JPH03141299A - 牛胎盤抽出細胞代謝活性化物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【１〕発明の目的 本発明は、牛の正常分娩（出産）後の胎盤から抽出され
た、新規な水溶性蛋白質に関する。

更に詳しくは、牛胎盤から抽出された水溶性蛋白質より
、更にこれを分画して得られる、分子量が２５，０００
付近、及び／又は、ｓｏ、ｏｏ。

の細胞代謝活性化物質に関する。

（産業上の利用分野） 胎盤エキスには、！！ｌ縄代謝活性作用、組織再生ｎ復
能が知られており、強肝、抗潰瘍剤、損傷修復剤として
利用されてきた。

本発明による新規な水溶性蛋白質は、推定分子措が２５
，０００付近、及び、８０，０００付近であり、細胞代
謝活性化作用が顕著である。

すなわち、本発明による水溶性蛋白質は、繊維芽細胞の
増殖と伸展を促進し、又、マクロファージの伸展を促進
して、ｎ食作用を促進する。よって、例えば、医薬品と
して、強肝剤、胃、十二指腸潰瘍剤、損傷修復剤、免疫
賦活剤等に直接、或は、配合剤として利用できる。

又、近年、癌治療において、従来の抗癌剤は正常細胞に
対する毒性作用も強く、生体の免疫機部も低下させるこ
とが知られ、このため、免疫系を強化する物質が注目さ
れているが、本発明による新規な水溶性蛋白質は、癌治
療に併用することは、有用であると考えられる。

（従来の技術） ８種基原（動物種属）の胎盤を出発原料となし、これよ
り各種の抽出法を採用して得られた、そのエキス、又は
その有効成分を分離して、医薬品や化粧品に用いること
は、古くから知られている。

その中から、水溶性抽出成分（エキス）について、その
応用や抽出法について調査すれば、例えば、「第１表ノ
に示すごとくの公知刊行物がある。

「第１表」公知刊行物（［］本国特許庁発行）又、第１
表に示されるような胎盤からの水溶性成分の抽出物につ
いて、これをそれぞれの抽出操作法から調べてみると、
その其通点としては、有機溶媒、強酸又は強アルカリが
用いられていることである。

更に、この他、蛋白分解酵素等を用いるなどの方法も知
られている。

そして、これらの抽出物の薬理学的作用としては、抗潰
瘍作用、組織代謝賦活作用が知られており、医薬品では
、注射剤や内服剤の形態で、強肝剤、胃又は十二指腸ｆ
ｉ瘍治療剤として用いられている。

又、化粧品では、肌の老化防止（シワ防止）、シミの防
止（メラニン色素生成抑制）の目的で、外用ｔ？布剤の
形態で用いられている。

つまり、従来から、胎盤中には組織再生修復能を有する
物質の存在が知られている。ところが、その作用又は効
果についての裏付けなどの判定法は、充分でなく、従来
では、例えば、モルモットの皮膚などの組織片を用い、
これに胎盤から抽出したエキス、又は、成分を添加して
、ワールブルクの検圧計などを用いて、消費される酸素
の量を求める方法により、評価されていたに過ぎなかっ
た。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、胎盤抽出物に関する、前記の組織代謝活
性作用、又は、組織再生修復作用に注目すると共に、こ
れらの従来の抽出方法による抽出物の再評価のための、
より的蹄な試験法の確立をもとに、胎盤からその本体を
求める研究をすることにした。

すなわち、胎盤由来の抽出成分の治療効果は、臨床学的
報告によって確立されているが、しかし基礎的な角度か
ら、これを細胞レベルにおいての真の細胞増殖能につい
て立証されたものは見あたらないでいた。

本発明者らは、受精卵を１０力月の体内にあって、１４
Ｑ数千万倍に成長促進させる、胎盤の重要な機能に着目
し、直接、細胞に対する増殖作用の定量的な検索法を開
発し、これをもとに、真の胎盤由来の細胞代謝活性化物
質の検索を開始したわけである。

本発明による検索法は、次項に示すごとくであるが、こ
れによって、前記の第１表で示すごとくの抽出物には、
そのいずれもが、細胞に対して直接的に高い活性能を有
するものではないことを見い出したのである。

そして、この原因について検討を加えてみると、１つに
、従来法による抽出方法及びエキス抽出のための処理法
に起因していることがわかったのである。つまり、本物
質が、熱と有機溶媒に対して不安定であることと関係し
ている。

