８）。
［試験例６］
Ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ
　配列番号４９~１２３に記載の２’−Ｏ−メトキシ−ホスホロチオエート体（２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡ）のアンチセンスオリゴマーを用いて実験を行った。アッセイに用いた各種アンチセンスオリゴマーは日本バイオサービス社より購入した。各種アンチセンスオリゴマーの配列を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000043
　ＲＤ細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞株）３×１０５個を６穴プレートに播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（インビトロジェン社製）を含むＥａｇｌｅ′ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地（シグマ社製、以下同じ）２ｍＬ中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。上記のエクソン５３スキッピング用の各種アンチセンスオリゴマー（日本バイオサービス社製）（１μＭ）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社製）の複合体を作成し、１．８ｍＬで培地交換したＲＤ細胞に、２００μｌ添加し、終濃度１００ｎＭとした。
　添加後、一晩培養した。細胞をＰＢＳ（ニッスイ社製、以下同じ）で２回洗浄した後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）５００μｌを細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、該溶解物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに回収した。ＩＳＯＧＥＮに添付のプロトコールに従ってｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡの濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ　ＮＤ−１０００（エル・エム・エス社製）を用いて測定した。
　抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　４００ｎｇに対し、Ｔｉｔａｎ　Ｏｎｅ　Ｔｕｂｅ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いてＯｎｅ−Ｓｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲを行った。キットに添付のプロトコールに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはＰＴＣ−１００（ＭＪ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた。用いたＲＴ−ＰＣＲのプログラムは、以下の通りである。
　５０℃、３０分間：逆転写反応
　９４℃、２分間：熱変性
　［９４℃、１０秒間；５８℃、３０秒間；６８℃、４５秒間］ｘ３０サイクル：ＰＣＲ増幅
　６８℃、７分間：ポリメラーゼの熱失活
　ＲＴ−ＰＣＲに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000044
　次に、上記ＲＴ−ＰＣＲの増幅産物に対し、Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロシュ社製）を用いてｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行った。用いたＰＣＲプログラムは、以下の通りである。
　９４℃、２分間：熱変性
　［９４℃、１５秒間；５８℃、３０秒間；６８℃、４５秒間］ｘ３０サイクル：ＰＣＲ増幅
　６８℃、７分間：ポリメラーゼの熱失活
　上記ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045
　上記ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲの反応産物１μｌをＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント社製）を用いて解析した。
　エクソン５３がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン５３がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を測定した。これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
　スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）ｘ１００
実験結果
　結果を図９から図１７に示す。本実験により、ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３１~６１番目にアンチセンスオリゴマーを設計した場合、高い効率でエクソン５３をスキッピングさせることが判明した。
［試験例７］
　ＲＤ細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞株）３．５×１０５個に対して、アンチセンスオリゴマー０．３~３０μＭをＡｍａｘａ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　Ｋｉｔ　Ｌを用いてＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　ＩＩ（Ｌｏｎｚａ）により導入した。プログラムはＴ−０３０を用いた。
