WO2011155607A1 - 抗ｔｉｍ－３抗体 - Google Patents

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seq
tim
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晋一郎 高柳
ひとみ 戸村
知紀 俵
好昌 稲垣
麗夫 久保田
浩一 赤司
吉謙 菊繁
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協和発酵キリン株式会社
国立大学法人九州大学
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention binds to the extracellular region of T-cell immunoglobulin and mucin domain containing molecular-3 (hereinafter referred to as TIM-3) and has antibody-dependent cytotoxic activity (hereinafter referred to as anti-dependent cellular activity, hereinafter referred to as “antibody-dependent cellular activity”). Or a fragment thereof, a hybridoma producing the antibody, a DNA encoding the antibody, a vector containing the DNA, a transformant obtained by introducing the vector, the hybridoma or the transformation
  • the present invention relates to a method for producing an antibody or antibody fragment using a body, a therapeutic agent and a diagnostic agent comprising the antibody or antibody fragment as an active ingredient.
  • the TIM gene family consists of 8 genes in mice and 3 genes in humans, and exists in the 11th chromosome and 5q33 region, respectively (Non-patent Document 1). These gene regions are associated with autoimmune diseases and allergic diseases.
  • the TIM protein is a type I transmembrane protein having a structurally conserved immunoglobulin variable (IgV) domain and a mucin domain.
  • TIM proteins were initially expressed specifically on T cells and were thought to directly control their activity, but recently their expression and function on antigen-presenting cells have also been reported ( Non-patent document 2). It is known by crystal structure analysis that the TIM protein has a conserved structure and has a ligand binding site in the IgV domain.
  • TIM-3 was identified as a molecule that is not expressed in Th2 cells but specifically expressed in mouse Th1 cells (Non-patent Document 3).
  • the DNA sequence, amino acid sequence, and three-dimensional structure of TIM-3 are published on public databases and can be referred to from accession numbers such as NM_032782 and NM_134250 (GenBank).
  • TIM-3 is also called HAVCR2.
  • TIM-3 is expressed in T cells in humans as well as in mice, and is also expressed in phagocytic cells such as macrophages or dendritic cells. TIM-3 inhibits Th1 response through a mechanism such as inducing apoptosis in Th1 cells by binding to a ligand protein (eg, galectin-9), and induces peripheral tolerance, for example.
  • a ligand protein eg, galectin-9
  • IFN ⁇ interferon ⁇
  • TIM-3 expression was not observed in CD4 positive T cells derived from autoimmune disease patients.
  • the cerebrospinal fluid-derived T cell clones of multiple sclerosis patients had lower TIM-3 expression and higher IFN ⁇ secretion than non-healthy clones (Non-patent Document 4).
  • TIM-3 has also been suggested to be associated with allergy or asthma disease (Patent Documents 1 and 2).
  • AML acute myeloid leukemia
  • TIM-3 is expressed on AML stem cells and is associated with hematologic tumors.
  • Anti-TIM-3 monoclonal antibodies established so far include anti-human TIM-3 rat monoclonal antibody (Clone 344823, manufactured by R & D Systems), anti-human TIM-3 mouse monoclonal antibody (Clone F38-2E2, eBioscience) Manufactured) is known.
  • an object of the present invention is to provide a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof that binds to the amino acid sequence of the extracellular region of human TIM-3, or a three-dimensional structure thereof, and exhibits ADCC activity.
  • Another object of the present invention is to provide an anti-human TIM-3 antibody having high ADCC activity by searching for an anti-human TIM-3 antibody that competes with the monoclonal antibody or antibody fragment thereof.
  • the present invention relates to a hybridoma producing the antibody, a DNA encoding the antibody, a vector containing the DNA, a transformant obtained by introducing the vector, an antibody using the hybridoma or the transformant, or the An object of the present invention is to provide a method for producing an antibody fragment, and a therapeutic agent and a diagnostic agent containing the antibody or the antibody fragment as an active ingredient.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • CDRs 1 to 3 each include an antibody heavy chain (hereinafter referred to as H chain) comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 3, respectively.
  • CDRs 1 to 3 are represented by SEQ ID NOs: 11 to 13, respectively.
  • An antibody comprising the H chain of an antibody comprising the amino acid sequence and the CDR1 to 3 comprising the L chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 14 to 16, respectively (iii)
  • the antibody includes the heavy chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by 23, and CDRs 1 to 3 comprise the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 24-26, respectively.
  • An antibody comprising an L chain of an antibody (2) The monoclonal antibody or the antibody fragment thereof according to (1), which is a monoclonal antibody that binds to the same epitope as one antibody selected from (i) to (iii) above.
  • a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof that competes with the following antibody (a) or (b) and binds to the extracellular region of human TIM-3.
  • (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 An antibody comprising a VH of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, and an antibody comprising the VL of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20
  • a monoclonal antibody and the antibody fragment which are the following (a) or (b):
  • the transformed strain according to (13) is cultured in a medium, and the monoclonal antibody or the antibody fragment according to any one of (1) to (10) is produced and accumulated in the culture, The method for producing a monoclonal antibody or the antibody fragment according to any one of (1) to (10), wherein the antibody or the antibody fragment is collected.
  • a reagent for detecting or measuring human TIM-3 comprising the monoclonal antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (10).
  • a diagnostic agent for a disease involving human TIM-3-positive cells comprising the monoclonal antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (10).
  • Involves human TIM-3-positive cells comprising detecting or measuring human TIM-3-positive cells using the monoclonal antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (10) Disease diagnosis method.
  • a disease involving a human TIM-3-positive cell comprising detecting or measuring human TIM-3 using the monoclonal antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (10) Diagnosis method.
  • a therapeutic agent for a disease involving human TIM-3-positive cells comprising the monoclonal antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (10).
  • (22) Involves human TIM-3-positive cells, comprising inducing cell death of human TIM-3-positive cells using the monoclonal antibody according to any one of (1) to (10) or the antibody fragment thereof To treat disease.
  • (23) Use of the monoclonal antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (10) for producing a therapeutic agent for a disease involving human TIM-3-positive cells.
  • the monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention specifically recognizes a specific amino acid sequence in the extracellular region of human TIM-3 or its three-dimensional structure and binds to the extracellular region.
  • the amino acid sequence of the extracellular region of human TIM-3 recognized by the monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention or its three-dimensional structure is different from the amino acid sequence recognized by the conventional anti-TIM-3 monoclonal antibody or its three-dimensional structure.
  • high ADCC activity can be exhibited.
  • the monoclonal antibody or antibody fragment of the present invention that specifically binds to the extracellular region of human TIM-3 and has high ADCC activity is very useful for the treatment and diagnosis of diseases involving human TIM-3-positive cells. Useful.
  • the present invention also relates to a hybridoma producing the antibody, a DNA encoding the antibody, a vector containing the DNA, a transformant obtained by introducing the vector, an antibody using the hybridoma or the transformant, or the A method for producing an antibody fragment, a therapeutic agent and a diagnostic agent comprising the antibody or the antibody fragment as an active ingredient can be provided.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequences of the H chain variable regions HV0, HV3, HV4, HV5, HV6, HV7, HV8, HV10, and HV12 of the designed 8213 antibody.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequences of the L chain variable regions LV0, LV2, LV4, LV5, LV6, LV7, and LV9 of the designed 8213 antibody.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 or GenBank accession number NM_032782 and having the function of human TIM-3, and SEQ ID NO: 53 or GenBank accession number NM_032782
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is preferably 1 to several tens, for example 1 to 20, more preferably 1 to several, for example 1 to 5 amino acids. It is.
  • Examples of the gene encoding human TIM-3 include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 52 or GenBank accession number NM_032782.
  • a DNA encoding a polypeptide consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 52 or GenBank accession number NM_032782, and having a function of human TIM-3 A nucleotide sequence having at least 60% or more homology with the gene comprising SEQ ID NO: 52 or GenBank accession number NM_032782, preferably having a homology of 80% or more, more preferably 95% or more
  • a gene comprising a DNA comprising a homologous base sequence and encoding a polypeptide having the function of human TIM-3, and a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 52 or GenBank accession number NM_032782 Consists hybridizing DNA in matters under and are encompassed gene encoding human TIM-3 also
  • DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 52 or GenBank Accession No. NM_032782 is used as a probe, colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot -It means a hybridizable DNA obtained by a hybridization method or a DNA microarray method.
  • 0.7 to 1.0 mol / L of sodium chloride is present using a DNA or DNA derived from a hybridized colony or plaque, or a filter or slide glass on which a PCR product or oligo DNA having the sequence is immobilized.
  • the hybridizable DNA is DNA having at least 60% homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 52 or GenBank Accession No. NM_032782, preferably DNA having 80% homology, more preferably Mention may be made of DNA having a homology of 95% or more.
  • the gene used in the present invention includes a gene in which a small-scale mutation has occurred in the nucleotide sequence due to such a polymorphism, and is included in the gene encoding TIM-3 of the present invention.
  • the numerical value of homology in the present invention may be a numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art unless otherwise specified, but the base sequence may be BLAST [J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)], for amino acid sequences such as numerical values calculated using default parameters, BLAST2 [Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997), Genome Res. 7, 649 (1997), http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / Education / BLASTinfo / information3. numerical values calculated using default parameters in [html].
  • the default parameters are 5 if G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 if it is an amino acid sequence, 2 if -E (Cost to extend gap) is a base sequence, and 1 if it is an amino acid sequence.
  • -Q (Penalty for nucleotide mismatch) is -3
  • -r (reward for nucleotide match) is 1
  • -e (expect value) is 10
  • 11 residues when -W (wordsize) is a base sequence
  • -y [Dropoff (X) for blast extensions in bits] is 20 if blastn, 7 for programs other than blastn
  • -X X dropoff value If the organized alignment in bits is 15 and Z (final X dropoff value for gapd alignment in bits) is blastn, it is 25 for programs other than blastn (http://www.vn.cn. blast / html / blastcgihelp.html).
  • a polypeptide consisting of a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 or GenBank accession number NM_032782 can be prepared by a method known to those skilled in the art, for example, a DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 Can be prepared by culturing a transformant into which an expression vector containing this is introduced.
  • polypeptide or DNA produced by the above method one or more amino acids are deleted in the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 or GenBank accession number NM_032782 by the same method as described above.
  • a polypeptide having a substituted or added amino acid sequence can be obtained.
  • polypeptide having a substituted or added amino acid sequence can also be produced by a chemical synthesis method such as a fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) method or a t-butyloxycarbonyl (tBoc) method.
  • Fmoc fluorenylmethyloxycarbonyl
  • tBoc t-butyloxycarbonyl
  • the amino acid sequence of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 53 is converted into a known transmembrane region prediction program SOSUI (http: //bp.nuap.nagoya-u. ac.jp/sosui/sosui_submit.html), TMHMM ver. 2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/), ExPASy Proteomics Server (http://Ca.expasy.org/) or SMART (http: //smart.embl- For example, a region predicted using heidelberg.de/) is used.
  • the amino acid sequence of the extracellular region of human TIM-3 in the present invention includes the 1st to 201st amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 53, which are extracellular domains predicted in SMART.
  • the three-dimensional structure of the extracellular region of human TIM-3 in the present invention is equivalent to the structure that the extracellular region of human TIM-3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 or GenBank accession number NM_032782 can take in the natural state. Any structure may be used as long as it has the following structure.
  • the three-dimensional structure that the extracellular region of human TIM-3 can take in the natural state refers to the natural three-dimensional structure of human TIM-3 expressed on the cell membrane.
  • the function of human TIM-3 is to inhibit the Th1 response through a mechanism such as inducing apoptosis in Th1 cells by binding to a ligand protein (eg, galectin-9).
  • a ligand protein eg, galectin-9
  • phagocytic cells it means that apoptotic cells are recognized as receptors.
  • the binding of the monoclonal antibody of the present invention (hereinafter also referred to as the antibody of the present invention) or an antibody fragment thereof to the amino acid sequence of the extracellular region of human TIM-3 or its three-dimensional structure can be achieved by a solid phase sandwich method or the like.
  • a fluorescent antibody staining method using a FMAT8100HTS system (Applied Biosystems) or the like [Cancer Immunol. Immunother. 36, 373 (1993)]
  • fluorescent cell staining using flow cytometry or surface plasmon resonance using a Biacore system (manufactured by GE Healthcare).
  • the cell expressing human TIM-3 may be any cell as long as it expresses TIM-3.
  • a cell naturally existing in the human body a cell established from a cell naturally existing in the human body Strains or cells obtained by genetic recombination techniques.
  • Examples of cells naturally present in the human body include cells in which the TIM-3 is expressed in patients with cancer, autoimmune diseases or allergic diseases, and specifically include Th1 cells, macrophages. And dendritic cells.
  • cell lines established from cells naturally present in the human body include, for example, cell lines obtained by stocking cells expressing the TIM-3 obtained from the above cancer patients, A cell line expressing the TIM-3 can be mentioned.
  • a cell line expressing the TIM-3 can be mentioned.
  • an acute myeloid leukemia-derived cell line KG-1 American Type Culture Collection (ATCC) number: CCL-246] or a Burkitt lymphoma-derived cell line Daudi (ATCC number: CCL-213), which is a cell line established from humans ) And the like.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • Daudi Burkitt lymphoma-derived cell line Daudi
  • cells obtained by gene recombination techniques include, for example, the TIM-3 obtained by introducing an expression vector containing cDNA encoding the TIM-3 into insect cells or animal cells. And the like.
  • the present invention also relates to a monoclonal antibody that binds to the amino acid sequence of the extracellular region of human TIM-3 or its three-dimensional structure and exhibits ADCC activity.
  • the ADCC activity in the present invention means that an antibody bound to human TIM-3 on the cell surface mainly binds to Fc ⁇ RIIIa on the surface of natural killer cells (hereinafter referred to as NK cells) via the Fc portion.
  • NK cells natural killer cells
  • the antibody of the present invention includes an amino acid sequence of the extracellular region of human TIM-3, or an antibody or an antibody fragment thereof that recognizes the three-dimensional structure and binds to the extracellular region, or the extracellular region of human TIM-3 Any antibody may be included as long as it is a monoclonal antibody or an antibody fragment that binds to the amino acid sequence of or its three-dimensional structure and has ADCC activity.
  • the antibody of the present invention is preferably the 67th to 105th of the extracellular region consisting of the 1st to 201st amino acid sequences in the amino acid sequence of human TIM-3 represented by SEQ ID NO: 53.
  • CDRs 1 to 3 each include an antibody heavy chain (hereinafter referred to as H chain) comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 3, respectively.
  • a monoclonal antibody comprising a light chain (hereinafter referred to as L chain) of an antibody in which CDRs 1 to 3 each contain the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 4 to 6, and an antibody fragment thereof (ii) CDRs 1 to 3 are each represented by SEQ ID NO: 11
  • the monoclonal antibody of the present invention include the following monoclonal antibodies (a) and (b) and antibody fragments thereof.
  • A a monoclonal antibody comprising the antibody VH comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 and comprising the VL of the antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 and an antibody fragment thereof
  • B A monoclonal antibody comprising the antibody VH comprising the amino acid sequence represented and the antibody VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 and antibody fragments thereof
  • the monoclonal antibody of the present invention the monoclonal antibody that binds to the amino acid sequence of the extracellular region of human TIM-3, or the three-dimensional structure thereof, and the antibody fragment thereof compete with the monoclonal antibody, and the monoclonal antibody binds. And monoclonal antibodies and antibody fragments thereof that bind to the same epitope as that present on the extracellular region of human TIM-3.
  • an antibody that competes with a monoclonal antibody has an epitope (also referred to as an antigenic determinant) in the extracellular region of human TIM-3 that is the same or partially the same as the monoclonal antibody of the present invention.
  • the antibody that binds to the same epitope to which the monoclonal antibody of the present invention binds refers to an antibody that recognizes and binds to the same sequence as the human TIM-3 amino acid sequence recognized by the monoclonal antibody of the present invention.
  • Examples of the monoclonal antibody of the present invention include an antibody produced by a hybridoma, or a recombinant antibody produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene.
  • a monoclonal antibody is an antibody that is secreted by an antibody-producing cell of a single clone, recognizes only one epitope (also referred to as an antigenic determinant), and has a uniform amino acid sequence (primary structure) constituting the monoclonal antibody. It is a feature.
  • epitopes include a single amino acid sequence that is recognized and bound by a monoclonal antibody, a three-dimensional structure composed of amino acid sequences, a three-dimensional structure composed of amino acid sequences bound to sugar chains, and a three-dimensional structure composed of amino acid sequences bound to sugar chains.
  • the monoclonal antibody of the present invention is the amino acid sequence of the human TIM-3 IgV domain represented by the 22nd to 131st amino acid sequences of the amino acid sequence of the extracellular region of human TIM-3 represented by SEQ ID NO: 53 It is preferable to bind to.
  • the amino acid sequence to which the monoclonal antibody of the present invention binds is preferably the 67th to 105th amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, more preferably the 67th to 96th amino acid sequence, More preferably, it is the 67th to 87th amino acid sequence.
  • the epitope to which the monoclonal antibody of the present invention binds is the human TIM-3 IgV represented by the 22nd to 131st amino acid sequences of the amino acid sequence of the extracellular region of human TIM-3 represented by SEQ ID NO: 53. It is preferably included in the domain.
  • the epitope to which the monoclonal antibody of the present invention binds is preferably contained in the 67th to 105th amino acid sequence, and more preferably contained in the 67th to 96th amino acid sequence. Preferably, it is more preferably contained in the 67th to 87th amino acid sequences.
  • the amino acid sequence of the epitope to which the monoclonal antibody of the present invention binds preferably contains at least one amino acid selected from the 67th to 87th amino acids of SEQ ID NO: 53 among the amino acid sequences of the human TIM-3 IgV domain. 67, 74, 76, 78, 79, 81, 83 and 85, more preferably at least one amino acid selected from the amino acids.
  • the amino acid sequence of the epitope to which the monoclonal antibody of the present invention binds is at least two or more consecutive amino acids selected from the 67th to 87th amino acid sequences of SEQ ID NO: 53 among the amino acid sequences of the IgV domain of human TIM-3. It preferably contains an amino acid, contains at least one amino acid selected from the 67th, 74th, 76th, 78th, 79th, 81st, 83rd and 85th amino acids, and from the 67th position of SEQ ID NO: 53 More preferably, it comprises at least two consecutive amino acids selected from the 87th amino acid sequence.
  • amino acid sequence of the epitope to which the monoclonal antibody of the present invention binds, the amino acid sequence containing the 67th to 74th amino acids of SEQ ID NO: 53, the amino acid sequence containing the 67th to 76th amino acids, the 67th position Amino acid sequence including the amino acid sequence of the 78th amino acid, an amino acid sequence including the amino acid sequence of the 67th to 79th amino acid, an amino acid sequence including the amino acid of the 67th to 81st amino acid sequence, An amino acid sequence comprising the Amino acid sequence including amino acids 74 to 76, amino acid sequence including amino acids 74 to 78, amino acid sequences including amino acids 74 to 79, amino acid sequences including amino acids 74 to 81, 74 An amino acid sequence comprising the 83rd amino acid, an amino acid sequence comprising the 74th to 85th amino acid, Amino acid sequence including the 76th to 78th amino acids, Amino acid sequence including the 76th to
  • the hybridoma is prepared, for example, by using a cell expressing the above human TIM-3 as an antigen, and inducing an antibody-producing cell having antigen specificity from an animal immunized with the antigen. It can be prepared by fusing cells.
  • An anti-TIM-3 monoclonal antibody can be obtained by culturing the hybridoma or administering the hybridoma cells to an animal to cause the animal to undergo ascites tumor, and separating and purifying the culture medium or ascites. .
  • Any animal can be used as the animal to immunize with the antigen as long as it can produce a hybridoma.
  • a mouse, a rat, a hamster, a chicken or a rabbit is used.
  • An antibody produced by a hybridoma prepared by obtaining a cell capable of producing an antibody from such an animal, immunizing the cell in vitro, and then fusing it with a myeloma cell is also an antibody of the present invention. Is included.
  • the recombinant antibody includes an antibody produced by genetic recombination, such as a human chimeric antibody, a human CDR-grafted antibody, a human antibody or an antibody fragment.
  • a recombinant antibody having characteristics of a monoclonal antibody, low antigenicity, and extended blood half-life is preferable as a therapeutic agent.
  • Examples of the recombinant antibody include those obtained by modifying the monoclonal antibody of the present invention using a gene recombination technique.
  • the human chimeric antibody refers to an antibody comprising VH and VL of a non-human animal antibody and a heavy chain constant region (hereinafter referred to as CH) and light chain constant region (hereinafter referred to as CL) of a human antibody.
  • the human chimeric antibody of the present invention encodes VH and VL from a hybridoma that specifically recognizes human TIM-3 and produces a monoclonal antibody that binds to the amino acid sequence of the extracellular region or its three-dimensional structure.
  • Obtaining cDNA inserting it into an animal cell expression vector having genes encoding human antibody CH and CL, constructing a human chimeric antibody expression vector, introducing it into an animal cell, and expressing and producing it Can do.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any CH as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as hIg), but preferably the hIgG class is used, and hIgG1, hIgG2, and hIgG3 belonging to the hIgG class. Alternatively, any subclass such as hIgG4 can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • the human chimeric antibody of the present invention contains a VH of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28, and a chimeric antibody comprising the VL of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 Is mentioned.
  • the chimeric antibody of the present invention includes a chimeric antibody that binds to the amino acid sequence of the extracellular region of human TIM-3, or its three-dimensional structure in competition with the monoclonal antibody of the present invention, and the human to which the above-described chimeric antibody binds. Mention may be made of chimeric antibodies that bind to the same epitope as that present on the extracellular region of TIM-3.
  • the human CDR-grafted antibody is sometimes referred to as a humanized antibody, and refers to an antibody obtained by grafting the VH and VL CDR amino acid sequences of non-human animal antibodies to appropriate positions of the human antibodies VH and VL.
  • the human CDR-grafted antibody of the present invention is produced from a hybridoma that specifically recognizes human TIM-3 and produces a monoclonal antibody of a non-human animal that binds to the amino acid sequence of the extracellular region or its three-dimensional structure.
  • a cDNA encoding the V region obtained by grafting the VH and VL CDR amino acid sequences of the non-human animal antibody into the VH and VL framework regions (hereinafter referred to as FR) of any human antibody is constructed.
  • the human CDR-grafted antibody expression vector can be constructed by inserting it into an animal cell expression vector having genes encoding human antibodies CH and CL, respectively, and introduced into animal cells for expression and production.
  • the CH of the human CDR-grafted antibody may be any as long as it belongs to hIg, but preferably the hIgG class is used, and any subclass such as hIgG1, hIgG2, hIgG3, or hIgG4 belonging to the hIgG class should be used. Can do.
  • the CL of the human CDR-grafted antibody may be any CL as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • the human CDR-grafted antibody of the present invention includes VH of an antibody in which CDR1 to 3 include the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 21 to 23, and CDR1 to 3 include SEQ ID NOs: 24 to 26. And humanized antibodies that contain the VL of the antibody comprising the amino acid sequence represented.
  • humanized antibody of the present invention include humanized antibodies containing at least one of the following (a) VH and (b) VL.
  • (1) to (8) are preferable as VH contained in the humanized antibody of the present invention.
  • 12th Lys, 20th Val, 38th Arg, 40th Ala, 48th Met, 67th Arg, 68th Val, 70th Ile in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 which includes an amino acid sequence in which the 72nd Ala, the 74th Thr, the 98th Arg, and the 113th Val are substituted with other amino acid residues
  • 12th Lys, 38th Arg, 40th Ala, 48th Met, 67th Arg, 68th Val, 70th Ile, 72nd Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 , 74th Thr, and 98th Arg include an amino acid sequence substituted with another amino acid residue (3) 20th Val, 38th Arg, 48th Met, 68th Val, 70th Ile, 72nd Ala, 98th Arg, and 113th in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 VH
  • amino acid sequence of VH for example, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67, 12th Lys is Val, 20th Val is Leu, 38th Arg is Lys, and 40th Ala is Arg. 48th Met to Ile, 67th Arg to Lys, 68th Val to Ala, 70th Ile to Leu, 72nd Ala to Val, 74th Thr to Lys, 98
  • An amino acid sequence into which at least one modification selected from the modification in which the 1st Arg is substituted with Gly or the 113th Val is substituted with Leu is included.
  • the amino acid sequence of VH into which 12 modifications are introduced is, for example, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67, the 12th Lys to Val, the 20th Val to Leu, and the 38th Arg to Lys, 40th Ala to Arg, 48th Met to Ile, 67th Arg to Lys, 68th Val to Ala, 70th Ile to Leu, 72nd Ala Val includes an amino acid sequence in which the 74th Thr is replaced with Lys, the 98th Arg is replaced with Gly, and the 113th Val is replaced with Leu.
  • amino acid sequence of VH into which 11 modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (12).
  • the 20th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Leu
  • the 38th Arg is Lys
  • the 40th Ala is Arg
  • the 48th Met is Ile
  • the 67th Arg is Lys.
  • the 68th Val is replaced with Ala
  • the 70th Ile is replaced with Leu
  • the 72nd Ala is replaced with Val
  • the 74th Thr is replaced with Lys
  • the 98th Arg is replaced with Gly
  • the 113th Val is replaced with Leu.
  • the 12th Lys is Val
  • the 38th Arg is Lys
  • the 40th Ala is Arg
  • the 48th Met is Ile
  • the 67th Arg To Lys 68th Val to Ala
  • 70th Ile to Leu 72nd Ala to Val
  • 74th Thr to Lys 98th
  • the amino acid sequence in which Arg is replaced with Gly and the 113th Val is replaced with Leu (3)
  • the 12th Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Val
  • the 20th Val is Leu
  • the 40th Ala is Arg 48th Met to Ile, 67th Arg to Lys, 68th Val to Ala, 70th Ile to Leu, 72nd Ala to Val, 74th Thr to Lys
  • the amino acid sequence in which the 98th Arg is replaced with Gly and the 113th Val is replaced with Leu (4)
  • the 12th Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Val
  • Amino acid sequence (11) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67, 12th Lys is Val, 20th Val is Leu, 38th Arg is Lys, 40th Ala is Arg, and 48th Met is Ile, 67th Arg to Lys, 68th Val to Ala, 70th Ile to Leu, 72nd Ala to Val, 74th
  • amino acid sequence (12) of SEQ ID NO: 67 wherein Thr is replaced with Lys and Thr of 113 is replaced with Leu
  • the 12th Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Val
  • the 20th Val is Leu
  • the 38th Arg is Lys
  • 40th Ala to Arg 48th Met to Ile, 67th Arg to Lys
  • 68th Val to Ala
  • amino acid sequence of VH into which 10 modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (8).
  • the 12th Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Val
  • the 38th Arg is Lys
  • the 40th Ala is Arg
  • the 48th Met is Ile
  • the 67th Arg is Lys.
  • Amino acid sequence (6) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67, 38th Arg is Lys, 40th Ala is Arg, 48th Met is Ile, 67th Arg is Lys, and 68th Val is Ala, 70th Ile to Leu, 72nd Ala to Val, 74th Thr to Lys, 98th Arg to Gly, and 1 The amino acid sequence in which the 13th Val is replaced with Leu (7) The 12th Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Val, the 20th Val is Leu, the 38th Arg is Lys, and the 40th Ala To Arg, 48th Met to Ile, 68th Val to Ala, 70th Ile to Leu, 72nd Ala to Val, 98th Arg to Gly, and 113th Val In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 substituted with Leu, the 12th Lys is Val, the 38th Arg is Lys, the 40th Ala is Arg, the 48th
  • amino acid sequence of VH into which 8 modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (13).
  • the 20th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Leu
  • the 38th Arg is Lys
  • the 48th Met is Ile
  • the 68th Val is Ala
  • the 70th Ile is Leu.
  • the amino acid sequence in which the 72nd Ala is replaced with Val, the 98th Arg is replaced with Gly, and the 113th Val is replaced with Leu.
  • the 38th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is replaced with Lys.
  • Ala is Arg
  • the 48th Met is Ile
  • the 68th Val is Ala
  • the 70th Ile is Leu
  • the 72nd Al Is replaced with Val
  • 98th Arg is Gly
  • 113th Val is replaced with Leu.
  • the 38th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Lys
  • the 40th Ala is Arg.
  • the 12th Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Val, the 38th Arg is Lys, the 48th Met is Ile, the 68th Val is Ala, the 70th Ile is Leu, Amino acid sequence in which 72nd Ala is replaced with Val, 74th Thr is replaced with Lys, and 98th Arg is replaced with Gly (12) 12th Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Val, 38th Arg to Lys, 40th Ala to Arg, 48th Met to Ile, 68th Val to Ala, 70th Ile In the amino acid sequence (13) SEQ ID NO: 67 in which the 72nd Ala is replaced with Val and the 98th Arg is replaced with Gly, the 12th Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Val, the 20th Val is Leu, The 38th Arg was replaced with Lys, the 48th Met replaced with Ile, the 68th Val replaced with Ala, the 70th Ile
  • amino acid sequence of VH into which seven modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (11).
  • the 38th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Lys
  • the 40th Ala is Arg
  • the 48th Met is Ile
  • the 67th Arg is Lys
  • the 72nd Ala is Val.
  • Amino acid sequence in which 74 th Thr is replaced by Lys and 98 th Arg is replaced by Gly (2) 38 th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Lys, 48 th Met is Ile, 68 th The amino acid sequence in which Val is replaced with Ala, the 70th Ile is replaced with Leu, the 72nd Ala is replaced with Val, the 74th Thr is replaced with Lys, and the 98th Arg is replaced with Gly (3) amino acid of SEQ ID NO: 67 In the sequence, the 38th Arg is Lys, the 48th Met is Ile, the 67th Arg is Lys, the 70th Ile is Leu, 72 The amino acid sequence in which Ala is replaced with Val, 74th Thr is replaced with Lys, and 98th Arg is replaced with Gly.
  • the 38th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Lys, and the 48th Met is Ile, 67th Arg to Lys, 68th Val to Ala, 72nd Ala to Val, 74th Thr to Lys, and 98th Arg to Gly (5)
  • the 38th Arg is Lys
  • the 48th Met is Ile
  • the 67th Arg is Lys
  • the 68th Val is Ala
  • the 70th Ile is Leu
  • the 38th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 Lys, 40th Ala
  • the amino acid sequence in which the 98th Arg is substituted with Gly (9)
  • the 38th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Lys, the 40th Ala is Arg, the 48th Met is Ile, and the 67th Arg in Lys, 72nd Ala in Val, 74th Thr in Lys, and 98th Arg in Gly (10)
  • the 38th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Lys 40th Ala to Arg, 48th Met to Ile, 67th Arg to Lys, 70th Ile to Leu, 72nd Ala to Val, and 98th Arg to Gly
  • the 38th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Lys
  • the 40th Ala is Arg
  • the 48th The et to Ile, in Lys 67 th Arg, the 68th Val in Ala, 72 th Ala to Val and the amino acid sequence obtained by replacing 98
  • amino acid sequence of VH into which six modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (16).
  • the 12th Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Val
  • the 67th Arg is Lys
  • the 68th Val is Ala
  • the 72nd Ala is Val
  • the 74th Thr is Lys.
  • the 12th Lys is Val
  • the 20th Val is Leu
  • the 38th Arg is Lys
  • 48th position the amino acid sequence of VH into which six modifications have been introduced.
  • Amino acid sequence in which Met of Ile is replaced by Ile, 67th Arg is replaced by Lys, and 98th Arg is replaced by Gly (3) 12th Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Val, 38th Arg is Lys, 40th Ala in Arg, 48th Met in Ile, 67th Arg in Lys, and 98th Arg in Gly
  • the 12th Lys is Val
  • the 38th Arg is Lys
  • the 48th Met is Ile
  • the 67th Arg is Lys
  • the 68th Val Is replaced with Ala
  • the 98th Arg is replaced with Gly.
  • the 12th Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Val
  • the 38th Arg is Lys
  • the 48th Met is Ile.
  • 67th Arg to Lys 72nd Ala to Val
  • 98th Arg to Gly amino acid sequence 12th Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 to Val, 38th Arg to Lys, 48th Met to Ile, 67th Arg to Lys, 74th Thr to Lys, and 98th rg is replaced with Gly (7)
  • the 20th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Leu
  • the 38th Arg is Lys
  • the 40th Ala is Arg
  • the 48th Met is Ile.
  • the amino acid sequence in which the 67th Arg is replaced with Lys and the 98th Arg is replaced with Gly (8)
  • the 20th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Leu, the 38th Arg is Lys, the 48th Amino acid sequence in which Met of Ile is substituted with Ile, 67th Arg with Lys, 68th Val with Ala, and 98th Arg with Gly (9)
  • 20th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 Leu, 38th Arg to Lys, 48th Met to Ile, 67th Arg to Lys, 72nd Ala to Val In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67, the 20th Val in Leu, the 38th Arg in Lys, the 48th Met in Ile, and the 67th Arg is Lys, 74th Thr is replaced by Lys, and 98th Arg is replaced by Gly (11)
  • amino acid sequence of VH into which five modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (7).
  • the 38th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Lys
  • the 40th Ala is Arg
  • the 48th Met is Ile
  • the 67th Arg is Lys
  • the 98th Arg is Gly.
  • the 12th Lys is Val
  • the 38th Arg is Lys
  • the 48th Met is Ile
  • the 67th Arg is Lys
  • 98 The amino acid sequence in which the Arg is substituted with Gly (3)
  • the 20th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Leu
  • the 38th Arg is Lys
  • the 48th Met is Ile
  • the 67th Arg is The amino acid sequence in which Lys and 98th Arg are substituted with Gly
  • the 38th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Lys and 4
  • the amino acid sequence in which the Met is replaced with Ile
  • the 67th Arg is replaced with Lys
  • the 68th Val is replaced with Ala
  • the 98th Arg is replaced with Gly.
  • amino acid sequence of VH into which four modifications are introduced include the following amino acid sequences (1) to (8).
  • SEQ ID NO: 67 The amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 in which the 20th Val is replaced with Leu, the 38th Arg is replaced with Lys, the 48th Met is replaced with Ile, and the 67th Arg is replaced with Lys.
  • the 38th Arg is Lys
  • the 40th Ala is Arg
  • the 48th Met is Ile
  • the 67th Arg is Lys.
  • Substituted amino acid sequence (5) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67, the 38th Arg is replaced with Lys, the 48th Met is replaced with Ile, the 67th Arg is replaced with Lys, and the 68th Val is replaced with Ala Sequence (6)
  • the 38th Arg is replaced with Lys
  • the 48th Met is replaced with Ile
  • the 67th Arg is replaced with Lys
  • the 72nd Ala is replaced with Val (8)
  • amino acid sequence of VH into which three modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (9).
