JP4452799B2 - コアセルベートを活用したリポソームの製造方法 - Google Patents
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しかしながら、上記方法で解決したのは室温以下の保存温度での安定性のみであり、室温においても水溶液状態で長期間安定なリポソームを提供するものではない。さらに、リポソームを用いる生体組織、細胞への物質導入には必要不可欠なリポソームへの薬剤、生理活性物質、遺伝子等を簡便に高効率で含有させる方法についても解決すべき問題が多く、実用化されていない。
(1)糖脂質を用いて形成したコアセルベートより調製することを特徴とするリポソームの製造方法。
(2)前記糖脂質が下記一般式1で表されるマンノシドリピド系化合物であることを特徴とする、上記(1)記載のリポソームの製造方法。
(3)前記マンノシドリピド系化合物が、下記一般式2で表される化合物であることを特徴とする、上記(2)記載のリポソームの製造方法。
(4)前記糖脂質が下記一般式3または4で表されるラムノースリピド系化合物であることを特徴とする、上記(1)記載のリポソームの製造方法。
(5)前記糖脂質が下記一般式6または7で表されるソフォロースリピド系化合物であることを特徴とする、上記(1)記載のリポソームの製造方法。
(6)前記糖脂質が下記一般式8で表されるトレハロースリピド系化合物であることを特徴とする、上記(1)記載のリポソームの製造方法。
(7)前記糖脂質が下記一般式11で表されるサクシノイルトレハロースリピド系化合物であることを特徴とする、上記(1)記載のリポソームの製造方法。
(8)前記糖脂質が下記一般式12で表されるセロビオースリピド系化合物であることを特徴とする、上記(1)記載のリポソームの製造方法。
(9)前記糖脂質が下記一般式14で表されるグルコシドリピド系化合物であることを特徴とする、上記(1)記載のリポソームの製造方法。
(10)前記糖脂質が下記一般式15で表されるアルカノイル−N−メチルグルカミドリピド系化合物であることを特徴とする、上記(1)記載のリポソームの製造方法。
(11)前記糖脂質が、糖脂質系バイオサーファクタント化合物であることを特徴とする、上記(1)〜(10)のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
(12)形成したコアセルベートを構成する糖脂質の化学構造を変化させて調製することを特徴とする、上記(1)〜(11)のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
(13)形成したコアセルベートに、リン脂質、もしくは該コアセルベートを形成する糖脂質以外の糖脂質を混合することによって、調製することを特徴とする、上記(1)〜(11)のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
(14)形成したコアセルベートに、電気的刺激を与えることにより、または、圧力もしくは温度を変化せしめることによって、調製することを特徴とする、上記(1)〜(11)のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
(15)上記(1)〜(14)のいずれかに記載のリポソームの製造方法で得られたことを特徴とするリポソーム。
(16)熱力学的に安定であることを特徴とする、上記(15)に記載のリポソーム。
(17)上記(15)または(16)に記載のリポソームからなる、生体または細胞に物質を導入するための担体。
(18)生体または細胞に導入される物質が、薬剤、生理活性物質または遺伝子であることを特徴とする、上記(17)記載の担体、
(19)上記(15)または(16)に記載のリポソームを含有し、薬剤、生理活性物質もしくは遺伝子を該リポソームに導入、または担持せしめたことを特徴とする医薬品。
本発明において、糖脂質として、糖脂質系バイオサーファクタントを用いることができる。
バイオサーファクタントとは、生物由来の両親媒性物質であり、界面活性作用を有するものである。例えば、微生物が産生するバイオサーファクタントとしては、糖脂質系のもの、コリノミコール酸(Corynomycolic acid)等の脂肪酸系のもの、エマルサン(Emulsan)、リポサン(Liposan)等のバイオポリマー系のもの、サーファクチン、ビィスコシン等のリポペプタイド系のもの等、種々のものが知られており、これらは通常の界面活性剤に比べ、1)複数の官能基や光学活性を有する点、2)嵩高い構造や複雑な構造を有する点、3)生理活性(抗微生物、抗腫瘍作用など)を有する点、および4)生分解性や安全性が高い点を有することを特徴とする。本発明は、上記バイオサーファクタントのうち、特に糖脂質系のものを用いる点に特徴を有するものである。
