KR101310569B1

KR101310569B1 - 안티센스 핵산

Info

Publication number: KR101310569B1
Application number: KR1020137006385A
Authority: KR
Inventors: 나오키 와타나베; 요우헤이 사토우; 신이치 다케다; 데츠야 나가타
Original assignee: 도꾸리쯔교세이호징 고꾸리쯔 세이신ㆍ신께이 이료겡뀨센따; 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2010-09-01
Filing date: 2011-08-31
Publication date: 2013-09-23
Also published as: CN103154245A; US11028122B1; US20190211049A1; US10329319B2; JP6867621B1; US20130211062A1; HRP20160336T1; US20200109162A1; RS59361B1; JP2021072822A; EP2612917A1; DK3018211T3; CA2809637A1; HUE046364T2; JP6141728B2; JP2014054250A; JP2018027083A; EP3018211B1; ES2567411T3; CA2809637C

Abstract

본 발명은 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손을 고효율로 스키핑시키는 약제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 올리고머를 제공한다.

Description

안티센스 핵산{Antisense nucleic acid}

본 발명은 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머 및 그 올리고머를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.

뒤시엔느형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy; DMD)은 출생 남자 약 3,500명에 1명이 발증하는 가장 빈도가 높은 유전성 진행성 근위축증이다. 유유아기에는 정상의 인간과 거의 다름없는 운동기능을 나타내지만, 만4~5세경부터 근력 저하가 보인다. 그 후 근력 저하는 진행되어 만12세경까지 보행 불능이 되고, 20대에서 심부전 또는 호흡기 부전에 의해 사망에 이르는 심각한 질환이다. 현재, DMD에 대한 유효한 치료법은 없어, 새로운 치료약의 개발이 강하게 요구되고 있다.

DMD는 디스트로핀 유전자의 변이가 원인인 것이 알려져 있다. 디스트로핀 유전자는 X염색체에 존재하며, 220만 염기쌍의 DNA로 이루어지는 거대한 유전자이다. DNA로부터 mRNA 전구체로 전사되고, 또한 스플라이싱에 의해 인트론이 제거되어 79의 엑손이 결합한 mRNA가 합성된다. 이 mRNA로부터 3,685의 아미노산으로 번역되어, 디스트로핀 단백질이 생성된다. 디스트로핀 단백질은 근세포의 막 안정성의 유지에 관여하고 있어, 근세포를 파손되기 어렵게 하기 위해 필요하다. DMD 환자의 디스트로핀 유전자는 변이를 갖기 때문에, 근세포에 있어서 기능을 갖는 디스트로핀 단백질이 거의 발현되지 않는다. 그 때문에, DMD 환자 체내에서는, 근세포의 구조를 유지할 수 없게 되어, 다량의 칼슘 이온이 근세포 내로 흘러들어간다. 그 결과, 염증과 유사한 반응이 생겨, 섬유화가 진행되기 때문에 근세포가 재생되기 어려워진다.

베커형 근이영양증(BMD)도 디스트로핀 유전자의 변이가 원인인데, 그 증상은 근위축에 의한 근력 저하를 나타내지만 일반적으로 DMD와 비교하여 가볍고, 근력 저하의 진행도 느리며, 대부분의 경우, 성인기에 발증한다. DMD와 BMD의 임상증상의 차이는, 변이에 의해 디스트로핀의 mRNA가 디스트로핀 단백질로 번역될 때의 아미노산 리딩 프레임이 파괴되는지, 또는 유지되는지에 따른 것으로 생각되고 있다(비특허문헌 1). 즉, DMD의 경우는, 아미노산 리딩 프레임이 조금 벗어나는 변이를 가짐으로써, 기능을 갖는 디스트로핀 단백질이 거의 발현하지 않는데, BMD의 경우는 변이에 의해 엑손의 일부는 결실되어 있으나, 아미노산 리딩 프레임은 유지되어 있기 때문에 불완전하지만 기능을 갖는 디스트로핀 단백질이 생산된다.

DMD의 치료법으로서, 엑손 스키핑법이 기대되고 있다. 이 방법은, 스플라이싱을 개변함으로써 디스트로핀의 mRNA의 아미노산 리딩 프레임을 수복하여, 부분적으로 기능을 회복한 디스트로핀 단백질의 발현을 유도하는 방법이다(비특허문헌 2). 엑손 스키핑의 대상이 되는 아미노산 서열 부분은 상실되게 된다. 그 때문에 이 치료에서 발현되는 디스트로핀 단백질은 정상의 것보다 짧아지나, 아미노산 리딩 프레임이 유지되기 때문에 근세포를 안정화하는 기능이 부분적으로 유지된다. 따라서, 엑손 스키핑에 의해, DMD는, 보다 경증의 BMD와 동일한 증상을 나타내게 될 것으로 기대되고 있다. 엑손 스키핑법은, 마우스나 개에 의한 동물실험을 거쳐, 인간 DMD 환자에 대한 임상시험이 행해지고 있다.

엑손 스키핑은, 5' 또는 3' 스플라이스 부위 중 어느 하나 또는 양쪽, 또는 엑손의 내부를 표적으로 하는 안티센스 핵산의 결합에 의해 유도할 수 있다. 엑손은 양쪽의 스플라이스 부위가 이어맞추기복합체(spliceosome)에 의해 인식된 경우만 mRNA에 포함된다. 따라서, 스플라이스 부위를 안티센스 핵산으로 타겟팅함으로써, 엑손 스키핑을 유도할 수 있다. 또한, 엑손이 스플라이싱의 기구에 인식되기 위해서는 엑손 스플라이싱 인핸서(ESE)로의 SR 단백질의 결합이 필요할 것으로 생각되고 있어, ESE를 타겟팅하는 것으로도 엑손의 스키핑을 유도할 수 있다.

디스트로핀 유전자의 변이는 DMD 환자에 따라 상이하기 때문에, 유전자 변이의 장소나 종류에 따른 안티센스 핵산이 필요해진다. 지금까지, 웨스턴 오스트레일리아 대학의 Steve Wilton 등에 의해 79개 전부의 엑손에 대해 엑손 스키핑을 유도하는 안티센스 핵산이 제작되어 있고(비특허문헌 3), 네덜란드의 Annemieke Aartsma-Rus 등에 의해 39종류의 엑손에 대해 엑손 스키핑을 유도하는 안티센스 핵산이 제작되어 있다(비특허문헌 4).

전체 DMD 환자의 8% 정도는, 제53번째의 엑손(이하, 「엑손 53」이라 한다)을 스키핑함으로써 치료 가능한 것으로 생각되고 있다. 최근 들어서는, 디스트로핀 유전자의 엑손 53을 엑손 스키핑의 타겟으로 한 연구에 대해서, 복수의 연구기관으로부터 보고가 이루어져 있다(특허문헌 1~4；비특허문헌 5). 그러나, 엑손 53을 고효율로 스키핑시키는 기술은, 아직 확립되어 있지 않다.

국제공개공보 WO 2006/000057 국제공개공보 WO 2004/048570 미국 특허공개공보 US 2010/0168212 국제공개공보 WO 2010/048586

Monaco A. P. et al., Genomics 1988；2：p. 90-95 Matsuo M., Brain Dev 1996；18：p. 167-172 Wilton S. D., et al., Molecular Therapy 2007：15：p. 1288-96 Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12：S71-S77 Linda J. Poplewell et al., (2010) Neuromuscular Disorders, vol. 20, no. 2, p. 102-10

발명의 개시

상기와 같은 상황에 있어서, 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑을 강하게 유도하는 안티센스 올리고머 및 그의 올리고머를 포함하는 근이영양증 치료약이 요망되고 있다.

본 발명자들은, 디스트로핀 유전자의 구조를 상세히 연구한 결과, 디스트로핀 유전자의 mRNA 전구체(이하, 「pre-mRNA」라 한다) 중 엑손 53의 5' 말단으로부터 제32~56번째 주변의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열을 안티센스 올리고머로 타겟팅함으로써, 고효율로 엑손 53의 스키핑을 유도할 수 있는 것을 발견하였다. 본 발명자들은, 이 지견(知見)을 토대로, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은, 다음과 같다.

[1]　인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머로서, 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손의 5' 말단으로부터 제31~53번째, 제31~54번째, 제31~55번째, 제31~56번째, 제31~57번째, 제31~58번째, 제32~53번째, 제32~54번째, 제32~55번째, 제32~56번째, 제32~57번째, 제32~58번째, 제33~53번째, 제33~54번째, 제33~55번째, 제33~56번째, 제33~57번째, 제33~58번째, 제34~53번째, 제34~54번째, 제34~55번째, 제34~56번째, 제34~57번째, 제34~58번째, 제35~53번째, 제35~54번째, 제35~55번째, 제35~56번째, 제35~57번째, 제35~58번째, 제36~53번째, 제36~54번째, 제36~55번째, 제36~56번째, 제36~57번째 또는 제36~58번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.

[2]　올리고뉴클레오티드인, 상기 [1]에 기재된 안티센스 올리고머.

[3]　상기 올리고뉴클레오티드를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 당부분 및/또는 인산 결합부분이 수식되어 있는, 상기 [2]에 기재된 안티센스 올리고머.

[4] 상기 올리고뉴클레오티드를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 당부분이, 2' 위치의 -OH기가, OR, R, R'OR, SH, SR, NH₂, NHR, NR₂, N₃, CN, F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 기로 치환된 리보오스인, 상기 [3]에 기재된 안티센스 올리고머.

(상기 R은 알킬 또는 아릴을 나타내고, 상기 R'는 알킬렌을 나타낸다.)

[5]　상기 올리고뉴클레오티드를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 인산 결합부분이, 포스포로티오에이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합, 알킬포스포네이트 결합, 포스포로아미데이트 결합, 및 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 것인, 상기 [3] 또는 [4]에 기재된 안티센스 올리고머.

[6]　모르폴리노 올리고머인, 상기 [1]에 기재된 안티센스 올리고머.

[7]　포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머인, 상기 [6]에 기재된 안티센스 올리고머.

[8]　5' 말단이, 하기 화학식 1~3 중 어느 하나의 기인, 상기 [1]~[7] 중 어느 한 항에 기재된 안티센스 올리고머.

[9]　인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손의 5' 말단으로부터 제32~56번째 또는 제36~56번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는, 상기 [1]~[8] 중 어느 한 항에 기재된 안티센스 올리고머.

[10] 서열번호 2~37로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, 상기 [1]~[8] 중 어느 한 항에 기재된 안티센스 올리고머.

[11] 서열번호 11, 17, 23, 29 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, 상기 [1]~[8] 중 어느 한 항에 기재된 안티센스 올리고머.

[12] 서열번호 11 또는 35 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, 상기 [1]~[8] 중 어느 한 항에 기재된 안티센스 올리고머.

[13] 상기 [1]~[12] 중 어느 한 항에 기재된 안티센스 올리고머, 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물을 유효성분으로 하는, 근이영양증(muscular dystrophy) 치료용 의약 조성물.

본 발명의 안티센스 올리고머에 의해, 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑을 고효율로 유도하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 의약 조성물을 투여함으로써, 뒤시엔느형 근이영양증의 증상을, 효과적으로 경감할 수 있다.

