WO2007100009A1

WO2007100009A1 - Ｌ－アミノ酸の製造法

Info

Publication number: WO2007100009A1
Application number: PCT/JP2007/053803
Authority: WO
Inventors: Yoshihiro Usuda; Kazuhiko Matsui
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 2006-03-03
Filing date: 2007-02-28
Publication date: 2007-09-07
Also published as: EP2003209B1; US20090093029A1; EP2003209A4; EP2003209A1; JP2009118740A; US20140045228A1

Abstract

腸内細菌科に属し、Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌をグリセロール、特に粗グリセロールを炭素源とする培地に培養し、培養物中にＬ－アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ－アミノ酸を採取することにより、Ｌ－アミノ酸を製造する。

Description

明細書

L—アミノ酸の製造法

技術分野

[0001] 本発明は、微生物を用いた L—アミノ酸の製造法に関する。 L—アミノ酸は、調味料、食品添加物、飼料添加物、化学製品、医薬品などの様々な分野に利用される。背景技術

[0002] Lースレオニン、 L リジン等の L アミノ酸は、これらの L アミノ酸生産能を有するェシエリヒア属細菌等の L アミノ酸生産菌を用いて発酵法により工業生産されている。これらの L アミノ酸生産菌としては、自然界から分離した菌株または該菌株の人ェ変異株、遺伝子組換えにより L アミノ酸生合成酵素が増強された組換え体等が用いられている。 L スレオニンの製造法としては、例えば、特許文献:!〜 4に記載された方法を挙げることができる。一方、 L—リジンの製造法としては、例えば、特許文献 5〜8に記載された方法を挙げることができる。

発酵法による L アミノ酸の工業生産においては、炭素源として糖類、すなわち、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等が使用されている。特許文献 1 :特開平 5— 304969号公報

特許文献 2 :国際公開第 98/04715号パンフレット

特許文献 3：特開平 05— 227977号公報

特許文献 4 :米国特許出願公開第 2002/0110876号明細書

特許文献 5 :特開平 10— 165180号公報

特許文献 6：特開平 11 - 192088号公報

特許文献 7 :特開 2000— 253879号公報

特許文献 8 :特開 2001— 057896号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0003] 本発明は、従来、主として糖類を炭素源として行われてきた微生物を用いた Lーァミノ酸の発酵製造法に対し、新たな原料を使用することにより、より安価な L—アミノ酸の製造法を提供するものである。

課題を解決するための手段

[0004] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、腸内細菌科に属し、L_アミノ酸生産能を有する細菌をグリセロールを炭素源とする培地に培養することにより、糖類を炭素源とする培地と同等またはそれ以上に L_アミノ酸を生産できることを見出した。さらに、グリセロールとして、全世界的に工業生産が行われているバイォディーゼル燃料生産において副生物として生成する純度の低い粗グリセロールが、純粋なグリセロールよりも高い生育促進効果を有することを見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至った。

[0005] すなわち、本発明は以下のとおりである。

(1)腸内細菌科に属し、 L アミノ酸生産能を有する細菌をグリセロールを炭素源として含む培地に培養し、培養物中に L アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物から Lーァミノ酸を採取することを特徴とする L アミノ酸の製造法。

(2)培地中のグリセロールの初発濃度が l〜30w/v%である前記方法。

(3)前記培地が粗グリセロールを添加した培地である前記方法。

(4)前記粗グリセロール力バイオディーゼル燃料生産にぉレ、て産生される粗グリセ口ールである前記方法。

(5)前記粗グリセロール力炭素源として用いたときに試薬グリセロールと比較して、より多くの L—アミノ酸を生産することが出来るグリセロールである、前記方法。

(6)前記細菌がェシエリヒア属に属する細菌である前記方法。

(7)前記細菌がパントエア属に属する細菌である前記方法。

(8)前記細菌がェシエリヒア'コリである前記方法。

(9)前記 L—アミノ酸が L—スレオニンまたは L—リジンである前記方法。

(10)前記 L—アミノ酸が L—スレオニンであり、前記細菌がァスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、 thrオペロンにコードされるァスパルトキナーゼ I、ホモセリンキナーゼ、ァスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及び、スレオニンシンターゼからなる群より選択される 1種または 2種以上の酵素の活性が増強されている前記方法。

(11)前記 L アミノ酸が L リジンであり、前記細菌がジヒドロジピコリン酸レダクタ一ゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォェノールピルべ一トカルボキシラーゼ、ァスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸ェピメラーゼ、ァスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシ二ラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼからなる群より選択される 1種または 2種以上の酵素の活性が増強されている、及び/または、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている前記方法。

(12)前記 L_アミノ酸が L—グノレタミン酸であり、前記細菌がグルタメートデヒドロゲナーゼ、クェン酸シンターゼ、ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ、メチルタエン酸シンターゼからなる群より選択される 1種または 2種以上の酵素の活性が増強されている、及び/または、ひ一ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が弱化されている前記方法。

(13)前記 L—アミノ酸が L—トリプトファンであり、前記細菌がフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、 3 デォキシ D ァラビノヘプッロン酸 7—リン酸シンターゼ、 3—デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、 5—ェノール酸ピルビルシキミ酸 3—リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、及び、コリスミ酸ムターゼからなる群より選択される 1種または 2種以上の酵素の活性が増強されてレ、る前記方法。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

