JP2015007031A - セロビオースリピッドを含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】糖脂質型バイオサーファクタントの一種であるセロビオースリピッドを含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【選択図】なし
Description
2.下記一般式(I)又は(II)で表される構造を有するセロビオースリピッドを含有することを特徴とする、1に記載のコラーゲン産生促進剤。
(式(I)中、R1は、水素又はヒドロキシル基を表し、n1は炭素数が12〜14を示す。また式I中の糖1のR2、R3、R4はアセチル基またはヒドロキシル基であることを示す。)
(式(II)中、R1、及びR2は、それぞれ水素又はヒドロキシル基を表す。またn1は炭素数11あるいは12のアルキレン基を表し、n2は炭素数2または4のアルキレン基を表す。)
3.1又は2に記載のコラーゲン産生促進剤を含む抗老化剤。
4.1又は2に記載のコラーゲン産生促進剤を含む肌のキメ調整剤。
5.1又は2に記載のコラーゲン産生促進剤を含む皮膚のしわ防止・抑制剤。
本明細書において「コラーゲン産生促進」とは、細胞により生産されるコラーゲンの生産量を増加させる効果のことである。表皮と真皮の境界部位は、コラーゲンIV、VIIが表皮細胞の支持、接着などに関与する。加齢や紫外線によるダメージ、特に紫外線によってコラーゲンIV、VIIが減少し、表皮、真皮支持機能が減少し、選別透過機能が弱化して有害な成分が容易に皮膚に影響を及ぼすため、シワが生成される。また真皮を構成する細胞外マトリックスは、真皮内の線維芽細胞から作られ、コラーゲン、エラスチンなどの繊維状のタンパク質とヒアルロン酸などの酸性ムコ多糖と呼ばれる多糖類で構成されており、皮膚の弾力性、代謝、生気などに直接関与している。線維芽細胞の活性が特に加齢や光老化より低下すると、コラーゲン生合成性が減少して変性されたエラスチンが増加する。さらに真皮の主成分であるコラーゲンI型を分解するマトリックスメタロプロテナーゼMMP−1の増加によってコラーゲンなどの細胞外マトリックス成分の分解が増加し、真皮内にキズが発生して、表皮−真皮の境界が破壊され、真皮の分解が加速化される。最終的には、皮膚の弾力性やみずみずしさ、生気が失われ、シワ、小ジワ、肌荒れが発生し皮膚の老化をもたらされる。このため「コラーゲン産生促進」の効果により抗老化作用が期待される。
セロビオースリピッドは、生物により生産される界面活性能力や乳化能力を有する糖脂質型バイオサーファクタントの一種である。「バイオサーファクタント」とは生物によって生み出される界面活性能力や乳化能力を有する物質の総称であり、優れた界面活性や、高い生分解性を示すばかりでなく、様々な生理作用を有していることから合成界面活性剤とは異なる挙動・機能を発現する可能性がある。
セロビオースリピッドは、セロビオースリピッド生産菌の培養液を抽出、精製することにより得られる。CL生産菌としては、例えば、クリプトコッカス(Cryptococcus属)やウスチラゴ(Ustilago)属に属し、かつセロビオースリピッドを生産する能力を有する微生物が挙げられる。クリプトコッカス (Cryptococcus)属微生物は主に上記構造式(I)のセロビオースリピッドを生産し、ウスチラゴ(Ustilago)属の微生物は主に構造式(II)のセロビオースリピッドを生産する。
「肌のキメ」とは表皮の表面にあるくぼみ(皮溝)と盛り上がり(皮丘)でできた凹凸のことを指す。また「肌のキメ」が整っているとは、皮溝の幅が狭く皮丘が平らでそろっている状態をいい、皮溝の幅と間隔により決まる。それらは表皮の厚さと硬さ、細胞間基質の弾力などにより構成される。加齢または光老化とともにこの構成要素が不均一になるとキメの規則性が損なわれる。細胞間基質の弾力にはコラーゲンが関与している。本発明に係るコラーゲン産生促進剤の有効成分であるセロビオースリピッドを用いることによりコラーゲン産生能が活性化され、細胞間基質の弾力が改善され、キメが正常な状態に調整される。キメが整うことで、光の散乱効果が高まり皮膚のくすみが消え肌のトーンが明るくなるといった効果が得られる。
「皮膚のしわ防止・抑制」とは加齢や光老化に伴うしわ形成を阻止する効果を指す。本発明に係るセロビオースリピッドを用いることにより細胞のコラーゲン産生能が促進されることによりしわの防止、抑制される。しわの発生は、紫外線の照射に伴い真皮細胞がダメージを受けたり、加齢による影響で、エラスチンやコラーゲンで構成される真皮の構造が壊れたり、それらの産生が低下することに起因する。
[本発明の使用形態]