도 1은 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자엑손 53의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 2는 인간 정상 조직 유래 섬유아세포(TIG-119세포)에 인간 myoD 유전자를 도입하여 근육세포로 분화 유도한 세포에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 3은 인간 DMD 환자 유래 섬유아세포(5017세포)에 인간 myoD 유전자를 도입하여 근육세포로 분화 유도한 세포에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 4는 인간 DMD 환자(엑손 45-52 결실) 유래 섬유아세포에 인간 myoD 유전자를 도입하여 근육세포로 분화 유도한 세포에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 5는 인간 DMD 환자(엑손 48-52 결실) 유래 섬유아세포에 인간 myoD 유전자를 도입하여 근육세포로 분화 유도한 세포에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 6은 인간 DMD 환자(엑손 48-52 결실) 유래 섬유아세포에 인간 myoD 유전자를 도입하여 근육세포로 분화 유도한 세포에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 7은 인간 DMD 환자(엑손 45-52 결실 또는 엑손 48-52 결실) 유래 섬유아세포에 인간 myoD 유전자를 도입하여 근육세포로 분화 유도한 세포에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 8은 인간 DMD 환자(엑손 45-52 결실) 유래 섬유아세포에 인간 myoD 유전자를 도입하여 근육세포로 분화 유도한 세포에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 9는 인간 횡문근육종 세포(RD세포)에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율(2'-OMe-S-RNA)을 나타내는 도면이다.
도 10은 인간 횡문근육종 세포(RD세포)에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율(2'-OMe-S-RNA)을 나타내는 도면이다.
도 11은 인간 횡문근육종 세포(RD세포)에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율(2'-OMe-S-RNA)을 나타내는 도면이다.
도 12는 인간 횡문근육종 세포(RD세포)에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율(2'-OMe-S-RNA)을 나타내는 도면이다.
도 13은 인간 횡문근육종 세포(RD세포)에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율(2'-OMe-S-RNA)을 나타내는 도면이다.
도 14의 인간 횡문근육종 세포(RD세포)에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율(2'-OMe-S-RNA)을 나타내는 도면이다.
도 15는 인간 횡문근육종 세포(RD세포)에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율(2'-OMe-S-RNA)을 나타내는 도면이다.
도 16은 인간 횡문근육종 세포(RD세포)에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율(2'-OMe-S-RNA)을 나타내는 도면이다.
도 17은 인간 횡문근육종 세포(RD세포)에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑 효율(2'-OMe-S-RNA)을 나타내는 도면이다.
도 18은 인간 횡문근육종 세포(RD세포)에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 올리고머 농도별 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 19는 인간 횡문근육종 세포(RD세포)에 있어서의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 올리고머 농도별 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 다음의 실시형태는, 본 발명을 설명하기 위한 예시로, 본 발명을 이 실시형태로만 한정하는 취지는 아니다. 본 발명은, 그 요지를 벗어나지 않는 한, 다양한 형태로 실시할 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 인용한 모든 문헌, 및 공개공보, 특허공보, 기타 특허문헌은, 참조로써 본 명세서에 포함하는 것으로 한다. 또한, 본 명세서는, 2010년 9월 1일에 출원된 본원 우선권주장의 기초가 되는 일본국 특허출원(제2010-196032호)의 명세서 및 도면에 기재된 내용을 포함한다.

1. 안티센스 올리고머

본 발명은, 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머로서, 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손의 5' 말단으로부터 제31~53번째, 제31~54번째, 제31~55번째, 제31~56번째, 제31~57번째, 제31~58번째, 제32~53번째, 제32~54번째, 제32~55번째, 제32~56번째, 제32~57번째, 제32~58번째, 제33~53번째, 제33~54번째, 제33~55번째, 제33~56번째, 제33~57번째, 제33~58번째, 제34~53번째, 제34~54번째, 제34~55번째, 제34~56번째, 제34~57번째, 제34~58번째, 제35~53번째, 제35~54번째, 제35~55번째, 제35~56번째, 제35~57번째, 제35~58번째, 제36~53번째, 제36~54번째, 제36~55번째, 제36~56번째, 제36~57번째 또는 제36~58번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열(이하, 「표적 서열」이라고도 한다.) 중 어느 하나에 상보적인 염기서열로 이루어지는, 안티센스 올리고머(이하, 「본 발명의 올리고머」라 한다)를 제공한다.

[인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손]

본 발명에 있어서, 「유전자」에는, 게놈 유전자 이외에, cDNA, mRNA 전구체 및 mRNA도 포함된다. 바람직하게는, 유전자는 mRNA 전구체, 즉, pre-mRNA이다.

인간 게놈에 있어서, 인간 디스트로핀 유전자는 유전자좌 Xp21.2에 존재한다. 인간 디스트로핀 유전자는, 3.0 Mbp의 사이즈를 가지고 있어, 주지의 인간 유전자로서는 최대의 유전자이다. 단, 인간 디스트로핀 유전자의 코드영역은 불과 14 kb에 불과하여, 그 코드영역은 79개의 엑손으로서 디스트로핀 유전자 내에 분산되어 있다(Roberts, RG., et al., Genomics, 16：536-538(1993)). 인간 디스트로핀 유전자의 전사물인 pre-mRNA는, 스플라이싱을 받아 14 kb의 성숙 mRNA를 생성한다. 인간의 야생형 디스트로핀 유전자의 염기서열은 공지이다(GenBank　Accession No.NM_004006).

인간의 야생형 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 염기서열을 서열번호 1에 나타낸다.

본 발명의 올리고머는, 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑에 의해, DMD형 디스트로핀 유전자로 코드되는 단백질을, BMD형 디스트로핀 단백질로 개변하는 것을 목적으로 제작된 것이다. 따라서, 본 발명의 올리고머의 엑손 스키핑의 대상이 되는 디스트로핀 유전자의 엑손 53에는, 야생형뿐 아니라 변이형도 포함된다.

변이형의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53은, 구체적으로는, 아래의 (a) 또는 (b)에 기재된 폴뉴클레오티드이다.

(a) 서열번호 1의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드；

(b) 서열번호 1의 염기서열에 대해, 90% 이상의 동일성을 갖는 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드

본 명세서 중, 「폴리뉴클레오티드」란 DNA 또는 RNA를 의미한다.

본 명세서 중, 「스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드」란, 예를 들면, 서열번호 1의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 프로브로 하여, 콜로니 하이브리다이제이션법, 플라크 하이브리다이제이션법 또는 서던 하이브리다이제이션법 등을 사용함으로써 얻어지는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 하이브리다이제이션의 방법으로서는, 예를 들면, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001" 및 "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Jogn Wiley & Sons 1987-1997" 등에 기재되어 있는 방법을 이용할 수 있다.

본 명세서 중, 「상보적인 염기서열」이란, 대상이 되는 염기서열과 왓슨·크릭쌍(Watson-Crick pairing)을 형성하는 염기서열에 한정되지 않고, 동요염기쌍(Wobble base pair)을 형성하는 염기서열도 포함한다. 여기서, 왓슨·크릭쌍이란, 아데닌-티민, 아데닌-우라실 및 구아닌-시토신 간에 수소결합이 형성되는 염기쌍을 의미하고, 동요염기쌍이란, 구아닌-우라실, 이노신-우라실, 이노신-아데닌 및 이노신-시토신 간에 수소결합이 형성되는 염기쌍을 의미한다. 또한, 「상보적인 염기서열」이란, 대상이 되는 염기서열과 100%의 상보성을 가지고 있지 않아도 되고, 예를 들면, 대상이 되는 염기서열에 대해, 1~3개, 1~2개 또는 1개의 비상보적 염기가 포함되어 있어도 된다.

본 명세서 중, 「스트린젠트한 조건」이란, 저스트린젠트한 조건, 중스트린젠트한 조건 및 고스트린젠트한 조건 중 어느 것이어도 된다. 「저스트린젠트한 조건」은, 예를 들면, 5×SSC, 5×덴하르트용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 32℃의 조건이다. 또한, 「중스트린젠트한 조건」은, 예를 들면, 5×SSC, 5×덴하르트용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 42℃ 또는 5×SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 50% 포름아미드, 42℃의 조건이다. 「고스트린젠트한 조건」은, 예를 들면, 5×SSC, 5×덴하르트용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 50℃ 또는 0.2×SSC, 0.1% SDS, 65℃의 조건이다. 이들 조건에 있어서, 온도를 올릴수록 높은 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 효율적으로 얻어지는 것을 기대할 수 있다. 단, 하이브리다이제이션의 스트린젠시에 영향을 미치는 요소로서는 온도, 프로브 농도, 프로브의 길이, 이온 강도, 시간, 염농도 등의 복수의 요소를 생각할 수 있고, 당업자라면 이들 요소를 적절히 선택함으로써 동일한 스트린젠시를 실현하는 것이 가능하다.

또한, 하이브리다이제이션에 시판의 키트를 사용하는 경우는, 예를 들면 Alkphos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare)을 사용할 수 있다. 이 경우는, 키트에 첨부된 프로토콜에 따라, 표지된 프로브와의 인큐베이션을 하룻밤 행한 후, 멤브레인을 55℃의 조건하에서 0.1%(w/v) SDS를 포함하는 1차 세정 버퍼로 세정 후, 하이브리다이즈한 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있다. 또는, 서열번호 1의 염기서열과 상보적인 염기서열의 전부 또는 일부를 토대로 프로브를 제작할 때, 시판의 시약(예를 들면, PCR 라벨링 믹스(로슈·다이어그노스틱스사) 등)을 사용하여 그 프로브를 디곡시게닌(DIG) 라벨한 경우에는, DIG 핵산 검출 키트(로슈·다이어그노스틱스사)를 사용하여 하이브리다이제이션을 검출할 수 있다.

상기 하이브리다이즈 가능한 폴리뉴클레오티드 이외의 폴리뉴클레오티드로서는, 상동성 검색 소프트웨어인 BLAST에 의해, 디폴트의 파라미터를 사용하여 계산했을 때, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.

또한, 염기서열의 동일성은, 칼린 및 알츄얼에 의한 알고리즘 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990；Proc Natl Acad Sci USA 90：5873, 1993)를 사용하여 결정할 수 있다. BLAST의 알고리즘을 토대로 한 BLASTN이나 BLASTX로 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul SF, et al：J Mol Biol 215：403, 1990). BLASTN을 사용하여 염기서열을 해석하는 경우는, 파라미터는, 예를 들면 score=100, Wordlength=12로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다.

엑손 53의 5' 말단으로부터 제31~53번째, 제31~54번째, 제31~55번째, 제31~56번째, 제31~57번째, 제31~58번째, 제32~53번째, 제32~54번째, 제32~55번째, 제32~56번째, 제32~57번째, 제32~58번째, 제33~53번째, 제33~54번째, 제33~55번째, 제33~56번째, 제33~57번째, 제33~58번째, 제34~53번째, 제34~54번째, 제34~55번째, 제34~56번째, 제34~57번째, 제34~58번째, 제35~53번째, 제35~54번째, 제35~55번째, 제35~56번째, 제35~57번째, 제35~58번째, 제36~53번째, 제36~54번째, 제36~55번째, 제36~56번째, 제36~57번째 및 제36~58번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열의 예를 아래의 표에 나타낸다.

본 발명의 올리고머는, 바람직하게는, 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손의 5' 말단으로부터 제32~56번째, 제33~56번째, 제34~56번째, 제35~56번째 또는 제36~56번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열(예를 들면, 서열번호 11, 서열번호 17, 서열번호 23, 서열번호 29 또는 서열번호 35)로 이루어진다.

바람직하게는, 본 발명의 올리고머는, 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손의 5' 말단으로부터 제32~56번째 또는 제36~56번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열(예를 들면, 서열번호 11 또는 서열번호 35)로 이루어지는 것이다.

「인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손의 스키핑을 가능하게 하는」이란, 인간 디스트로핀 유전자의 전사물(예를 들면, pre-mRNA)의 엑손 53에 상당하는 부위에 본 발명의 올리고머가 결합함으로써, 그 전사물이 스플라이싱을 받았을 때, 예를 들면 엑손 52가 결실된 DMD 환자의 경우, 엑손 51의 3' 말단에 상당하는 염기서열의 3'측에 엑손 54의 5' 말단에 상당하는 염기서열이 연결되어, 코돈의 프레임 시프트가 일어나지 않은 성숙 mRNA가 형성되는 것을 의미한다.

따라서, 본 발명의 올리고머는, 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑을 가능하게 하는 한, 타겟 서열에 대해 100% 상보적인 염기서열을 가지고 있지 않아도 된다. 예를 들면, 본 발명의 올리고머에는, 타겟 서열에 대해, 1~3개, 1~2개 또는 1개의 비상보적 염기가 포함되어 있어도 된다.