< 1 >本発明で使用するグリセロール

グリセロールは、正式名称 Propane_l,2，3-triolである物質を指す。本発明において、粗グリセロールは、工業的に生産される不純物を含むグリセロールをいう。粗グリセロールは、油脂を高温、高圧下で水と接触させ加水分解することによって、あるいは、バイオディーゼル燃料生産のためのエステルイ匕反応によって、工業的に生産される。バイオディーゼル燃料とは、油脂とメタノールからエステル交換反応により生成する脂肪酸メチルエステルのことであり、この反応の副生物として粗グリセロールが生成する（Fukuda, H.， Kondo, A., and Noda, H. 2001， J. Biosci. Bioeng. 92， 405—416を参照のこと）。バイオディーゼル燃料生産プロセスでは、エステル交換にはアルカリ触媒法が用いられることが多ぐ中和時に酸を加えるため、水と不純物を含んだ純度 70 〜95重量％程度の粗グリセロールが生成する。バイオディーゼル燃料生産において産生される粗グリセロールは、水に加えて、残存メタノールや触媒である NaOH等のァルカリとその中和に用いられる K SO等の酸との塩を不純物として含んでいる。メーカ

2 4

一や製法により差はある力このような塩類やメタノールは数パーセントに達する。ここでナトリウム、カリウム、塩化物イオン、硫酸イオン等の、アルカリやその中和に用いられた酸に由来するイオン類は、粗グリセロールの重量に対し、 2〜7%、好ましくは 3 〜6%、さらに好ましくは 4〜5.8%含まれていることが好ましレ、。メタノーノレは、不純物として含まれてレ、なくてもょレ、が、望ましくは 0.01%以下含まれてレ、ることが好ましレ、。

[0007] さらに、粗グリセロール中には、微量の金属、有機酸、リン、脂肪酸などを含むことがある。含まれる有機酸としては、蟻酸、酢酸等が挙げられ、不純物として含まれていなくてもよいが、望ましくは 0.01%以下含まれていることが好ましい。粗グリセロールに含まれる微量の金属としては、微生物の生育に必要な微量金属が好ましぐ例えばマグネシウム、鉄、カルシウム、マンガン、銅、亜鉛等が挙げられる。マグネシウム、鉄、カルシウムは、粗グリセロールの重量に対し、合計で 0.00001〜0.1%、好ましくは 0.0 005〜0.1%、より好ましくは 0.004〜0.05%、さらに好ましくは 0.007〜0.01%含まれていることが好ましレ、。マンガン、銅、亜鉛としては、合計で 0.000005〜0.01%、より好ましくは 0.000007〜0.005%、さらに好ましくは 0.00001〜0.001%含まれていることが好ましい

[0008] 粗グリセロールのグリセロールの純度としては 10%以上であればよぐ好ましくは 50 %以上であり、さらに好ましくは 70%以上、特に好ましくは 80%以上である。不純物の含有量が上記の範囲を満たす限り、グリセロールの純度は 90%以上であってもよレ、。

[0009] 本発明において好ましい粗グリセロールは、バイオディーゼル燃料の生産において産生される粗グリセロールである。また本発明において好ましい粗グリセロールは、炭素源として用いたときに同量の試薬グリセロールと比較して、より多くの L—アミノ酸を生産することが出来るグリセロールを意味する。試薬グリセロールと比較して、より多くの L_アミノ酸を生産するとは、試薬グリセロールを炭素源として用いた場合に比べ、 L アミノ酸の生産量力 %、好ましくは 10%、さらに好ましくは 20%以上上昇することを意味する。「試薬グリセロール」とは、いわゆる試薬グレードとして市販されているグリセロール又はそれと同等の純度のグリセロールを意味し、純度が 99重量％以上であることが好ましぐ特に好ましいのは純グリセロールである。「粗グリセロールと同量の試薬グリセロール」とは、粗グリセロールが水を含む場合、水を除いた残部の重量と同量の試薬グリセロールを意味する。

[0010] 本発明において、粗グリセロールは、水等の溶媒で希釈して使用してもよい。その場合、上記のグリセロール及び不純物の含有量に関する記載は、希釈前の粗グリセロールに適用される。すなわち、粗グリセロールが水等の溶媒を含む場合、溶媒の含有量が好ましくは 30重量％以下、より好ましくは 20重量％以下、さらに好ましくは 10 重量％以下となるように溶媒を除去したときに、上記のグリセロール及び不純物の含有量の範囲を満たせば、本発明における「粗グリセロール」に該当する。

[0011] < 2 >本発明で使用する細菌

本発明においては、腸内細菌科に属し、 L アミノ酸生産能を有する細菌を使用する。

腸内細菌科は、ェシエリヒア、ェンテロパクター、エルビニァ、クレブシエラ、パントェァ、フォトルハブドウス、プロビデンシァ、サルモネラ、セラチア、シグラ、モルガネラ、ィエルシニア等の属に属する細菌を含む。特に、 NCBI (National Center for Biotechn ology Information)のァ¹ ~~タべ¹ ~~ス (http://www.ncbi.nlm. mh.gov/Taxonomy/Browser /wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌が好ましい。

[0012] ェシエリヒア属に属する細菌とは、特に制限されないが、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、ェシヱリヒア属に分類されていることを意味する。本発明において使用されるェシエリヒア属に属する細菌の例としては、ェシエリヒア'コリ (E.coli)が挙げられるが、これに限定されなレ、。

[0013] 本発明において使用することができるェシエリヒア属に属する細菌は、特に制限されないが、例えば、ナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia col l and salmonella: し ellular and Molecular Biology/Second Edition pp. 2477-2483. Ta ble 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.)に記述されている系統のものが含まれる。具体的には、プロトタイプの野生株 K12株由来のェシエリヒァ'コリ W3110 (ATCC 27325)、ェシエリヒア 'コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。