  • An amino acid sequence in which the 38th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is replaced with Lys, the 48th Met is replaced with Ile, and the 98th Arg is replaced with Gly (2) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67
  • the amino acid sequence in which the 12th Lys is replaced with Val, the 38th Arg is replaced with Lys, and the 48th Met is replaced with Ile (3)
  • the 20th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is replaced with Leu, and the 38th The amino acid sequence in which Arg is replaced with Lys and the 48th Met is replaced with Ile
  • the 38th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Lys
  • the 40th Ala is Arg
  • the 48th Met is The amino acid sequence substituted with Ile (5)
  • amino acid sequence in which 67th Arg is substituted with Lys (6)
  • the 38th Arg is replaced with Lys
  • the 48th Met is replaced with Ile
  • the 68th Val is replaced with Ala
  • the 38th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is replaced with Lys
  • the 48th Met is replaced with Ile
  • the 70th Ile is replaced with Leu.
  • amino acid sequence of VH into which two modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (21).
  • the 20th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is represented in Leu
  • the amino acid sequence in which the 38th Arg in the amino acid sequence is substituted with Lys, and the 48th Met is substituted with Ile
  • the 38th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Lys
  • the 67th Arg is Lys
  • the amino acid sequence substituted with (6) the 38th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 to Lys, and the 68th Val The amino acid sequence
  • amino acid sequence of VH into which one modification has been introduced include the following amino acid sequences (1) to (12).
  • SEQ ID NO: 67 The amino acid sequence in which the 38th Arg in the amino acid sequence of the amino acid sequence was substituted with Lys
  • the amino acid sequence in which the Met is replaced with Ile (6)
  • the 68th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Ala Substituted amino acid sequence (8) Amin
  • the following (1) to (6) are preferable.
  • (2) 11th Leu, 15th Val, 36th Tyr, 44th Pro, 46th Leu, 71st Phe, and 85th Thr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 are VL containing an amino acid sequence substituted with an amino acid residue
  • (3) 15th Val, 36th Tyr, 44th Pro, 46th Leu, 71st Phe, and 85th Thr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 are substituted with other amino acid residues.
  • VL containing the determined amino acid sequence (4) An amino acid sequence in which the 36th Tyr, 43rd Ala, 44th Pro, 46th Leu, and 85th Thr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 are substituted with other amino acid residues Including VL (5) VL including an amino acid sequence in which the 15th Val, the 36th Tyr, the 46th Leu, and the 71st Phe in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 are substituted with other amino acid residues (6) VL including an amino acid sequence in which the 36th Tyr and 44th Pro in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 are substituted with other amino acid residues
  • the 11th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Met
  • the 13th Ala is Val
  • the 15th Val is Leu
  • the 36th Tyr is Leu
  • the 43rd Introduced at least one modification selected from the modification of substituting Ala to Ser, 44th Pro to Phe, 46th Leu to Gly, 71st Phe to Tyr, and 85th Thr to Asp
  • the amino acid sequence made up is mentioned.
  • the 11th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Met
  • the 13th Ala is Val
  • Examples include amino acid sequences substituted with Asp.
  • amino acid sequence of VL into which eight modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (9).
  • the 13th Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Val
  • the 15th Val is Leu
  • the 36th Tyr is Leu
  • the 43rd Ala is Ser
  • the 44th Pro is Phe.
  • 11th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Met, 15th Val to Leu, 36th Tyr to Leu, 43rd Ala to Ser, 44th Pro to Phe, 46th Leu to Gly, 71st Phe to Tyr, and 85th Amino acid sequence in which Thr is substituted with Asp (3)
  • the 11th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Met, the 13th Ala is Val, and the 36th Amino acid sequence in which the Tyr of the above is replaced with Leu, the 43rd Ala with Ser, the 44th Pro with Phe, the 46th Leu with Gly, the 71st Phe with Tyr, and the 85th Thr with Asp (4)
  • the 11th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Met, the 13th Ala is Val, the 15th Val is Leu,
  • 11th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Met, 13th Ala to Val, 15th Val to Leu, 36th Tyr to Leu, 44th Pro to Phe, 46th Leu to G
  • 11th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Met
  • the 13th Ala is Val
  • the 15th Val is replaced with Leu
  • the 36th Tyr is replaced with Leu
  • the 43rd Ala is replaced with Ser
  • the 46th Leu is replaced with Gly
  • the 71st Phe is replaced with Tyr
  • 85th Thr is replaced with Asp.
  • Amino acid sequence (7) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69, the 11th Leu is Met, the 13th Ala is Val, the 15th Val is Leu, the 36th Tyr is Leu, and the 43rd Ala is Ser, amino acid sequence obtained by substituting 44th Pro for Phe, 71st Phe for Tyr and 85th Thr for Asp (8) In the amino acid sequence of No.
  • the 11th Leu is Met
  • the 13th Ala is Val
  • the 15th Val is Leu
  • the 36th Tyr is Leu
  • the 43rd Ala is Ser
  • the 44th Amino acid sequence in which Pro is replaced with Phe, 46th Leu with Gly, and 85th Thr with Asp (9)
  • the 11th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Met
  • the 13th Ala is Val
  • amino acid sequence of VL into which seven modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (9).
  • the 11th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Met, the 15th Val is Leu, the 36th Tyr is Leu, the 44th Pro is Phe, and the 46th Leu is Gly.
  • the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Leu, the 36th Tyr is Leu, and the 43rd
  • the 11th Leu in the array is Met
  • the 36th Tyr is Leu
  • the 43rd Ala is Ser
  • the 44th Pro is Phe
  • the 11th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Met
  • the 15th Val is Amino acid sequence in which Leu, 43rd Ala is replaced with Ser, 44th
  • the amino acid sequence in which the 85th Thr is replaced with Asp (9)
  • the 11th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Met, the 15th Val is Leu, the 36th Tyr is Leu, the 43rd An amino acid sequence in which Ala is replaced with Ser, 44th Pro is replaced with Phe, 46th Leu is replaced with Gly, and 71st Phe is replaced with Tyr.
  • amino acid sequence of VL into which six modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (6).
  • the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Leu
  • the 36th Tyr is Leu
  • the 44th Pro is Phe
  • the 46th Leu is Gly
  • the 71st Phe is Tyr.
  • the amino acid sequence in which the 85th Thr is substituted with Asp (2)
  • the 36th Tyr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Leu, the 43rd Ala is Ser, the 44th Pro is Phe, and the 46th Amino acid sequence in which Leu of Gly is substituted with Gly, 71st Phe with Tyr, and 85th Thr with Asp (3)
  • the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Leu, and the 36th Tyr is Place Leu, 43rd Ala in Ser, 44th Pro in Phe, 46th Leu in Gly, and 85th Thr in Asp.
  • the 11th Leu is Met
  • the 36th Tyr is Leu
  • the 44th Pro is Phe
  • the 46th Leu is Gly
  • the 71st Phe In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69, 11th Leu in Met, 36th Tyr in Leu, and 43rd Ala in Ser Amino acid sequence in which the 44th Pro is replaced with Phe, the 46th Leu with Gly, and the 85th Thr with Asp (6)
  • the 11th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is represented by Met, Ala to Val, 36th Tyr to Leu, 44th Pro to Phe, 46th Leu to Gly, and 85th
  • amino acid sequence of VL into which five modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (7).
  • the 36th Tyr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Leu
  • the 43rd Ala is Ser
  • the 44th Pro is Phe
  • the 46th Leu is Gly
  • the 85th Thr is Asp.
  • amino acid sequence of VL into which four modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (10).
  • Amino acid sequence in which the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is replaced with Leu, the 36th Tyr is replaced with Leu, the 46th Leu is replaced with Gly, and the 71st Phe is replaced with Tyr (2) An amino acid sequence in which the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is replaced with Leu, the 36th Tyr is replaced with Leu, the 44th Pro is replaced with Phe, and the 46th Leu is replaced with Gly (3) SEQ ID NO: 69 The amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 in which the 15th Val is replaced with Leu, the 36th Tyr is replaced with Leu, the 44th Pro is replaced with Phe, and the 71st Phe is replaced with Tyr.
  • the 15th Val is Leu
  • the 36th Tyr is Leu
  • the 44th Pro is Phe
  • the 85th Thr is Asp.
  • Substituted amino acid sequence (5) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69, the 15th Val is replaced with Leu, the 36th Tyr is replaced with Leu, the 46th Leu is replaced with Gly, and the 85th Thr is replaced with Asp.
  • Sequence (6) An amino acid sequence in which the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is replaced with Leu, the 36th Tyr is replaced with Leu, the 71st Phe is replaced with Tyr, and the 85th Thr is replaced with Asp (7 ) Amino acid sequence in which the 36th Tyr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is replaced with Leu, the 44th Pro is replaced with Phe, the 46th Leu is replaced with Gly, and the 71st Phe is replaced with Tyr (8) The 36th Tyr in the 69 amino acid sequence is Leu, the 44th Pro is Phe, the 46th Leu is Gly, and 8 Amino acid sequence in which th-thr is substituted with Asp (9) 36th Tyr in Leu, 44th Pro in Phe, 71st Phe in Tyr, and 85th Thr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69, the 36th Tyr as Leu, the 46th
  • amino acid sequence of VL into which three modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (7).
  • An amino acid sequence in which the 11th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is replaced with Met, the 36th Tyr is replaced with Leu, and the 44th Pro is replaced with Phe (2) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 The amino acid sequence in which the 13th Ala is replaced with Val, the 36th Tyr is replaced with Leu, and the 44th Pro is replaced with Phe.
  • the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is replaced with Leu.
  • amino acid sequence of VL into which two modifications are introduced include the following amino acid sequences (1) to (15).
  • Amino acid sequence in which the 36th Tyr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is replaced with Leu, and the 44th Pro is replaced with Phe (2) The 11th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Met, And amino acid sequence (3) in which the 36th Tyr is substituted with Leu (3) amino acid sequence in which the 13th Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is substituted with Val and the 36th Tyr is substituted with Leu (4) The amino acid sequence in which the 15th Val in the amino acid sequence is replaced with Leu and the 36th Tyr is replaced with Leu (5) The 36th Tyr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Leu, and the 43rd Ala is Ser.
  • the amino acid sequence substituted with (6) The 36th Tyr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is replaced with Leu, and the 46th Leu Amino acid sequence substituted with Gly (7) 36th amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 and 36th amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 in which the 36th Tyr was substituted with Leu and the 71st Phe with Tyr Amino acid sequence in which the Tyr of the amino acid was replaced with Leu and the 85th Thr was replaced with Asp (9)
  • the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is in Leu, and The
  • amino acid sequence of VL into which one modification is introduced include the following amino acid sequences (1) to (9).
  • An amino acid sequence in which the 11th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is substituted with Met (2)
  • An amino acid sequence in which the 13th Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is substituted with Val (3)
  • SEQ ID NO: 69 The amino acid sequence in which the 15th Val in the amino acid sequence of (1) is replaced with Leu
  • Ala is replaced with Ser (6)
  • the 46th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Gly Substituted amino acid sequence (8)
  • the amino acid sequence of the 85 th Thr in the amino acid sequence of issue 69 was replaced with Asp
  • humanized antibody of the present invention examples include a humanized antibody in which the VH of the antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 and / or the VL of the antibody of SEQ ID NO: 69, the VH of the antibody has SEQ ID NO: 67 and / or The humanized antibody in which the VL of the antibody includes any one of the amino acid sequences shown in FIG. 2, or the VH of the antibody has any of the amino acid sequences shown in FIG. 1 and / or the VL of the antibody has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69.
  • humanized antibodies of the present invention include humanized antibodies that compete with the monoclonal antibody of the present invention and bind to the amino acid sequence of the extracellular region of human TIM-3, or the three-dimensional structure thereof, and the above-mentioned humanized antibodies. Mention may be made of humanized antibodies that bind to the same epitope as that present on the extracellular region of human TIM-3 to which it binds.
  • a human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in the human body, but a human antibody phage library and a human antibody-producing transgene produced by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering. Also included are antibodies obtained from transgenic animals.
  • the antibody naturally present in the human body can be cultured by, for example, isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting and immortalizing EB virus, etc., and cloning the lymphocytes that produce the antibody.
  • the antibody can be further purified.
  • the human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the phage surface by inserting antibody genes prepared from human B cells into the phage genes. From the library, phages expressing an antibody fragment having a desired antigen-binding activity on the surface can be collected using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule comprising two complete heavy chains and two complete light chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal means an animal in which a human antibody gene is incorporated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be produced by introducing a human antibody gene into a mouse ES cell, transplanting the ES cell into an early mouse embryo, and generating it.
  • human antibody-producing hybridomas are obtained and cultured using normal hybridoma production methods performed in non-human animals to produce human antibodies in the culture supernatant. It can be produced by accumulating.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and / or added is 1 or more, and the number is not particularly limited, but site-specific mutagenesis [Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols, Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)], and the like, and the number can be deleted, substituted or added.
  • the number is preferably 1 to several tens, more preferably 1 to 20, further preferably 1 to 10, and particularly preferably 1 to 5.
  • deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the above antibody indicates the following. That is, it means that there is a deletion, substitution, insertion or addition of one or a plurality of amino acid residues in any one and a plurality of amino acid sequences in the same sequence.
  • deletion, substitution, insertion or addition may occur simultaneously, and the amino acid residue to be substituted, inserted or added may be either a natural type or a non-natural type.
  • natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, or L-cysteine.
  • amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homoserine
  • antibody fragments include Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′, single chain antibody (scFv), dimerization V region (diabody), disulfide stabilized V region (dsFv) and CDR. Examples thereof include peptides.
  • Fab is a fragment obtained by treating IgG with papain, a proteolytic enzyme (cleaved at the 224th amino acid residue of the H chain), about half of the N chain side of the H chain and the entire L chain are disulfides. It is an antibody fragment having an antigen binding activity with a molecular weight of about 50,000 bound by binding.
  • the Fab of the present invention can be obtained by treating human TIM-3 specifically and treating a monoclonal antibody that binds to the amino acid sequence of the extracellular region or its three-dimensional structure with papain.
  • a Fab may be produced by inserting a DNA encoding the Fab of the antibody into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and expressing the vector by introducing the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism. it can.
  • F (ab ′) 2 was obtained by decomposing the lower part of two disulfide bonds in the hinge region of IgG with pepsin, a proteolytic enzyme, and was constructed by combining two Fab regions at the hinge portion. It is a fragment having an antigen binding activity with a molecular weight of about 100,000.
  • the F (ab ′) 2 of the present invention can be obtained by treating human TIM-3 specifically and treating a monoclonal antibody that binds to the amino acid sequence of the extracellular region or its three-dimensional structure with pepsin. .
  • Fab ′ described below can be prepared by thioether bond or disulfide bond.
  • Fab ′ is an antibody fragment having an antigen binding activity of about 50,000 molecular weight obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab ′) 2 .
  • the Fab ′ of the present invention specifically recognizes the human TIM-3 of the present invention and reduces F (ab ′) 2 that binds to the amino acid sequence of the extracellular region or its three-dimensional structure, such as dithiothreitol. It can be obtained by treating with an agent.
  • DNA encoding the Fab ′ fragment of the antibody is inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the vector is introduced into prokaryotic or eukaryotic cells to express Fab ′. You can also
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as P), and has antigen-binding activity. It is an antibody fragment having
  • the scFv of the present invention obtains cDNA encoding VH and VL of a monoclonal antibody that specifically recognizes human TIM-3 of the present invention and binds to the amino acid sequence of the extracellular region, or to its three-dimensional structure, constructing a DNA encoding scFv, inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism to express and produce it can.
  • Diabody is an antibody fragment obtained by dimerizing scFv and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen binding activity can be the same, or one can be a different antigen binding activity.
  • the diabody of the present invention obtains cDNA encoding VH and VL of a monoclonal antibody that specifically recognizes the human TIM-3 of the present invention and binds to the amino acid sequence of the extracellular region, or to its three-dimensional structure,
  • a DNA encoding scFv is constructed so that the length of the amino acid sequence of the peptide linker is 8 residues or less, the DNA is inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the expression vector is inserted into a prokaryotic expression vector. It can be expressed and produced by introduction into an organism or eukaryote.
  • DsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue and bonded via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue to be substituted with the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to a known method [Protein Engineering, 7, 697 (1994)].
  • the dsFv of the present invention specifically obtains the cDNA encoding the VH and VL of the monoclonal antibody that specifically recognizes the human TIM-3 of the present invention and binds to the amino acid sequence of the extracellular region or its three-dimensional structure, constructing a DNA encoding dsFv, inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism to express and produce the DNA it can.
  • the peptide containing CDR is configured to contain at least one region of CDR of VH or VL.
  • Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.
  • the peptide comprising the CDR of the present invention specifically recognizes human TIM-3 of the present invention and encodes the CDRs of VH and VL of a monoclonal antibody that binds to the amino acid sequence of the extracellular region, or to its conformation. It can be produced by constructing DNA, inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism. Moreover, the peptide containing CDR can also be manufactured by chemical synthesis methods, such as Fmoc method or tBoc method.
  • the monoclonal antibody of the present invention specifically recognizes the amino acid sequence of the extracellular region of human TIM-3 of the present invention, or its three-dimensional structure, and radioactively binds to the monoclonal antibody or antibody fragment thereof that binds to the extracellular region. It includes antibody derivatives in which isotopes, low-molecular drugs, high-molecular drugs, proteins, antibody drugs and the like are chemically or genetically bound.
  • the derivative of the antibody in the present invention is a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof that specifically recognizes the amino acid sequence of the extracellular region of human TIM-3 of the present invention, or a three-dimensional structure thereof, and binds to the extracellular region.
  • Radioisotope, small molecule on the N-terminal side or C-terminal side of the H chain or L chain, the appropriate substituent or side chain in the antibody or antibody fragment thereof, and the sugar chain in the monoclonal antibody or antibody fragment thereof The above-mentioned drugs, polymer drugs, immunostimulants, proteins, antibody drugs, and the like can be produced by combining them with chemical methods [Introduction to Antibody Engineering, Jinshoshokan (1994)].
  • amino acid sequence of the extracellular region of human TIM-3 of the present invention is specifically recognized, and it is desired to bind to a DNA encoding a monoclonal antibody or antibody fragment that binds to the extracellular region. It can be produced by a genetic engineering technique in which DNA encoding a protein or antibody drug is linked and inserted into an expression vector, the expression vector is introduced into an appropriate host cell, and expressed.
  • radioisotope examples include 131 I, 125 I, 90 Y, 64 Cu, 99 Tc, 77 Lu, or 211 At.
  • the radioisotope can be directly bound to the antibody by the chloramine T method or the like. Further, a substance that chelates a radioisotope may be bound to the antibody.
  • the chelating agent include 1-isothiocyanate benzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA).
  • low molecular weight drugs examples include alkylating agents, nitrosourea agents, antimetabolites, antibiotics, plant alkaloids, topoisomerase inhibitors, hormone therapy agents, hormone antagonists, aromatase inhibitors, P glycoprotein inhibitors, platinum Anticancer agents such as complex derivatives, M-phase inhibitors or kinase inhibitors [Clinical Oncology, Cancer and Chemotherapy (1996)], or steroids such as hydrocortisone and prednisone, non-steroidal agents such as aspirin and indomethacin , Gold thiomalate, penicillamine and other immunomodulators, cyclophosphamide, azathioprine and other immunosuppressive agents, chlorpheniramine maleate and antihistamines such as clemacitine [inflammatory and anti-inflammatory therapy, dentistry publication Inc. (1982)].
  • anticancer agents examples include amifostine (ethiol), cisplatin, dacarbazine (DTIC), dactinomycin, mechlorethamine (nitrogen mustard), streptozocin, cyclophosphamide, ifosfamide, carmustine (BCNU), lomustine (CCNU) ), Doxorubicin (adriamycin), epirubicin, gemcitabine (gemzar), daunorubicin, procarbazine, mitomycin, cytarabine, etoposide, methotrexate, 5-fluorouracil, fluorouracil, vinblastine, vincristine, bleomycin, dauromycin, peprotamine, peprotamine , Docetaxel (taxotea), aldesleukin, asparaginase, Sulfane, carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin, cladribine, camptothecin
  • Examples of a method for binding a low molecular weight drug to an antibody include, for example, a method of binding between the drug and the amino group of the antibody via glutaraldehyde, or a drug amino group and the antibody carboxyl group via a water-soluble carbodiimide. And the like.
  • polymer drug examples include polyethylene glycol (hereinafter referred to as PEG), albumin, dextran, polyoxyethylene, styrene maleic acid copolymer, polyvinyl pyrrolidone, pyran copolymer, and hydroxypropyl methacrylamide.
  • PEGylation modifying reagents include a modifier for e-amino group of lysine (Japanese Patent Laid-Open No. 61-178926), a modifier for carboxyl groups of aspartic acid and glutamic acid (Japanese Patent Laid-Open No. 56-23587). Or a modifier for guanidino group of arginine (Japanese Patent Laid-Open No. 2-117920).
  • the immunostimulant may be, for example, a natural product known as an immunoadjuvant, and specific examples include ⁇ (1 ⁇ 3) glucan (lentinan, schizophyllan), ⁇ -galactosylceramide, etc. Is mentioned.
  • proteins include cytokines or growth factors that activate immunocompetent cells such as NK cells, macrophages, or neutrophils, or toxin proteins.
  • cytokines or growth factors examples include IFN ⁇ , IFN ⁇ , IFN ⁇ , interleukin (hereinafter referred to as IL) -2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, granulocyte colony Examples include stimulating factor (G-CSF), granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), and the like.
  • toxin protein examples include ricin, diphtheria toxin, ONTAK, and the like, and also include protein toxins in which mutations are introduced into the protein to control toxicity.
  • Examples of the antibody drug include an antigen against which apoptosis is induced by antibody binding, an antigen associated with tumor pathogenesis or an antigen that regulates immune function, and an antibody against an antigen involved in angiogenesis of a lesion site.
  • antigens whose apoptosis is induced by antibody binding include, for example, Cluster of differentiation (hereinafter referred to as CD) 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80 (B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86 (B7.2), human leukocyte antigen (HLA) -Class II, or Epidermal growthRector FactorFactor ) And the like.
  • CD Cluster of differentiation
  • antigens involved in tumor pathogenesis or antibodies that regulate immune functions include CD40, CD40 ligand, B7 family molecules (CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3, or B7 -H4), B7 family molecule ligand (CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1, or BTLA), OX-40, OX-40 ligand, CD137, tumor necrosis factor (TNF) receptor family molecule (DR4, DR5, TNFR1, or TNFR2), TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor (TRAIL) family molecule, TRAIL family molecule receptor family (TRAIL-R1, TRAIL-R2) TRAIL-R3 or TRAIL-R4), receptor activator of nuclear factor kappa B (RANK), RANK ligand, CD-25, folate receptor 4, cytokine [IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-4, IL-5 IL-6, IL-10, IL
  • antigens for antibodies that inhibit angiogenesis of a lesion site include vascular endodermal growth factor (VEGF), anangiopoietin, fibroblast growth factor (FGF), EGF, and platelet-induced growth. (EPO), TGF ⁇ , IL-8, Ephilin, SDF-1, or a receptor thereof.
  • VEGF vascular endodermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • EPO platelet-induced growth.
  • TGF ⁇ IL-8
  • Ephilin Ephilin
  • SDF-1 or a receptor thereof.
  • a fusion antibody with a protein or an antibody drug comprises linking a cDNA encoding a protein to a cDNA encoding a monoclonal antibody or antibody fragment, constructing a DNA encoding the fusion antibody, and expressing the DNA for prokaryote or eukaryote It is inserted into a vector and expressed by introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism to produce a fusion antibody.
  • the amino acid sequence of the extracellular region of human TIM-3 of the present invention, or its steric structure is specifically determined.
  • the agent that recognizes and binds to the monoclonal antibody or antibody fragment thereof that binds to the extracellular region include a label used in usual immunological detection or measurement methods.
  • the label examples include an enzyme such as alkaline phosphatase, peroxidase or luciferase, a luminescent substance such as acridinium ester or lophine, or a fluorescent substance such as fluorescein isothiocyanate (FITC) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC).
  • an enzyme such as alkaline phosphatase, peroxidase or luciferase, a luminescent substance such as acridinium ester or lophine, or a fluorescent substance such as fluorescein isothiocyanate (FITC) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC).
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • RITC tetramethylrhodamine isothiocyanate
  • the present invention also relates to a therapeutic agent for diseases involving TIM-3-positive cells containing the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof as an active ingredient.
  • the disease involving TIM-3-positive cells may be any disease involving cells expressing TIM-3, and examples thereof include cancer, autoimmune diseases, and allergic diseases.
  • cancer examples include blood cancer, breast cancer, uterine cancer, colon cancer, esophageal cancer, stomach cancer, ovarian cancer, lung cancer, kidney cancer, rectal cancer, thyroid cancer, cervical cancer, small intestine cancer, prostate cancer or pancreatic cancer.
  • hematological cancer, esophageal cancer, gastric cancer, colon cancer, liver cancer or prostate cancer is mentioned.
  • Examples of blood cancer include acute myelogenous leukemia (AML), chronic myelogenous leukemia (CML), myelodysplastic syndromes (MDS), and multiple myeloma (ultimate myeloma).
  • Cutaneous T cell lymphoma cutaneous T cell lymphoma, CTCL
  • peripheral T cell lymphoma peripheral T cell lymphoma
  • undifferentiated large cell lymphoma anaplastic large cell lymphoma, leukemia) lymphatic (Lukemia, ALL), chronic phosphorus Sexual leukemia (chronic lympatic leukemia, CLL), other lymphocytic leukemia, NK cells lymphoma, Hodgkin's lymphoma, or, such as non-Hodgkin's lymphoma and the like, including Burkitt's lymphoma.
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, psoriasis, Crohn's disease, ankylosing spondylitis, multiple sclerosis, type I diabetes, hepatitis, myocarditis, Sjogren's syndrome, post-transplant rejection autoimmune hemolytic anemia, blisters
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, psoriasis, Crohn's disease, ankylosing spondylitis, multiple sclerosis, type I diabetes, hepatitis, myocarditis, Sjogren's syndrome, post-transplant rejection autoimmune hemolytic anemia, blisters
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, psoriasis, Crohn's disease, ankylosing spondylitis, multiple sclerosis, type I diabetes, hepatitis, myocarditis, Sjogren's syndrome, post-transplant rejection autoimmune hemolytic anemia, blisters
  • pemphigoid Grave
  • allergic diseases include acute or chronic airway hypersensitivity, bronchial asthma, atopic dermatitis, allergic rhinitis, hives, PIE syndrome, food allergy, hay fever, allergic nose, bronchial asthma, atopic dermatitis And anaphylactic shock.
  • the therapeutic agent of the present invention contains the above-described monoclonal antibody of the present invention or the antibody fragment as an active ingredient.
  • the therapeutic agent containing the antibody or the antibody fragment or derivative thereof of the present invention may contain only the antibody or the antibody fragment or derivative thereof as an active ingredient. It is desirable to provide a pharmaceutical formulation prepared by any method known in the pharmaceutical arts, mixed with one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • the administration route is preferably the most effective for treatment, and includes oral administration or parenteral administration such as buccal, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular or intravenous, preferably intravenous. Internal administration can be mentioned.
  • administration forms include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, or tapes.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 ⁇ g / kg to 10 mg / kg per day for an adult.
  • the present invention provides a TIM comprising, as an active ingredient, a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof that specifically recognizes the amino acid sequence of the extracellular region of TIM-3, or a three-dimensional structure thereof, and binds to the extracellular region.
  • a TIM comprising, as an active ingredient, a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof that specifically recognizes the amino acid sequence of the extracellular region of TIM-3, or a three-dimensional structure thereof, and binds to the extracellular region.
  • a TIM comprising, as an active ingredient, a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof that specifically recognizes the amino acid sequence of the extracellular region of TIM-3, or a three-dimensional structure thereof, and binds to the extracellular region.
  • -3 immunological detection or measurement method, TIM-3 immunological detection or measurement reagent, immunological detection or measurement method for cells expressing TIM-3, and TIM-3-positive cells The present invention relates to a diagnostic agent for diseases.
  • any known method can be used as a method for detecting or measuring the amount of TIM-3.
  • immunological detection or measurement methods can be mentioned.
  • the immunological detection or measurement method is a method for detecting or measuring an antibody amount or an antigen amount using a labeled antigen or antibody.
  • Immunological detection or measurement methods include radiolabeled immunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA or ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), luminescent immunoassay, western blot method Or a physicochemical method etc. are mentioned.
  • a disease associated with TIM-3 can be diagnosed.
  • Suitable immunological detection methods can be used to detect the cells in which the polypeptide is expressed, but immunoprecipitation, fluorescent cell staining, immunohistochemical staining, immunohistological staining, etc. Preferably used. Moreover, fluorescent antibody staining methods such as FMAT8100HTS system (Applied Biosystems) can also be used.
  • the biological sample to be detected or measured for TIM-3 includes cells expressing TIM-3, such as tissue cells, blood, plasma, serum, pancreatic juice, urine, feces, tissue fluid, or culture fluid. If there is a possibility, it will not specifically limit.
  • the diagnostic agent containing the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, or a derivative thereof may contain a reagent for performing an antigen-antibody reaction and a reagent for detecting the reaction, depending on the target diagnostic method.
  • the reagent for performing the antigen-antibody reaction include a buffer and a salt.
  • the detection reagent for example, a labeled secondary antibody that recognizes the monoclonal antibody or an antibody fragment thereof, or a derivative thereof, or a substrate corresponding to the label, or the like, is used for usual immunological detection or measurement methods.
  • a reagent for example, a labeled secondary antibody that recognizes the monoclonal antibody or an antibody fragment thereof, or a derivative thereof, or a substrate corresponding to the label, or the like, is used for usual immunological detection or measurement methods.
  • TIM-3 or TIM-3 serving as an antigen are expressed in Escherichia coli, yeast, an expression vector containing cDNA encoding the full length of TIM-3 or a partial length thereof. It can be obtained by introduction into insect cells or animal cells.
  • TIM-3 can be purified and obtained from cultured human tumor cells and human tissues that express TIM-3 in a large amount. Further, the tumor cultured cells or the tissue can be used as an antigen as it is.
  • a synthetic peptide having a partial sequence of TIM-3 can be prepared by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method and used as an antigen.
  • TIM-3 used in the present invention is described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) or Current Protocols in BioJulio 19
  • the DNA encoding the TIM-3 can be expressed in a host cell and produced by the following method.
  • a recombinant vector is prepared by inserting a full-length cDNA containing a portion encoding TIM-3 downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a polypeptide-encoding portion prepared based on the full-length cDNA may be used.
  • a transformant producing the polypeptide can be obtained by introducing the obtained recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • Any expression vector can be used so long as it can be autonomously replicated in the host cell to be used or integrated into the chromosome, and contains an appropriate promoter at a position where the DNA encoding the polypeptide can be transcribed. Can do.
  • any microorganism that belongs to the genus Escherichia such as Escherichia coli, yeast, insect cells, or animal cells can be used so long as it can express the target gene.
  • the recombinant vector When a prokaryote such as E. coli is used as a host cell, the recombinant vector is capable of autonomous replication in the prokaryote, and at the same time a promoter, a ribosome binding sequence, DNA containing a TIM-3 coding part, and transcription termination.
  • a vector containing the sequence is preferred.
  • the recombinant vector does not necessarily require a transcription termination sequence, but it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • the recombinant vector may contain a gene that controls the promoter.
  • the recombinant vector it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence (also referred to as SD sequence), which is a ribosome binding sequence, and the start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • SD sequence also referred to as SD sequence
  • start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • the base sequence of the DNA encoding the TIM-3 can be substituted so that the codon is optimal for expression in the host, thereby improving the production rate of the target TIM-3. Can be made.
  • Any expression vector can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • pBTrp2, pBTac1, pBTac2 above, Roche Diagnostics
  • pKK233-2 Pharmacia
  • pSE280 manufactured by Invitrogen
  • pGEMEX-1 manufactured by Promega
  • pQE-8 manufactured by Qiagen
  • pKYP10 Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-110600
  • pKYP200 Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)]
  • pLSA1 Agric Biol. Chem. 53, 277 (1989)
  • pGEL1 Proc. Natl.
  • any promoter can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • promoters derived from Escherichia coli or phage such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter, or T7 promoter can be mentioned.
  • An artificially designed and modified promoter such as a tandem promoter, tac promoter, lacT7 promoter, or let I promoter in which two Ptrps are connected in series can also be used.
  • Examples of host cells include E. coli XL-1 Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli MC1000, E. coli KY3276, E. coli W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49, E. coli W3110, E. coli NY49, or E. coli DH5 ⁇ .
  • Any method can be used for introducing a recombinant vector into a host cell as long as it is a method for introducing DNA into the host cell to be used.
  • a method using calcium ions Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)].
  • any expression vector can be used as long as it can function in animal cells.
  • Any promoter can be used as long as it can function in animal cells.
  • a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter for example, a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter, an SV40 early promoter, a retroviral promoter. , Metallothionein promoter, heat shock promoter, SR ⁇ promoter, or Moloney murine leukemia virus promoter or enhancer.
  • CMV cytomegalovirus
  • IE immediate early
  • IE SV40 early promoter
  • a retroviral promoter e.g., a promoter for example, a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter, an SV40 early promoter, a retroviral promoter.
  • Metallothionein promoter e.g., Metallothionein promoter, heat shock promoter, SR ⁇ promoter, or Moloney murine leukemia virus promoter or enhancer.
  • host cells examples include human leukemia cells Namalwa cells, monkey cells COS cells, Chinese hamster ovary cells CHO cells (Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Sci.USA, 77, 4216 (1980); Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 60, 1275 (19 8); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell genetics, Appendix I, II (pp.
  • CHO / DG44 CHO-K1 (ATCC number: CCL-61), DUkXB11 (ATCC number: CCL) -9096), Pro-5 (ATCC number: CCL-1781), CHO-S (Life Technologies, Cat # 11619), Pro-3, rat myeloma cells YB2 / 3HL. P2. G11.16 Ag. 20 (also referred to as YB2 / 0), mouse myeloma cell NSO, mouse myeloma cell SP2 / 0-Ag14, Syrian hamster cell BHK or HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-000299), and the like.
  • Any method can be used for introducing a recombinant vector into a host cell as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • electroporation method [Cytotechnology 3, 133 (1990)]
  • calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 227075/1990
  • lipofection method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • a transformant derived from a microorganism or animal cell having a recombinant vector incorporating DNA encoding TIM-3 obtained as described above is cultured in a medium, and the TIM-3 is added to the culture.