여기서, 상기 「결합」은, 본 발명의 올리고머와 인간 디스트로핀 유전자의 전사물을 혼합한 경우에, 생리적 조건하에서 양자가 하이브리다이즈하여 이중가닥을 형성하는 것을 의미한다. 상기 「생리적 조건하」란, 생체 내와 유사한 pH, 염 조성, 온도로 조절된 조건을 의미한다. 예를 들면, 25~40℃, 바람직하게는 37℃, pH 5~8, 바람직하게는 pH 7.4이며, 염화나트륨 농도가 150 mM인 조건을 들 수 있다.

인간 디스트로핀 유전자의 엑손 53의 스키핑의 생성 여부는, 디스트로핀 발현세포(예를 들면, 인간 횡문근육종 세포)에 본 발명의 올리고머를 도입하고, 상기 디스트로핀 발현세포의 total RNA로부터, 인간 디스트로핀 유전자의 mRNA의 엑손 53의 주변영역을 RT-PCR 증폭하고, 그 PCR 증폭산물에 대해 nested PCR 또는 시퀀스 해석을 행함으로써 확인할 수 있다.

스키핑 효율은, 인간 디스트로핀 유전자의 mRNA를 피검세포로부터 회수하여, 그 mRNA 중, 엑손 53이 스킵한 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「A」와, 엑손 53이 스킵하지 않은 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「B」를 측정하고, 이들 「A」 및 「B」의 측정값을 토대로, 아래의 식에 따라 계산할 수 있다.

본 발명의 올리고머로서는, 예를 들면, 18~28 염기의 길이를 갖는, 올리고뉴클레오티드, 모르폴리노 올리고머, 또는 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid：PNA) 올리고머를 들 수 있다. 21~25 염기의 길이가 바람직하고, 모르폴리노 올리고머가 바람직하다.

상기 올리고뉴클레오티드(이하, 「본 발명의 올리고뉴클레오티드」라 한다)는, 뉴클레오티드를 구성 단위로 하는 본 발명의 올리고머로, 이러한 뉴클레오티드는, 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 수식 뉴클레오티드 중 어느 것이어도 된다.

수식 뉴클레오티드란, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 구성하는 핵산 염기, 당부분 및 인산 결합부분의 전부 또는 일부가 수식되어 있는 것을 말한다.

핵산 염기로서는, 예를 들면, 아데닌, 구아닌, 히포크산틴, 시토신, 티민, 우라실 또는 그들의 수식 염기를 들 수 있다. 이러한 수식 염기로서는, 예를 들면, 슈도우라실, 3-메틸우라실, 디히드로우라실, 5-알킬시토신(예를 들면, 5-메틸시토신), 5-알킬우라실(예를 들면, 5-에틸우라실), 5-할로우라실(5-브로모우라실), 6-아자피리미딘, 6-알킬피리미딘(6-메틸우라실), 2-티오우라실, 4-티오우라실, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록시메틸)우라실, 5'-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 1-메틸아데닌, 1-메틸히포크산틴, 2,2-디메틸구아닌, 3-메틸시토신, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메틸카르보닐메틸우라실, 5-메틸옥시우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시초산, 2-티오시토신, 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이소구아닌, 인돌, 이미다졸, 크산틴 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.

당부분의 수식으로서는, 예를 들면, 리보오스의 2' 위치의 수식 및 당의 기타 부분의 수식을 들 수 있다. 리보오스의 2' 위치의 수식로서는, 예를 들면, 리보오스의 2' 위치의 -OH기를 OR, R, R'OR, SH, SR, NH₂, NMR, NR₂, N₃, CN, F, Cl, Br, I로 치환하는 수식을 들 수 있다. 여기서, R은 알킬 또는 아릴을 나타낸다. R'는 알킬렌을 나타낸다.

당의 기타 부분의 수식으로서는, 예를 들면, 리보오스 또는 데옥시리보오스의 4' 위치의 O를 S로 치환한 것, 당의 2' 위치와 4' 위치를 가교한 것, 예를 들면, LNA(Locked Nucleic Acid) 또는 ENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids) 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.

인산 결합부분의 수식으로서는, 예를 들면, 포스포디에스테르 결합을 포스포로티오에이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합, 알킬포스포네이트 결합, 포스포로아미데이트 결합, 보라노포스페이트 결합(Enya et al：Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154-9160)으로 치환하는 수식을 들 수 있다(예를 들면, 특허 재공표공보 제2006/129594호 및 제2006/038608호를 참조).

알킬로서는, 직쇄상 또는 분지쇄상의 탄소수 1~6의 알킬이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸, n-헥실, 이소헥실을 들 수 있다. 당해 알킬은 치환되어 있어도 되고, 이러한 치환기로서는, 예를 들면, 할로겐, 알콕시, 시아노, 니트로를 들 수 있으며, 이들이 1~3개 치환되어 있어도 된다.

시클로알킬로서는, 탄소수 5~12의 시클로알킬이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 시클로데실, 시클로도데실을 들 수 있다.

할로겐으로서는, 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다.

알콕시로서는, 직쇄상 또는 분지쇄상의 탄소수 1~6의 알콕시, 예를 들면, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, n-펜틸옥시, 이소펜틸옥시, n-헥실옥시, 이소헥실옥시 등을 들 수 있다. 특히, 탄소수 1~3의 알콕시가 바람직하다.

아릴로서는, 탄소수 6~10의 아릴이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면, 페닐, α-나프틸, β-나프틸을 들 수 있다. 특히 페닐이 바람직하다. 당해 아릴은 치환되어 있어도 되고, 이러한 치환기로서는, 예를 들면, 알킬, 할로겐, 알콕시, 시아노, 니트로를 들 수 있으며, 이들이 1~3개 치환되어 있어도 된다.

알킬렌으로서는, 직쇄상 또는 분지쇄상의 탄소수 1~6의 알킬렌이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면, 메틸렌, 에틸렌, 트리메틸렌, 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌, 2-(에틸)트리메틸렌, 1-(메틸)테트라메틸렌을 들 수 있다.

아실로서는, 직쇄상 또는 분지쇄상의 알카노일, 또는 알로일을 들 수 있다. 알카노일로서는, 예를 들면, 포르밀, 아세틸, 2-메틸아세틸, 2,2-디메틸아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 펜타노일, 2,2-디메틸프로피오닐, 헥사노일 등을 들 수 있다. 알로일로서는, 예를 들면, 벤조일, 톨루오일, 나프토일을 들 수 있다. 이러한 알로일은 치환 가능한 위치에서 치환되어 있어도 되고, 알킬로 치환되어 있어도 된다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 바람직하게는, 리보오스의 2' 위치의 -OH기가 메톡시로 치환되고, 인산 결합부분이 포스포로티오에이트 결합인, 하기 화학식으로 표시되는 기를 구성 단위로 하는 본 발명의 올리고머이다.

(식 중, Base는 핵산 염기를 나타낸다.)

본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 각종 자동 합성장치(예를 들면, AKATA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare))를 사용하여 용이하게 합성하는 것이 가능하고, 또는, 제3자 기관(예를 들면, Promega사 또는 Takara사) 등에 위탁하여 제작하는 것도 가능하다.

본 발명의 모르폴리노 올리고머는, 하기 화학식으로 표시되는 기를 구성 단위로 하는 본 발명의 올리고머이다.

(식 중, Base는 상기와 동일한 정의이고；

W는 다음 중 어느 하나의 식으로 나타내어지는 기를 나타낸다.

(식 중, X는 -CH₂R¹, -O-CH₂R¹, -S-CH₂R¹, -NR₂R³ 또는 F를 나타내고；

R¹은 H, 알킬을 나타내며；

R² 및 R³는 동일 또는 상이하여 H, 알킬, 시클로알킬, 또는, 아릴을 나타내고；

Y₁은 O, S, CH₂ 또는 NR¹을 나타내며；

Y₂는 O, S 또는 NR¹을 나타내고；

Z는 O 또는 S를 나타낸다.))

모르폴리노 올리고머는, 바람직하게는, 이하의 식으로 표시되는 기를 구성 단위로 하는 올리고머(포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(이하, 「PMO」이라 한다))이다.

(식 중, Base, R², R³는 상기와 동일한 정의이다.)

모르폴리노 올리고머는, 예를 들면, 국제공개공보 제1991/009033호, 또는 국제공개공보 제2009/064471호에 따라 제조할 수 있다. 특히, PMO는 국제공개공보 제2009/064471호에 기재된 방법에 따라 제조하거나, 또는 아래에 나타내는 방법에 따라 제조할 수 있다.

[PMO의 제법]

PMO의 하나의 태양으로서, 예를 들면, 다음의 화학식 I으로 표시되는 화합물(이하, PMO(I)이라 한다)를 들 수 있다.

[식 중, 각 Base, R², R³는 상기와 동일한 정의이고；

n은 1~99의 범위 내에 있는 임의의 정수이며, 바람직하게는, 18~28의 범위 내에 있는 임의의 정수이다.]

PMO(I)은, 공지의 방법에 따라 제조할 수 있는데, 예를 들면, 하기 공정의 조작을 실시함으로써 조제할 수 있다.

하기 공정에 사용되고 있는 화합물 및 시약은, PMO의 제조에 일반적으로 사용되고 이는 것이라면 특별히 한정되지 않는다.

또한, 하기의 모든 공정은, 액상법 또는 고상법(매뉴얼 또는 시판의 고상 자동합성기를 사용한다)으로 실시할 수 있다. 고상법으로 PMO를 제조하는 경우, 조작 절차의 간편화 및 합성의 정확성 관점에서 자동합성기를 사용하는 방법이 바람직하다.

(1) 공정 A：

다음의 화학식 II로 표시되는 화합물(이하, 화합물(II)라 한다)에 산을 작용시킴으로써, 다음의 화학식 III로 표시되는 화합물(이하, 화합물(III)라 한다.)을 제조하는 공정.

[식 중, n, R², R³는 상기와 동일한 정의이고；

각 B^P는 독립적으로 보호되어 있어도 되는 핵산 염기를 나타내며；

T는 트리틸기, 모노메톡시트리틸기, 또는 디메톡시트리틸기를 나타내고；

L은 수소, 아실, 또는 다음의 화학식 IV로 표시되는 기(이하, 기(IV)라 한다.)를 나타낸다. ]

B^P에 관계되는 「핵산 염기」로서는, Base와 동일한 「핵산 염기」를 들 수 있다. 단, B^P에 관계되는 핵산 염기의 아미노기 또는 수산기는 보호되어 있어도 된다.

이러한 아미노기의 보호기로서는, 핵산의 보호기로서 사용되는 것이라면 특별히 제한되지 않고, 구체적으로는, 예를 들면, 벤조일, 4-메톡시벤조일, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 페닐아세틸, 페녹시아세틸, 4-tert-부틸페녹시아세틸, 4-이소프로필페녹시아세틸, (디메틸아미노)메틸렌을 들 수 있다. 수산기의 보호기로서는, 예를 들면, 2-시아노에틸, 4-니트로페네틸, 페닐설포닐에틸, 메틸설포닐에틸, 트리메틸실릴에틸, 치환 가능한 임의의 위치에서 1~5개의 전자 흡인성기로 치환되어 있어도 되는 페닐, 디페닐카르바모일, 디메틸카르바모일, 디에틸카르바모일, 메틸페닐카르바모일, 1-피롤리디닐카르바모일, 모르폴리노카르바모일, 4-(tert-부틸카르복시)벤질, 4-[(디메틸아미노)카르복시]벤질, 4-(페닐카르복시)벤질을 들 수 있다(예를 들면, 국제공개공보 제2009/064471호 공보 참조).