[0014] これらの菌株は、例えばアメリカン.タイプ.カルチャー 'コレクション（住所 P.O. Box

1549 Manassas, VA 20108, United States of America)より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン'タイプ'カルチヤ一 ·コレクションのカタログに記載されてレ、る。

パントエア属に属する細菌とは、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、パントエア属に分類されていることを意味する。ェンテロパクター 'アグロメランスのある種のものは、最近、 16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア'ァグロメランス、パントエア'アナナティス、パントエア'ステヮルティィその他に再分類された (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993))。本発明において、パントエア属に属する細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。

[0015] 本発明に用いる細菌は、グリセロールの資化性を高めるために、 glpR遺伝子（EP17 15056)の発現が弱化されているか、 glpA、 glpB、 glpC、 glpD、 glpE、 glpF、 glpG、 glpK 、 glpQ、 glpT、 glpX、 tpiA、 gldA、 dhaKゝ dhaL、 dhaMゝ dhaRゝ fsa及び ta 遺伝子等のグリセロール代謝遺伝子（EP1715055A)の発現が強化されていてもよい。

[0016] 本発明において、アミノ酸生産能を有する細菌とは、培地に培養したとき、 L アミノ酸を生産し、培地中に分泌する能力を有する細菌をいう。また、好ましくは、目的とする L—アミノ酸を好ましくは 0.5g/L以上、より好ましくは 1.0g/L以上の量を培地に蓄積させることができる細菌をいう。 L一アミノ酸は、 L—ァラニン、 L—アルギニン、 L- ァスパラギン、 L—ァスパラギン酸、 L—システィン、 L—グルタミン酸、 L—グルタミン、グリシン、 L—ヒスチジン、 L—イソロイシン、 L—ロイシン、 L—リジン、 L_メチォニン、 L—フエニノレアラニン、 L—プロリン、 L—セリン、 L—スレオニン、 L—トリプトファン、 L —チロシン及び L—バリンを含む。特に、 L—スレォニン、 L—リジン及び L—グルタミン酸が好ましい。以下、前記のような細菌に L アミノ酸生産能を付与する方法、又は前記のような細菌 L アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。

[0017] L アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、 L アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、 L_アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はェシエリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株)学会出版センター、 1986年 5月 30日初版発行、第 77〜： 100頁参照）。ここで、 L—アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよぐ 2種又は 3種以上であってもよい。また、発現が増強される L_ アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、 2種又は 3種以上であってもよレ、。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。

[0018] L アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわち X線や紫外線の照射、または N メチルー N，一二トロー N 二トロソグァ二ジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつ L アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ること力 Sできる。

[0019] また、 L アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによつても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、 L アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含む DNA断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレット W095/34672号参照）。

[0020] 上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良ぐ用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよレ、。コリネ型細菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの一35、一10領域をコンセンサス配列に近づけることによつても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、 WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開 1010755号明細書等に記載されている。

[0021] 以下、細菌に L一アミノ酸生産能を付与する方法、及び L一アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。

[0022] Lースレオニン生産菌

L—スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、 L—スレオニン生合成系酵素の 1種又は 2種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。 L—スレオニン生合成系酵素としては、ァスパルトキナーゼ III (lysC)、ァスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（_asd)、 thrオペロンにコードされるァスパルトキナーゼ I (thrA)、ホモセリンキナーゼ（thrB)、スレオニンシンターゼ（thrC)、ァスパルテートアミノトランスフエラーゼ（ァスパルテートトランスアミナーゼ） (aspC)が挙げられる。カツコ内は、その遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、ァスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ァスパルトキナーゼ I、ホモセリンキナーゼ、ァスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましレ、。

Lースレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたェシエリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたェシエリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損した TDH6株（特開 2001— 346578号）等が挙げられる。

[0023] Lースレオニン生合成系酵素は、最終産物の Lースレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、 L—スレオニン生産菌を構築するためには、 L—スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように L—スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましレ、。また、上記 thrA、 thrB, thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成している、スレオニンオペロンは、ァテニユエ一ター構造を形成しており、スレオニンオペ口ンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、ァテニユエーシヨンにより発現が抑制される。この改変は、ァテニユエーシヨン領域のリーダー配列あるいは、ァテニユエ一ターを除去することにより達成出来る。 (Lynn, S. P. , Burton, W. S.， Donohue, T. J. , Gould, R. M. , Gumport, R. I. , and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194: 59-69 (1987);国際公開第 02/26993号パンフレット；国際公開第 2005/049808号パンフレット参,照）

[0024] スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在する力 S、非天然のプロモーターに置換してもよいし (WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第 0593792号明細書参照 )また、 L—スレォニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、 a -amino- β -hydroxyvaleric acid (AHV)に耐性な菌株を選抜することも可能である。

[0025] このように L スレオニンによるフィドバック阻害を受けなレ、ように改変されたスレォニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇している力、あるいは強力なプロモータ一に連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、 Mu—ファージ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによつても達成出来る。

[0026] Lースレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、 TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらの L—スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ (pntAB)遺伝子（欧州特許 733712号明細書）、ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（P印 C) (国際公開 95/06114号パンフレット)、ホスホェノールピルビン酸シンターゼ遺伝子 (pps) (欧州特許 877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開 99/18228号パンフレット、欧州出願公開 1092776号明細書)が挙げられる。