ずなオ〕ち、従来の胎盤エキス、又は、抽出成分の有す
る、これまでに知られている臨床治験における抗潰瘍作
用、組織代謝活性作用等は、本試験法による検討からす
れば、少なくとも、直接、細胞を増殖促進させることに
よって、治療的効果が得られたというより、別の作用機
序から組織の代謝を活性化することによって得られたも
のであると考えられたのである。

そこで、本発明者らは、細胞に対して、直接に増殖促進
作用を有する物質について、胎盤中から見出すための抽
出１段について、いかなる操作を用いたら良いか、又、
従来の公知な方法による抽出エキス、又は単離成分が、
なぜ細胞増殖促進作用が小さいか又は無いのか、この２
点から研究を続け、鋭意追求した結果、高い細胞増殖促
進作用を有する抽出物を得ることが出来たのである。

（細胞増殖促進作用の測定等に関する（Ｌ解）細胞増殖
促進作用について、今］」一般に知られている成長因子
でも、的確にその効力を表現する方法は少なかった。

しかし、細胞毒性を表現する方法としては、これまでに
様々な方法が示され、例えば、増殖率の抑制として、細
胞数、蛋白量等で定量的に示すことが確立されている。

そこで、本発明者らはこの細胞毒性試験をもとに、これ
らを応用することによって、逆に、増殖率の促進能を定
量的に表現する方法を鋭意検討してきた。その結果、細
胞を培養する際の環境を制御し、対照の細胞増殖率を死
滅しないまでも、ゼロ近くに抑制・制御することにより
、目的物質の細胞増殖作用を表現する方法を確立するに
至ったのである。

この方法をより具体的に示せば、細胞を培養する環境に
おいて、添加する牛胎児血清（ＦＢＳ）のｆＩｔを調節
することにより行う方法である。

尚、本発明者らは、本試験法の確立のための研究の初期
段階において、目的物質の評価にあたって、様々の株細
胞で検Ｊ・すしてきた。しかし、それらは正常細胞とは
異なり、生体での細胞の機能王デルとは言い難いことが
わかり、最終的には、正常皮膚から取り出した初代細胞
で検索することにした。

すなわち、モルモットの皮膚から無菌的に細胞を分層し
、一定期間継代して変異していない細胞を対象となし、
目的物質の細胞増殖度を表現することにした。

以下に、その方法について詳しく述べる。

皮膚の細胞には、表皮細胞、繊維芽細胞があるが、例え
ば、モルモット（ハートレー系、雌）から採取した＃ｊ
Ａ維芽細胞は、５％牛脂児血清（ＦＢＳ）を添加したイ
ーグルＭＥＭ培地中では、盛んに分裂Ｉ′ｆ？殖し、そ
の倍数増殖時間は、「第１図」に示すごとく、約４８時
間であることが確認された。

そして、この細胞は、採取後、約１年間で株化すること
である。

そこで、本発明の目的物質の細胞増殖能の評価のために
は、出来るだけ正常に近い細胞という条件から、採取後
、６力月までに増殖継代した細胞を、冷凍保存すること
より、目的物質の分離、及び熱処理に対する安定化方法
等の検討のために、順次便用することにした。

一方、培養環境については、使用する牛胎児血清（ＦＢ
Ｓ）による細胞増殖促進作用への影響を、そのＩｎ度変
化から：Ｊ８査し、培養中、細胞を死滅化させることな
く、又、細胞増殖を認めない最善の柴ｆ生を満たす最少
量を基準とした。

具体的に、系中に添加するＦＢＳの添加漬と、それによ
る繊維芽細胞増殖との関係を示せば、第２　ｒ２のごと
くである。

ここで示されるように、添加するＦＢＳが系中０１％Ｍ
の時では、９０間の培古で、繊維芽細胞の増殖を認めな
かった。

したがって、コントロールとして、この条件をＪ、を準
とした。

その方法は、まず、直径３．５ｃｍのベトリディッシュ
（コーニング社製）に、１ｍＬ当り４〜’：’ｒ　Ｘ　
１０量個の細胞浮遊液を分注し、低温度のＦｒ３　Ｓを
添加（細胞が死滅することがなく、増Ｗ４率がゼロ付近
となる量）シた、イーグルＭＥＭ培地を２〜３［］毎に
交換する。そして、細胞数を、２〜３１１目ｆηにビュ
ルケルチュルクの血球計算盤を用いて測定する。

尚、この際、同時に蛋白量、核酸量を測定しても良い。

測定に使用する目的物質は、その蛋白量にて調！１（溶
油）シ、培地肖り１０分の１量を、培地交換の都度添加
し、対照（コントロール）には、四ｂｔの生理食塩水の
みを添加する。