「고상 담체」로서는, 핵산의 고상반응에 사용 가능한 담체라면 특별히 제한되지 않는데, 예를 들면, (i) 모르폴리노 핵산 유도체의 합성에 사용 가능한 시약(예를 들면, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 테트라졸, N-메틸이미다졸, 피리딘, 무수 초산, 루티딘, 트리플루오로초산)에 거의 용해되지 않고, (ii) 모르폴리노 핵산 유도체의 합성에 사용 가능한 시약에 대해 화학적으로 안정하며, (iii) 화학 수식 가능하고, (iv) 바람직한 모르폴리노 핵산 유도체의 장전이 가능하며, (v) 처리 중에 가해지는 고압에 견디는 충분한 강도를 갖고, (vi) 일정 입경 범위와 분포인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 팽윤성 폴리스티렌(예를 들면, 아미노메틸폴리스티렌 수지 1% 디벤질벤젠 가교(200~400 메시)(2.4~3.0 mmol/g)(도쿄 화성사 제조), Aminomethylated Polystyrene Resin·HCl[디벤질벤젠 1%, 100~200 메시](펩티드 연구소사 제조)), 비팽윤성 폴리스티렌(예를 들면, Primer Support(GE Healthcare사 제조)), PEG 사슬 결합형 폴리스티렌(예를 들면, NH₂-PEG resin(와타나베 화학사 제조), TentaGel resin), 정공 유리(controlled pore glass；CPG)(예를 들면, CPG사 제조), 옥살릴화 정공 유리(예를 들면, Alul 등, Nucleic Acids Research, Vol. 19, 1527(1991)을 참조), TentaGel 지지체-아미노폴리에틸렌글리콜 유도체화 지지체(예를 들면, Wright 등, Tetrahedron Letters, Vol.34, 3373(1993)을 참조), Poros-폴리스티렌/디비닐벤젠의 코폴리머를 들 수 있다.

「링커」로서는, 통상 핵산이나 모르폴리노 핵산 유도체를 연결하기 위해 사용되는 공지의 것을 사용할 수 있는데, 예를 들면, 3-아미노프로필, 숙시닐, 2,2'-디에탄올설포닐, 장쇄 알킬 아미노(LCAA)를 들 수 있다.

본 공정은, 화합물(II)에 산을 작용시킴으로써 실시할 수 있다.

본 공정에 사용 가능한 「산」으로서는, 예를 들면, 트리플루오로초산, 디클로로초산 또는 트리클로로초산을 들 수 있다. 산의 사용량으로서는, 예를 들면, 화합물(II) 1몰에 대해 0.1몰 당량~1000몰 당량의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 1몰 당량~100몰 당량의 범위 내이다.

또한, 상기 산과 함께, 유기 아민을 사용할 수 있다. 유기 아민으로서는, 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들면, 트리에틸아민을 들 수 있다. 유기 아민의 사용량은, 예를 들면, 산 1몰에 대해, 0.01몰 당량~10몰 당량의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는, 0.1몰 당량~2몰 당량의 범위 내이다.

본 공정에 있어서 산과 유기 아민의 염 또는 혼합물을 사용하는 경우에는, 예를 들면, 트리플루오로초산과 트리에틸아민의 염 또는 혼합물을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 트리플루오로초산 2 당량에 대해 트리에틸아민 1 당량을 혼합한 것을 들 수 있다.

본 공정에 사용 가능한 산은, 0.1%~30%의 범위 내의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석해서 사용하는 것도 가능하다. 용매로서는, 반응에 관여하지 않는다면 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 알코올류(에탄올, 이소프로판올, 트리플루오로에탄올 등), 물 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.

상기 반응에 있어서의 반응온도는, 예를 들면, 10℃~50℃의 범위 내가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20℃~40℃의 범위 내이며, 더욱 바람직하게는 25℃~35℃의 범위 내이다.

반응시간은 사용하는 산의 종류, 반응온도에 따라 상이하나, 통상 0.1분~24시간의 범위 내가 적당하다. 바람직하게는, 1분~5시간의 범위 내이다.

또한, 본 공정이 종료된 후, 필요에 따라, 계(系) 중에 존재하는 산을 중화하기 위해 염기를 첨가할 수 있다. 「염기」로서는 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 디이소프로필아민을 들 수 있다. 염기는 0.1%(v/v)~30%(v/v) 범위 내의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용하는 것도 가능하다.

본 공정에 사용하는 용매로서는, 반응에 관여하지 않는다면 특별히 한정되지 않으나, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 알코올류(에탄올, 이소프로판올, 트리플루오로에탄올 등), 물 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다. 반응온도는, 예를 들면, 10℃~50℃의 범위 내가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20℃~40℃의 범위 내이며, 더욱 바람직하게는 25℃~35℃의 범위 내이다.

반응시간은, 사용하는 염기의 종류, 반응온도에 따라 상이하나, 통상 0.1분~24시간의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 1분~5시간의 범위 내이다.

또한, 화합물(II)에 있어서, n=1이고, L이 기(IV)인, 다음의 화학식 IIa로 표시되는 화합물(이하, 화합물(IIa)라 한다)은, 다음의 방법에 따라 제조할 수 있다.

[식 중, B^P, T, 링커, 고상 담체는 상기와 동일한 정의이다.]

공정 1：

다음의 화학식 V로 표시되는 화합물에 아실화제를 작용시킴으로써, 다음의 화학식 VI로 표시되는 화합물(이하, 화합물(VI)라 한다.)을 제조하는 공정.

[식 중, B^P, T, 링커는 상기와 동일한 정의이고；

R⁴는 수산기, 할로겐, 또는, 아미노를 나타낸다.]

본 공정은, 화합물(V)를 출발원료로 하여, 공지의 링커의 도입 반응에 의해 실시할 수 있다.

특히, 다음의 화학식 VIa로 표시되는 화합물은, 화합물(V)와 무수 숙신산을 사용하여 에스테르화 반응으로서 알려진 방법을 실시함으로써 제조할 수 있다.

[식 중, B^P, T는 상기와 동일한 정의이다.]

공정 2：

화합물(VI)에 축합제 등을 작용시킴으로써, 고상 담체와 반응시켜, 화합물(IIa)를 제조하는 공정.

[식 중, B^P, R⁴, T, 링커, 고상 담체는 상기와 동일한 정의이다.]

본 공정은, 화합물(VI)와 고상 담체를 사용하여 축합 반응으로서 알려진 방법에 의해 제조할 수 있다.

화합물(II)에 있어서, n=2~99이고, L이 기(IV)인, 다음의 화학식 IIa2로 표시되는 화합물은, 화합물(IIa)를 출발 원료로 하여, 본 명세서에 기재된 PMO의 제법에 관계되는 공정 A 및 공정 B를 목적하는 횟수 반복하여 실시함으로써 제조할 수 있다.

[식 중, B^P, R², R³, T, 링커, 고상 담체는 상기와 동일한 정의이고；

n'는, 1~98을 나타낸다.]

또한, 화합물(II)에 있어서, n=1이고, L이 수소인, 다음의 화학식 IIb로 표시되는 화합물은, 예를 들면, 국제공개공보 제1991/009033호에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다.

[식 중, B^P, T는 상기와 동일한 정의이다.]

화합물(II)에 있어서, n=2~99이고, L이 수소인, 다음의 화학식 IIb2로 표시되는 화합물은, 화합물(IIb)를 출발 원료로 하여, 본 명세서에 기재된 PMO의 제법에 관계되는 공정 A 및 공정 B를 목적하는 횟수 반복해서 실시함으로써 제조할 수 있다.

[식 중, B^P, n', R², R³, T는 상기와 동일한 정의이다.]

또한, 화합물(II)에 있어서, n=1이고, L이 아실인, 다음의 화학식 IIc로 표시되는 화합물은, 화합물(IIb)에 대해 아실화 반응으로서 알려진 방법을 실시함으로써 제조할 수 있다.

[식 중, B^P, T는 상기와 동일한 정의이고；

R⁵는 아실을 나타낸다.]

화합물(II)에 있어서, n=2~99이고, L이 아실인, 다음의 화학식 IIc2로 표시되는 화합물은, 화합물(IIc)를 출발 원료로 하여, 본 명세서에 기재된 PMO의 제법에 관계되는 공정 A 및 공정 B를 목적하는 횟수 반복해서 실시함으로써 제조할 수 있다.

[식 중, B^P, n', R², R³, R⁵, T는 상기와 동일한 정의이다.]

(2) 공정 B：

화합물(III)에 염기 존재하에 모르폴리노 모노머 화합물을 작용시킴으로써, 다음의 화학식 VII으로 표시되는 화합물(이하, 화합물(VII)이라 한다.)을 제조하는 공정.

[식 중, 각 B^P, L, n, R², R³, T는 상기와 동일한 정의이다.]

본 공정은, 화합물(III)에 염기 존재하에 모르폴리노 모노머 화합물을 작용시킴으로써 실시할 수 있다.

모르폴리노 모노머 화합물로서는, 예를 들면, 다음의 화학식 VIII으로 표시되는 화합물를 들 수 있다.

[식 중, B^P, R², R³, T는 상기와 동일한 정의이다.]

본 공정에 사용 가능한 「염기」로서는, 예를 들면, 디이소프로필아민, 트리에틸아민, 또는, N-에틸모르폴린을 들 수 있다. 염기의 사용량으로서는, 예를 들면, 화합물(III) 1몰에 대해, 1몰 당량~1000몰 당량의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 10몰 당량~100몰 당량의 범위 내이다.

본 공정에 사용 가능한 모르폴리노 모노머 화합물 및 염기는, 0.1%~30%의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용하는 것도 가능하다. 용매로서는, 반응에 관여하지 않는다면 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, N,N-디메틸이미다졸리돈, N-메틸피페리돈, DMF, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란, 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.

반응온도는 예를 들면, 0℃~100℃의 범위 내가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10℃~50℃의 범위 내이다.

반응시간은 사용하는 염기의 종류, 반응온도에 따라 상이하나, 통상 1분~48시간의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 30분~24시간의 범위 내이다.

또한 본 공정의 종료 후, 필요에 따라, 아실화제를 첨가할 수 있다. 「아실화제」로서는, 예를 들면, 무수 초산, 초산 클로라이드, 페녹시초산 무수물을 들 수 있다. 아실화제는, 예를 들면, 0.1%~30%의 범위 내의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용하는 것도 가능하다. 용매로서는, 반응에 관여하지 않는다면 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 알코올류(에탄올, 이소프로판올, 트리플루오로에탄올 등), 물 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.

또한, 필요하다면, 아실화제와 함께, 예를 들면, 피리딘, 루티딘, 콜리딘, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-에틸모르폴린 등의 염기를 사용할 수 있다. 아실화제의 사용량으로서는, 0.1몰 당량~10000몰 당량의 범위 내가 바람직하고, 1몰 당량~1000몰 당량의 범위 내가 보다 바람직하다. 염기의 사용량으로서는, 예를 들면, 아실화제 1몰에 대해, 0.1몰 당량~100몰 당량의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 1몰 당량~10몰 당량의 범위 내이다.

본 반응의 반응온도는 10℃~50℃의 범위 내가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10℃~50℃의 범위 내가 바람직하며, 보다 바람직하게는 20℃~40℃의 범위 내이고, 더욱 바람직하게는 25℃~35℃의 범위 내이다. 반응시간은 예를 들면, 사용하는 아실화제의 종류, 반응온도에 따라 상이하나, 통상 0.1분~24시간의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 1분~5시간의 범위 내이다.

(3) 공정 C：

공정 B에 있어서 제조되는 화합물(VII)에 있어서, 탈보호제를 사용하여 보호기를 탈리해서, 화학식 IX로 표시되는 화합물을 제조하는 공정.

[식 중, Base, B^P, L, n, R², R³, T는 상기와 동일한 정의이다.]

본 공정은, 화합물(VII)에 탈보호제를 작용시킴으로써 실시할 수 있다.