[0027] また、 L—スレォニンに耐性を付与する遺伝子、 L—ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主に L—スレオニン耐性、 L—ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、 rhtA遺伝子 (Res. Microbio 1. 154:123— 135 (2003))、 rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第 0994190号明細書）、 rht C遺伝子（欧州特許出願公開第 1013765号明細書）、 yfiK、 yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第 1016710号明細書）が挙げられる。また宿主に L—スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第 0994190号明細書や、国際公開第 90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。

[0028] L—スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 E. coli TDH- 6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第 5, 175, 107号、米国特許第 5，705，371号)、 E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第 5, 631,157号)、 E. coli NRRL-21593 ( 米国特許第 5，939，307号)、 E. coli FERM BP-3756 (米国特許第 5，474，918号)、 E. coli FERM BP-3519及び FERM BP- 3520 (米国特許第 5, 376,538号)、 E. coli MG442 (Gu syatiner et al, Genetika (in Russian), 14, 947—956 (1978))、 E. coli VL643及び VL20 55 (EP 1149911 A)などのェシエリヒア属に属する株が挙げられる力これらに限定されない。

[0029] TDH-6株は thrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、その ilvA遺伝子力 Sリーキー (leaky)変異を有する。この株はまた、 rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。 B-3996株は、 RSF1010由来ベクターに、変異 _thrA遺伝子を含む thrA*BCオペロンを挿入したプラスミド pVIC40 を保持する。この変異 thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたァスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼ Iをコードする。 B-3996 株は、 1987年 11月 19日、オールユニオン 'サイエンティフィック 'センタ一'ォブ'アンチビォテイクス (Nagatinskaya Street 3_A， 117105 Moscow, Russia)に、受託番号 RIA 1867で寄託されている。この株は、また、 1987年 4月 7日、ルシアン 'ナショナル'コレクシヨン'ォブ 'インダストリアル 'マイクロオルガ二ズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545， Russia)に、受託番号 B-3996で寄託されている。

[0030] E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、 L_スレォニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。 B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミド PVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域力温度感受性ラムダファージ C1リプレッサー及び PRプロモーターにより置換されている。 VKPM B-5318は、 1990年 5月 3日、ルシアン'ナショナル 'コレクション'ォブ ·インダストリアル ·マイクロオルガ二ズムズ (V KPM)(1 Dorozhny proezd. , 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号 VKPM B-5318 で国際寄託されている。

[0031] Escherichia coliのァスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼ Iをコードする thrA 遺伝子は明らかにされている (ヌクレオチド番号 337〜2799, GenBank accession NC_0 00913.2, gi: 49175990)。 thrA遺伝子は、 E. coli K-12の染色体において、 thrL遺伝子と thrB遺伝子との間に位置する。 Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードする thrB遺伝子は明らかにされている (ヌクレオチド番号 2801〜3733， GenBank accessi on NC_000913.2, gi: 49175990)。 thrB遺伝子は、 E. coli K-12の染色体において、 thr A遺伝子と thrC遺伝子との間に位置する。 Escherichia coliのスレオニンシンターゼをコードする thrC遺伝子は明らかにされている (ヌクレオチド番号 3734〜5020, GenBank accession NC— 000913.2， gi: 49175990)。 thrC遺伝子は、 E. coli K-12の染色体において、 thrB遺伝子と yaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するァテニユエ一ター領域を、好ましくは、ォペロンから除去する (WO2005/049808, WO2003/097839)。

[0032] スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のァスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼ Iをコードする変異 thrA遺伝子、ならびに、 thrB遺伝子及び thrC遺伝子は、スレオニン生産株 E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミド pVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミド pVIC40の詳細は、米国特許第 5,705,371号に記載されている。

[0033] rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードする glnHPQオペロンに近い Ε· col i染色体の 18分に存在する。 rhtA遺伝子は、 ORF1 (ybiF遺伝子，ヌクレオチド番号 76 4〜1651， GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、 pexB遺伝子と ompX遺伝子との間に位置する。 ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、 rhtA遺伝子と呼ばれている (rht:ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、 rhtA23変異が、 ATG開始コドンに対して- 1位の G→A置換であることが判明してレヽる (ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemist ry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997， abstract N o. 457, EP 1013765 A)。

[0034] E. coliの asd遺伝子は既に明らかにされており (ヌクレオチド番号 3572511〜3571408 ， GenBank accession NC_000913.1， gi: 16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いる PCRにより得ることができる (White, T.J. et al., Tren ds Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物の asd遺伝子も同様に得ることができる。

[0035] また、 E. coliの aspC遺伝子も既に明らかにされており (ヌクレオチド番号 983742〜98 4932, GenBank accession NC_000913.1, gi: 16128895)、 PCRにより得ることができる。他の微生物の aspC遺伝子も同様に得ることができる。

[0036] L一リジン生産菌

ェシエリヒア属に属する L リジン生産菌の例としては、 L リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。 L リジンアナログはェシエリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、 L リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。 L リジンアナログの例としては、ォキサリジン、リジンヒドロキサメート、 S - (2—アミノエチル） L システィン (AEC)、 y—メチルリジン、 α—クロロカプロラタタムなどが挙げられる力 S、これらに限定されなレ、。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、ェシエリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。 L—リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、 Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185;米国特許第 4,346, 1 70号参照)及び Escherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、ァスパノレトキナーゼの L—リジンによるフィードバック阻害が解除されている。