（ｒＪ）発ｎＪＩの構成 本発明は、生胎盤から抽出した水溶性蛋白質でその推定
分子量が２５，０００付近、及び／又は、８０，０００
付近である細胞代謝活性化物質をもってなる。

（問題点を解決するための手段） 本発明のミロは、前述した如くであるが、より具体的に
示すために、以下に実施例及び作用について述べる。尚
、実施例を示すに当たり、本発明による基本的な決意を
示すと次の如くである。

（イ） 抽出法における、その出発原料は、牛の正常分娩（出産
）後の新鮮な胎盤を用いる。又、必要によっては、豚等
の他の家畜動物の胎盤などを用いることもできるが、そ
れは、用いる対象となる動物種の、治療又は医薬的な用
途、化ｆＩｔ料等々の用途に応じて選択すればよい。

（ロ） 実施例では、特定した抽出条件下で、最も簡易な方法を
示すも、その抽出行程における操作のポイントは、熱を
加えないこと。有機？８媒による抽出操作は避けること
。強酸、強アルカリ、各種の蛋白質分解酵素を用いない
ことが必要である。

すなわち、これらの処理操作は、目的物質の活性を失活
させてしまうので、用いてはならないのである。よって
、本発明による胎盤からの抽出法の特徴は、従来の公知
な胎盤エキス、又は、単甥成分の抽出法に用いた、有機
溶媒、強酸、強アルカリや酵素等を、行程中に一切用い
ないことにあり、これに従がって、遠心分離法、塩析分
画法、ゲル濾過法、透析法、低温又は真空濃縮法、凍結
乾燥法などの、従来の生体成分を抽出する様々な方法の
組合せによって、本願物質を得ることができる。

（実施例１） 牛の正常分娩後の胎盤を洗浄の前処理なしに細切し、低
温下にてホモジナイザー等でホモジネートする。これに
対して水又は緩衝液、例えば塩化ナトリウム含有の低イ
オン濃度リン酸緩衝液を添加して撹拌し、６時間から１
昼夜放置した後、遠心分離して上澄液を得る。

次にこの上澄液に対して、２０％飽和の潤度になるよう
に硫酸アンモニウムを添加後、遠心分離して、その上澄
液を回収し、更にこの上澄液に対して、６０％飽和の潤
度になるように硫酸アンモニウムを＋ｌｆ　ｍ加し、こ
れによって発生する沈澱物を回収する。

尚、沈澱物は、少量の水又は生理食塩水などに溶解した
後、脱塩操作を行う。

脱塩操作には、ゲル濾過、限外濾過、透析などの方法が
あるが、ここでは、例えば透析チューブに入れて、充分
量の生理食塩水などに、１昼夜以上透析する方法により
行った。

（実施例２） 実施例１で得られた細胞増殖促進作用の高い抽出物は、
その用いる用途を考慮するとき、ウィルスの不活化につ
いて充分な配慮が必要である。

例えば、肝炎ウィルスを不活化するには、６０℃、１０
時間の加熱処理が有効とされている。

実施例１で得られた液体を凍結乾燥したものについて、
水又は食塩水に溶解させた後、６０℃、１０時間の加熱
処理を行ったところ、ウィルス不活化には有効であって
も、本来の目的である細胞増殖促進作用も１００％失活
してしまうことがわかった。

すなわち、いろいろと条件を変え、加熱処理を行った結
果、・本願発明物質である新規な水溶性蛋白質は、６０
℃、３０分間で細胞増殖促進作用が完全に失活してしま
うことがわかったのである。

そこで、本発明者らは、本物質の有する細胞増殖作用が
持続し、肝炎ウィルスのみ不活化するための１段として
、長時間高温下での処理に耐えられる安定化法について
、種々の研究に入った。

そして、その手段として、例えばグルコース、マンノー
ス等の単糖類、ショ糖、マルトース等の２糖類等を添加
し加熱処理を行い、検討を加えたが、この操作でも同様
に失活してしまうことがわかった。

本発明者らは、溶解した状態で６０℃の加熱処理を行う
と、この処理によって目的物質蛋白の高次構造に不可逆
的な変性をきたし、これによって失活したものと推定す
ると共に、これに対応する１段として、次に高濃度塩類
溶液中等で、Ｆめ蛋白の構造を変化させ、沈澱させた状
態で加熱することによって、蛋白の不可逆的な変性を最
小限に抑制することが可能ではないか、との発想のもと
に、実施例３で示すごとくの新規な加熱処理方法を完成
した。