種菌培養はCryptococcus humicola NBRC 10251のコロニーを種培地(50mL/500mL坂口フラスコ)に1 Loop植菌して実施した。27 ℃にて一晩培養した。得られた培養液を種菌とした。種培地組成は10g/L グルコース、3g/L 硝酸ナトリウム、0.5g/L硫酸マグネシウム7水和物、0.03g/Lリン酸二水素ナトリウム 0.1g/L 酵母エキスとした。.培養は上記種菌 60mLを生産培地6L(10L-jar)に植菌し、27 ℃、530rpm(攪拌回転)、3L/min(Air)の条件で10L-jarを用いて培養した。生産培地組成は、10g/L グルコース、3g/L 硝酸ナトリウム、0.5g/L硫酸マグネシウム7水和物、0.03g/Lリン酸二水素ナトリウム 0.1g/L 酵母エキスとした。6日間培養した培養液を遠心分離 (7500rpm, 20min ) を行い、菌体と上清を分離した。菌体と等量の酢酸エチル : アセトン=4:1を加え攪拌後、CL抽出を行った。沈殿と上清に分け、上清をエバポレーターで乾燥させ、粉末を得た。得られた粉末からさらに脂質不純物を取り除くため、ヘキサン(300g)を加え攪拌後、ガラスフィルターろ過とエバポレーションを行いヘキサン除去した。これにより、CLの混合体を得た。
種菌培養はUstilago esculenta NBRC 9887のコロニーを種培地 (50mL/500mL坂口フラスコ) に1 loop植菌して実施した。27 ℃にて一晩培養した。得られた培養液を種菌とした。種培地組成は50g/L グルコース、3g/L 硝酸ナトリウム、0.5g/L硫酸マグネシウム7水和物、0.25g/Lリン酸二水素カリウム 0.5g/Lリン酸水素二カリウム、8g/L 酵母エキスとした。培養は上記種菌100mLを生産培地6L(10L-jar)に植菌し、27 ℃、530rpm(攪拌回転)、3L/min(Air)の条件で10L-jarを用いて培養した。生産培地組成は、50g/L グルコース、3g/L 硝酸ナトリウム、0.5g/L硫酸マグネシウム7水和物、0.25g/Lリン酸二水素カリウム 0.5g/Lリン酸水素二カリウム、8g/L酵母エキスとした。6日間培養した培養液を遠心分離 (7500rpm, 20min ) を行い、菌体と上清を分離した。菌体と等量の酢酸エチル : アセトン=4:1を加え、十分攪拌後、CL抽出を行った。沈殿と上清に分け、上清をエバポレーターで乾燥させ、粉末を得た。得られた粉末からさらに脂質不純物を取り除くため、ヘキサン(300g)を加え、攪拌後、ガラスフィルターろ過とエバポレーションを行いヘキサン除去した。これにより、CLの混合体を得た。
実施例1又は2で得られたCLを4gに蒸留水20mLを添加して撹拌した。この溶液に1N NaOHを滴下し、pH7〜8になるように調製を行った。粉末化のため、エバポレーターで水分を除去後さらにエタノールを添加、乾燥させた。
クリプトコッカス・フミコーラ(Cryptococcus humicola)およびウスチラゴ・エスキュレンタ(Ustilago esculenta)それぞれから得られたCLの同定は、共鳴周波数500MHzの1H−NMR測定(プロトン型核磁気共鳴分光測定)にて行った。測定装置はBRUKER社製 NMR装置AVANCE 500を用い、溶媒には重クロロホルム(CDCl3)および重メタノール(CD3OD)を用いた。その結果、これらの株から得られた粉末はすべてCLであることが判明した。化3、化4に一般式を示す。化3にクリプトコッカス・フミコーラ(Cryptococcus humicola)由来のCLの主な構造を示し、化4にウスチラゴ・エスキュレンタ(Ustilago esculenta)から得られたCLの主な構造を示す。それぞれ代表的な構造について、重クロロホルムを用いた測定ではクロロホルムのピークを7.24ppm、重メタノールを用いた測定ではメタノールのメチルプロトンのピークを3.30ppmとしたときの、帰属された化学シフトをまとめて表1、表2に示す。なお、表1は式(III)において、n1=14,R1=OHであり、表2は式(IV)においてn1=12、R1=OH,R2=OHである。
(式(III)中、R1は、水素又はヒドロキシル基を表し、n1は炭素数が12または14を示す。また式I中の糖1のR2、R3、R4はアセチル基またはヒドロキシル基であることを示す。)
(式(IV)中、R1、及びR2は、それぞれ水素又はヒドロキシル基を表す。またn1は炭素数11あるいは12のアルキレン基を表し、n2は炭素数2または4のアルキレン基を表す。)
ヒト正常皮膚線維芽細胞を1ウェル当たり2.0×104個となるように48穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) に10%のウシ胎児血清を添加したものを用いた。37℃、二酸化炭素濃度5%中にて24時間培養後、CL−Na塩を終濃度100μg/mL〜1μg/mLとなるよう試験培地に添加し、さらに72時間培養した。
溶媒対照として、蒸留水を設けた。次いで生細胞数測定試薬SFを25μL添加して3時間培養し、マイクロプレートリーダーにて450nmの吸光度を測定した。
