WO2008018448A1 - Activateur comprenant un bio-tensioactif comme ingrédient actif, un mannosyl érythritol lipide et son procédé de préparation - Google Patents

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Michiko Suzuki
Masaru Kitagawa
Shuhei Yamamoto
Atsushi Sogabe
Dai Kitamoto
Tomotake Morita
Tokuma Fukuoka
Tomohiro Imura
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Toyo Boseki Kabushiki Kaisha
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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    • C11D1/66—Non-ionic compounds
    • C11D1/662—Carbohydrates or derivatives

Definitions

  • the present invention relates to an activator comprising a biosurfactant as an active ingredient, and particularly contains a biosurfactant that activates various cells and is effective in preventing aging, hair growth and hair loss. It relates to cosmetics, quasi-drugs, pharmaceuticals, and food and drinks.
  • the present invention also relates to a novel mannosyl erythritol lipid (hereinafter sometimes simply referred to as MEL) and a method for producing the same, and more specifically, MEL which is a kind of microorganism-produced glycolipid having a molecular structure. It relates to MEL whose mannosylerythritol skeleton is l-O- ⁇ -D-mannobiranosyl- meso-erythritol and its microbial production method.
  • MEL mannosylerythritol skeleton is l-O- ⁇ -D-mannobiranosyl- meso-erythritol and its microbial production method.
  • the skin is composed of epidermal cells, fibroblasts, and extracellular matrices such as elastin and collagen that support these extracellular skin structures.
  • extracellular matrices such as elastin and collagen that support these extracellular skin structures.
  • moisture retention, flexibility, and elasticity are ensured by maintaining the homeostasis of the interaction between these skin tissues, and the skin has a firmness and wrinkles in appearance, and is maintained in a fresh state.
  • the extracellular matrix and fibroblast function are particularly weakened.
  • the skin's flexibility and moisturizing function are reduced, and the skin loses its habit and becomes rough. Aging symptoms such as wrinkles and dullness occur.
  • Patent Document 5 Extracts of Puri, Sohakuhi, Tounin, Carrot, Hop, Mukuge, Kyo-inin (Patent Document 5, Patent Document 6), Ginger Family Tucum (Patent Document 7), Hanasuri Family Hanayasuri (Patent Document 8), etc. are known. It has been. Some of these are used in quasi-drugs and cosmetics as activators and anti-aging agents, but no activators or anti-aging agents that exhibit satisfactory effects have been obtained.
  • Mannosyl erythritol lipid is a natural surfactant produced by yeast, and various physiological effects have been reported (Non-patent Document 1). Recently, mannitol erythritol lipid has been replaced by mannitol. Lipid (MMU has been found! /, Ru (Patent Document 9). Anti-inflammatory and anti-allergic agents (Patent Document 10), hair nourishing and hair restorer (Patent Document 9) It is known for its usefulness as 11), antibacterial action (Patent Document 12), and surface tension lowering action (Patent Document 13).
  • biosurfactants such as glycolipids are said to have novel physiological functions that are highly biodegradable, have low toxicity, and are friendly to the environment. Because of these properties, the wide application of biosurfactants in the food industry, cosmetics industry, pharmaceutical industry, chemical industry, environmental fields, etc. has both the realization of a sustainable society and the provision of high-performance products. It is extremely meaningful.
  • MEL glycolipid biosurfactant
  • Ustilago nuda and Shizonella melanogramma see Non-Patent Documents 2 and 3
  • Candida yeasts see Patent Document 14 and Non-Patent Document 4
  • Candida antarctica currently Pseudozyma antarctica
  • Kurtzmanomyces see Non-Patent Document 7
  • other yeasts At present, it is possible to produce over 300g / L by continuous cultivation and production for a long time.
  • Patent Document 1 Japanese Published Patent Publication "JP-A 62-84024”
  • Patent Document 2 Japanese Published Patent Publication “Japanese Unexamined Patent Publication No. 63-188697”
  • Patent Document 3 Japanese Patent Publication “JP-A-03-141299”
  • Patent Document 4 Japanese Published Patent Publication “JP 10-45615 A”
  • Patent Document 5 Japanese Patent Publication “Japanese Patent Laid-Open No. 10-036279”
  • Patent Document 6 Japanese Patent Publication “JP-A-10-36279”
  • Patent Document 7 Japanese Patent Publication “JP 2004-75632 A”
  • Patent Document 8 Japanese Patent Publication “JP 2005-89375”
  • Patent Document 9 Japanese Patent Publication “JP 2005-104837”
  • Patent Document 10 Japanese Published Patent Publication “JP 2005-68015 Publication”
  • Patent Document 11 Japanese Published Patent Publication “Japanese Patent Laid-Open No. 2003-261424”
  • Patent Document 12 Japanese Patent Publication “JP-A 57-145896”
  • Patent Document 13 Japanese Patent Publication “JP-A-61-205450”
  • Patent Document 14 Japanese Patent Publication “Japanese Patent Publication No.57-145896”
  • Non-patent literature 1 Journal of Bioscience and Bioengineering,
  • Non-Patent Document 2 R. H. Haskins, J. A. Thorn, B. Boothroyd, Can. J. Microbiol., Vol 1, p749-756, 1955.
  • Non-Patent Document 3 G. Demi, T. Anke, F. Oberwinkler, B. M. Giannetti, W. Steglich, Phytochemistry, Vol 19, p83-87, 1980.
  • Non-Patent Document 4 T. Nakahara, H. Kawasaki, T. Sugisawa, Y. Takamori, T. Tabuchi, J. Ferment. Technol. Vol61, pl9_23, 1983.
  • Non-Patent Document 5 D. Kitamoto, S. Akiba, C. Hioki, T. Tabuch, Agric. Biol. Chem., Vol 54. P31-36, 1990.
  • Non-Patent Document 6 H.-S. Kim, B.-D. Yoon, D.-H. Choung, H.-M. Oh, T. Katsuragi, Y. Tani, Appl. Microbiol. Biotechnol., Springer- Verlag, Vol52, p713_721, 1999.
  • Non-Patent Document 7 K. kakukawa, M. Tamai,. Imamura,. Miyamoto, S. Miyoshi, Y. Morinaga, O. Suzuki, T. Miyakawa, Biosci. Biotechnol. Biochem., V0I66, pl88_191, 2002.
  • Non-Patent Document 8 D. Crich, MA Mora, R. Cruz, Tetrahedron, Elsevier, Vol58, p35- 4, 4, 2002.
  • Non-Patent Literature 9 Dai Kitamoto “Oleoscience” (Japan), Japan Oil Chemists' Society, Vol. 3, p663-672 (2003).
  • Non-Patent Document 10 T. Imura, N. Ohta,. Inoue, N. Yagi, H. Negishi, H. Yanagishita, D. itamoto, Chem. Eur. J, Wiley, Voll2, p2434- 2440, 2006.
  • an object of the present invention is to provide an activator and an anti-aging agent that have excellent safety and anti-aging effects on cells, and have safety sufficient to withstand long-term use.
  • Cosmetics with the active ingredient as quasi-drugs, pharmaceuticals, food and drinks.
  • MEL is not only excellent in productivity and interface physical properties, but also has been developed for various uses utilizing unique self-assembly properties and physiological activities.
  • MEL has been reported to have various physiological activities including antibacterial, antitumor and glycoprotein binding ability (Non-patent Document 9).
  • MEL has extremely unique self-assembly properties, and attempts have been made to develop ribosome materials and liquid crystal technology using them. It has also been reported to have an impact (Non-Patent Documents 9 and 10). [0014] Therefore, it is expected that the production of MEL optical isomers that have been conventionally known in large quantities, and their physical property comparison and functional evaluation will greatly contribute to the development of MEL applications.
  • the non-patent document 8 describes a force S that describes that MEL having an l-O- ⁇ -D-mannobilanosyl-meso erythritol structure was obtained by chemical synthesis, This was the synthesis of a single MEL through a very complicated and complicated process, and it was difficult to use because of its versatility.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems, and an object of the present invention is a conventional MEL having a 40 ⁇ -D-mannobilanosyl-meso erythritol structure.
  • an object of the present invention is a conventional MEL having a 40 ⁇ -D-mannobilanosyl-meso erythritol structure.
  • it is to provide a MEL having l-O-0-D-mannobilanosyl-meso-erythritol structure, which is an optical isomer thereof, and a method for producing the same.
  • MEL and triacinole MEL are effective in activating cells, and have completed the present invention.
  • the inventors of the present invention have developed a conventional MEL having a 4 O—13 D mannobilanosyl-meso erythritol structure (hereinafter referred to as “conventional MEL” or “4-O”).
  • MEL (which may also be referred to as“ MEL ”), which is an optical isomer of L-O ⁇ -D-mannobilanosyl-meso MEL having an erythritol structure (hereinafter referred to as“ MEL of the present invention ”or“ 1) -O-MELj may be referred to)
  • MEL of the present invention or“ 1) -O-MELj may be referred to
  • the present invention has been completed by finding a microorganism producing 1), that is, the present invention includes the following inventions.
  • An activator comprising a biosurfactant as an active ingredient.
  • An anti-aging agent comprising the activator according to any one of (1) to (3) as an active ingredient.
  • An external preparation comprising the hair-restoring agent according to (5) as an active ingredient.
  • a cosmetic comprising the hair restorer according to (5) as an active ingredient.
  • a quasi-drug containing the hair-restoring agent according to (5) as an active ingredient is provided.
  • a pharmaceutical comprising the hair restorer according to (5) as an active ingredient.
  • the substituent R 1 may be the same or different and may be an aliphatic asil group having 4 to 24 carbon atoms
  • the substituent R 2 may be the same or different and may be hydrogen or acetyl
  • the substituent R 3 represents hydrogen or an aliphatic acyl group having 2 to 24 carbon atoms, provided that both substituents are aliphatic acyl groups having 12 carbon atoms, and both substituents R 2 are Excluding acetyl groups in which the substituent R 3 is hydrogen.
  • the substituent R 3 is an aliphatic acyl group having 2 to 24 carbon atoms. Characterized in (11) or (12) characterized (;
  • the substituent R 1 may be the same or different and is an aliphatic asil group having 4 to 24 carbon atoms
  • the substituent R 2 may be the same or different and is hydrogen or acetyl
  • the substituent R 3 represents hydrogen or an aliphatic acyl group having 2 to 24 carbon atoms.
  • the biosurfactant used as an active ingredient of the activator according to the present invention has a significant activation effect on various cells. Therefore, the activator according to the present invention exhibits excellent effects as an anti-aging agent and a hair restorer.
  • biosurfactant is a biologically derived natural surfactant, it is excellent in safety, and the activator according to the present invention has an effect that it can sufficiently withstand long-term use.
  • biosurfactants can be produced by culturing microorganisms, raw material costs are low, and mass production is possible. Therefore, the activator according to the present invention has an effect that it can be provided at a low price.
  • the MEL of the present invention is a conventionally known optical isomer of MEL.
  • the difference in molecular chirality has a great influence on the physiological activity and ability to form self-assemblies, so that it exhibits different behavior in other properties even though there is no difference in surface activity from conventional MEL. Become. Therefore, using the MEL according to the present invention, it is possible to greatly contribute to the development of MEL applications by comparing the physical properties with the conventional MEL and performing the function evaluation. In particular, the MEL according to the present invention is effective when it has a liquid crystal forming ability different from that of the conventional MEL.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of examining the cell activation effect of MEL (MEL-A produced from soybean oil as a raw material) using normal human skin fibroblasts.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of examining the cell activation effect of MEL (MEL-A produced from soybean oil as a raw material) using human hair hair papilla cells.
  • FIG. 3 Results of cell activation of triacyl MEL using normal human skin fibroblasts (triacyl MEL-A with oleic acid added to the hydroxyl group of erythritol of MEL-A produced from soybean oil) It is a graph which shows.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of thin layer chromatography on the culture of Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 strain.
  • FIG. 5 shows the results of high performance liquid chromatography analysis of a culture of Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 strain.
  • FIG. 6 is a view showing the results of thin-layer chromatography for a culture of Pseudozyma crassa CBS 9959 strain.
  • FIG. 8 Enlargement of the sugar skeleton in the 1 H-NMR spectrum of mannosyl erythritol synthesized from MEL produced by Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 and Pseudozyma antarctica KM-34 (FERMP-20730). It is a figure (3-3-4 ⁇ 2ppm)
  • FIG. 9 An enlarged view of the sugar skeleton (3.4-45.7 ppm) in the 1 H-NMR spectrum of MEL produced by Pseudozyma crassa CBS 9959.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of observation with a polarizing microscope of the liquid crystal forming ability of the MEL produced by Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 strain and Pseudozyma antarctica KM-34 (FERMP-20730) strain by the water intrusion method.
  • FIG. ll This figure shows the results of phase contrast microscopic observation of the liquid crystal forming ability of the MEL produced by Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 and Pseudozyma antarctica KM-34 (FERMP-20730) by the water intrusion method. .
  • FIG. 12 is an enlarged view (3.4 to 5.7 ppm) of a 1 H—N MR spectrum and a sugar skeleton of triacyl MEL produced by Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 strain.
  • FIG. 13 is an enlarged view (3.0 to 5.7 ppm) of 1 H-NMR spectrum and sugar skeleton of triacyl MEL produced by Pseudozyma hubeiensis.
  • FIG. 14 is a diagram showing lipid domain analysis results by HPLC (ODS) —MS analysis of MEL produced by Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 strain.
  • FIG. 15 Lipid domain analysis results by HPLC (ODS) -MS analysis of triacinole MEL produced by Pseudozyma hubeiensis.
  • activation is intended to maintain or enhance cell function or cell activity. As a result, it is possible to suppress a decrease in cell function and cell activity, that is, to suppress cell aging. Therefore, “activator” is synonymous with “cell activator” and has utility as “anti-aging agent”.
  • activator is synonymous with “cell activator” and has utility as “anti-aging agent”.
  • activation, anti-aging in skin cells refers to the reduction of skin cell functions associated with the accumulation of structural changes in the underlying membrane due to aging and photoaging, thereby reducing wrinkles and sagging in the skin. This refers to the prevention and improvement of curing, etc., and maintaining the skin's elasticity and youthful healthy skin.
  • dermal papilla cells or hair matrix cells it is possible to maintain the hair cycle and suppress hair loss by reducing the functional degradation of dermal papilla cells or hair matrix cells due to aging, stress, and hormone balance. pointing.
  • Biosurfactant is a general term for substances having surface-active ability and emulsifying ability produced by living organisms. It has excellent surface activity, high biodegradability, power, and various physiological functions that can be overcome. Therefore, it may develop behavior / function different from those of synthetic surfactants. Note that noosafatatant can be produced in large quantities by culturing microorganisms and may be used as a premix product.
  • the "premix product” is a product obtained by adding a dispersing agent or the like in addition to a functional material, or diluting with a solvent so that it can be used when making cosmetics.
  • biosurfactants include mannosyl erythritol lipid (MEL), mannosyl mannitol lipid (MMU, trehalose lipid, rhamnolipid, sophorolipid, sulfatatin, spiculsporic acid, emalzan, and the like.
  • MEL mannosyl erythritol lipid
  • MMU mannosyl mannitol lipid
  • trehalose lipid rhamnolipid
  • sophorolipid sophorolipid
  • sulfatatin spiculsporic acid
  • emalzan and the like.
  • MEL and MML are particularly preferable because it is preferable to use a biosurfactant that forms a lamellar structure.
  • Equation (2) shows the structure of MEL-A.
  • R1 and R2 represent a hydrocarbon group. That is, MEL-A is a compound having an alkanoyl group having 5 to 19 carbon atoms at the 2nd and 3rd positions of mannose and the acetyl group at the 4th and 6th positions of mannose in the formula (2).
  • MEL-B the 4-position acetyl group (CH 2 CO 3) of mannose in formula (2) is H
  • MEL-C is mannose in formula (2).
  • the 6-position acetyl group (CH 2 CO 3) is H, and MEL—D is mannose in formula (2)
  • the acetyl group (CH 2 CO 3) at positions 4 and 6 of the carbon is also H.
  • R1 and R2 represent a hydrocarbon group.
  • formula (3) either the 4-position or 6-position acetyl group (CH 2 CO 3) of mannose, or
  • the biosurfactant used in the activator according to the present invention may be a MEL triacinole or MML triacyl.
  • Triacyl biosurfactant is a biosurfactant with a novel structure that has higher hydrophobicity than MEL and MML. For example, when a large amount is obtained from other than the culture solution of MEL-producing bacteria, it can be produced by reacting MEL with various vegetable oils using enzymes.
  • Rl, R2 and R3 each independently represent a hydrocarbon group or an oxygen atom-containing hydrocarbon group, and one or both of the hydroxyl groups at the 4-position and 6-position of mannose.
  • An atom is replaced by a acetyl group! /, Or even! /.
  • the hydrocarbon group may have only a saturated bond or an unsaturated bond. When it has an unsaturated bond, it may have a plurality of double bonds.
  • the carbon chain may be linear or branched.
  • the number and position of oxygen atoms contained are not limited.
  • Rl and R2 have an ester bond with a hydroxyl group at the 2nd and 3rd positions of mannose as an aliphatic asil group (RCO 1) preferably having 6 to 20 carbon atoms.
  • the remaining hydroxyl groups are ester-bonded with acetyl groups! /!
  • R3 preferably has 6 to 20 carbon atoms, and has an ester bond with the primary hydroxyl group of erythritol as an aliphatic acyl group (RCO—).
  • Triacyl MEL is a structure to which a fatty acid ester is added and has high hydrophobicity. Therefore, Triacyl MEL is superior as a emollient agent to various oil components in comparison with conventional MEL.
  • biosurfactants may be used alone, or two or more biosurfactants may be used in combination.
  • a method for producing a biosurfactant is not particularly limited, but a fermentation method using a known biosurfactant producing microorganism may be arbitrarily selected.
  • MEL can be produced by culturing Pseudozyma antarctica NBRC 10736 according to conventional methods.
  • MEL-producing microorganisms Candida ant arctica, Candida sp., Etc. can be used in addition to the above. It is well known to those skilled in the art that MEL can be easily obtained by culturing these microorganisms.
  • the biosurfactant-producing microorganism is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • Fermentation media for producing biosurfactant include yeast extract, N sources such as peptone, c sources such as glucose and fructose, and sodium nitrate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate heptahydrate, etc.
  • a medium having a general composition composed of inorganic salts can be used, and oils such as olive oil, soybean oil, sunflower oil, corn oil, canola oil, coconut oil, and carbonized liquid paraffin, tetradecane, etc.
  • a water-insoluble substrate such as hydrogen can be used alone or with two or more added.
  • Fermentation conditions such as pH and temperature, culture time, and the like can be arbitrarily set, and the culture solution after fermentation can be used as it is as the biosurfactant of the present invention.
  • any operation such as filtration, centrifugation, extraction, purification, sterilization, etc., to the cultured broth after fermentation, and the obtained extract can be diluted, concentrated and dried. it can.
  • Vegetable oils are preferred as the oils and fats used as raw materials. Vegetable fats and oils are not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include soybean oil, rapeseed oil, corn oil, peanut oil, cottonseed oil, safflower oil, sesame oil, olive oil, and palm oil. Among these, soybean oil is a biosurfactant (especially MEL) production efficiency (especially MEL). Production volume, production speed, and yield) are particularly preferable in that they can be improved. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the inorganic nitrogen source is not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include ammonium nitrate, urea, sodium nitrate, ammonium chloride, ammonium sulfate and the like.
  • the method of recovering and purifying the nosulfatant there are no particular restrictions on the method of recovering and purifying the nosulfatant, and it can be appropriately selected according to the purpose. For example, it can be recovered by centrifuging the culture solution to recover the oil, and extracting and concentrating with an organic solvent such as ethyl acetate.
  • Examples of the extraction solvent include water, alcohols (for example, methanol, absolute ethanol, ethanol) Lower alcohols such as alcohol, or polyhydric alcohols such as propylene glycol and 1,3-butylene glycolol), ketones such as acetone, esters such as jetyl ether, dioxane, acetonitrile, and ethyl acetate, xylene and benzene
  • alcohols for example, methanol, absolute ethanol, ethanol
  • Lower alcohols such as alcohol, or polyhydric alcohols such as propylene glycol and 1,3-butylene glycolol
  • ketones such as acetone
  • esters such as jetyl ether, dioxane, acetonitrile, and ethyl acetate
  • xylene and benzene an organic solvent such as black mouth form can be used alone or in combination of two or more kinds, and a combination of each solvent extract can also be used.
  • the extraction method is not particularly limited, but it is usually within the range of the boiling point of the solvent from room temperature to normal pressure.
  • filtration or ion exchange resin is used to perform purification by adsorption or decolorization.
  • the solution, paste, gel, and powder may be used. In many cases, it can be used as it is, but if necessary, further purification treatment such as deodorization and decolorization may be added as long as the effect is not affected.
  • a purification treatment means such as deodorization and decolorization, an ordinary means generally applied depending on an extractable substance using an activated carbon column or the like may be arbitrarily selected. If necessary, it is possible to obtain a high purity / biosurfactant by purifying using a silica gel column.
  • the triacyl MEL fraction in order to obtain triacyl MEL, can be purified from a culture solution produced by fermenting a microorganism as described above. To obtain a large amount, dissolve MEL in an organic solvent, add a fatty acid derivative such as vegetable oil, and perform esterification or transesterification in the presence of hydrolase.
  • a fatty acid derivative such as vegetable oil
  • the fatty acid introduced into the erythritol part of MEL may be a long-chain hydrocarbon monovalent carboxylic acid. Further, it may be a saturated fatty acid or an unsaturated fatty acid. In the case of an unsaturated fatty acid, it may have a plurality of double bonds.
  • the carbon chain may be linear or branched.
  • a fatty acid derivative that is a derivative of a fatty acid may be used in the present invention, or a mixture of a fatty acid and a fatty acid derivative may be used in the present invention.
  • the fatty acid or fatty acid derivative introduced into the erythritol part of MEL is preferably derived from oils, higher fatty acids and synthetic esters.
  • the "oils” may be vegetable oils, animal oils, mineral oils and hardened oils thereof.
  • liquid oil examples include liquid oil, mineral oil such as petrolatum, and synthetic triglycerin such as glycerin tripalmitate.
  • mineral oil such as petrolatum
  • synthetic triglycerin such as glycerin tripalmitate.
  • avocado oil olive oil, sesame oil, camellia oil, evening primrose oil, turtle oil, macadamian nut oil, corn oil, mink oil, rapeseed oil, egg yolk oil, persic oil, wheat germ oil, southern power oil, castor oil, Amani oil, safflower oil, cottonseed oil, eno oil, soybean oil, peanut oil, tea seed oil, cacao oil, rice bran oil, more preferably olive oil and soybean oil.
  • Examples of the "higher fatty acids” include caproic acid, strong prillic acid, strong purine acid, lauric acid, myristic acid, normitic acid, oleic acid, linolenolic acid, linolenic acid, stearic acid, behenic acid, Examples include 12-hydroxystearic acid, isostearic acid, undesic acid, tonoleic acid, eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, and the like.
  • lauric acid myristic acid, palmitic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, stearic acid and undecylenic acid, and more preferred are oleic acid, linoleic acid and undecylenic acid.
  • Examples of the "synthetic ester” include, for example, methyl methyl proproate, methyl caprylate, methyl methyl purinate, methyl laurate, methyl myristate, methyl palmitate, methyl oleate, methyl linoleate, methyl linolenate, Methyl stearate, methyl undecinate, ethyl caproate, ethyl caprylate, ethyl ethyl caprate, ethyl laurate, ethyl myristate, ethyl ethyl palmitate, ethyl ethyl oleate, ethyl linoleate, ethyl linolenate, ethyl stearate , Undecyl ethyl, caproic acid bulle, caprinolic acid bulle, strong purine bule, lauric acid bure, my
  • triacyl MEL can be produced by dissolving and reacting MEL in an organic solvent.
  • the organic solvent is not limited as long as it can solubilize MEL. What is necessary is just to be able to solubilize a part even if not all can be solubilized.
  • the organic solvent may be a mixture of a plurality of organic solvents.
  • Acetone, tetrahydrofuran, tertiary butanol, acetonitrile, and dioxane are preferable, and acetone is more preferable.
  • hydrolases examples include lipases, proteases, and esterases. A plurality of hydrolases that preferably use at least one selected from these may be used. Lipase and esterase are preferable, and lipase is more preferable.
  • MEL purified from the culture solution of MEL-producing microorganisms is dissolved in an organic solvent (for example, acetone), and commercially available lipase (for example, Novozym 435 (manufactured by Novozymes), etc.) And add vegetable oil.