この方法は、当然さまざまの従来の公知な血液及び臓器
由来の成分の、熱安定化法としても利用可能な、便利な
方法である。

（実施例３） 実施例１で得られた液体を凍結乾燥し、これを６０％硫
酸アンモニウム飽和溶液に懸濁したもの、又はその沈澱
物を分取し、６０℃、１０時間加熱処理を施した。

この方法によれば、肝炎ウィルスの不活化がなされると
共に、細胞に対する増殖促進作用が８０〜９０％残存す
ることがわかった。

第３図は、実施例３による処理後の目的物質の細胞増殖
作用について、実施例１で得られたものと対比して測定
した結果を示す。

つまり、加熱処理に対して、細胞増殖作用を失活させな
いための手段が、実施例３で示した方法である。

尚、実施例２〜３は、血清及び各［ａ器由来の蛋白質製
剤における、公知な肝炎ウィルスの不活化法をもとに、
６０℃、１０時間を前提に行ったときのものであるが、
特に、実施例３において、その行程中で採用した、高濃
度塩類溶液による沈澱又は懸濁化法によれば、温度はさ
らに高くすることにより、処理時間も短縮することがも
ちろん可能である。

（実施例４） 実施例１又は３で得られた蛋白質は、細胞に対して、直
接、代謝活性化作用を有する抽出物であり、そのまま、
従来の胎盤エキスの公知な使用分野（医薬、化粧品等）
に利用することが出来るが、本発明者らは、有効成分を
更に追求するため、次のような分画を試みた。

まず、実施例１又は３で得られた沈澱物について、ゲル
濾過を試み、経時的に流出する各フラクションの成分に
ついて検討してみた。ゲル濾過に用いられる担体として
は、セファデックス、アガロース、セファクリル等があ
げられるが、ここでは、セファデックスな用い行うこと
にした。

＃１（脂、セファデックスＧ−２００ カラムサイス゛：　　３１Ｘ３７０ｍｍ溶　　媒：　０
．０１Ｍ　リン酸ハ゛）７１−（０，１４Ｍ　ＮａＣ１
含　ｐＨ７，４１流　速：２ｃ（ｎ／ｈｒ これについての流出曲線は、第４図及び第５図に示す通
りである。

尚、第４図は、実施例１で得られた成分で、又、第５図
は、実施例３による加熱処理された成分の流出曲線であ
る。

そして、各フラクションについて繊維芽細胞増殖能の測
定を試みた結果、第６図に示すごとく、Ｆｒ−Ｃ１及び
、Ｆ　ｒ　−Ｄ　（Ｋａｖ［Ｑ、１８〜（１，８０付近
に流出する分画）に、有効成分が存在していることを見
いだした。

そこで、史に詳しく追求するため、Ｆｒ−Ｃ１及び、Ｆ
ｒ−Ｄについて、イオン交換による分画を試みた。イオ
ン交換に用いられる担体としては、セファデックス、セ
ファロース、セファクリル等の、陽及び陰イオン交換体
があげられるが、ここでは、ＤＦ、ＡＥ−セファデック
スを用いて分画した。

樹　　脂：　ＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラムリ
イス゛　：　　２０ｘ２００ｍｍ溶　　媒：　Ｏ，１Ｍ
−０，０５Ｎ　　トリス塩酸ハ１フフ１−（ｐｌ＋　　
８．０） 溶出条件：　ＮａＣｌ潰度　潤度０．５Ｍ（０，０５１
４段階に分は分画） 第７図は、これについての流出曲線を示したものである
。

そして、この分画操作によって得られた各フラクション
について、同様にして繊維芽細胞増殖能を測定した結果
、ＮａＣ１？ａ度　０．０５〜０．１ＭＭ、及び、０２
０〜０．２５Ｍの間に流出する両分に、強い活性が見ら
れた。そこで、再度、この分画について、セファデック
スＧ−２００を用い、ゲル濾過を行ったところ、第８図
に示す流出曲線が得られた。

図中Ａは、ＮａＣ１［１度０．０５〜０．１０Ｍで流出
する成分、又、Ｂは、０．２０〜０．２５Ｍで流出する
成分を示す。

（実施例５） 実施例４によって分画した、有効成分の分子量を測定す
るため、分子量既知物質である下記の４物質について、
セファデックスＧ−２００によるゲル濾過を行い、Ｋａ
ｖ値と分子量の検量線を作成し、目的物質の分子量を算
定した。