本発明において使用する糖脂質としては、例えば、トレハロースリピド系化合物、サクシノイルトレハロースリピド系化合物、ソフォロースリピド系化合物、セロビオースリピド系化合物、マルトースリピド系化合物、ポリオールリピド系化合物、グルコースリピド系化合物、フルクトースリピド系化合物、グルコシドリピド系化合物、マンノシドリピド系化合物、ラムノースリピド系化合物、シュークロースリピド系化合物、アルカノイル−N−グルカミドリピド系化合物等の各種化合物を挙げることができる。また、本発明において、これらの誘導体も糖脂質として使用することができる。
マンノシドリピド系化合物としては、一般式2で表される化合物が好ましく、一般式2で表される化合物のうち、R25がCH2(OH)−〔CH(OH)〕m2−CH2−基(ただしm2=1〜8、好ましくは2〜6の整数を示す。)であり、R21〜R24が同一もしくは異なっていても良い、炭素数1〜15のアルカノイル基である化合物がより好ましく、一般式16で表されるマンノシルエリスリトール系化合物(以下、MEL−Aとも略す)がさらに好ましい。
ラムノースリピド系化合物の好ましい具体例(RL−1、RL−2、RL−3、RL−4、RL−A、RL−B)を以下に示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
ソフォロースリピド系化合物の好ましい具体例(SL−1、SL−2、SL−3、SL−5、SL−6)を以下に示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
トレハロースリピド系化合物の好ましい具体例(TL−1、TL−2)を以下に示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
サクシノイルトレハロースリピド系化合物の好ましい具体例(STL−1、STL−2、STL−3)を以下に示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
セロビオースリピド系化合物の好ましい具体例(CL−A、CL−B、CL−C)を以下に示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
グルコシドリピド系化合物として、アルキルグルコシド系の化合物(一般式14において、R148がアルキル基のもの。)が好ましい。グルコシドリピド系化合物の好ましい具体例(GL−1)を以下に示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
アルカノイル−N−メチルグルカミドリピド系化合物としては、上記一般式15において、R151が炭素数12の飽和または不飽和で、直鎖または分岐鎖の脂肪族炭化水素基である場合が好ましい。
本発明においては、糖脂質を水中に懸濁してコアセルベートを形成させた後、糖脂質の化学構造を変化させることにより、リポソームを調製する。
2種類の高分子水溶液を混合したり、高分子や界面活性剤に塩やアルコールを添加することにより、コロイドに富む液相(濃厚水溶液)と、コロイドに乏しい液相(希薄水溶液)の2液に相分離する(コアセルベーション)。この2相に分離した水溶液のうち、コロイドに富む相をコアセルベートという。
本発明では、糖脂質を用い水中で形成したコアセルベートを経て、リポソームを形成する。コアセルベートは水中に存在する薬剤、タンパク質、酵素、医薬品等の溶質をその内部に多量に保持できる性質がある。従って、有機溶媒を用いて製造するような、従来法により得られるリポソームと比べて、コアセルベートより形成される本発明のリポソームは、より多量に且つ簡便に前記のような溶質を内包できる。
本発明において、コアセルベートの形成法として、例えば、糖脂質等の両性界面活性剤を水中に添加し、攪拌するだけでコアセルベートを形成する方法が挙げられるが、本発明においてはこれに限定されることはない。
コアセルベートを形成するための糖脂質の濃度は特に制限されないが、好ましくは1乃至50mMである。
ここで、糖脂質の化学構造の変化とは、糖脂質の1位〜6位の炭素原子に結合する水酸基とのエステル化反応により付加された基(例えば、前記一般式1における、R11〜R18等が挙げられる)に対し、生化学的反応または化学的反応により、加水分解による脱離反応や、別の新たな基を付加する付加反応を行うことによりコアセルベートの形態を変化させて、結果リポソームを形成するような、糖脂質の構造変化をいう。