  • TIM-3 can be produced by accumulating and collecting from the culture.
  • the method of culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • TIM-3 When expressed in cells derived from eukaryotes, TIM-3 with an added sugar or sugar chain can be obtained.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • cultivating a microorganism transformed with a recombinant vector using the lac promoter cultivate a microorganism transformed with isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside or the like using a recombinant vector using the trp promoter.
  • indole acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • Examples of a medium for culturing a transformant obtained using an animal cell as a host include a commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, 1 (1950)], Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum (FBS) or the like to these mediums.
  • RPMI 1640 medium The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)]
  • Eagle's MEM medium Science 122, 501 (1952)]
  • Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)]
  • 199 medium Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, 1 (19
  • the culture is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C., and 5% CO 2 .
  • a production method of TIM-3 there are a method of producing in a host cell, a method of secreting it outside the host cell, or a method of producing it on the host cell outer membrane, and the host cell to be used or the TIM-3 to be produced is produced. By changing the structure, an appropriate method can be selected.
  • the production amount of TIM-3 can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-227075).
  • the obtained TIM-3 can be isolated and purified as follows, for example.
  • the cells When TIM-3 is expressed in a dissolved state in the cells, the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press, a Manton Gaurin homogenizer, dynomill, etc. The cells are disrupted using a to obtain a cell-free extract.
  • a normal protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylamino Anion exchange chromatography using a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical), cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) Methods such as electrophoresis, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose, phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, or electrophoresis such as isoelectric focusing To obtain purified preparations Door can be.
  • a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical),
  • TIM-3 When TIM-3 is expressed in the form of an insoluble substance in the cell, the cell is recovered and crushed in the same manner as described above, and centrifuged to recover the insoluble substance of TIM-3 as a precipitate fraction. .
  • the recovered insoluble TIM-3 is solubilized with a protein denaturant. After diluting or dialyzing the solubilized solution, the TIM-3 is returned to a normal three-dimensional structure, and then a purified product of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the derivative such as TIM-3 or a sugar-modified product thereof can be recovered from the culture supernatant.
  • a soluble fraction can be obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purified preparation can be obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. it can.
  • TIM-3 used in the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method.
  • chemical chemistry is performed using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecel-Vega, Perceptive, or Shimadzu. It can also be synthesized.
  • Immunization is performed by administering the antigen subcutaneously, intravenously or intraperitoneally to the animal together with an appropriate adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • an appropriate adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • the antigen is a partial peptide
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (bovine serum albumin) or KLH (Keyhole Limothemoyanin) is prepared and used as an immunogen.
  • BSA bovine serum albumin
  • KLH Keyhole Limothemoyanin
  • the antigen is administered 5 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, and the antibody titer of the serum is measured using an enzyme immunoassay [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. An animal whose serum shows a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization is used as a source of antibody producing cells for fusion.
  • tissues containing antibody-producing cells such as the spleen are removed from the immunized animal, and antibody-producing cells are collected.
  • the spleen is shredded and loosened, and then centrifuged, and the erythrocytes are removed to obtain antibody producing cells for fusion.
  • a cell line obtained from a mouse is used.
  • an 8-azaguanine resistant mouse derived from Balb / C
  • myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 P3- U1 [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)]
  • P3-NS1 / 1 Ag41 P3-1 [European J. et al. Immunology, 6, 511 (1976)]
  • SP2 / 0-Ag14 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)]
  • P3-X63-Ag8653 653
  • P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975)] or the like is used.
  • the myeloma cells are subcultured in normal medium [RPMI 1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, FBS, and 8-azaguanine], and subcultured to normal medium 3 to 4 days before cell fusion. On the day of fusion, secure a cell count of 2 ⁇ 10 7 or more.
  • a mixture of polyethylene glycol-1000 (PEG-1000), MEM medium and dimethyl sulfoxide is added at 37 ° C. with stirring.
  • the cells are gently suspended in the HAT medium [normal medium supplemented with hypoxanthine, thymidine, and aminopterin] on the antibody-producing cells for fusion. This suspension is cultured for 7-14 days at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • a part of the culture supernatant is extracted, and a cell group that reacts with an antigen containing TIM-3 and does not react with an antigen not containing TIM-3 is selected by a hybridoma selection method such as a binding assay described later.
  • cloning was repeated twice by the limiting dilution method (first time was HT medium (medium obtained by removing aminopterin from HAT medium), second time normal medium was used), and a stable and strong antibody titer was observed.
  • One is selected as a monoclonal antibody-producing hybridoma.
  • the monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in (4) is cultured in an RPMI1640 medium supplemented with 10% FBS, the supernatant is removed by centrifugation, and the suspension is suspended in a Hybridoma-SFM medium and cultured for 3 to 7 days. To do.
  • the obtained cell suspension is centrifuged, and purified using a protein A-column or protein G-column from the obtained supernatant, and the IgG fraction is collected to obtain a purified monoclonal antibody.
  • 5% Daigo GF21 can be added to the Hybridoma-SFM medium.
  • the antibody subclass is determined by enzyme immunoassay using a sub-clustering kit.
  • the amount of protein is calculated from the Raleigh method or absorbance at 280 nm.
  • a monoclonal antibody is selected by a binding assay by the enzyme immunoassay shown below and a kinetic analysis by Biacore.
  • (6-a) Binding assay As an antigen, a gene-transferred cell obtained by introducing an expression vector containing cDNA encoding TIM-3 obtained in (1) into E. coli, yeast, insect cells, or animal cells. A recombinant protein, or a purified polypeptide or partial peptide obtained from human tissue. When the antigen is a partial peptide, a conjugate with a carrier protein such as BSA or KLH is prepared and used.
  • a carrier protein such as BSA or KLH
  • a test substance such as serum, hybridoma culture supernatant or purified monoclonal antibody is dispensed as the first antibody and allowed to react.
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance, a radiation compound or the like is dispensed and reacted as a second antibody.
  • a reaction is performed according to the labeling substance of the second antibody, and a monoclonal antibody that specifically reacts with the immunogen is selected.
  • a monoclonal antibody that competes with the anti-TIM-3 monoclonal antibody of the present invention and binds to TIM-3 can be obtained by adding a test antibody to the above-described binding assay system for reaction. That is, by competing with the acquired monoclonal antibody for binding to the amino acid sequence of the extracellular region of TIM-3 or its three-dimensional structure by screening for an antibody that inhibits the binding of the monoclonal antibody when the test antibody is added. Monoclonal antibodies can be obtained.
  • the antibody that binds to the same epitope as the epitope recognized by the monoclonal antibody that binds to the amino acid sequence of the extracellular region of TIM-3 of the present invention or its three-dimensional structure is an antibody obtained by the aforementioned binding assay system. It can be obtained by preparing and immunizing a partial synthetic peptide of the identified epitope or a synthetic peptide mimicking the three-dimensional structure of the epitope.
  • ⁇ Kinetics analysis is performed on the obtained data using the software attached to the device using a 1: 1 binding model, and various parameters are acquired.
  • human TIM-3 is immobilized on a sensor chip by, for example, an amine coupling method, and then purified monoclonal antibodies having a plurality of known concentrations are flowed to measure binding and dissociation.
  • the obtained data is subjected to kinetic analysis using a software that is included with the device, using a binding binding model, and various parameters are acquired.
  • a recombinant antibody expression vector is an expression vector for animal cells in which DNAs encoding human antibodies CH and CL are incorporated, and the expression vector for animal cells is human. It can be constructed by cloning DNAs encoding antibody CH and CL, respectively.
  • Any human antibody CH and CL can be used for the C region of a human antibody.
  • ⁇ 1 subclass CH and ⁇ class CL of human antibodies are used.
  • cDNA is used for the DNA encoding CH and CL of the human antibody, chromosomal DNA consisting of exons and introns can also be used.
  • Any expression vector for animal cells can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the C region of a human antibody.
  • pAGE107 [Cytotechnol. 3, 133 (1990)]
  • pAGE103 [J. Biochem. , 101, 1307 (1987)]
  • pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]
  • pKCR Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)]
  • pSG1bd2-4 [Cytotechnol. 4, 173 (1990)]
  • pSE1UK1Sed1-3 [Cytotechnol. 13, 79 (1993)].
  • the promoter and enhancer include the SV40 early promoter [J. Biochem. 101, 1307 (1987)], Moloney murine leukemia virus LTR [Biochem. Biophys. Res. Commun. 149, 960 (1987)], or an immunoglobulin heavy chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)] and an enhancer [Cell, 33, 717 (1983)].
  • Recombinant antibody expression vectors balance the ease of construction of recombinant antibody expression vectors, the ease of introduction into animal cells, and the balance of expression levels of antibody H and L chains in animal cells.
  • a vector for expressing a recombinant antibody of a type (tandem type) in which the antibody H chain and L chain are present on the same vector [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)]
  • pKANTEX93 International Publication No. 97/10354
  • pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)]
  • MRNA is extracted from hybridoma cells producing non-human antibodies, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or a plasmid to prepare a cDNA library.
  • a recombinant phage or recombinant plasmid having cDNA encoding VH or VL is isolated from the library.
  • the entire base sequence of VH or VL of the target mouse antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, respectively, and the total amino acid sequence of VH or VL is estimated from the base sequence, respectively.
  • non-human animal for producing a hybridoma cell producing a non-human antibody a mouse, rat, hamster, rabbit or the like is used, but any animal can be used as long as it can produce a hybridoma cell. .
  • RNA easy kit manufactured by Qiagen
  • oligo (dT) -immobilized cellulose column method For preparation of mRNA from total RNA, oligo (dT) -immobilized cellulose column method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press (1989)], or Oligo-dT> SurSpurP Use a kit such as (Takara Bio).
  • mRNA can be prepared from hybridoma cells using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen) or QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • any vector can be used as a vector into which cDNA synthesized using mRNA extracted from a hybridoma cell as a template is incorporated.
  • ZAP ExPress [Stratesies, 5, 58 (1992)]
  • pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)]
  • ⁇ ZAPIII (manufactured by Stratagene)
  • Lambda BlueMid manufactured by Clontech
  • pT7T3-18U manufactured by Pharmacia
  • pcD2 [Mol. Cell. Biol. 3, 280 (1983)]
  • pUC18 Gene, 33, 103 (1985)].
  • Escherichia coli into which a cDNA library constructed by a phage or plasmid vector is introduced can be used as long as it can introduce, express and maintain the cDNA library.
  • XL-1 Blue MRF [Stratesies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 [J. Mol. Biol. 166, 1 (1983)], K802 [J. Mol. Biol. 16, 118 (1966)] or JM105 [Gene, 38, 275 (1985)].
  • PCR method Polymerase Chain Reaction method
  • the selected cDNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and the nucleotide sequence of the cDNA is determined by a commonly used nucleotide sequence analysis method.
  • a base sequence analysis method include the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)], etc., followed by ABI PRISM 3700 (manufactured by PE Biosystems) or A.P. L. F. An automatic base sequence analyzer such as a DNA sequencer (Pharmacia) is used.
  • the entire amino acid sequences of VH and VL are estimated from the determined base sequences, respectively, and the entire amino acid sequences of VH and VL of known antibodies [A. L. F. DNA, US Dept. Comparison with Health and Human Services (1991)] confirms whether the obtained cDNA encodes the complete amino acid sequence of VH and VL of the antibody including the secretory signal sequence.
  • VH and VL of an antibody including a secretory signal sequence all amino acid sequences of known antibody VH and VL [A. L. F. DNA, US Dept. By comparing with Health and Human Services (1991)], the length of the secretory signal sequence and the N-terminal amino acid sequence can be estimated, and further, the subgroup to which they belong can be known.
  • the amino acid sequences of CDRs of VH and VL are also the amino acid sequences of VH and VL of known antibodies [A. L. F. DNA, US Dept. It can be found by comparing with Health and Human Services (1991)].
  • VH and VL complete amino acid sequences for example, BLAST method [J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)] and the like, and whether the complete amino acid sequences of VH and VL are novel can be confirmed.
  • a human chimeric antibody expression vector VH or VL of a non-human antibody is respectively upstream of each gene encoding CH or CL of a human antibody of the recombinant antibody expression vector obtained in (1).
  • a human chimeric antibody expression vector can be constructed by cloning the encoded cDNAs.
  • the base sequence of the linking portion encodes an appropriate amino acid, and VH and VL cDNAs designed to have appropriate restriction enzyme recognition sequences are prepared.
  • the prepared VH and VL cDNAs are expressed in an appropriate form upstream of each gene encoding the human antibody CH or CL of the human CDR-grafted antibody expression vector obtained in (1). Each is cloned to construct a human chimeric antibody expression vector.
  • a recombinant antibody expression vector obtained in (1) by amplifying cDNA encoding non-human antibody VH or VL by a PCR method using a synthetic DNA having an appropriate restriction enzyme recognition sequence at both ends, respectively. can also be cloned.
  • a cDNA encoding VH or VL of human CDR-grafted antibody can be constructed as follows.
  • the amino acid sequence of the VH or VL FR of the human antibody to be transplanted with the VH or VL CDR amino acid sequence of the non-human antibody is selected. Any amino acid sequence can be used as long as it is derived from a human antibody.
  • FR amino acid sequences of human antibodies registered in databases such as Protein Data Bank, or common amino acid sequences of each subgroup of FRs of human antibodies [A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services (1991)] are used.
  • an FR amino acid sequence having as high a homology as possible (at least 60% or more) with the VH or VL FR amino acid sequence of the original antibody is selected.
  • the amino acid sequence of the CDR of the original antibody is transplanted to the amino acid sequence of the FR of VH or VL of the selected human antibody, and the amino acid sequence of VH or VL of the human CDR-grafted antibody is designed.
  • Frequency of codon usage of the designed amino acid sequence in the base sequence of the antibody gene [A. L. F. DNA, US Dept. Considering Health and Human Services (1991)]
  • the DNA sequence is converted into a DNA sequence, and a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH or VL of the human CDR-grafted antibody is designed.
  • the human CDR-grafted antibody VH can be easily added to the human CDR-grafted antibody expression vector obtained in (1).
  • cDNA encoding VL can be cloned.
  • each H chain and L chain full-length synthetic DNA synthesized as one DNA based on the designed DNA sequence.
  • the amplified product is cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene), the base sequence is determined by the same method as described in (2), and the desired human CDR is obtained.
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH or VL of the transplanted antibody is obtained.
  • Human CDR-grafted antibody can be obtained by transplanting only non-human antibody VH and VL CDRs to human antibody VH and VL FRs. The binding activity is reduced compared to the original non-human antibody [BIO / TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)].
  • amino acid residues directly involved in binding to the antigen amino acid residues that interact with the CDR amino acid residues, and Decreased by maintaining the three-dimensional structure of the antibody, identifying amino acid residues indirectly involved in antigen binding, and substituting those amino acid residues with the amino acid residues of the original non-human antibody Antigen binding activity can be increased.
  • the amino acid residues of FR of human antibody VH and VL can be modified by performing the PCR reaction described in (4) using the synthetic DNA for modification.
  • the base sequence is determined by the method described in (2) and it is confirmed that the target modification has been performed.
  • a recognition sequence for an appropriate restriction enzyme at the 5 ′ end of the synthetic DNA located at both ends are introduced into the human CDR-grafted antibody expression vector obtained in (1), and cloned so that they are expressed in an appropriate form upstream of each gene encoding CH or CL of the human antibody.
  • Any host cell capable of expressing the recombinant antibody can be used as the host cell into which the expression vector is introduced.
  • COS-7 cells ATCC number: CRL1651 are used [Methods in Nucleic Acids. Res. , CRC Press, 283 (1991)].
  • the expression amount and antigen binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant are measured by enzyme immuno-antibody method [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-ALaboratory Cold Spring Harbor Laboratory (1988), monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific (1987)] and the like.
  • Any host cell capable of expressing a recombinant antibody can be used as a host cell into which the recombinant antibody expression vector is introduced.
  • CHO-K1 ATCC number: CCL-61
  • DUkXB11 ATCC number: CCL-9096
  • Pro-5 ATCC number: CCL-1781
  • CHO-S Life Technologies, Cat # 11619
  • mice myeloma cell NSO mouse myeloma cell SP2 / 0-Ag14
  • mouse P3-X63-Ag8653 cell ATCC number: CRL1580
  • dihydrofolate reductase gene Deficient CHO cells [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)], Lec13 [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 55 (1986)] that has acquired lectin resistance, CHO cells deficient in the ⁇ 1,6-fucose transferase gene (International Publication No. 2005 / 035586, WO 02/31140), rat YB2 / 3HL. P2. G11.16 Ag. 20 cells (ATCC number: CRL1662) are used.
  • a protein such as an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or a sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end of an N-glycoside-linked complex sugar chain
  • a transformant that stably expresses the recombinant antibody is selected by culturing in an animal cell culture medium containing a drug such as G418 sulfate (Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891). ).
  • Examples of the medium for animal cell culture include RPMI1640 medium (manufactured by Invitrogen), GIT medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical), EX-CELL301 medium (manufactured by JRH), IMDM medium (manufactured by Invitrogen), Hybridoma-SFM medium ( Invitrogen) or a medium obtained by adding various additives such as FBS to these mediums.
  • the obtained transformant is cultured in a medium to express and accumulate the recombinant antibody in the culture supernatant.
  • the expression level and antigen-binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant can be measured by ELISA or the like.
  • the transformed strain can increase the expression level of the recombinant antibody using a DHFR amplification system (Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891).
  • the recombinant antibody is purified from the culture supernatant of the transformed strain using a protein A-column [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A LaboratoryLaboratoryLaboratoryLaboratoryLaboratoryLaboratoryLaboratory. (1988)].
  • methods used in protein purification such as gel filtration, ion exchange chromatography, and ultrafiltration can be combined.
  • the molecular weight of the purified recombinant antibody H chain, L chain, or whole antibody molecule is determined by polyacrylamide gel electrophoresis [Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting [Monoclonal Antibodies-Principles and practicies, Third]. edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • Activity evaluation of purified monoclonal antibody or antibody fragment thereof The activity evaluation of the purified monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention can be carried out as follows.
  • the binding activity to the TIM-3-expressing cell line is measured by the surface plasmon resonance method using the binding assay described in 1- (6a) and the Biacore system described in (6b). In addition, the fluorescent antibody method [Cancer Immunol. Immunother. 36, 373 (1993)].
  • CDC activity Complement-dependent injury activity
  • ADCC activity against an antigen-positive cultured cell line is measured using a known measurement method [Cancer Immunol. Immunother. 36, 373 (1993)].
  • Method for controlling the effector activity of the anti-TIM-3 monoclonal antibody of the present invention is to reduce the N-linked complex type sugar chain that binds to the 297th asparagine (Asn) of the Fc region of the antibody.
  • Methods for controlling the amount of fucose (also referred to as core fucose) that binds ⁇ 1,6 to N-acetylglucosamine (GlcNAc) present at the terminal International Publication No. 2005/035586, International Publication No. 2002/31140, International Publication No. 00) No. / 61739
  • Any method can be used for the anti-TIM-3 monoclonal antibody of the present invention to control the effector activity.
  • the effector activity refers to antibody-dependent activity caused through the Fc region of an antibody, and includes ADCC activity, CDC activity, or antibody-dependent phagocytosis by phagocytic cells such as macrophages or dendritic cells (Antibody-dependent phagocytosis). , ADP activity) and the like are known.
  • the effector activity of the antibody can be increased or decreased.
  • expressing the antibody using CHO cells deficient in the ⁇ 1,6-fucose transferase gene An antibody to which fucose is not bound can be obtained.
  • Antibodies without fucose binding have high ADCC activity.
  • the antibody is expressed using a host cell into which an ⁇ 1,6-fucose transferase gene has been introduced.
  • an antibody to which fucose is bound can be obtained.
  • An antibody to which fucose is bound has a lower ADCC activity than an antibody to which fucose is not bound.
  • ADCC activity or CDC activity can be increased or decreased by modifying amino acid residues in the Fc region of the antibody.
  • the CDC activity of an antibody can be increased by using the amino acid sequence of the Fc region described in US Patent Application Publication No. 2007/0148165.
  • ADCC activity or CDC activity can be increased or decreased.
  • an antibody in which the effector activity of the antibody is controlled can be obtained by using the above method in combination with one antibody.
  • the monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention can be used for the treatment of diseases involving TIM-3-positive cells.
  • the therapeutic agent containing the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, or a derivative thereof may contain only the antibody or the antibody fragment, or a derivative thereof as an active ingredient. It is provided as a pharmaceutical preparation produced by a method known in the technical field of pharmaceutics, mixed with one or more physically acceptable carriers.
  • Examples of the administration route include oral administration and parenteral administration such as intraoral, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular or intravenous.
  • Examples of the dosage form include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, or tapes.
  • preparations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, and granules.
  • Liquid preparations such as emulsions or syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol or fructose, glycols such as polyethylene glycol or propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil or soybean oil, p-hydroxybenzoic acid Manufactured using preservatives such as esters, or flavors such as strawberry flavor or peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders or granules include excipients such as lactose, glucose, sucrose or mannitol, disintegrants such as starch or sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate or talc, polyvinyl alcohol, hydroxy A binder such as propylcellulose or gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin is used as an additive.
  • preparations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, and sprays.
  • Injection is manufactured using a carrier composed of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are produced using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the propellant is manufactured using a carrier that does not irritate the recipient's oral cavity and airway mucosa, disperses the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof as fine particles, and facilitates absorption.
  • a carrier for example, lactose or glycerin is used. It can also be produced as an aerosol or dry powder.
  • Diagnosis of cancer which is one of the diseases related to TIM-3, can be performed by detecting or measuring TIM-3 as follows, for example.
  • Diagnosis can be made by detecting TIM-3 expressed in cancer cells in a patient using an immunological technique such as a flow cytometer.
  • the immunological technique is a method for detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • a radioactive substance labeled immunoassay method an enzyme immunoassay method, a fluorescence immunoassay method, a luminescence immunoassay method, a Western blot method, a physicochemical method, or the like is used.
  • the radioactive substance-labeled immunoantibody method is, for example, a method in which an antibody of the present invention or the antibody fragment thereof is reacted with an antigen or a cell expressing the antigen and further reacted with a radiolabeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment. Measure with a scintillation counter.
  • an antigen or a cell expressing the antigen is reacted with the antibody of the present invention or the antibody fragment, and further, a labeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment is reacted, and then a coloring dye. Is measured with an absorptiometer. For example, a sandwich ELISA method is used.
  • a known enzyme label [enzyme immunoassay, Medical School (1987)] can be used.
  • enzyme immunoassay Medical School (1987)
  • alkaline phosphatase label, peroxidase label, luciferase label, biotin label or the like is used.
  • the sandwich ELISA method is a method in which after binding an antibody to a solid phase, an antigen to be detected or measured is trapped, and a second antibody is reacted with the trapped antigen.
  • the ELISA method two types of antibodies or antibody fragments that recognize an antigen to be detected or measured and having different antigen recognition sites are prepared, and the first antibody or antibody fragment is pre-plated on a plate (for example, 96 Next, the second antibody or antibody fragment is labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase, or biotin.
  • the above-mentioned antibody-adsorbed plate is reacted with cells or a lysate thereof, tissue or a lysate thereof, cell culture supernatant, serum, pleural effusion, ascites or ocular fluid, etc.
  • the detected monoclonal antibody or antibody fragment is reacted, and a detection reaction corresponding to the labeling substance is performed.
  • the antigen concentration in the test sample is calculated from a calibration curve prepared by diluting antigens with known concentrations stepwise.
  • an antibody used in the sandwich ELISA method either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used, and an antibody fragment such as Fab, Fab ′, or F (ab ′) 2 may be used.
  • the combination of the two types of antibodies used in the sandwich ELISA method may be a combination of monoclonal antibodies or antibody fragments that recognize different epitopes, or a combination of polyclonal antibodies and monoclonal antibodies or antibody fragments.
  • the fluorescence immunoassay is measured by the method described in the literature [Monoclonal Antibodies-Principles and practices, Third edition, Academic Press (1996), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)].
  • a label used in the fluorescence immunoassay for example, a known [fluorescent antibody method, Soft Science (1983)] fluorescent label can be mentioned.
  • FITC or RITC can be used.
  • Luminescent immunoassay is performed by the method described in the literature [Bioluminescence and chemiluminescence, clinical examination 42, Yodogawa Shoten (1998)].
  • Examples of the label used in the luminescence immunoassay include known phosphor labels, such as acridinium ester and lophine.
  • an antigen or cells expressing the antigen are fractionated with SDS (sodium dodecyl sulfate) -PAGE [Antibodies-A Laboratory Manual Spring Spring Laboratory (1988)], and then the gel is polyvinylidene fluoride (PVDF).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • a cell or tissue expressing a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 is dissolved, and 0.1 to 30 ⁇ g of protein per lane is electrophoresed by SDS-PAGE under reducing conditions.
  • the migrated protein is transferred to a PVDF membrane and reacted with PBS containing 1 to 10% BSA (hereinafter referred to as BSA-PBS) for 30 minutes at room temperature to perform a blocking operation.
  • BSA-PBS PBS containing 1 to 10% BSA
  • the monoclonal antibody of the present invention was reacted, washed with PBS containing 0.05 to 0.1% Tween-20 (hereinafter referred to as Tween-PBS), and peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG was washed at room temperature. React for 2 hours.
  • the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 is detected by washing with Tween-PBS and detecting the band to which the monoclonal antibody is bound using ECL Western Blotting Detection Reagents (Amersham) or the like.
  • ECL Western Blotting Detection Reagents Amersham
  • an antibody capable of binding to a polypeptide that does not have a natural three-dimensional structure is used.
  • the physicochemical method is performed by, for example, forming an aggregate by binding the antigen TIM-3 and the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, and detecting the aggregate.
  • Other physicochemical methods include, for example, the capillary method, the one-dimensional immunodiffusion method, the immunoturbidimetric method, or the latex immunoturbidimetric method [Presentation of clinical testing methods, Kanbara Publishing (1998)].
  • Latex immunoturbidimetry is a method in which an antibody or antigen-sensitized carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m is used to cause an antigen-antibody reaction with the corresponding antigen or antibody. Scattered light increases and transmitted light decreases. By detecting this change as absorbance or integrating sphere turbidity, the antigen concentration or the like in the test sample is measured.
  • an antibody or antigen-sensitized carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m
  • a known immunological detection method can be used for detection or measurement of cells expressing TIM-3.
  • immunoprecipitation, immunocytostaining, immunohistochemical staining, or fluorescence are preferable. Examples include antibody staining.
  • cells expressing TIM-3 or the like are reacted with the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, and then a carrier having a specific binding ability to an immunoglobulin such as protein G-sepharose is added to the antigen.
  • the antibody complex is allowed to settle.
  • the following method can be used.
  • the above-described monoclonal antibody of the present invention or antibody fragment thereof is immobilized on a 96-well plate for ELISA, and then blocked with BSA-PBS.
  • the antibody When the antibody is in an unpurified state such as a hybridoma culture supernatant, anti-mouse immunoglobulin, anti-rat immunoglobulin, protein-A or protein G is immobilized on a 96-well plate for ELISA in advance. After blocking with BSA-PBS, the hybridoma culture supernatant is dispensed and allowed to bind. Next, after discarding the BSA-PBS and thoroughly washing with PBS, a lysate of cells or tissues expressing TIM-3 is reacted. Immunoprecipitates are extracted from the well-washed plate with SDS-PAGE sample buffer and detected by Western blotting as described above.
  • an unpurified state such as a hybridoma culture supernatant, anti-mouse immunoglobulin, anti-rat immunoglobulin, protein-A or protein G is immobilized on a 96-well plate for ELISA in advance. After blocking with BSA-PBS, the hybridoma culture superna
  • the immune cell staining method or the immunohistochemical staining method is a method in which cells or tissues expressing an antigen are treated with a surfactant or methanol to improve the passage of the antibody in some cases, and then reacted with the monoclonal antibody of the present invention. And then reacting with an anti-immunoglobulin antibody or a binding fragment thereof to which a fluorescent label such as FITC, an enzyme label such as peroxidase, or a biotin label is applied, and then the label is visualized and observed under a microscope. .
  • the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, which binds to the amino acid sequence of the extracellular region of TIM-3 or its three-dimensional structure is expressed while retaining the natural three-dimensional structure by fluorescent antibody staining. Can detect cells.
  • the formed antibody-antigen complex and the free that is not involved in the formation of the antibody-antigen complex can be measured without separating the antibody or antigen.
  • Example 1 Human TIM-3 cDNA was amplified by PCR using ExMaq (manufactured by Takara Bio Inc.) using Human MTC Panel (manufactured by Clontech) as a template.
  • ExMaq manufactured by Takara Bio Inc.
  • Human MTC Panel manufactured by Clontech
  • TIM-3 Fw2 SEQ ID NO: 31
  • TIM-3 Re2 SEQ ID NO: 32
  • the obtained PCR product was inserted into pGEM-T Easy vector (manufactured by Promega), transformed into TOP10 One Shot (manufactured by Invitrogen) and amplified, and then plasmid DNA was extracted by the miniprep method.
  • the purified plasmid DNA was subjected to DNA sequence analysis using primers TIM-3 Fw2 and TIM-3 Re2, and a clone having the same base sequence as the coding region of GenBank accession number NM_032782 was selected. Recombining the selected clone insert into the pMCs-IRES-GFP vector (CELL manufactured by BIOLABS) (hTIM-3 / pMCs-IG), using Retrovirus Constructive System Ampho (manufactured by Takara Bio Inc.), human TIM-3 retrovirus was prepared.
  • TIM-3-positive cells were collected with FACSAria (BD, Biosciences). Further, after several passages, TIM-3-positive cells were collected again by FACSAria to prepare a human TIM-3 stably expressing cell line.
  • Example 2 (Preparation of soluble extracellular TIM-3 human Fc fusion protein expression vector) CDNA encoding the extracellular region of human TIM-3 was amplified by the PCR method using ExTaq (manufactured by Takara Bio Inc.) using hTIM-3 / pMCs-IG constructed in Example 1 as a template. As the primers, pMCs-Fw (SEQ ID NO: 33) and TIM3ED-FcReXba (SEQ ID NO: 34) were used.
  • the obtained PCR product was inserted into the pTracer-CMV-FLAG-humanFc vector [modified vector in which the FLAG and human IgG1 Fc regions were introduced into the Xba I and Apa I sites of pTracer-CMV (Invitrogen)] and TOP10 After transformation into One Shot (manufactured by Invitrogen) and amplification, plasmid DNA (sTIM-3-FLAG-Fc / pTracerCMV) was extracted by the miniprep method.
  • Purified sTIM-3-FLAG-Fc / pTracerCMV has the same base as that region of GenBank accession number NM_032782 by DNA sequence analysis using T7 (SEQ ID NO: 35) and hTIM-3 Fw1 (SEQ ID NO: 36) as primers. It was confirmed to have a sequence.
  • the sequence of the insert was as shown in SEQ ID NO: 37.
  • Example 3 (Preparation of soluble extracellular TIM-3 expression vector) CDNA encoding the extracellular region of human TIM-3 was amplified by PCR using ExTaq (manufactured by Takara Bio Inc.) using sTIM-3-FLAG-Fc / pTracerCMV constructed in Example 2 as a template.
  • TIM-3 Fw2 SEQ ID NO: 31
  • TIM3ED-FLAG4aa SEQ ID NO: 39
  • a FLAG epitope was prepared by PCR using ExTaq (manufactured by Takara Bio Inc.) using TIM-3 Fw2 (SEQ ID NO: 31) and C-FLAG-NotR2 (SEQ ID NO: 40) as primers. Connected.
  • the obtained PCR product was inserted into pGEM-T Easy vector (Promega), transformed into TOP10 One Shot (Invitrogen), amplified, and then plasmid DNA (sTIM-3-FLAG / pEF6 Myc_HisC) was extracted.
  • Purified sTIM-3-FLAG / pEF6 Myc_HisC has the same nucleotide sequence as that of GenBank accession number NM_032782 by DNA sequence analysis using T7 (SEQ ID NO: 35) and BGH-R (SEQ ID NO: 41) as primers. Confirmed to have. The sequence of the insert (from behind the Not I recognition site to immediately before the Not I recognition site) was as shown in SEQ ID NO: 42.
  • Example 4 (Preparation of soluble extracellular human TIM-3 human Fc fusion protein and soluble extracellular human TIM-3)
  • the sTIM-3-FLAG-Fc / pTracerCMV plasmid DNA and sTIM-3-FLAG / pEF6 Myc_HisC plasmid DNA obtained in Example 2 and Example 3 were introduced into HEK293F cells (manufactured by Invitrogen), respectively. Expressed. After 6 days, the cell supernatant was collected and used for protein purification.
  • the eluate was fractionated, and each fraction was subjected to SDS-PAGE under reducing conditions, followed by silver staining and Western blotting.
  • Western blotting an anti-FLAG M2 antibody (manufactured by Sigma) and an alkaline phosphatase-labeled rabbit anti-mouse immunoglobulin antibody (manufactured by DAKO) were used.
  • Fractions in which the target protein was recognized were concentrated using Amicon Ultra-4 10K (Millipore), and gel filtration chromatography was performed using Superdex 200 gp (GE Healthcare).
  • each fraction was subjected to SDS-PAGE under reducing conditions, followed by silver staining and Western blotting.
  • the fraction in which the target protein was observed was concentrated and washed with 0.5 mL of PBS.
  • the solution was sterilized by filtration with a membrane filter MILLEX-GV (manufactured by Millipore) having a pore size of 0.22 ⁇ m to obtain soluble extracellular human TIM-3 human Fc fusion protein or soluble extracellular human TIM-3.
  • the degree of purification was measured using Limulus ES-II Kit Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is a dedicated reagent for measuring endotoxin, and it was confirmed that the product was sufficiently purified.
  • Example 5 (Production of human antibody-producing mice)
  • the mouse used for immunization has a homozygous genetic background for both endogenous Ig heavy chain and kappa light chain disruption and chromosome 14 fragment containing the human Ig heavy chain locus (SC20) And the human Ig ⁇ chain transgene (KCo5).
  • SC20 human Ig heavy chain locus
  • KCo5 human Ig ⁇ chain transgene
  • Line A is a mouse line that is homozygous for both endogenous Ig heavy chain and kappa light chain disruption and retains the chromosome 14 fragment (SC20) capable of offspring transmission.
  • SC20 chromosome 14 fragment
  • Line B is a mouse line (transgenic mouse) that is homozygous for both endogenous Ig heavy chain and kappa light chain disruption and carries the human Ig kappa chain transgene (KCo5), as reported by Fishwild et al. [Nat Biotechnol, 1996, 14: 845].