第９図は、その標準線である。

分子量既知物質（標準物質） Ａ、アルドラーゼ（分子Ｉｔ　１５８，０００）Ｂ、牛
血清アルブミン（公刊１１ｆｉ？、０００）Ｃ１α−キ
モトリプシノーゲンＡ （分子量２５，０００） 尚、本願発明物質の収量は、牛の胎盤１ｋｇから、約１
５０〜３００ｍｇ程度得られる。

〔ハ〕発明の効果 本発明は、牛の胎盤から得られた新規な水溶性の蛋白質
にある。そして、この蛋白質は、直接に細胞の代謝活性
化作用が極めて高いことにある。

従来の公知な胎盤抽出エキス又は抽出物質と、その抽出
条件から対比すると、従来の公知な抽出エキス又は抽出
物質は、その行程中で、有機溶媒、強酸、強アルカリ、
蛋白分解酵素などの薬剤が用いられてきたが、その結果
は、これらの薬剤によって、胎盤中の細胞増殖促進作用
物質が失活されてきたことである。又、従来法における
特徴は、抽出操作の前処理として、胎盤又はホモジナイ
ズした胎盤を洗浄していたが、その結果、本目的物質を
洗い流していたこと。又、単なる、加熱処理によっても
、失活されていたものと考えられる。

本発明は、牛の胎盤中に存在する細胞増殖促進作用物質
を、細胞に添加して、その増殖能を直接に細胞の数で定
置的に立証した。そして、更に、従来の抽出法による胎
盤エキス、又は、その単離物質が、なぜ細胞増殖作用を
示さないのか、その原因を追求した。その結果、抽出の
ために用いられる薬剤や、加熱処理の行程で失活させて
いたことを見いだすと共に、本願発明を完成することが
出来た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、モルモット（ハートレー系、雌）から採取し
た繊維芽細胞を、培養液中５％量の牛胎児血清（ＦＢＳ
）を添加したイーグルＭＥＭ培地中で培養した時の、細
胞数の変化を示したものである。 第２図は、繊維芽細胞増殖に及ぼす、培養液中の、牛胎
児血清（ＦＢＳ）濃度の影響について示したものである
。 第３図は、牛の胎盤から抽出された水溶性蛋白質の、熱
処理する前と熱処理した後の、細胞増殖促進作用を示し
たものである。図中イは、熱処理する前の抽出物の添加
による、細胞増殖作用、口は、熱処理した後の抽出物の
添加による細胞増殖作用、又、ハは対照群（生理食塩水
添加群）の細胞増殖作用である。 第４図は、６０％硫酸アンモニウムで沈澱した成分の、
セファデックスＧ−２００を用いたゲルＪＩＩ過゛によ
る流出曲線である。 第５図は、６０％硫酸アンモニウムで沈澱した成分を加
熱処理した物の、セファデックスＧ−２００を用いたゲ
ル濾過による流出曲線である。 第６図は、６０％硫酸アンモニウムで沈澱した成分を、
セファデックスＧ−２００をもちいて分両した各フラク
ションの、繊維芽細胞増殖作用を示したものである。 第７図は、牛の胎盤から抽出された水溶性蛋白質を、セ
ファデックスＧ−２００をもちいて分画し得られた、フ
ラクションＣ及びＤについて、更に、ＤＥＡＥセファデ
ックスＡ−５０を用いて、イオン交換分画した流出曲線
を示す。 第８図は、ＤＥＡＥセファデックスＡ−５０を用いて分
両した、活性フラクションの、セファデックスＧ−２０
０を用いたゲル濾過による、流出曲線である。 図中Ａは、イオン交換分画でＮａｃ１１１度０．０５〜
０　、　ＩＯＮの間で流出する分画、図中Ｂは、ＮａＣ
１潰度０．２０〜０．２５Ｍの間に流出する両分につい
ての、セファデックスＧ−２００でのゲル濾過による流
出曲線である。 第９図は、 アルドラーゼ（分子１ｉ　１５８，０００）第　３！２
１ 図中Ａ、 牛血清アルブミン （分子量６７．０００） 図 中Ｂ、 α−キモトリプシノーゲンＡ （分子量２５゜ ０００） 一図中Ｃをマーカー蛋白質として作成した、に６ｖ値に
よる標準線である。 藁４　図 ２　　４　６　８　１０ 日数 ０７１１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１） 牛胎盤から抽出された水溶性蛋白質で、その推定分子量
   が、２５，０００付近であり、等電点が５．０〜５．５
   付近、及び／又は、推定分子量が、８０，０００付近で
   あり、等電点が６．５〜７．０付近であることを特徴と
   する細胞代謝活性化物質。