  • an organic solvent for example, acetone
  • commercially available lipase for example, Novozym 435 (manufactured by Novozymes), etc.
  • the reaction temperature is 10 to 100 ° C, preferably 20 to 50 ° C, more preferably 25 to 40 ° C, and the mixture may be stirred for 1 to 7 days.
  • molecular sieves may be added to the reaction solution.
  • the biosurfactant obtained as described above can be used as an activator as it is. It is preferable to use the biosurfactant in a cosmetic, quasi-drug, pharmaceutical, or food product.
  • the concentration of biosurfactant is the degree of absorption, degree of action, product It is appropriately selected depending on the form, frequency of use, etc., and is not particularly limited. Usually, 0.00;! To 50% by mass is preferable to the total weight of the activator that should be selected within the range that does not impair the cell activation effect. 0;; ! To 15% by mass is more preferable 3 to 10% by mass is particularly preferable.
  • the use form of the biosurfactant to be blended in the activator is arbitrary.
  • it may be used after the oxafatatant is extracted from the culture broth, or after it has been purified, purified or suspended in water, or dissolved in an organic solvent such as ethanol.
  • the method for producing the activator according to the present invention using no-surfatantant is not particularly limited,
  • biosurfactant is highly hydrophobic, and therefore, nonionic surfactant, lower alcohol, It is preferably used by dissolving in polyhydric alcohol or natural oils such as olive oil, squalane, fatty acid and the like.
  • nonionic surfactant examples include sorbitan fatty acid esters (for example, sorbitan monooleate, sorbitan monoisostearate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate, sorbitan monostearate, sorbitan).
  • sorbitan fatty acid esters for example, sorbitan monooleate, sorbitan monoisostearate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate, sorbitan monostearate, sorbitan).
  • glycerin polyglycerin fatty acids eg mono cottonseed oil fatty acid glycerin, Glyceryl monoellate, glyceryl sesquioleate
  • hydrophilic hydrophilic nonionic surfactant examples include ⁇ -sorbitan fatty acid esters (for example, ⁇ -sorbitan monooleate, ⁇ -sorbitan monostearate, ⁇ -sorbitan monooleate, ⁇ -Sorbitan tetraoleate, etc.) ⁇ ⁇ Sorbit fatty acid esters (eg, ⁇ -Sorbit monolaurate, ⁇ -Sol) Bit monooleate, POE sorbit pentaoleate, POE sorbite monostearate, etc .; POE glycerin fatty acid esters (eg POE glycerin monostearate, POE glycerin monoisostearate, POE glycerin triisostearate, etc.) POE fatty acid esters (eg, POE distearate, POE monodiolate, ethylene glycol distearate); POE alkynole ethers (
  • Tetra POP ethylenediamin condensates eg Tetronic etc.
  • POE Castor oil hardened castor oil derivatives eg POE castor oil, POE hardened castor oil, POE hardened castor oil monoisostearate, POE hardened castor oil triisostearate, POE hardened castor oil monopyroglutamic acid monoisostearic acid diester, POE Hardened castor oil maleic acid, etc.
  • POE beeswax 'lanolin derivatives eg POE sorbite beeswax etc.
  • Alcohol noramide eg coconut oil fatty acid diethanolamide, lauric acid monoethanolamide, fatty acid isopropanolamide, etc.
  • POE propylene Glycol fatty acid ester POE -Alkylamines
  • POE fatty acid amides sucrose fatty acid esters; alkyl ethoxy dimethylamine oxides;
  • Examples of the lower alcohol include ethanol, propanol, isopropanol, isobutyl alcohol, and tbutyl alcohol.
  • polyhydric alcohol examples include divalent alcohols (for example, ethylene glycol, propylene glycol, trimethylene glycol, 1,2 butylene glycol, 1,3 butylene glycolate, tetramethylene glycolenolate, 2,3 butylene glycol).
  • divalent alcohols for example, ethylene glycol, propylene glycol, trimethylene glycol, 1,2 butylene glycol, 1,3 butylene glycolate, tetramethylene glycolenolate, 2,3 butylene glycol.
  • oils avocado oil, olive oil, sesame oil, camellia oil, evening primrose oil, turtle oil, madame demian nut oil, corn oil, mink oil, rapeseed oil, egg yolk oil, persic oil, oat germ oil , Southern power oil, castor oil, Amani oil, safflower oil, cottonseed oil, Eno oil, soybean oil, peanut oil, tea seed oil, cocoa oil, rice bran oil, kiri oil, jojoba oil, cocoa butter, coconut oil, Animal and vegetable oils such as horse oil, palm oil, palm kernel oil, beef tallow, sheep fat, tallow, lanolin, whale wax, beeswax, carnauba roux, moclaw, candelilla roux, squall and their hardened oils.
  • fluid paraffin mineral oil such as petrolatum
  • synthetic triglycerin such as glycerin tripalmitate.
  • Examples of higher fatty acids include lauric acid, myristic acid, normic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, stearic acid, behenic acid, 12-hydroxystearic acid, isostearic acid, undesic acid, and tolic acid. Eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid.
  • Examples of the higher alcohols include laurinorenolechol, cetyl alcohol, stearinorenole monole, beheninoleanoreconole, myristinoleanore: 3-nore, reino reinorenorenore, ceto stearinorenoreconole, Jojobano Reconole, Lanolinano Reconole, Notino Reano Renore, 2-Desino Rete Tethecinore, Cholesterol Nore, Phytosterol Nore, Isostearinore Alcohol, etc.
  • Synthetic esters include, for example, cetyl octanoate, octyldodecyl myristate, isopropyl myristate, myristyl myristate, isopropyl palmitate, butyl stearate, hexyl laurate, decyl orenate, dimethyl octanoate, cetyl lactate, Examples include myristyl lactate.
  • the silicone include chain polysiloxanes such as dimethyl polysiloxane and methinorefinole polysiloxane, cyclic polysiloxanes such as decamethylenocyclopolysiloxane, and three-dimensional network structures such as silicone resins.
  • the activator according to the present invention is preferably carried out in the form of a composition by blending a biosurfactant as an active ingredient into cosmetics, quasi drugs, pharmaceuticals, and foods.
  • the biosurfactant has been demonstrated to activate human hair hair nipple cells, so that it is used as a drug for promoting hair growth and preventing progression of hair loss. That's the power S.
  • the dosage form is not limited, and various forms such as ampoules, capsules, powders, granules, pills, tablets, solids, liquids, gels, bubbles, emulsions, creams, ointments, sheets, mousses, bathing agents, etc. be able to.
  • cosmetics, quasi-drugs, and pharmaceuticals include, for example, internal and external pharmaceutical preparations, skin lotions, emulsions, creams, ointments, lotions, oils, packs, and other basic cosmetics, face wash, Skin cleansers, shampoos, rinses, hair treatments, hair creams, pomades, hair sprays, hair styling agents, permanents, hair nickings, hair dyes, hair restorations
  • Makeup cosmetics such as scarlet, eye shadow, eyeliner, mascara, eyebrows, eyelashes
  • cosmetics for finishing such as nail polish, perfumes, bath preparations, other toothpastes, mouth fresheners and mouthwashes Liquid odor / deodorant, hygiene products, sanitary cotton, wet tissue, etc.
  • ice confectionery such as ice, soba, udon , Harusame, Gyoza skin, Pomegranate skin, Chinese rice cake, instant rice cake, etc., rice cake, candy, gum, chocolate, tablet confectionery, snack confectionery, biscuit, jelly, jam, cream, baked confectionery, bread, etc.
  • the activator according to the present invention can be applied to animals other than humans as long as the effects of each force can be expected.
  • the activator according to the present invention is used in cosmetics, quasi-drugs, pharmaceuticals, and foods and drinks as long as the effects of the present invention are not impaired as needed, in addition to the biosurfactant that is an active ingredient. Ingredients and additives can be used in combination.
  • apogado oil for example, as fats and oils, apogado oil, almond oil, wikiyo oil, sesame oil, olive oil, orange oil, orange raffer oil, sesame oil, kaka-age ⁇ , power mitsule oil, power lot oil, cucumber Oil, beef tallow, beef tallow fatty acid, cucumber nut oil, safflower oil, soybean oil, camellia oil, corn oil, rapeseed oil, persic oil, castor oil, cottonseed oil, peanut oil, turtle oil, mink oil, egg yolk oil, cocoa butter, palm Oil, palm kernel oil, owl, coconut oil, beef tallow, lard, hydrogenated oil, hydrogenated castor oil.
  • waxes examples include beeswax, carnauba wax, whale wax, lanolin, liquid lanolin, reduced lanolin, hard lanolin, candelillaro, montan wax, shellac wax and the like.
  • mineral oils examples include liquid paraffin, petrolatum, paraffin, ozokelide, ceresin, microcrystalline wax, polyethylene powder, squalene, squalane, pristane, and the like.
  • the fatty acids include lauric acid, myristic acid, normitic acid, stearic acid, behenic acid, oleic acid, 12-hydroxystearic acid, undecylenic acid, tall oil, lanolin fatty acid and other natural fatty acids, isononane
  • examples thereof include synthetic fatty acids such as acid, caproic acid, 2-ethylbutanoic acid, isopentanoic acid, 2-methylpentanoic acid, 2-ethylhexanoic acid, and isopentanoic acid.
  • alcohols include ethanol, isopiropanol, laurinorenole col, cetanol, stearino rea reno, oleino reno eno ole, lanolin ano re concore.
  • Natural alcohols such as terol and phytosterol, synthetic alcohols such as 2-hexyldecanol, isostearyl alcohol, and 2-octayldodecanol, ethylene oxide, ethylene glycolol, diethylene glycolol, triethylene glycolol, ethylene glycol Noremonochinenoatenore, ethyleneglycolenobutinorenoatenore, diethyleneglycol noremonomethinoreatenore, diethyleneglycolenolemonotinoreatenore, polyethyleneglycolinole, propyleneoxide, propyleneglycolole, polypropyleneglycol 1,3-butylene glyconole, glycerin, notinoreinoreconole, pentaerythritolenole, sonorebitonore, mannitol, glucose, sucrose, etc. And the like.
  • esters include isopropyl myristate, isopropyl palmitate, butyl stearate, hexyl laurate, myristyl myristate, oleyl oleate, decyl oleate, octyldodecyl myristate, hexyldecyl dimethyloctanoate Nole, cetyl lactate, myristyl lactate, jetyl phthalate, dibutyl phthalate, lanolin acetate, ethylene glycol monostearate, propylene glycol monostearate, propylene glycol dioleate and the like.
  • Examples of the metal soap include aluminum stearate, magnesium stearate, zinc stearate, calcium stearate, zinc palmitate, magnesium myristate, zinc laurate, and zinc undecylenate.
  • gum and water-soluble polymer compounds include gum arabic and benzoin rubber
  • Dammar gum guayata fat, Irish moss, caraca gum, tragacanth gum, carob gum, quinseed, agar, casein, dextrin, gelatin, pectin, starch, carrageen, chitosan salt, sulfated chitin, phosphorylated chitin, alginic acid and its salts, Hyaluronic acid and its salts, chondroitin sulfate, heparin, ethyl cellulose, methylcellulose
  • Rosenorelose crystalline senorelose, polyvinylenorenoleconole, polyvinino methinoreatenore, polybulol pyrrolidone, polybull metaaterylate, polyacrylic acid salt, polyalkylene oxide such as polyethylene oxide and polypropylene oxide or cross-linking thereof polymerization Product, carboxybule polymer, polyethyleneimine and the like.
  • an anionic surfactant (carboxylate, sulfonate, sulfate ester salt, phosphate ester salt), a cationic surfactant (ammine salt, quaternary ammonium salt), Amphoteric surfactants (carboxylic acid type amphoteric surfactants, sulfate ester type amphoteric surfactants, sulfonic acid type amphoteric surfactants, phosphate ester type amphoteric surfactants), nonionic surfactants (ether type non-surfactants) Ionic surfactant, ether ester type nonionic surfactant, ester type nonionic surfactant, block polymer type nonionic surfactant, nitrogen-containing type nonionic surfactant), other surfactants (natural interface) Examples thereof include surfactants, derivatives of protein hydrolysates, polymer surfactants, surfactants containing titanium 'key, and fluorocarbon surfactants.
  • vitamin A1 As vitamins, retinol, retinal (vitamin A1), dehydroretinal (vitamin A2), carotene, lycopene (provitamin A), vitamin B group, thiamine hydrochloride, thiamine sulfate (Vitamin B1), riboflavin (vitamin B2), pyridoxine (vitamin B6), cyanocobalamin (vitamin B12), folic acid, nicotinic acids, pantothenic acids, biotins, choline, inositols, ascorbine in vitamin C group Acids and their derivatives, in vitamin D group, ergocalciferol (vitamin D2), cholecalciferol (vitamin D3), dihydrotaxosterol, in vitamin E group, tocopherol and its derivatives, ubiquinones, in vitamin K group, Huitonadione (vitamin K1), Menakinon (Vita Min K2), menad
  • amino acids there are noline, leucine, isoleucine, threonine, methionine, phenylalanine, tryptophan, lysine, glycine, alanine, asparagine, glutamine, serine, cysteine, cystine, tyrosine, proline, hydroxyproline, aspartic acid.
  • amino acid derivatives such as sulphates, phosphates, nitrates, citrates, pyrrolidone carboxylic acids, etc., and gnoretamic acid, hydroxylysine, anoleginine, norenitine and histidine.
  • a whitening agent ascorbic acid or a derivative thereof, io, placental hydrolyzate, ellagic acid or a derivative thereof, kojic acid or a derivative thereof, darcosamine or a derivative thereof Derivatives, Arbutin or its derivatives, Hydroxycainic acid or its derivatives, Glutathione, A / Leni force extract, Ogon extract, Sawhakhi extract, Psycho extract, Bow fuchs, Manntake mycelium culture or extract thereof, Linden extract, Peach leaf extract AGE extract, KUJIN extract, juju extract, toki extract, okuinin extract, rikikiki kiss, dai sai extract, button pi extract, potato melon extract, maronier extract, virgin extract, oil soluble licorice extract and the like.
  • hyaluronic acid polyglutamic acid, serine, glycine, threonine, alanine, collagen, hydrokeratin collagen, hydronectin, fibronectin, keratin, elastin, royal jelly, chondroitin sulfate heparin, Glyce mouth phospholipid, Glyce mouth phospholipid, Sphingo phospholipid, Sphingo glycolipid, Linoleic acid or its esters, Eicosapentaenoic acid or its esters, Pectin, Bifidobacterium fermented product, Lactic acid fermented product, Yeast extract, Ganoderma Mycelium culture or extract thereof, wheat germ oil, avogad oil, rice germ oil, jojoba oil, soybean phospholipid, ⁇ — oryzanol, belode oyster kiss, yoku yun extract, di sai extract, taiso extract, force is
  • a hair restorer pentadecanoic acid glyceride, coleus extract, gentianakis, macca squeez, royano jelly extract, kumazasa extract, t-furano kunon, 6_benzilaminopurine, assembly extract, carpronium chloride, minoxidinore, finasteride Adenosine, nicotinamide, mulberry root extract, dio extract, 5-aminolevulinic acid and the like.
  • microbial culture metabolites include yeast extract, zinc-containing yeast extract, germanium-containing yeast extract, selenium-containing yeast extract, magnesium-containing yeast extract, rice fermentation extract, Euglena extract, and skim milk powder.
  • yeast extract zinc-containing yeast extract
  • germanium-containing yeast extract germanium-containing yeast extract
  • selenium-containing yeast extract magnesium-containing yeast extract
  • rice fermentation extract Euglena extract
  • skim milk powder examples include lactic acid fermented products.
  • examples of the ⁇ -hydroxy acid include glyconolic acid, citrate, malic acid, tartaric acid, and lactic acid.
  • anhydrous caustic acid magnesium silicate, talc, kaolin, bentonite, my strength, mica titanium, bismuth oxychloride, zirconium oxide, magnesium oxide, zinc oxide, titanium oxide, calcium carbonate
  • magnesium carbonate yellow iron oxide, red iron oxide, black iron oxide, gundiio, chromium oxide, chromium hydroxide, carbon black, calamine and the like.
  • an ultraviolet absorber ⁇ -aminobenzoic acid derivative, salicylic acid derivative, anthranilic acid derivative, coumarin derivative, amino acid compound, benzotriazole derivative, tetrazole derivative, imidazoline derivative, pyrimidine derivative, dioxane derivative
  • examples include camphor derivatives, furan derivatives, pyrone derivatives, nucleic acid derivatives, allantoin derivatives, nicotinic acid derivatives, vitamin ⁇ ⁇ 6 derivatives, oxybenzone, benzophenone, guaiazurene, shikonin, baicalin, neukalein, and berberine.
  • astringents include lactic acid, tartaric acid, succinic acid, succinic acid, allantoin, lead chloride, zinc sulfate, zinc oxide, calamine, ⁇ -phenol sulfonate zinc, potassium aluminum sulfate, resorcin chloride, secondary chloride Examples thereof include iron and tannic acid.
  • antioxidant for example, ascorbic acid and its salt, stearic acid ester, tocopherol and its ester derivative, nordihydroguasertenic acid, butylhydroxytoluene ( ⁇ ), butylhydroxydisole ( ⁇ ) , Parahydroxyanisole, propyl gallate, sesamol, sesamorin, gossypol and the like.
  • anti-inflammatory agents include ictamol, indomethacin, kaolin, salicylic acid, sodium salicylate, methyl salicylate, acetyl salicylic acid, diphenhydramine hydrochloride, d or dl-forcenfunole, hydrocortisone, guaiazulene, camazulene, maleic acid chloro
  • anti-inflammatory agents include ictamol, indomethacin, kaolin, salicylic acid, sodium salicylate, methyl salicylate, acetyl salicylic acid, diphenhydramine hydrochloride, d or dl-forcenfunole, hydrocortisone, guaiazulene, camazulene, maleic acid chloro
  • lucerilamine glycyrrhizic acid and its salt
  • glycyrrhetinic acid and its salt and the like.
  • bactericidal agents include atalinol, io, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, methylrosaniline chloride, crezonole, calcium dalconate, chlorhexidine dalconate, sulfamine, mercurochrome, ratatoferrin or its addition. Moisture breakdown products.
  • a hair preparation selenium disulfide, alkylisoquinolinium bromide, zinc pilichn, bifuenamine, thianthol, castari tincture, pepper tincture, pepper tincture, quinine hydrochloride, strong ammonia water
  • examples include potassium bromate, sodium bromate, and thiodaricholic acid.
  • fragrance natural animal fragrances such as Jiakou, Civet, Castrium, Ambergris, Anise Essential Oil, Angri Essential Oil, Iran Essential Oil, Iris Essential Oil, Wikiyo Essential Oil, Orange Essential Oil, Kananga Essential Oil, Power Laue Essential Oil , Cardamom essential oil, guayata wood essential oil, cumin essential oil, black letter essential oil, key skin essential oil, cinnamon essential oil, geranium essential oil, copaiba balsam essential oil, coriandel essential oil, perilla essential oil, cedarwood essential oil, citronella essential oil, jasmine essential oil, gingergrass essential oil, cedar essential oil , Spearmint essential oil, Western heart force essential oil, Otsuka perfume essential oil, tuberose essential oil, clove essential oil, orange flower essential oil, winter green essential oil, trout balsam essential oil, batile lily essential oil, rose essential oil, palmarosa essential oil, persimmon essential oil, hiba essential oil, Sandalwood
  • red cabbage dye red rice dye, akane dye, anato dye, squid dye, turmeric dye, chenju dye, krill dye, amber dye, caramel, gold, silver, gardenia dye, Corn dye, onion dye, tamarind dye, spirulina dye, soy Examples include whole grass pigments, cherry pigments, laver pigments, hibiscus pigments, grape juice pigments, marigold pigments, purple imo pigments, purple potato pigments, lac pigments and rutin.
  • sweetener examples include sugar, sweet tea, fructose, arabinose, galactose, xylose, mannose, maltose, honey, glucose, miraculin, monelin and the like.
  • examples of the nutrient fortifier include shell calcined calcium, cyanobacamine, yeast, wheat germ, soybean germ, egg yolk powder, hemicellulose, heme iron and the like.
  • the present invention includes an anti-aging method using a biosurfactant.
  • the anti-aging method according to the present invention is characterized in that it includes a step of (i) contacting a biosurfactant with an animal.
  • the biosurfactant is preferably at least one selected from the group consisting of mannosyl erythritol lipid (MEU, mannosyl mannitol lipid (MML), and mannosyl erythritol lipid.
  • the animal is not particularly limited as long as the anti-aging effect of biosurfactant can be expected, but a human preferred by a mammal is particularly preferable.
  • Contacting an animal is intended to contact a biosurfactant to a range to which an external preparation is applied, such as the skin and mucous membrane of an animal.
  • the anti-aging method according to the present invention is characterized in that it further comprises (ii) a step of activating cells with a biosurfactant.
  • a biosurfactant that has a cell activation effect, for example, preventing and improving wrinkles, sagging, hardening, etc. of the skin to maintain a rejuvenating, youthful and healthy skin state Exhibit anti-aging effects such as Is possible.
  • the substituent R is a hydrocarbon group (alkyl group or alkenyl group).
  • MEL four types of MEL-A, MEL-B, MEL-C and MEL-D are known depending on the presence or absence of acetyl groups at the 4th and 6th positions of mannose.
  • the substituents R 1 and R 2 in the general formula (5) are both acetyl groups.
  • the substituent R 1 is a acetyl group and the substituent R 2 is hydrogen.
  • the substituent R 1 is hydrogen and the substituent R 2 is a acetyl group.
  • the substituents R 1 and R 2 are both hydrogen.
  • the carbon number of the substituent R in the above MEL-A to MEL-D is the carbon number of the fatty acid constituting the triglyceride in the fats and oils contained in the MEL production medium and the utilization of the fatty acid of the MEL-producing fungus used. Varies with degree. Further, when the triglyceride has an unsaturated fatty acid residue, an unsaturated fatty acid residue can be included as the substituent R if the MEL-producing bacterium does not assimilate up to the double bond portion of the unsaturated fatty acid. is there. As is clear from the above explanation, each MEL obtained usually has a different fatty acid residue portion of the substituent R. It is in the form of a mixture of compounds.
  • the MEL according to the present invention has a structure represented by the general formula (1), and the erythritol in the MEL is an optical isomer introduced in the opposite direction to the conventional MEL.
  • the substituent R 1 may be the same or different and may be an aliphatic asil group having 4 to 24 carbon atoms
  • the substituent R 2 may be the same or different and is hydrogen or acetyl.
  • the substituent R 3 represents hydrogen or an aliphatic acyl group having 2 to 24 carbon atoms.
  • the substituent R 1 is both an aliphatic acyl group having 12 carbon atoms
  • the substituents are both acetyl groups
  • the substituent R 3 is hydrogen. It should be noted that this is intended to exclude the MEL disclosed in Non-Patent Document 8 above, and other intentions are not limitations that unduly limit the scope of the present invention.
  • the substituent R 1 in the general formula (1) is not limited, whether it is a saturated aliphatic acyl group or an unsaturated aliphatic acyl group. When it has an unsaturated bond, it may have a plurality of double bonds.
  • the carbon chain may be linear or branched. In the case of an oxygen atom-containing hydrocarbon group, the number and position of oxygen atoms contained are not limited.
  • any one of the substituents R 2 is a acetyl group and the other is hydrogen.
  • it is l—O—MEL, and it is preferable that it is ⁇ -8 or ⁇ .
  • the 4-position is hydrogen and the 6-position is a acetyl group, that is, MEL-B.
  • MEL-A two acetyl groups
  • MEL-B or MEL-C acetyl group
  • MEL-A the sponge phase (L phase), etc. is applied in a wide concentration range.
  • MEL-B is expected to be easy to apply to ribosome cosmetics and pharmaceuticals because it forms vesicles (ribosomes) encapsulated in bilayer membranes and can immediately encapsulate drugs in capsules (see Non-Patent Documents above). 9, 10).
  • the MEL synthesized in Non-Patent Document 8 is of the A type, and the fatty acid. Both chains are C12.
  • MEL-B and MEL-C can be produced, and the fatty acid chain length can be varied. As a result, it is possible to provide a MEL having a different liquid crystal forming ability.
  • Non-Patent Document 8 The synthesis method described in Non-Patent Document 8 is limited only to the synthesis method of MEL-A. In order to synthesize MEL-B and C, different protecting groups are used and different steps are used. It should be noted that the MEL according to the present invention cannot be synthesized even if the above-mentioned literature is taken into consideration.