　導入後、細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（インビトロジェン社製）を含むＥａｇｌｅ′ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地（シグマ社製、以下同じ）２ｍＬ中、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で一晩培養した。細胞をＰＢＳ（ニッスイ社製、以下同じ）で２回洗浄した後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）５００μｌを細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、該溶解物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに回収した。ＩＳＯＧＥＮに添付のプロトコールに従ってｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ　ＲＡの濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ　ＮＤ−１０００（エル・エム・エス社製）を用いて測定した。
　抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　４００ｎｇに対し、ＱＩＡＧＥＮ　ＯｎｅＳｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＯｎｅ−Ｓｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲを行った。キットに添付のプロトコールに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはＰＴＣ−１００（ＭＪ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた。用いたＲＴ−ＰＣＲのプログラムは、以下の通りである。
　５０℃、３０分間：逆転写反応
　９５℃、１５分間：熱変性
　［９４℃、３０秒間；６０℃、３０秒間；７２℃、１分間］ｘ３５サイクル：ＰＣＲ増幅
　７２℃、１０分間：ポリメラーゼの熱失活
　ＲＴ−ＰＣＲに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000046
　上記ＰＣＲの反応産物１μｌをＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント社製）を用いて解析した。
　エクソン５３がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン５３がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を測定した。これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
　スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）ｘ１００
実験結果
　結果を図１８及び１９に示す。本実験により、ＰＭＯ　Ｎｏ．８の本発明のオリゴマーは、ＰＭＯ　Ｎｏ．１５及び１６のアンチセンスオリゴマーと比べて、著しく高い効率でエクソン５３をスキッピングさせることが判明した（図１８）。また、ＰＭＯ　Ｎｏ．３及び８の本発明のオリゴマーは、ＰＭＯ　Ｎｏ．１３及び１４の本発明のオリゴマーよりも著しく高い効率でエクソン５３をスキッピングさせることが判明した（図１９）。この結果から、同一配列であっても、５’末端が−ＯＨ基である方が、スキッピング効率が高いことが示される。
　試験例に示す実験結果から、本発明のオリゴマー（ＰＭＯ　Ｎｏ．１~１０）は、従来技術に係るオリゴマー（ＰＭＯ　Ｎｏ．１１、１２、１５及び１６）と比べ、いずれの細胞環境においても、著しく高い効率でエクソン５３をスキッピングさせることが示された。また、試験例２で用いた５０１７細胞は、ＤＭＤ患者から採取した細胞であり、さらに、試験例３及び５で用いた線維芽細胞もＤＭＤ患者由来のエクソン５３スキッピング対象細胞である。特に、試験例３及び５において、本発明のオリゴマーは、エクソン５３スキッピング対象となるＤＭＤ患者由来の細胞において、９０％以上のエクソン５３スキッピング効率を示すため、本発明のオリゴマーは、実際にＤＭＤ患者に投与した場合にも、高効率にエクソン５３をスキッピングさせるといえる。
　従って、本発明のオリゴマーは、ＤＭＤの治療において、非常に有用である。
　配列番号２：合成核酸
　配列番号３：合成核酸
　配列番号４：合成核酸
　配列番号５：合成核酸
　配列番号６：合成核酸
　配列番号７：合成核酸
　配列番号８：合成核酸
　配列番号９：合成核酸
　配列番号１０：合成核酸
　配列番号１１：合成核酸
　配列番号１２：合成核酸
　配列番号１３：合成核酸
　配列番号１４：合成核酸
　配列番号１５：合成核酸
　配列番号１６：合成核酸
　配列番号１７：合成核酸
　配列番号１８：合成核酸
　配列番号１９：合成核酸
　配列番号２０：合成核酸
　配列番号２１：合成核酸
　配列番号２２：合成核酸
　配列番号２３：合成核酸
　配列番号２４：合成核酸
　配列番号２５：合成核酸
　配列番号２６：合成核酸
　配列番号２７：合成核酸
　配列番号２８：合成核酸
　配列番号２９：合成核酸
　配列番号３０：合成核酸
　配列番号３１：合成核酸
　配列番号３２：合成核酸
　配列番号３３：合成核酸
　配列番号３４：合成核酸
　配列番号３５：合成核酸
　配列番号３６：合成核酸
　配列番号３７：合成核酸
　配列番号３８：合成核酸
　配列番号３９：合成核酸
　配列番号４０：合成核酸
　配列番号４１：合成核酸
　配列番号４２：合成核酸
　配列番号４３：合成核酸
　配列番号４５：合成核酸
　配列番号４６：合成核酸
　配列番号４７：合成核酸
　配列番号４８：合成核酸
　配列番号４９：合成核酸
　配列番号５０：合成核酸
　配列番号５１：合成核酸
　配列番号５２：合成核酸
　配列番号５３：合成核酸
　配列番号５４：合成核酸
　配列番号５５：合成核酸
　配列番号５６：合成核酸
　配列番号５７：合成核酸
　配列番号５８：合成核酸
　配列番号５９：合成核酸