リン脂質またはコアセルベートを構成する糖脂質とは別の糖脂質の添加量としては、コアセルベートを構成する糖脂質に対して、好ましくは10乃至80mol%、さらに好ましくは30mol%である。
本発明に用いられるリン脂質としては、フォスファチジルコリン、ホスファチジルセリン等の公知の中性リン脂質が挙げられ、具体的には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリン等が挙げられる。
本発明に用いられる、コアセルベートを構成する糖脂質とは別の糖脂質としては、前記糖脂質系バイオサーファクタント等が挙げられる。
これに対し、MEL−A等の糖脂質は、水中に懸濁すると、リポソームに見られるような内水相は持たず、集合体の内部にも脂質が詰まっている油滴のようなコアセルベートとなる場合がある。このコアセルベートに対して、上記方法を実施することで、コアセルベートからリポソームへと形態が変化する。
本発明で調製されるリポソームは一枚膜でも多重膜のものでも良い。
また、従来の方法により製造されるリポソームは、通常、サイジング処理等を行わなければ、その粒子は数μm以上となる。しかし、本発明によれば、このような処理を行うことなく、100〜1,000nm程度の粒子径を持つリポソームを得ることができる。
本発明により得られるリポソームに遺伝子を担持させようとする場合においては、目的とする遺伝子を含む発現ベクターを構築し、上記コアセルベートに該発現ベクター添加、混合し、上記方法によりリポソームを調製せしめれば、該発現ベクターを担持したリポソームを容易に得ることができる。
なお、本発明のリポソームに遺伝子を担持させる場合、該リポソームの構成物質の一部として、陽イオン性脂質が含まれていることが好ましい。陽イオン性脂質としては、コレスレリル−3β−カルボキシアミドエチレン−N−ヒドロキシエチルアミンやコレスレリル−3β−カルボキシアミドエチレン−N,N−ジメチルアミン等が挙げられ、これらの化合物の合成法は、R.Okayamaら、「FEBS Letters」(408、232−234、1997)等に記載されている。
また、薬剤等を導入、担持させたリポソームを、化粧品に含有させることもできる。
本発明のリポソームに導入し得る薬剤および生理活性物質としては、特にその種類により限定されるものではないが、リン酸L−アスコルビルマグネシウム、アスコルビン酸グリコシド、グリチルリチン酸ジカリウム、エスチン、エスクリン、インドメタシン、アスコルビン酸、またはこれらの塩など等が挙げられる。
一般式16で示すn16=10のものを主成分とするMEL−Aを1〜50mMとなるように試験管中に測りとり、蒸留水2mLを加えて1分間ボルテックス処理したところ、コロイド状の水溶液が得られた。MEL−Aの濃度が2mMのときの水溶液をNikon社製の微分干渉光学顕微鏡であるE600(商品名)を用いて観察した結果を図1に示す。この図から明らかなように、水溶液中にMEL−Aが形成する粒子径2μm〜20μmのコアセルベートが多数観察された(図1中、球状部に相当する)。さらに、MEL−Aの濃度の増加に伴い、コアセルベートの粒子径は増大し、MEL−Aの濃度が50mMのときでは、コアセルベートの粒子径は100μm程度となった。
参考例で得られた、前記MEL−Aが形成するコアセルベートに、シグマ社製の酵素であるアセチルエステラーゼ1nMを作用させることによって、MEL−Aの糖鎖部分を脱アセチル化した。この際のコアセルベートの形態変化をカールツアイス社製の共焦点レーザー操作顕微鏡を用いて観察した。その結果について、脱アセチル化処理前の共焦点レーザー操作顕微鏡写真を図2−1(a)に、脱アセチル化処理後の共焦点レーザー操作顕微鏡写真を図2−2(a)に示す。また、図2−1(b)および図2−2(b)は、図2−1(a)および図2−2(a)中の矢印に沿って測定した蛍光強度を示すグラフを表し、図2−1(b)および図2−2(b)中、横軸は図2−1(a)および図2−2(a)中の矢印の距離を示し、縦軸は、蛍光強度を示す。これらの図から明らかなように、糖鎖部分を脱アセチル化処理することによって、コアセルベートから、内部に内水相を持つリポソームを調製できた。