  • the substituent R 3 is an aliphatic Ashiru group of 2 to 24 carbon atoms.
  • the substituents R 1 and R 3 are aliphatic acyl groups, the triacinole MEL is obtained, and MEL having properties different from those of the diacyl MEL can be obtained.
  • the triacyl form is a more lipophilic surfactant having a lower HLB (hydrophilic / hydrophobic balance) than the conventional diacyl form. For this reason, application uses differ. For example, it can be used for W / O emulsion and dispersant.
  • the synthesis method described in Non-Patent Document 8 is limited to the synthesis method of the diacyl MEL-A. Group or multi-step reaction). Therefore, it is impossible to synthesize the MEL according to the present invention even if the above Non-Patent Document 8 is taken into consideration.
  • the molecular structure of the MEL according to the present invention basically consists of a mixture of compounds that differ in the number of carbons of the aliphatic acyl group of the substituent R 1 in the general formula (1) or the presence or absence of a double bond. Forces obtained in the form These can be converted into single MEL compounds by further purification by preparative HPLC or the like.
  • the MEL of the present invention has a high surface activity, has a new physiological activity and self-assembly property, and can be used as various catalysts for surfactants or fine chemicals. S can.
  • MEL is very significant because it is biodegradable and highly safe. In other words, it is a biosurfactant with high biodegradability, low toxicity and environmental friendliness.
  • MEL has various physiological activity. For example, when MEL is applied to human acute promyelocytic leukemia cell line HL60, the granule system is differentiated. To induce leukemia cell differentiation. In addition, when MEL is applied to PC12 cells derived from rat adrenal medullary pheochromocytoma, it has physiological activity such as neuronal cell differentiation-inducing action that causes neurite outgrowth and is the first microbially produced glycolipid. It has been reported that apoptosis of ranoma cells can be induced (X. Zhao et. Al., Cancer Research, 59, 482-486 (1999)), and has an inhibitory effect on cancer cell proliferation. In view of the physiological action of these conventional MELs, the MEL according to the present invention can be expected to have various physiological activities. For example, it can be used as a medicine such as an anticancer agent and used as a novel cosmetic material.
  • the MEL according to the present invention is significantly different in liquid crystal forming ability from the conventional MEL due to the difference in molecular chirality, as shown in the Examples described later. Specifically, the MEL according to the present invention is much wider than the conventional MEL! / And has the ability to form a lamellar phase in the concentration range, and is a biosurfacter with extremely excellent liquid crystal forming ability. It can be said to be a Tanto.
  • the above-described evaluation method of the liquid crystal forming ability can be confirmed by a conventionally known method.
  • a water intrusion method can be mentioned as a simple comparison method of the liquid crystal forming ability.
  • the behavior of liquid crystal formation can be traced by applying MEL on a slide glass, dropping distilled water next to it and observing the liquid crystal phase formed at the interface under a microscope.
  • the method for producing MEL according to the present invention is characterized by using a microorganism having the ability to produce 1 O MEL.
  • a microorganism belonging to the genus Pseudozyma and capable of producing mannosyl erythritol lipid is cultured to produce a mannosyl erythritol lipid having the structure represented by the general formula (1).
  • This is a manufacturing method of ME L.
  • the substituent R 1 may be the same or different and is an aliphatic acyl group having 4 to 24 carbon atoms.
  • R 2 may be the same or different and represents hydrogen or a acetyl group.
  • the substituent R 3 represents hydrogen or an aliphatic acyl group having 2 to 24 carbon atoms.
  • microorganisms that produce MEL of the above general formula (1) include, for example, microorganisms belonging to Syudu Zaima kubansis, Syudu Zaima 'Kurassa, etc. Among them, microorganisms belonging to Syudu zyma's kubanensis are particularly preferable. For example, microorganisms belonging to Syudozyma's Cubaensis are highly effective in improving the productivity of MEL when cultured at 25 ° C to 30 ° C. Especially in the case of Syuduzyma's Cubaensis JCM 10324, the culture temperature is 30 ° C. The best productivity is obtained.
  • a medium generally used for general microorganisms or yeasts can be used, and a medium used for yeasts is particularly preferable, although not particularly limited.
  • examples of such a medium include YPD medium (yeast extract 10 g, polypeptone 20 g, and glucose 100 g).
  • YPD medium yeast extract 10 g, polypeptone 20 g, and glucose 100 g.
  • a preferable medium composition when MEL is produced using a microorganism that can be used in the MEL production method of the present invention, in particular, the above-mentioned pseudozym baensis JCM 10324 strain is as follows.
  • Oils and fats 40g / L or more is preferred 80g / L is particularly preferred.
  • the carbon source may contain oils and fats, fatty acids, fatty acid derivatives (fatty acid esters such as fatty acid triglycerides), or synthetic esters, and a mixture of more than one.
  • fatty acids such as fatty acid triglycerides
  • synthetic esters such as fatty acid esters
  • Technical water at the time of use of the present invention is not particularly limited It can be selected as appropriate based on the criteria.
  • Oil and fats may be vegetable oils, animal oils, mineral oils and hardened oils thereof. Specifically, avocado oil, olive oil, sesame oil, camellia oil, evening primrose oil, turtle oil, virgin demian nut oil, corn oil (corn oil), mink oil, rapeseed oil, egg yolk oil, persic oil, peanut oil, Safflower oil, wheat germ oil, Southern power oil, castor oil, Amani oil, safflower oil, cottonseed oil, eno oil, soybean oil, peanut oil, tea seed oil, cacao oil, rice bran oil, kiri oil, jojoba oil Plant oils such as cacao butter, palm oil, horse oil, palm oil, palm kernel oil, beef tallow, sheep fat, lard, lanolin, whale wax, beeswax, carnauba wax, crow, candelilla wax, squall Hardened oil, liquid paraffin, mineral oil such as petrolatum, and synthetic triglycerin such as glycerin trip
  • avocado oil olive oil, sesame oil, camellia oil, evening primrose oil, turtle oil, mackerel demian nut oil, corn oil, mink oil, rapeseed oil, egg yolk oil, persic oil, wheat germ oil, southern power oil, Castor oil, linseed oil, safflower oil, cottonseed oil, eno oil, soybean oil, peanut oil, teaseed oil, cacao oil, rice bran oil, more preferably olive oil and soybean oil.
  • fatty acid or "fatty acid derivative”
  • those derived from higher fatty acids are preferred, such as cabronic acid, strong prillic acid, strong purine acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid.
  • examples include acids, stearic acid, behenic acid, 12-hydroxystearic acid, isostearic acid, undesic acid, toluic acid, eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, and the like.
  • lauric acid myristic acid, normitic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, stearic acid and undecylenic acid, and more preferred are oleic acid, linoleic acid and undecylenic acid.
  • Examples of the "synthetic ester” include methyl methyl proproate, methyl caprylate, methyl methyl purinate, methyl laurate, methyl myristate, methyl palmitate, methyl oleate, methyl linoleate, methyl linolenate, Methyl stearate, methyl undecinate, ethyl caproate, ethyl caprylate, ethyl ethyl caprate, ethyl laurate, ethyl myristate, ethyl ethyl palmitate, ethyl ethyl oleate, ethyl linoleate, ethyl linolenate, ethyl stearate , Undecyl ethyl ester, caproic acid bull, caplinoleic acid vinylol, strong purinate bull, lauric acid bull, myristate bull
  • the specific steps of the MEL production method according to the present invention are not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • seed culture, main culture, and MEL production culture It is preferable to scale up in order.
  • Examples of the culture medium and culture conditions in these cultures are as follows.
  • Seed culture Glucose 40 g / L, yeast extract lg / L, sodium nitrate 0.3 g / L, potassium dihydrogen phosphate 0.3 g / L, and magnesium sulfate 0.3 g / L Inoculate one platinum loop into the test tube and incubate at 30 ° C for 1 day.
  • oils and fats such as vegetable oil and fat, yeast extract lg / L, sodium nitrate 0.3 g / L, potassium dihydrogen phosphate 0.3 g / L, and magnesium sulfate 0.3 g / L Inoculate the Sakaguchi flask containing lOOmL of liquid medium with the composition of a) and incubate at 30 ° C for 2 days.
  • Mannosyl erythritol lipid production culture predetermined amount of fats and oils such as vegetable oils and yeast extract lg / L, sodium nitrate 0.3 g / L, potassium dihydrogen phosphate 0.3 g / L, and magnesium sulfate 0.
  • Liquid medium with a composition of 3g / L 1. Inoculate a jar fermenter containing 4L and incubate at 30 ° C with a stirring speed of 800rpm. In this culturing, it is preferable that plant fats and oils are allowed to flow down into the culture vessel from the middle of the cultivation to maintain the fats and oils concentration in the medium at 20 to 200 g / L.
  • lipid purification methods can also be used for MEL recovery. Is not to be done. For example, after completion of the culture, a step of extracting a lipid component with this volume to 4 times volume of ethyl acetate and distilling off the ethyl acetate using an evaporator to recover lipid and glycolipid components can be mentioned. Then, this lipid component is dissolved in an equal amount of Kuroguchi Form, and this is subjected to silica gel chromatography, and Kuroguchi Form, Kuroguchi Form: Aceton (80:20), (70:30), (60: Elute in the order of 40), (50:50), (30:70), and acetone.
  • the structure of the MEL obtained by the MEL production method described above can be determined by a conventionally known method, and is not particularly limited.
  • the MEL obtained by using the Suzyzaymaqbaensis JCM 10324 strain An example of the structure determination method is as follows.
  • the isolated glycolipid component can be judged to be a glycolipid component by being colored blue-green with an anthrone sulfate reagent on a TLC plate.
  • This glycolipid is MEL because of its 13 C, two-dimensional NMR analysis, the spectrum obtained, and the conventional MEL (MEL—AD) with the known structure (the above general formula (4))
  • the power S can be easily confirmed by comparing with the spectrum.
  • MEL force according to the present invention The optical isomer of conventional MEL can be easily confirmed by performing 1) NMR analysis of sugar skeleton and 2) optical rotation measurement as follows. .
  • the peptone in the sugar chain part of MEL is detected in the vicinity of 3.3 to 5.6 ppm.
  • the mannose 1 '(reducing terminal) proton involved in the glycosidic bond and the erythritol 4-position proton are detected around 4.7 ppm and 4. Oppm, respectively.
  • D. Crich et al That the proton-derived peaks are shifted when the binding directions of erythritol are different (see Non-Patent Document 8 above). Therefore, the MEL according to the present invention is different from the conventional MEL. It is confirmed that only the above-described peak is shifted.
  • the obtained MEL was saponified with alkali (NaOCH 3) to obtain a sugar chain (mannosin
  • Non-Patent Document 8 By measuring the optical rotation of MEL or ME, the chirality of the conventional MEL and the MEL according to the present invention can be compared (see Non-Patent Document 8 above).
  • the MEL obtained by the present invention is different from the conventional MEL in the three-dimensional structure force S of the sugar skeleton.
  • the chirality is different from that of the conventional MEL, and it is possible to selectively produce MELs that have not been reported to date using microorganisms. S can.
  • the MEL according to the present invention since the difference in molecular chirality has a great effect on physiological activity and self-assembly ability, the MEL according to the present invention has no difference in surface activity from the conventional MEL. Behave differently in other properties. Therefore, the physical property comparison between the MEL according to the present invention and the conventional MEL shows an important factor for the functional evaluation of the MEL. As a result, the accumulation of data related to structural-physical properties such as physiological activity greatly contributes to the development of biosurfactants for various uses such as pharmaceuticals, foods, and cosmetics.
  • the MEL according to the present invention appears to be theoretically synthesizable even when a chemical synthesis method is used.
  • very special synthesis techniques and multi-step complex protection / deprotection reactions are required.
  • the microorganism production method as shown in the present invention goes through an elaborate biosynthetic pathway, so that it maintains a special structure in which the position and the three-dimensional structure are completely controlled, and is manufactured in only one step. Can be a very effective means.
  • Example 1 Cell activation of MEL using normal human dermal fibroblasts
  • Normal human skin fibroblasts were cultured by a conventional method using a normal human skin fibroblast total kit (CA106K05, manufacturer: Cell Applications Inc. USA, importer / distributor: Toyobo Co., Ltd.).
  • Normal human dermal fibroblasts were seeded in a 48-well microplate so that the number of normal human skin fibroblasts was 2.0 ⁇ 10 4 per well.
  • the seeding medium used was Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 10% urchin fetal serum. After culturing at 37 ° C in a carbon dioxide concentration of 5 vol% for 24 hours, the culture medium was replaced with a test medium supplemented with a final concentration of lng / ml to 0.01 mg / ml of MEL-A, and further cultured for 48 hours.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • MEL-A used in this example was prepared by adding Pseudozy maantarctica NBRC 10736 to a medium supplemented with soybean oil (3% soybean oil, 0.02% MgS04.H20, 0.02% KH2P04, 0.1% MEL-A obtained by culturing in yeast extract) was used.
  • MEL-A was dissolved in ethanol, serially diluted with ethanol, and added to each medium so that the final concentration of ethanol was 0.5%.
  • ethanol group final concentration 0.5%).
  • SDS-added group final concentration 0.1%) was established to confirm that cell growth was inhibited by cytotoxic substances.
  • Formazan produced by ring opening was extracted with 2-propanol, and the absorbance at 550 nm was measured with a microplate reader. At the same time, the absorbance at 650 nm was measured as turbidity, and the cell activation effect was evaluated by the difference between the two measured values.
  • the MEL-A addition group showed a higher cell activation effect on normal human skin fibroblasts than the ethanol group at any concentration.
  • MEL-A having a final concentration of lng / ml was added, a significant cell activation effect of 65% or more was observed compared with the ethanol group. From this result, it is clear that MEL has an excellent cell activation effect, and by applying MEL to the skin, it exhibits an extremely excellent anti-aging effect, skin wrinkles caused by aging, UV exposure, etc. It was suggested that sagging can be effectively improved.
  • Example 2 Cell activation of MEL using human hair papilla cells
  • Human hair papilla cells (THPC-001) tota nore kit (HDPC total kit: THPCK-001, manufacturer: Cell Applications Inc. USA, importer: Toyobo Co., Ltd.) Papillary cells were cultured.
  • the human hair dermal papilla cell is a cell that is widely used for evaluating the efficacy of hair restorers (see, for example, JP-A-2006-83084, JP-A-2003-81793, JP-A-2000-159640).
  • PCGM medium for suspending thawed cells into 10mL and 15mL centrifuge tubes, and keep them on ice. Rapidly thaw a vial containing frozen human hair dermal papilla cells (THPC-001) in a thermostatic chamber at 37 ° C. Gradually add about 1 mL of PCGM medium to this vial and dilute DMSO. Transfer the entire volume to a centrifuge tube containing PCGM medium and suspend. Centrifuge suspended cells at 4 ° C, 1000rpm for 5 minutes in a cooled low speed centrifuge To do. Aspirate the supernatant, taking care not to suck the precipitated cells, and resuspend in ImLPCGM medium.
  • THPC-001 frozen human hair dermal papilla cells
  • the whole amount is placed in a T-75 flask coated with collagen solution, and placed in an incubator maintained at 37 ° C with a carbon dioxide concentration of 5 vol% under humidification. After 1 day, the medium is changed. Thereafter, the culture medium is changed every other day and subcultured.
  • PCGM medium 250 mL of PCGM basal medium containing 1% FBS and 2.5 mL of bovine pituitary extract (BPE) 100-fold diluted solution and 2. fetal calf serum (FCS) IOO-fold diluted solution 2. 5 mL, 1-25 mL of 200-fold diluted solution of insulin 'transferrin' tolyodothyronine solution (ITT) and 1.25 mL of 200-fold diluted siloprotein solution (Cyp) were used.
  • BPE bovine pituitary extract
  • FCS fetal calf serum
  • Human hair dermal papilla cells were seeded in a 48-well microplate so that there were 2 ⁇ 4 ⁇ 10 4 cells per well.
  • the seeding medium used was Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10% urine fetal serum. After culturing for 24 hours, the culture medium was replaced with a test medium supplemented with MEL-A having a final concentration of lng / ml to 0. Olmg / ml, and further cultured for 48 hours.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • MEL-A used in this example is Pseudozymaantarctica NBRC 10736 medium supplemented with soybean oil (3% soybean oil, 0.02% MgS04'H20, 0.02% KH2P04, 0.1% ye MEL-A obtained by culturing with ast extract) was used.
  • MEL-A was dissolved in ethanol, serially diluted with ethanol, and added to each medium so that the final ethanol concentration was 0.5%.
  • an ethanol group (final concentration 0.5%) was provided.
  • the culture medium was replaced with a medium containing 10011 g / mL of 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and cultured for 3 hours.
  • MTT 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • Example 3 Cell activation of triacyl MEL using normal human dermal fibroblasts
  • Pseudozyma antarctica NBRC 10736 was added to a medium supplemented with soybean oil (3% soybean oil, 0.02).
  • % MgSO ⁇ 0, 0.02% KH PO, 0.1% veast
  • Normal human skin fibroblasts were cultured by a conventional method using a normal human skin fibroblast total kit (CA106K05, manufacturer: Cell Applications Inc. USA, import sales company: Toyobo Co., Ltd.).
  • Normal human dermal fibroblasts were seeded in a 48-well microplate so that the number of normal human skin fibroblasts was 2.0 ⁇ 10 4 per well.
  • the seeding medium used was Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 10% urchin fetal serum. After culturing at 37 ° C and carbon dioxide concentration of 5 vol% for 24 hours, replace with test medium supplemented with Triacyl MEL (OL—MEL (SB)) at a final concentration of 0.01 ng / ml to 0.01 mg / ml. The cells were further cultured for 48 hours.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • OLB Triacyl MEL
  • Triacyl MEL was dissolved in ethanol, serially diluted with ethanol, and added to each medium so that the final concentration of ethanol was 0.5%.
  • an ethanol group (final concentration 0.5%) was provided.
  • an SDS-added group (final concentration 0.1%) was established to confirm that cell growth was inhibited by cytotoxic substances.
  • 3- (4,5 dimethyl-2 thiazolyl) 2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT) was replaced with a medium containing 100 Hg / mL and cultured for 3 hours, and the formazan formed by the opening of the tetrazolium ring.
  • the triacyl MEL addition group showed a higher cell activation effect on normal human skin fibroblasts than the ethanol group at any concentration.
  • Triacyl MEL at a final concentration of 1 ng / ml was added, a significant cell activation * anti-aging effect of about 50% was observed compared to the ethanol group. From this result, it is clear that triacyl MEL has an excellent cell activation effect similar to MEL-A, and by applying triacinole MEL to the skin, it exerts an extremely excellent anti-aging effect, and is aging, ultraviolet It was suggested that skin wrinkles and sagging caused by radiation exposure can be effectively improved.
  • a cosmetic liquid having the following composition was produced by a conventional method.
  • Total amount of purified water is 100
  • An emulsion having the composition shown below was produced by a conventional method.
  • a cream having the following composition was produced by a conventional method.
  • Example 8 Cultivation of Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 strain
  • b) is cultured for 7 days, and the culture solution is collected and used to produce biosurfactant of Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 strain using a thin-layer chromatography. confirmed.
  • Pseudozyma antarctica KM_34 (FERMP-20730) strain was cultured in a soybean oil-added medium, and a purified preparation from which impurities such as raw oils and fats were removed was used.
  • MEL-A to D each represent a compound represented by the above general formula (5).
  • Example 10 Production of the same lipid in MEL production medium
  • Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 strain was used and a) was cultured for 1 day, then b) was cultured for 7 days. Thereafter, the culture broth was collected, and the ethyl acetate-soluble component in the culture broth was purified, and the produced MEL was detected by high performance liquid chromatography.
  • a culture solution of Pseudozyma antarctica KM-34 (FERMP-20730) strain cultured using soybean oil as a carbon source was similarly detected by high performance liquid chromatography.
  • Pseudozyma crassa CBS 9959 strain was used and the temperature was set at 25 ° C., and the culture was performed in the same manner. After the culture of a) was performed for 1 day, the culture solution after the culture of b) was performed for 7 days was collected and used in the same manner as described in Example 9 for Pseudoz yma crassa CBS 9959 strain. Biosurfactant production was confirmed by thin layer chromatography.
  • Example 12 Structural analysis of MEL produced by Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 strain
  • Example 9 NMR analysis of the sugar skeleton was performed.
  • the glycolipid obtained in Example 9 was isolated and purified by a known separation method using silica gel column chromatography, and deuterated black mouth form.
  • ctica KM-34 (FERMP 20730) strain was cultivated and produced, and isolated 'purified conventional MEL B was similarly measured.
  • MEL EL sugar skeleton
  • ME derived from Pseudozyma antarctica KM_34 (FERMP-20730) was obtained as a white powder by the above-described recovery operation, and had a melting point of 156.9 ° C, whereas Pseud ozyma tsukubaensis JCM 10324 strain The derived ME was obtained as a colorless, transparent, oily compound, and its melting point could not be measured. It was shown that the three-dimensional structure of the molecule was different between the two, and the crystallinity was different.
  • the MEL produced by the Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 strain obtained in Example 9 is MEL-B, and the conventional MEL-B has an optical isomer relationship 1— (6'-acetyl-1-2 ', 3'-di-O-al force (ke) -noyl- ⁇ -D-mannobilano silu) It was confirmed to be meso-erythritol.
  • Example 13 Structural analysis of MEL produced by Pseudozyma crassa CBS 9959 strain
  • glycolipid produced by Pseudozyma crassa CBS 9959 strain obtained in Example 11 was also isolated and purified in the same manner as in Example 12, and 1 H-N MR analysis was performed on all three types of glycolipids. Compared with conventional MEL—AC.
  • the MEL produced by the Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 strain obtained in Example 8 and the conventional MEL produced by the Pseudozyma antarctica KM_34 (FERMP-20730) strain were compared for liquid crystal forming ability by the water intrusion method.
  • the MEL derived from Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 was compared with the conventional MEL. It has the ability to form a lamellar phase in a very wide concentration range, and was shown to be a biosurfactant with an extremely excellent liquid crystal forming ability.
  • Example 15 Production of triacyl MEL by cultivation of Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 strain
  • 0. 2 ml of P.tsukubaensis frozen stock was inoculated into 20 ml of YM seed medium / 500 ml Sakaguchi Flasco, and cultured at 26 ° C, 180 rpm for 1 cm to obtain seeds.
  • 0. 2 ml of the inoculum was again inoculated into a 20 ml YM seed medium / 500 ml volumetric flask and cultured at 26 ° C, 180 rpm for 1 cm to form an inoculum.
  • 20 ml of the inoculum was inoculated into 2 L of YM medium / 5 LJar and cultured at 26 ° C. 300 rpm (l / 4WM, 0.5 L air / min) for 8 days.
  • the culture was centrifuged at 7,900 rpm 60 min 4 ° C to separate the cells (including MEL-B) and the supernatant.
  • 8 Oml of ethyl acetate was added to each cell fraction, and the mixture was stirred up and down so that the cells were sufficiently suspended, and then centrifuged at 7,900 rpm for 30 minutes at 4 ° C.
  • An equal amount of saturated saline was added to the obtained supernatant and stirred to obtain an ethyl acetate layer.
  • An appropriate amount of anhydrous sodium sulfate was added to the ethyl acetate layer and allowed to settle for 30 minutes, and then evaporated to obtain a glycolipid.
  • Example 16 NMR angle preanalysis of triacyl MEL produced by Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324]
  • the glycolipid obtained in Example 15 was isolated and purified by a known separation method using silica gel column chromatography to obtain 50 g of MEL-B and 1.5 g of triacyl MEL-B. Dissolve deuterated dimethyl sulfoxide (DMSO-d) in the Triacyl MEL-B fraction.
  • DMSO-d deuterated dimethyl sulfoxide
  • MEL-C produced by Pseudozyma hubeiensis is erythritol. It confirmed that it was couple
  • Example 18 Lipid domain analysis of MEL-B produced by Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324]
  • LCMS analysis was also performed on triacyl MEL-C, which was produced by culturing Pseudozyma hubeiensis and isolated and purified. As a result, as shown in FIG. 15, it was confirmed that fatty acids having 6 carbon atoms were mainly added to one hydroxyl group of mannose and fatty acids having 8 to 16 were added to the other.
  • HPLC analysis conditions were as follows. HPLC system: Agilent 100, column: Imtakt
  • MS conditions are as follows. MS equipment: BRUKER DALTONICS esquire 300 0 Plus, ionization method: ESI positive.