同時に濁度として650nmにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。
図1より、CL−Na塩を終濃度100μg/mL〜10μg/mL添加すると、ヒト正常皮膚線維芽細胞に対して、蒸留水よりも高い細胞賦活化作用を示した。特にCLを終濃度25μg/mL添加した場合には、蒸留水よりも30%以上の有意な細胞賦活化作用が認められた。この結果より、CLが優れた細胞賦活化作用を有することが明らかとなった。
実施例3に記載されているCL−Na塩の粉末を蒸留水に溶解し、それぞれCL−Na塩の終濃度が100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、および1μg/mLであるセロビオースリピッド水溶液を用意して、正常ヒト皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生量の変化を評価した。コントロールとして蒸留水のみ用い、同じく評価した。評価は、以下の手順で行った。正常ヒト皮膚線維芽細胞を1ウェル当たり1.0×104個となるように48穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に1%のウシ胎児血清を添加したものを用いた。37℃、二酸化炭素濃度5vol%中にて24時間培養後、PBS(−)で2回洗浄した後、任意の濃度の試料を添加した無血清培地に交換し、さらに3日間、6日間同条件にて培養した。培養上清から、ヒト線維芽細胞が産生するI型プロコラーゲンC末端ペプチド(Procollagen typeIcarboxyterminal propeptide:PIP)を、Procollagen type I C-peptide (PIP) EIA Kit (TaKaRa)で測定した。コラーゲン産生促進率は、標準品を上記ELISAキットにて測定し、その結果から検量線を作成、その検量線から試料添加時のコラーゲン産生量及び試料無添加時のコラーゲン産生量を求めた。
以下に示す組成の美容液を常法により製造した。
(組成) (重量%)
クエン酸 0.01
クエン酸Na 0.04
CL−Na塩 0.5
1.3.ブチレングリコール 5.0
濃グリセリン 2.5
1.2.ペンタンジオール 2.0
フェノキシエタノール 0.25
精製水 全体で100となる量
以下に示す組成の乳液を常法により製造した。
(組成) (重量%)
グリセルエーテル 1.5
CL−Na塩 0.01
ショ糖脂肪酸エステル 1.5
モノステアリン酸ソルビタン 1.0
スクワラン 7.5
ジプロピレングリコール 5.0
精製水 全体で100となる量
以下に示す組成のクリームを常法により製造した。
(組成) (重量%)
ε−アミノカプロン酸 0.2
CL−Na塩 0.1
パラオキシ安息香酸メチル 0.5
フェノキシエタノール 0.2
1,3−ブチレングリコール 7.5
MEL 0.1
セタノール 2.5
ベヘニルアルコール 3.0
スクワラン 5.0
トリ(カプリル酸/カプリン酸)グリセリル 15.0
ペンタステアリン酸ポリグリセリル−10 0.95
ステアロイル乳酸Na 0.3
精製水 全体で100となる量
以下に示す組成の洗顔料を常法により製造した。
(組成) (重量%)
エデト酸ニナトリウム 0.05
ε−アミノカプロン酸 0.2
濃グリセリン 1.5
CL−Na塩 0.1
パラオキシ安息香酸メチル 0.15
1,3−ブチレングリコール 4.5
2−アルキル−N−カルボキシメチル−N−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン (30%水溶液)
3.0
N-ヤシ油脂肪酸アシル-DL-アラニントリエタノールアミン液 (30%水溶液)
30.0
フェノキシエタノール 0.5
精製水 全体で100となる量
Claims (5)
- セロビオースリピッドを含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
- 下記一般式(I)又は(II)で表される構造を有するセロビオースリピッドを含有することを特徴とする、請求項1に記載のコラーゲン産生促進剤。
(式(I)中、R1は、水素又はヒドロキシル基を表し、n1は炭素数が12または14を示す。また式I中の糖1のR2、R3、R4はアセチル基またはヒドロキシル基であることを示す。)
(式(II)中、R1、及びR2は、それぞれ水素又はヒドロキシル基を表す。またn1は炭素数11あるいは12のアルキレン基を表し、n2は炭素数2または4のアルキレン基を表す。) - 請求項1又は2に記載のコラーゲン産生促進剤を含む抗老化剤。
- 請求項1又は2に記載のコラーゲン産生促進剤を含む肌のキメ調整剤。
- 請求項1又は2に記載のコラーゲン産生促進剤を含む皮膚のしわ防止・抑制剤。
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