MEL−Aの代わりに、ラムノースリピド系化合物としてRL−4、ソフォロースリピド系化合物としてSL−5、トレハロースリピド系化合物としてTL−1(m20=14、n20=16のもの)、セロビオースリピド系化合物としてCL−C(R221がOHで、X=4のもの)、グルコシドリピド系化合物としてドデシル−β−D−グルコシド(GL−1)、マンノシド系リピド化合物としてドデシル−β−D−マンノシド(ML−1)、または、アルカノイル−N−メチルグルカミドリピド系化合物としてドデシル−N−メチルグルカミドを用いて、それぞれ参考例と同様の操作を行ったところ、参考例と同様、コアセルベートを調製できた。なお、これらの糖脂質は、北本大、“オレオサイエンス”、1(1)、17−31(2001)記載の方法によって微生物培養液より調製した。また、実施例1と同様に、上記のコアセルベートを形成している糖脂質の脱アセチル化処理を行うことによって、コアセルベートからリポソームが形成された。
蛍光物質であるカルセイン(商品名、株式会社同仁研究所社製)0.1mMを含む緩衝液(10mM Tris−HCl(pH7.3))中で、参考例と同様、MEL−Aを用いてコアセルベートを調製した。これに、ジパルミトイルフォスファチジルコリン(DPPC)の添加量が、MEL−Aに対して0mol%〜100mol%となるよう、10mol%刻みで、DPPCを添加し、リポソームを形成した。
次に、この調製したリポソーム懸濁液40μLを、2.0mLの10mM Tris−HCl(pH7.3)緩衝液に添加し、蛍光強度を測定した(励起波長は490nm、蛍光波長は520nmとした)。このときの蛍光強度をFtとする。使用した装置は、蛍光分光光度計FP−6500(商品名、日本電子株式会社)である。
次に、10mMのCoCl2水溶液を20μL添加し、リポソームに封入されなかったカルセインを消光させ、リポソーム内部に封入されたカルセインのみの蛍光強度を測定した。このときの蛍光強度をFinとする。
さらに20%TritonX−100(商品名)溶液を20μL添加することにより、リポソームを破壊し、すべてのカルセインをCo2+と結合させ消光させる。このときの蛍光強度をFqとする。
リポソームの保持効率は、以下の式により計算される。
図3より明らかなように、保持効率を持たないコアセルベートから、10mol%〜80mol%、特に、30mol%のDPPCの添加によって、保持効率の大きなリポソームへと形態変化することが確認できた。
なお、DPPC以外のリン脂質であるジステアロイルフォスファチジルコリン(DSPC)、ジミリストリルフォスファチジルコリン(DMPC)、ジラウロイルフォスファチジルコリン(DLPC)を用いても、同様の結果が得られた。
実施例3で形成したリポソームのうち、MEL−Aに対して、DPPCを30mol%添加して調製したリポソームの粒子径を、大塚電子(株)製の光散乱光度計を用いて測定した。その結果を図4に示す。図4からわかるように、本発明のリポソームの粒子径は、約600nmと極めて小さいことが確認できた。
実施例3で調製したリポソームを、常温(25℃)で3ヶ月間静置した後の、リポソームの安定性を検討した。
その結果、実施例3において保持効率が高かった、DPPCをMEL−Aに対して10mol%〜80mol%添加した場合、その他の組成の水溶液に比べて均一な水溶液が得られた。また、この組成においては、得られたリポソームは常温で3ヶ月以上静置していても熱力学的に安定であることがわかった。
参考例で形成したMEL−Aのコアセルベートに、蛍光ラベルしたヒト抗体であるシグマ社製のFITC−hIgG(商品名)を20mg/ml添加、攪拌して、カールツアイス社製の共焦点レーザー操作顕微鏡を用いて観察した。
その結果、コアセルベート内部からのみ、FITC−hIgGの蛍光が確認され、コアセルベート内部に前記人抗体を添加したヒト抗体の総量のうち80乃至90%を濃縮して内包させることが可能であった。
なお、FITC−hIgGの代わりに、Promega社製のプラスミドDNApGL3(商品名)を用いた場合も、同様の結果が得られた。
Claims (5)
- 下記一般式16で表されるマンノシドリピドを用いてコアセルベートを形成した後、該マンノシルリピドの脱アセチル化を行うかあるいはリン脂質を混合することを特徴とする、リポソームの製造方法。
- 請求項1に記載のリポソームの製造方法で得られたリポソーム(ただし、コレステロール誘導体を構成成分として含むリポソームを除く。)であって、粒子径が100〜1000nmであることを特徴とするリポソーム。
- 熱力学的に安定であることを特徴とする、請求項2に記載のリポソーム。
- 請求項2または3に記載のリポソームからなる、生体または細胞に物質を導入するための担体。
- 生体または細胞に導入される物質が、薬剤、生理活性物質または遺伝子であることを特徴とする、請求項4に記載の担体。
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