  • the MEL according to the present invention has a completely different structure of chirality in which erythritol is ether-bonded to mannose in the opposite direction to the conventional MEL, and exhibits a liquid crystal forming behavior.
  • the self-assembling property is very different from the conventional one. Because of these differences in physical properties, it is expected to develop new physiological activities that are not seen in the conventional type. Therefore, as with the conventional MEL, it is widely used in detergent applications, food industry, chemical industry, environmental fields, etc. In addition to its use, it is expected that it will be able to make a great contribution to expanding its use especially in the pharmaceutical and cosmetic industries.

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Description

明 細 書
バイオサーファクタントを有効成分とする賦活化剤、及びマンノシルエリス リトールリピッド並びにその製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、バイオサーファタタントを有効成分とする賦活化剤に関するものであり、 特に、各種細胞を賦活化し、老化防止や発毛 ·脱毛防止に有効なバイオサーファタ タントを含有する化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品に関するものである。
[0002] また、本発明は、新規マンノシルエリスリトールリピッド（以下、単に MELと称する場 合もある）及びその製造方法に関し、より詳細には微生物生産糖脂質の一種である MELであって、分子構造中のマンノシルエリスリトール骨格が l—O— β—D—マン ノビラノシルー meso—エリスリトールである MEL及びその微生物生産法に関するも のである。
背景技術
[0003] 個体老化やこれに伴って発生する各種の疾患などは、分裂するすべての細胞の老 化（分裂速度の低下、細胞機能の低下）と深く関わっている。例えば皮膚は、表皮細 胞、繊維芽細胞、およびこれら細胞外の皮膚構造を支持するエラスチン、コラーゲン 等の細胞外マトリックスによって構成されている。若い皮膚においては、これらの皮膚 組織の相互作用が恒常性を保つことによって水分保持、柔軟性、弾力性が確保され 、肌は外観的にも張りと艷があり、みずみずしい状態に維持される。ところ力 加齢や 紫外線、乾燥、ストレスなどによって特に細胞外マトリックスや繊維芽細胞の機能低下 力引き起こされ、その結果、皮膚の柔軟性、保湿機能は低下し、肌は張りゃ艷を失い 、荒れ、しわ、くすみなどの老化症状が発生する。
[0004] 細胞レベルで老化防止や抑制を目的に賦活化剤、抗老化剤の探索が行われて!/、 る。例えば動物由来の賦活化剤としては、結合組織加水分解物（特許文献 1)、胸腺 •脾臓由来水溶性蛋白（特許文献 2)、牛胎盤エキス（特許文献 3)などが知られて!/ヽ る。植物由来の賦活化剤としては、ゴマ、サンャク、トウガラシ、トウキ、ドクダミ、バクモ ンドウ（特許文献 4)、アーモンド、セィヨウタンポポ、セィヨウニヮトコ、センキユウ、セン プリ、ソゥハクヒ、トウニン、ニンジン、ホップ、ムクゲ、ョクイニン (特許文献 5、特許文 献 6)、ショウガ科ゥコン属（特許文献 7)、ハナヤスリ科ハナヤスリ属（特許文献 8)の抽 出物などが知られている。これらの一部は賦活化剤、抗老化剤として医薬部外品や 化粧品に利用されているが、満足すべき作用効果を発揮する賦活化剤ゃ抗老化剤 は得られていない。
[0005] マンノシルエリスリトールリピッド（MEUは酵母が作る天然系の界面活性剤であり 種々の生理作用が報告されている（非特許文献 1)。また最近ではエリスリトールがマ ンニトールに代わったマンノシルマン二トールリピッド（MMUが見出されて!/、る（特 許文献 9)。外用剤や化粧品としての用途としては、抗炎症剤および抗アレルギー剤 (特許文献 10)、養毛 ·育毛剤 (特許文献 11)としての有用性や、抗菌作用（特許文 献 12)や表面張力低下作用（特許文献 13)が知られている。
[0006] し力、し、 MELの細胞に対する賦活化作用については全く知られていなかった。また 、特許文献 11に記載の育毛作用は動物を用いて効果が確認されたものであり、ヒト 頭髪毛乳頭細胞を賦活化させることは報告されていなかった。
[0007] ところで、上述したように、糖脂質等のバイオサーファクタントは、生分解性が高ぐ 低毒性で環境に優しぐ新規な生理機能を持つといわれている。これらの諸性質から 、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等にバイオサーファタ タントを幅広く適用することは、持続可能社会の実現と高機能製品の提供という、両 面を兼ね備えており極めて有意義である。
[0008] 代表的な糖脂質系バイオサーファタタントの一つに MELがある。 MELは、 Ustilago nuda (ウスチラゴ ヌーダ)と Shizonella melanogramma (シゾネラ メラノグラマ)力、ら発 見された物質である（非特許文献 2及び 3参照）。その後、ィタコン酸生産の変異株で ある Candida属酵母（特許文献 14及び非特許文献 4参照）、 Candida antarctica (キヤ ンデダ アンタークチ力) (現在は Pseudozyma antarctica (シユードザイマ アンターク チカ） ) (非特許文献 5及び 6参照）、 Kurtzmanomyces (クルツマノマイセス）属（非特許 文献 7参照）等の酵母らによっても生産されることが報告されている。現在では、長時 間の連続培養 ·生産を行うことで 300g/L以上の生産が可能となっている。
特許文献 1 :日本国公開特許公報「特開昭 62— 84024号公報」 特許文献 2:日本国公開特許公報「特開昭 63— 188697号公報」
特許文献 3：日本国公開特許公報「特開平 03— 141299号公報」
特許文献 4:日本国公開特許公報「特開平 10— 45615号公報」
特許文献 5:日本国公開特許公報「特開平 10— 036279号公報」
特許文献 6:日本国公開特許公報「特開平 10— 36279号公報」
特許文献 7:日本国公開特許公報「特開 2004— 75632号公報」
特許文献 8:日本国公開特許公報「特開 2005— 89375号公報」
特許文献 9：日本国公開特許公報「特開 2005— 104837号公報」
特許文献 10:日本国公開特許公報「特開 2005— 68015号公報」
特許文献 11:日本国公開特許公報「特開 2003— 261424号公報」
特許文献 12:日本国公開特許公報「特開昭 57— 145896号公報」
特許文献 13：日本国公開特許公報「特開昭 61— 205450号公報」
特許文献 14:日本国公開特許公報「特公昭 57— 145896号公報」
非特許文献 1:ジャーナル ォブ バイオサイエンス アンド バイオエンジニアリング、
94, 187(2002)
非特許文献 2: R. H. Haskins, J. A. Thorn, B. Boothroyd, Can. J. Microbiol., Vol 1 , p749- 756， 1955.
非特許文献 3: G. Demi, T. Anke, F. Oberwinkler, B. M. Giannetti, W. Steglich, Ph ytochemistry, Vol 19, p83- 87, 1980.
非特許文献 4: T. Nakahara, H. Kawasaki, T. Sugisawa, Y. Takamori, T. Tabuchi, J. Ferment. Technol. Vol61, pl9_23, 1983.
非特許文献 5: D. Kitamoto, S. Akiba, C. Hioki, T. Tabuch, Agric. Biol. Chem., Vol 54. P31-36, 1990.
非特許文献 6:H.-S. Kim, B.-D. Yoon, D.-H. Choung, H.-M. Oh, T. Katsuragi, Y. Tani, Appl. Microbiol. Biotechnol., Springer- Verlag, Vol52, p713_721, 1999.
非特許文献 7: K. kakukawa, M. Tamai, . Imamura, . Miyamoto, S. Miyoshi, Y. M orinaga, O. Suzuki, T. Miyakawa, Biosci. Biotechnol. Biochem., V0I66, pl88_191, 2002. 非特許文献 8 : D. Crich, M. A. Mora, R. Cruz, Tetrahedron, Elsevier, Vol58, p35- 4 4, 2002.
非特許文献 9 :北本 大「ォレオサイエンス」， （日本）， 日本油化学会， 3巻， p663— 672 (2003) .
非特許文献 10 : T. Imura, N. Ohta, . Inoue, N. Yagi, H. Negishi, H. Yanagishita, D. itamoto, Chem. Eur. J, Wiley, Voll2, p2434- 2440, 2006.
発明の開示
[0009] 哺乳類、特にヒトに対して賦活化ゃ抗老化を付与することは極めて重要な課題であ り、動物由来、植物由来の賦活物質ゃ抗老化剤は各種見つかつている力 実際には 産業上利用可能な程度に十分かつ安定した効果は得られておらず、新規な賦活化 剤ゃ抗老化剤が探索されているのが現状である。
[0010] 従って、本発明の目的は、細胞に対する賦活化および抗老化効果に優れ、長期に わたる使用に十分に耐え得る安全性を備えた賦活化剤および抗老化剤を提供し、こ れらを有効成分とした化粧品 ·医薬部外品、医薬品、飲食品を提供することである。
[0011] また、上述したように、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野 等に広く普及をはかるため、分解性が高ぐ低毒性で環境に優しぐ新規な生理機能 を持つ糖脂質等のバイオサーファタタントについて、生産効率の向上、構造'機能バ ラエティの拡充が重要である。特に、 MELは、生産性、界面物性に優れるだけでなく 、特異な自己集合特性と生理活性を利用した種々の用途開発が行われている。
[0012] しかしながら、これまで報告されている微生物由来の MELは、糖骨格が全て 4 O
β—D—マンノビラノシルー meso エリスリトール構造であった。このため、構造' 機能バラエティの拡充が強く求められていた。
[0013] 特に、生理活性を有する有機化合物にとって、その分子のキラリティーは極めて重 要なポイントとなる。これまで MELは、抗菌性、抗腫瘍性、糖タンパク結合能をはじめ 、様々な生理活性を有することが報告されている（非特許文献 9)。さらに、 MELは極 めて特異な自己集合特性を示し、それを利用したリボソーム素材、液晶化技術への 展開も試みられており、分子構造の僅力、な違いが自己集合体の形成に大きな影響を 与えることも報告されている（非特許文献 9、 10)。 [0014] したがって、従来知られていた MELの光学異性体を大量に生産し、それらの物性 比較、機能評価を行うことは、 MELの用途開発に向けて大きく貢献できるものと期待 される。
[0015] ここで、上記非特許文献 8には、 l—O— β—D—マンノビラノシルー meso エリス リトール構造を有する MELを化学合成して得た旨が記載されている力 S、これはたつ た一つの MELを非常に複雑な複雑な工程を経て合成するものであり、汎用性に欠 け利用し難いものであった。
[0016] よって他の局面において、本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、 その目的は、従来の 4 0 β—D—マンノビラノシルー meso エリスリトール構造 を有する MELに対して、その光学異性体である l— O— 0—D—マンノビラノシルー meso-エリスリトール構造を有する MEL及びその製造方法を提供することにある。
[0017] 本発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意努力した結果、 MELおよびトリアシノレ MELが細胞の賦活化に有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。また 、本発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意努力した結果、従来の 4 O— 13 D マンノビラノシルー meso エリスリトール構造を有する MEL (以下、「従来型 MEL 」又は「4—〇— MEL」と称する場合もある。）に対して、その光学異性体である l— O β—D—マンノビラノシルー meso エリスリトール構造を有する MEL (以下、「本 発明に係る MEL」又は「 1 -O-MELjと称する場合もある。 )を生産する微生物を 見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
[0018] (1)バイオサーファタタントを有効成分として含有することを特徴とする賦活化剤。
[0019] (2)上記バイオサーファクタントが、マンノシルアルジトールリピッド又はそのトリァシ ル体であることを特徴とする（1)に記載の賦活化剤。
[0020] (3)上記マンノシルアルジトールリピッド力 マンノシルエリスリトールリピッド（MEL) 又はマンノシルマン二トールリピッド（MML)であることを特徴とする（2)に記載の賦 活化剤。
[0021] (4)上記（1)〜（3)のいずれかに記載の賦活化剤を有効成分として含有することを 特徴とする抗老化剤。
[0022] (5)上記（1)〜（3)のいずれかに記載の賦活化剤を有効成分として含有することを 特徴とする育毛剤。
[0023] (6)上記（1)〜（3)のいずれかに記載の賦活化剤、（4)に記載の抗老化剤、または
(5)に記載の育毛剤を有効成分として含有することを特徴とする外用剤。
[0024] (7)上記（1)〜（3)のいずれかに記載の賦活化剤、（4)に記載の抗老化剤、または
(5)に記載の育毛剤を有効成分として含有することを特徴とする化粧品。
[0025] (8)上記（1)〜（3)のいずれかに記載の賦活化剤、（4)に記載の抗老化剤、または
(5)に記載の育毛剤を有効成分として含有することを特徴とする医薬部外品。
[0026] (9)上記（1)〜（3)のいずれかに記載の賦活化剤、（4)に記載の抗老化剤、または
(5)に記載の育毛剤を有効成分として含有することを特徴とする医薬品。
[0027] (10)上記（1)〜（3)のいずれかに記載の賦活化剤、（4)に記載の抗老化剤、また は（5)に記載の育毛剤を有効成分として含有することを特徴とする飲食品類。
[0028] (11)下記一般式（1)で表される構造を有することを特徴とするマンノシルエリスリト 一ルリピッド。
[0029] [化 1]
Figure imgf000007_0001
' « ( 1 )
[0030] (式（1)中、置換基 R1は同一でも異なっていてもよく炭素数 4〜24の脂肪族ァシル基 であり、置換基 R2は同一でも異なっていてもよく水素又はァセチル基を表す。また、 置換基 R3は水素又は炭素数 2〜24の脂肪族ァシル基を表す。ただし、置換基 が ともに炭素数 12の脂肪族ァシル基であって、置換基 R2がともにァセチル基であって 、置換基 R3が水素であるものを除く。 )
(12)上記一般式（1)中、置換基 R2のいずれか一方がァセチル基であり、他方が水 素であることを特徴とする（11)に記載のマンノシルエリスリトールリピッド。
[0031] (13)上記一般式（1)中、置換基 R3が炭素数 2〜24の脂肪族ァシル基であることを 特徴とする（11)又は（12)に記載 (；
[0032] (14)微生物により生産されたものであることを特徴とする（11)〜（； 13)の!/、ずれか に記載のマンノシノレエリスリトールリピッド。
[0033] (15)シユードザイマ（Pseudozyma)属に属し、かつマンノシルエリスリトールリピッド を生産する能力を有する微生物を培養し、下記一般式（1)で表される構造を有する マンノシルエリスリトールリピッドを製造することを特徴とするマンノシルエリスリトールリ ピッドの製造方法。
[0034] [化 2]
Figure imgf000008_0001
■ · « ( 1 )
[0035] (式（1)中、置換基 R1は同一でも異なっていてもよく炭素数 4〜24の脂肪族ァシル基 であり、置換基 R2は同一でも異なっていてもよく水素又はァセチル基を表す。また、 置換基 R3は水素又は炭素数 2〜24の脂肪族ァシル基を表す。 )
(16)上記微生物が、シユードザイマ'ックバェンシス（Pseudozyma tsukubaensis)、 又はシユードザイマ.クラッサ（Pseudozyma crassa)であることを特徴とする（15)に記 載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
[0036] 本発明に係る賦活化剤の有効成分として用いるバイオサーファクタントは、各種細 胞に対して顕著な賦活作用を有している。したがって、本発明に係る賦活化剤は、抗 老化剤や育毛剤として優れた効果を発揮する。また、バイオサーファタタントは生物 由来の天然界面活性剤であるため安全性に優れており、本発明に係る賦活化剤は 長期にわたる使用に十分に耐え得るという効果を奏する。さらに、バイオサーファクタ ントは、微生物の培養により製造できるため原料コストが安価であり、大量生産可能 である。したがって、本発明係る賦活化剤は低価格で提供できるという効果を奏する [0037] また、本発明に係る MELは、従来知られていた MELの光学異性体である。分子の キラリティーの違いは生理活性や自己集合体形成能に大きな影響を及ぼすことから 、従来型 MELとは界面活性に差が無いにもかかわらず、その他の諸性質において 異なる挙動を示すようになる。それゆえ、本発明に係る MELを用いて従来の MELと の物性比較、機能評価を行うことにより、 MELの用途開発に向けて大きく貢献できる という効果を奏する。特に、本発明に係る MELは、従来型 MELと異なる液晶形成能 を有するとレ、う効果を奏する。
[0038] さらに、本発明に係る MELの製造方法によれば、従来知られていた MELの光学 異性体を大量かつ簡易に生産することができる。
[0039] 本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分か るであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白にな るであろう。
図面の簡単な説明
[0040] [図 1]正常ヒト皮膚繊維芽細胞を用いた MEL (大豆油を原料として製造した MEL— A)の細胞賦活作用を検討した結果を示すグラフである。
[図 2]ヒト頭髪毛乳頭細胞を用いた MEL (大豆油を原料として製造した MEL—A)の 細胞賦活作用を検討した結果を示すグラフである。
[図 3]正常ヒト皮膚繊維芽細胞を用いたトリァシル MEL (大豆油を原料として製造した MEL— Aのエリスリトール部の水酸基にォレイン酸が付加したトリァシル MEL— A) の細胞賦活作用を検討した結果を示すグラフである。
[図 4]Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株の培養物についての薄層クロマトグラ フィ一の結果を示す図である。
[図 5]Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株の培養物についての高速液体クロマト グラフィ一の分析結果を示す図である。
[図 6]Pseudozyma crassa CBS 9959株の培養物についての薄層クロマトグラフィーの 結果を示す図である。
[図 7]Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株及び Pseudozyma antarctica KM- 34 (F ERMP-20730)株が生産する MELの1 H— NMRスペクトルにおける、糖骨格部分の 拡大図（3. 4〜5. 7ppm)である。
[図 8]Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株及び Pseudozyma antarctica KM-34 (F ERMP-20730)株が生産する MELを出発物質として合成した、マンノシルエリスリトー ルの1 H— NMRスペクトルにおける、糖骨格部分の拡大図（3· 3〜4· 2ppm)である
〇
[図 9]Pseudozyma crassa CBS 9959株が生産する MELの1 H— NMRスぺクトノレにお ける、糖骨格部分の拡大図（3· 4〜5· 7ppm)である。
[図 10]Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株及び Pseudozyma antarctica KM-34 ( FERMP-20730)株が生産する MELに関し、水侵入法によって液晶形成能について 偏光顕微鏡観察を行った結果を示す図である。
[図 l l]Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株、及び Pseudozyma antarctica KM-34 (FERMP-20730)株が生産する MELに関し、水侵入法によって液晶形成能につい て位相差顕微鏡観察を行った結果を示す図である。
[図 12]Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産するトリァシル MELの1 H— N MRスペクトルと糖骨格部分の拡大図（3. 4〜5. 7ppm)である。
[図 13]Pseudozyma hubeiensisが生産するトリァシル MELの1 H— NMRスぺタトノレと糖 骨格部分の拡大図（3. 0〜5. 7ppm)である。
[図 14]Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産する MELの HPLC (ODS)— MS分析による脂質ドメイン解析結果を示す図である。
[図 15]Pseudozyma hubeiensisが生産するトリアシノレ MELの HPLC (ODS)—MS分 析による脂質ドメイン解析結果である。
発明を実施するための最良の形態
〔実施の形態 1〕
< 1.賦活化剤 >
本明細書において「賦活化」とは、細胞機能や細胞活性を維持または亢進させるこ とが意図される。その結果、細胞機能や細胞活性の低下を抑制、すなわち細胞の老 化を抑制すること力 Sできる。したがって、「賦活化剤」は「細胞賦活剤」と同義であり、「 抗老化剤」としての有用性を持つ。 [0042] 例えば、皮膚細胞における「賦活化、抗老化」とは、加齢や光老化による基低膜の 構造変化の蓄積に伴う皮膚細胞の機能低下を小さくすることで、皮膚のしわ、たるみ 、硬化等を防止、改善して弾力のある若々しい健康な肌の状態を維持することなどを 指している。また、例えば、毛乳頭細胞または毛母細胞においては、加齢、ストレス、 ホルモンバランスによる毛乳頭細胞または毛母細胞の機能低下を小さくすることで、 ヘアサイクルを維持して脱毛を抑えることなどを指している。
[0043] 「バイオサーファクタント」とは生物によって生み出される界面活性能力や乳化能力 を有する物質の総称であり、優れた界面活性や、高い生分解性を示すば力、りでなぐ 様々な生理作用を有していることから合成界面活性剤とは異なる挙動 ·機能を発現 する可能性がある。なお、ノ^オサーファタタントは微生物の培養により大量に製造 可能であり、プレミックス品として使用してもよい。
[0044] 「プレミックス品」とは機能性の素材の他に、分散剤などを添加したり、溶媒で化粧 品製造時に使!/、やす!/、ように希釈したりしたものである。
[0045] バイオサーファタタントとしては、マンノシルエリスリトールリピッド（MEL)、マンノシ ルマン二トールリピッド（MMU、トレハロースリピッド、ラムノリピッド、ソホロリピッド、サ 一ファタチン、スピクルスポル酸、エマルザンなどが挙げられ、いずれも本発明に係る 賦活化剤に使用できる。なかでも、ラメラ構造を形成するバイオサーファタタントを利 用するのが好ましぐ MEL、 MMLが特に好ましい。
[0046] MELは、マンノースの 4位および 6位のァセチル基の有無から MEL—A、 MEL— B、 MEL— Cおよび MEL— Dの 4種類が知られている。式（2)に MEL— Aの構造を 示す。式（2)中、 R1および R2は炭化水素基を示す。すなわち、 MEL— Aは、式（2) 中、マンノースの 2位、 3位に炭素数 5〜 19のアルカノィル基を有し、マンノースの 4 位、 6位にァセチル基を有する化合物である。なお、 MEL— Bは式（2)においてマン ノースの 4位のァセチル基（CH CO)が Hであり、 MEL— Cは式（2)においてマンノ
3
ースの 6位のァセチル基（CH CO)が Hであり、 MEL— Dは式（2)においてマンノー
3
スの 4位および 6位のァセチル基（CH CO)カ^、ずれも Hである。
3
[0047] [化 3]
Figure imgf000012_0001
MBL-A
( 2)
[0048] MMLの構造を式（3)に示す。式（3)中、 R1および R2は炭化水素基を示す。また 、式（3)中、マンノースの 4位、 6位のァセチル基（CH CO)のどちらか一方、あるい
3
は両方が Hになって!/、てもよ!/、。
[0049] [化 4]
Figure imgf000012_0002
MML
( 3 )