「탈보호제」로서는, 예를 들면, 농암모니아수, 메틸아민을 들 수 있다. 본 공정에 사용 가능한 「탈보호제」는, 예를 들면, 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란, DMF, N,N-디메틸이미다졸리돈, N-메틸피페리돈 또는 이들의 혼합용매로 희석해서 사용하는 것도 가능하다. 그 중에서도, 에탄올이 바람직하다. 탈보호제의 사용량으로서는, 예를 들면, 화합물(VII) 1몰에 대해, 예를 들면, 1몰 당량~100000몰 당량의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 10몰 당량~1000몰 당량의 범위 내이다.

반응온도는 예를 들면, 15℃~75℃의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 40℃~70℃의 범위 내이며, 보다 바람직하게는 50℃~60℃의 범위 내이다. 탈보호 반응시간은, 화합물(VII)의 종류, 반응온도 등에 따라 상이하나, 10분~30시간의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 30분~24시간의 범위 내이며, 보다 바람직하게는 5시간~20시간의 범위 내이다.

(4) 공정 D：

공정 C에 있어서 제조되는 화합물(IX)에 산을 작용시킴으로써, PMO(I)을 제조하는 공정.

[식 중, Base, n, R², R³, T는 상기와 동일한 정의이다.]

본 공정은, 화합물(IX)에 산을 첨가함으로써 실시할 수 있다.

본 공정에 있어서 사용 가능한 「산」으로서는, 예를 들면, 트리클로로초산, 디클로로초산, 초산, 인산 및 염산 등을 들 수 있다. 산의 사용량으로서는, 예를 들면, 용액의 pH가 0.1~4.0의 범위 내가 되도록 사용하는 것이 적당하고, 보다 바람직하게는 1.0~3.0의 범위 내가 되도록 사용한다. 용매로서는, 반응에 관여하지 않는다면 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 아세토니트릴, 물, 또는 이들의 혼합용매를 들 수 있다.

반응온도는 10℃~50℃의 범위 내가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20℃~40℃의 범위 내이며, 더욱 바람직하게는 25℃~35℃의 범위 내이다. 탈보호 반응시간은, 화합물(IX)의 종류, 반응온도 등에 따라 상이하나, 0.1분~5시간의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 1분~1시간의 범위 내이며, 보다 바람직하게는 1분~30분의 범위 내이다.

PMO(I)은, 본 공정에서 얻어진 반응 혼합물로부터 통상의 분리정제수단, 예를 들면, 추출, 농축, 중화, 여과, 원심분리, 재결정, C₈~C₁₈의 역상 칼럼크로마토그래피, 양이온 교환 칼럼크로마토그래피, 음이온 교환 칼럼크로마토그래피, 겔 여과 칼럼크로마토그래피, 고속 액체크로마토그래피, 투석, 한계 여과 등의 수단을 단독 또는 조합해서 사용함으로써 얻을 수 있어, 목적하는 PMO(I)을 단리 정제할 수 있다(예를 들면, 국제공개공보 WO1991/09033을 참조).

역상 크로마토그래피를 사용하여 PMO(I)을 정제하는 경우에는, 용출 용매로서, 예를 들면 20 mM의 트리에틸아민/초산 완충액과 아세토니트릴의 혼합용액을 사용할 수 있다.

또한, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 PMO(I)을 정제하는 경우에는, 예를 들면, 1 M의 식염수와 10 mM의 수산화나트륨 수용액의 혼합용액을 사용할 수 있다.

펩티드 핵산은, 하기 화학식으로 표시되는 기를 구성 단위로 하는 본 발명의 올리고머이다.

(식 중, Base는 상기와 동일한 정의이다.)

펩티드 핵산은, 예를 들면, 아래의 문헌에 따라 제조할 수 있다.

1) P. E. Nielsen M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497(1991)

2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895(1992)

3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem.,, 59, 5767(1994)

4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen ,H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175(1995)

5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80(1997)

또한, 본 발명의 올리고머는, 5' 말단이, 하기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 기여도 된다. 바람직하게는 (3)-OH이다.

이하, 상기 (1), (2) 및 (3)으로 나타내어지는 기를, 각각 「기(1)」, 「기(2)」 및 「기(3)」이라 부른다.

2. 의약 조성물

본 발명의 올리고머는, 종래 기술에 관계되는 안티센스 올리고머와 비교하여, 고효율로 엑손 53의 스키핑을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 올리고머를 포함하는 의약 조성물을 DMD 환자에게 투여함으로써, 고효율로 근이영양증(muscular dystrophy)의 증상을 완하할 수 있을 것으로 예측된다. 예를 들면, 본 발명의 올리고머를 포함하는 의약 조성물을 사용하는 경우, 종래 기술에 관계되는 올리고머에 비해 소량의 투여량으로도 동일 정도의 치료효과를 얻을 수 있기 때문에, 부작용을 경감할 수 있고, 또한 경제적이다.

이에, 다른 실시태양으로서, 본 발명의 올리고머, 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물을 유효성분으로 하는, 근이영양증 치료용 의약 조성물(이하, 「본 발명의 조성물」이라 한다)을 제공한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 올리고머의 의약적으로 허용 가능한 염의 예로서는, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염과 같은 알칼리금속염, 칼슘염, 마그네슘염과 같은 알칼리토류금속염；알루미늄염, 철염, 아연염, 구리염, 니켈염, 코발트염 등의 금속염；암모늄염；t-옥틸아민염, 디벤질아민염, 모르폴린염, 글루코사민염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 구아니딘염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 프로카인염, 디에탄올아민염, N-벤질-페네틸아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄염과 같은 유기 아민염；플루오르화 수소산염, 염산염, 브롬화 수소산염, 요오드화 수소산염과 같은 할로겐화 수소산염；질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염；메탄설폰산염, 트리플루오로메탄설폰산염, 에탄설폰산염과 같은 저급 알칸설폰산염；벤젠설폰산염, p-톨루엔설폰산염과 같은 아릴설폰산염；초산염, 말산염, 푸마르산염, 숙신산염, 구연산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염；글리신염, 리신염, 아르기닌염, 오르니틴염, 글루타민산염, 아스파라긴산염과 같은 아미노산염 등을 들 수 있다. 이들 염은, 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 또는, 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 올리고머는, 그의 수화물의 형태에 있어도 된다.

본 발명의 조성물의 투여형태는, 의약적으로 허용 가능한 투여형태라면 특별히 제한되지 않고, 치료방법에 따라 선택할 수 있으나, 근조직으로의 송달 용이성의 관점에서, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경구 투여, 조직내 투여, 경피 투여 등이 바람직하고, 또한, 본 발명의 조성물이 취할 수 있는 제형으로서는, 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 각종 주사제, 경구제, 점적제, 흡입제, 연고제, 로션제 등을 들 수 있다.

본 발명의 올리고머를 근이영양증 환자에게 투여하는 경우, 본 발명의 조성물은, 그 올리고머의 근조직으로의 송달을 촉진하는 담체를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 담체는, 의약적으로 허용 가능한 것이라면 특별히 제한되지 않고, 그 예로서, 양이온성 리포솜, 양이온성 폴리머 등의 양이온성 담체, 또는 바이러스 엔벨로프를 이용한 담체를 들 수 있다. 양이온성 리포솜로서는, 예를 들면, 2-O-(2-디에틸아미노에틸)카르바모일-1,3-O-디올레오일글리세롤과 인지질을 필수 구성성분으로서 형성되는 리포솜(이하, 「리포솜 A」라 한다), 올리고펙트아민(등록상표)(Invitrogen사 제조), 리포펙틴(등록상표)(Invitrogen사 제조), 리포펙트아민(등록상표)(Invitrogen사 제조), Lipofectamine 2000(등록상표)(Invitrogen사 제조), DMRIE-C(등록상표)(Invitrogen사 제조), GeneSilencer(등록상표)(Gene Therapy Systems사 제조), TransMessenger(등록상표)(QIAGEN사 제조), TransIT TKO(등록상표)(Mirus사 제조), Nucleofector II(Lonza)를 들 수 있다. 그들 중에서, 리포솜 A가 바람직하다. 양이온성 폴리머로서는, 예를 들면, JetSI(등록상표)(Qbiogene사 제조), Jet-PEI(등록상표)(폴리에틸렌이민, Qbiogene사 제조)를 들 수 있다. 바이러스 엔벨로프를 이용한 담체로서는, 예를 들면, GenomeOne(등록상표)(HVJ-E 리포솜, 이사하라 산업사 제조)을 들 수 있다. 또는, 일본국 특허 제2924179호에 기재된 의약 디바이스, 일본국 특허 재공표 공보 제2006/129594호 및 일본국 특허 재공표 공보 제2008/096690호에 기재된 양이온성 담체를 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 올리고머의 농도는, 담체의 종류 등에 따라 상이하나, 0.1 nM~100 μM의 범위 내가 적당하고, 1 nM~10 μM의 범위 내가 바람직하며, 10 nM~1 μM의 범위 내가 보다 바람직하다. 또한, 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 올리고머와 담체의 중량비(담체/본 발명의 올리고머)는, 그 올리고머의 성질 및 그 담체의 종류 등에 따라 상이하나, 0.1~100의 범위 내가 적당하고, 1~50의 범위 내가 바람직하며, 10~20의 범위 내가 보다 바람직하다.

본 발명의 조성물에는, 본 발명의 올리고머와 전술한 담체 이외에, 임의로 의약적으로 허용 가능한 첨가제를 배합할 수 있다. 이러한 첨가제로서, 예를 들면, 유화 보조제(예를 들면, 탄소수 6~22의 지방산이나 그의 의약적으로 허용 가능한 염, 알부민, 덱스트란), 안정화제(예를 들면, 콜레스테롤, 포스파티딘산), 등장화제(예를 들면, 염화나트륨, 글루코오스, 말토오스, 락토오스, 수크로오스, 트레할로오스), pH 조정제(예를 들면, 염산, 황산, 인산, 초산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에탄올아민)를 들 수 있다. 이들을 1종 또는 2종 이상 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물 중의 당해 첨가제의 함유량은, 90 중량% 이하가 적당하고, 70 중량% 이하가 바람직하며, 50 중량% 이하가 보다 바람직하다.

본 발명의 조성물은, 담체의 분산액에 본 발명의 올리고머를 첨가하고, 적당히 교반함으로써 조제할 수 있다. 또한, 첨가제는, 본 발명의 올리고머의 첨가 전에도 첨가 후에도 적합한 공정에서 첨가할 수 있다. 본 발명의 올리고머를 첨가시킬 때 사용할 수 있는 수성 용매로서는, 의약적으로 허용 가능한 것이라면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 주사용수, 주사용 증류수, 생리식염수 등의 전해질액, 포도당액, 말토오스액 등의 당액을 들 수 있다. 또한, 이러한 경우의 pH 및 온도 등의 조건은, 당업자가 적당히 선택할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 예를 들면, 액제나 그의 동결건조제제로 할 수 있다. 당해 동결건조제제는, 통상의 방법으로, 액제의 형태를 가지고 있는 본 발명의 조성물을 동결건조처리함으로써 조제할 수 있다. 예를 들면, 액제의 형태를 가지고 있는 본 발명의 조성물을 적당한 멸균을 행한 후, 소정량을 바이알에 분주하고, 약 -40~-20℃의 조건에서 예비 동결을 2시간 정도 행하여, 약 0~10℃에서 감압하에 1차 건조를 행하고, 이어서, 약 15~25℃에서 감압하에 2차 건조하여 동결건조할 수 있다. 그리고, 일반적으로는 바이알 내부를 질소가스로 치환하고, 타전(打栓)하여 본 발명의 조성물의 동결건조제제를 얻을 수 있다.

본 발명의 조성물의 동결건조제제는, 일반적으로는 임의의 적당한 용액(재용해액)의 첨가에 의해 재용해해서 사용할 수 있다. 이러한 재용해액으로서는, 주사용수, 생리식염수, 기타 일반 수액을 들 수 있다. 이 재용해액의 액량은, 용도 등에 따라 상이하여 특별히 제한되지 않으나, 동결건조 전의 액량의 0.5~2배량, 또는 500 mL 이하가 적당하다.