  • KM mouse human antibody-producing mouse
  • Example 6 Preparation of human monoclonal antibody against human TIM-3 Monoclonal antibodies in this example were prepared according to a general method as described in the introduction to monoclonal antibody experimental procedures (issued by Ando Minhe et al., Kodansha, 1991).
  • TIM-3 as an immunogen, the TIM-3-expressing L929 cells obtained in Example 1 or the soluble extracellular human TIM-3 human Fc fusion protein obtained in Example 4 was used.
  • the KM mouse was used as the immunized animal.
  • mice were immunized intraperitoneally with 1 ⁇ 10 7 TIM-3-expressing L929 cells per mouse. Since the first immunization, the same cells were immunized three times or more. Three days before obtaining the spleen, the soluble extracellular TIM-3 human Fc fusion protein 20 ⁇ g / mouse obtained in Example 4 was administered via the tail vein. After the spleen was surgically obtained from the immunized mouse, the spleen was placed in 4 mL of PBS and crushed using a syringe piston on a mesh (Cell Strainer: manufactured by Falcon).
  • the cell suspension that passed through the mesh was centrifuged to precipitate the cells, and then resuspended in 1 mL of Red Blood Cell Lysing Buffer (manufactured by Sigma). After incubation at room temperature for 5 minutes, 10 mL of serum-free DMEM medium (Invitrogen) containing 50 units / mL penicillin and 50 ⁇ g / mL streptomycin (hereinafter referred to as serum-free DMEM medium) is added, and the cells are precipitated by centrifugation. I let you.
  • myeloma cells SP2 / 0 (ATCC number: CRL-1581) is a DMEM medium (Invitrogen) containing 10% FCS (Invitrogen), 50 units / mL penicillin, 50 ⁇ g / mL streptomycin (hereinafter referred to as DMEM with serum).
  • DMEM medium Invitrogen
  • FCS Invitrogen
  • 50 units / mL penicillin 50 units / mL penicillin
  • 50 ⁇ g / mL streptomycin hereinafter referred to as DMEM with serum.
  • the cells were cultured so that the cell concentration did not exceed 1 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • SP2 / 0 cells were washed with 10 mL of serum-free DMEM medium in the same manner as spleen-derived cells, and suspended in serum-free DMEM medium. These spleen-derived cell suspension and mouse myeloma suspension were mixed at a cell number of 5: 1, and after centrifugation, the supernatant was completely removed.
  • 1 mL of 50% (w / v) polyethylene glycol 1500 (manufactured by Boehringer Mannheim) as a fusion agent was slowly added while stirring the pellet with the tip of a pipette, and then heated to 37 ° C. in advance. 1 mL of serum-free DMEM medium was slowly added. Further, 5 mL and 10 mL of serum-free DMEM medium was slowly added. Then, it left still for 5 minutes in 37 degreeC and 5% carbon dioxide gas presence.
  • the fusion cells obtained by removing the supernatant were 10% FCS (manufactured by Invitrogen), penicillin-streptomycin-glutamine (manufactured by Invitrogen, catalog number 10378-016 diluted 100-fold), IL-6 (5 ng / mL) and 2-mercaptoethanol (manufactured by Invitrogen, catalog number 21985-023 diluted 1000-fold) in 50 mL of DMEM medium (manufactured by Invitrogen) (hereinafter referred to as IL-6-containing DMEM medium).
  • FCS manufactured by Invitrogen
  • penicillin-streptomycin-glutamine manufactured by Invitrogen, catalog number 10378-016 diluted 100-fold
  • IL-6 5 ng / mL
  • 2-mercaptoethanol manufactured by Invitrogen, catalog number 21985-023 diluted 1000-fold
  • the cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide gas.
  • HAT hypoxanthine-aminopterin-thymidine
  • Example 7 (Preparation of mouse monoclonal antibody against human TIM-3) Monoclonal antibodies in this example were prepared according to a general method as described in the introduction to monoclonal antibody experimental procedures (issued by Ando Minhe et al., Kodansha, 1991).
  • TIM-3 As an immunogen, TIM-3-expressing L929 cells obtained in Example 1 or soluble extracellular human TIM-3 obtained in Example 4 were used.
  • Balb / C mice purchased from Charles River Japan) were used as immunized animals.
  • mice were immunized intraperitoneally with 1 ⁇ 10 7 TIM-3-expressing L929 cells per mouse. Since the first immunization, the same cells were immunized three times or more. Three days before obtaining the spleen, 20 ⁇ g / mouse of soluble extra-cellular human TIM-3 obtained in Example 4 was administered via the tail vein. After the spleen was surgically obtained from the immunized mouse, the spleen was placed in 4 mL of PBS and crushed using a syringe piston on a mesh (Cell Strainer: manufactured by Falcon).
  • the cell suspension that passed through the mesh was centrifuged to precipitate the cells, and then resuspended in 1 mL of Red Blood Cell Lysing Buffer (manufactured by Sigma). After incubation at room temperature for 5 minutes, 10 mL of serum-free DMEM medium was added and the cells were precipitated by centrifugation. The precipitated cells were again suspended in serum-free DMEM medium.
  • myeloma cells SP2 / 0 (ATCC number: CRL-1581) were cultured in serum-containing DMEM medium at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide so that the cell concentration did not exceed 1 ⁇ 10 6 cells / mL. .
  • SP2 / 0 cells were washed with 10 mL of serum-free DMEM medium in the same manner as spleen-derived cells, and suspended in serum-free DMEM medium. These spleen-derived cell suspension and mouse myeloma suspension were mixed at a cell number of 5: 1, and after centrifugation, the supernatant was completely removed. To this pellet, 1 mL of 50% (w / v) polyethylene glycol 1500 (manufactured by Boehringer Mannheim) as a fusion agent was slowly added while stirring the pellet with the tip of a pipette, and then heated to 37 ° C. in advance. 1 mL of serum-free DMEM medium was slowly added.
  • 50% (w / v) polyethylene glycol 1500 manufactured by Boehringer Mannheim
  • Example 8 (Screening of hybridomas producing human and mouse monoclonal antibodies that bind to human TIM-3) Hybridomas were screened using the cell supernatants prepared in Examples 6 and 7. The method was performed by flow cytometry using a human TIM-3 stably expressing cell line. First, the human TIM-3-expressing Jurkat cells or EoL-1 cells obtained in Example 1 were washed with staining medium (PBS containing 2% FCS and 0.05% sodium azide), and 1 ⁇ 10 per mL. The suspension was suspended again with staining medium so that there were seven . 10 ⁇ L of the cell suspension was transferred to a 96-well plate.
  • staining medium PBS containing 2% FCS and 0.05% sodium azide
  • the labeled antibody is Goat F (ab ′) 2 Anti-Human IgG ( ⁇ chain specific) -R-PE (manufactured by Southern Biotech) for human monoclonal antibodies, and Goat F (for Southern monoclonal antibody).
  • Goat F for Southern monoclonal antibody.
  • ab ′ 2 Anti-Mouse IgG (H + L) R-PE (manufactured by Southern Biotech) was used.
  • HT Hypoxanthine-thymidine
  • the collected supernatant was screened in the same manner as in the primary screening, and anti-human TIM-3 human monoclonal antibody-producing hybridoma and anti-human TIM-3 mouse monoclonal antibody-producing hybridoma were cloned and used for purification of the monoclonal antibody.
  • Example 9 Purification of hybridoma-derived monoclonal antibody
  • Anti-TIM-3 human or mouse monoclonal antibody was purified from the anti-human TIM-3 human or mouse monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in Example 8. Briefly, using a CELLine antibody production system (BD Biosciences), a hybridoma supernatant containing anti-TIM-3 antibody at a high concentration was prepared, and anti-human TIM-3 monoclonal antibody was purified.
  • a number of mediums in which a DMEM medium containing HT containing HT and a BD Cell MAb serum-free medium were mixed at a ratio of 1: 1. Cultivated for a few days in a medium mixed 1: 2 for several more days.
  • the hybridoma was serum-free by culturing in a BD Cell MAb serum-free medium (BD Biosciences).
  • the serum-free hybridoma was cultured in a CL-1000 flask or the like according to the manual, and the hybridoma supernatant containing anti-TIM-3 antibody at a high concentration was recovered.
  • Antibody purification from the hybridoma supernatant was performed by a standard method using Protein A.
  • MabSelect manufactured by GE Healthcare was packed in an open column, passed through a 2-fold diluted supernatant with PBS, and eluted with 0.1 mol / L Glycin-HCl (pH 2.7). Concentrated using Amicon Ultra (Millipore). After that, 4 clones (512 antibody, 644 antibody, 4545 antibody, 4177 antibody) were obtained by substituting PBS with a NAP-5 column (manufactured by GE Healthcare) and sterilizing by filtration. One clone (8213 antibody) of purified anti-human TIM-3 mouse monoclonal antibody was obtained.
  • Example 10 (Determination of isotype of anti-TIM-3 human monoclonal antibody)
  • the isotype of the anti-TIM-3 human monoclonal antibody obtained in Example 9 was determined by antigen solid phase ELISA and flow cytometry. Specifically, in the antigen solid-phase ELISA method, first, 50 ⁇ L of the soluble extra-cellular human TIM-3 obtained in Example 4 was prepared in 1 ⁇ g / mL Carbonate-Bibonate Buffer (manufactured by Sigma), It added to each well of 96-well microplate for ELISA (Maxisorp, Nunk). By incubating overnight at 4 ° C., soluble extracellular TIM-3 was adsorbed to the microplate.
  • Carbonate-Bibonate Buffer manufactured by Sigma
  • the isotypes of the 512 antibody, the 644 antibody, and the 4545 antibody are IgG1, IgG4, and IgG2, respectively.
  • Example 11 Determination of isotype of mouse monoclonal antibody against human TIM-3)
  • the isotype of the anti-human TIM-3 mouse monoclonal antibody obtained in Example 9 was determined using an IsoStripe Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche Diagnostics).
  • the hybridoma supernatant containing the anti-TIM-3 antibody obtained in Example 8 was used and operated according to the manual. As a result, it was revealed that the isotype of the 8213 antibody is IgG2b.
  • Example 12 Isolation of anti-TIM-3 monoclonal antibody gene
  • the anti-TIM-3 human or mouse monoclonal antibody gene was isolated from the anti-human TIM-3 human or mouse monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in Example 9.
  • Total RNA was extracted from the cloned hybridoma using a High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics) according to the manual.
  • the variable region of the antibody cDNA was cloned using a SMART RACE cDNA amplification kit (manufactured by Clontech) according to the attached instructions.
  • the VH of the 512 antibody is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 54 and the amino acid sequence of 55
  • the VH of the 644 antibody is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 58 and the amino acid sequence of 59
  • the VH of the 4545 antibody is The nucleotide sequence was represented by SEQ ID NO: 7
  • the amino acid sequence was represented by SEQ ID NO: 8
  • it was revealed that the VH of the 4177 antibody was represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the obtained variable regions and human IgG1 constant region were incorporated into an expression vector N5KG1 (manufactured by Biogen IDEC Inc) and linked.
  • the VL of the 512 antibody is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 56 and the amino acid sequence of 57
  • the VL of the 644 antibody is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 60 and the amino acid sequence of 61
  • the VL of the 4545 antibody is The nucleotide sequence was represented by SEQ ID NO: 9, the amino acid sequence was represented by SEQ ID NO: 10, and the VH of the 4177 antibody was revealed to be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • the obtained variable regions and the constant region of the kappa chain were incorporated into an expression vector N5KG1 (manufactured by Biogen IDEC Inc) and linked.
  • VH mouse monoclonal antibody heavy chain
  • UPM SMART RACE cDNA amplification kit; manufactured by Clontech
  • primer mH_Rv1 SEQ ID NO: 48
  • NUP SMART RACE cDNA amplification kit; Clontech
  • primer mH_Rv2 SEQ ID NO: 49
  • the PCR product was cloned using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (manufactured by Invitrogen), etc., and the nucleotide sequence and amino acid sequence were analyzed using a universal primer (eg, T7 or M13R primer) of the vector.
  • a universal primer eg, T7 or M13R primer
  • VH of the antibody 8213 is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.
  • the obtained variable region and mouse IgG2a constant region were ligated and incorporated into an expression vector N5KG1 (manufactured by Biogen IDEC Inc).
  • VL PCR For mouse monoclonal antibody light chain (VL) PCR, UPM (SMART RACE cDNA amplification kit; manufactured by Clontech) and primer mK_Rv1 (SEQ ID NO: 50) were used. (SMART RACE cDNA amplification kit; manufactured by Clontech) and primer mK_Rv2 (SEQ ID NO: 51) were used.
  • the PCR product was cloned using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (manufactured by Invitrogen) or the like, and the base sequence and amino acid sequence were analyzed using a universal primer (eg, T7 or M13R primer) of the vector.
  • VL of the 8213 antibody is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
  • the obtained variable region and the mouse ⁇ chain constant region were ligated and inserted into an expression vector incorporating the above-mentioned 8213 antibody VH.
  • an anti-dinitrophenol (DNP) human IgG1 antibody as a negative control, the base sequence of anti-heavy chain (VH) (SEQ ID NO: 62), the base sequence of antibody light chain (VL) (SEQ ID NO: 64), human IgG1 And the constant region of the kappa chain were incorporated into an expression vector N5KG1 (Biogen IDEC Inc).
  • Example 13 Purification of Recombinant Anti-TIM-3 Human Monoclonal Defucose Antibody
  • the recombinant antibody expression vector constructed in Example 12 was introduced into a host cell to prepare a recombinant antibody expression cell.
  • a host cell for expression FUT8 ⁇ / ⁇ CHO cells were used according to a report (Clin Cancer Res 2006: 12 (9) Iida et al.).
  • the 512, 644, 4545, or 4177 expression vectors obtained in Example 12 were introduced into FUT8 ⁇ / ⁇ CHO cells using FreeStyle TM MAX Reagent (manufactured by Invitrogen).
  • FUT8 ⁇ / ⁇ CHO cells were cultured in a CO 2 5%, 37 ° C. environment using a shaker, and the culture supernatant was recovered after about 5 days.
  • the collected culture supernatant is Protein A (manufactured by GE Healthcare) and a 0.8 ⁇ 40 cm column (manufactured by Bio-Rad) depending on the amount of purification, PBS as an adsorption buffer, and 0.02 mol as an elution buffer.
  • the prepared antibody solution was substituted and concentrated with PBS using NAP-25 (manufactured by GE Healthcare) and Amicon Ultra (10000 cut, manufactured by Millipore), sterilized by filtration, and then recombinant anti-TIM-3 human. Monoclonal defucose antibodies (512 antibody, 644 antibody, 4545 antibody, 4177 antibody) were obtained. The degree of purification was measured using Limulus ES-II kit Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and it was confirmed that the product was sufficiently purified. In addition, the anti-DNP antibody expression vector obtained in Example 12 was introduced into CHO-DG44 cells.
  • CHO-DG44 cells were cultured using a shaker in an environment of 5% CO 2 and 37 ° C., and the culture supernatant was recovered after about 5 days. Similarly, the collected culture supernatant is purified using Protein A (GE Healthcare) and a 0.8 ⁇ 40 cm column (BioRad) according to the amount to be purified. As an affinity purification, 0.02 mol / L sodium citrate buffer (pH 2.7, 50 mmol / L NaCl) was used. For the elution fraction, 0.2 mol / L sodium phosphate buffer (pH 7.0) was added.
  • the prepared antibody solution was substituted and concentrated with PBS using NAP-25 (manufactured by GE Healthcare) and Amicon Ultra (10000 cut, manufactured by Millipore), sterilized by filtration, and then a recombinant anti-DNP antibody was obtained. It was.
  • the degree of purification was measured using Limulus ES-II kit Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and it was confirmed that the product was sufficiently purified.
  • Example 14 Purification of recombinant anti-TIM-3 mouse monoclonal antibody
  • the expression vector of the 8213 antibody obtained in Example 12 was introduced into HEK293F cells (Invitrogen) using 293fectin (Invitrogen).
  • HEK293F cells were cultured in a CO 2 5%, 37 ° C. environment using a shaker, and the culture supernatant was collected after about 5 days.
  • the collected culture supernatant was subjected to Protein A (GE Healthcare) and 0.8 ⁇ 40 cm column (BioRad) depending on the amount of purification, PBS as an adsorption buffer, and 0.
  • Affinity purification was performed using 02 mol / L sodium citrate buffer (pH 2.7, 50 mmol / L NaCl).
  • the elution fraction was added with 0.2 mol / L sodium phosphate buffer (pH 7.0).
  • the prepared antibody solution was substituted and concentrated with PBS using NAP-25 (manufactured by GE Healthcare) and Amicon Ultra (10000 cut, manufactured by Millipore), sterilized by filtration, and then recombined anti-TIM-3 mice.
  • a monoclonal antibody (8213 antibody) was obtained.
  • the degree of purification was measured using Limulus ES-II kit Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and it was confirmed that it was sufficiently purified.
  • Example 15 Fluorescent labeling of purified monoclonal antibody
  • Fluorescent labeling of the hybridoma-derived monoclonal antibody and the recombinant monoclonal antibody was carried out using Alexa Fluor 647 Monoclonal Antibody Labeling Kit (manufactured by Invitrogen) according to the manual. After the labeling operation, each antibody was confirmed to be labeled with Alexa Fluor 647 (hereinafter referred to as Alexa-647) by FACSCalibur (manufactured by BD Biosciences) on TIM-3-expressing cells.
  • Example 16 (Epitope classification by competitive test-1) The relationship between the epitopes of the antibodies obtained in Examples 13 and 14 and the commercially available anti-TIM-3 antibody 344823 antibody (Clone 344823, manufactured by R & D Systems) was examined in a competition test. Briefly, the test antibody is reacted with the TIM-3-expressing cells obtained in Example 1, and it is evaluated by flow cytometry whether another labeled anti-TIM-3 antibody can further bind to the TIM-3-expressing cells. did.
  • the presence or absence of competition between the monoclonal antibodies (512 antibody, 644 antibody, 4545 antibody, 4177 antibody, 8213 antibody) prepared in Examples 13 and 14 and the 344823 antibody was examined.
  • purified test monoclonal antibodies (512 antibody, 644 antibody, 4545 antibody, 4177 antibody, and 8213 antibody) were reacted with human TIM-3-expressing EoL-1 cells washed with staining medium and parent strain EoL-1 cells, respectively. (4 ° C for 30 minutes). The final concentration was 10 ⁇ g / mL.
  • PE-labeled 344823 antibody (Clone 344823, manufactured by R & D Systems) was added and allowed to react (4 ° C., 30 minutes). After washing with staining medium, 7-AAD (BD Biosciences) was added and analyzed by FACSCalibur (BD Biosciences).
  • antibody 4545 inhibited binding of Alexa-647-labeled 8213 antibody to TIM-3-expressing cells. Therefore, it was revealed that the 4545 antibody and the 8213 antibody compete with each other, while these two antibodies do not compete with the 512 antibody. This result suggests that the 512 antibody recognizes a different epitope from the 344823 and 8213 antibodies.
  • the presence or absence of competition with the 512 and 8213 antibodies was examined for the 4177 antibody, which was found to partially compete with the 344823 antibody in the first stage.
  • the method was performed as in the second stage.
  • the 4177 antibody did not inhibit the binding of Alexa-647-labeled 512 antibody to TIM-3-expressing cells, while it inhibited the binding of Alexa-647-labeled 8213 antibody to TIM-3-expressing cells. It was revealed that the antibody did not compete with the 512 antibody but competed with the 8213 antibody.
  • the 644 antibody recognizes the vicinity of the epitope recognized by the 344823 antibody, and the 512 antibody is the 344823 antibody or other 4 antibodies (644 antibody, 4545 antibody). , 4177 antibody, and 8213 antibody) were suggested to recognize different epitopes.
  • the 8213 antibody recognizes an epitope different from the epitope recognized by the 344823 antibody or 512 antibody. It was suggested that the 4545 antibody recognizes the vicinity of the epitope recognized by the 8213 antibody. On the other hand, it was suggested that the 4177 antibody slightly recognizes the vicinity of the epitope recognized by the 344823 antibody as well as the vicinity of the epitope recognized by the 8213 antibody.
  • Antibody-dependent cytotoxic activity test using recombinant anti-TIM-3 human monoclonal defucose antibody Antibody-mediated cellular cytotoxicity is measured by measuring ADCC activity on target cells using human peripheral blood mononuclear cells (hereinafter referred to as PBMC) as an effector in the presence of antibodies. Carried out. First, peripheral blood was collected from a healthy volunteer and an anticoagulant was added. This blood was allowed to stand on Ficoll-Place Plus (manufactured by GE Healthcare) and centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes using a large centrifuge (CF9RX, manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.) so as not to disturb the interface. .
  • Ficoll-Place Plus manufactured by GE Healthcare
  • the intermediate layer containing the cells was collected and washed with PBS, and the platelets removed by centrifugation at 900 rpm for 20 minutes was used as PBMC for measurement.
  • Recombinant anti-TIM-3 human monoclonal defucose antibodies (512 antibody, 644 antibody, 4545 antibody, 4177 antibody) obtained in Examples 13 and 14 and anti-DNP antibody as human IgG1 controls were suspended in the medium, respectively, to give final concentrations. It added so that it might become 1 microgram / mL and a total of 100 microliters. After mixing, the cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 4 hours. The solubility of the target cells was evaluated from the amount of LDH released into the medium. Measurement of LDH and calculation of solubility were performed according to the manual using CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega). For the significance test, standard Student's t-test was used, and those with a risk factor (p) of 0.05 or less were significantly different.
  • p risk factor
  • the 4545 antibody and the 4177 antibody showed a marked increase in target cell lysis rate compared with the anti-DNP antibody. This result suggests that anti-TIM-3 mouse antibody 8213 and anti-TIM-3 antibody that competes with anti-TIM-3 mouse antibody 8213 have high ADCC activity.
  • the recombinant anti-TIM-3 human monoclonal defucose antibody (4545 antibody, 4177 antibody) obtained in Example 13, 344823 antibody which is a commercially available anti-human TIM-3 monoclonal antibody, and anti-DNP as a negative control ADCC activity was similarly measured using the antibody.
  • peripheral blood was collected from a healthy volunteer and an anticoagulant was added. This blood was allowed to stand on Ficoll-Plaque Plus (GE Healthcare) and centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes using a large centrifuge (CF9RX, manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.) so as not to disturb the interface. .
  • the intermediate layer containing the cells was collected and washed with PBS, and the platelets removed by centrifugation at 900 rpm for 20 minutes was used as PBMC for measurement.
  • Example 18 (Calculation of binding dissociation constant using anti-TIM-3 antibody)
  • the binding dissociation constant of the anti-TIM-3 antibody was analyzed using an analyzer based on the principle of surface plasmon resonance (Biacore, manufactured by GE Healthcare). Briefly, anti-human antibody or anti-mouse antibody was immobilized on a CM5 sensor chip, and then anti-TIM-3 human or mouse antibody was allowed to flow and bind, and then the soluble extracellular human TIM prepared in Example 4 was used. The binding dissociation of TIM-3 to the anti-TIM-3 antibody was observed by flowing -3. Throughout the entire experimental process, basically, GE Healthcare's experimental method for calculating the binding dissociation constant was referred to.
  • CM5 Research Grade, manufactured by GE Healthcare
  • a CM5 chip was mixed with 400 mmol / L EDC (N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbohydrate) and 100 mmol / L NHS (N-hydroxysuccinimide) and mixed into an activated CM5 chip. It was.
  • the anti-human antibody antibody attached to Human Antibody Capture Kit manufactured by GE Healthcare
  • mouse antibodies antibodies against mouse antibodies attached to Mouse Antibody Capture Kit (manufactured by GE Healthcare) were diluted in a solution attached to the kit, and flowed to a CM5 chip in the required amount. Next, 1 mol / L ethanolamide hydrochloride was flowed to block and inactivate the activated chip surface.
  • HBS-EP buffer manufactured by GE Healthcare
  • soluble extracellular TIM-3 was flowed.
  • 3 mol / L MgCl 2 attached to Human Antibody Capture Kit or pH 1.7 Glycine-HCl attached to Mouse Antibody Capture Kit The amount of shed.
  • the process up to this point was made one step, and the same process was repeated at a plurality of concentrations for soluble extracellular human TIM-3 to obtain data (sensorgram) for calculating the binding dissociation constant.
  • concentration of soluble extracellular TIM-3 flowing as an analyte was calculated by measuring the absorbance at 280 nm and 1 mg / mL as 1.4 OD.
  • the molecular weight of the soluble extra-cellular human TIM-3 was calculated to be about 42.8 kDa from the electrophoretic mobility.
  • the analysis used Biavaluation software (made by GE Healthcare), and referred to Biavaluation Software Handbook. Specifically, simultaneous analysis of Kinetics analysis is performed, fitting is basically performed using a 1: 1 Langmuir Binding reaction model, and a binding rate constant (Ka) and a dissociation rate constant (Kd) are calculated, and Kd / calculated dissociation constants K D values by calculation of Ka.
  • Example 19 (Epitope classification by competitive test-2) The epitopes of anti-TIM-3 antibodies 512, 644, 4545, 8213, 344823, F38-2E2 and control anti-DNP antibody were examined in a competition test. Briefly, an unlabeled test antibody is reacted with the TIM-3-expressing cells obtained in Example 1 to determine whether another fluorescently labeled anti-TIM-3 antibody can further bind to the TIM-3-expressing cells. It was evaluated by a measurement method.
  • Test monoclonal antibodies purified to human TIM-3-expressing EoL-1 cells washed with staining medium [anti-DNP antibody, 512 antibody, 644 antibody, 4545 antibody, 8213 antibody, 344823 antibody (manufactured by R & D Systems), F38-2E2 Antibody (manufactured by Imgenex)] was reacted (4 ° C., 30 minutes). The final concentration was 10 ⁇ g / mL.
  • Alexa-647 or APC-labeled anti-TIM-3 antibody [344823 antibody (R & D Systems), F38-2E2 antibody (eBioscience)] was added and allowed to react (4 ° C., 30 minutes). After washing with staining medium, 7-AAD (BD Biosciences) was added and analyzed by FACSCalibur (BD Biosciences).
  • Table 1 The results are shown in Table 1.
  • “+” indicates that binding to an unlabeled anti-TIM-3 antibody bound to a TIM-3-expressing cell was observed to the same extent as in the negative control, “+”, and TIM ⁇ bound to an unlabeled anti-TIM-3 antibody.
  • Alexa-647-labeled 512 antibody was found to bind to TIM-3-expressing cells to which other unlabeled anti-TIM-3 antibodies were bound, 644 antibody, 4545 antibody, 8213 antibody , 344823 antibody, F38-2E2 antibody, it was suggested to recognize independent epitopes.
  • Alexa-647-labeled 644 antibody was found to have no or decreased binding to TIM-3-expressing cells to which unlabeled anti-TIM-3 antibody 344823 antibody or F38-2E2 antibody was bound. Therefore, 344823 antibody, F38-2E2 It was suggested to recognize closely adjacent epitopes that compete with the antibody.
  • Alexa-647-labeled 4545 antibody recognizes epitopes close to each other that compete with 8213 antibody because binding of unlabeled anti-TIM-3 antibody 8213 antibody to bound TIM-3-expressing cells was not observed. Was suggested.
  • Alexa-647-labeled 8213 antibody recognizes epitopes close to each other that compete with 4545 antibody because binding of unlabeled anti-TIM-3 antibody 4545 antibody to bound TIM-3-expressing cells was not observed. Was suggested.
  • the APC-labeled F38-2E2 antibody was in close proximity to each other, competing with the 644 antibody or 344823 antibody, since no binding of unlabeled anti-TIM-3 antibody 644 antibody or 344823 antibody to bound TIM-3-expressing cells was observed. It was suggested that the recognized epitope was recognized.
  • Example 20 (Molecular cloning of mouse TIM-3 cDNA) Mouse TIM-3 cDNA was obtained in the same manner as in Example 1. Total RNA was extracted from Balb / c mouse-derived bone marrow cells using High Pure RNA Isolation Kit (Roche), and template cDNA was synthesized using ThermoScript RT-PCR System (Invitrogen). As the primers, mTim-3 Fw3 (SEQ ID NO: 70) and mTim-3 Re3 (SEQ ID NO: 71) were used. After insertion into pGEM-T Easy vector (Promega), a clone having the same base sequence as the coding region of GenBank accession number AF450241 was selected by DNA sequence analysis.
  • mTim-3 Fw4NotI SEQ ID NO: 72
  • mTim-3 Re4NotI SEQ ID NO: 73
  • Example 21 (Construction of hTim-3 / pEF6 Myc_HisC)
  • the hTIM-3 / pMCs-IG plasmid DNA and pEF6 Myc_HisC prepared in Example 1 were each digested with NotI to construct a human TIM-3-expressing pEF6 Myc_HisC vector (hTim-3 / pEF6 Myc_HisC). DNA sequence analysis was performed, and it was confirmed that it had the same base sequence as the coding region of GenBank accession number NM_032782.
  • Example 22 Evaluation of cross-reactivity of anti-human TIM-3 antibody to mouse TIM-3 antibody
  • HEK293F cells were transfected with mTim-3 / pEF6 Myc_HisC, hTim-3 / pEF6 Myc_HisC plasmid DNA prepared in Example 20 and Example 21, and a control empty vector.
  • Alexa-647-labeled anti-human TIM-3 antibody 512 antibody, 644 antibody, 4545 antibody, 8213 antibody
  • APC-labeled commercially available anti-human TIM-3 antibodies 344823 antibody and F38-2E2
  • Antibody) and PE-labeled commercially available anti-mouse TIM-3 antibody (RMT3-23 antibody, manufactured by Biolegend) were evaluated by flow cytometry for binding to human TIM-3 and mouse TIM-3.
  • the 512 antibody, 644 antibody, 4545 antibody, 8213 antibody, 344823 antibody and F38-2E2 antibody bound only to human TIM-3 expressing 293F cells.
  • RMT3-23 antibody bound only to mouse TIM-3-expressing 293F cells. From this, it was found that the 512 antibody, 644 antibody, 4545 antibody, 8213 antibody, 344823 antibody and F38-2E2 antibody did not cross-react with mouse TIM-3.
  • Example 23 Construction of TIM-3 chimeric protein expression system in which IgV domain is replaced with mouse TIM-3) Using hTIM3 + mIgV_vecR1 primer (SEQ ID NO: 74) and hTIM3 + mIgV_vecF1 primer (SEQ ID NO: 75) using hTim-3 / pEF6 Myc_HisC plasmid DNA as a template, PCR was performed using PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara Bio).
  • the obtained two PCR products were combined using GENEART seamless cloning and assembly kit (manufactured by Invitrogen).
  • the sequence of the clone obtained from the transformant was analyzed and confirmed to be the target sequence (IgV chimeraTIM-3 / pEF6 Myc_HisC, SEQ ID NO: 78).
  • Example 24 (Construction of a TIM-3 chimeric protein expression system in which the Mucin domain is replaced with mouse TIM-3)
  • the hTIM3 + mMucin_vecR2 primer (SEQ ID NO: 80) and the hTIM3 + mMucin_vecF2 primer (SEQ ID NO: 81) were used with hTim-3 / pEF6 Myc_HisC plasmid DNA as a template, and PrimeSTAR GXL DNA Polymerase was used for PCR amplification by Takara Bio.
  • hTIM3 + mMucin_insF2 primer SEQ ID NO: 82
  • hTIM3 + mMucin_insR2 primer SEQ ID NO: 83
  • PrimeSTAR GXL DNA Polymerase manufactured by Takara Bio Inc.
  • the obtained two PCR products were combined using GENEART seamless cloning and assembly kit (manufactured by Invitrogen).
  • the sequence of the clone obtained from the transformant was analyzed and confirmed to be the target sequence (Mucin chimeraTIM-3 / pEF6 Myc_HisC, SEQ ID NO: 84).
  • Example 25 (Evaluation of anti-TIM-3 antibody binding to TIM-3 chimeric protein with IgV domain replaced with mouse TIM-3 and TIM-3 chimeric protein with mucin domain replaced with mouse TIM-3) IgV chimerTIM-3 / pEF6 Myc_HisC, Mucin chimeraTIM-3 / pEF6 Myc_HisC, hTim-3 / pEF6 Myc_HisC, mTim-3 / pEF6 Mys_p HEK293F cells were transfected as described above. Two days later, the binding of anti-TIM-3 antibody was evaluated by flow cytometry in the same manner as in Example 22.
  • the 512 antibody, the 644 antibody, the 4545 antibody, the 8213 antibody, the 4177 antibody, the 344823 antibody, and the F38-2E2 antibody bound only to the human TIM-3 expressing cells and the Mucin chimeraTIM-3 expressing cells.
  • RMT3-23 antibody bound only to mouse TIM-3-expressing cells and IgV chimeraTIM-3-expressing cells.
  • Example 26 (Construction of TIM-3 chimera 22-47 / pEF6 Myc_HisC) An expression vector for expressing a TIM-3 chimeric protein in which amino acids corresponding to positions 22 to 47 of human TIM-3 (SEQ ID NO: 53) are substituted with mouse TIM-3 (hereinafter referred to as TIM-3 chimera 22-47) ) was built.
  • the method uses hTim-3 chimera22-47F1 primer (SEQ ID NO: 86) and hTIM3 chimera 22-47R1 primer (SEQ ID NO: 87) as a template using hTim-3 / pEF6 Myc_HisC plasmid DNA prepared in Example 21 as a template. Amplification was performed by PCR using Biotechnology.
  • the obtained PCR product was used as a template for amplification by PCR using PrimeR GXL DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) using hTIM3 chimera 22-47F2 primer (SEQ ID NO: 88) and hTIM3 chimera 22-47R2 primer (SEQ ID NO: 89).
  • amplification was performed by PCR using PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) using hTIM3 chimera 22-47F3 primer (SEQ ID NO: 90) and hTIM3 chimera 22-47R3 primer (SEQ ID NO: 91).
  • the PCR product obtained by the third PCR was digested with DpnI (New England Biolabs) and then subjected to agarose electrophoresis. DNA was extracted and bound using GENEART seamless cloning and assembly kit (manufactured by Invitrogen). The sequence of the clone obtained from the transformant was analyzed and confirmed to be the target sequence (TIM-3 chimera 22-47 / pEF6 Myc_HisC, SEQ ID NO: 92).
  • Example 27 (Construction of TIM-3 chimera 57-66 / pEF6 Myc_HisC) An expression vector for expressing a TIM-3 chimeric protein in which amino acids corresponding to positions 57 to 66 of human TIM-3 (SEQ ID NO: 53) are substituted with mouse TIM-3 (hereinafter referred to as TIM-3 chimera 57-66) ) was built. The method was the hTIM3 chimera57-66F primer (ra.