[0050] 本発明に係る賦活化剤に用いられるバイオサーファクタントは、 MELのトリアシノレ 体および MMLのトリァシル体でもよい。トリァシル体のバイオサーファクタントは、 M ELや MMLよりもさらに高い疎水性を有する新規構造のバイオサーファタタントであ る。例えば、 MEL生産菌の培養液以外から大量に得る時は、酵素を用いて MELを 種々の植物油と反応することによって製造することができる。
[0051] MELのトリァシル体
MELと称することがある）は、式 (4)のような構造を示す。 [0052] [化 5]
Figure imgf000013_0001
■· ' - ( 4 )
[0053] 式 (4)中、 Rl、 R2および R3はそれぞれ独立して炭化水素基または酸素原子含有 炭化水素基を示し、マンノースの 4位および 6位の水酸基のいずれか一方、あるいは 両方の水素原子がァセチル基に置換されて!/、てもよ!/、。炭化水素基は飽和結合の みを有していてもよぐ不飽和結合を有していてもよい。不飽和結合を有している場 合、複数の二重結合を有していてもよい。炭素鎖は直鎖状であってもよく分岐鎖状で あってもよい。また、酸素原子含有炭化水素基の場合、含まれる酸素原子の数およ び位置は限定されない。
[0054] 式 (4)中、 Rl、 R2は炭素数が 6〜20であることが好ましぐ脂肪族ァシル基 (RCO 一）としてマンノースの 2位および 3位の水酸基とエステル結合をしており、残りの水酸 基にはァセチル基がエステル結合して!/、てもよ!/、。 R3は炭素数が 6〜20であること が好ましく、脂肪族ァシル基 (RCO— )としてエリスリトールの一級水酸基とエステル 結合をしている。
[0055] トリァシル MELは脂肪酸エステルが付加した構造であり高い疎水性を有することか らェモリエント剤として従来の MELと比べても種々のオイル成分と馴染みやすレ、点 で優れている。
[0056] これらのバイオサーファクタントは、単独で使用してもよいが、 2種以上のバイオサー ファクタントを併用することもできる。
[0057] バイオサーファタタントの製造方法は特に制限されるものはないが、公知のバイオ サーファタタント生産微生物を用いた発酵方法を任意に選択して行えばよい。例えば MELの培養生産は、 Pseudozyma antarctica NBRC 10736を常法に従って培養する ことにより生産すること力 Sできる。 MEL生産微生物としては、上記以外に Candida ant arctica、 Candida sp.、等を用いること力 Sできる。これらの微生物の培養により、容易に MELが得られることは当業者に周知である。バイオサーファクタント生産微生物は特 に限定されず、 目的に応じて適宜選択することができる。
[0058] バイオサーファタタントを生産するときの発酵培地は、酵母エキス、ペプトン等の N 源、グルコース、フルクトース等の c源、および硝酸ナトリウム、リン酸水素二カリウム、 硫酸マグネシウム 7水塩等の無機塩類からなる一般的な組成の培地を用いることが でき、これにォリーブ油、ダイズ油、ヒマヮリ油、トウモロコシ油、キャノーラ油、ココナツ ッ油等の油脂類、並びに、流動パラフィン、テトラデカン等の炭化水素等の非水溶性 基質の単独或いは 2種以上を添加したものを使用することができる。
[0059] pHや温度等の発酵条件や培養時間等は任意に設定でき、発酵後の培養液をそ のまま本発明のバイオサーファクタントとして使用することが可能である。また、発酵 後の培養液を必要に応じて濾過、遠心分離、抽出、精製、滅菌等の任意の操作を適 宜加えることも可能であり、得られたエキスを希釈、濃縮、乾燥することもできる。
[0060] 原料とする油脂類としては植物油脂が好ましい。植物油脂は特に限定されず、 目 的に応じて適宜選定することができる。例えば、大豆油、菜種油、コーン油、ピーナツ ッ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、ォリーブ油、パーム油などが挙げられ、これらの 中でも、大豆油がバイオサーファタタント（特に MEL)の生産効率（生産量、生産速 度、および収率）を向上させることができる点で特に好ましい。これらは、 1種を単独で 、または 2種以上を併用しても構わない。
[0061] 無機窒素源としては特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選定することができるが、 例えば、硝酸アンモニゥム、尿素、硝酸ナトリウム、塩化アンモニゥム、硫安等が挙げ られる。
[0062] ノ ォサーファタタントの回収、精製方法には特に制限はなぐ 目的に応じて適宜 選択することができる。例えば、培養液を遠心分離して油分を回収し、酢酸ェチル等 の有機溶媒で抽出濃縮することにより回収することができる。
[0063] 抽出溶媒としては、水、アルコール類（例えば、メタノール、無水エタノール、ェタノ ールなどの低級アルコール、またはプロピレングリコール、 1 , 3-ブチレングリコーノレ などの多価アルコール）、アセトンなどのケトン類、ジェチルエーテル、ジォキサン、ァ セトニトリノレ、酢酸ェチルなどのエステル類、キシレン、ベンゼン、クロ口ホルムなどの 有機溶媒を、単独であるいは 2種類以上の混液を任意に組み合わせて使用すること ができ、また、各々の溶媒抽出物が組み合わされたものでも使用することができる。
[0064] 抽出方法は特に制限されるものはないが、通常、常温から常圧下での溶媒の沸点 の範囲であればよぐ抽出後は濾過またはイオン交換樹脂を用い、吸着 '脱色'精製 して溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状とすればよい。多くの場合は、そのままの状 態で利用できるが、必要であれば、その効力に影響のない範囲でさらに脱臭、脱色 などの精製処理を加えてもよい。脱臭'脱色等の精製処理手段としては、活性炭カラ ムなどを用いればよぐ抽出物質により一般的に適用される通常の手段を任意に選 択して行えばよい。必要に応じて、シリカゲルカラムを用いて精製することにより、純 度の高!/、バイオサーファタタントを得ることができる。
[0065] バイオサーファタタントのトリァシル体を得る方法を、 MELのトリァシル体を製造する 方法を例として説明する力 本発明に用いられるバイオサーファタタントのトリアシノレ 体はトリァシル MELに限定されない。
[0066] 例えば、トリァシル MELを得るためには、上記のようにして微生物を発酵して製造 した培養液からトリァシル MEL画分を精製して得ることができる。また、大量に得るた めには、 MELを有機溶媒に溶かし、植物油などの脂肪酸誘導体を添加、加水分解 酵素の存在下でエステル化反応またはエステル交換反応を行う。
[0067] MELのエリスリトール部に導入される脂肪酸は長鎖炭化水素の 1価のカルボン酸 であればよい。また、飽和脂肪酸であっても不飽和脂肪酸であってもよい。不飽和脂 肪酸の場合、複数の二重結合を有していてもよい。炭素鎖は直鎖状であってもよく分 岐鎖状であってもよい。さらに、脂肪酸の誘導体である脂肪酸誘導体を本発明に使 用してもよいし、脂肪酸と脂肪酸誘導体の混合物を本発明に使用してもよい。 MEL のエリスリトール部に導入される脂肪酸または脂肪酸誘導体は、油類、高級脂肪酸、 合成エステル由来であることが好ましい。
[0068] 「油類」としては、植物油、動物油、鉱物油およびその硬化油であればよい。具体的 には、アボカド油、ォリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデミア ンナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、パーシック油、小麦胚芽油 、サザン力油、ヒマシ油、アマ二油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生 油、茶実油、カャ油、コメヌ力油、キリ油、ホホバ油、カカオ脂、ヤシ油、馬油、パーム 油、パーム核油、牛脂、羊脂、豚脂、ラノリン、鯨ロウ、ミツロウ、カルナゥバロウ、モク ロウ、キャンデリラロゥ、スクヮラン等の動植物油およびその硬化油。流動パラフィン、 ワセリン等の鉱物油、トリパルミチン酸グリセリン等の合成トリグリセリンが挙げられる。 好ましくはアボカド油、ォリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデ ミアンナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、パーシック油、小麦胚 芽油、サザン力油、ヒマシ油、アマ二油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落 花生油、茶実油、カャ油、コメヌ力油、より好ましくはォリーブ油、大豆油である。
[0069] 「高級脂肪酸」としては、例えばカプロン酸、力プリル酸、力プリン酸、ラウリン酸、ミリ スチン酸、ノ ルミチン酸、ォレイン酸、リノ一ノレ酸、リノレン酸、ステアリン酸、ベヘン酸 、 12—ヒドロキシステアリン酸、イソステアリン酸、ゥンデシン酸、トーノレ酸、エイコサぺ ンタエン酸、ドコサへキサェン酸などが挙げられる。好ましくはラウリン酸、ミリスチン酸 、パルミチン酸、ォレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、ゥンデシレン酸、よ り好ましくはォレイン酸、リノール酸、ゥンデシレン酸である。
[0070] 「合成エステル」としては、例えば、力プロン酸メチル、カプリル酸メチル、力プリン酸 メチル、ラウリン酸メチル、ミリスチン酸メチル、パルミチン酸メチル、ォレイン酸メチル 、リノール酸メチル、リノレン酸メチル、ステアリン酸メチル、ゥンデシン酸メチル、カプ ロン酸ェチル、カプリル酸ェチル、カプリン酸ェチル、ラウリン酸ェチル、ミリスチン酸 ェチル、パルミチン酸ェチル、ォレイン酸ェチル、リノール酸ェチル、リノレン酸ェチ ノレ、ステアリン酸ェチル、ゥンデシン酸ェチル、カプロン酸ビュル、カプリノレ酸ビュル、 力プリン酸ビュル、ラウリン酸ビュル、ミリスチン酸ビュル、パルミチン酸ビュル、ォレイ ン酸ビュル、リノール酸ビュル、リノレン酸ビュル、ステアリン酸ビュル、ゥンデシン酸 ビュル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オタチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、 ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸へ キシル、オレンィ酸デシル、ジメチルオクタン酸、乳酸セチル、乳酸ミリスチル等が挙 げられる。好ましくはラウリン酸メチル、ミリスチン酸メチル、ノ ルミチン酸メチル、ォレ イン酸メチル、リノール酸メチル、リノレン酸メチル、ステアリン酸メチル、ゥンデシレン 酸メチル、より好ましくはォレイン酸メチル、リノール酸メチル、ゥンデシレン酸メチル である。
[0071] トリァシル MELは、上述のように MELを有機溶媒に溶解して反応させることにより 生産すること力 Sできる。有機溶媒としては、 MELを可溶化できるものであれば限定さ れない。全部を可溶化できなくても一部を可溶化できるものであればよい。また、有 機溶媒は複数の有機溶媒の混合物でもよい。具体的には、例えば、メタノール、エタ ノーノレ、プロパノーノレ、ブタノーノレ、アセトン、プロノ ノン、ブタノン、ペンタン 2—ォ ン、 1 , 2 エタンジオール、 2, 3 ブタンジオール、ジォキサン、ァセトニトリル、 2— メチルーブタンー2 オール、第 3級ブタノール、 2 メチルプロパノール、 4ーヒドロ キシ一 2—メチルペンタノン、テトラヒドロフラン、へキサン、 DMF、 DMSO、ピリジン、 メチルェチルケトンなどを挙げることができる。好ましくはアセトン、テトラヒドロフラン、 第 3級ブタノール、ァセトニトリル、ジォキサン、より好ましくはアセトンである。
[0072] 加水分解酵素としては、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼが挙げられる。これ らの中から選択される少なくとも 1種を用いることが好ましぐ複数の加水分解酵素を 用いてもよい。好ましくはリパーゼ、エステラーゼ、より好ましくはリパーゼである。
[0073] 具体的には、例えば、 MEL生産微生物の培養液から精製した MELを有機溶媒（ 例えば、アセトン）に溶解し、これに市販のリパーゼ（例えば、ノボザィム 435 (ノボザィ ムズ社製）など）および植物油脂を添加する。
[0074] この製造方法の場合、反応温度は 10〜； 100°C、好ましくは 20〜50°C、より好ましく は 25〜40°Cで、 1日〜 7日間攪拌すればよい。また、反応液にモレキュラーシーブス を添加してもよい。この製造方法により、材料として添加した MELがほぼ定量的にトリ ァシル体となる。
[0075] トリァシル MELの精製は、上述の MELの精製に準じて行うことができる。
[0076] 上述のようにして得られるバイオサーファクタントは、そのまま賦活化剤として利用す ることも可能である力 化粧品、医薬部外品、医薬品、食品に配合して利用すること が好ましい。バイオサーファタタントを配合する濃度は、吸収程度、作用程度、製品 形態、使用頻度などによって適宜選択され、特に限定されるのもではない。細胞賦活 化作用を損なわない範囲で配合濃度を選択すればよぐ賦活化剤全重量に対し、通 常 0. 00；!〜 50質量％が好ましぐ 0. ；!〜 20質量％がより好ましぐ；!〜 15質量％が さらに好ましく 3〜； 10質量％が特に好ましい。
[0077] ここで、賦活化剤に配合するバイオサーファクタントの使用形態は任意である。例え ば、ノ^オサーファタタントを培養液からの抽出物のまま、あるいは精製した高純度品 、もしくは水に懸濁し、あるいはエタノール等の有機溶媒に溶力、した後使用してもよい
[0078] ノ^オサーファタタントを用いた本発明に係る賦活化剤の製造方法は、特に限定さ れるものではないが、
ノ ォサーファタタントを用いた本発明に係る賦活化剤の製造方法は特に限定され るものではないが、バイオサーファタタントは疎水性が高いため、非イオン性の界面 活性剤や低級アルコール、多価アルコール、あるいはォリーブ油、スクヮラン、脂肪 酸などの天然油脂に溶解して用いることが好ましい。
[0079] 非イオン界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル類 (例えば、ソル ビタンモノォレエート、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソル ビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンセスキォレエート、ソ ノレビタントリオレエート、ペンター 2—ェチルへキシル酸ジグリセロールソルビタン、テ トラー 2—ェチルへキシル酸ジグリセロールソルビタン等）；グリセリンポリグリセリン脂 肪酸類 (例えば、モノ綿実油脂肪酸グリセリン、モノエル力酸グリセリン、セスキォレイ ン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、 α , α，ーォレイン酸ピログルタミン酸ダリ セリン、モノステアリン酸グリセリンリンゴ酸等）；プロピレングリコール脂肪酸エステル 類（例えば、モノステアリン酸プロピレングリコール等）；硬化ヒマシ油誘導体；グリセリ ンアルキルエーテル等が挙げられる。
[0080] ΡΟΕ系の親水性非イオン界面活性剤としては、例えば、 ΡΟΕ—ソルビタン脂肪酸 エステル類（例えば、 ΡΟΕ—ソルビタンモノォレエート、 ΡΟΕ—ソルビタンモノステア レート、 ΡΟΕ—ソルビタンモノォレエート、 ΡΟΕ—ソルビタンテトラオレエート等）； ΡΟ Εソルビット脂肪酸エステル類（例えば、 ΡΟΕ—ソルビットモノラウレート、 ΡΟΕ—ソル ビットモノォレエート、 POE ソルビットペンタォレエート、 POE ソルビットモノステア レート等）； POE グリセリン脂肪酸エステル類（例えば、 POE グリセリンモノステア レート、 POE グリセリンモノイソステアレート、 POE グリセリントリイソステアレート等 の POE モノォレエート等）； POE 脂肪酸エステル類（例えば、 POE ジステアレ ート、 POE モノジォレエート、ジステアリン酸エチレングリコール等）； POE アルキ ノレエーテル類（例えば、 POE ラウリルエーテル、 POE ォレイルエーテル、 POE ーステアリルエーテル、 POE べへニルエーテル、 POE— 2—オタチルドデシルェ 一テル、 POE コレスタノールエーテル等）；プル口ニック型類（例えば、プル口ニック 等）； ΡΟΕ· POP アルキルエーテル類（例えば、 ΡΟΕ· POP セチルエーテル、 P OE · POP— 2—デシルテトラデシルエーテル、 POE · POP—モノブチルエーテル、 POE'POP 水添ラノリン、 POE'POP グリセリンエーテル等）；テトラ POE.テトラ POP エチレンジァミン縮合物類（例えば、テトロニック等）； POE ヒマシ油硬化ヒ マシ油誘導体（例えば、 POE ヒマシ油、 POE 硬化ヒマシ油、 POE 硬化ヒマシ 油モノイソステアレート、 POE 硬化ヒマシ油トリイソステアレート、 POE 硬化ヒマシ 油モノピログルタミン酸モノイソステアリン酸ジエステル、 POE 硬化ヒマシ油マレイ ン酸等）； POE ミツロウ'ラノリン誘導体（例えば、 POE ソルビットミツロウ等）；アル 力ノールアミド（例えば、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、ラウリン酸モノエタノールァ ミド、脂肪酸イソプロパノールアミド等）； POE プロピレングリコール脂肪酸エステル ； POE -アルキルアミン； POE 脂肪酸アミド；ショ糖脂肪酸エステル；アルキルエト キシジメチルアミンォキシド；トリオレィルリン酸等が挙げられる。
[0081] 低級アルコールとしては、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ィ ソブチルアルコール、 t ブチルアルコール等が挙げられる。
[0082] 多価アルコールとしては、例えば、 2価のアルコール（例えば、エチレングリコール、 プロピレングリコール、トリメチレングリコール、 1 , 2 ブチレングリコール、 1 , 3 ブチ レングリコーノレ、テトラメチレングリコーノレ、 2, 3 ブチレングリコーノレ、ペンタメチレン グリコーノレ、 2—ブテン 1 , 4 ジォーノレ、へキシレングリコーノレ、オタチレングリコー ル等）；3価のアルコール（例えば、グリセリン、トリメチロールプロパン等）；4価アルコ ール（例えば、 1 , 2, 6 へキサントリオール等のペンタエリスリトール等）； 5価アルコ ール（例えば、キシリトール等）；6価アルコール（例えば、ソノレビトーノレ、マンニトーノレ 等）；多価アルコール重合体（例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール 、トリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、テトラエチレンダリコール、ジグリ セリン、ポリエチレングリコール、トリグリセリン、テトラグリセリン、ポリグリセリン等）；2価 のアルコールアルキルエーテル類（例えば、エチレングリコールモノメチルエーテル、 エチレングリコーノレモノェチノレエーテノレ、エチレングリコーノレモノブチノレエーテノレ、ェ チレングリコ一ノレモノフエニノレエーテノレ、エチレングリコ一ノレモノへキシノレエーテノレ、 エチレングリコーノレモノ 2—メチノレへキシノレエーテノレ、エチレングリコーノレイソアミノレェ ーテノレ、エチレングリコーノレべンジノレエーテノレ、エチレングリコーノレイソプロピノレエ一 テノレ、エチレングリコーノレジメチノレエーテノレ、エチレングリコーノレジェチノレエーテノレ、 エチレングリコールジブチルエーテル等）； 2価アルコールアルキルエーテル類（例え ば、ジエチレングリコーノレモノメチノレエーテノレ、ジエチレングリコーノレモノェチノレエー テル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエー テノレ、ジエチレングリコーノレジェチノレエーテノレ、ジエチレングリコーノレブチノレエーテ ノレ、ジエチレングリコーノレメチノレエチノレエーテノレ、トリエチレングリコーノレモノメチノレエ ーテノレ、トリエチレングリコーノレモノェチノレエーテノレ、プロピレングリコーノレモノメチノレ エーテノレ、プロピレングリコーノレモノェチノレエーテノレ、プロピレングリコ一ノレモノブチ ノレエーテノレ、プロピレングリコーノレイソプロピノレエーテノレ、ジプロピレングリコ一ノレメチ ノレエーテノレ、ジプロピレングリコーノレエチノレエーテノレ、ジプロピレングリコーノレブチノレ エーテル等）；2価アルコールエーテルエステル（例えば、エチレングリコールモノメチ ルエーテルアセテート、エチレングリコールモノェチルエーテルアセテート、エチレン グリコーノレモノブチノレエーテノレアセテート、エチレングリコーノレモノフエニノレエーテノレ アセテート、エチレングリコーノレジアジべート、エチレングリコーノレジサクシネート、ジ エチレングリコールモノェチルエーテルアセテート、ジエチレングリコールモノブチル エーテノレアセテート、プロピレングリコーノレモノメチノレエーテノレアセテート、プロピレン グリコーノレモノェチノレエーテノレアセテート、プロピレングリコーノレモノプロピノレエーテ ルアセテート、プロピレングリコールモノフエニルエーテルアセテート等）；グリセ リンモノアルキルエーテル（例えば、キミノレァノレコーノレ、セラキルアルコーノレ、ノ チノレ アルコール等）；糖アルコール（例えば、ソノレビトーノレ、マノレチトーノレ、マルトトリオース 、マンニトール、ショ糖、エリトリトール、グルコース、フルクトース、デンプン分解糖、マ ルトース、キシリトース、デンプン分解糖還元アルコール等）；グリソリッド；テトラハイド 口フルフリルアルコール； POE テトラハイド口フルフリルアルコール； POP ブチル エーテノレ； POP · POE ブチノレエーテノレ；トリポリォキシプロピレングリセリンエーテノレ ； POP -グリセリンエーテル； POP -グリセリンエーテルリン酸； POP · POE ペンタ ンエリスリトールエーテル、ポリグリセリン等が挙げられる。
[0083] 油類としては、アボカド油、ォリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、月見草油、タートル油、 マ力デミアンナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、パーシック油、小 麦胚芽油、サザン力油、ヒマシ油、アマ二油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油 、落花生油、茶実油、カャ油、コメヌ力油、キリ油、ホホバ油、カカオ脂、ヤシ油、馬油 、パーム油、パーム核油、牛脂、羊脂、豚脂、ラノリン、鯨ロウ、ミツロウ、カルナウバロ ゥ、モクロウ、キャンデリラロゥ、スクヮラン等の動植物油およびその硬化油。流動パラ フィン、ワセリン等の鉱物油、トリパルミチン酸グリセリン等の合成トリグリセリンがある。
[0084] 高級脂肪酸としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、ノ ルミチン酸、ォレイン酸、リ ノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、 12—ヒドロキシステアリン酸、イソステ アリン酸、ゥンデシン酸、トール酸、エイコサペンタエン酸、ドコサへキサェン酸などが ある。高級アルコールとしては、例えば、ラウリノレアノレコール、セチルアルコール、ステ ァリノレアノレ 一ノレ、ベへニノレアノレコーノレ、ミリスチノレアノレ: 3—ノレ、才レイノレアノレコーノレ 、セトステアリノレアノレコーノレ、ホホバァノレコーノレ、ラノリンァノレコーノレ、ノ チノレアノレコー ノレ、 2—デシノレテトラテセシノーノレ、コレステロ一ノレ、フィトステロ一ノレ、イソステアリノレ アルコール等がある。合成エステルとしては、例えば、オクタン酸セチル、ミリスチン酸 オタチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸イソ プロピル、ステアリン酸プチル、ラウリン酸へキシル、オレンィ酸デシル、ジメチルォク タン酸、乳酸セチル、乳酸ミリスチル等がある。シリコーンとしては、例えば、ジメチル ポリシロキサン、メチノレフエニノレポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、デカメチノレシ クロポリシロキサン等の環状ポリシロキサン、シリコーン樹脂等の三次元網目構造のも の等がある。 [0085] 上述のように、本発明に係る賦活化剤は、有効成分であるバイオサーファクタントを 化粧品、医薬部外品、医薬品、食品に配合して組成物の形態で実施することが好ま しい。
[0086] 化粧品、医薬部外品、医薬品の形態で実施する場合、外用剤とすることが好適で ある。ただし、バイオサーファタタントは経口摂取も可能であるため、外用剤に限定さ れず、内用剤、飲食品としてもよい。
[0087] 本発明に係る賦活化剤を医薬品とする場合は、バイオサーファタタントのヒト頭髪毛 乳頭細胞賦活作用が実証されていることから、発毛促進用および脱毛進行予防用医 薬品とすること力 Sでさる。
[0088] 剤形は限定されず、アンプル、カプセル、粉末、顆粒、丸剤、錠剤、固形剤、液剤、 ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート、ムース、浴用剤など多様なものとすること ができる。
[0089] 具体的には、化粧品、医薬部外品、医薬品としては、例えば内用 ·外用薬用製剤、 化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パックなどの基礎化粧料、洗顔料 や皮膚洗浄料、シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、ヘアクリーム、ポマード、へ ァスプレー、整髪料、パーマ剤、ヘアートニック、染毛料、育毛 '養毛料などの頭髪化 粧料、ファンデーション、白粉、おしろい、口紅、頰紅、アイシャドウ、アイライナー、マ スカラ、眉墨、まつ毛などのメークアップ化粧料、美爪料などの仕上げ用化粧料、香 水類、浴用剤、その他、歯磨き類、口中清涼剤 ·含嗽剤、液臭 ·防臭防止剤、衛生用 品、衛生綿類、ウエットティシュなどが挙げられる。