본 발명의 조성물을 투여할 때의 용량으로서는, 함유되는 본 발명의 올리고머의 종류, 제형, 연령이나 체중 등의 환자의 상태, 투여 경로, 질환의 성질과 정도를 고려하여 조제하는 것이 바람직하나, 성인에 대해 본 발명의 올리고머의 양으로서, 1일당 0.1 ㎎~10 g/인간의 범위 내가, 바람직하게는 1 ㎎~1 g/인간의 범위 내가 일반적이다. 이 수치는 표적으로 하는 질환의 종류, 투여 형태, 표적 분자에 따라서도 상이한 경우가 있다. 따라서, 경우에 따라서는 이 이하여도 충분하고, 또한 반대로 이 이상의 용량을 필요로 하는 때도 있다. 또한 1일 1회 내지 수회의 투여 또는 1일 내지 수일 간의 간격으로 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물의 다른 태양으로서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 발현할 수 있는 벡터와 전술한 담체를 포함하는 의약 조성물을 들 수 있다. 이러한 발현 벡터는, 복수의 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 발현 가능한 것이어도 된다. 당해 조성물에는, 본 발명의 올리고머를 함유하는 본 발명의 조성물과 마찬가지로, 의약적으로 허용 가능한 첨가제를 첨가할 수 있다. 당해 조성물 중에 포함되는 발현 벡터의 농도는, 담체의 종류 등에 따라 상이하나, 0.1 nM~100 μM의 범위 내가 적당하고, 1 nM~10 μM의 범위 내가 바람직하며, 10 nM~1 μM의 범위 내가 보다 바람직하다. 당해 조성물 중에 포함되는 발현 벡터와 담체의 중량비(담체/발현 벡터)는, 발현 벡터의 성질, 담체의 종류 등에 따라 상이하나, 0.1~100의 범위 내가 적당하고, 1~50의 범위 내가 바람직하며, 10~20의 범위 내가 보다 바람직하다. 또한, 당해 조성물 중에 포함되는 담체의 함유량은, 본 발명의 올리고머를 함유하는 본 발명의 조성물의 경우와 동일하고, 그 조제방법 등에 관해서도, 본 발명의 조성물의 경우와 동일하다.

아래에, 실시예 및 시험예를 들어, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하나, 본 발명은 실시예에 나타내어지는 범위에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

[참고예 1]

아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 4-｛[(2S,6R)-6-(4-벤즈아미드-2-옥소피리미딘-1-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시｝-4-옥소부탄산

공정 1：4-｛[(2S,6R)-6-(4-벤즈아미드-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시｝-4-옥소부탄산의 제조

아르곤 분위기하, N-｛1-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]-2-옥소-1,2-디히드로피리미딘-4-일｝벤즈아미드 22.0 g과 4-디메틸아미노피리딘(4-DMAP) 7.04 g을 디클로로메탄 269 mL에 현탁하고, 무수 숙신산 5.76 g을 첨가하여, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응액에 메탄올 40 mL를 첨가하고, 감압 농축하였다. 잔사에 초산에틸과 0.5 M의 인산이수소칼륨 수용액을 사용하여 추출 조작을 행하였다. 얻어진 유기층을 0.5 M의 인산이수소칼륨 수용액, 물, 포화식염수의 순으로 세정하였다. 얻어진 유기층을 황산나트리륨으로 건조하고, 감압 농축하여, 25.9 g의 목적물을 얻었다.

공정 2：아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 4-｛[(2S,6R)-6-(4-벤즈아미드-2-옥소피리미딘-1-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시｝-4-옥소부탄산의 제조

4-｛[(2S,6R)-6-(4-벤즈아미드-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시｝-4-옥소부탄산 23.5 g을 피리딘(탈수) 336 mL에 용해하고, 4-DMAP 4.28 g, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염 40.3 g을 첨가하였다. 이어서, 아미노메틸폴리스티렌 수지 1% DVB 가교(도쿄 화성공업사 제조, A1543) 25.0 g, 트리에틸아민 24 mL를 첨가하고, 실온에서 4일간 진탕하였다. 반응 후, 수지를 여과하여 모았다. 얻어진 수지를 피리딘, 메탄올, 디클로로메탄의 순으로 세정하고, 감압 건조하였다. 얻어진 수지에 테트라히드로푸란(탈수) 150 mL, 무수 초산 15 mL, 2,6-루티딘 15 mL를 첨가하고, 실온에서 2시간 진탕하였다. 수지를 여과하여 모아, 피리딘, 메탄올, 디클로로메탄의 순으로 세정하고, 감압 건조하여, 33.7 g의 목적물을 얻었다.

당해 목적물의 로딩량은, 공지의 방법을 사용하여, 1 g당 트리틸의 몰량을 409 nm에 있어서의 UV 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 수지의 로딩량은, 397.4 μmol/g이었다.

UV 측정조건

기기：U-2910(히타치 제작소)

용매：메탄설폰산

파장：265 nm

ε값：45000

[참고예 2]

아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 4-옥소-4-｛[(2S,6R)-6-(6-옥소-2-[2-페녹시아세트아미드]-1H-퓨린-9-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시｝부탄산

공정 1：N²-(페녹시아세틸)구아노신의 제조

구아노신 100 g을 80℃에서 감압하, 24시간 건조하였다. 피리딘(탈수) 500 mL, 디클로로메탄(탈수) 500 mL를 첨가하고, 아르곤 분위기하, 0℃에서 클로로트리메틸실란 401 mL를 적하하고 실온에서 3시간 교반하였다. 재차 빙랭하고, 페녹시아세틸 클로라이드 66.3 g을 적하하여, 빙랭하, 추가로 3시간 교반하였다. 반응액에 메탄올 500 ㎖를 첨가하고, 실온에서 밤새 교반 후, 감압하 용매를 증류 제거하였다. 잔사에 메탄올 500 mL를 첨가하고, 감압하 농축하는 것을 3회 행하였다. 잔사에 물 4 L를 첨가하여 빙랭하 1시간 교반하고, 석출물을 여과하여 모았다. 이것을, 물, 이어서, 냉메탄올로 세정하고, 건조하여 목적 화합물을 150.2 g 얻었다(수율：102%)(참고：Org. Lett. (2004), Vol.6, No.15, 2555-2557).

공정 2：N-｛9-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-모르폴린-2-일]-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-2-일｝-2-페녹시아세트아미드 p-톨루엔설폰산염

공정 1에서 얻어진 화합물 30 g을 메탄올 480 mL에 현탁하고, 빙랭하, 2N 염산 130 mL를 첨가하였다. 이어서, 4붕산암모늄 4수화물 56.8 g, 과옥소산나트륨 16.2 g을 이 순서로 첨가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응액을 빙랭하고, 불용물을 여과하여 제거해서, 이것을 메탄올 100 mL로 세정하였다. 여액과 세정액을 합하여 빙랭하고, 2-피콜린보란 11.52 g을 첨가하여 20분간 교반 후, p-톨루엔설폰산·1수화물 54.6 g을 천천히 첨가하여, 4℃에서 밤새 교반하였다. 석출물을 여과하여 모으고, 냉메탄올 500 mL로 세정 후, 건조하여 목적 화합물을 17.7 g 얻었다(수율：43.3%).

공정 3：N-｛9-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-2-일｝-2-페녹시아세트아미드의 제조

공정 2에서 얻어진 화합물 2.0 g을 디클로로메탄 30 mL에 현탁하고, 빙랭하, 트리에틸아민 13.9 g, 트리틸 클로라이드 18.3 g을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 포화중조수, 이어서 물로 세정 후 건조하고, 유기층을 감압 농축하였다. 잔사에 0.2 M 구연산나트륨 완충액(pH 3)/메탄올(1：4(v/v)) 40 mL를 첨가하여 교반하고, 이어서 물 40 mL를 첨가하여 빙랭하 1시간 교반하였다. 이것을 여과하여 모아서, 냉메탄올로 세정하고, 건조하여 목적 화합물을 1.84 g 얻었다(수율：82.0%).

공정 4：아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 4-옥소-4-｛[(2S,6R)-6-(6-옥소-2-[2-페녹시아세트아미드]-1H-퓨린-9-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시｝부탄산의 제조

참고예 1과 동일한 방법으로 표기 화합물을 제조하였다. 단, 참고예 1의 공정 1에서 사용한 N-｛1-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]-2-옥소-1,2-디히드로피리미딘-4-일｝벤즈아미드 대신에, 본 공정에서는, N-｛9-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-2-일｝-2-페녹시아세트아미드를 사용하였다.

[참고예 3]

아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 4-｛[(2S,6R)-6-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시｝-4-옥소부탄산

참고예 1과 동일한 방법으로 표기 화합물을 제조하였다. 단, 참고예 1의 공정 1에서 사용한 N-｛1-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]-2-옥소-1,2-디히드로피리미딘-4-일｝벤즈아미드 대신에, 본 공정에서는, 1-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]-5-메틸피리미딘-2,4(1H,3H)-디온을 사용하였다.

[참고예 4]

아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 1,12-디옥소-1-(4-트리틸피페라진-1-일)-2,5,8,11-테트라옥사-15-펜타데칸산

참고예 1과 동일한 방법으로 표기 화합물을 제조하였다. 단, 참고예 1의 공정 1에서 사용한 N-｛1-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]-2-옥소-1,2-디히드로피리미딘-4-일｝벤즈아미드 대신에, 본 공정에서는, 2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에틸 4-트리틸피페라진-1-카르복실산(국제공개공보 제2009/064471호에 기재된 화합물)을 사용하였다.

아래의 실시예 1~12, 비교예 1~3의 기재에 따라, 표 2 PMO No.1-11, 13-16에 나타내는 각종 PMO를 합성하였다. 합성한 PMO를 주사용수(오츠카 제약 공장사 제조)로 용해하였다. 또한, PMO No.12는 진 툴즈사로부터 구입하였다.

[실시예 1]

PMO No.8

아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 4-｛[(2S,6R)-6-(4-벤즈아미드-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시｝-4-옥소부탄산(참고예 1) 2 g(800 μmol)을 반응조에 옮겨넣고, 디클로로메탄 30 mL를 첨가하여, 30분간 정치하였다. 추가로, 디클로로메탄 30 mL로 2회 세정한 후, 하기 합성 사이클을 개시하였다. 표기 화합물의 염기서열이 되도록, 각 사이클에 있어서 목적하는 모르폴리노 모노머 화합물을 첨가하였다.

또한, 디블로킹 용액으로서는, 트리플루오로초산(2 당량)과 트리에틸아민(1 당량)의 혼합물을 3%(w/v)가 되도록, 1%(v/v)의 에탄올과 10%(v/v)의 2,2,2-트리플루오로에탄올을 함유하는 디클로로메탄 용액으로 용해한 것을 사용하였다. 중화 용액으로서는, N,N-디이소프로필에틸아민을 5%(v/v)가 되도록, 25%(v/v)의 2-프로판올을 함유하는 디클로로메탄 용액으로 용해한 것을 사용하였다. 커플링 용액 A로서는, 모르폴리노 모노머 화합물을 0.15 M이 되도록, 10%(v/v)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 함유하는 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논으로 용해한 것을 사용하였다. 커플링 용액 B로서는, N,N-디이소프로필에틸아민을 10%(v/v)가 되도록, 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논으로 용해한 것을 사용하였다. 캡핑 용액으로서는, 디클로로메탄에 대해 20%(v/v)의 무수 초산과 30%(v/v)의 2,6-루티딘을 용해한 것을 사용하였다.

상기에서 합성한 PMO가 담지된 아미노메틸폴리스티렌 수지를 반응 용기로부터 회수하여, 2시간 이상 실온에서 감압 건조하였다. 건조한 아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 PMO를 반응 용기에 넣고, 28% 암모니아수-에탄올(1/4) 200 mL를 첨가하고, 55℃에서 15시간 교반하였다. 아미노메틸폴리스티렌 수지를 여과 분별하고, 물-에탄올(1/4) 50 mL로 세정하였다. 얻어진 여액을 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 20 mM의 초산-트리에틸아민 완충액(TEAA 완충액)과 아세토니트릴의 혼합용매(4/1) 100 mL에 용해하고, 멤브레인 필터로 여과하였다. 얻어진 여액을 역상 HPLC로 정제하였다. 사용한 조건은, 아래와 같다.