[0037] WC196株は、 Escherichia coliの L—リジン生産菌として使用できる。この菌株は、 Es cherichia coli K-12に由来する W3110株に AEC耐性を付与することにより育種された。同株は、 Escherichia coli AJ13069と命名され、 1994年 12月 6日、工業技術院生命ェ学工業技術研究所 (現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一、 τ 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に受託番号 FER M P-14690として寄託され、 1995年 9月 29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 FERM BP-5252が付与されている (米国特許第 5,827,698号)。

[0038] L リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 L リジン生合成系酵素の 1種又は 2種以上の活性が増強されている株も挙げられる。かかる酵素の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ (dapA)、ァスパルトキナーゼ (lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ (dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ (lysA)、ジァミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ (ddh) (米国特許第 6,040， 160号)、フォスフォエノールビルビン酸カルボキシラーゼ (ppc)、ァスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸ェピメラーゼ (dapF)、テトラヒドロジピコリン酸スクシ二ラーゼ (dap D)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ (dapE)及びァスパルターゼ (aspA) (EP 1 253195 A)が挙げられる力これらに限定されなレ、。これらの酵素の中では、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォェノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ァスパルテートァミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸ェピメラーゼ、ァスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシ二ラーゼ、及び、スクシニルジアミノビメリン酸デアシラーゼが特に好ましい。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子 (cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子 (pntAB) (米国特許第 5,830,716号)、 ybjE遺伝子 (WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大してレ、てもよレ、。

[0039] L リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 L リジンの生合成経路から分岐して L リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。 L_リジンの生合成経路から分岐して L —リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ (米国特許第 5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素 (WO2005/010175)が挙げられる。

[0040] 好ましい L—リジン生産菌として、ェシエリヒア'コリ WC196DcadADldc/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039)。この菌株は、リジンデカルボキシラーゼをコードする cad A及び ldcC遺伝子が破壊された WC196株に、米国特許第 6040160に記載されたプラスミド pCABD2が導入することにより得られた株である。 PCABD2は、 L リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するェシエリヒア'コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS)をコードする変異型 dapA遺伝子と、 L リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するェシエリヒア'コリ由来のァスバルトキナーゼ IIIをコードする変異型 lysC遺伝子と、ェシエリヒア'コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクタ一ゼをコードする dapB遺伝子と、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム由来ジアミノビメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする ddh遺伝子を含んでいる。このプラスミドを持つェシエリヒア'コリ W3110(tyrA)/pCABD2は、 AJ12604と命名され、 1991年 1月 28日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (住所 τ 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に FERM P-11975の受託番号で寄託され、 1991年 9月 26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、 FERM BP-35 79の受託番号で寄託されてレ、る。

[0041] L システィン生産菌

L—システィン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンァセチルトランスフェラーゼをコードする異なる cysEアレルで形質転換された E. coli JM15(米国特許第 6,218,168号、ロシア特許出願第 2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有する E. coli W3110 (米国特許第 5,972,663号)、システィンデスルフォヒドラーゼ活性が低下した E. coli株（JP11155571A2)、 cysB遺伝子によりコードされる正のシスティンレギュロンの転写制御因子の活性が上昇した E. coli W3110 (WO0127307A1)などのェシエリヒア属に属する株が挙げられる力 S、これらに限定されない。

[0042] L_ロイシン生産菌

L ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性の E • coil株 (例えば、 57株 (VKPM B-7386,米国特許第 6，124，121号))または j3 _ 2—チェニルァラニン、 3—ヒドロキシロイシン、 4—ァザロイシン、 5, 5, 5-トリフルォロロイシンなどのロイシンアナログ耐性の E.coli株 (特公昭 62-34397号及び特開平 8-70879号)、 WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られた E. coli株、 E. coli H-9068 ( 特開平 8-70879号)などのェシエリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

[0043] 本発明に用いる細菌は、 L一口イシン生合成に関与する遺伝子の 1種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくは L—ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異 leuA遺伝子 (米国特許第 6,403,342号)に代表される、 leuABCDォペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞から L_ アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の 1種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよレ、。このような遺伝子の例としては、 b2682遺伝子及び b268 3遺伝子 (ygaZH遺伝子） (EP 1239041 A2)が挙げられる。

[0044] L_ヒスチジン生産菌

L—ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 E. coli 24株（ VKPM B-5945, RU2003677), E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、 E. coli NR RL B- 12116 - B12121 (米国特許第 4,388,405号)、 E. coli H- 9342 (FERM BP- 6675) 及び H-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第 6,344,347号)、 E. coli H-9341 (FERM B P-6674) (EP1085087)、 E. coli AI80/pFM201 (米国特許第 6, 258,554号)などのェシェリヒア属に属する株が挙げられる力 S、これらに限定されない。

[0045] L ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 L ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の 1種以上の発現が増大した株も挙げられる。か力る遺伝子の例としては、 ATPフォスフオリボシルトランスフェラーゼ遺伝子 (hisG)、フォスフオリボシル AMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子 (hisl)、フォスフオリボシル -ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子 (hisl)、フォスフオリボシルフオルミミノ- 5-ァミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子 (hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子 (his H)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子 (hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子 (hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子 (hisD)などが挙げられる。

[0046] hisG及び hisBHAFIにコードされる L -ヒスチジン生合成系酵素は L -ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、 L—ヒスチジン生産能は、 ATPフォスフオリボシルトランスフェラーゼ遺伝子 (hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる (ロシア特許第 2003677号及び第 2119536号)。