  • hTIM3 chimera57-66F primer (rain 94IM) and the hTIM3 chimera57-66F primer (rain 94IM) that were phosphorylated with T4 Polynucleotide Kinase (manufactured by New England Biolabs) using the hTim-3 / pEF6 Myc_HisC plasmid DNA prepared in Example 21 as a template.
  • T4 Polynucleotide Kinase manufactured by New England Biolabs
  • amplification was performed by PCR using PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the obtained PCR product was digested with DpnI (manufactured by New England Biolabs) and then subjected to agarose electrophoresis. DNA was extracted and bound using a LigaFast TM Rapid DNA Ligation System (Promega). The sequence of the clone obtained from the transformant was analyzed and confirmed to be the target sequence (TIM-3 chimera 57-66 / pEF6 Myc_HisC, SEQ ID NO: 96).
  • Example 28 (Construction of TIM-3 chimera 67-105 / pEF6 Myc_HisC) An expression vector for expressing a TIM-3 chimeric protein in which amino acids corresponding to positions 67 to 105 of human TIM-3 (SEQ ID NO: 53) are substituted with mouse TIM-3 (hereinafter referred to as TIM-3 chimera 67-105) ) was built.
  • mTIM3 chimera 67-105F primer (SEQ ID NO: 100) and mTIM3 chimera 67-105R primer (SEQ ID NO: 101) were used with mTim-3 / pEF6 Myc_HisC plasmid DNA as a template, and PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used. did.
  • the obtained two PCR products were combined using GENEART serumless cloning and assembly kit (manufactured by Invitrogen). The sequence of the clone obtained from the transformant was analyzed and confirmed to be the target sequence (TIM-3 chimera 67-105 / pEF6 Myc_HisC, SEQ ID NO: 102).
  • Example 29 (Construction of TIM-3 chimera 74-81 / pEF6 Myc_HisC)
  • An expression vector (hereinafter referred to as TIM-3 chimera 74-81) for expressing a TIM-3 chimeric protein in which amino acids corresponding to positions 74 to 81 of human TIM-3 (SEQ ID NO: 53) are substituted with mouse TIM-3 ) was built.
  • the method uses hTim-3 / pEF6 Myc_HisC plasmid DNA prepared in Example 21 as a template, hTIM3 chimera 74-81F primer (SEQ ID NO: 104) and hTIM3 chimera 74-81R primer (SEQ ID NO: 105), and PrimeSTAR GXL DNA polymerase Amplification was carried out by PCR using Biotechnology.
  • the obtained PCR product was digested with DpnI (manufactured by New England Biolabs) and then subjected to agarose electrophoresis. DNA was extracted and bound using GENEART seamless cloning and assembly kit (manufactured by Invitrogen). The sequence of the clone obtained from the transformant was analyzed and confirmed to be the target sequence (TIM-3 chimera 74-81 / pEF6 Myc_HisC, SEQ ID NO: 106).
  • Example 30 (Construction of TIM-3 chimera 88-96 / pEF6 Myc_HisC)
  • An expression vector (hereinafter referred to as TIM-3 chimera 88-96) for expressing a TIM-3 chimeric protein in which amino acids corresponding to positions 88 to 96 of human TIM-3 (SEQ ID NO: 53) are substituted with mouse TIM-3 ) was built.
  • the method used was the hTIM3 chimera 88-96F primer (SEQ ID NO: 108) and the hTIM3 chimera 88-96R primer (SEQ ID NO: 109) using the hTim-3 / pEF6 Myc_HisC plasmid DNA prepared in Example 21 as a template, and PrimeSTAR GXL DNA polymerase Amplification was performed by PCR using Biotechnology.
  • the obtained PCR product was digested with DpnI (manufactured by New England Biolabs) and then subjected to agarose electrophoresis. DNA was extracted and bound using GENEART seamless cloning and assembly kit (manufactured by Invitrogen). The sequence of the clone obtained from the transformant was analyzed and confirmed to be the target sequence (TIM-3 chimera 88-96 / pEF6 Myc_HisC, SEQ ID NO: 110).
  • Example 31 (Construction of TIM-3 chimera 96-105 / pEF6 Myc_HisC) An expression vector for expressing a TIM-3 chimeric protein in which amino acids corresponding to positions 96 to 105 of human TIM-3 (SEQ ID NO: 53) are substituted with mouse TIM-3 (hereinafter referred to as TIM-3 chimera 96-105) ) was built.
  • the method uses hTIM3 chimera 96-105F primer (SEQ ID NO: 112) and hTIM3 chimera 96-105R primer (SEQ ID NO: 113) using hTim-3 / pEF6 Myc_HisC plasmid DNA prepared in Example 21 as a template, PrimeSTAR GXL DNA primer (SEQ ID NO: 113). Amplification was carried out by PCR using Biotechnology.
  • the obtained PCR product was digested with DpnI (manufactured by New England Biolabs) and then subjected to agarose electrophoresis. DNA was extracted and bound using GENEART seamless cloning and assembly kit (manufactured by Invitrogen). The sequence of the clone obtained from the transformant was analyzed and confirmed to be the target sequence (TIM-3 chimera 96-105 / pEF6 Myc_HisC, SEQ ID NO: 114).
  • Example 32 (Assessment of anti-TIM-3 antibody binding to TIM-3 chimeric protein in which a part of IgV domain is substituted with mouse TIM-3)
  • HEK293F cells were transfected with expression vectors for various TIM-3 chimeric proteins prepared in Examples 26 to 31 and a control empty vector.
  • the introduced expression vector and the TIM-3 chimeric protein expressed by the vector are as follows.
  • TIM-3 chimera 22-47 TIM-3 chimera protein in which amino acids corresponding to positions 22 to 47 of human TIM-3 (SEQ ID NO: 53) are substituted with mouse TIM-3
  • TIM-3 chimera 57 -66 TIM-3 chimeric protein in which amino acids corresponding to positions 57 to 66 of human TIM-3 (SEQ ID NO: 53) were substituted with mouse TIM-3
  • TIM-3 chimera 67-105 human TIM-3 ( TIM-3 chimeric protein in which amino acids corresponding to positions 67 to 105 of SEQ ID NO: 53) were substituted with mouse TIM-3
  • TIM-3 chimeric protein in which the amino acid corresponding to the position is substituted with mouse TIM-3
  • TIM-3 chim ra 88-96 TIM-3 chimeric protein in which amino acids corresponding to positions 88 to 96 of human TIM-3
  • 4545 antibody and 8213 antibody are cells transfected with TIM-3 chimera 22-47, TIM-3 chimera 57-66, TIM-3 chimera 88-96, TIM-3 chimera 96-105. Combined. On the other hand, it did not bind to the cells transfected with TIM-3 chimera 67-105.
  • the 512 antibody is a cell transfected with TIM-3 chimera 57-66, TIM-3 chimera 88-96, TIM-3 chimera 96-105, TIM-3 chimera 67-105, and TIM-3 chimera 74-81. Combined. On the other hand, it did not bind to the cells transfected with TIM-3 chimera 22-47.
  • the 644 antibody, 344823 antibody, and F38-2E2 antibody are TIM-3 chimera 22-47, TIM-3 chimera 88-96, TIM-3 chimera 96-105, TIM-3 chimera 67-105, and TIM- 3 chimera 74-81 bound to the transfected cells. On the other hand, it did not bind to cells transfected with TIM-3 chimera 57-66.
  • TIM-3 chimera 22-47, TIM-3 chimera 57-66, and TIM-3 chimera 67-105 bound weakly to the transfected cells.
  • Example 16 and Example 19 From the above results and the results of Example 16 and Example 19, it was shown that the 4545 antibody and the 8213 antibody bind to amino acids 67 to 87 of human TIM-3. Furthermore, since it did not bind to cells transfected with TIM-3 chimera 74-81, amino acids necessary for binding of human 4TIM and 8213 antibodies to human TIM-3 are included in the 74th to 81st amino acids. It was suggested that
  • the 512 antibody binds to amino acids up to 47th of human TIM-3, and the 644, 344823, and F38-2E2 antibodies bind to amino acids 57 to 66 of human TIM-3. Was suggested.
  • the 4177 antibody binds to the 4545 antibody or the 8213 antibody, but does not bind to the 512 antibody, the 644 antibody, the 344823 antibody, and the F38-2E2 antibody.
  • the amino acids contained in amino acids 67 to 87 of human TIM-3. Of these, it was suggested to bind to amino acids except 74th to 81st amino acids.
  • Example 33 (Preparation of anti-human TIM-3 8213 antibody humanized antibody) (1) Design of VH and VL amino acid sequences of 8213 antibody humanized antibody The VH amino acid sequence of the 8213 antibody humanized antibody was designed as follows. The amino acid sequence of the VH FR of a human antibody suitable for transplantation of the amino acid sequence of CDRs 1 to 3 of the 8213 antibody VH (SEQ ID NOs: 21 to 23) was selected as follows.
  • the homology of HSGI, HSGII, and HSGIII was 77.0%, 55.2%, and 58.6%, respectively. Therefore, the FR amino acid sequence of 8213 antibody VH had the highest homology with subgroup I.
  • the amino acid sequence of CDR of the 8213 antibody VH (SEQ ID NOs: 21 to 23) was transplanted to the appropriate position of the FR amino acid sequence of the consensus sequence of VH subgroup I of the human antibody.
  • the VH amino acid sequence 8213 antibody HV0 of the anti-human TIM-3 8213 antibody humanized antibody represented by SEQ ID NO: 67 was designed.
  • amino acid sequence of VL of the 8213 antibody humanized antibody was designed as follows.
  • the amino acid sequence of the FRs of human antibody VL suitable for transplantation of the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of the 8213 antibody VL were selected as follows.
  • the homology of HSGI, HSGII, HSGIII, and HSGIV was 76.3%, 61.3%, 61.3%, and 68.8%, respectively. Therefore, the FR amino acid sequence of the 8213 antibody VL had the highest homology with subgroup I.
  • the CDR amino acid sequence of the 8213 antibody VL (SEQ ID NOs: 24-26) was transplanted to the appropriate position of the FR amino acid sequence of the consensus sequence of subgroup I of the human antibody VL.
  • the amino acid sequence 8213 antibody LV0 of the VL of the anti-human TIM-3 8213 antibody humanized antibody represented by SEQ ID NO: 69 was designed.
  • the above-designed humanized antibody VH amino acid sequence 8213 antibody HV0 and VL amino acid sequence 8213 antibody LV0 are the amino acid sequence of the mouse monoclonal antibody 8213 antibody CDR. This is a sequence obtained by transplanting only the sequence.
  • HV0LV0 the three-dimensional structure of the antibody V region
  • Discovery Studio (Accelrys Co., Ltd.) was used for producing the three-dimensional structure coordinates and displaying the three-dimensional structure.
  • a computer model of the three-dimensional structure of the V region of the 8213 antibody was also constructed in the same manner.
  • amino acid residues that differ from the 8213 antibody are selected, and an amino acid sequence modified to the amino acid residue of the 8213 antibody is prepared.
  • amino acid residues predicted to affect the binding activity of the antibodies were identified.
  • the three-dimensional structure of the antigen binding site is changed, and the amino acid residues that are thought to affect the antibody binding activity
  • the 8213 antibody HV0, the 12th Lys, the 20th Val, the 38th Arg, the 40th Ala, the 48th Met, the 67th Arg, the 68th Val, the 70th Ile, the 72nd Ala, The 74th Thr, the 98th Arg, and the 113th Val the 8213 antibody LV0, the 11th Leu, the 13th Ala, the 15th Val, the 36th Tyr, the 43rd Ala, the 44th Pro, 46th Leu, 71st Phe, and 85th Thr were selected, respectively.
  • At least one amino acid sequence was modified to an amino acid residue present at the same site of the 8213 antibody, and VH and VL of humanized antibodies having various modifications were designed.
  • the 12th Lys of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 is Val
  • the 20th Val is Leu
  • the 38th Arg is Lys
  • the 40th Ala is Arg
  • the 48th Met to Ile, 67th Arg to Lys, 68th Val to Ala, 70th Ile to Leu, 72nd Ala to Val, 74th Thr to Lys, 98th Arg
  • At least one of the amino acid modifications in which Gly was substituted for Gly or 113th Val was replaced with Leu was introduced.
  • the 11th Leu of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69 is Met
  • the 13th Ala is Val
  • the 15th Val is Leu
  • the 36th Tyr is Leu
  • the 43rd Ala is In Ser
  • at least one of the amino acid substitutions for substitution of 44th Pro into Phe, 46th Leu into Gly, 71st Phe into Tyr, and 85th Thr into Asp was introduced.
  • the antibody V region of the humanized antibody modified with at least one amino acid residue present in FR of HV0LV0 is HV0LV0, HV0LV2, HV0LV4, HV0LV5, HV0LV6, HV0LV7, HV0LV9, HV3LV4, HV3LV4, HV3LV2, , HV3LV7, HV3LV9, HV4LV0, HV4LV2, HV4LV4, HV4LV5, HV4LV6, HV4LV7, HV4LV9, HV5LV0, HV5LV2, HV5LV4, HV5LV5, HV5LV6, HV5LV7, HV5LV9, HV6LV0, HV6LV2, HV6LV4, HV6LV5, HV6LV6, HV6LV7, HV6LV9, HV7LV0, HV7LV2 , HV7LV4, HV7LV5, HV7L 6, HV7LV7, HV7LV9, HV7LV0
  • the amino acid sequences of the heavy chain variable regions HV3, HV4, HV5, HV6, HV7, HV8, HV10, HV12 and the light chain variable regions LV2, LV4, LV5, LV6, LV7, and LV9 are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
  • the DNA encoding the amino acid sequence of the variable region of the 8213 antibody humanized antibody is the DNA encoding the amino acid sequence of the 8213 antibody VH and the 8213 antibody VL (SEQ ID NOs: 27 and 29).
  • amino acid codons and modifying amino acids they were designed using codons frequently used in mammalian cells.
  • antibody expression vectors were constructed and humanized antibodies were expressed.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence of Human 4545 H chain CDR1 SEQ ID NO: 2: amino acid sequence of Human 4545 H chain CDR2 SEQ ID NO: 3: amino acid sequence of Human 4545 H chain CDR3 SEQ ID NO: 4: amino acid sequence of Human 4545 L chain CDR1 SEQ ID NO: 5: Human 4545 L Amino acid sequence of chain CDR2 SEQ ID NO: 6: Amino acid sequence of human 4545 L chain CDR3 SEQ ID NO: 11: Amino acid sequence of human chain 4177 H chain CDR1 SEQ ID NO: 12: Amino acid sequence of human chain 4 CDR2 SEQ ID NO: 13: Amino acid sequence of human 4177 H chain CDR3 No.

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Abstract

　本発明は、ヒトＴＩＭ－３発現細胞が関与する疾患に対して、ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合し、抗体依存的細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）などのエフェクター活性が高い抗ヒトＴＩＭ－３抗体を提供する。本発明は、ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合し、かつＡＤＣＣ活性を発揮するモノクローナル抗体又はその抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマ又は該形質転換体を用いる抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする、治療薬及び診断薬を提供することができる。さらに、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と競合する抗ヒトＴＩＭ－３抗体を探索することにより、高ＡＤＣＣ活性を示す抗ヒトＴＩＭ－３抗体に関する。

Description

抗ＴＩＭ－３抗体
　本発明は、Ｔ－ｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ａｎｄ　ｍｕｃｉｎ　ｄｏｍａｉｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ－３（以下、ＴＩＭ－３と記す）の細胞外領域に結合し、かつ抗体依存的細胞傷害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下ＡＤＣＣ活性と記す）を発揮するモノクローナル抗体又はその抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマ又は該形質転換体を用いる抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする、治療薬及び診断薬に関する。
　ＴＩＭ遺伝子ファミリーはマウスでは８つ、ヒトでは３つの遺伝子から構成され、それぞれ１１番染色体と５ｑ３３領域に存在する（非特許文献１）。これらの遺伝子領域は、自己免疫疾患及びアレルギー疾患に関連する。ＴＩＭ蛋白質は構造的に保存されたイムノグロブリン・バリアブル［ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ（ＩｇＶ）］ドメイン及びムチンドメインを有するＩ型膜貫通蛋白質である。
　ＴＩＭ蛋白質は、当初Ｔ細胞上に特異的に発現し、それらの活性を直接的に制御していると考えられてきたが、最近では抗原提示細胞上での発現及び機能も報告されている（非特許文献２）。結晶構造解析により、ＴＩＭ蛋白質は保存された構造をもち、ＩｇＶドメイン内にリガンド結合部位を持つことが知られている。
　ＴＩＭ－３は、Ｔｈ２細胞に発現せずにマウスＴｈ１細胞特異的に発現する分子として同定された（非特許文献３）。ＴＩＭ－３のＤＮＡ配列、アミノ酸配列及び立体構造は、公的データベース上に公開されており、例えばＮＭ＿０３２７８２、ＮＭ＿１３４２５０（ＧｅｎＢａｎｋ）等のアクセッション番号から参照可能である。ＴＩＭ－３は、別名ＨＡＶＣＲ２とも呼ばれている。
　ＴＩＭ－３は、ヒトでも、マウスと同様に、Ｔ細胞に発現しており、マクロファージまたは樹状細胞など、貪食細胞にも発現している。ＴＩＭ－３は、リガンドとなる蛋白質（例えば、ガレクチン－９）との結合により、Ｔｈ１細胞にアポトーシスを誘導するなどのメカニズムでＴｈ１応答を阻害し、例えば、末梢性寛容を誘導する。
　ヒトＴＩＭ－３に対するｓｉＲＮＡによる発現の減弱またはブロッキング抗体による阻害により、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からのインターフェロンγ（ＩＦＮγ）分泌の亢進などが認められており、ＴＩＭ－３がヒトＴ細胞における阻害的な役割をすることを支持している。また、貪食細胞上においては、ＴＩＭ－３はアポトーシス細胞を認識する受容体として機能する。
　臨床検体を用いた解析では、自己免疫疾患患者由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞ではＴＩＭ－３の発現が見られなかった。特に、多発性硬化症患者の脳脊髄液由来のＴ細胞クローンでは、健常人由来のクローンに比べてＴＩＭ－３の発現が低く、ＩＦＮγの分泌が高かった（非特許文献４）。また、ＴＩＭ－３は、アレルギーまたは喘息疾患との関連も示唆されている（特許文献１及び２）。
　さらに、急性骨髄性白血病（以下、ＡＭＬと記す）の造血幹細胞と正常な造血幹細胞とのマイクロアレイ解析から、ＡＭＬ幹細胞上にはＴＩＭ－３が発現しており、血液腫瘍との関連も示されている（非特許文献５及び特許文献３）。
　これまでに確立されている抗ＴＩＭ－３モノクローナル抗体には、抗ヒトＴＩＭ－３ラットモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ　３４４８２３、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、抗ヒトＴＩＭ－３マウスモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ　Ｆ３８－２Ｅ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）などが知られている。
国際公開９６／２７６０３号 国際公開２００３／０６３７９２号 国際公開２００９／０９１５４７号
Ｈａｆｌｅｒ　ＤＡら、Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ．２０５：２６９９－７０１（２００８） Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＡＣら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　３１８：１１４１－３（２００７） Ｍｏｎｎｅｙ　Ｌら、Ｎａｔｕｒｅ　４１５：５３６－４１．（２００２） Ｋｏｇｕｃｈｉ　Ｋら、Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ．２０３：１４１３－８．（２００６） Ｍａｊｅｔｉ　Ｒら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．２００９　Ｍａｒ　３；１０６（９）：３３９６－４０１．
　しかしながら、ＡＤＣＣ活性を有するヒトＴＩＭ－３に対するモノクローナル抗体は知られていない。したがって、本発明は、ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合し、かつＡＤＣＣ活性を発揮するモノクローナル抗体又はその抗体断片を提供することを課題とする。また、本発明は、該モノクローナル抗体又はその抗体断片と競合する抗ヒトＴＩＭ－３抗体を探索することにより、高ＡＤＣＣ活性を有する抗ヒトＴＩＭ－３抗体を提供することを課題とする。
　さらに、本発明は、前記抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマ又は該形質転換体を用いる抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする、治療薬及び診断薬を提供することを課題とする。
　本発明の要旨は以下である。
（１）以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）から選ばれる１の抗体と競合してヒトＴＩＭ－３の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又は該抗体断片。
　（ｉ）相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記す）１～３がそれぞれ配列番号１～３で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と記す）を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号４～６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖（以下、Ｌ鎖と記す）を含む抗体
　（ｉｉ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１１～１３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１４～１６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
　（ｉｉｉ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号２１～２３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号２４～２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（２）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）から選ばれる１の抗体と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である、（１）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（３）以下の（ａ）または（ｂ）の抗体と、競合してヒトＴＩＭ－３の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又は該抗体断片。
　（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含む抗体
　（ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含む抗体
（４）前記（ａ）または（ｂ）の抗体と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である、（３）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（５）遺伝子組換え抗体である、（１）～（４）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（６）ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、（５）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（７）以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）から選ばれる１のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
　（ｉ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１～３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号４～６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片。
　（ｉｉ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１１～１３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１４～１６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片。
　（ｉｉｉ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号２１～２３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号２４～２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片。
（８）以下の（ａ）または（ｂ）であるモノクローナル抗体及び該抗体断片。
　（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体及び該抗体断片。
　（ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体及び該抗体断片。
（９）配列番号５３で表されるヒトＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのアミノ酸配列のうち、６７番から１０５番目のアミノ酸配列、６７番から９６番目のアミノ酸配列または６７番から８７番目のアミノ酸配列に結合するモノクローナル抗体および該抗体断片。
（１０）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（１）～（９）のいずれか１に記載の抗体断片。
（１１）（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（１２）（１１）に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
（１３）（１２）に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（１４）（１３）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
（１５）（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いるヒトＴＩＭ－３の免疫学的検出又は測定方法。
（１６）（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を含むヒトＴＩＭ－３の検出又は測定用試薬。
（１７）（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を含むヒトＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の診断薬。
（１８）（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いてヒトＴＩＭ－３陽性細胞を検出又は測定することを含む、ヒトＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の診断方法。
（１９）（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いてヒトＴＩＭ－３を検出又は測定することを含む、ヒトＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の診断方法。
（２０）ヒトＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の診断薬を製造するための、（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の使用。
（２１）（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を含むヒトＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の治療薬。
（２２）（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いてヒトＴＩＭ－３陽性細胞の細胞死を誘導することを含む、ヒトＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の治療方法。
（２３）ヒトＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の治療薬を製造するための、（１）～（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の使用。
　本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域における特定のアミノ酸配列、またはその立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する。本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片が認識するヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列またはその立体構造は、従来の抗ＴＩＭ－３モノクローナル抗体が認識するアミノ酸配列またはその立体構造と相違しており、このことにより高いＡＤＣＣ活性を発揮することができると考えられる。ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域に特異的に結合し、かつ高いＡＤＣＣ活性を有する本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ヒトＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の治療および診断等に非常に有用である。
　また、本発明は、前記抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマ又は該形質転換体を用いる抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする、治療薬及び診断薬を提供することができる。
図１は、設計した８２１３抗体のＨ鎖可変領域ＨＶ０、ＨＶ３、ＨＶ４、ＨＶ５、ＨＶ６、ＨＶ７、ＨＶ８、ＨＶ１０、ＨＶ１２のアミノ酸配列を示す。 図２は、設計した８２１３抗体のＬ鎖可変領域ＬＶ０、ＬＶ２、ＬＶ４、ＬＶ５、ＬＶ６、ＬＶ７、ＬＶ９のアミノ酸配列を示す。
　本発明におけるヒトＴＩＭ－３としては、配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列を含み、かつヒトＴＩＭ－３の機能を有するポリペプチド、ならびに配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒトＴＩＭ－３の機能を有するポリペプチドなどが挙げられる。
　配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得る方法としては、部位特異的変異導入法　［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９、（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などを用いて、例えば、配列番号５３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。
　欠失、置換又は付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。
　ヒトＴＩＭ－３をコードする遺伝子としては、配列番号５２又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示される塩基配列が挙げられる。配列番号５２又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつヒトＴＩＭ－３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号５２又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒトＴＩＭ－３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、ならびに配列番号５２又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつヒトＴＩＭ－３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども本発明のヒトＴＩＭ－３をコードする遺伝子に包含される。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号５２又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、又はＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。
　具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、又は該配列を有するＰＣＲ産物またはオリゴＤＮＡを固定化したフィルター又はスライドガラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、（１９９５）］を行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルター又はスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
　前記ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号５２又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のＴＩＭ－３をコードする遺伝子に包含される。
　本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０）］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、２５、３３８９（１９９７）、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．、７、６４９（１９９７）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
　デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｏｐｅｎ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｅｘｔｅｎｄ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈ）が－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍａｔｃｈ）が１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ　ｖａｌｕｅ）が１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、－ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）　ｆｏｒ　ｂｌａｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｔｓ］　がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、－Ｘ（Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）が１５及びＺ（ｆｉｎａｌ　Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。
　配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号５２で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。
　また、上記の方法で作製されるポリペプチド又はＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。
　さらに、配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、又は配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明におけるヒトＴＩＭ－３の細胞外領域としては、例えば、配列番号５３で示される該ポリペプチドのアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／ｓｏｓｕｉ＿ｓｕｂｍｉｔ．ｈｔｍｌ）、ＴＭＨＭＭ　ｖｅｒ．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ－２．０／）、ＥｘＰＡＳｙ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／Ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）又はＳＭＡＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）などを用いて予測された領域などが挙げられる。
　本発明におけるヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列としては、ＳＭＡＲＴにおいて予測される細胞外ドメインである、配列番号５３で表されるアミノ酸配列の１番目から２０１番目までが挙げられる。
　本発明におけるヒトＴＩＭ－３の細胞外領域の立体構造としては、配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列を含むヒトＴＩＭ－３の細胞外領域が天然状態でとりうる構造と同等の構造を有していればいずれの構造でもよい。ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域が天然状態でとりうる立体構造とは、細胞膜上に発現しているヒトＴＩＭ－３の天然型の立体構造のことをいう。
　本発明においてヒトＴＩＭ－３の機能としては、リガンドとなる蛋白質（例えば、ガレクチン－９）との結合により、Ｔｈ１細胞にアポトーシスを誘導するなどのメカニズムでＴｈ１応答を阻害し、例えば末梢性寛容を誘導することをいう。また、貪食細胞上においては、受容体としてアポトーシス細胞を認識することをいう。
　本発明のモノクローナル抗体（以下、本発明の抗体ともいう。）又はその抗体断片が、ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合することは、固相サンドイッチ法などを用いたラジオイムノアッセイ、又は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などを用いたヒトＴＩＭ－３を発現した細胞に対する公知の免疫学的検出法、好ましくは蛍光細胞染色法などの特定の抗原を発現した細胞と特定抗原に対する抗体の結合性を調べることができる方法により確認することができる。
　例えば、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いる蛍光抗体染色法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３６、３７３（１９９３）］、フローサイトメトリーを用いる蛍光細胞染色法、又はＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社製）などを用いた表面プラズモン共鳴などの方法が挙げられる。
　また、公知の免疫学的検出法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。
　ヒトＴＩＭ－３を発現した細胞としては、該ＴＩＭ－３を発現していればいずれの細胞でもよく、例えばヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株、又は遺伝子組換え技術により得られた細胞などが挙げられる。
　ヒト体内に天然に存在する細胞としては、例えば、がん、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の患者体内において該ＴＩＭ－３が発現している細胞が挙げられ、具体的には、Ｔｈ１細胞、マクロファージ及び樹状細胞などが挙げられる。
　ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株としては、例えば、前記のがん患者から得られた該ＴＩＭ－３が発現している細胞を株化して得られた細胞株のうち、該ＴＩＭ－３を発現している細胞株が挙げられる。例えば、ヒトから樹立された細胞株である急性骨髄性白血病由来細胞株ＫＧ－１［Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号：ＣＣＬ－２４６］又はバーキットリンパ腫由来細胞株Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－２１３）などが挙げられる。
　遺伝子組換え技術により得られた細胞としては、具体的には、例えば、該ＴＩＭ－３をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを昆虫細胞又は動物細胞などに導入することにより得られる、該ＴＩＭ－３を発現した細胞などが挙げられる。
　また本発明は、ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合し、ＡＤＣＣ活性を発揮するモノクローナル抗体に関する。
　本発明におけるＡＤＣＣ活性とは、細胞表面のヒトＴＩＭ－３に結合した抗体が、Ｆｃ部分を介して主にナチュラルキラー細胞（以下ＮＫ細胞と表記する）表面のＦｃγＲＩＩＩａに結合し、その結果、ＮＫ細胞から放出されるパーフォリンまたはグランザイムなどの細胞傷害性分子によって生じる細胞融解反応である［Ｃｌａｒｋ　Ｍ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７）；Ｇｏｒｔｅｒ　Ａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２０，５７６（１９９９）］。
　本発明の抗体としては、ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造を認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体またはその抗体断片、もしくはヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合し、ＡＤＣＣ活性を有するモノクローナル抗体または抗体断片であればいずれの抗体も包含される。
　本発明の抗体としては、具体的には、配列番号５３で表されるヒトＴＩＭ－３のアミノ酸配列における、１番目～２０１番目のアミノ酸配列からなる細胞外領域のうち、好ましくは６７番目～１０５番目のアミノ酸配列、より好ましくは６７番目～９６番目のアミノ酸配列、さらに好ましくは６７番目～８７番目のアミノ酸配列、から選ばれるいずれかのアミノ酸配列、またはその立体構造に結合する抗体が挙げられる。
　前記抗体として、具体的には、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）のモノクローナル抗体およびその抗体断片が挙げられる。
（ｉ）相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記す）１～３がそれぞれ配列番号１～３で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と記す）を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号４～６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖（以下、Ｌ鎖と記す）を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
（ｉｉ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１１～１３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１４～１６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号２１～２３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号２４～２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
　また、本発明のモノクローナル抗体としてより具体的には、以下の（ａ）および（ｂ）のモノクローナル抗体及びその抗体断片が挙げられる。
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
（ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
　さらに、本発明のモノクローナル抗体としては、前記モノクローナル抗体と競合して、ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体及びその抗体断片、並びに前記モノクローナル抗体が結合するヒトＴＩＭ－３の細胞外領域上に存在するエピトープと、同じエピトープに結合するモノクローナル抗体及びその抗体断片を挙げることができる。
　本発明において、モノクローナル抗体と競合する抗体とは、本発明のモノクローナル抗体と同一または部分的に同一のヒトＴＩＭ－３の細胞外領域にエピトープ（抗原決定基ともいう）を有し、該エピトープに結合する抗体をいう。本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体とは、本発明のモノクローナル抗体が認識するヒトＴＩＭ－３のアミノ酸配列と同じ配列を認識し結合する抗体をいう。
　本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、又は抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
　モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一であることが特徴である。
　エピトープとしては、例えば、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列及び糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
　本発明のモノクローナル抗体は、配列番号５３で表されるヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列のうち、２２番目～１３１番目のアミノ酸配列で表されるヒトＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのアミノ酸配列に結合することが好ましい。具体的には、本発明のモノクローナル抗体が結合するアミノ酸配列は、配列番号５３の６７番目～１０５番目のアミノ酸配列であることが好ましく、６７番目～９６番目のアミノ酸配列であることがより好ましく、６７番目～８７番目のアミノ酸配列であることがさらに好ましい。
　本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープは、配列番号５３で表されるヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列のうち、２２番目～１３１番目のアミノ酸配列で表されるヒトＴＩＭ－３のＩｇＶドメインに含まれることが好ましい。具体的には、本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープは、６７番目～１０５番目のアミノ酸配列の中に含まれることが好ましく、６７番目～９６番目までのアミノ酸配列の中に含まれることがより好ましく、６７番目～８７番目までのアミノ酸配列の中に含まれることがさらに好ましい。
　本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープのアミノ酸配列は、ヒトＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのアミノ酸配列のうち、配列番号５３の６７番目～８７番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を含むことが好ましく、６７番目、７４番目、７６番目、７８番目、７９番目、８１番目、８３番目および８５番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を含むことがより好ましい。
　また、本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープのアミノ酸配列は、ヒトＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのアミノ酸配列のうち、配列番号５３の６７番目～８７番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも連続した２以上のアミノ酸を含むことが好ましく、６７番目、７４番目、７６番目、７８番目、７９番目、８１番目、８３番目および８５番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を含み、かつ配列番号５３の６７番目～８７番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも連続した２以上のアミノ酸を含むことがより好ましい。
　具体的には、本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープのアミノ酸配列としては、配列番号５３の６７番目～７４番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、６７番目～７６番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、６７番目～７８番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、６７番目～７９番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、６７番目～８１番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、６７番目～８３番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、６７番目～８５番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
７４番目～７６番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７４番目～７８番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７４番目～７９番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７４番目～８１番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７４番目～８３番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７４番目～８５番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
７６番目～７８番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７６番目～７９番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７６番目～８１番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７６番目～８３番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７６番目～８５番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
７８番目～７９番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７８番目～８１番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７８番目～８３番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７８番目～８５番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
７９番目～８１番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７９番目～８３番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７９番目～８５番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
８１番目～８３番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、８１番目～８５番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、または、
８３番目～８５番のアミノ酸を含むアミノ酸配列、などが挙げられる。
　ハイブリドーマは、例えば、上記のヒトＴＩＭ－３を発現した細胞などを抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体生産細胞を誘導し、さらに、該抗体生産細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより、調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、または該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水がん化させ、該培養液又は腹水を分離、精製することにより抗ＴＩＭ－３モノクローナル抗体を取得することができる。
　抗原を免疫する動物としては、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ニワトリ又はラビットなどが用いられる。また、このような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にｉｎ　ｖｉｔｒｏで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して作製したハイブリドーマが生産する抗体なども本発明の抗体に包含される。
　本発明において遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、ヒト抗体又は抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。遺伝子組換え抗体は、例えば上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用いて改変したものが挙げられる。
　ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬとヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと記す）及び軽鎖定常領域（以下、ＣＬと記す）とからなる抗体をいう。本発明のヒト型キメラ抗体は、ヒトＴＩＭ－３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、ＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
　本発明のヒト型キメラ抗体として具体的には、配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつが配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むキメラ抗体が挙げられる。
　さらに、本発明のキメラ抗体としては、本発明のモノクローナル抗体と競合して、ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するキメラ抗体及び上述のキメラ抗体が結合するヒトＴＩＭ－３の細胞外領域上に存在するエピトープと、同じエピトープに結合するキメラ抗体を挙げることができる。
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト化抗体という場合もあり、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒトＴＩＭ－３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するヒト以外の動物のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生されるヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３又はｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
　本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体としては、具体的には、ＣＤＲ１～３が配列番号２１～２３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつＣＤＲ１～３が配列番号２４～２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むヒト化抗体が挙げられる。
　本発明のヒト化抗体として、具体的には、以下の（ａ）ＶＨおよび（ｂ）ＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列、または配列番号６７のアミノ酸配列の１２番目のＬｙｓ、２０番目のＶａｌ、３８番目のＡｒｇ、４０番目のＡｌａ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、９８番目のＡｒｇ、および１１３番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＨ
（ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列、または配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕ、１３番目のＡｌａ、１５番目のＶａｌ、３６番目のＴｙｒ、４３番目のＡｌａ、４４番目のＰｒｏ、４６番目のＬｅｕ、７１番目のＰｈｅ、および８５番目のＴｈｒから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＬ
　更に、本発明のヒト化抗体に含まれるＶＨとしては、以下の（１）～（８）が好ましい。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓ、２０番目のＶａｌ、３８番目のＡｒｇ、４０番目のＡｌａ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、９８番目のＡｒｇ、および１１３番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓ、３８番目のＡｒｇ、４０番目のＡｌａ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、および９８番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌ、３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７２番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇ、および１１３番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇ、４０番目のＡｌａ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、および９８番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、および９８番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇ、４０番目のＡｌａ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、および９８番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、および７４番目のＴｈｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、および９８番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
　前記ＶＨのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号６７のアミノ酸配列中の、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、または１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
　１２個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、配列番号６７のアミノ酸配列中の、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列が挙げられる。
　１１個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（１２）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
　１０個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（８）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
　８個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（１３）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
　７個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（１１）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
　６個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（１６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
　５個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（７）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
　４個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（８）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７４番目のＴｈｒをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７２番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
　３個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（９）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７２番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７４番目のＴｈｒをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
　２個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（２１）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、および３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、および３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および４０番目のＡｌａをＡｒｇに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７２番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７４番目のＴｈｒをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号６７のアミノ酸配列中の４０番目のＡｌａをＡｒｇに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（１７）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１８）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７２番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１９）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７４番目のＴｈｒをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（２０）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２１）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
　１個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（１２）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の４０番目のＡｌａをＡｒｇに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６７のアミノ酸配列中の７２番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６７のアミノ酸配列中の７４番目のＴｈｒをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号６７のアミノ酸配列中の９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
　また、本発明のヒト化抗体に含まれるＶＬとしては、以下の（１）～（６）が好ましい。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕ、１３番目のＡｌａ、１５番目のＶａｌ、３６番目のＴｙｒ、４３番目のＡｌａ、４４番目のＰｒｏ、４６番目のＬｅｕ、７１番目のＰｈｅ、および８５番目のＴｈｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３６番目のＴｙｒ、４４番目のＰｒｏ、４６番目のＬｅｕ、７１番目のＰｈｅ、および８５番目のＴｈｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌ、３６番目のＴｙｒ、４４番目のＰｒｏ、４６番目のＬｅｕ、７１番目のＰｈｅ、および８５番目のＴｈｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒ、４３番目のＡｌａ、４４番目のＰｒｏ、４６番目のＬｅｕ、および８５番目のＴｈｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌ、３６番目のＴｙｒ、４６番目のＬｅｕ、および７１番目のＰｈｅが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒ、および４４番目のＰｒｏが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
　前記ＶＬのアミノ酸配列としては、配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
　９個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列が挙げられる。
　８個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（９）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
　７個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（９）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
　６個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
　５個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（７）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および４６番目のＬｅｕをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
　４個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（１０）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および４６番目のＬｅｕをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
　３個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（７）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１３番目のＡｌａをＶａｌに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および４６番目のＬｅｕをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
　２個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（１５）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、および３６番目のＴｙｒをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１３番目のＡｌａをＶａｌに、および３６番目のＴｙｒをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、および３６番目のＴｙｒをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および４３番目のＡｌａをＳｅｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および４６番目のＬｅｕをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６９のアミノ酸配列中の１３番目のＡｌａをＶａｌに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号６９のアミノ酸配列中の４３番目のＡｌａをＳｅｒに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号６９のアミノ酸配列中の４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および４６番目のＬｅｕをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号６９のアミノ酸配列中の４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号６９のアミノ酸配列中の４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
　１個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（９）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１３番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の４３番目のＡｌａをＳｅｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６９のアミノ酸配列中の４６番目のＬｅｕをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６９のアミノ酸配列中の７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６９のアミノ酸配列中の８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
　また、本発明のヒト化抗体の具体例としては、抗体のＶＨが配列番号６７および／または抗体のＶＬが配列番号６９のアミノ酸配列を含むヒト化抗体、抗体のＶＨが配列番号６７および／または抗体のＶＬが図２で示されるいずれかのアミノ酸配列を含むヒト化抗体、または、抗体のＶＨが図１で示されるいずれかのアミノ酸配列および／または抗体のＶＬが配列番号６９のアミノ酸配列を含むヒト化抗体などが挙げられる。
　さらに、本発明のヒト化抗体としては、本発明のモノクローナル抗体と競合して、ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するヒト化抗体及び上述のヒト化抗体が結合するヒトＴＩＭ－３の細胞外領域上に存在するエピトープと、同じエピトープに結合するヒト化抗体を挙げることができる。
　ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリー及びヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
　ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
　ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖及び２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
　ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法を用い、ヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることにより作製できる。
　上述の抗体又は抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、付加、置換又は挿入され、かつ上述の抗体又はその抗体断片と同様な活性を有するモノクローナル抗体又はその抗体断片も、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片に包含される。
　欠失、置換、挿入及び／又は付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３、４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などの周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数である。例えば、好ましくは１～数十個、より好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～１０個、特に好ましくは１～５個である。
　上記の抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、次のことを示す。即ち、同一配列中の任意、かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中において、１又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入又は付加があることを意味する。また、欠失、置換、挿入又は付加が同時に生じる場合もあり、置換、挿入又は付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。
　天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、又はＬ－システインなどが挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
　Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
　Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
　Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
　Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２、４－ジアミノブタン酸、２、３－ジアミノプロピオン酸
　Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
　Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　本発明において、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
　Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素であるパパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　本発明のＦａｂは、ヒトＴＩＭ－３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体をパパインで処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することもできる。
　Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を蛋白質分解酵素であるペプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有する断片である。
　本発明のＦ（ａｂ’）２は、ヒトＴＩＭ－３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体をペプシンで処理して得ることができる。また、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合させ、作製することもできる。
　Ｆａｂ’は、前記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、本発明のヒトＴＩＭ－３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することもできる。
　ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ－Ｐ－ＶＬないしはＶＬ－Ｐ－ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
　本発明のｓｃＦｖは、本発明のヒトＴＩＭ－３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
　本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明のヒトＴＩＭ－３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は既知の方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
　本発明のｄｓＦｖは、本発明のヒトＴＩＭ－３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
　本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のヒトＴＩＭ－３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明のモノクローナル抗体には、本発明のヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質、又は抗体医薬などを化学的または遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
　本発明における、抗体の誘導体は、本発明のヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片のＨ鎖またはＬ鎖のＮ末端側またはＣ末端側、抗体又はその抗体断片中の適当な置換基または側鎖、さらにはモノクローナル抗体又はその抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、免疫賦活剤、蛋白質又は抗体医薬などを化学的手法［抗体工学入門、地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。
　また、本発明のヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又は抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質又は抗体医薬をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。
　放射性同位元素としては、例えば、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕ、又は２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
　低分子の薬剤としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤若しくはキナーゼ阻害剤などの抗がん剤［臨床腫瘍学、癌と化学療法社（１９９６）］、又はハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン若しくはクレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社（１９８２）］などが挙げられる。
　抗がん剤としては、例えば、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５－フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０－ヒドロキシ－７－エチル－カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、ＦＭＳ－ｌｉｋｅ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　３（Ｆｌｔ３）阻害剤、Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、イレッサ、タルセバなどのｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤、ラディシコール、１７－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール－トランスレチノイン酸、サリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ－ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（ターグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、カリケアマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、イファスファミド、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミン、メトトレキセート、マイタンシノイド、又はその誘導体、などが挙げられる。
　低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、又は水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。
　高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、又はヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。これらの高分子化合物を抗体又は抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的または生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失又は抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのe－アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１－１７８９２６号公報）、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６－２３５８７号公報）、又はアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２－１１７９２０号公報）などが挙げられる。
　免疫賦活剤としては、例えば、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β（１→３）グルカン（レンチナン、シゾフィラン）、又はαガラクトシルセラミドなどが挙げられる。
　蛋白質としては、例えば、ＮＫ細胞、マクロファージ、又は好中球などの免疫担当細胞を活性化するサイトカイン若しくは増殖因子、又は毒素蛋白質などが挙げられる。
　サイトカインまたは増殖因子としては、例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、又はマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）などが挙げられる。
　毒素蛋白質としては、例えば、リシン、ジフテリアトキシン、又はＯＮＴＡＫなどが挙げられ、毒性を調節するために蛋白質に変異を導入した蛋白毒素も含まれる。
　抗体医薬としては、例えば、抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原、腫瘍の病態形成に関わる抗原又は免疫機能を調節する抗原、病変部位の血管新生に関与する抗原に対する抗体が挙げられる。
　抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原としては、例えば、Ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（以下、ＣＤと記載する）１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）－Ｃｌａｓｓ　ＩＩ、又はＥｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）などが挙げられる。
　腫瘍の病態形成に関わる抗原又は免疫機能を調節する抗体の抗原としては、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｂ７ファミリー分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７４、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、又はＢ７－Ｈ４）、Ｂ７ファミリー分子のリガンド（ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、又はＢＴＬＡ）、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０リガンド、ＣＤ１３７、ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）受容体ファミリー分子（ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１、又はＴＮＦＲ２）、ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｌｉｇａｎｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲＡＩＬ）ファミリー分子、ＴＲＡＩＬファミリー分子の受容体ファミリー（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、又はＴＲＡＩＬ－Ｒ４）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ｋａｐｐａ　Ｂ（ＲＡＮＫ）、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ－２５、葉酸受容体４、サイトカイン［ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）β、又はＴＮＦαなど］、これらのサイトカインの受容体、ケモカイン（ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｉ－３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、又はＣＴＡＣＫなど）、又はこれらのケモカインの受容体が挙げられる。
　病変部位の血管新生を阻害する抗体の抗原としては、例えば、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）、ＥＧＦ、ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）、ＴＧＦβ、ＩＬ－８、Ｅｐｈｉｌｉｎ、ＳＤＦ－１、又はこれらの受容体などが挙げられる。
　蛋白質又は抗体医薬との融合抗体は、モノクローナル抗体又は抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物または真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
　上記抗体の誘導体を検出方法、定量方法、検出用試薬、定量用試薬又は診断薬として使用する場合に、本発明のヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片に結合する薬剤としては、通常の免疫学的検出又は測定法で用いられる標識体が挙げられる。
　標識体としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ若しくはルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル若しくはロフィンなどの発光物質、又はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。
　また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分として含有するＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の治療薬に関する。
　ＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患としては、ＴＩＭ－３が発現している細胞が関与する疾患であればいかなるものでもよく、例えば、がん、自己免疫疾患、アレルギー性疾患が挙げられる。
　がんとしては、例えば、血液がん、乳癌、子宮癌、大腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立腺癌又は膵臓癌などが挙げられ、好ましくは血液がん、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌又は前立腺癌が挙げられる。
　血液がんとしては、例えば、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅｓ、ＭＤＳ）、多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｙｅｌｏｍａ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞性リンパ腫（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＰＴＣＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ　ｌａｒｇｅ　ｃｅｌｌ　ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＡＬＣＬ）、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ　ｌｙｍｐａｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ　ｌｙｍｐａｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＬＬ）、その他リンパ性白血病、ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、又は、バーキットリンパ腫をはじめとする非ホジキンリンパ腫などが挙げられる。
　自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチ、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、肝炎、心筋炎、シェーグレン症候群、移植後拒絶反応自己免疫性溶血性貧血、水疱性類天疱瘡、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、天疱瘡および悪性貧血などが挙げられる。
　アレルギー性疾患としては、例えば、急性又は慢性気道過敏症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、ＰＩＥ症候群、食物アレルギー、花粉症、アレルギー性鼻、気管支喘息、アトピー性皮膚炎およびアナフィラキシーショックなどが挙げられる。
　本発明の治療剤としては、上述した本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する。
　本発明の抗体又は該抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
　投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられ、好ましくは静脈内投与を挙げられる。
　投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。
　投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、及び体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇである。
　さらに、本発明は、ＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分として含有する、ＴＩＭ－３の免疫学的検出又は測定方法、ＴＩＭ－３の免疫学的検出用又は測定用試薬、ＴＩＭ－３が発現する細胞の免疫学的検出又は測定方法、及びＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の診断薬に関する。
　本発明においてＴＩＭ－３の量を検出又は測定する方法としては、任意の公知の方法が挙げられる。例えば、免疫学的検出又は測定方法などが挙げられる。
　免疫学的検出又は測定方法とは、標識を施した抗原又は抗体を用いて、抗体量又は抗原量を検出又は測定する方法である。免疫学的検出又は測定方法としては、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット法又は物理化学的手法などが挙げられる。
　本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いてＴＩＭ－３が発現した細胞を検出又は測定することにより、ＴＩＭ－３が関連する疾患を診断することができる。
　該ポリペプチドが発現している細胞の検出には、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織染色法、又は免疫組織染色法などが、好ましく用いられる。また、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などの蛍光抗体染色法なども用いることができる。
　本発明においてＴＩＭ－３を検出又は測定する対象となる生体試料としては、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液、又は培養液など、ＴＩＭ－３が発現した細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
　本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、抗原抗体反応を行うための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行うための試薬としては、例えば、緩衝剤、塩などが挙げられる。検出用試薬としては、例えば、該モノクローナル抗体若しくはその抗体断片、又はこれらの誘導体を認識する標識された二次抗体、又は標識に対応した基質などの通常の免疫学的検出又は測定法に用いられる試薬が挙げられる。
　以下に、本発明の抗体の製造方法、疾患の治療方法、及び疾患の診断方法について、具体的に説明する。
１．モノクローナル抗体の製造方法
（１）抗原の調製
　抗原となるＴＩＭ－３又はＴＩＭ－３を発現させた細胞は、ＴＩＭ－３全長又はその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ＴＩＭ－３を多量に発現している各種ヒト腫瘍培養細胞、ヒト組織などからＴＩＭ－３を精製し、得ることが出来る。また、該腫瘍培養細胞、又は該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＴＩＭ－３の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
　本発明で用いられるＴＩＭ－３は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ＴＩＭ－３をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
　まず、ＴＩＭ－３をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製又は染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
　宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
　大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ＴＩＭ－３をコードする部分を含むＤＮＡ、及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
　該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
　また、該ＴＩＭ－３をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＴＩＭ－３の生産率を向上させることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８、６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５３、２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－４００）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ６７９８）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２、２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、又はｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。
　プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、又はＴ７プロモーターなどの、大腸菌またはファージなどに由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、又はｌｅｔ　Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
　宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ－１Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、又は大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９、２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ、１７、１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６８、１１１（１９７９）］　が挙げられる。
　動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡ　Ｉ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３－２２９７９号公報；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ、３２９、８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡ　Ｉ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０１、１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、又はｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）などが挙げられる。
　プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、又はモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
　宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０８、９４５（１９５８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６０、１２７５（１９６８）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５５、５１３（１９６８）；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ、４１、１２９（１９７３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８、１１５（１９９６）；Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１４８、２６０（１９９７）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６０、１２７５（１９６８）；Ｃｅｌｌ、６、１２１（１９７５）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａｐｐｅｎｄｉｘ　Ｉ、ＩＩ（ｐｐ．８８３－９００））、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、Ｐｒｏ－３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫ又はＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３－０００２９９号公報）、などが挙げられる。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、又はリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７４１３（１９８７）］などが挙げられる。
　以上のようにして得られるＴＩＭ－３をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、又は動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ＴＩＭ－３を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ＴＩＭ－３を製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖または糖鎖が付加されたＴＩＭ－３を得ることができる。
　誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
　動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９、５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２２、５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８、３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、７３、１（１９５０）］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、又はこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１～７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシンまたはペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
　ＴＩＭ－３をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産又は融合蛋白質発現などの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］を用いることができる。
　ＴＩＭ－３の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、又は宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞、または生産させるＴＩＭ－３の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
　ＴＩＭ－３が宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４、１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐ．、４、１２８８（１９９０）］、日本国特開平０５－３３６９６３号公報、又は国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ＴＩＭ－３を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
　また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２－２２７０７５号公報）を利用してＴＩＭ－３の生産量を上昇させることもできる。
　得られたＴＩＭ－３は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。
　ＴＩＭ－３が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、又はダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
　前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、又は等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独または組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
　ＴＩＭ－３が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ＴＩＭ－３の不溶体を回収する。回収した該ＴＩＭ－３の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該ＴＩＭ－３を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
　ＴＩＭ－３又はその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＴＩＭ－３又はその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
　また、本発明において用いられるＴＩＭ－３は、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル－ベガ社製、パーセプチブ社製、又は島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
　３～２０週令のマウス、ラット又はハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ＴＩＭ－３ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
　免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、又は水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、又はＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
　抗原の投与は、１回目の投与の後、１～２週間おきに５～１０回行う。各投与後３～７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。
　抗原の最終投与後３～７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。
（３）骨髄腫細胞の調製
　骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８－アザグアニン耐性マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８、１（１９７８）］、Ｐ３－ＮＳ１／１Ａｇ４１（ＮＳ－１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６、５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ－２）［Ｎａｔｕｒｅ、２７６、２６９（１９７８）］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２３、１５４８（１９７９）］、又はＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５）］などが用いられる。
　該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２－メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、及び８－アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３～４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
　（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地又はＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５～１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
　沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）、ＭＥＭ培地及びジメチルスルホキシドの混液を３７℃で、攪拌しながら加える。さらに１～２分間毎にＭＥＭ培地１～２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、及びアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７～１４日間培養する。
　培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のバインディングアッセイなどのハイブリドーマの選択方法により、ＴＩＭ－３を含む抗原に反応し、ＴＩＭ－３を含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目はＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
（５）精製モノクローナル抗体の調製
　プリスタン処理［２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８～１０週令のマウス又はヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０～２１日でハイブリドーマは腹水がん化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０～５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＡ－カラムまたはゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
　また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地に懸濁し、３～７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ－カラム又はプロテインＧ－カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。
　抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法又は２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
（６）モノクローナル抗体の選択
　モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイ、及びＢｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析により行う。
（６－ａ）バインディングアッセイ
　抗原としては、（１）で得られるＴＩＭ－３をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞などに導入して得られた遺伝子導入細胞、リコンビナント蛋白質、又はヒト組織から得た精製ポリペプチドまたは部分ペプチドなどを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ又はＫＬＨなどのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製して、これを用いる。
　抗原を９６ウェルプレートなどのプレートに分注し、固相化した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。ＰＢＳ又はＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎなどで、よく洗浄した後、第２抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質又は放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、第２抗体の標識物質に応じた反応を行ない、免疫原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
　また、本発明の抗ＴＩＭ－３モノクローナル抗体と競合してＴＩＭ－３に結合するモノクローナル抗体は、上述のバインディングアッセイ系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被検抗体を加えた時にモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造への結合について、取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。
　さらに、本発明のＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体が認識するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体は、上述のバインティングアッセイ系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、又はエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。
（６－ｂ）Ｂｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析
　Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００を用い、抗原と被験物の間の結合におけるｋｉｎｅｔｉｃｓを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウエアで解析をする。抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を流し、適当量結合させ、さらに濃度既知の複数濃度の抗原を流し、結合、解離を測定する。
　得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、１：１バインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。又は、ヒトＴＩＭ－３をセンサーチップ上に、例えばアミンカップリング法により固定した後、濃度既知の複数濃度の精製モノクローナル抗体を流し、結合、解離を測定する。得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、バイバレントバインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。
２．遺伝子組換え抗体の作製
　遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製方法を示す。
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
　ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨ及びκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。
　動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３、１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ、２７、２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８、１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ｂｄ２－４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４、１７３（１９９０）］、又はｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１－３［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１３、７９（１９９３）］などを用いる。
　動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１４９、９６０（１９８７）］、又は免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ、４１、４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ、３３、７１７（１９８３）］などを用いる。
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６７、２７１（１９９４）］を用いるが、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号公報）、ｐＥＥ１８［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１７、５５９（１９９８）］などを用いる。
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析
　非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ又はプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。
　前記ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分又はＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ又は組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ又は組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨまたはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨ又はＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、又はラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
　ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４、３（１９８７）］、又はＲＮＡ　ｅａｓｙ　ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。
　全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］、又はＯｌｉｇｏ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、又はＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。
　ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）］、又はＳｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）、またはＺＡＰ－ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ　ＥｘＰｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５、５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７、９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ、４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ　ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘ　Ｃｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３－１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３、２８０（１９８３）］、又はｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ、３３、１０３（１９８５）］などを用いる。
　ファージ又はプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ－１Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５、８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３９、４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２、７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６、１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６、１１８（１９６６）］、又はＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ、３８、２７５（１９８５）］などを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープまたは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、又はプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］などを用いる。
　また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）］を行うことよりＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
　選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３（１９７７）］などの反応を行った後、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社製）又はＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。
　決定した塩基配列からＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。