　配列番号６０：合成核酸
　配列番号６１：合成核酸
　配列番号６２：合成核酸
　配列番号６３：合成核酸
　配列番号６４：合成核酸
　配列番号６５：合成核酸
　配列番号６６：合成核酸
　配列番号６７：合成核酸
　配列番号６８：合成核酸
　配列番号６９：合成核酸
　配列番号７０：合成核酸
　配列番号７１：合成核酸
　配列番号７２：合成核酸
　配列番号７３：合成核酸
　配列番号７４：合成核酸
　配列番号７５：合成核酸
　配列番号７６：合成核酸
　配列番号７７：合成核酸
　配列番号７８：合成核酸
　配列番号７９：合成核酸
　配列番号８０：合成核酸
　配列番号８１：合成核酸
　配列番号８２：合成核酸
　配列番号８３：合成核酸
　配列番号８４：合成核酸
　配列番号８５：合成核酸
　配列番号８６：合成核酸
　配列番号８７：合成核酸
　配列番号８８：合成核酸
　配列番号８９：合成核酸
　配列番号９０：合成核酸
　配列番号９１：合成核酸
　配列番号９２：合成核酸
　配列番号９３：合成核酸
　配列番号９４：合成核酸
　配列番号９５：合成核酸
　配列番号９６：合成核酸
　配列番号９７：合成核酸
　配列番号９８：合成核酸
　配列番号９９：合成核酸
　配列番号１００：合成核酸
　配列番号１０１：合成核酸
　配列番号１０２：合成核酸
　配列番号１０３：合成核酸
　配列番号１０４：合成核酸
　配列番号１０５：合成核酸
　配列番号１０６：合成核酸
　配列番号１０７：合成核酸
　配列番号１０８：合成核酸
　配列番号１０９：合成核酸
　配列番号１１０：合成核酸
　配列番号１１１：合成核酸
　配列番号１１２：合成核酸
　配列番号１１３：合成核酸
　配列番号１１４：合成核酸
　配列番号１１５：合成核酸
　配列番号１１６：合成核酸
　配列番号１１７：合成核酸
　配列番号１１８：合成核酸
　配列番号１１９：合成核酸
　配列番号１２０：合成核酸
　配列番号１２１：合成核酸
　配列番号１２２：合成核酸
　配列番号１２３：合成核酸
配列表

Claims (13)

  1. 　ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーであって、ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３１~５３番目、第３１~５４番目、第３１~５５番目、第３１~５６番目、第３１~５７番目、第３１~５８番目、第３２~５３番目、第３２~５４番目、第３２~５５番目、第３２~５６番目、第３２~５７番目、第３２~５８番目、第３３~５３番目、第３３~５４番目、第３３~５５番目、第３３~５６番目、第３３~５７番目、第３３~５８番目、第３４~５３番目、第３４~５４番目、第３４~５５番目、第３４~５６番目、第３４~５７番目、第３４~５８番目、第３５~５３番目、第３５~５４番目、第３５~５５番目、第３５~５６番目、第３５~５７番目、第３５~５８番目、第３６~５３番目、第３６~５４番目、第３６~５５番目、第３６~５６番目、第３６~５７番目又は第３６~５８番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つに相補的な塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー。
  2. 　オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
  3. 　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドの糖部分及び／又はリン酸結合部分が修飾されている、請求項２に記載のアンチセンスオリゴマー。
  4. 　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドの糖部分が、２’位の−ＯＨ基が、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、請求項３に記載のアンチセンスオリゴマー。
    （上記Ｒは、アルキル又はアリールを示し、上記Ｒ’は、アルキレンを示す。）
  5. 　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか１つのものである、請求項３又は４に記載のアンチセンスオリゴマー。
  6. 　モルホリノオリゴマーである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
  7. 　ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項６に記載のアンチセンスオリゴマー。
  8. 　５’末端が、下記化学式（１）~（３）のいずれかの基である、請求項６又は７に記載のアンチセンスオリゴマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
  9. 　ヒトジストロフィン遺伝子の第５３番目のエクソンの５’末端から第３２~５６番目又は第３６~５６番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなる、請求項１~８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
  10. 　配列番号２~３７からなる群より選択されるいずれか１つに示す塩基配列からなる、請求項１~８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
  11. 　配列番号１１、１７、２３、２９及び３５からなる群より選択されるいずれか１つの塩基配列からなる、請求項１~８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
  12. 　配列番号１１又は３５のいずれか１つの塩基配列からなる、請求項１~８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
  13. 　請求項１~１２のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
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