[0047] L ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、 L ヒスチジン生合成系酵素をコードする DNAを保持するベクターを導入した E. coli FERM-P 5038及び 5048 (特開昭 56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入した E.coli株 (EP1016710A)、スルファグァニジン、 DL-1, 2,4 -トリアゾール -3 -ァラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与した E. coli 80株 (VKPM B-7270,ロシア特許第 2119536号)などが挙げられる。

[0048] L一グルタミン酸生産菌

L—グノレタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 E. coli VL33 4thrC⁺ (EP 1172433)などのェシエリヒア属に属する株が挙げられる力これらに限定されなレ、。 E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、 thrC遺伝子及び ilvA遺伝子に変異を有する L—イソロイシン及び L—スレォニン要求性株である (米国特許第 4，278，765号）。 thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型 E. coli K12株（VKPM B_7)の細胞で増殖したバタテリオファージ P1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、 L イソロイシン要求性の L グルタミン酸生産菌 VL334thrC⁺ (VKPM B-8961)が得られた。

[0049] Lーグノレタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 L ダルタミン酸生合成系酵素 1種又は 2種以上の活性が増強された株が挙げられる力これらに限定されない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA)、グルタミンシンテターゼ (glnA)、グルタメートシンテターゼ (gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ (icdA)、アコ二テートヒドラターゼ (acnA, acnB)、クェン酸シンターゼ (gltA)、メチルクェン酸シンター (p卬 C)、フォスフォェノールピルべートカルボシラーゼ (ppc )、ピルべ一トデヒドロゲナーゼ (aceEF, lpdA)、ピルべートキナーゼ (pykA， pykF)、フォスフォェノールピルべートシンターゼ (pp_SA)、エノラーゼ (eno)、フォスフォグリセロムターゼ (pgmA, pgml)、フォスフォグリセレートキナーゼ (pgk)、グリセルアルデヒド- 3-フォスフエートデヒドロゲナーゼ (gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ (tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ (ftp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pikB)、グルコースフォスフェートイソメラーゼ (pgi)などが挙げられる。これらの酵素の中では、グルタメートデヒドロゲナーゼ、クェン酸シンターゼ、フォスフォェノールピルべートカルボキシラーゼ、及びメチルクェン酸シンターゼが好ましレ、。

[0050] シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォェノールピルべ一トカルボキシラーゼ遺伝子、及び/またはグノレタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、 EP1078989A、 EP955368A及び EP952221Aに開示されたものが挙げられる。

[0051] L—グノレタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 L—ダルタミン酸の生合成経路から分岐して L一グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、ィソシトレートリアーゼ (aceA)、ひ-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ (sucA)、フォスフォトランスァセチラーゼ (pta)、アセテートキナーゼ (ack)、ァセトヒドロキシ酸シンターゼ (ilv G)、ァセトラクテートシンターゼ (ΠνΙ)、フオルメートァセチルトランスフェラーゼ (pfl)、ラタテートデヒドロゲナーゼ (ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ (gadAB)などが挙げられる。 α -ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、 α -ケトグルタレ一トデヒドロゲナーゼ活性が低下したェシエリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第 5,378,616号及び第 5,573,945号に記載されてレ、る。

[0052] 具体例としては下記のものが挙げられる。

E. coli W3110sucA::Kmr

E. coli AJ12624 (FERM BP- 3853)

E. coli AJ12628 (FERM BP- 3854)

E. coli AJ 12949 (FERM BP- 4881)

[0053] E. coli W3110sucA::Kmrは、 E. coli W3110のひ -ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、 α -ケトグノレタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損してレ、る。

[0054] L—グノレタミン酸生産菌の他の例としては、ェシエリヒア属に属し、ァスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、ひ-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよぐ例えば、 E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第 5，908，768号)、さらに L—グノレタミン酸分解能が低下した FFRM P_12379(米国特許第 5,393,671号)； AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第 6, 110,714号)などが挙げられる。

[0055] パントァェ 'アナナティスの L—グルタミン酸生産菌の例としては、パントエア'ァナナテイス AJ13355株が挙げられる。同株は、静岡県磐田巿の土壌から、低 pHで L—グノレタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。パントェァ-アナナティス AJ13355は、 1998年 2月 19日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所 T 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に、受託番号 FERM P-16644として寄託され、 1999年 1月 11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はェンテロバクタ一'アグロメランス（Enterobacter ag glomerans)と同定され、ェンテロバクタ一'アグロメランス AJ13355として寄託されたが、近年 16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア'アナナティス（Pantoea anana tis)に再分類されている。

[0056] また、パントァェ 'アナナティスの Lーグノレタミン酸生産菌として、 α -ケトグノレタレートデヒドロゲナーゼ（a KGDH)活性が欠損した、または、 a KGDH活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、 AJ13355株の ct KGDH-E 1サブユニット遺伝子（_SUCA)を欠損させた AJ13356(米国特許第 6,331,419号)、及び A J13355株から粘液質低生産変異株として選択された SC17株由来の sucA遺伝子欠損株である SC17sucA (米国特許第 6,596,517号)がある。 AJ13356は、 1998年 2月 19日、工業技術院生命工学工業技術研究所 (現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、 τ 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に受託番号 FERM P-16645として寄託され、 1999年 1月 11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 FERM BP-6616が付与されている。 AJ13355 及び AJ13356は、上記寄託機関に Enterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、 Pantoea ananatisとして記載する。また、 SC17sucA株は、ブライべ一トナンバー AJ417株が付与され、 2004年 2月 26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP-08646として寄託されてレ、る。