　分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨ及びＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。
　また、得られたＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ又はＰＩＲ－Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０）］などの相同性検索を行い、ＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
　（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
　非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを作製する。
　作製されたＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。
　また、非ヒト抗体ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。
　非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。
　例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、又はヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。
　次に、選択したヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
　設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＨ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計する。
　また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターに容易にヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。
　又は、設計したＤＮＡ配列に基づき、１本のＤＮＡとして合成された各Ｈ鎖、Ｌ鎖全長合成ＤＮＡを用いることで実施できる。
　ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、９、２６６（１９９１）］。
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、及び抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
　抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１２、５３５（１９７７）］又はコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、１５０１（１９９４）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築及び解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有する改変ヒト型ＣＤＲ移植抗体を取得できる。
　ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
　（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
　例えば、（４）及び（５）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
　（３）及び（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、又はそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト型ＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
　発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６５１）を用いる［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、２８３（１９９１）］。
　ＣＯＳ－７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ－デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、（１９９１）］、又はリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７４１３（１９８７）］などを用いる。
　発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。
（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
　（３）及び（６）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平２－２５７８９１号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］などを用いる。
　遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２、５５（１９８６）］、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。
　また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースの合成に関与する酵素などの蛋白質またはＮ－グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などの蛋白質、又は細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質などの活性が低下又は欠失した宿主細胞、例えばα１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）などを用いることもできる。
　発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２－２５７８９１号公報）。
　動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、又はこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。
　得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、形質転換株は、ＤＨＦＲ増幅系（日本国特開平２－２５７８９１号公報）などを利用して遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
　遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ－カラムを用いて精製する［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。
　精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０（１９７０）］、又はウェスタンブロッティング法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］など用いて測定することができる。
３．精製モノクローナル抗体又はその抗体断片の活性評価
　精製した本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
　ＴＩＭ－３発現細胞株に対する結合活性は、前述の１－（６ａ）記載のバインディングアッセイ及び（６ｂ）記載のＢｉａｃｏｒｅシステムなどを用いた表面プラズモン共鳴法を用いて測定する。また、蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３６、３７３（１９９３）］などを用いて測定できる。
　抗原陽性培養細胞株に対する補体依存性傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と記す）、又はＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３６、３７３（１９９３）］により測定する。
４．抗体のエフェクター活性を制御する方法
　本発明の抗ＴＩＭ－３モノクローナル抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体のＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）、または抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。本発明の抗ＴＩＭ－３モノクローナル抗体にはいずれの方法を用いても、エフェクター活性を制御することができる。
　エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、またはマクロファージ若しくは樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、ＡＤＰ活性）などが知られている。
　抗体のＦｃのＮ結合複合型糖鎖のコアフコースの含量を制御することで、抗体のエフェクター活性を増加又は低下させることができる。抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法としては、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現することで、フコースが結合していない抗体を取得することができる。フコースが結合していない抗体は高いＡＤＣＣ活性を有する。
　一方、抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法としては、α１，６－フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、フコースが結合している抗体を取得できる。フコースが結合している抗体は、フコースが結合していない抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を有する。
　また、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を増加又は低下させることができる。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書または米国特許第７，３１７，０９１号明細書に記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を、増加させることも低下させることもできる。
　さらに、上述の方法を組み合わせて、一つの抗体に使用することにより、抗体のエフェクター活性が制御された抗体を取得することができる。
５．本発明の抗ＴＩＭ－３モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いた疾患の治療方法
　本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の治療に用いることができる。
　本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
　投与経路としては、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。
　経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などでが挙げられる。
　乳剤又はシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、又はストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。
　カプセル剤、錠剤、散剤又は顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤又はグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。
　非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤又は噴霧剤などが挙げられる。
　注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、又はその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。
　座剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸などの担体を用いて製造する。
　噴霧剤は受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖又はグリセリンなどを用いる。また、エアロゾル又はドライパウダーとして製造することもできる。
　さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
６．本発明の抗ＴＩＭ－３モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いた疾患の診断方法
　本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いて、ＴＩＭ－３又はＴＩＭ－３が発現した細胞を検出又は測定することにより、ＴＩＭ－３が関連する疾患を診断することができる。
　ＴＩＭ－３が関連する疾患の一つであるがんの診断は、例えば、以下のようにＴＩＭ－３の検出又は測定して行うことができる。
　患者体内のがん細胞に発現しているＴＩＭ－３をフローサイトメーターなどの免疫学的手法を用いて検出することにより診断を行うことができる。
　免疫学的手法とは、標識を施した抗原又は抗体を用いて、抗体量又は抗原量を検出又は測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウェスタンブロット法又は物理化学的手法などを用いる。
　放射性物質標識免疫抗体法は、例えば、抗原又は抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体又は該抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体又は結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する。
　酵素免疫測定法は、例えば、抗原又は抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体又は該抗体断片を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体又は結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する。例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法などを用いる。
　酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知［酵素免疫測定法、医学書院（１９８７）］の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、又はビオチン標識などを用いる。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出又は測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。該ＥＬＩＳＡ法では、検出又は測定したい抗原を認識する抗体又は抗体断片であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体又は抗体断片を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、次に第２の抗体又は抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、又はビオチンなどで標識しておく。
　上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞又はその破砕液、組織又はその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、又は眼液などを反応させた後、標識したモノクローナル抗体又は抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体又は抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体又は抗体断片との組み合わせでもよい。
　蛍光免疫測定法は、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、例えば、公知［蛍光抗体法、ソフトサイエンス社（１９８３）］の蛍光標識が挙げられる。例えば、ＦＩＴＣ、又はＲＩＴＣなどが挙げられる。
　発光免疫測定法は文献［生物発光と化学発光　臨床検査４２、廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、例えば、公知の発光体標識が挙げられ、アクリジニウムエステル、ロフィンなどが挙げられる。
　ウェスタンブロット法は、抗原又は抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）－ＰＡＧＥ［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜又はニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体又は抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、又はビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体又は結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。一例を以下に示す。
　配列番号５３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞または組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりの蛋白量として０．１～３０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により泳動する。泳動された蛋白質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１～１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳと表記する）に室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。
　ここで本発明のモノクローナル抗体を反応させ、０．０５～０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳと表記する）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いてモノクローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、配列番号５３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出する。ウェスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。
　物理化学的手法は、例えば、抗原であるＴＩＭ－３と本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的手法として、例えば、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法またはラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要、金原出版（１９９８）］などが挙げられる。
　ラテックス免疫比濁法は、抗体又は抗原を感作させた粒径０．１～１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原または抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度または積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。
　一方、ＴＩＭ－３が発現している細胞の検出又は測定は、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、例えば、好ましくは免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法又は蛍光抗体染色法などが挙げられる。
　免疫沈降法は、ＴＩＭ－３を発現した細胞などを本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と反応させた後、プロテインＧ－セファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる。又は以下のような方法によっても行なうことができる。ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに上述した本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を固相化した後、ＢＳＡ－ＰＢＳによりブロッキングする。
　抗体が、例えばハイブリドーマ培養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスイムノグロブリン、抗ラットイムノグロブリン、プロテイン－Ａ又はプロテインＧなどをあらかじめＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに固相化し、ＢＳＡ－ＰＢＳでブロッキングした後、ハイブリドーマ培養上清を分注して結合させる。次に、ＢＳＡ－ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、ＴＩＭ－３を発現している細胞または組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッティングにより検出する。
　免疫細胞染色法又は免疫組織染色法は、抗原を発現した細胞又は組織などを、場合によっては抗体の通過性を良くするため界面活性剤またはメタノールなどで処理した後、本発明のモノクローナル抗体と反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識又はビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体又はその結合断片と反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡する方法である。
　また、蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フローサイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］により検出を行うことができる。
　特に、ＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合する、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、蛍光抗体染色法により天然型の立体構造を保持して発現している細胞の検出ができる。
　また、蛍光抗体染色法のうち、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いた場合には、形成された抗体－抗原複合体と、抗体－抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体又は抗原とを分離することなく、抗原量又は抗体量を測定できる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（ヒトＴＩＭ－３　ｃＤＮＡの分子クローニングと安定発現株作製）
　ヒトＴＩＭ－３のｃＤＮＡはＨｕｍａｎ　ＭＴＣ　Ｐａｎｅｌ（クローンテック社製）を鋳型にＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲ法により増幅した。プライマーは、ＴＩＭ－３　Ｆｗ２（配列番号３１）及びＴＩＭ－３　Ｒｅ２（配列番号３２）を用いた。得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へ挿入し、ＴＯＰ１０　Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ（インビトロジェン社製）に形質転換し増幅させた後、ミニプレップ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。
　精製したプラスミドＤＮＡについて、プライマーＴＩＭ－３　Ｆｗ２及びＴＩＭ－３　Ｒｅ２を用いたＤＮＡ配列解析を行い、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２のコーディングリージョンと同一の塩基配列を有するクローンを選定した。選定したクローンのインサートをｐＭＣｓ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰベクター（ＣＥＬＬ　ＢＩＯＬＡＢＳ社製）へ組換え（ｈＴＩＭ－３／ｐＭＣｓ－ＩＧ）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ａｍｐｈｏ（タカラバイオ社製）を用い、ヒトＴＩＭ－３レトロウイルスを調製した。
　このヒトＴＩＭ－３レトロウイルスを、あらかじめフローサイトメトリー解析で内在的にＴＩＭ－３が発現していないことを確認したＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ－２０６３）、ＥｏＬ－１細胞（ＲＩＫＥＮ　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫ番号：ＲＣＢ０６４１）及びＬ９２９細胞（シグマアルドリッチ社製）へそれぞれ感染させた。数回の継代の後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にてＴＩＭ－３陽性細胞を採取した。さらに数回の継代の後、再度ＦＡＣＳＡｒｉａにてＴＩＭ－３陽性細胞を採取することによって、ヒトＴＩＭ－３安定発現細胞株を作製した。
［実施例２］
（可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３ヒトＦｃ融合蛋白質発現ベクターの調製）
　ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを実施例１で構築したｈＴＩＭ－３／ｐＭＣｓ－ＩＧを鋳型にＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲ法で増幅した。プライマーはｐＭＣｓ－Ｆｗ（配列番号３３）及びＴＩＭ３ＥＤ－ＦｃＲｅＸｂａ（配列番号３４）を用いた。
　得られたＰＣＲ産物をｐＴｒａｃｅｒ－ＣＭＶ－ＦＬＡＧ－ｈｕｍａｎＦｃベクター［ｐＴｒａｃｅｒ－ＣＭＶ（インビトロジェン社製）のＸｂａ　Ｉ部位とＡｐａ　Ｉ部位にＦＬＡＧ及びヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を導入した改変ベクター］に挿入し、ＴＯＰ１０　Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ（インビトロジェン社製）に形質転換し増幅させた後、ミニプレップ法によりプラスミドＤＮＡ（ｓＴＩＭ－３－ＦＬＡＧ－Ｆｃ／ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ）を抽出した。
　精製したｓＴＩＭ－３－ＦＬＡＧ－Ｆｃ／ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶは、Ｔ７（配列番号３５）及びｈＴＩＭ－３　Ｆｗ１（配列番号３６）をプライマーとしたＤＮＡ配列解析により、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２の当該領域と同一の塩基配列を有することを確認した。インサート（ＥｃｏＲＩ認識部位の後ろからＡｐａＩ認識部位直前まで）の配列は配列番号３７のとおりであった。
［実施例３］
（可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３発現ベクターの調製）
　ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを実施例２で構築したｓＴＩＭ－３－ＦＬＡＧ－Ｆｃ／ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶを鋳型にＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲ法で増幅した。プライマーはＴＩＭ－３　Ｆｗ２（配列番号３１）及びＴＩＭ３ＥＤ－ＦＬＡＧ４ａａ（配列番号３９）を用いた。
　次に、得られたＰＣＲ産物を鋳型に、ＴＩＭ－３　Ｆｗ２（配列番号３１）及びＣ－ＦＬＡＧ－ＮｏｔＲ２（配列番号４０）をプライマーとしたＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）によるＰＣＲ法によりＦＬＡＧ　ｅｐｉｔｏｐｅを連結した。得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、ＴＯＰ１０　Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ（インビトロジェン社製）に形質転換し増幅させた後、ミニプレップ法によりプラスミドＤＮＡ（ｓＴＩＭ－３－ＦＬＡＧ／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ）を抽出した。
　精製したｓＴＩＭ－３－ＦＬＡＧ／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣは、Ｔ７（配列番号３５）及びＢＧＨ－Ｒ（配列番号４１）をプライマーとしたＤＮＡ配列解析により、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２の当該領域と同一の塩基配列を有することを確認した。インサート（Ｎｏｔ　Ｉ認識部位の後ろからＮｏｔ　Ｉ認識部位直前まで）の配列は配列番号４２のとおりであった。
［実施例４］
（可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３ヒトＦｃ融合蛋白質及び可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３の調製）
　実施例２及び実施例３で得られたｓＴＩＭ－３－ＦＬＡＧ－Ｆｃ／ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶプラスミドＤＮＡ及びｓＴＩＭ－３－ＦＬＡＧ／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣプラスミドＤＮＡをそれぞれＨＥＫ２９３Ｆ細胞（インビトロジェン社製）に導入し、一過性に発現させた。６日後、細胞上清を回収し、蛋白精製に用いた。
　可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３ヒトＦｃ融合蛋白質又は可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３を含む培養上清を遺伝子導入から６日後に遠心分離により回収し、Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ　Ｍ２　Ａｇａｒｏｓｅ　Ａｆｆｉｎｉｔｙｇｅｌ（シグマ社製）を用いて作製したＡｎｔｉ－ＦＬＡＧカラムとＦＬＡＧペプチド（シグマ社製）を用いてマニュアルに従い精製した。
　溶出液を分画し、各フラクションを還元条件化でＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、銀染色及びウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングには、抗ＦＬＡＧ　Ｍ２抗体（シグマ社製）とアルカリフォスファターゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を用いた。目的の蛋白質が認められたフラクションをアミコンウルトラ－４　１０Ｋ（ミリポア社製）を用いて濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｇｐ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。
　分画し、各フラクションを還元条件化でＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、銀染色及びウェスタンブロッティングを行った。目的の蛋白質が認められたフラクションを濃縮し、ＰＢＳ　０．５ｍＬで洗浄した。孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ－ＧＶ（ミリポア社製）でろ過滅菌し、可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３ヒトＦｃ融合蛋白質又は可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３を得た。エンドトキシン測定用専用試薬である、リムルスＥＳ－ＩＩキットワコー（和光純薬社製）を用いて精製度を測定し、十分に精製されていることを確認した。
［実施例５］
（ヒト抗体産生マウスの作製）
　免疫に用いたマウスは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体の遺伝的背景を有しており、かつ、ヒトＩｇ重鎖遺伝子座を含む１４番染色体断片（ＳＣ２０）及びヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を同時に保持する。このマウスはヒトＩｇ重鎖遺伝子座を持つ系統Ａのマウスと、ヒトＩｇκ鎖トランスジーンを持つ系統Ｂのマウスとの交配により作製された。
　系統Ａは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、子孫伝達可能な１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持するマウス系統であり、例えば富塚らの報告［Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．、２０００　Ｖｏｌ９７：７２２］に記載されている。
　また、系統Ｂは内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、ヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を保持するマウス系統（トランスジェニックマウス）であり、例えばＦｉｓｈｗｉｌｄらの報告［Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９６、１４：８４５］に記載されている。
　系統Ａの雄マウスと系統Ｂの雌マウス、または系統Ａの雌マウスと系統Ｂの雄マウスの交配により得られた、血清中にヒトＩｇ重鎖及びκ軽鎖が同時に検出される個体［Ｉｓｈｉｄａ＆Ｌｏｎｂｅｒｇ、ＩＢＣ’ｓ　１１ｔｈ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａｂｓｔｒａｃｔ　２０００］を、以下の免疫実験に用いた。なお、前記ヒト抗体産生マウス（以下、ＫＭマウスと記す）は、契約を結ぶことによって、協和発酵キリン株式会社より入手可能である。
［実施例６］
（ヒトＴＩＭ－３に対するヒトモノクローナル抗体の作製）
　本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら、講談社発行、１９９１年）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。免疫原としてのＴＩＭ－３は、実施例１で得られたＴＩＭ－３発現Ｌ９２９細胞又は実施例４で得られた可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３ヒトＦｃ融合蛋白質を用いた。被免疫動物は、上記ＫＭマウスを用いた。
　まず、ＫＭマウスに、ＴＩＭ－３発現Ｌ９２９細胞をマウス１匹あたり１×１０７個腹腔内に免疫した。初回免疫から以降、同細胞を３回又はそれ以上免疫した。脾臓を取得する３日前に、実施例４で得られた可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３ヒトＦｃ融合蛋白質２０μｇ／マウス個体を尾静脈投与した。免疫されたマウスから脾臓を外科的に取得した後、ＰＢＳ　４ｍＬ中に脾臓を入れ、メッシュ（セルストレイナー：ファルコン社製）上でシリンジのピストンを用いてつぶした。
　メッシュを通過した細胞懸濁液を遠心分離して細胞を沈澱させた後、Ｒｅｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅｌｌ　Ｌｙｓｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（シグマ社製）１ｍＬで再懸濁した。室温で５分間のインキュベーションの後、５０単位／ｍＬ　ペニシリン、５０μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシンを含む無血清ＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）（以下、無血清ＤＭＥＭ培地と記す）１０ｍＬを加え、遠心分離により細胞を沈澱させた。
　沈殿した細胞を、再度、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁した。一方、ミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ－１５８１）は１０％　ＦＣＳ（インビトロジェン社製）、５０単位／ｍＬ　ペニシリン、５０μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）（以下、血清入りＤＭＥＭ培地と記す）にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で細胞濃度が１×１０６細胞／ｍＬを越えないように培養した。
　ＳＰ２／０細胞を脾臓由来細胞と同様に無血清ＤＭＥＭ培地１０ｍＬで洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁した。これら脾臓由来細胞の懸濁液とマウスミエローマ懸濁液とを細胞数５：１で混合し、遠心分離後、上清を完全に除去した。このぺレットに、融合剤として５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００（ベーリンガーマンハイム社製）１ｍＬを、ピペットの先でぺレットを撹拌しながらゆっくり添加した後、予め３７℃に加温しておいた無血清ＤＭＥＭ培地１ｍＬをゆっくり添加した。さらに５ｍＬ及び１０ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地をゆっくり添加した。その後、３７℃、５％炭酸ガス存在下で５分間静置した。
　遠心分離後、上清を除去して得られた融合細胞を、１０％　ＦＣＳ（インビトロジェン社製）、ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（インビトロジェン社製、カタログ番号１０３７８－０１６を１００倍希釈）、ＩＬ－６（５ｎｇ／ｍＬ）、２－メルカプトエタノール（インビトロジェン社製、カタログ番号２１９８５－０２３を１０００倍希釈）を含むＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）（以下、ＩＬ－６入りＤＭＥＭ培地と記す）５０ｍＬに懸濁し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。
　翌日、細胞をピペッティングにより回収し、遠心分離により沈殿した細胞ペレットを１０ｍＬのＩＬ－６入りＤＭＥＭ培地に再懸濁した。翌日、Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（以下、ＨＡＴと記す、シグマ社製）を添加し、約７－１０日後、培養上清を回収し、ハイブリドーマスクリーニングに用いた。
［実施例７］
（ヒトＴＩＭ－３に対するマウスモノクローナル抗体の作製）
　本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら、講談社発行、１９９１年）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。免疫原としてのＴＩＭ－３は、実施例１で得られたＴＩＭ－３発現Ｌ９２９細胞又は実施例４で得られた可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３を用いた。被免疫動物は、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（日本チャールズ・リバー社から購入）を用いた。
　まず、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、ＴＩＭ－３発現Ｌ９２９細胞をマウス１匹あたり１×１０７個腹腔内に免疫した。初回免疫から以降、同細胞を３回又はそれ以上免疫した。脾臓を取得する３日前に、実施例４で得られた可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３　２０μｇ／マウス個体を尾静脈投与した。免疫されたマウスから脾臓を外科的に取得した後、ＰＢＳ　４ｍＬ中に脾臓を入れ、メッシュ（セルストレイナー：ファルコン社製）上でシリンジのピストンを用いてつぶした。
　メッシュを通過した細胞懸濁液を遠心分離して細胞を沈澱させた後、Ｒｅｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅｌｌ　Ｌｙｓｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（シグマ社製）１ｍＬで再懸濁した。室温で５分間のインキュベーションの後、無血清ＤＭＥＭ培地１０ｍＬを加え、遠心分離により細胞を沈澱させた。沈殿した細胞を、再度、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁した。一方、ミエローマ細胞　ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ－１５８１）は血清入りＤＭＥＭ培地にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で細胞濃度が１×１０６細胞／ｍＬを越えないように培養した。
　ＳＰ２／０細胞を脾臓由来細胞と同様に無血清ＤＭＥＭ培地１０ｍＬで洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁した。これら脾臓由来細胞の懸濁液とマウスミエローマ懸濁液とを細胞数５：１で混合し、遠心分離後、上清を完全に除去した。このぺレットに、融合剤として５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００（ベーリンガーマンハイム社製）１ｍＬを、ピペットの先でぺレットを撹拌しながらゆっくり添加した後、予め３７℃に加温しておいた無血清ＤＭＥＭ培地１ｍＬをゆっくり添加した。
　この細胞懸濁液に５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地をゆっくり添加した後、さらに１０ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地を添加し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で５分間静置した。遠心分離後、上清を除去して得られた融合細胞を、ＩＬ－６入りＤＭＥＭ培地５０ｍＬに懸濁し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。翌日、細胞をピペッティングにより回収し、遠心分離により沈殿した細胞ペレットを１０ｍＬのＩＬ－６入りＤＭＥＭ培地に再懸濁した。翌日、ＨＡＴ（シグマ社製）を添加し、約７－１０日後、培養上清を回収し、ハイブリドーマスクリーニングに用いた。
［実施例８］
（ヒトＴＩＭ－３に結合するヒト及びマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング）
　実施例６及び７で作製した細胞上清を用いてハイブリドーマのスクリーニングを行った。方法は、ヒトＴＩＭ－３安定発現細胞株を利用したフローサイトメトリー法で行った。まず、実施例１で得られたヒトＴＩＭ－３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞又はＥｏＬ－１細胞をステイニングメディウム（２％　ＦＣＳ及び０．０５％　アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄し、１ｍＬあたり１×１０７個になるように再びステイニングメディウムで懸濁した。細胞懸濁液を９６ウェルプレートに１０μＬずつ移した。
　さらに、ハイブリドーマの上清５０μＬを加え、４℃、３０分間静置した。ステイニングメディウムで２回洗浄後、ステイニングメディウムで２００倍希釈した標識抗体を５０μＬずつ加え、４℃、３０分間静置した。標識抗体は、ヒトモノクローナル抗体に対してはＧｏａｔ　Ｆ（ａｂ’）２　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（γ　ｃｈａｉｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ）－Ｒ－ＰＥ（サザンバイオテック社製）を、マウスモノクローナル抗体に対してはＧｏａｔ　Ｆ（ａｂ’）２　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｒ－ＰＥ、（サザンバイオテック社製）を用いた。
　ステイニングメディウムで２回洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で解析し、一次スクリーニングとした。ポジティブクローンを拡大培養した後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）でクローンソーティングし、Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（以下、ＨＴと記す、シグマ社製）を含んだＩＬ－６入りＤＭＥＭ培地で約７日培養した。
　回収した上清について、一次スクリーニングと同様にスクリーニングを行い、抗ヒトＴＩＭ－３ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ及び抗ヒトＴＩＭ－３マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをクローニングし、モノクローナル抗体の精製に用いた。
［実施例９］
（ハイブリドーマ由来モノクローナル抗体の精製）
　実施例８で取得した抗ヒトＴＩＭ－３ヒト又はマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから、抗ＴＩＭ－３ヒト又はマウスモノクローナル抗体を精製した。簡単には、ＣＥＬＬｉｎｅ　抗体産生システム（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、高濃度に抗ＴＩＭ－３抗体を含むハイブリドーマ上清を調製し、抗ヒトＴＩＭ－３モノクローナル抗体を精製した。まず、クローン化されたハイブリドーマを無血清培地に馴化させるために、ＨＴを含んだＩＬ－６入りＤＭＥＭ培地とＢＤ　Ｃｅｌｌ　ＭＡｂ　無血清培地（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を１：１で混合した培地で数日間培養し、１：２で混合した培地でさらに数日間培養した。
　その後、ＢＤ　Ｃｅｌｌ　ＭＡｂ　無血清培地（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で培養し、ハイブリドーマを無血清化した。無血清化したハイブリドーマはＣＬ－１０００フラスコなどにてマニュアルに従い培養し、高濃度に抗ＴＩＭ－３抗体を含むハイブリドーマ上清を回収した。ハイブリドーマ上清からの抗体精製はＰｒｏｔｅｉｎ　Ａを用いた標準的な方法で実施した。
　具体的には、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥヘルスケア社製）をオープンカラムに詰め、ＰＢＳで２倍希釈した上清を通過させ、０．１ｍｏｌ／Ｌ　Ｇｌｙｃｉｎ－ＨＣｌ（ｐＨ２．７）を用いて溶出し、アミコンウルトラ（ミリポア社製）を用いて濃縮した。その後、ＮＡＰ－５カラム（ＧＥヘルスケア社製）でＰＢＳに置換し、濾過滅菌することで、精製抗ヒトＴＩＭ－３ヒトモノクローナル抗体を４クローン（５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、４１７７抗体）、精製抗ヒトＴＩＭ－３マウスモノクローナル抗体を１クローン（８２１３抗体）取得した。
［実施例１０］
（抗ＴＩＭ－３ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプの決定）
　実施例９で得られた抗ＴＩＭ－３ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプは、抗原固相ＥＬＩＳＡ法及びフローサイトメトリー法により決定した。
　具体的には、抗原固相ＥＬＩＳＡ法では、まず、実施例４で得られた可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３を１μｇ／ｍＬ　Ｃａｒｂｏｎａｔｅ－Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（シグマ社製）に調製したものを５０μＬ、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ヌンク社製）の各ウェルに加えた。４℃で一晩インキュベートし、可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３をマイクロプレートに吸着させた。
　上清を捨てた後、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｉｎ　ＴＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を加えて室温で１０分間インキュベートし、さらにハイブリドーマ培養上清５０μＬを添加し、室温で３０分間インキュベートした。各ウェルを０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ－Ｔ）で洗浄後、ＨＲＰで標識されたマウス抗ヒトＩｇＧ１抗体、マウス抗ヒトＩｇＧ２抗体、マウス抗ヒトＩｇＧ３抗体又はマウス抗ヒトＩｇＧ４抗体（１０％　ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ含有ＴＢＳ－Ｔでそれぞれ２０００、２０００、２０００、４０００倍希釈したもの。ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）をそれぞれ５０μＬ加え、室温下で３０分間インキュベートした。
　各ウェルをＴＢＳ－Ｔで洗浄し、基質緩衝液（ＴＭＢ、ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ加え、室温下で２０分間インキュベートした後、０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸（和光純薬工業株式会社製）を５０μＬ加え、反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ、モレキュラーデバイス社製）で測定した。
　また、フローサイトメトリー法では、まず、実施例１で得られたヒトＴＩＭ－３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞をステイニングメディウムで洗浄後、ハイブリドーマの上清５０μＬを加え、４℃、３０分間静置した。洗浄後、ステイニングメディウムで１００倍程度に希釈したＭｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ１－ＰＥ、Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ２－ＰＥ、Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ３（Ｈｉｎｇｅ）－ＰＥ及びＭｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　４（Ｆｃ）－ＰＥ（全てサザンバイオテック社製）をそれぞれ５０μＬずつ加え、４℃、３０分間静置し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で解析した。
　以上の結果から、５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体のアイソタイプはそれぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＧ２であることが明らかとなった。
［実施例１１］
（ヒトＴＩＭ－３に対するマウスモノクローナル抗体のアイソタイプの決定）
　実施例９で得られた抗ヒトＴＩＭ－３マウスモノクローナル抗体のアイソタイプは、ＩｓｏＳｔｒｉｐ　Ｍｏｕｓｅ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて決定した。実施例８で得られた抗ＴＩＭ－３抗体を含むハイブリドーマ上清を用い、マニュアルに従って操作した。その結果、８２１３抗体のアイソタイプはＩｇＧ２ｂであることが明らかとなった。
［実施例１２］
（抗ＴＩＭ－３モノクローナル抗体遺伝子の単離）
　実施例９で取得された抗ヒトＴＩＭ－３ヒト又はマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから抗ＴＩＭ－３ヒト又はマウスモノクローナル抗体遺伝子を単離した。トータルＲＮＡの抽出は、クローン化したハイブリドーマから、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用い、マニュアルに従い実施した。抗体ｃＤＮＡの可変領域のクローニングは、ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（クローンテック社製）を用い、添付の説明書に従って行った。
　ヒトモノクローナル抗体重鎖（ＶＨ）のＰＣＲには、ＵＰＭ（ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；クローンテック社製）とプライマーｈｈ－６（配列番号４４）を用い、さらに、この反応液の一部を鋳型とし、ＮＵＰ（ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；クローンテック社製）とプライマーｈｈ－３（配列番号４５）を用いた。ＰＣＲ産物をＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）などを用いてクローニングし、ベクターのユニバーサルプライマー（例えば、Ｔ７またはＭ１３Ｒプライマー）を用いて塩基配列及びアミノ酸配列を解析した。
　その結果、５１２抗体のＶＨは、塩基配列が配列番号５４、アミノ酸配列が５５で表され、６４４抗体のＶＨは、塩基配列が配列番号５８、アミノ酸配列が５９で表され、４５４５抗体のＶＨは、塩基配列が配列番号７、アミノ酸配列が配列番号８で表され、４１７７抗体のＶＨは、塩基配列が配列番号１７、アミノ酸配列が配列番号１８で表されることが明らかとなった。得られた各可変領域とヒトＩｇＧ１の定常領域とを発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｂｉｏｇｅｎ　ＩＤＥＣ　Ｉｎｃ社製）に組み込み、連結した。
　ヒトモノクローナル抗体軽鎖（ＶＬ）のＰＣＲには、ＵＰＭ（ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；クローンテック社製）とプライマーｈｋ－２（配列番号４６）を用い、さらに、この反応液の一部を鋳型とし、ＮＵＰ（ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；クローンテック社製）とプライマーｈｋ－６（配列番号４７）を用いた。ＰＣＲ産物をＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）などを用いてクローニングし、ベクターのユニバーサルプライマー（例えば、Ｔ７またはＭ１３Ｒプライマー）を用いて塩基配列及びアミノ酸配列を解析した。
　その結果、５１２抗体のＶＬは、塩基配列が配列番号５６、アミノ酸配列が５７で表され、６４４抗体のＶＬは、塩基配列が配列番号６０、アミノ酸配列が６１で表され、４５４５抗体のＶＬは、塩基配列が配列番号９、アミノ酸配列が配列番号１０で表され、４１７７抗体のＶＨは、塩基配列が配列番号１９、アミノ酸配列が配列番号２０で表されることが明らかとなった。得られた各可変領域とκ鎖の定常領域とを発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｂｉｏｇｅｎ　ＩＤＥＣ　Ｉｎｃ社製）に組み込み、連結した。
　マウスモノクローナル抗体重鎖（ＶＨ）のＰＣＲには、ＵＰＭ（ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；クローンテック社製）とプライマーｍＨ＿Ｒｖ１（配列番号４８）を用い、さらに、この反応液の一部を鋳型とし、ＮＵＰ（ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；クローンテック社）とプライマーｍＨ＿Ｒｖ２（配列番号４９）を用いた。
　ＰＣＲ産物をＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）などを用いてクローニングし、ベクターのユニバーサルプライマー（例えば、Ｔ７またはＭ１３Ｒプライマー）を用いて塩基配列及びアミノ酸配列を解析した。
　その結果、８２１３抗体のＶＨは、塩基配列が配列番号２７、アミノ酸配列が配列番号２８で表されることが明らかとなった。得られた可変領域とマウスＩｇＧ２ａ定常領域とを連結し、発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｂｉｏｇｅｎ　ＩＤＥＣ　Ｉｎｃ社製）に組み込んだ。
　マウスモノクローナル抗体軽鎖（ＶＬ）のＰＣＲには、ＵＰＭ（ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；クローンテック社製）とプライマーｍＫ＿Ｒｖ１（配列番号５０）を用い、さらに、この反応液の一部を鋳型とし、ＮＵＰ（ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；クローンテック社製）とプライマーｍＫ＿Ｒｖ２（配列番号５１）を用いた。ＰＣＲ産物をＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）などを用いてクローニングし、ベクターのユニバーサルプライマー（例えば、Ｔ７またはＭ１３Ｒプライマー）を用いて塩基配列及びアミノ酸配列を解析した。
　その結果、８２１３抗体のＶＬは、塩基配列が配列番号２９、アミノ酸配列が配列番号３０で表されることが明らかとなった。得られた可変領域とマウスκ鎖の定常領域とを連結し、上述の８２１３抗体のＶＨを組み込んだ発現ベクターに挿入した。
　また、陰性コントロールとして抗ジニトロフェノール（ＤＮＰ）ヒトＩｇＧ１抗体を得るため、抗重鎖（ＶＨ）の塩基配列（配列番号６２）、抗体軽鎖（ＶＬ）の塩基配列（配列番号６４）、ヒトＩｇＧ１及びκ鎖の定常領域を発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｂｉｏｇｅｎ　ＩＤＥＣ　Ｉｎｃ社製）に組み込んだ。
［実施例１３］
（組換抗ＴＩＭ－３ヒトモノクローナルデフコース抗体の精製）
　実施例１２で構築した組換え型抗体発現ベクターを宿主細胞に導入し、組換え型抗体発現細胞を作製した。発現のための宿主細胞は、既報に従い、ＦＵＴ８－／－　ＣＨＯ細胞を用いた（Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　２００６：１２（９）Ｉｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．）。まず、実施例１２で得られた５１２、６４４、４５４５、又は、４１７７の発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ　ＭＡＸ　Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）を用いてＦＵＴ８－／－　ＣＨＯ細胞にそれぞれ導入した。ＦＵＴ８－／－　ＣＨＯ細胞は、シェーカーを用いてＣＯ２　５％、３７℃の環境下で培養し、約５日後に培養上清を回収した。
　回収した培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ（ＧＥヘルスケア社製）及び精製量に応じて０．８×４０ｃｍカラム（バイオラッド社製）などを用い、吸着緩衝液としてＰＢＳ、溶出緩衝液として０．０２ｍｏｌ／Ｌ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．７、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は０．２ｍｏｌ／Ｌ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した。
　調製された抗体溶液は、ＮＡＰ－２５（ＧＥヘルスケア社製）及びアミコンウルトラ（１００００カット、ミリポア社製）を用いてＰＢＳに置換及び濃縮し、ろ過滅菌した後、組換抗ＴＩＭ－３ヒトモノクローナルデフコース抗体（５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、４１７７抗体）を得た。リムルスＥＳ－ＩＩキットワコー（和光純薬社製）を用いて精製度を測定し、十分に精製されていることを確認した。
　また、実施例１２で得られた抗ＤＮＰ抗体の発現ベクターをＣＨＯ－ＤＧ４４細胞に導入した。ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞は、シェーカーを用いてＣＯ２　５％、３７℃の環境下で培養し、約５日後に培養上清を回収した。回収した培養上清を、同様に精製Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ（ＧＥヘルスケア社製）及び精製量に応じて０．８×４０ｃｍカラム（バイオラッド社製）などを用い、吸着緩衝液としてＰＢＳ、溶出緩衝液として０．０２ｍｏｌ／Ｌ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．７、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は０．２ｍｏｌ／Ｌ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した。調製された抗体溶液は、ＮＡＰ－２５（ＧＥヘルスケア社製）及びアミコンウルトラ（１００００カット、ミリポア社製）を用いてＰＢＳに置換及び濃縮し、ろ過滅菌した後、組換抗ＤＮＰ抗体を得た。リムルスＥＳ－ＩＩキットワコー（和光純薬社製）を用いて精製度を測定し、十分に精製されていることを確認した。
［実施例１４］
（組換抗ＴＩＭ－３マウスモノクローナル抗体の精製）
　実施例１２で得られた８２１３抗体の発現ベクターは、２９３フェクチン（インビトロジェン社製）を用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞（インビトロジェン社製）に導入した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、シェーカーを用いてＣＯ２　５％、３７℃の環境下で培養し、約５日後に培養上清を回収した。回収した培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ（ＧＥヘルスケア社製）及び精製量に応じて０．８×４０　ｃｍ　カラム（バイオラッド社製）などを用い、吸着緩衝液としてＰＢＳ、溶出緩衝液として０．０２ｍｏｌ／Ｌ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．７、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）を用いてアフィニティー精製した。
　溶出画分は０．２ｍｏｌ／Ｌ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した。調製された抗体溶液は、ＮＡＰ－２５（ＧＥヘルスケア社製）及びアミコンウルトラ（１００００カット、ミリポア社製）を用いてＰＢＳに置換及び濃縮し、ろ過滅菌した後、組換抗ＴＩＭ－３マウスモノクローナル抗体（８２１３抗体）を得た。リムルスＥＳ－ＩＩキットワコー（和光純薬社製）を用いて精製度を測定し、十分に精製されていることを確認した。
［実施例１５］
（精製モノクローナル抗体の蛍光標識）
　ハイブリドーマ由来モノクローナル抗体および組換モノクローナル抗体の蛍光標識は、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、マニュアルに従い実施した。標識操作後、ＴＩＭ－３発現細胞に対するＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、各抗体がＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７（以下、Ａｌｅｘａ－６４７と記す）で標識されていることを確認した。
［実施例１６］
（競合試験によるエピトープ分類－１）
　実施例１３及び１４で得られた抗体、並びに市販の抗ＴＩＭ－３抗体である３４４８２３抗体（Ｃｌｏｎｅ　３４４８２３、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）のエピトープの関係を競合試験で検討した。簡単には、被験抗体を実施例１で得られたＴＩＭ－３発現細胞に反応させ、標識した別の抗ＴＩＭ－３抗体がＴＩＭ－３発現細胞にさらに結合しうるかをフローサイトメトリー法で評価した。
　第一段階として、実施例１３及び１４で作製したモノクローナル抗体（５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、４１７７抗体、８２１３抗体）と３４４８２３抗体との競合の有無をそれぞれ検討した。まず、ステイニングメディウムで洗浄したヒトＴＩＭ－３発現ＥｏＬ－１細胞と親株ＥｏＬ－１細胞に精製した被験モノクローナル抗体（５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、４１７７抗体、８２１３抗体）をそれぞれ反応させた（４℃　３０分間）。終濃度は１０μｇ／ｍＬとした。続いて、ＰＥ標識３４４８２３抗体（Ｃｌｏｎｅ　３４４８２３、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、反応させた（４℃　３０分間）。ステイニングメディウムで洗浄後、７－ＡＡＤ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加え、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で解析した。
　その結果、陽性対照として用いたヤギ由来抗ヒトＴＩＭ－３　ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及び６４４抗体はＰＥ標識３４４８２３抗体のＴＩＭ－３発現細胞への結合をほぼ完全に阻害した。一方で、５１２、４５４５及び８２１３抗体はＰＥ標識３４４８２３抗体のＴＩＭ－３発現細胞への結合を阻害しなかった。また、４１７７抗体は、ＰＥ標識３４４８２３抗体のＴＩＭ－３発現細胞への結合を阻害したが、その阻害は６４４抗体に比べると極めて低かった。従って、６４４抗体は３４４８２３抗体と競合する一方で、５１２、４５４５及び８２１３抗体は３４４８２３抗体と競合せず、４１７７抗体は３４４８２３抗体と競合するものの、その競合は部分的であることが明らかとなった。
　第二段階として、これまでテストした抗ＴＩＭ－３モノクローナル抗体のうち、３４４８２３抗体と競合しなかった、５１２、４５４５及び８２１３抗体の競合の有無を検討した。方法は、標識抗体として実施例１５で得られたＡｌｅｘａ－６４７標識５１２抗体又はＡｌｅｘａ－６４７標識８２１３抗体を用いた以外は、第一段階と同様に行った。その結果、４５４５及び８２１３抗体は、Ａｌｅｘａ－６４７標識５１２抗体のＴＩＭ－３発現細胞への結合を阻害しなかった。
　一方で、４５４５抗体は、Ａｌｅｘａ－６４７標識８２１３抗体のＴＩＭ－３発現細胞への結合を阻害した。従って、４５４５抗体と８２１３抗体は競合する一方で、これら２抗体は５１２抗体と競合しないことが明らかとなった。この結果は、５１２抗体は、３４４８２３抗体及び８２１３抗体と異なるエピトープを認識することを示唆している。
　第三段階として、第一段階で３４４８２３抗体と部分的に競合することが明らかとなった４１７７抗体について、５１２及び８２１３抗体との競合の有無を検討した。方法は、第二段階と同様に行った。その結果、４１７７抗体は、Ａｌｅｘａ－６４７標識５１２抗体のＴＩＭ－３発現細胞への結合を阻害しない一方で、Ａｌｅｘａ－６４７標識８２１３抗体のＴＩＭ－３発現細胞への結合を阻害したことから、４１７７抗体は５１２抗体と競合せず、８２１３抗体と競合することが明らかとなった。
　以上の結果から、実施例１３及び１４で得られた５抗体のうち、６４４抗体は３４４８２３抗体が認識するエピトープの近傍を認識し、５１２抗体は３４４８２３抗体または他の４抗体（６４４抗体、４５４５抗体、４１７７抗体、８２１３抗体）が認識するエピトープと異なるエピトープを認識することが示唆された。
　また、８２１３抗体は３４４８２３抗体または５１２抗体が認識するエピトープとは異なるエピトープを認識することが示唆された。４５４５抗体はこの８２１３抗体が認識するエピトープの近傍を認識することが示唆された。一方、４１７７抗体は８２１３抗体が認識するエピトープの近傍と共に、３４４８２３抗体が認識するエピトープの近傍もわずかに認識することが示唆された。
［実施例１７］
（組換抗ＴＩＭ－３ヒトモノクローナルデフコース抗体による抗体依存的細胞傷害活性試験）
　抗体を介した細胞性の細胞傷害活性は、抗体の存在下でエフェクターとしてヒト末梢血由来単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｅｌｌｓ、以下、ＰＢＭＣと記す）を用い、ターゲット細胞へのＡＤＣＣ活性の測定を実施した。まず、健康なボランティアより末梢血を採取し、抗凝固剤を添加した。この血液をＦｉｃｏｌｌ－Ｐｌａｑｕｅ　Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）の上に静置し、界面を乱さないように大型遠心分離機（ＣＦ９ＲＸ、日立工機社製）を用いて２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
　細胞が含まれる中間層を集めＰＢＳを用いて洗浄し、９００ｒｐｍ　２０分間の遠心分離により血小板を除いたものをＰＢＭＣとして測定に用いた。次に、ターゲット細胞に用いるＤａｕｄｉ細胞とＰＢＭＣをエフェクター／ターゲット比＝５０で混合した。
　実施例１３及び１４で得られた組換抗ＴＩＭ－３ヒトモノクローナルデフコース抗体（５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、４１７７抗体）およびヒトＩｇＧ１コントロールとして抗ＤＮＰ抗体をそれぞれ培地に懸濁し、終濃度１μｇ／ｍＬ、トータル１００μＬとなるように添加した。混合後、３７℃、５％　ＣＯ２存在下で４時間培養した。培地中に放出されたＬＤＨ量から、ターゲット細胞の溶解度を評価した。ＬＤＨの測定と溶解度の算出は、ＣｙｔｏＴｏｘ　９６　Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（プロメガ社製）を用い、マニュアルに従った。有意差検定は標準的なＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔを用い、危険率（ｐ）が０．０５以下のものを有意に異なるものとした。
　Ｄａｕｄｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性を測定した結果、抗ＤＮＰ抗体と比較して、４５４５抗体及び４１７７抗体は、ターゲット細胞溶解率の顕著な増加が認められた。この結果は、抗ＴＩＭ－３マウス抗体８２１３、および、抗ＴＩＭ－３マウス抗体８２１３と競合する抗ＴＩＭ－３抗体は、高いＡＤＣＣ活性を有することを示唆している。
　同様に、実施例１３で得られた、組換抗ＴＩＭ－３ヒトモノクローナルデフコース抗体（４５４５抗体、４１７７抗体）、市販抗ヒトＴＩＭ－３モノクローナル抗体である３４４８２３抗体、および、ネガティブコントロールとして抗ＤＮＰ抗体を用い、同様にＡＤＣＣ活性の測定を実施した。
　まず、健康なボランティアより末梢血を採取し、抗凝固剤を添加した。この血液をＦｉｃｏｌｌ－Ｐｌａｑｕｅ　Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）の上に静置し、界面を乱さないように大型遠心分離機（ＣＦ９ＲＸ、日立工機社製）を用いて２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。細胞が含まれる中間層を集めＰＢＳを用いて洗浄し、９００ｒｐｍ　２０分間の遠心分離により血小板を除いたものをＰＢＭＣとして測定に用いた。
　次に、ターゲット細胞に用いるＤａｕｄｉ細胞とＰＢＭＣをエフェクター／ターゲット比＝２５で混合した。４５４５抗体、４１７７抗体、３４４８２３抗体、抗ＤＮＰ抗体およびＰＢＳを培地に懸濁し、終濃度１μｇ／ｍＬ、トータル１００μＬとなるように添加した。混合後、３７℃、５％　ＣＯ２存在下で４時間培養した。培地中に放出されたＬＤＨ量から、ターゲット細胞の溶解度を評価した。
　ＬＤＨの測定と溶解度の算出は、ＣｙｔｏＴｏｘ　９６　Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（プロメガ社製）を用い、マニュアルに従った。有意差検定は標準的なＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔを用い、危険率（ｐ）が０．０５以下のものを有意に異なるものとした。Ｄａｕｄｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性を測定した結果、４５４５抗体、および、４１７７抗体は、抗ＤＮＰ抗体と比較して、ターゲット細胞溶解率の有意な増加が認められた。一方、３４４８２３抗体は、抗ＤＮＰ抗体およびＰＢＳと比較して、ターゲット細胞溶解率の有意な増加は認められなかった。
［実施例１８］
（抗ＴＩＭ－３抗体を用いた結合解離定数の算出）
　抗ＴＩＭ－３抗体の結合解離定数を、表面プラズモン共鳴の原理による解析装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ　ヘルスケア社製）を用いて解析した。簡単には、抗ヒト抗体または抗マウス抗体をＣＭ５センサーチップに固相化し、次に抗ＴＩＭ－３ヒトまたはマウス抗体を流して結合させ、次いで実施例４で作製した可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３を流すことによって、抗ＴＩＭ－３抗体に対するＴＩＭ－３の結合解離を観察した。全実験工程を通して、基本的にはＧＥ　ヘルスケア社の結合解離定数算出のための実験方法を参照した。
　具体的には、センサーチップはＣＭ５（リサーチグレード、ＧＥヘルスケア社製）を用いた。まず、ＣＭ５チップを４００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＣ（Ｎ－ｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）　ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）と１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＨＳ（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を等量混合したものをＣＭ５チップに流して活性化させた。次に、Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）付属の抗ヒト抗体抗体をキット付属の溶液に希釈して流し、ＣＭ５チップにヒト抗体に対する抗体を必要量固相化させた。
　また、マウス抗体に関しては、Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）付属のマウス抗体に対する抗体をキット付属の溶液に希釈して流し、ＣＭ５チップに必要量固相化させた。次に、１ｍｏｌ／Ｌ　ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを流し、活性化したチップ表面をブロッキングし不活化させた。
　次に、抗ＴＩＭ－３抗体を１フローセルに１種類ずつＨＢＳ－ＥＰバッファー（ＧＥヘルスケア社製）に希釈して流し、固相化されたヒト抗体に対する抗体またはマウス抗体に対する抗体に結合させた。次に、可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３を流した。結合した抗ＴＩＭ－３抗体及び可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３を解離させるため、Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ付属の３ｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２、またはＭｏｕｓｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ付属のｐＨ１．７　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌをキット付属の量を流した。
　ここまでの工程を１ステップとし、同様の工程を可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３について複数の濃度で繰り返すことで、結合解離定数を算出するためのデータ（センサーグラム）を取得した。アナライトとして流した可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３の濃度は、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍＬ　を１．４ＯＤとして算出した。
　可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３の分子量は、電気泳動の泳動度から、約４２．８　ｋＤａと算出した。解析は、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフト（ＧＥヘルスケア社製）を用い、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋを参照した。具体的には、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ解析の同時解析を実施し、基本的に１：１　Ｌａｎｇｍｕｉｒ　Ｂｉｎｄｉｎｇの反応モデルを採用してフィッティングし、結合速度定数（Ｋａ）及び解離速度定数（Ｋｄ）を算出し、Ｋｄ／Ｋａの計算により解離定数ＫＤ値を算出した。
　抗ヒトＴＩＭ－３ヒトモノクローナル抗体のＫＤ値は、多くの抗体で１０－９ｍｏｌ／Ｌオーダーとなった。このことから、ＴＩＭ－３を標的にしたＡＤＣＣ活性と結合親和性の間に相関は認められなかった。
　抗ヒトＴＩＭ－３マウスモノクローナル抗体は、観察した限りにおいて（例えば解離相を３０分程度観察）、抗原である可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ－３との解離が認められなかった。このことから、ヒトＴＩＭ－３に対し、極めて高い結合性を有するモノクローナル抗体を作製しうることが示された。
［実施例１９］
（競合試験によるエピトープ分類－２）
　抗ＴＩＭ－３抗体である、５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体、３４４８２３抗体、Ｆ３８－２Ｅ２抗体、および、コントロールの抗ＤＮＰ抗体のエピトープを競合試験で検討した。簡単には、未標識の被験抗体を実施例１で得られたＴＩＭ－３発現細胞に反応させ、蛍光標識した別の抗ＴＩＭ－３抗体がＴＩＭ－３発現細胞にさらに結合しうるかをフローサイトメトリー法で評価した。
　ステイニングメディウムで洗浄したヒトＴＩＭ－３発現ＥｏＬ－１細胞に精製した被験モノクローナル抗体［抗ＤＮＰ抗体、５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体、３４４８２３抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｆ３８－２Ｅ２抗体（Ｉｍｇｅｎｅｘ社製）］をそれぞれ反応させた（４℃　３０分間）。終濃度は１０μｇ／ｍＬとした。続いて、Ａｌｅｘａ－６４７またはＡＰＣ標識抗ＴＩＭ－３抗体［３４４８２３抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｆ３８－２Ｅ２抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）］を添加し、反応させた（４℃　３０分間）。ステイニングメディウムで洗浄後、７－ＡＡＤ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加え、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で解析した。
　結果を表１に示す。表１において、未標識抗ＴＩＭ－３抗体の結合したＴＩＭ－３発現細胞への結合がネガティブコントロールと同程度に認められた場合を「＋」、未標識抗ＴＩＭ－３抗体の結合したＴＩＭ－３発現細胞への結合が減弱しながらも認められた場合を「＋／－」、未標識抗ＴＩＭ－３抗体の結合したＴＩＭ－３発現細胞への結合が認められなかった場合を「－」で表した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、Ａｌｅｘａ－６４７標識５１２抗体は、その他の未標識抗ＴＩＭ－３抗体の結合したＴＩＭ－３発現細胞への結合が認められたことから、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体、３４４８２３抗体、Ｆ３８－２Ｅ２抗体とは競合しない、独立したエピトープを認識することが示唆された。
　Ａｌｅｘａ－６４７標識６４４抗体は、未標識抗ＴＩＭ－３抗体３４４８２３抗体またはＦ３８－２Ｅ２抗体の結合したＴＩＭ－３発現細胞への結合が認められない、もしくは減弱したことから、３４４８２３抗体、Ｆ３８－２Ｅ２抗体と競合する、互いに近接したエピトープを認識することが示唆された。
　Ａｌｅｘａ－６４７標識４５４５抗体は、未標識抗ＴＩＭ－３抗体８２１３抗体の結合したＴＩＭ－３発現細胞への結合が認められなかったことから、８２１３抗体と競合する、互いに近接したエピトープを認識することが示唆された。
　Ａｌｅｘａ－６４７標識８２１３抗体は、未標識抗ＴＩＭ－３抗体４５４５抗体の結合したＴＩＭ－３発現細胞への結合が認められなかったことから、４５４５抗体と競合する、互いに近接したエピトープを認識することが示唆された。
　ＡＰＣ標識３４４８２３抗体は、未標識抗ＴＩＭ－３抗体６４４抗体またはＦ３８－２Ｅ２抗体の結合したＴＩＭ－３発現細胞への結合が認められない、もしくは減弱したことから、６４４抗体またはＦ３８－２Ｅ２抗体と競合する、互いに近接したエピトープを認識することが示唆された。
　ＡＰＣ標識Ｆ３８－２Ｅ２抗体は、未標識抗ＴＩＭ－３抗体６４４抗体または３４４８２３抗体の結合したＴＩＭ－３発現細胞への結合が認められなかったことから、６４４抗体または３４４８２３抗体と競合する、互いに近接したエピトープを認識することが示唆された。
［実施例２０］
（マウスＴＩＭ－３　ｃＤＮＡの分子クローニング）
　マウスＴＩＭ－３のｃＤＮＡは実施例１と同様に取得した。Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨髄細胞からＨｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を用いて鋳型ｃＤＮＡを合成した。プライマーは、ｍＴｉｍ－３　Ｆｗ３（配列番号７０）及びｍＴｉｍ－３　Ｒｅ３（配列番号７１）を用いた。ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へ挿入後、ＤＮＡ配列解析により、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４５０２４１のコーディングリージョンと同一の塩基配列を有するクローンを選定した。
　選定したクローンを鋳型としたＰＣＲにより、ｐＥＦ６／Ｍｙｃ－ＨｉｓＣベクター（インビトロジェン社製）のＮｏｔＩ部位に挿入した（ｍＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ）。ＰＣＲのプライマーには、ｍＴｉｍ－３　Ｆｗ４ＮｏｔＩ（配列番号７２）およびｍＴｉｍ－３　Ｒｅ４ＮｏｔＩ（配列番号７３）を用いた。
［実施例２１］
（ｈＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの構築）
　実施例１で作製したｈＴＩＭ－３／ｐＭＣｓ－ＩＧ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡとｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣをそれぞれＮｏｔＩで消化し、ヒトＴＩＭ－３発現ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ　ベクターを構築した（ｈＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ）。ＤＮＡ配列解析を行い、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２のコーディングリージョンと同一の塩基配列を有することを確認した。
［実施例２２］
（抗ヒトＴＩＭ－３抗体のマウスＴＩＭ－３抗体への交差性評価）
　実施例２０および実施例２１で作製したｍＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、ｈＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ、および、コントロールの空ベクターを実施例４と同様にＨＥＫ２９３Ｆ細胞にそれぞれトランスフェクションした。２日後、実施例１５と同様にＡｌｅｘａ－６４７標識した抗ヒトＴＩＭ－３抗体（５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体）、ＡＰＣ標識市販抗ヒトＴＩＭ－３抗体（３４４８２３抗体およびＦ３８－２Ｅ２抗体）およびＰＥ標識市販抗マウスＴＩＭ－３抗体（ＲＭＴ３－２３抗体、バイオレジェンド社製）のヒトＴＩＭ－３およびマウスＴＩＭ－３に対する結合性をフローサイトメトリーで評価した。
　その結果、５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体、３４４８２３抗体およびＦ３８－２Ｅ２抗体はヒトＴＩＭ－３発現２９３Ｆ細胞にのみ結合した。一方、ＲＭＴ３－２３抗体はマウスＴＩＭ－３発現２９３Ｆ細胞にのみ結合した。このことから、５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体、３４４８２３抗体およびＦ３８－２Ｅ２抗体はマウスＴＩＭ－３には交差反応しないことが分かった。
［実施例２３］
（ＩｇＶドメインをマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質発現系の構築）
　ｈＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡを鋳型としてｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｖｅｃＲ１プライマー（配列番号７４）および、ｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｖｅｃＦ１プライマー（配列番号７５）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。ｍＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡを鋳型としてｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｉｎｓＦ１プライマー（配列番号７６）および、ｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｉｎｓＲ１プライマー（配列番号７７）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。
　得られた２つのＰＣＲ産物をＧＥＮＥＡＲＴ　ｓｅａｍｌｅｓｓ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（ＩｇＶ　ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号７８）。
［実施例２４］
（ＭｕｃｉｎドメインをマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質発現系の構築）
　ｈＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡを鋳型としてｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｖｅｃＲ２プライマー（配列番号８０）および、ｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｖｅｃＦ２プライマー（配列番号８１）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。ｍＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡを鋳型としてｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｉｎｓＦ２プライマー（配列番号８２）および、ｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｉｎｓＲ２プライマー（配列番号８３）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。
　得られた２つのＰＣＲ産物をＧＥＮＥＡＲＴ　ｓｅａｍｌｅｓｓ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（Ｍｕｃｉｎ　ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号８４）。
［実施例２５］
（ＩｇＶドメインをマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質およびＭｕｃｉｎドメインをマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質への抗ＴＩＭ－３抗体の結合性評価）
　実施例２３および２４で作製したＩｇＶ　ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、Ｍｕｃｉｎ　ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、ｈＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、ｍＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ、および、コントロールの空ベクターを実施例４と同様にＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションした。２日後、実施例２２と同様に抗ＴＩＭ－３抗体の結合性をフローサイトメトリーで評価した。
　その結果、５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体、４１７７抗体、３４４８２３抗体およびＦ３８－２Ｅ２抗体は、ヒトＴＩＭ－３発現細胞とＭｕｃｉｎ　ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ－３発現細胞のみに結合した。一方、ＲＭＴ３－２３抗体はマウスＴＩＭ－３発現細胞とＩｇＶ　ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ－３発現細胞のみに結合した。
　このことから、テストした全ての抗ヒトＴＩＭ－３抗体（５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体、４１７７抗体、３４４８２３抗体、Ｆ３８－２Ｅ２抗体）およびマウスＴＩＭ－３抗体（ＲＭＴ３－２３抗体）はＩｇＶドメインを認識することが示された。
［実施例２６］
（ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　２２－４７／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの構築）
　ヒトＴＩＭ－３（配列番号５３）の２２から４７番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質を発現させるための発現ベクター（以下、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　２２－４７、と記す）を構築した。方法は、実施例２１で作製したｈＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡを鋳型に、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２－４７Ｆ１プライマー（配列番号８６）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２－４７Ｒ１プライマー（配列番号８７）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。
　得られたＰＣＲ産物を鋳型に、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２－４７Ｆ２プライマー（配列番号８８）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２－４７Ｒ２プライマー（配列番号８９）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。
　得られたＰＣＲ産物を鋳型に、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２－４７Ｆ３プライマー（配列番号９０）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２－４７Ｒ３プライマー（配列番号９１）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。
　３度目のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロース電気泳動した。ＤＮＡを抽出し、ＧＥＮＥＡＲＴ　ｓｅａｍｌｅｓｓ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　２２－４７／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号９２）。
［実施例２７］
（ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　５７－６６／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの構築）
　ヒトＴＩＭ－３（配列番号５３）の５７から６６番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質を発現させるための発現ベクター（以下、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　５７－６６、と記す）を構築した。方法は、実施例２１で作製したｈＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡを鋳型に、Ｔ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いてリン酸化したｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ５７－６６Ｆプライマー（配列番号９４）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ５７－６６Ｒプライマー（配列番号９５）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。
　得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロース電気泳動した。ＤＮＡを抽出し、ＬｉｇａＦａｓｔＴＭ　Ｒａｐｉｄ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　５７－６６／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号９６）。
［実施例２８］
（ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　６７－１０５／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの構築）
　ヒトＴＩＭ－３（配列番号５３）の６７から１０５番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質を発現させるための発現ベクター（以下、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　６７－１０５、と記す）を構築した。ｈＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡを鋳型としてｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７－１０５Ｆプライマー（配列番号９８）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７－１０５Ｒプライマー（配列番号９９）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。
　ｍＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡを鋳型としてｍＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７－１０５Ｆプライマー（配列番号１００）および、ｍＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７－１０５Ｒプライマー（配列番号１０１）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。得られた２つのＰＣＲ産物をＧＥＮＥＡＲＴ　ｓｅａｍｌｅｓｓ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　６７－１０５／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号１０２）。
［実施例２９］
（ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　７４－８１／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの構築）
　ヒトＴＩＭ－３（配列番号５３）の７４から８１番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質を発現させるための発現ベクター（以下、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　７４－８１、と記す）を構築した。方法は、実施例２１で作製したｈＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡを鋳型に、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ７４－８１Ｆプライマー（配列番号１０４）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ７４－８１Ｒプライマー（配列番号１０５）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。
　得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロース電気泳動した。ＤＮＡを抽出し、ＧＥＮＥＡＲＴ　ｓｅａｍｌｅｓｓ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　７４－８１／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号１０６）。
［実施例３０］
（ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　８８－９６／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの構築）
　ヒトＴＩＭ－３（配列番号５３）の８８から９６番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質を発現させるための発現ベクター（以下、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　８８－９６、と記す）を構築した。方法は、実施例２１で作製したｈＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡを鋳型に、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ８８－９６Ｆプライマー（配列番号１０８）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ８８－９６Ｒプライマー（配列番号１０９）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。
　得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロース電気泳動した。ＤＮＡを抽出し、ＧＥＮＥＡＲＴ　ｓｅａｍｌｅｓｓ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　８８－９６／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号１１０）。
［実施例３１］
（ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　９６－１０５／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの構築）
　ヒトＴＩＭ－３（配列番号５３）の９６から１０５番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質を発現させるための発現ベクター（以下、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　９６－１０５、と記す）を構築した。方法は、実施例２１で作製したｈＴｉｍ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡを鋳型に、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ９６－１０５Ｆプライマー（配列番号１１２）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ９６－１０５Ｒプライマー（配列番号１１３）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。
　得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロース電気泳動した。ＤＮＡを抽出し、ＧＥＮＥＡＲＴ　ｓｅａｍｌｅｓｓ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　９６－１０５／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号１１４）。
［実施例３２］
（ＩｇＶドメインの一部をマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質への抗ＴＩＭ－３抗体の結合性評価）
　実施例２６から３１で作製した各種ＴＩＭ－３キメラ蛋白質の発現ベクター、および、コントロールの空ベクターを実施例４と同様にＨＥＫ２９３Ｆ細胞にそれぞれトランスフェクションした。導入された発現ベクターおよび当該ベクターにより発現するＴＩＭ－３キメラ蛋白質は次の通りである。
（１）ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　２２－４７：ヒトＴＩＭ－３（配列番号５３）の２２から４７番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質
（２）ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　５７－６６：ヒトＴＩＭ－３（配列番号５３）の５７から６６番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質
（３）ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　６７－１０５：ヒトＴＩＭ－３（配列番号５３）の６７から１０５番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質
（４）ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　７４－８１：ヒトＴＩＭ－３（配列番号５３）の７４から８１番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質
（５）ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　８８－９６：ヒトＴＩＭ－３（配列番号５３）の８８から９６番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質
（６）ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　９６－１０５：ヒトＴＩＭ－３（配列番号５３）の９６から１０５番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ－３に置換したＴＩＭ－３キメラ蛋白質
トランスフェクションした２日後、実施例２２と同様に抗ＴＩＭ－３抗体の結合性をフローサイトメトリーで評価した。
　その結果を表２に示す。表２において、トランスフェクションした細胞への抗体の結合が認められた場合を「＋」、トランスフェクションした細胞への抗体の結合が減弱しながらも認められた場合を「＋／－」、トランスフェクションした細胞への抗体の結合が認められなかった場合を「－」で表した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、４５４５抗体および８２１３抗体は、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　２２－４７、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　５７－６６、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　８８－９６、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　９６－１０５をトランスフェクションした細胞に結合した。一方、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　６７－１０５をトランスフェクションした細胞に結合しなかった。
　５１２抗体は、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　５７－６６、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　８８－９６、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　９６－１０５、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　６７－１０５、および、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　７４－８１をトランスフェクションした細胞に結合した。一方、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　２２－４７をトランスフェクションした細胞に結合しなかった。
　６４４抗体、３４４８２３抗体、および、Ｆ３８－２Ｅ２抗体は、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　２２－４７、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　８８－９６、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　９６－１０５、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　６７－１０５、および、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　７４－８１をトランスフェクションした細胞に結合した。一方、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　５７－６６をトランスフェクションした細胞に結合しなかった。
　４１７７抗体は、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　８８－９６、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　９６－１０５、および、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　７４－８１をトランスフェクションした細胞に結合した。また、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　２２－４７、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　５７－６６、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　６７－１０５をトランスフェクションした細胞に弱く結合した。
　以上の結果と、実施例１６および実施例１９の結果から、４５４５抗体および８２１３抗体は、ヒトＴＩＭ－３の６７から８７番目のアミノ酸に結合することが示された。さらに、ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　７４－８１をトランスフェクションした細胞に結合しなかったことから、４５４５抗体および８２１３抗体のヒトＴＩＭ－３への結合に必要なアミノ酸が７４番目から８１番目のアミノ酸に含まれていることが示唆された。
　また、５１２抗体は、ヒトＴＩＭ－３の４７番目までのアミノ酸に結合すること、６４４抗体、３４４８２３抗体、および、Ｆ３８－２Ｅ２抗体は、ヒトＴＩＭ－３の５７から６６番目のアミノ酸に結合することが示唆された。
　さらに、４１７７抗体は、４５４５抗体または８２１３抗体は結合する一方、５１２抗体、６４４抗体、３４４８２３抗体、および、Ｆ３８－２Ｅ２抗体は結合しない、ヒトＴＩＭ－３の６７から８７番目のアミノ酸に含まれるアミノ酸のうち、７４から８１番目を除くアミノ酸にも結合することが示唆された。
［実施例３３］
（抗ヒトＴＩＭ－３　８２１３抗体ヒト化抗体の作製）
（１）８２１３抗体ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
　８２１３抗体ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。８２１３抗体ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列（配列番号２１～２３）の移植に適したヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を以下のようにして選択した。
　カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＨをそのアミノ酸配列の相同性からサブグループ（ＨＳＧ　Ｉ～ＩＩＩ）に分類し、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。そこで、ヒト抗体のＶＨのサブグループＩ～ＩＩＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列と８２１３抗体ＶＨのＦＲのアミノ酸配列との相同性検索を実施した。
　相同性を検索した結果、ＨＳＧＩ、ＨＳＧＩＩ、およびＨＳＧＩＩＩの相同性はそれぞれ７７．０％、５５．２％、５８．６％であった。従って、８２１３抗体ＶＨのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩと最も高い相同性を有していた。
　以上の結果から、ヒト抗体のＶＨのサブグループＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、８２１３抗体ＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列（配列番号２１～２３）を移植した。このようにして、配列番号６７で表される抗ヒトＴＩＭ－３　８２１３抗体ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列８２１３抗体ＨＶ０を設計した。
　次に、８２１３抗体ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。８２１３抗体ＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列（配列番号２４～２６）を移植に適したヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を、以下のようにして選択した。
　カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性からサブグループ（ＨＳＧ　Ｉ～ＩＶ）に分類し、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。そこで、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩ～ＩＶの共通配列のＦＲのアミノ酸配列と８２１３抗体ＶＬのＦＲのアミノ酸配列との相同性検索を実施した。
　相同性を検索した結果、ＨＳＧＩ、ＨＳＧＩＩ、ＨＳＧＩＩＩ、およびＨＳＧＩＶの相同性はそれぞれ７６．３％、６１．３％、６１．３％、６８．８％であった。従って、８２１３抗体ＶＬのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩと最も高い相同性を有していた。
　以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、８２１３抗体ＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列（配列番号２４～２６）を移植した。このようにして、配列番号６９で表される抗ヒトＴＩＭ－３　８２１３抗体ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列８２１３抗体ＬＶ０を設計した。
　上記で設計した８２１３抗体ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列８２１３抗体ＨＶ０、およびＶＬのアミノ酸配列８２１３抗体ＬＶ０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に、マウスモノクローナル抗体である８２１３抗体のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列である。
　しかし、一般に、ヒト化抗体を作製する場合には、単にヒト抗体のＦＲへマウス抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を移植するのみでは、結合活性が低下してしまうことが多い。このような結合活性の低下を回避するため、ＣＤＲのアミノ酸配列の移植とともに、ヒト抗体とマウス抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基を改変することが行われている。そこで、本実施例においても、結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を以下のようにして同定し、改変することとした。
　まず、上記で設計した８２１３抗体ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列８２１３抗体ＨＶ０、およびＶＬのアミノ酸配列８２１３抗体ＬＶ０より成る抗体Ｖ領域（以下、ＨＶ０ＬＶ０と表す）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製および三次元構造の表示には、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｓｔｕｄｉｏ（アクセルリス社）を用いた。また、８２１３抗体のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。
　更に、ＨＶ０ＬＶ０のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、８２１３抗体と異なっているアミノ酸残基を選択し、８２１３抗体のアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列を作製し、同様に三次元構造モデルを構築した。これら作製した８２１３抗体、ＨＶ０ＬＶ０および改変体の各Ｖ領域の三次元構造を比較し、抗体の結合活性に影響を与えると予測されるアミノ酸残基を同定した。
　その結果、ＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、
８２１３抗体ＨＶ０では、１２番目のＬｙｓ、２０番目のＶａｌ、３８番目のＡｒｇ、４０番目のＡｌａ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、９８番目のＡｒｇ、および１１３番目のＶａｌを、８２１３抗体ＬＶ０では、１１番目のＬｅｕ、１３番目のＡｌａ、１５番目のＶａｌ、３６番目のＴｙｒ、４３番目のＡｌａ、４４番目のＰｒｏ、４６番目のＬｅｕ、７１番目のＰｈｅ、および８５番目のＴｈｒを、それぞれ選択した。
　これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を８２１３抗体の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ改変し、様々な改変を有するヒト化抗体のＶＨおよびＶＬを設計した。
　具体的には、ＶＨについては、配列番号６７のアミノ酸配列の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、または１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。
　また、ＶＬについては、配列番号６９のアミノ酸配列の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。
　ＨＶ０ＬＶ０のＦＲに存在する、少なくとも１つのアミノ酸残基を改変した８２１３抗体ヒト化抗体の抗体Ｖ領域として、ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ０ＬＶ２、ＨＶ０ＬＶ４、ＨＶ０ＬＶ５、ＨＶ０ＬＶ６、ＨＶ０ＬＶ７、ＨＶ０ＬＶ９、ＨＶ３ＬＶ０、ＨＶ３ＬＶ２、ＨＶ３ＬＶ４、ＨＶ３ＬＶ５、ＨＶ３ＬＶ６、ＨＶ３ＬＶ７、ＨＶ３ＬＶ９、ＨＶ４ＬＶ０、ＨＶ４ＬＶ２、ＨＶ４ＬＶ４、ＨＶ４ＬＶ５、ＨＶ４ＬＶ６、ＨＶ４ＬＶ７、ＨＶ４ＬＶ９、ＨＶ５ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ２、ＨＶ５ＬＶ４、ＨＶ５ＬＶ５、ＨＶ５ＬＶ６、ＨＶ５ＬＶ７、ＨＶ５ＬＶ９、ＨＶ６ＬＶ０、ＨＶ６ＬＶ２、ＨＶ６ＬＶ４、ＨＶ６ＬＶ５、ＨＶ６ＬＶ６、ＨＶ６ＬＶ７、ＨＶ６ＬＶ９、ＨＶ７ＬＶ０、ＨＶ７ＬＶ２、ＨＶ７ＬＶ４、ＨＶ７ＬＶ５、ＨＶ７ＬＶ６、ＨＶ７ＬＶ７、ＨＶ７ＬＶ９、ＨＶ８ＬＶ０、ＨＶ８ＬＶ２、ＨＶ８ＬＶ４、ＨＶ８ＬＶ５、ＨＶ８ＬＶ６、ＨＶ８ＬＶ７、ＨＶ８ＬＶ９、ＨＶ１０ＬＶ０、ＨＶ１０ＬＶ２、ＨＶ１０ＬＶ４、ＨＶ１０ＬＶ５、ＨＶ１０ＬＶ６、ＨＶ１０ＬＶ７、ＨＶ１０ＬＶ９、ＨＶ１２ＬＶ０、ＨＶ１２ＬＶ２、ＨＶ１２ＬＶ４、ＨＶ１２ＬＶ５、ＨＶ１２ＬＶ６、ＨＶ１２ＬＶ７、およびＨＶ１２ＬＶ９をそれぞれ設計した。
　Ｈ鎖可変領域ＨＶ３、ＨＶ４，ＨＶ５，ＨＶ６、ＨＶ７、ＨＶ８，ＨＶ１０、ＨＶ１２、およびＬ鎖可変領域ＬＶ２、ＬＶ４、ＬＶ５、ＬＶ６、ＬＶ７、ＬＶ９のアミノ酸配列をそれぞれ図１および２に示した。
（２）８２１３抗体ヒト化抗体の作製
　８２１３抗体ヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、８２１３抗体ＶＨおよび８２１３抗体ＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号２７、２９）で用いられているコドンを利用して設計し、アミノ酸改変を行う場合には、哺乳動物細胞で高頻度で使用されるコドンを用いて設計し、各々作製した。
　これらＤＮＡ配列を用いて、抗体発現ベクターの構築およびヒト化抗体の発現を行った。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１０年６月１１日付で出願された米国仮出願（６１／３５３８３６）に基づいており、その全体が引用により援用される。
　本発明によれば、ヒトＴＩＭ－３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合し、かつＡＤＣＣ活性を発揮するモノクローナル抗体又はその抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマ又は該形質転換体を用いる抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする、治療薬及び診断薬を提供することができる。
配列番号１：Ｈｕｍａｎ４５４５　Ｈ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２：Ｈｕｍａｎ４５４５　Ｈ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３：Ｈｕｍａｎ４５４５　Ｈ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４：Ｈｕｍａｎ４５４５　Ｌ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５：Ｈｕｍａｎ４５４５　Ｌ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６：Ｈｕｍａｎ４５４５　Ｌ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１：Ｈｕｍａｎ４１７７　Ｈ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１２：Ｈｕｍａｎ４１７７　Ｈ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１３：Ｈｕｍａｎ４１７７　Ｈ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１４：Ｈｕｍａｎ４１７７　Ｌ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１５：Ｈｕｍａｎ４１７７　Ｌ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１６：Ｈｕｍａｎ４１７７　Ｌ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２１：Ｍｏｕｓｅ８２１３　Ｈ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２２：Ｍｏｕｓｅ８２１３　Ｈ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２３：Ｍｏｕｓｅ８２１３　Ｈ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２４：Ｍｏｕｓｅ８２１３　Ｌ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２５：Ｍｏｕｓｅ８２１３　Ｌ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２６：Ｍｏｕｓｅ８２１３　Ｌ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３１：プライマー　ＴＩＭ－３　Ｆｗ２の塩基配列
配列番号３２：プライマー　ＴＩＭ－３　Ｒｅ２の塩基配列
配列番号３３：プライマー　ｐＭＣｓ－Ｆｗの塩基配列
配列番号３４：プライマー　ＴＩＭ３ＥＤ－ＦｃＲｅＸｂａの塩基配列
配列番号３５：プライマー　Ｔ７の塩基配列
配列番号３６：プライマー　ｈＴＩＭ－３　Ｆｗ１の塩基配列
配列番号３７：インサート　ｈＴＩＭ－３　ＥＣＤ　Ｆｃ　ｆｕｓｉｏｎの塩基配列
配列番号３８：インサート　ｈＴＩＭ－３　ＥＣＤ　Ｆｃ　ｆｕｓｉｏｎのアミノ酸配列
配列番号３９：プライマー　ＴＩＭ３ＥＤ－ＦＬＡＧ４ａａの塩基配列
配列番号４０：プライマー　Ｃ－ＦＬＡＧ－ＮｏｔＲ２の塩基配列
配列番号４１：プライマー　ＢＧＨ－Ｒの塩基配列
配列番号４２：インサート　ｈＴＩＭ－３　ＥＣＤの塩基配列
配列番号４３：インサート　ｈＴＩＭ－３　ＥＣＤのアミノ酸配列
配列番号４４：プライマー　ｈｈ－６の塩基配列
配列番号４５：プライマー　ｈｈ－３の塩基配列
配列番号４６：プライマー　ｈｋ－２の塩基配列
配列番号４７：プライマー　ｈｋ－６の塩基配列
配列番号４８：プライマー　ｍＨ＿Ｒｖ１の塩基配列
配列番号４９：プライマー　ｍＨ＿Ｒｖ２の塩基配列
配列番号５０：プライマー　ｍＫ＿Ｒｖ１の塩基配列
配列番号５１：プライマー　ｍＫ＿Ｒｖ２の塩基配列
配列番号６６：８２１３抗体　ＨＶ０可変領域の塩基配列
配列番号６７：８２１３抗体　ＨＶ０可変領域のアミノ酸配列
配列番号６８：８２１３抗体　ＬＶ０可変領域の塩基配列
配列番号６９：８２１３抗体　ＬＶ０可変領域のアミノ酸配列
配列番号７０：プライマー　ｍＴｉｍ－３　Ｆｗ３の塩基配列
配列番号７１：プライマー　ｍＴｉｍ－３　Ｒｅ３の塩基配列
配列番号７２：プライマー　ｍＴｉｍ－３　Ｆｗ４ＮｏｔＩの塩基配列
配列番号７３：プライマー　ｍＴｉｍ－３　Ｒｅ４ＮｏｔＩの塩基配列
配列番号７４：プライマー　ｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｖｅｃＲ１の塩基配列
配列番号７５：プライマー　ｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｖｅｃＦ１の塩基配列
配列番号７６：プライマー　ｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｉｎｓＦ１の塩基配列
配列番号７７：プライマー　ｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｉｎｓＲ１の塩基配列
配列番号７８：インサート　ＩｇＶ　ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号７９：インサート　ＩｇＶ　ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列
配列番号８０：プライマー　ｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｖｅｃＲ２の塩基配列
配列番号８１：プライマー　ｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｖｅｃＦ２の塩基配列
配列番号８２：プライマー　ｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｉｎｓＦ２の塩基配列
配列番号８３：プライマー　ｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｉｎｓＲ２の塩基配列
配列番号８４：インサート　Ｍｕｃｉｎ　ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号８５：インサート　Ｍｕｃｉｎ　ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ－３／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列
配列番号８６：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２－４７Ｆ１の塩基配列
配列番号８７：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２－４７Ｒ１の塩基配列
配列番号８８：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２－４７Ｆ２の塩基配列
配列番号８９：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２－４７Ｒ２の塩基配列
配列番号９０：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２－４７Ｆ３の塩基配列
配列番号９１：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２－４７Ｒ３の塩基配列
配列番号９２：インサート　ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　２２－４７／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号９３：インサート　ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　２２－４７／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列
配列番号９４：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ５７－６６Ｆの塩基配列
配列番号９５：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ５７－６６Ｒの塩基配列
配列番号９６：インサート　ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　５７－６６／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号９７：インサート　ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　５７－６６／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列
配列番号９８：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７－１０５Ｆの塩基配列
配列番号９９：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７－１０５Ｒの塩基配列
配列番号１００：プライマー　ｍＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７－１０５Ｆの塩基配列
配列番号１０１：プライマー　ｍＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７－１０５Ｒの塩基配列
配列番号１０２：インサート　ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　６７－１０５／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号１０３：インサート　ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　６７－１０５／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列
配列番号１０４：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ７４－８１Ｆの塩基配列
配列番号１０５：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ７４－８１Ｒの塩基配列
配列番号１０６：インサート　ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　７４－８１／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号１０７：インサート　ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　７４－８１／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列
配列番号１０８：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ８８－９６Ｆの塩基配列
配列番号１０９：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ８８－９６Ｒの塩基配列
配列番号１１０：インサート　ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　８８－９６／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号１１１：インサート　ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　８８－９６／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列
配列番号１１２：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ９６－１０５Ｆの塩基配列
配列番号１１３：プライマー　ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ９６－１０５Ｒの塩基配列
配列番号１１４：インサート　ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　９６－１０５／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号１１５：インサート　ＴＩＭ－３　ｃｈｉｍｅｒａ　９６－１０５／ｐＥＦ６　Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列

Claims (23)

  1. 　以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）から選ばれる１の抗体と競合してヒトＴＩＭ－３の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又は該抗体断片。
    （ｉ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１～３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号４～６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
    （ｉｉ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１１～１３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１４～１６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
    （ｉｉｉ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号２１～２３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号２４～２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
  2. 　前記（ｉ）～（ｉｉｉ）から選ばれる１の抗体と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
  3. 　以下の（ａ）または（ｂ）の抗体と、競合してヒトＴＩＭ－３の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又は該抗体断片。
    （ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含む抗体
    （ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含む抗体
  4. 　前記（ａ）または（ｂ）の抗体と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である、請求項３に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
  5. 　遺伝子組換え抗体である、請求項１～４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
  6. 　ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項５に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
  7. 　以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）から選ばれる１のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
    （ｉ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１～３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号４～６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片。
    （ｉｉ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１１～１３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１４～１６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片。
    （ｉｉｉ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号２１～２３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号２４～２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片。
  8. 　以下の（ａ）または（ｂ）であるモノクローナル抗体及び該抗体断片。
    （ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体及び該抗体断片。
    （ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体及び該抗体断片。
  9. 　配列番号５３で表されるヒトＴＩＭ－３のＩｇＶドメインのアミノ酸配列のうち、６７番から１０５番目のアミノ酸配列、６７番から９６番目のアミノ酸配列または６７番から８７番目のアミノ酸配列に結合するモノクローナル抗体および該抗体断片。
  10. 　Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体断片。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ。
  12. 　請求項１１に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
  13. 　請求項１２に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
  14. 　請求項１３に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
  15. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いるヒトＴＩＭ－３の免疫学的検出又は測定方法。
  16. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を含むヒトＴＩＭ－３の検出又は測定用試薬。
  17. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を含むヒトＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の診断薬。
  18. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いてヒトＴＩＭ－３陽性細胞を検出又は測定することを含む、ヒトＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の診断方法。
  19. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いてヒトＴＩＭ－３を検出又は測定することを含む、ヒトＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の診断方法。
  20. 　ヒトＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の診断薬を製造するための、請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の使用。
  21. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を含むヒトＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の治療薬。
  22. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いてヒトＴＩＭ－３陽性細胞の細胞死を誘導することを含む、ヒトＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の治療方法。
  23. 　ヒトＴＩＭ－３陽性細胞が関与する疾患の治療薬を製造するための、請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の使用。
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