[0090] 具体的には、飲食品としては、例えば清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、 乳酸飲料等の飲料、アイスクリーム、アイスシャーベット、力、き氷等の冷菓、そば、うど ん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麵、即席麵等の麵類、飴、キャンデ ィー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼 き菓子、パン等の菓子類、力二、サケ、アサリ、マグロ、イワシ、ェビ、カツォ、サノ 、ク ジラ、カキ、サンマ、イカ、ァカガイ、ホタテ、ァヮビ、ゥュ、イクラ、トコブシ等の水産物 、かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産'畜産加工食品、加工乳、発酵乳等の乳製品 、サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ド レッシング等の油脂および油脂加工食品、ソース、たれ等の調味料、カレー、シチュ 一、親子丼、お粥、雑炊、中華丼、かつ丼、天丼、うな丼、ノ、ヤシライス、おでん、マ ーボドーフ、牛丼、ミートソース、玉子スープ、オムライス、餃子、シユーマイ、ハンバ ーグ、ミートボール等のレトルトバウチ食品、種々の形態の健康 ·栄養補助食品、保 健機能食品、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチなどが挙げられる。
[0091] 本発明に係る賦活化剤はヒトに対して好適に適用されるものである力 それぞれの 作用効果が期待できる限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
[0092] 本発明に係る賦活化剤は、有効成分であるバイオサーファクタントに加え、必要に 応じて本発明の効果を損なわない範囲内で、化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品 に使用される成分や添加剤を併用して配合することができる。
[0093] 例えば、油脂類としては、アポガド油、アルモンド油、ウイキヨゥ油、エゴマ油、オリー ブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカ才 β旨、力ミツレ油、力ロット油、キ ユーカンバー油、牛脂、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、大豆油、ツバキ 油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル 油、ミンク油、卵黄油、カカオ脂、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚 脂、硬化油、硬化ヒマシ油などが挙げられる。
[0094] 例えば、ロウ類としては、ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還 元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロゥ、モンタンロウ、セラックロウなどが挙げられる。
[0095] 例えば、鉱物油としては、流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、ォゾケライド、セレシ ン、マイクロクリスタンワックス、ポリエチレン末、スクワレン、スクヮラン、プリスタンなど が挙げられる。
[0096] 例えば、脂肪酸類としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、ノ ルミチン酸、ステアリン酸、 ベヘン酸、ォレイン酸、 12-ヒドロキシステアリン酸、ゥンデシレン酸、トール油、ラノリ ン脂肪酸などの天然脂肪酸、イソノナン酸、カプロン酸、 2—ェチルブタン酸、イソぺ ンタン酸、 2—メチルペンタン酸、 2—ェチルへキサン酸、イソペンタン酸などの合成 脂肪酸が挙げられる。
[0097] 例えば、アルコール類としては、エタノール、イソピロパノール、ラウリノレアノレコール、 セタノーノレ、ステアリノレアノレコーノレ、ォレイノレアノレコーノレ、ラノリンァノレコーノレ. コレス テロール、フィトステロールなどの天然アルコーノレ、 2—へキシルデカノーノレ、イソステ ァリルアルコール、 2—オタチルドデカノールなどの合成アルコーノレ、酸化エチレン、 エチレングリコーノレ、ジエチレングリコーノレ、 トリエチレングリコーノレ、エチレングリコー ノレモノェチノレエーテノレ、エチレングリコーノレモノブチノレエーテノレ、ジエチレングリコー ノレモノメチノレエーテノレ、ジエチレングリコ一ノレモノェチノレエーテノレ、ポリエチレングリコ 一ノレ、酸化プロピレン、プロピレングリコーノレ、ポリプロピレングリコール、 1 , 3—ブチ レングリコーノレ、グリセリン、ノ チノレアノレコーノレ、ペンタエリトリトーノレ、ソノレビトーノレ、マ ンニトール、ブドウ糖、ショ糖などの多価アルコール類などが挙げられる。
[0098] 例えば、エステル類としては、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、 ステアリン酸プチル、ラウリン酸へキシル、ミリスチン酸ミリスチル、ォレイン酸ォレイル 、ォレイン酸デシル、ミリスチン酸オタチルドデシル、ジメチルオクタン酸へキシルデシ ノレ、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジェチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン 、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジォレ イン酸プロピレングリコールなどが挙げられる。
[0099] 例えば、金属セッケンとしては、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム 、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛、ミリスチン酸マグネ シゥム、ラウリン酸亜鉛、ゥンデシレン酸亜鉛などが挙げられる。
[0100] 例えば、ガム質および水溶性高分子化合物としては、アラビアゴム、ベンゾインゴム
、ダンマルゴム、グアヤタ脂、アイルランド苔、カラャゴム、トラガントゴム、キヤロブゴム 、クインシード、寒天、カゼイン、デキストリン、ゼラチン、ぺクチン、デンプン、カラギー ン、キトサン塩、硫酸化キチン、リン酸化キチン、アルギン酸およびその塩、ヒアルロン 酸およびその塩、コンドロイチン硫酸、へパリン、ェチルセルロース、メチルセルロー
ロセノレロース、結晶セノレロース、ポリビニノレアノレコーノレ、ポリビニノレメチノレエーテノレ、 ポリビュルピロリドン、ポリビュルメタアタリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンォキ サイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイドまたはその架橋重合 物、カルボキシビュルポリマー、ポリエチレンィミンなどが挙げられる。
[0101] 例えば、界面活性剤としては、ァニオン界面活性剤（カルボン酸塩、スルホン酸塩、 硫酸エステル塩、リン酸エステル塩）、カチオン界面活性剤（ァミン塩、四級アンモニ ゥム塩）、両性界面活性剤（カルボン酸型両性界面活性剤、硫酸エステル型両性界 面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤）、非ィ オン界面活性剤（エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界 面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤 、含窒素型非イオン界面活性剤）、その他の界面活性剤 (天然界面活性剤、タンパク 質加水分解物の誘導体、高分子界面活性剤、チタン'ケィ素を含む界面活性剤、フ ッ化炭素系界面活性剤などが挙げられる。
[0102] 例えば、ビタミン類としては、ビタミン A群ではレチノール、レチナール（ビタミン A1) 、デヒドロレチナール（ビタミン A2)、カロチン、リコピン（プロビタミン A)、ビタミン B群 では、チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩（ビタミン B1)、リボフラビン（ビタミン B2)、ピリド キシン（ビタミン B6)、シァノコバラミン（ビタミン B12)、葉酸類、ニコチン酸類、パントテ ン酸類、ビォチン類、コリン、イノシトール類、ビタミン C群では、ァスコルビン酸および その誘導体、ビタミン D群では、ェルゴカルシフエロール（ビタミン D2)、コレカルシフ エロール（ビタミン D3)、ジヒドロタキステロール、ビタミン E群では、トコフエロールおよ びその誘導体、ュビキノン類、ビタミン K群では、フイトナジオン（ビタミン K1)、メナキ ノン（ビタミン K2)、メナジオン（ビタミン K3)、メナジオール（ビタミン K4)などが挙げら れる。
[0103] 例えば、アミノ酸としては、ノ リン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチォニン、フ ェニルァラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、ァラニン、ァスパラギン、グルタミン、 セリン、システィン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、ァスパラギン酸、 グノレタミン酸、ヒドロキシリジン、ァノレギニン、才ノレニチン、ヒスチジンなどや、それらの 硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クェン酸塩、あるいはピロリドンカルボン酸の如きアミノ酸 誘導体などが挙げられる。
[0104] 例えば、美白剤としては、ァスコルビン酸またはその誘導体、ィォゥ、胎盤加水分解 物、エラグ酸またはその誘導体、コウジ酸またはその誘導体、ダルコサミンまたはその 誘導体、アルブチンまたはその誘導体、ヒドロキシケィヒ酸またはその誘導体、グルタ チォン、ァ /レニ力エキス、ォゥゴンエキス、ソゥハクヒエキス、サイコエキス、ボウフゥェ キス、マンネンタケ菌糸体培養物またはその抽出物、シナノキエキス、モモ葉エキス、 エイジッエキス、クジンエキス、ジュエキス、トウキエキス、ョクイニンエキス、力キ葉ェ キス、ダイ才ゥエキス、ボタンピエキス、ノヽマメリスエキス、マロニエエキス、才トギリソゥ エキス、油溶性カンゾゥエキスなどが挙げられる。
[0105] 例えば、保湿剤としては、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸、セリン、グリシン、スレオニ ン、ァラニン、コラーゲン、加水分角早コラーゲン、ヒドロネクチン、フイブロネクチン、ケ ラチン、エラスチン、ローヤルゼリー、コンドロイチン硫酸へパリン、グリセ口リン脂質、 グリセ口糖脂質、スフインゴリン脂質、スフインゴ糖脂質、リノール酸またはそのエステ ル類、エイコサペンタエン酸またはそのエステル類、ぺクチン、ビフィズス菌発酵物、 乳酸発酵物、酵母抽出物、レイシ菌糸体培養物またはその抽出物、小麦胚芽油、ァ ボガド油、米胚芽油、ホホバ油、ダイズリン脂質、 γ —オリザノール、ビロウドアオイェ キス、ョクイユンエキス、ジ才ゥエキス、タイソゥエキス、力イソゥエキス、キダチアロェェ キス、ゴボウエキス、マンネンロウエキス、アル二力エキス、小麦フスマなどが挙げられ
[0106] 例えば、育毛剤としては、ペンタデカン酸グリセリド、コレウスエキス、ゲンチアナェ キス、マッカサェキス、ローヤノレゼリーエキス、クマザサエキス、 t-フラノくノン、 6_ベン ジルァミノプリン、センブリエキス、塩化カルプロニゥム、ミノキシジノレ、フィナステリド、 アデノシン、ニコチン酸アミド、桑の根エキス、ジォゥエキス、 5-アミノレブリン酸などが 挙げられる。
[0107] 例えば、動物あるいは植物、生薬の抽出物やエキスとしては、ァセンャク（阿仙薬） 、ァシタバ、ァセロラ、ァノレテア、アル二力、アボカド、アマチヤ（甘茶）、アロエ、アロエ ベラ、イラクサ、イチヨウ (銀杏葉、銀杏）、ウイキヨゥ（茴香）、ゥコン (鬱金）、ウスパサイ シン (細辛）、ウメ（烏梅）、ゥラジ口ガシ、ゥワウルシ、ノイバラ（営実）、ヒキォコシ (延命 草）、ォウギ (黄耆）、コガネバナ (ォゥゴン）、ャマザクラ (桜皮）、キハダ (黄柏）、ォゥ レン (黄連）、ォタネニンジン（人参）、オトギリソゥ（弟切草）、ォドリコソゥ、オランダガラ シ、オレンジ、イトヒメハギ（遠志）、ゥッボダサ（夏枯草）、ツルドクダミ（何首烏）、ェン ジュ (槐花）、ョモギ (ガイ葉）、ガジュッ (莪朮）、クズ (葛根）、カノコソゥ（吉草根）、カミ ッレ、キカラスゥリ（瓜呂根）、力ワラョモギ（茵チン蒿）、カンゾゥ（甘草）、フキタンポポ (款冬花、款冬葉）、キイチゴ、キウイ果実、キキヨウ (桔梗）、キク (菊花）、キササゲ（ 梓実）、ミカン属植物果実 (枳実）、タチバナ (橘皮)、キユウリ、ウドまたはシシウド (羌活 、独活）、アンズ (杏仁）、クコ（地骨皮、枸杞子、枸杞葉）、クララ（苦参）、タスノキ、ク マザサ、グレープフルーツ果実、二ッケィ (桂皮）、ケィガイ (ケィガイ）、ェビスダサ (決 明子）、マルバアサガオまたはアサガオ (ケン牛子）、ベニバナ（紅花）、ゴバイシ（五 倍子）、コンフリー、コパイバ、クチナシ（山梔子）、ゲンチアナ、ホオノキ (厚朴）、ヒナ タイノコズチ（牛膝）、ゴシュュ（呉茱萸）、ゴボウ、チョウセンゴミシ (五味子）、米、米ぬ 力、、コムギ、ミシマサイコ（柴胡）、サフラン、サボンソゥ、サンザシ（山ザ子）、サンショウ (山椒）、サルビア、サンシチニンジン（三七人参）、シィタケ (椎茸）、ジォゥ（地黄）、 シクンシ (使君子）、ムラサキ (紫根)、シソ (紫蘇葉、紫蘇子）、カキ (柿蒂）、シャクャク（ 芍薬）、ォォバコ（車前子、車前草）、ショウガ (生姜）、ショウブ (菖蒲）、トウネズミモチ (女貞子）、シモッケソゥ、シラカバ、スイカズラ（金銀花、忍冬）、セィヨウキヅタ、セィ ヨウノコギリソゥ、セィヨウニヮトコ、ァズキ（赤小豆）、ニヮトコ（接骨木）、ゼニァオイ、セ ンキユウ (川キユウ）、センプリ（当薬）、クヮ（桑白皮、桑葉）、ナツメ (大棗）、ダイズ、タ ラノキ、チクセッニンジン (竹節人参）、ハナスゲ (知母）、ヮレモコゥ（地楡）、ドクダミ（ 十薬）、フユムシナツクサタケ (冬虫夏草）、トウガラシ、ホオズキ (登呂根）、タチジヤコ ゥソゥ、リヨクチャ（緑茶）、コウチヤ (紅茶）、チヨウジ (丁子）、ゥンシユウミカン (陳皮）、 ツバキ、ッボクサ、トウガラシ (番椒）、トウキ（当帰）、トウキンセン力、ダイダイ (橙皮）、 ヮレモコゥ（地楡）、トウモロコシ（南蛮毛）、トチュウ（杜仲、杜仲葉）、トマト、ナンテン（ 南天実）、ニンニク (大サン）、ォォムギ (麦芽）、ハクセン（白蘚皮）、ジヤノヒゲ (麦門 冬）、パセリ、バタタ、ハツ力（薄荷）、ハマメリス、バラ、ビヮ葉 (枇杷葉）、マツホド（茯リ ヨウ）、ブドウまたはその葉、へチマ、ボダイジュ、ボタン (牡丹皮）、ホップ、マイカイ（ マイ瑰花）、松葉、マロニエ、マンネンロウ、ムクロジ、メリッサ、メリロート、ボケ（木瓜） 、モヤシ、モモ（桃仁、桃葉）、ヒォウギ (射干）、ビンロウジュ（檳ロウ子）、メハジキ（益 母草）、ャグルマギク、ユキノシタ（虎耳草）、ャマモモ（楊梅皮）、ヤシャブシ (矢車）、 ハトムギ（ョクイニン）、モウコョモギ、ャマョモギ、ラベンダー、リンゴ果実、マンネンタ ケ（霊芝）、レモン果実、レンギヨゥ（連翹）、レンゲソゥ、ゲンノショウコ（老鸛草）、ハシ リドコ口（ロート根）、鶏トサ力、牛'人の胎盤抽出物、豚'牛の胃、十二指腸、或いは腸 の抽出物若しくはその分解物、水溶性コラーゲン、水溶性コラーゲン誘導体、コラー ゲン加水分解物、エラスチン、エラスチン加水分解物、水溶性エラスチン誘導体、シ ルク蛋白、シルク蛋白分解物、牛血球蛋白分解物などが挙げられる。
[0108] 例えば、微生物培養代謝物としては、酵母エキス、亜鉛含有酵母エキス、ゲルマ二 ゥム含有酵母エキス、セレン含有酵母エキス、マグネシウム含有酵母エキス、米醱酵 エキス、ユーグレナ抽出物、脱脂粉乳の乳酸発酵物などが挙げられる。
[0109] 例えば、 α—ヒドロキシ酸としては、グリコーノレ酸、クェン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳 酸などが挙げられる。
[0110] 例えば、無機顔料としては、無水ケィ酸、ケィ酸マグネシウム、タルク、カオリン、ベ ントナイト、マイ力、雲母チタン、ォキシ塩化ビスマス、酸化ジルコニウム、酸化マグネ シゥム、酸化亜鉛、酸化チタン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、黄酸化鉄、ベン ガラ、黒酸化鉄、グンジヨウ、酸化クロム、水酸化クロム、カーボンブラック、カラミンな どが挙げられる。
[0111] 例えば、紫外線吸収剤としては、 ρ—ァミノ安息香酸誘導体、サルチル酸誘導体、 アントラニル酸誘導体、クマリン誘導体、アミノ酸系化合物、ベンゾトリアゾール誘導 体、テトラゾール誘導体、イミダゾリン誘導体、ピリミジン誘導体、ジォキサン誘導体、 カンファー誘導体、フラン誘導体、ピロン誘導体、核酸誘導体、アラントイン誘導体、 ニコチン酸誘導体、ビタミン Β6誘導体、ォキシベンゾン、ベンゾフエノン、グアイァズレ ン、シコニン、バイカリン、ノ イカレイン、ベルべリンなどが挙げられる。
[0112] 例えば、収斂剤としては、乳酸、酒石酸、コハク酸、クェン酸、アラントイン、塩化亜 鉛、硫酸亜鉛、酸化亜鉛、カラミン、 ρ—フエノールスルホン酸亜鉛、硫酸アルミニウム カリウム、レソルシン、塩化第二鉄、タンニン酸などが挙げられる。
[0113] 例えば、抗酸化剤としては、ァスコルビン酸およびその塩、ステアリン酸エステル、ト コフエロールおよびそのエステル誘導体、ノルジヒドログァセレテン酸、ブチルヒドロキ シトルエン（ΒΗΤ)、ブチルヒドロキシァ二ソール（ΒΗΑ)、パラヒドロキシァニソール、 没食子酸プロピル、セサモール、セサモリン、ゴシポールなどが挙げられる。 [0114] 例えば、抗炎症剤としては、ィクタモール、インドメタシン、カオリン、サリチル酸、サ リチル酸ナトリウム、サリチル酸メチル、ァセチルサリチル酸、塩酸ジフェンヒドラミン、 dまたは dl—力ンフノレ、ヒドロコルチゾン、グアイァズレン、カマズレン、マレイン酸クロ ルフエ二ラミン、グリチルリチン酸およびその塩、グリチルレチン酸およびその塩など が挙げられる。
[0115] 例えば、殺菌 '消毒薬としては、アタリノール、ィォゥ、塩化ベンザルコニゥム、塩化 ベンゼトニゥム、塩化メチルロザ二リン、クレゾ一ノレ、ダルコン酸カルシウム、ダルコン 酸クロルへキシジン、スルファミン、マーキュロクロム、ラタトフエリンまたはその加水分 解物などが挙げられる。
[0116] 例えば、頭髪用剤としては、二硫化セレン、臭化アルキルイソキノリニゥム液、ジンク ピリチ才ン、ビフエナミン、チアントール、カスタリチンキ、ショウキヨウチンキ、トウガラシ チンキ、塩酸キニーネ、強アンモニア水、臭素酸カリウム、臭素酸ナトリウム、チォダリ コール酸などが挙げられる。
[0117] 例えば、香料としては、ジヤコゥ、シベット、カストリウム、アンバーグリスなどの天然 動物性香料、ァニス精油、アングリ力精油、イラン精油、ィリス精油、ウイキヨゥ精油、 オレンジ精油、カナンガ精油、力ラウエ一精油、カルダモン精油、グアヤタウッド精油 、クミン精油、黒文字精油、ケィ皮精油、シンナモン精油、ゲラニゥム精油、コパイバ バルサム精油、コリアンデル精油、シソ精油、シダーウッド精油、シトロネラ精油、ジャ スミン精油、ジンジャーグラス精油、杉精油、スペアミント精油、西洋ハツ力精油、大茴 香精油、チュべローズ精油、丁字精油、橙花精油、冬緑精油、トルーバルサム精油、 バチユリ一精油、バラ精油、パルマローザ精油、檜精油、ヒバ精油、白檀精油、プチ ダレン精油、べィ精油、べチバ精油、ベルガモット精油、ペルーバルサム精油、ボア ドローズ精油、芳樟精油、マンダリン精油、ユーカリ精油、ライム精油、ラベンダー精 油、リナロェ精油、レモングラス精油、レモン精油、ローズマリー精油、和種ハツ力精 油などの植物性香料、その他合成香料などが挙げられる。
[0118] 例えば、色素 ·着色剤としては、赤キャベツ色素、赤米色素、ァカネ色素、アナトー 色素、イカスミ色素、ゥコン色素、ェンジュ色素、ォキアミ色素、柿色素、カラメル、金 、銀、クチナシ色素、コーン色素、タマネギ色素、タマリンド色素、スピルリナ色素、ソ バ全草色素、チェリー色素、海苔色素、ハイビスカス色素、ブドウ果汁色素、マリーゴ 一ルド色素、紫ィモ色素、紫ャマイモ色素、ラック色素、ルチンなどが挙げられる。
[0119] 例えば、甘味料としては、砂糖、甘茶、果糖、ァラビノース、ガラクトース、キシロース 、マンノース、麦芽糖、蜂蜜、ブドウ糖、ミラクリン、モネリンなどが挙げられる。
[0120] 例えば、栄養強化剤としては、貝殻焼成カルシウム、シァノコラバミン、酵母、小麦 胚芽、大豆胚芽、卵黄粉末、へミセルロース、ヘム鉄などが挙げられる。
[0121] その他、ホルモン類、金属イオン封鎖剤、 pH調整剤、キレート剤、防腐'防バイ剤、 清涼剤、安定化剤、乳化剤、動 ·植物性蛋白質およびその分解物、動 ·植物性多糖 類およびその分解物、動'植物性糖蛋白質およびその分解物、血流促進剤、消炎剤 *抗アレルギー剤、細胞賦活剤、角質溶解剤、創傷治療剤、増泡剤、増粘剤、口腔 用剤、消臭 ·脱臭剤、苦味料、調味料、酵素などが挙げられる。
[0122] < 2.杭老化方法〉
本発明に係る賦活化剤の有効成分であるバイオサーファタタントを用いることにより
、抗老化方法を提供することができる。すなわち、本発明には、バイオサーファクタン トを用いる抗老化方法が含まれる。
[0123] 本発明に係る抗老化方法は、（i)バイオサーファタタントを動物に接触させる工程を 含むことを特徴としている。バイオサーファタタントとしては、マンノシルエリスリトールリ ピッド（MEU、マンノシルマン二トールリピッド（MML)、マンノシルエリスリトールリピ 体からなる群より選択された少なくとも 1種であることが好ましい。
[0124] 動物としては、バイオサーファタタントの抗老化効果が期待できる限り特に限定され ないが、哺乳動物が好ましぐヒトが特に好ましい。
[0125] 「動物に接触させる」とは、動物の皮膚、粘膜など、外用剤が適用される範囲にバイ ォサーファタタントを接触させることが意図される。
[0126] 本発明に係る抗老化方法は、さらに（ii)バイオサーファタタントで細胞を賦活させる 工程を含むことを特徴としている。細胞賦活作用を有するバイオサーファタタントで細 胞を賦活させることにより、例えば、皮膚のしわ、たるみ、硬化等を防止、改善して弹 力のある若々しい健康な肌の状態を維持することなどの抗老化効果を発揮すること が可能となる。
[0127] 〔実施の形態 2〕
本発明の他の実施形態について説明すると以下の通りである。
[0128] < 1.マンノシルエリスリトールリピッド（MEL)〉
本発明に係る MELの理解の一助とすべぐまず従来型 MELについて概説する。
[0129] 従来型 MELは、 MEL生産菌の培養によって得られ、その化学構造の代表例は以 下の一般式（5)に示すように、 4-0- β—D—マンノビラノシルー meso—エリスリト ールをその基本構造とするものである。
[0130] [化 6]
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R； alky! or alkenyi
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[0131] 上記一般式（5)中、置換基 Rは炭化水素基（アルキル基又はアルケニル基）である 。上記従来型 MELは、マンノースの 4位及び 6位のァセチル基の有無から MEL— A 、 MEL— B、 MEL— C及び MEL— Dの 4種類が知られている。
[0132] まず、 MEL— Aは、上記一般式（5)中、置換基 R1及び R2がともにァセチル基であ る。 MEL— Bは、上記一般式（5)中、置換基 R1がァセチル基で置換基 R2は水素で ある。 MEL— Cは、上記一般式（5)中、置換基 R1が水素で置換基 R2はァセチル基 である。 MEL— Dは、上記一般式（5)中、置換基 R1及び R2がともに水素である。
[0133] 上記 MEL— A〜MEL— Dにおける置換基 Rの炭素数は、 MEL生産培地に含有 させる油脂類中のトリグリセリドを構成する脂肪酸の炭素数及び使用する MEL生産 菌の脂肪酸の資化の程度により変化する。また、上記トリグリセリドが不飽和脂肪酸残 基を有する場合、 MEL生産菌が上記不飽和脂肪酸の二重結合部分まで資化しなけ れば、置換基 Rとして不飽和脂肪酸残基を含ませることも可能である。以上の説明か ら明らかなように、得られる各 MELは、通常、置換基 Rの脂肪酸残基部分が異なる化 合物の混合物の形態である。
[0134] 一方、本発明に係る MELは上記一般式（1)で表される構造を有し、 MEL中のエリ スリトールが従来型 MELとは逆向きに導入された光学異性体であることが大きな特 徴である。なお、上記一般式（1)中、置換基 R1は同一でも異なっていてもよく炭素数 4〜24の脂肪族ァシル基であり、置換基 R2は同一でも異なっていてもよく水素又は ァセチル基を表す。また、置換基 R3は水素又は炭素数 2〜24の脂肪族ァシル基を 表す。ただし、置換基 R1がともに炭素数 12の脂肪族ァシル基であって、置換基 が ともにァセチル基であって、置換基 R3が水素であるものを除く。これは、上記非特許 文献 8に開示の MELを除く意図であり、それ以外の意図はなぐ本発明の権利範囲 を不当に制限する限定事項ではないことを念のため付言しておく。
[0135] また、上記一般式（1)中の置換基 R1は、飽和脂肪族ァシル基であっても不飽和脂 肪族ァシル基であってもよぐ限定されるものではない。不飽和結合を有している場 合、複数の二重結合を有していてもよい。炭素鎖は直鎖状であってもよく分岐鎖状で あってもよい。また、酸素原子含有炭化水素基の場合、含まれる酸素原子の数及び 位置は限定されない。
[0136] さらに、上記一般式（1)中、置換基 R2のいずれか一方がァセチル基であり、他方が 水素であることが好ましい。つまり、 l— O— MELであって、 ^^しー8又は^^しーじ であることが好ましい。なかでも特に、 4位が水素であって、 6位がァセチル基である、 すなわち MEL— Bであることがより好ましい。
[0137] 例えば、 MEL— A (ァセチル基が 2個）に比べて、 MEL— Bまたは MEL— C (ァセ チル基力 個）は極性が高ぐ水中での自己組織化挙動が異なる。このため、形成さ れる液晶の形態が異なり、 MEL— Aでは幅広い濃度領域でスポンジ相（L相）等を
3 作るのに対して、 ^^しー8又は^^しーじではラメラ相（し ）を作りやすい。ラメラ相は 肌の角質層と非常に近い形態ですので、肌浸透性が良くなり、スキンケア素材として 有用である。さらに、 MEL— Bは 2分子膜がカプセル化したべシクル（リボソーム）を 形成しやすぐカプセル内に薬剤を内包できることから、リボソーム化粧品、医薬品へ の応用が容易になると期待される（上記非特許文献 9, 10参照）。