[0057] さらに、パントァェ.アナナティスの L—グルタミン酸生産菌として、 SC17sucA/RSFC PG+pSTVCB株、 AJ13601株、 NP106株、及び NA1株が挙げられる。 SC17sucA/RSFC PG+pSTVCB株は、 SC17sucA株に、ェシエリヒア'コリ由来のクェン酸シンターゼ遺伝子（gltA)、ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA)、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA)を含むプラスミド RSFCPG、並びに、ブレビバタテリゥム ·ラタトフアーメンタム由来のクェン酸シンターゼ遺伝子（gltA)を含むプラスミド pSTVCBを導入して得た株である。 AJ13601株は、この SC17sucA/RSFCPG+pSTVC B株から低 pH下で高濃度の L—グノレタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、 NP106株は、実施例に記載したように、 AJ13601株からプラスミド RSFCPG+p STVCBを脱落させた株である。 AJ13601株は、 1999年 8月 18日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（T 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1 丁目 1番地 1 中央第 6)に受託番号 FERM P-17516として寄託され、 2000年 7月 6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 FERM BP-7207が付与されている。

L—フエ二ルァラニン生産菌

L—フエ二ルァラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸ムターゼープレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損した E.co li AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B_8197)(WO03/044191)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼープレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型 phe A34遺伝子を保持する E.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5, 354,672号)、 E. coli MWEC101-b (KR8903681), E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B_l 2146及び NRRL B-12147 (米国特許第 4,407,952号)などのェシエリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されなレ、。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ一プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持する E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP_3566)、 E. coli K- 12 [W3110 (tyr A)/pPHAD] (FERM BP_12659)、 E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM B P-12662)及び AJ 12604と命名された E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pAC MAB] (FERM BP-3579)も使用できる (EP 488424 Bl)。さらに、 yedA遺伝子または ydd G遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したェシエリヒア属に属する L—フエ二ルァラニン生産菌も使用できる (米国特許出願公開 2003/0148473 A1及び 2003/01 57667 Al、 WO03/044192)。

[0059] L トリプトファン生産菌

L—トリブトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異 t卬 S遺伝子によりコードされるトリプトファニル -tRNAシンテターゼが欠損した E. coli JP4735/ PMU3028 (DSM10122)及び JP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第 5, 756, 345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードする serAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードする tn^Eアレルを有する E. coli SV164 (pGH5) (米国特許第 6，180，373号)、トリプトフアナーゼが欠損した E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263 )及び AGX6(pGX50)aroP (NRRL B- 12264) (米国特許第 4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大した E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO970833 3,米国特許第 6,319,696号)などのェシエリヒア属に属する株が挙げられる力 S、これらに限定されなレ、。 yedA遺伝子または yddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したェシエリヒア属に属する L トリブトファン生産菌も使用できる (米国特許出願公開 2003/0148473 A1及び 2003/0157667 Al)。

[0060] L—トリブトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ (t卬 E)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ (serA)、 3—デォキシー D ァラビノへプッロン酸 Ί リン酸シンターゼ (aroG)、 3 デヒドロキネートシンターゼ (aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ (aroE)、シキミ酸キナーゼ (aroL)、 5—ェノール酸ピルビルシキミ酸 3—リン酸シンターゼ (aroA)、コリスミ酸シンターゼ (aroC)、プレフエン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ及び、トリプトファンシンターゼ (t卬 AB)から選ばれる 1種又は 2種以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。プレフヱン酸デヒドラターゼ及びコリスミ酸ムターゼは、 2機能酵素（CM-PD)として pheA遺伝子によつてコードされている。これらの酵素の中では、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、 3—デォキシ一D—ァラピノへプッロン酸一 7 _リン酸シンターゼ、 3 _デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ、 5—ェノール酸ピルビルシキミ酸 3 _リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフヱン酸デヒドラターゼ、コリスミン酸ムターゼープレフェン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共に L トリプトファン及び L —セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持する E. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異 serA遺伝子を含むプラスミド pGH5 (WO 94/08031)を Ε· coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。

[0061] L_トリブトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株 (特開昭 57-71397号，特開昭 62-244382号，米国特許第 4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン (t卬 BA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることにより L トリブトファン生産能を付与してもよい。トリプトフアンシンターゼは、それぞれ t卬 A及び t卬 B遺伝子によりコードされる α及び βサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることにより L—トリプトファン生産能を改良してもよい (WO2005/103275)

[0062] L プロリン生産菌

L プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 ilvA遺伝子が欠損し、 L プロリンを生産できる Ε· coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのェシエリヒア属に属する株が挙げられる力これらに限定されない。

[0063] 本発明に用いる細菌は、 L_プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。 L—プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、 L—プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグノレタメートキナーゼをコ一ドする proB遺伝子 (ドイツ特許第 3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞から L一アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよレ、。このような遺伝子としては、 b2682 遺伝子及び b2683遺伝子 (ygaZH遺伝子） (EP1239041 A2)が挙げられる。 [0064] L—プロリン生産能を有するェシエリヒア属に属する細菌の例としては、 NRRL B-12 403及び NRRL B-12404 (英国特許第 2075056号)、 VKPM B-8012 (ロシア特許出願 2 000124295)、ドイツ特許第 3127361号に記載のプラスミド変異体、 Bloom F.R. et al (T he 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などの E. coli 株が挙げられる。