각 프랙션을 분석하여, 아세토니트릴-물(1/1) 100 mL로 목적물을 회수하고, 에탄올 200 mL를 첨가하여, 감압 농축하였다. 추가로, 감압 건조하여, 백색 고체를 얻었다. 얻어진 고체에 10 mM의 인산 수용액 300 mL를 첨가하고, 현탁시켰다. 2 M의 인산 수용액 10 mL를 첨가하고, 15분간 교반하였다. 추가로, 2 M의 수산화나트륨 수용액 15 mL를 첨가하여 중화하였다. 추가로, 2 M의 수산화나트륨 수용액 15 mL를 첨가하여 알칼리성으로 하고, 멤브레인 필터(0.45 ㎛)로 여과하였다. 10 mM의 수산화나트륨 수용액 100 mL로 씻어, 수용액으로서 목적물을 얻었다.

얻어진 목적물을 함유하는 수용액을 음이온 교환 수지 칼럼으로 정제하였다. 사용한 조건은 아래와 같다.

각 프랙션을 분석(HPLC)하여, 목적물을 수용액으로서 얻었다. 얻어진 수용액에 0.1 M의 인산 완충액(pH 6.0) 225 mL를 첨가하여 중화하였다. 멤브레인 필터(0.45 ㎛)로 여과하였다. 이어서, 하기 조건으로 한외여과를 행하여 탈염하였다.

여액을 농축하여, 약 250 mL의 수용액을 얻었다. 얻어진 수용액을 멤브레인 필터(0.45 ㎛)로 여과하였다. 얻어진 수용액을 동결건조하여, 백색 면상(綿狀) 고체로서 1.5 g의 목적 화합물을 얻었다.

ESI-TOF-MS　계산값：6924.82

측정값：6923.54

[실시예 2]

PMO. No.1

실시예 1과 동일한 방법에 따라, 표기 화합물을 제조하였다.

MALDI-TOF-MS　계산값：8291.96

측정값：8296.24

[실시예 3]

PMO. No.2

실시예 1과 동일한 방법에 따라, 표기 화합물을 제조하였다.

ESI-TOF-MS　계산값：7310.13

측정값：7309.23

[실시예 4]

PMO. No.3

실시예 1과 동일한 방법에 따라, 표기 화합물을 제조하였다.

ESI-TOF-MS　계산값：8270.94

측정값：8270.55

[실시예 5]

PMO. No.4

실시예 1과 동일한 방법에 따라, 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서, 아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 4-(((2S,6R)-6-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일)메톡시)-4-옥소부탄산(참고예 3)을 사용하였다.

ESI-TOF-MS　계산값：7310.13

측정값：7310.17

[실시예 6]

PMO. No.5

ESI-TOF-MS　계산값：8270.94

측정값：8270.20

[실시예 7]

PMO. No.6

실시예 1과 동일한 방법에 따라, 표기 화합물을 제조하였다.

ESI-TOF-MS　계산값：5964.01

측정값：5963.68

[실시예 8]

PMO. No.7

실시예 1과 동일한 방법에 따라, 표기 화합물을 제조하였다.

ESI-TOF-MS　계산값：6609.55

측정값：6608.85

[실시예 9]

PMO. No.9

실시예 1과 동일한 방법에 따라, 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서, 아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 4-옥소-4-(((2S,6R)-6-(6-옥소-2-(2-페녹시아세트아미드)-1H-퓨린-9(6H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일)메톡시)부탄산(참고예 2)을 사용하였다.

ESI-TOF-MS　계산값：7280.11

측정값：7279.42

[실시예 10]

PMO. No.10

ESI-TOF-MS　계산값：8295.95

측정값：8295.91

[실시예 11]

PMO. No.13

실시예 1과 동일한 방법에 따라, 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서, 아미노메틸폴리스티렌 수지에 담지된 1,12-디옥소-1-(4-트리틸피페라진-1-일)-2,5,8,11-테트라옥사-15-펜타데칸산(참고예 4)을 사용하였다.

ESI-TOF-MS　계산값：7276.15

측정값：7276.69

[실시예 12]

PMO. No.14

ESI-TOF-MS　계산값：8622.27

측정값：8622.29

[비교예 1]

PMO. No.11

실시예 1과 동일한 방법에 따라, 표기 화합물을 제조하였다.

ESI-TOF-MS　계산값：10274.63

측정값：10273.71

[비교예 2]

PMO. No.15

실시예 1과 동일한 방법에 따라, 표기 화합물을 제조하였다.

ESI-TOF-MS　계산값：9941.33

측정값：9940.77

[비교예 3]

PMO. No.16

실시예 1과 동일한 방법에 따라, 표기 화합물을 제조하였다.

ESI-TOF-MS　계산값：8238.94

측정값：8238.69

[시험예 1]

In vitro 어세이

RD세포(인간 횡문근육종 세포주) 4×10⁵개에 대해, PMO No.1~8의 본 발명의 올리고머 및 PMO No.11의 안티센스 올리고머 10 μM를 Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L을 사용하여 Nucleofector II(Lonza)에 의해 도입하였다. 프로그램은 T-030을 사용하였다.

도입 후, 세포를, 10% 소 태아 혈청(FCS)(인비트로젠사 제조)을 포함하는 Eagle's minimal essential medium(EMEM)배지(시그마사 제조, 이하 동일) 2 mL 중, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 세포를 PBS(닛스이사 제조, 이하 동일)로 2회 세정한 후, ISOGEN(닛폰 진사 제조) 500 ㎕를 세포에 첨가하고, 수분간 실온에 방치하여 세포를 용해시키고, 그 용해물을 Eppendorf 튜브에 회수하였다. ISOGEN에 첨부된 프로토콜에 따라 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA의 농도는 NanoDrop ND-1000(엘·엠·에스사 제)을 사용해서 측정하였다.

추출한 total RNA 400 ng에 대해, Titan One Tube RT-PCR Kit(로슈사 제조)를 사용하여 One-Step RT-PCR을 행하였다. 키트에 첨부된 프로토콜에 따라, 반응액을 조제하였다. 서멀 사이클러는 PTC-100(MJ Research사 제조)을 사용하였다. 사용한 RT-PCR의 프로그램은, 다음과 같다.

50℃, 30분간：역전사반응

94℃, 2분간：열변성

[94℃, 10초간；58℃, 30초간；68℃, 45초간]×30사이클：PCR 증폭

68℃, 7분간：폴리머라아제의 열 불활성화

RT-PCR에 사용한 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.

다음으로, 상기 RT-PCR의 증폭산물에 대해, Taq DNA Polymerase(로슈사 제조)를 사용하여 nested PCR을 행하였다. 사용한 PCR 프로그램은, 다음과 같다.

94℃, 2분간：열변성

[94℃, 15초간；58℃, 30초간；68℃, 45초간]×30사이클：PCR 증폭

68℃, 7분간：폴리머라아제의 열 불활성화

상기 nested PCR에 사용한 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.

상기 nested PCR의 반응산물 1 ㎕를 Bioanalyzer(아질렌트사 제조)를 사용해서 해석하였다.

엑손 53이 스킵한 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「A」와, 엑손 53이 스킵하지 않은 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「B」를 측정하였다. 이들 「A」 및 「B」의 측정값을 토대로, 아래의 식에 따라 스키핑 효율을 구하였다.

실험결과

결과를 도 1에 나타낸다. 본 실험에 의해, PMO No.1~8의 본 발명의 올리고머는, 모두 PMO No.11의 안티센스 올리고머와 비교하여, 현저히 높은 효율로 엑손 53을 스키핑시키는 것이 판명되었다. 특히, PMO No.3 및 8의 본 발명의 올리고머는, PMO No.11의 안티센스 올리고머와 비교하여, 4배 이상 높은 엑손 스키핑 효율을 나타낸다.

[시험예 2]

인간 섬유아세포를 사용한 In vitro 어세이

ZsGreen1 공발현 레트로바이러스 벡터에 의해 TIG-119세포(인간 정상 조직 유래 섬유아세포, 의약기반연구소) 또는 5017세포(인간 DMD 환자 유래 섬유아세포, Coriell Institute for Medical Research)에 인간 myoD 유전자(서열번호 44)를 도입하였다.

4~5일간 인큐베이트한 후에, FACS에 의해 ZsGreen 양성의 Myod 전환 섬유아세포를 회수하고, 5×10⁴개/㎠가 되도록 12웰 플레이트에 파종하였다. 증식배지는 10% FCS 및 1% Penicillin/Streptomycin(P/S)(시그마 알드리치사)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12)(인비트로젠사)를 1 mL 사용하였다.

24시간 후에 분화배지(2% 말 혈청(인비트로젠사), 1% P/S 및 ITS Liquid Media Supplement(시그마사) 함유 DMEM/F-12)로 교환하였다. 2, 3일마다 배지 교환을 행하여 12~14일간 인큐베이트하고, 근관세포로 분화시켰다.

그 후, 분화배지를 6 μM의 Endo-Porter(진 툴사) 함유 분화배지로 교환하고, 종농도 10 μM가 되도록 모르폴리노 올리고머를 첨가하였다. 48시간 인큐베이트 후에, TRIzol(인비트로젠사 제조)에 의해, 세포로부터 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA 50 ng에 대해, QIAGEN OneStep RT-PCR Kit를 사용하여 RT-PCR을 행하였다. 첨부된 프로토콜에 따라, 반응액을 조제하였다. 서멀 사이클러는 iCycler(Bio-Rad사 제조)를 사용하였다. 사용한 RT-PCR의 프로그램은, 다음과 같다.

50℃, 30분간：역전사반응

95℃, 15분간：열변성

[94℃, 1분간；60℃, 1분간；72℃, 1분간]×35사이클：PCR 증폭

72℃, 7분간：폴리머라아제의 열 불활성화

프라이머는 hEX51F 및 hEX55R을 사용하였다.

상기 RT-PCR 반응의 반응산물을 2% 아가로스겔 전기영동으로 분리하고, GeneFlash(Syngene사)에 의해 겔 사진을 촬영하였다. Image J(아메리카 국립위생연구소 제조)에 의해, 엑손 53이 스킵한 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「A」와, 엑손 53이 스킵하지 않은 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「B」를 측정하였다. 이들 「A」 및 「B」의 측정값을 토대로, 아래의 식에 따라 스키핑 효율을 구하였다.

실험결과

결과를 도 2 및 도 3에 나타낸다. 본 실험에 의해, PMO No.3, 8 및 9의 본 발명의 올리고머(도 2)는, TIG-119세포에 있어서, 모두 PMO No.12의 안티센스 올리고머와 비교하여, 높은 효율로 엑손 53을 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 2). 특히, PMO No.3 및 8의 본 발명의 올리고머는, PMO No.12의 안티센스 올리고머와 비교하여, 2배 이상 높은 엑손 스키핑 효율을 나타낸다(도 2).

또한, 본 실험에 의해, PMO No.3 및 8~10의 본 발명의 올리고머(도 3)는, 5017세포에 있어서, 모두 PMO No.12의 안티센스 올리고머와 비교하여, 높은 효율로 엑손 53을 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 3). 특히, PMO No.3 및 8의 본 발명의 올리고머는, PMO No.12의 안티센스 올리고머와 비교하여, 7배 이상 높은 엑손 스키핑 효율을 나타낸다(도 3).

[시험예 3]

인간 섬유아세포를 사용한 In vitro 어세이

엑손 45~52가 결실된 DMD 환자 또는 엑손 48~52가 결실된 DMD 환자의 좌상완 내측으로부터 생체 검사하여, 피부 섬유아세포주(인간 DMD 환자(엑손 45-52 또는 엑손 48-52) 유래 섬유아세포)를 수립하였다. ZsGreen1 공발현 레트로바이러스 벡터에 의해 섬유아세포에 인간 myoD 유전자(서열번호 44)를 도입하였다.