[0138] なお、上記非特許文献 8において合成された MELは Aタイプであり、かつ脂肪酸 鎖が 2本とも C12のものである。これに対して、本願発明では、 MEL— Bや MEL— C を作製することができ、また脂肪酸鎖長も多様性を持たせることができる。その結果、 より異なる液晶形成能を有する MELを提供することができる。
[0139] なお、上記非特許文献 8に記載の合成方法はあくまで MEL— Aの合成方法のみ に限定されており、 MEL-B, Cを合成するためには、異なる保護基の使用や異なる ステップの反応を繰り返さなければならず、上記文献を参酌しても本願発明に係る M ELを合成することはできないことを念のため付言しておく。
[0140] また、上記一般式（1)中、置換基 R3が炭素数 2〜24の脂肪族ァシル基であること が好ましい。式（1)中、置換基 R1及び R3がいずれも脂肪族ァシル基であれば、トリア シノレ MELとなり、ジァシル MELとは異なった性質の MELを得ることができる。
[0141] 具体的には、トリァシル体は従来のジァシル体と比べて HLB (親水 疎水バランス )が低ぐより親油性の高い界面活性剤である。このため、応用用途が異なってくる。 例えば、 W/Oェマルジヨンや分散剤等への利用が考えられる。また上述と同様、上 記非特許文献 8に記載の合成方法はあくまでジァシル体の MEL— Aの合成方法の みに限定されており、トリァシル体の合成には根本的に異なる合成経路（異なる保護 基や多段階反応）を経る必要がある。それゆえ、上記非特許文献 8を参酌しても本願 発明に係る MELを合成することはできなレ、。
[0142] 本発明に係る MELの分子構造は、基本的には上記一般式（1)における置換基 R1 の脂肪族ァシル基の炭素数あるいは二重結合の有無等において異なる各化合物の 混合物の形態で得られる力 これらはさらに分取 HPLC等により精製すれば、単一の MEL化合物とすることもできる。
[0143] 本発明の MELは、従来型 MELと同様、高い界面活性作用を有し、新たな生理活 性や自己集合特性を有し、界面活性剤又はファインケミカルの種々の触媒として用 いること力 Sできる。さらに MELは生分解性があり、高い安全性を有する点でも非常に 意義ある物質である。つまり、生分解性が高ぐ低毒性で環境に優しいバイオサーフ ァクタントである。
[0144] さらに、従来型 MELは様々な生理活性作用を有することが報告されている。例え ば、ヒト急性前骨髄性白血病細胞性 HL60株に MELを作用させると、顆粒系を分化 させる白血病細胞細胞分化誘導作用があること。またラット副腎髄質褐色細胞腫由 来の PC12細胞に MELを作用させると神経突起の伸長が生ずる神経系細胞分化誘 導作用等の生理活性作用を有すること、さらに微生物産生の糖脂質として初めて、メ ラノーマ細胞のアポトーシスを誘導することが可能となり（X. Zhao et. al.， Cancer Res earch,59, 482-486 (1999))、癌細胞増殖抑制作用があること、等が報告されている。 これら従来型 MELの生理作用からみて、本発明に係る MELにも種々の生理活性を 有することが期待でき、例えば抗ガン剤等の医薬としての用途や新規化粧品材料用 途が考えられる。
[0145] また、本発明に係る MELは、後述する実施例に示すように、分子のキラリティーの 違いによって、従来型 MELと液晶形成能において顕著に異なる。具体的には、本発 明に係る MELは従来型 MELと比べて非常に広!/、濃度領域でラメラ相を形成する能 力を有しており、液晶形成能に極めて優れたバイオサーファタタントといえる。
[0146] なお、上述した液晶形成能の評価方法としては、従来公知の方法で確認可能であ るが、例えば、液晶形成能力の簡便な比較方法として水侵入法が挙げられる。スライ ドガラス上に MELを塗布し、その横に蒸留水を滴下して界面に形成される液晶相を 顕微鏡観察することで、液晶形成の挙動を追跡することができる。上記方法を用いる ことで、従来型 MELと本発明の MEL光学異性体の液晶形成能を簡便に比較するこ と力 Sできる。
[0147] < 2. MELの製造方法〉
本発明に係る MELの製造方法は、 1 O MELの生産能を有する微生物を用い ることを特徴としている。具体的には、例えば、シユードザイマ（Pseudozyma)属に属し 、かつマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養し、上 記一般式（1)で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッドを製造する ME Lの製造方法である。なお、本 MELの製造方法を説明する記載においては、上記一 般式（1)中、置換基 R1は同一でも異なっていてもよく炭素数 4〜24の脂肪族ァシル 基であり、置換基 R2は同一でも異なっていてもよく水素又はァセチル基を表す。また 、置換基 R3は水素又は炭素数 2〜24の脂肪族ァシル基を表す。
[0148] < 2 1.使用微生物〉 本発明に係る MELの製造方法に使用可能な微生物としては、上記シユードザイマ 属に属し、 MELを生産する能力を有するもののうち、上記式（1)で表される MEL光 学異性体を生産するものであれば特に限定されるものではない。
[0149] 上記一般式（1)の MELを生産する微生物の例としては、例えばシユードザイマ.ッ クバェンシス、シユードザイマ'クラッサ等に属する微生物が挙げられ、このうち特に、 シユードザイマ'ックバェンシスに属する微生物が好ましい。シユードザイマ'ックバエ ンシスに属する微生物は、例えば 25°C〜30°Cで培養した場合、 MELの生産性向 上効果が高ぐ特にシユードザイマ 'ックバェンシス JCM 10324株の場合、培養温 度 30°Cの場合に最も良好な生産性が得られる。
[0150] < 2— 2.使用培地及び培養方法〉
培地は、例えば、一般的な微生物又は酵母に対して一般に用いられる培地を使用 でき、特に限定されるものではなぐ特に酵母に用いられる培地が好ましい。このよう な培地としては、例えば、 YPD培地（イーストイクストラタト 10g、ポリペプトン 20g、及 びグルコース 100g)を挙げることができる。特に、シユードザイマ 'ックバェンシス JC M 10324株を用いる場合は、培養温度を 27°C〜33°Cに設定することが好ましいと いう知見を得ている。上述のとおり、 MELの生産性が著しく向上するためである。
[0151] さらに、本発明の MEL製造方法に利用可能な微生物、特に前記シユードザィマ- ックバエンシス JCM 10324株を用いて MELを生産する場合の好適な培地組成は 、以下のとおりである。
'酵母エキス； 0. ；!〜 2g/Lが好ましぐ lg/Lが特に好ましい
'硝酸ナトリウム； 0. ；!〜 lg/Lが好ましぐ 0. 3g/Lが特に好ましい。
•リン酸 2水素カリウム； 0. ；!〜 lg/Lが好ましぐ 0. 3g/Lが特に好ましい。
•硫酸マグネシウム； 0. ；!〜 lg/Lが好ましぐ 0. 3g/Lが特に好ましい。
.油脂類； 40g/L以上が好ましぐ 80g/Lが特に好ましレ、。
[0152] また、上記微生物の培養においては、培地に炭素源を添加することが好ましい。炭 素源としては油脂類、脂肪酸、脂肪酸誘導体 (脂肪酸トリグリセリド等の脂肪酸エステ ノレ類）、あるいは合成エステルを少なくとも 1種、さらには複数種混合して含有させれ ばよく、その他の諸条件については、特に制限はなぐ本発明の利用当時の技術水 準に基づレ、て適宜選定することができる。
[0153] 「油脂類」としては、植物油、動物油、鉱物油及びその硬化油であればよい。具体 的には、アボカド油、ォリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マ力デミ アンナッツ油、トウモロコシ油（コーン油）、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、パーシック油 、ピーナッツ油、ベニバナ油、小麦胚芽油、サザン力油、ヒマシ油、アマ二油、サフラ ヮー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カャ油、コメヌ力油、キリ油、ホ ホバ油、カカオ脂、ヤシ油、馬油、パーム油、パーム核油、牛脂、羊脂、豚脂、ラノリ ン、鯨ロウ、ミツロウ、カルナゥバロウ、モクロウ、キャンデリラロウ、スクヮラン等の動植 物油及びその硬化油、流動パラフィン、ワセリン等の鉱物油、トリパルミチン酸グリセリ ン等の合成トリグリセリンが挙げられる。好ましくはアボカド油、ォリーブ油、ゴマ油、ッ バキ油、月見草油、タートル油、マ力デミアンナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタ ネ油、卵黄油、パーシック油、小麦胚芽油、サザン力油、ヒマシ油、アマ二油、サフラ ヮー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カャ油、コメヌ力油、より好まし くはォリーブ油、大豆油である。
[0154] 「脂肪酸」又は「脂肪酸誘導体」としては、高級脂肪酸由来が好ましぐ例えばカブ ロン酸、力プリル酸、力プリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ォレイン酸、 リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、 12—ヒドロキシステアリン酸、イソス テアリン酸、ゥンデシン酸、トール酸、エイコサペンタエン酸、ドコサへキサェン酸など が挙げられる。好ましくはラウリン酸、ミリスチン酸、ノ ルミチン酸、ォレイン酸、リノ一 ル酸、リノレン酸、ステアリン酸、ゥンデシレン酸、より好ましくはォレイン酸、リノール 酸、ゥンデシレン酸である。
[0155] 「合成エステル」としては、例えば、力プロン酸メチル、カプリル酸メチル、力プリン酸 メチル、ラウリン酸メチル、ミリスチン酸メチル、パルミチン酸メチル、ォレイン酸メチル 、リノール酸メチル、リノレン酸メチル、ステアリン酸メチル、ゥンデシン酸メチル、カプ ロン酸ェチル、カプリル酸ェチル、カプリン酸ェチル、ラウリン酸ェチル、ミリスチン酸 ェチル、パルミチン酸ェチル、ォレイン酸ェチル、リノール酸ェチル、リノレン酸ェチ ノレ、ステアリン酸ェチル、ゥンデシン酸ェチル、カプロン酸ビュル、カプリノレ酸ビニノレ、 力プリン酸ビュル、ラウリン酸ビュル、ミリスチン酸ビュル、パルミチン酸ビュル、ォレイ ン酸ビュル、リノール酸ビュル、リノレン酸ビュル、ステアリン酸ビュル、ゥンデシン酸 ビュル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オタチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、 ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸へ キシル、オレンィ酸デシル、ジメチルオクタン酸、乳酸セチル、乳酸ミリスチル等が挙 げられる。好ましくはラウリン酸メチル、ミリスチン酸メチル、ノ ルミチン酸メチル、ォレ イン酸メチル、リノール酸メチル、リノレン酸メチル、ステアリン酸メチル、ゥンデシレン 酸メチル、より好ましくはォレイン酸メチル、リノール酸メチル、ゥンデシレン酸メチル である。
[0156] これらは、 1種を単独で又は 2種以上を適宜混合して用いてもよい。
[0157] 本発明に係る MELの製造方法の具体的な工程については、特に限定されるもの ではなく、 目的に応じて適宜選定することができる力 例えば、種培養、本培養及び MEL生産培養の順にスケールアップしていくことが好ましい。これらの培養における 、培地並びに培養条件を例示すると以下のとおりである。
a)種培養；グルコース 40g/L、酵母エキス lg/L、硝酸ナトリウム 0· 3g/L、リン酸 2水素カリウム 0. 3g/L、及び硫酸マグネシウム 0. 3g/Lの組成の液体培地 5mL が入った試験管に 1白金耳接種し、 30°Cで 1日間振とう培養を行う。
b)本培養;所定量の植物性油脂等の油脂類と、酵母エキス lg/L、硝酸ナトリウム 0 . 3g/L、リン酸 2水素カリウム 0· 3g/L、及び硫酸マグネシウム 0· 3g/Lの組成の 液体培地 lOOmLの入った坂口フラスコに a)の培養液を接種して、 30°Cで 2日間培 養を行う。
c)マンノシルエリスリトールリピッド生産培養;所定量の植物性油脂等の油脂類と酵母 エキス lg/L、硝酸ナトリウム 0· 3g/L、リン酸 2水素カリウム 0· 3g/L、及び硫酸マ グネシゥム 0. 3g/Lの組成の液体培地 1. 4Lが入ったジャーファメンターに接種して 、 30°Cで 800rpmの撹拌速度で培養を行う。この培養においては、培養途中から植 物性油脂を培養容器中に流下させて、培地中の油脂類濃度を 20〜200g/Lに保 持することが好ましい。
[0158] < 2— 3. MELの回収方法〉
MELの回収についても従来公知の脂質の精製方法を用いることができ、特に限定 されるものではない。例えば、培養終了後、当容積〜 4容積倍の酢酸ェチルで脂質 成分を抽出し、酢酸ェチルを、エバポレーターを用いて留去して脂質及び糖脂質成 分を回収する工程を挙げることができる。その後、この脂質成分を等量のクロ口ホルム に溶解し、これをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロ口ホルム、クロ口ホルム：ァ セトン（80 : 20)、同（70 : 30)、同（60 : 40)、同（50 : 50)、同（30： 70)、アセトンの順 で溶出させる。各溶液を薄層クロマトグラフィー（TLC)プレートにチャージし、クロ口 ホルム：メタノール：アンモニア水 = 65 : 15 : 2 (容積比）で展開する。展開終了後、ァ ンスロン硫酸試薬で糖脂質の存在を確認する。糖脂質の含まれる溶出液を集め、溶 媒を留去して糖脂質成分を得ることができる。
[0159] < 2— 4. MELの構造決定〉
上述した MELの製造方法により得られる MELの構造決定は、従来公知の方法で 行うことができ、特に限定されるものではないが、例えば、シユードザイマ ·ックバェン シス JCM 10324株を用いて得られた MELの構造決定手法を例にして説明すると、 以下の通りである。
[0160] まず単離した糖脂質成分は、 TLCプレート上で、アンスロン硫酸試薬で青緑色に 呈色することにより糖脂質成分であると判断できる。この糖脂質が MELであることは、 、 13C、二次元 NMR解析を行い、得られたスペクトルと、構造既知である従来型 M EL (MEL— A〜D) (上記一般式 (4) )のスペクトルとを比較することで容易に確認す ること力 Sでさる。
[0161] 本発明に係る MEL力 従来型 MELの光学異性体であることは、次のように、 1)糖 骨格の NMR解析及び 2)旋光度測定を行うことにより簡便に確認することができる。
[0162] 1)糖骨格の NMR解析
重クロ口ホルム中で測定した1 H— NMRスペクトルにおいて、 MELの糖鎖部分のプ 口トンは 3. 3〜5. 6ppm付近に検出される。特に、グリコシド結合に関与するマンノー ス 1 '位（還元末端）のプロトンと、エリスリトール 4位のプロトンはそれぞれ 4· 7ppm付 近と 4. Oppm付近に検出される。しかし、エリスリトールの結合向きが異なる場合、上 記プロトン由来のピークがそれぞれシフトすることが D. Crichらによって報告されて いる（上記非特許文献 8参照）。そこで、従来型 MELに対して本発明に係る MELが 、上記のピークのみシフトしたスペクトルパターンを示すことを確認する。
[0163] さらに、得られた MELをアルカリ（NaOCH )でケン化して得られた糖鎖（マンノシ
3
ルエリスリトール；以下 MEと省略することがある）の NMR解析を行う。得られた MEL の糖鎖と従来型 MELの糖鎖の NMRスペクトルを比較することで、本発明に係る ME Lの糖鎖部分の構造が、従来型 MEL (4— O— β D マンノビラノシルー meso— エリスリトール構造）と異なるスペクトルパターンとなることを確認できる。
[0164] 2)旋光度測定
MEL又は MEの旋光度測定を行うことで、従来型 MELと本発明に係る MELの分 子のキラリティーを比較することができる（上記非特許文献 8参照）。 D. Crichらによ つて報告されている、本発明の MELと糖骨格が同じ 1ー〇ー（4' , 6 '—ジ—O ァ セチル 2' , 3，一ジ一 O ドデシノレ一 β—D マンノビラノシル） D エリスリトー ルの比旋光度 [ α ] =— 25. 9° (c = l . 5)であるので、これを参考にして比較する
D
ことで立体構造の違!/、がわかる。
[0165] 以上の方法により、本発明で得られる MELが従来型 MELとは糖骨格の立体構造 力 S異なること力 S確言忍でさる。
[0166] 以上のように、本発明に係る MELの製造方法によれば、従来型 MELとはキラリテ ィ一が異なり、これまで微生物による生産の報告例の無い MELを選択的に生産する こと力 Sできる。上述したように、分子のキラリティーの違いは生理活性や自己集合体形 成能に大きな影響を及ぼすことから、本発明に係る MELは、従来型 MELとは界面 活性に差が無いにもかかわらず、その他の諸性質において異なる挙動を示すように なる。それゆえ、本発明に係る MELと従来型 MELとの物性比較は、 MELの機能評 価に対する重要なファクターを示すこととなる。その結果、生理活性等の構造一物性 相関に関するデータの蓄積は、医薬、食品、化粧品分野等、種々用途へのバイオサ 一ファタタントの用途開拓の進展に大いに貢献するものである。
[0167] さらにいえば、本発明に係る MELは、一見すると化学的な合成手法を用いても理 論上では合成可能であるようにみえる。し力、しながら、化学合成により合成する場合、 極めて特殊な合成技術と多段階に渡る複雑な保護 ·脱保護反応が必要である。また 、そもそもキラリティーを完全に制御することは著しく困難であるため、現実的には化 学的に合成することは極めて困難であるといえる。これに対して、本発明が示すような 微生物生産法では精巧な生合成経路を経由するため、位置 ·立体構造が完全に制 御された特殊構造を維持し、かつ一段階のステップのみで製造する方法を提供でき るため、極めて有効な手段と成り得る。
[0168] なお、本実施形態 2にて記載した分子構造中のマンノシルエリスリトール骨格力 — 0- β—D—マンノビラノシルー meso—エリスリトールである MELは、実施形態 1で 述べた発明と組み合わせることができることを念のため付言しておく。
[0169] なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様お よび以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、 そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ当業者は、本 発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。 実施例
[0170] 以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であ つて、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
[0171] 〔実施例 1：正常ヒト皮膚繊維芽細胞を用いた MELの細胞賦活作用〕
正常ヒト皮膚繊維芽細胞トータルキット（CA106K05、製造元：セルアプリケイショ ンズインク USA、輸入販売元：東洋紡績株式会社)を用いて、常法により正常ヒト皮 膚繊維芽細胞を培養した。
[0172] 正常ヒト皮膚繊維芽細胞を 1ゥエル当たり 2· 0 X 104個となるように 48穴マイクロプ レートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM)に 10% のゥシ胎児血清を添加したものを用いた。 37°C、二酸化炭素濃度 5vol%中にて 24 時間培養後、終濃度 lng/ml〜0. 01mg/mlの MEL— Aを添加した試験培地に 交換し、さらに 48時間培養した。なお、本実施例で用いた MEL— Aは、 Pseudozy maantarctica NBRC 10736を、大豆油を添加した培地（3%大豆油、 0. 02% M gS04.H20、 0. 02% KH2P04、 0. 1 % yeast extract)で培養して得られた M EL— Aを用いた。
[0173] MEL— Aはエタノールに溶解後、エタノールで段階希釈し、エタノールの終濃度が すべて 0. 5%となるように各培地に添加した。溶媒対照として、エタノール群（終濃度 0. 5%)を設けた。また、細胞毒性物質により細胞増殖が阻害されることを確認する ために SDS添加群（終濃度 0. 1 %)を設けた。次いで 3—（4, 5—ジメチルー 2—チ ァゾリル） - 2, 5—ジフエニルテトラゾリゥムブロミド（MTT)を 100 μ g/mL含有する 培地に交換して 3時間培養し、テトラゾリゥム環の開環により生じるフオルマザンを 2— プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて 550nmの吸光度を測定した 。同時に濁度として 650nmにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活 作用を評価した。
[0174] 評価結果を、エタノール群 (溶媒対照群）における細胞賦活作用を 100とした相対 値にて図 1に示した。
[0175] 図 1から明らかなように、 MEL— A添加群では、いずれの濃度においても正常ヒト 皮膚繊維芽細胞に対してエタノール群より高い細胞賦活作用を示した。特に、終濃 度 lng/mlの MEL—Aを添加した場合には、エタノール群と比較して、 65%以上の 有意な細胞賦活作用が認められた。この結果から、 MELは、優れた細胞賦活作用 を有することが明らかとなり、 MELを肌に適用することにより、極めて優れた老化防止 効果を発揮し、加齢、紫外線曝露等により生じる皮膚のしわ、たるみ等を効果的に改 善できることが示唆された。
[0176] 〔実施例 2：ヒト頭髪毛乳頭細胞を用いた MELの細胞賦活作用〕
(1)ヒト頭髪毛乳頭細胞の培養方法
ヒト頭髪毛乳頭細胞（THPC -001)トータノレキット（HDPCトータルキット： THPCK — 001、製造元：セルアプリケイシヨンズインク USA、輸入販売元：東洋紡績株式会 社)を用いて、常法によりヒト毛乳頭細胞を培養した。なお、ヒト頭髪毛乳頭細胞は育 毛剤の薬効評価に広く用いられている細胞である（例えば、特開 2006— 83084、特 開 2003— 81793、特開 2000— 159640を参照）。
[0177] 具体的には、解凍した細胞を懸濁するための PCGM培地を 10mL、 15mL遠心チ ユーブに分注し、氷冷しておく。凍結したヒト頭髪毛乳頭細胞（THPC— 001)の入つ たバイアル瓶を 37°Cの恒温槽で急速に融解する。このバイアル瓶に PCGM培地を 1 mL程度徐々に滴下し DMSOを希釈後、全量を PCGM培地が入った遠心チューブ に移し懸濁させる。浮遊細胞を冷却低速遠心機で 4°C、 1000rpm、 5分間遠心分離 する。沈殿した細胞を吸わないように注意しながら上清を吸引し、 ImLPCGM培地 に再懸濁させる。この全量を、コラーゲン液でコートした T— 75フラスコに植え込み、 加湿下で、二酸化炭素濃度 5vol%、 37°Cに保たれたインキュベーターに入れ静置 培養を行う。 1日後、培地の交換を行う。以後、 1日おきに培地の交換を行い継代培 養する。
[0178] なお、 PCGM培地として、 1 %FBSを含有する PCGM基礎培地 250mLに牛下垂 体抽出液 (BPE) 100倍希釈液を 2. 5mL、牛胎児血清 (FCS) IOO倍希釈液を 2. 5 mL、インシュリン 'トランスフェリン 'トリョードサイロニン溶液（ITT) 200倍希釈液を 1 · 25mL、およびサイロプロテイン溶液（Cyp) 200倍希釈液を 1. 25mL添加したもの を用いた。
[0179] (2)ヒト頭髪毛乳頭細胞賦活作用の評価
ヒト頭髪毛乳頭細胞を 1ゥエル当たり 2· 0 X 104個となるように 48穴マイクロプレート に播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM)に 10%のゥシ 胎児血清を添加したものを用いた。 24時間培養後、終濃度 lng/ml〜0. Olmg/ mlの MEL— Aを添加した試験培地に交換し、さらに 48時間培養した。なお、本実施 例で用いた MEL— Aは、 Pseudozymaantarctica NBRC 10736を、大豆油を添 カロした培地（3%大豆油、 0. 02% MgS04 'H20、 0. 02% KH2P04、 0. 1 % ye ast extract)で培養して得られた MEL— Aを用いた。
MEL— Aはエタノールに溶解後、エタノールで段階希釈し、エタノールの終濃度が すべて 0. 5%となるように各培地に添加した。溶媒対照として、エタノール群（終濃度 0. 5%)を設けた。次いで 3— (4，5—ジメチルー 2—チアゾリル )ー2，5—ジフエニルテ トラゾリゥムブロミド（MTT)を 10011 g/mL含有する培地に交換して 3時間培養し、 テトラゾリゥム環の開環により生じるフオルマザンを 2—プロパノールにて抽出し、マイ クロプレートリーダーにて 550nmの吸光度を測定した。同時に濁度として 650nmに おける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。
[0180] 評価結果を、エタノール群 (溶媒対照群）における細胞賦活作用を 100とした相対 ィ直にて図 2に示した。
[0181] 図 2から明らかなように、 MEL— A添加群では、 lng/ml〜l μ g/mlの範囲でヒト 頭髪毛乳頭細胞に対してエタノール群より高い細胞賦活作用を示した。特に、終濃 度 lng/mlの MEL—Aを添加した場合には、エタノール群と比較して、 50%以上の 有意な細胞賦活作用が認められた。この結果から、 MELを頭皮に適用することによ り、きわめて優れた毛乳頭細胞賦活作用を発揮し、育毛効果が記載できることが示 唆された。
[0182] 〔実施例 3：正常ヒト皮膚繊維芽細胞を用いたトリァシル MELの細胞賦活作用〕 トリァシル MELとして、 Pseudozyma antarctica NBRC 10736を、大豆油を添 加した培地（3%大豆油、 0. 02% MgSO ·Η 0、 0. 02%KH PO、 0. 1 % veast
4 2 2 4
extract)で培養して得られた MEL— Aのエリスリトール部の水酸基にォレイン酸を 付加したもの（OL— MEL (SB) )を用いた。
[0183] 正常ヒト皮膚繊維芽細胞トータルキット（CA106K05、製造元：セルアプリケイショ ンズインク USA、輸入販売元：東洋紡績株式会社)を用いて、常法により正常ヒト皮 膚繊維芽細胞を培養した。
[0184] 正常ヒト皮膚繊維芽細胞を 1ゥエル当たり 2· 0 X 104個となるように 48穴マイクロプ レートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM)に 10% のゥシ胎児血清を添加したものを用いた。 37°C、二酸化炭素濃度 5vol%中にて 24 時間培養後、終濃度 0· 01ng/ml~0. 01mg/mlのトリァシル MEL (OL— MEL ( SB) )を添加した試験培地に交換し、さらに 48時間培養した。なお、トリァシル MEL はエタノールに溶解後、エタノールで段階希釈し、エタノールの終濃度がすべて 0. 5 %となるように各培地に添加した。溶媒対照として、エタノール群（終濃度 0. 5%)を 設けた。また、細胞毒性物質により細胞増殖が阻害されることを確認するために SDS 添加群（終濃度 0. 1 %)を設けた。次いで 3—（4, 5 ジメチルー 2 チアゾリル） 2 , 5 ジフエニルテトラゾリゥムブロミド（MTT)を 100 H g/mL含有する培地に交換し て 3時間培養し、テトラゾリゥム環の開環により生じるフオルマザンを 2 プロパノール にて抽出し、マイクロプレートリーダーにて 550nmの吸光度を測定した。同時に濁度 として 650nmにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価し た。
[0185] 評価結果を、エタノール群 (溶媒対照群）における細胞賦活作用を 100とした相対 ィ直にて図 3に示した。
[0186] 図 3から明らかなように、トリァシル MEL添加群では、いずれの濃度においても正 常ヒト皮膚繊維芽細胞に対してエタノール群より高い細胞賦活作用を示した。特に、 終濃度 lng/mlのトリァシル MELを添加した場合には、エタノール群と比較して、 5 0%程度の有意な細胞賦活 *抗老化作用が認められた。この結果から、トリァシル ME Lは、 MEL— A同様に優れた細胞賦活作用を有することが明らかとなり、トリアシノレ MELを肌に適用することにより、極めて優れた老化防止効果を発揮し、加齢、紫外 線曝露等により生じる皮膚のしわ、たるみ等を効果的に改善できることが示唆された
〇
[0187] 以下に、種々の剤型の本発明に係る細胞賦活剤の処方例を実施例 4〜6に示す。
[0188] 〔実施例 4 :美容液〕
以下に示す組成の美容液を常法により製造した。
(組成） （重量％)
ソノレビット 4. 0
ジプロピレングリコール 6. 0
ポジエチレングリコーノレ 1500 5. 0
POE (20)ォレイルアルコールエーテル 0. 5
ショ糖脂肪酸エステル 0. 2
メチノレセノレロース 0. 2
MEL 1. 0
精製水 全体で 100となる量
〔実施例 5 :乳液〕
以下に示す組成の乳液を常法により製造した。
(組成） （重量％)
グリセリノレエーテノレ 1. 5
ショ糖脂肪酸エステル 1. 5
モノステアリン酸ソノレビタン 1. 0
スクヮラン 7. 5 ジプロピレングリコール 5. 0
MEL 1. 0
精製水 全体で 100となる
〔実施例 6 :クリーム〕
以下に示す組成のクリームを常法により製造した。
(組成） （重量％)
プロピレングリコーノレ 6. 0
フタル酸ジブチル 19. 0
ステアリン酸 5. 0
モノステアリン酸グリセリン 5. 0
モノステアリン酸ソノレビタン 12. 0
モノステアリン酸ポリエチレンソルビタン 38. 0
ェデト酸ナトリウム 0· 03
MEL 1. 0
精製水 全体で 100となる
〔実施例 7 :官能評価〕
上記実施例 4〜6を用いて官能評価を行った。なお、ノ ィォサーファタタントを含ま ない比較例も同時に評価した。官能評価は、シヮ等の老化症状の気になる 26〜48 歳のパネラー 6人を 1群として実施例および比較例をそれぞれ 1日 2回、 3力月間連 続使用してもらい、 3力月後の肌状態についてアンケート調査をして行った。
[0189] 官能評価の結果として、各項目における評価者数を表 1に示した。バイオサーファ クタントを含まない比較例より実施例のほうが、 7割以上のパネラーが皮膚の弾力性 が向上し、シヮの改善が認められたと回答しており、顕著な皮膚の老化症状の回復 効果があることが示された。
[0190] [表 1] .実施例
( ィ才サ一ファクタントぁ y ) (バイオサ一ファクタントなし）
4 5 6 4 5 6
向上 2 4 0 0
やや向上 0 1 0 0
皮樓 力性
ま なし 2 2 2 S: 4
Q 0 0 0 2
改善 3 2 2 0 0 0
やや改瞢 1 1 Z 1 0 1
シヮ改 ¾
変 ft¾し 2 3 2 5 6 4
■■悪 0 0 Q 0 1
[0191] 〔実施例 8 : Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株の培養〕
a)保存培地（麦芽エキス 3g/L、酵母エキス 3g/L、ペプトン 5g/Lグルコース 10 g/L、寒天 30g/L)に保存しておいた Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株を、 グルコース 20g/L、酵母エキス lg/L、硝酸ナトリウムム 0· 3g/L、リン酸 2水素カリ ゥム 0. 3g/L、及び硫酸マグネシウム 0. 3g/Lの組成の液体培地 2mLが入った試 験管に 1白金耳接種し 30°Cで振とう培養を行い、次いで、 b)得られた菌体培養液 1 mLを所定量の大豆油と酵母エキス lg/L、硝酸ナトリウム 0. 3g/L、リン酸 2水素力 リウム 0. 3g/L、及び硫酸マグネシウム 0. 3g/Lの組成の液体培地 20mLの入った 坂口フラスコに接種して、 30°Cで振とう培養を行った。
上記 a)と ）の各培養により得られた菌体培養液を使用して、以下の試験を行った。
[0192] 〔実施例 9： Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株の糖脂質生産能の確認〕
a)の培養を 1日間行った後、 b)の培養を 7日間行って培養液を採取し、これを用い て Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株のバイオサーファタタントの生産を薄層ク 口マトグラフィ一で確認した。展開溶媒はクロ口ホルム：メタノール： 7Nアンモニア水 = 65 : 15 : 2を用い、指示薬には糖脂質を青緑色に発色させるアンスロン硫酸試薬を用 いた。 MELの標準として、 Pseudozyma antarctica KM_34 (FERMP— 20730)株を 大豆油添加培地で培養し、原料油脂等の不純物を取り除いた精製標品を用いた。
MEL標準における、 MEL— A〜Dはそれぞれ上記一般式（5)に表される化合物を 示す。
[0193] その結果を図 4に示す。同図によれば、 Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株は
、 MEL— Bと思われる糖脂質を生産していることがわかった。
[0194] 〔実施例 10： MEL生産用培地で同リピッドの生産〕 Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株を用い、 a)の培養を 1日間行った後、 b)の 培養を 7日間行った。その後培養液を採取し、培養液中の酢酸ェチル可溶成分を精 製後、生産された MELを高速液体クロマトグラフィーで検出した。また、比較例として 大豆油を炭素源として培養した Pseudozyma antarctica KM-34 (FERMP - 20730) 株の培養液を、同様にして高速液体クロマトグラフィーで検出した。
[0195] その結果を図 5に示す。図 5によれば、 Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株を 培養すると、 MEL— Bと同じ保持時間にピークが確認できる糖脂質を得られることが ゎカゝる。
[0196] 〔実施例 11： Pseudozyma crassa CBS 9959株の培養と MEL生産能の確認〕
実施例 8に記載の方法に対し、 Pseudozyma crassa CBS 9959株を用い、温度は 25 °Cに設定して同様に培養を行った。 a)の培養を 1日間行った後、 b)の培養を 7日間 行った後の培養液を採取し、これを用いて実施例 9に記載の方法と同様に、 Pseudoz yma crassa CBS 9959株のバイオサーファタタントの生産を薄層クロマトグラフィーで 確認した。
[0197] その結果を図 6に示す。これによれば、 Pseudozyma crassa CBS 9959株は、既知の MEL (MEL— A〜C)よりも少しずつ Rf値の低!/、糖脂質を生産して!/、ることがわかつ た。
[0198] 〔実施例 12 : Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産する MELの構造解析
]
まず、糖骨格の NMR解析を行った。実施例 9で得られた糖脂質を、シリカゲルカラ ムクロマトグラフィーを用いた既知の分離方法で単離 ·精製し、重水素化クロ口ホルム
(CDC1 )を溶媒として1 H— NMR解析を行った。比較対象として、 Pseudozyma antar
3
ctica KM-34 (FERMP 20730)株を培養して生産し、単離 '精製した従来型 MEL Bについても同様に測定した。
[0199] 結果を図 7に示す。同図に示すように、 Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が 生産する糖脂質は MEL— Bであることがわかった。また、マンノース 1 '位（図中、 H — 1 ' )が 4· 73ppm力、ら 4. 76ppmへと低磁場シフトし、さらに従来型 MELでは大き く 2つに分力、れるエリスリ卜ーノレ 4位プロ卜ン（3· 8ppm、 4. Oppm)も、大きくシフ卜して 1つにまとまる（3· 9ppm)様子が確認された。これは D. Crichらによって報告されて いる非特許文献 8の記述と全く一致しており、 Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324 株が生産した MEL由来のエリスリトールが従来型 MELとは逆向きに結合しているこ とを証明するものである。
[0200] さらに、より詳細な糖骨格構造の比較を行うために、メタノール中でナトリウムメトキ シドによって上記 MEL中に存在するエステル結合のアルカリ加水分解を行った。反 応終了後の生成物を酢酸ェチル中に再沈殿させて回収し、 90%エタノール水溶液 中で再結晶操作を行うことにより糖鎖（マンノシルエリスリトール; ME)の結晶を得た。
[0201] 従来型 MELについても同様の操作で糖鎖を回収し、得られた各 MEについて、重 水（D O)を溶媒として1 H、 13C―、各種二次元 NMR解析を行った。
2
[0202] その結果、図 8に示すように、エリスリトール 4位プロトンのみピークのシフトが見られ た（H— 4a : 3. 85ppm→3. 89ppm、 H— 4b： 4. 12ppm→4. Oppm)。 M. Kurzら は、従来型 MELと同じ構造であるウスチリピッドから調製した 4— O— β—マンノピラ ノシルー D—エリスリトール（文献中では 1ー〇ー /3マンノビラノシルー L—エリスリトー ルと記載）の詳細な構造解析を行っており（J. Antibiot., 56， 91-101 (2003))、ここで 従来型 MEの 4位プロトンのィ匕学シフト力 H— 4a : 3. 76ppm, H-4b : 4. 09ppmと 記載している。このように公知の文献においても、従来型 ME (及び MEUは、エリス リトール 4位プロトンが大きく 2つに分かれることが提示されており、本発明の MELが、 エリスリトールが逆向きに結合した l—O— 0—マンノピラノシル D エリスリトール を糖骨格構造に有する従来型 MELとは光学異性体の関係にある新規 MELである ことが示された。
[0203] 次!/、で、上記 MEにつ!/、て、旋光度測定をネ亍つた。 Pseudozyma antarctica M-34 ( FERMP 20730)株、 Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株それぞれを培養し て得られた MELから、上記に従ってアルカリ加水分解により MEを合成し、蒸留水に 溶解して 1 %水溶液を作成した。各水溶液について、旋光計（日本分光デジタル旋 光計 DIP370型）を用いて旋光度測定を行い、各 MEの比旋光度を求めた。
[0204] その結果、 Pseudozyma antarctica KM-34 (FERMP - 20730)由来の MEの比旋 光度は [ α ] =— 35. 2° であり、一方 Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株由来 の MEの比旋光度は [ α ] =— 39· 6° となった。すなわち各菌株から生産された Μ
D
ELの糖骨格（ME)のキラリティーが異なることが示され、 Pseudozyma tsukubaensis J CM 10324株が生産する MELは従来型の MELとは糖骨格の立体構造が異なる光 学異性体となっていることが証明された。
[0205] さらに、 Pseudozyma antarctica KM_34 (FERMP— 20730)由来の MEは、上記回 収操作によって白色粉末として得られ、融点が 156. 9°Cであったのに対して、 Pseud ozyma tsukubaensis JCM 10324株由来の MEは、無色透明、油状の化合物として得 られ、融点測定ができなかった。このこと力、ら、両者の間で分子の立体構造が異なり、 結晶性が異なることが示された。
[0206] 以上の結果から、実施例 9で得られた Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生 産する MELは MEL— Bであり、さらに従来型 MEL— Bとは光学異性体の関係にあ る 1— (6 '—ァセチル一 2 '、 3 '—ジ一 O—アル力（ケ）ノィル一 β—D—マンノビラノ シルー） meso—エリスリトールであることが確認された。
[0207] 〔実施例 13 : Pseudozyma crassa CBS 9959株が生産する MELの構造解析〕
実施例 11で得られた Pseudozyma crassa CBS 9959株が生産する糖脂質について も、実施例 12と同様にして単離 ·精製を行い、 3種類の糖脂質について全て1 H— N MR解析を行い、従来型 MEL— A〜Cと比較した。
[0208] その結果、図 9に示すように、 Pseudozyma crassa CBS 9959株が生産する 3種類の 糖脂質は、 MEL— A〜Cにそれぞれ対応し、さらに従来型 MELでは大きく 2つに分 かれるエリスリトール 4位プロトンピーク力 シフトして 1つにまとまつていることが確認さ れた。したがって Pseudozyma crassa CBS 9959株は、従来型 MELとはエリスリトール が逆向きに結合した MEL— A〜Cそれぞれの光学異性体を生産することが証明され た。
[0209] 〔実施例 14 :液晶形成能の比較〕
実施例 8で得られた Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産する MELと、 Ps eudozyma antarctica KM_34 (FERMP— 20730)株が生産する従来型 MELについ て、水侵入法による液晶形成能の比較を行った。その結果、図 10及び図 11に示す ように、 Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株由来の MELは、従来型 MELと比べ て非常に広い濃度領域でラメラ相を形成する能力を有しており、液晶形成能に極め て優れたバイオサーファタタントであることが示された。
[0210] 〔実施例 15 : Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株の培養によるトリァシル MEL の生産〕
0. 2mlの P.tsukubaensisフローズンストックを 20mlの YM種培地/ 500ml容坂口フ ラスコに植菌し、 26°C、 180rpm、 1晚培養させ、種種菌とした。 0. 2mlの種種菌を 再度、 20mlの YM種培地/ 500ml容坂ロフラスコに植菌し、 26°C、 180rpm、 1晚 培養させ、種菌とした。 20mlの種菌を 2Lの YM培地 /5LJarに植菌し、 26°C 300r pm (l/4WM、 0. 5L air/min)で 8日間培養した。培養液を 7, 900rpm 60mi n 4°Cで遠心し、菌体 (MEL— Bを含む）と上清に分離した。菌体画分にそれぞれ 8 Omlの酢酸ェチルを加え、菌体が十分懸濁するように上下に攪拌した後、 7, 900rp m 30min 4°Cで遠心した。得られた上清に等量の飽和食塩水を加え攪拌し酢酸 ェチル層を得た。酢酸ェチル層に無水硫酸 Naを適量加え、 30分間精置させた後、 エバポレートし糖脂質を得た。
[0211] 〔実施例 16 : Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産するトリァシル MELの NMR角早析〕
実施例 15で得られた糖脂質を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いた既知の 分離方法で単離 '精製し、 MEL— B 50gおよびトリァシル MEL— B 1. 5gを得た。 トリァシル MEL— B画分について重水素化ジメチルスルホキシド（DMSO— d )を溶
6 媒として1 H— NMR分析を行!/、実施例 13と同様の方法で解析を行った。その結果を 図 12に示す。同図に示すように、 P. tsukubaensis JCM 10324株が生産するトリァシル MEL— Bについてもエリスリトールが従来型 MELとは逆向きに結合していることが確 認された。
[0212] 比較対象として、 Pseudozyma hubeiensisを培養して生産し、上記と同様にシリカゲ ルカラムクロマトグラフィーを用いて、 MEL— C 45g、トリアシノレ MEL— C 1. 3gを 単離 ·精製した。このトリァシル MEL— Cについても同様に重水素化ジメチルスルホ キシド（DMSO— d )を溶媒として1 H— NMR分析を行った。その結果、図 13に示す
6
ように、 Pseudozyma hubeiensisが産生した MEL— Cは、エリスリトールが従来型 MEL と同じ向きで結合していることを確認した。
[0213] 〔実施例 18 : Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産する MEL— Bの脂質 ドメイン解析〕
Pseudozyma tsukubaensis JCM 10324株が生産する MEL— Bを、逆相カラムを用い た高速液体クロマトグラフィーで分離した後、マススぺタトロメトリーにより質量分析を 行い (LC MS分析）、脂質ドメインの脂肪酸構造を確認した。その結果、図 14に示 すように、マンノースの一方の水酸基には炭素数 8の脂肪酸が付加しており、もう一 方には 10から 14の脂肪酸が付加していることが確認された。
[0214] 比較対象として、 Pseudozyma hubeiensisを培養して生産し、単離 ·精製したトリァシ ル MEL— Cについても同様に LC MS分析を行った。その結果、図 15に示すよう に、マンノースの一方の水酸基には炭素数 6の脂肪酸が主に付加しており、もう一方 には 8から 16の脂肪酸が付加していることが確認された。
[0215] なお、 HPLCの分析条件は以下の通り。 HPLC装置： Agilent 100、カラム： Imtakt
Cadenza CD— C18 2 X 150mm、移動相： A 0. 1%ギ酸、 B ァセトニトリル、 0分（ 50%B) 20分（98%B)—30分（98%8)、流速：0. 2ml/min、カラム温度： 40°C、注 入量： 3 1。 MS条件は以下の通り。 MS装置： BRUKER DALTONICS esquire 300 0 Plus、イオン化法： ESI ポジティブ。
[0216] 発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あく までも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限 定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に記載する請求の範 囲内にお!/、て、レ、ろ!/、ろと変更して実施することができるものである。
産業上の利用可能性
[0217] 本発明により、ノ ォサーファタタント由来の安全性に優れた細胞賦活作用、抗老 化作用が期待でき、細胞賦活および抗老化成分を有効成分とした化粧品 ·医薬部外 品（皮膚外用剤、浴用剤、育毛剤等）、飲食品、医薬品を提供することできることから も、産業界に大きく寄与することが期待される。
[0218] また、本発明に係る MELは、従来型 MELに対してエリスリトールがマンノースに逆 向きにエーテル結合したキラリティーの全く異なる構造をしており、液晶形成挙動を はじめ、 自己集合特性が従来のものとは大きく異なる。これらの物性の違いによって、 従来型には見られない新たな生理活性の発現が期待されることから、従来型 MELと 同様に、洗浄剤用途、食品工業、化学工業、環境分野等への幅広い利用はもちろん 、特に医薬、化粧品産業等での用途拡大に多大に貢献できると考えられるものと期 待される。

Claims

請求の範囲
[I] ノ^オサーファタタントを有効成分として含有することを特徴とする賦活化剤。
[2] 上記バイオサーファクタントが、マンノシルアルジトールリピッド又はそのトリァシル体 であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の賦活化剤。
[3] 上記マンノシルアルジトールリピッド力 マンノシルエリスリトールリピッド（MEL)又 はマンノシルマン二トールリピッド（MMUであることを特徴とする請求の範囲第 2項 に記載の賦活化剤。
[4] 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか 1項に記載の賦活化剤を有効成分として含 有することを特徴とする抗老化剤。
[5] 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか 1項に記載の賦活化剤を有効成分として含 有することを特徴とする育毛剤。
[6] 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか 1項に記載の賦活化剤、請求の範囲第 4項 に記載の抗老化剤、または請求の範囲第 5項に記載の育毛剤を有効成分として含 有することを特徴とする外用剤。
[7] 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか 1項に記載の賦活化剤、請求の範囲第 4項 に記載の抗老化剤、または請求の範囲第 5項に記載の育毛剤を有効成分として含 有することを特徴とする化粧品。
[8] 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか 1項に記載の賦活化剤、請求の範囲第 4項 に記載の抗老化剤、または請求の範囲第 5項に記載の育毛剤を有効成分として含 有することを特徴とする医薬部外品。
[9] 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか 1項に記載の賦活化剤、請求の範囲第 4項 に記載の抗老化剤、または請求の範囲第 5項に記載の育毛剤を有効成分として含 有することを特徴とする医薬品。
[10] 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか 1項に記載の賦活化剤、請求の範囲第 4項 に記載の抗老化剤、または請求の範囲第 5項に記載の育毛剤を有効成分として含 有することを特徴とする飲食品類。
[I I] 下記一般式（1)で表される構造を有することを特徴とするマンノシルエリスリトールリ ピッド。 [化 1]
Figure imgf000054_0001
…（1 )
(式（1)中、置換基 R1は同一でも異なっていてもよく炭素数 4〜24の脂肪族ァシル基 であり、置換基 R2は同一でも異なっていてもよく水素又はァセチル基を表す。また、 置換基 R3は水素又は炭素数 2〜24の脂肪族ァシル基を表す。ただし、置換基 が ともに炭素数 12の脂肪族ァシル基であって、置換基 R2がともにァセチル基であって 、置換基 R3が水素であるものを除く。 )
[12] 上記一般式（1)中、置換基 R2のいずれか一方がァセチル基であり、他方が水素で あることを特徴とする請求の範囲第 11項に記載のマンノシルエリスリトールリピッド。
[13] 上記一般式（1)中、置換基 R3が炭素数 2〜24の脂肪族ァシル基であることを特徴 とする請求の範囲第 11項又は第 12項に記載のマンノシルエリスリトールリピッド。
[14] 微生物により生産されたものであることを特徴とする請求の範囲第 11項〜第 13項 のいずれか 1項に記載のマンノシルエリスリトールリピッド。
[15] シユードザイマ（Pseudozyma)属に属し、かつマンノシルエリスリトールリピッドを生産 する能力を有する微生物を培養し、下記一般式（1)で表される構造を有—
Figure imgf000054_0002
製造方法。
[化 2]
Figure imgf000055_0001
' · - ( 1 )
(式（1)中、置換基 R1は同一でも異なっていてもよく炭素数 4〜24の脂肪族ァシル基 であり、置換基 R2は同一でも異なっていてもよく水素又はァセチル基を表す。また、 置換基 R3は水素又は炭素数 2〜24の脂肪族ァシル基を表す。 )
[16] 上記微生物が、シユードザイマ 'ックバェンシス（Pseudozyma tsukubaensis)、又は シユードザイマ'クラッサ（Pseudozyma crassa)であることを特徴とする請求の範囲第 1 5項に記載のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
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