24시간 후에 분화배지(2% 말 혈청(인비트로젠사), 1% P/S 및 ITS Liquid Media Supplement(시그마사) 함유 DMEM/F-12)로 교환하였다. 2, 3일마다 배지 교환을 행하여 12, 14 또는 20일간 인큐베이트하고, 근관세포로 분환시켰다.

50℃, 30분간：역전사반응

95℃, 15분간：열변성

[94℃, 1분간；60℃, 1분간；72℃, 1분간]×35사이클：PCR 증폭

72℃, 7분간：폴리머라아제의 열 불활성화

프라이머는 hEx44F 및 h55R을 사용하였다.

상기 RT-PCR 반응의 반응산물을 2% 아가로스겔 전기영동에 의해 분리하고, GeneFlash(Syngene사)에 의해 겔 사진을 촬영하였다. Image J(아메리카 국립위생연구소 제조)에 의해, 엑손 53이 스킵한 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「A」와, 엑손 53이 스킵하지 않은 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「B」를 측정하였다. 이들 「A」 및 「B」의 측정값을 토대로, 아래의 식에 따라 스키핑 효율을 구하였다.

실험결과

결과를 도 4 및 도 5에 나타낸다. 본 실험에 의해, PMO No.3 및 8의 본 발명의 올리고머는, 엑손 45-52 결실(도 4) 또는 엑손 48-52 결실(도 5) DMD 환자 유래 세포에 있어서, 80% 이상의 높은 효율로 엑손 53을 스키핑시키는 것이 판명되었다. 또한, PMO No.3 및 8의 본 발명의 올리고머는, 엑손 45-52 결실 DMD 환자 유래 세포에 있어서, PMO No.15의 안티센스 올리고머와 비교하여 높은 효율로 엑손 53을 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 4).

[시험예 4]

웨스턴 블로팅

PMO No.8의 본 발명의 올리고머를 10 μM의 농도로 세포에 첨가하고, 72시간 후의 세포로부터 Complete Mini(Roche Applied Science사 제조) 함유 RIPA buffer(Thermo Fisher Scientific사 제조)로 단백질을 추출하여, BCA protein assay kit(Thermo Fisher Scientific사 제조)로 단백질을 정량하였다. NuPAGE Novex Trix-Acetate Gel 3-8%(Invitrogen사 제조)로 150V, 75분간 전기영동하여, 세미드라이 블로터로 PVDF막(Millipore사 제조)으로 전사하였다. PVDF막을 5% ECL Blocking agent(GE Healthcare사 제조)로 블로킹한 후, 항디스트로핀 항체(NCL-Dys1, Novocastra사 제조) 용액 중에서 막을 인큐베이트하였다. 추가로, peroxidase-conjugated goat-antimouse IgG(형번, Bio-Rad) 용액 중에서 인큐베이트한 후, ECL Plus Western blotting system(GE Healthcare사 제조)에 의해 발색하였다.

면역염색

PMO No.3 또는 No.8의 본 발명의 올리고머를 세포에 첨가하고, 72시간 후의 세포를 3% paraformaldehyde, 10분간에 걸쳐 고정화하였다. 10%　Triton-X로 10분간 인큐베이트하였다. 10% 염소 혈청 함유 PBS로 블로킹, 항디스트로핀 항체(NCL-Dys1, Novocastra) 용액 중에서 막을 인큐베이트하고, 추가로 항마우스 IgG 항체(Invitrogen사 제조) 용액 중에서 막을 인큐베이트하였다. Pro Long Gold Antifade reagent(Invitrogen사 제조)로 마운트하여, 형광현미경으로 관찰하였다.

실험결과

결과를 도 6 및 도 7에 나타낸다. 본 실험에 의해, PMO No.3 및 8의 본 발명의 올리고머는 디스트로핀 단백질의 발현을 유도하는 것을 웨스턴 블로팅(도 6) 및 면역염색(도 7)에 의해 확인할 수 있다.

[시험예 5]

인간 섬유아세포를 사용한 In vitro 어세이

시험예 3과 동일한 방법으로 실험을 행하였다.

실험결과

결과를 도 8에 나타낸다. 본 실험에 의해, PMO No.3 및 8의 본 발명의 올리고머는, 엑손 45-52 결실 DMD 환자 유래 세포에 있어서, PMO No.13 및 14의 본 발명의 올리고머보다도 높은 효율로 엑손 53을 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 8).

[시험예 6]

In vitro 어세이

서열번호 49~123에 기재된 2'-O-메톡시-포스포로티오에이트체

(2'-OMe-S-RNA)의 안티센스 올리고머를 사용하여 실험을 행하였다. 어세이에 사용한 각종 안티센스 올리고머는 일본 바이오서비스사로부터 구입하였다. 각종 안티센스 올리고머의 서열을 아래에 나타낸다.

RD세포(인간 횡문근육종 세포주) 3×10⁵개를 6웰 플레이트에 파종하고, 10% 소 태아 혈청(FCS)(인비트로젠사 제조)을 포함하는 Eagle's minimal essential medium(EMEM)배지(시그마사 제조, 이하 동일) 2 mL 중, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 상기 엑손 53 스키핑용의 각종 안티센스 올리고머(일본 바이오서비스사 제조)(1 μM)와 Lipofectamine 2000(인비트로젠사 제조)의 복합체를 제작하여, 1.8 mL로 배지교환한 RD세포에, 200 ㎕ 첨가하고, 종농도 100 nM로 하였다.

첨가 후, 하룻밤 배양하였다. 세포를 PBS(닛스이사 제조, 이하 동일)로 2회 세정한 후, ISOGEN(닛폰 진사 제조) 500 ㎕를 세포에 첨가하고, 수분간 실온에 방치하여 세포를 용해시키고, 그 용해물을 Eppendorf 튜브에 회수하였다. ISOGEN에 첨부된 프로토콜에 따라 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA의 농도는 NanoDrop ND-1000(엘·엠·에스사 제조)을 사용해서 측정하였다.

50℃, 30분간：역전사반응

94℃, 2분간：열변성

[94℃, 10초간；58℃, 30초간；68℃, 45초간]×30사이클：PCR 증폭

68℃, 7분간：폴리머라아제의 열 불활성화

94℃, 2분간：열변성

[94℃, 15초간；58℃, 30초간；68℃, 45초간]×30사이클：PCR 증폭

68℃, 7분간：폴리머라아제의 열 불활성화

실험결과

결과를 도 9~도 17에 나타낸다. 본 실험에 의해, 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손의 5' 말단으로부터 제31~61번째에 안티센스 올리고머를 설계한 경우, 높은 효율로 엑손 53을 스키핑시키는 것이 판명되었다.

[시험예 7]

RD세포(인간 횡문근육종 세포주) 3.5×10⁵개에 대해, 안티센스 올리고머 0.3~30 μM를 Aｍaxa Cell Line Nucleofector Kit L을 사용하여 Nucleofector II(Lonza)에 의해 도입하였다. 프로그램은 T-030을 사용하였다.

도입 후, 세포를, 10% 소 태아 혈청(FCS)(인비트로젠사 제조)을 포함하는 Eagle's minimal essential medium(EMEM)배지(시그마사 제조, 이하 동일) 2 mL 중, 37℃, 5%　CO₂ 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 세포를 PBS(닛스이사 제조, 이하 동일)로 2회 세정한 후, ISOGEN(닛폰 진사 제조) 500 ㎕를 세포에 첨가하고, 수분간 실온에 방치하여 세포를 용해시켜, 그 용해물을 Eppendorf 튜브에 회수하였다. ISOGEN에 첨부된 프로토콜에 따라 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA의 농도는 NanoDrop ND-1000(엘·엠·에스사 제조)을 사용해서 측정하였다.

추출한 total RNA 400 ng에 대해, QIAGEN　OneStep RT-PCR Kit(퀴아겐사 제조)를 사용하여 One-Step RT-PCR을 행하였다. 키트에 첨부된 프로토콜에 따라, 반응액을 조제하였다. 서멀 사이클러는 PTC-100(MJ Research사 제조)을 사용하였다. 사용한 RT-PCR의 프로그램은, 다음과 같다.

50℃, 30분간：역전사반응

95℃, 15분간：열변성

[94℃, 30초간；60℃, 30초간；72℃, 1분간]×35사이클：PCR 증폭

72℃, 10분간：폴리머라아제의 열 불활성화

상기 PCR의 반응산물 1 ㎕를 Bioanalyzer(아질렌트사 제조)를 사용해서 해석하였다.

실험결과

결과를 도 18 및 19에 나타낸다. 본 실험에 의해, PMO No.8의 본 발명의 올리고머는, PMO No.15 및 16의 안티센스 올리고머와 비교하여, 현저히 높은 효율로 엑손 53을 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 18). 또한, PMO No.3 및 8의 본 발명의 올리고머는, PMO No.13 및 14의 본 발명의 올리고머보다도 현저히 높은 효율로 엑손 53을 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 19). 이 결과로부터, 동일 서열이더라도, 5' 말단이-OH기인 편이, 스키핑 효율이 높은 것이 나타내어진다.

산업상이용가능성

시험예에 나타내는 실험결과로부터, 본 발명의 올리고머(PMO No.1~10)는, 종래기술에 관계되는 올리고머(PMO No.11, 12, 15 및 16)와 비교하여, 어느 세포환경에 있어서도, 현저히 높은 효율로 엑손 53을 스키핑시키는 것이 나타내어졌다. 또한, 시험예 2에서 사용한 5017세포는, DMD 환자로부터 채취한 세포이고, 또한, 시험예 3 및 5에서 사용한 섬유아세포도 DMD 환자 유래의 엑손 53 스키핑 대상세포이다. 특히, 시험예 3 및 5에 있어서, 본 발명의 올리고머는, 엑손 53 스키핑 대상이 되는 DMD 환자 유래의 세포에 있어서, 90% 이상의 엑손 53 스키핑 효율을 나타내기 때문에, 본 발명의 올리고머는, 실제로 DMD 환자에게 투여한 경우에도, 고효율로 엑손 53을 스키핑시킨다고 할 수 있다.

따라서, 본 발명의 올리고머는, DMD의 치료에 있어서, 매우 유용하다.

서열표 프리텍스트

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서열번호 123：합성 핵산

서열표

서열목록 전자파일 첨부

Claims

인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머로서, 인간 디스트로핀 유전자의 제53번째의 엑손의 5' 말단으로부터 제32~56번째 또는 제36~56번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
제1항에 있어서,
올리고뉴클레오티드인 안티센스 올리고머.
제2항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 당부분 및 인산 결합부분으로부터 선택되는 하나 이상이 수식되어 있는 안티센스 올리고머.
제3항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 당부분이, 2' 위치의 -OH기가, OR, R, R'OR, SH, SR, NH₂, NHR, NR₂, N₃, CN, F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 기로 치환된 리보오스인 안티센스 올리고머.
(상기 R은 알킬 또는 아릴을 나타내고, 상기 R'는 알킬렌을 나타낸다.)
제3항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 인산 결합부분이, 포스포로티오에이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합, 알킬포스포네이트 결합, 포스포로아미데이트 결합, 및 보라노포스페이트 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 것인 안티센스 올리고머.
제1항에 있어서,
모르폴리노 올리고머인 안티센스 올리고머.
제6항에 있어서,
포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머인 안티센스 올리고머.
제6항에 있어서,
5' 말단이 하기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 기인 안티센스 올리고머.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
서열번호 11 또는 35 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
제1항 내지 제8항 및 제12항 중 어느 한 항에 기재된 안티센스 올리고머, 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물을 유효성분으로 하는, 근이영양증(muscular dystrophy) 치료용 의약 조성물.
제13항에 있어서,
뒤시엔느형 근이영양증 환자용으로 투여하기 위한 것인, 근이영양증 치료용 의약 조성물.