[0065] L_アルギニン生産菌

L—アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開 2002/058315 Al)、及び、変異 N -ァセチルダノレタメートシンターゼを保持するその誘導株 (ロシア特許出願第 2001112869号)、 E. coli 382株（VKPM B-7926) (EP1170358A1), N -ァセチルダルタメートシンテターゼをコ一ドする argA遺伝子が導入されたアルギニン生産株 (EP1170361A1)などのェシヱリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

[0066] L—アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 L—アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の 1種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、 N-ァセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子 (argC)、オル二チンァセチルトランスフェラーゼ遺伝子 (argj)、 N_ァセチルダルタメートキナーゼ遺伝子 (argB)、ァセチルオル二チントランスアミナーゼ遺伝子 (argD)、オル二チン力ルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子 (argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子 (argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子 (argH)、力ルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子 (carAB)が挙げられる。

[0067] Lーバリン生産菌

L—バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 ilvGMEDAオペ口ンを過剰発現するように改変された株 (米国特許第 5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されなレ、。ァテニユエーシヨンに必要な ilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産される L—パリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンの ilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。

L—バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシル t_RNA シンテターゼの変異を有する変異株 (米国特許第 5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシン tRNAシンテターゼをコードする ileS遺伝子に変異を有する E. coli VL19 70が使用できる。 E. coli VL1970は、 1988年 6月 24日、ルシアン 'ナショナル'コレクシヨン'ォブ 'インダストリアル 'マイクロオルガ二ズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号 VKPM B-4411で寄託されている。

さらに、生育にリポ酸を要求する、及び/または、 H⁺-ATPaseを欠失している変異株 (WO96/06926)を親株として用いることができる。

[0068] ： L—イソロイシン生産菌

L—イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、 6 _ジメチノレアミノブリンに耐性を有する変異株 (特開平 5-304969号)、チアイソロイシン、イソ口イシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらに DL -ェチォニン及び Zまたはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株 (特開平 5-130 882号).が挙げられる力 S、これらに限定されなレ、。さらに、スレオニンデァミナーゼ、ァセトヒドロキシ酸シンターゼなどの L—イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる (特開平 2-458 号， FR 0356739,及び米国特許第 5,998,178号)。

[0069] 遺伝子組換えにより、上記の L アミノ酸生産菌を育種する場合、使用する遺伝子は、上述した遺伝子情報を持つ遺伝子や、公知の配列を有する遺伝子に限られず、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、その遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、 1若しくは数個の位置での 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、揷入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。

[0070] ここで、「1若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個を意味する。また、保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、 Phe、 Trp、 Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、 Leu、 Ile、 Val間で、極性アミノ酸である場合には、 Gln、 Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、 Lys、 Arg、 His間で、酸性アミノ酸である場合には、 Asp 、 Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、 Ser、 Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、 Alaから Ser又は Thrへの置換、 Argから Gln、 His又は Lysへの置換、 Asnから Glu、 Gln、 Lys、 His又は Aspへの置換、 Asp力、ら Asn、 G lu又は Ginへの置換、 Cysから Ser又は Alaへの置換、 Ginから Asn、 Glu、 Lys、 His, Asp 又は Argへの置換、 Gluから Gly、 Asn、 Gln、 Lys又は Aspへの置換、 Glyから Proへの置換、 Hisから Asn、 Lys, Gln、 Arg又は Tyrへの置換、 lie力、ら Leu、 Met, Val又は Pheへの置換、 Leuから Ile、 Met, Val又は Pheへの置換、 Lysから Asn、 Glu、 Gln、 His又は Argへの置換、 Metから Ile、 Leu、 Val又は Pheへの置換、 Pheから TYp、 Tyr、 Met, lie又は Leu への置換、 Serから Thr又は Alaへの置換、 Thrから Ser又は Alaへの置換、 TYpから Phe 又は Tyrへの置換、 Tyrから His、 Phe又は TYpへの置換、及び、 Val力、ら Met、 lie又は Le uへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付カロ、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又は variant)によって生じるものも含まれる。このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように公知の遺伝子の塩基配歹 IJを改変することによって取得することができる。

[0071] さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、コードされるアミノ酸配列全体に対して、 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上、特に好ましくは 97% 以上の相同性を有し、かつ、野生型タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。

また、遺伝子の配列におけるそれぞれのコドンは、遺伝子が導入される宿主で使用しゃすレ、コドンに置換したものでもよレ、。

[0072] 保存的変異を有する遺伝子は、変異剤処理等、通常変異処理に用いられる方法によって取得されたものであってもよい。

[0073] また、遺伝子は、公知の遺伝子配列の相補配列又はその相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、公知の遺伝子産物と同等の機能を有するタンパク質をコードする DNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高い DNA同士、例えば 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上、特に好ましくは 97%以上の相同性を有する DNA同士がハイブリダィズし、それより相同性が低い DNA同士がハイブリダィズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダィゼーシヨンの洗いの条件である 60。C、 I X SSC、 0.1% SDS、好ましくは、 0.1 X SSC、 0.1% SDS、さらに好ましくは、 68。C、 0.1 X SSC 、 0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、 1回、より好ましくは 2〜3回洗浄する条件が挙げられる。

[0074] プローブとしては、遺伝子の相補配列の一部を用いることもできる。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含む DNA断片を铸型とする PCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、 300 bp程度の長さの DNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーシヨンの洗いの条件は、 50°C、 2 X SSC、 0.1% SDSが挙げられる。

[0075] < 3 >L アミノ酸の製造法

本発明の L アミノ酸の製造法においては、グリセロールを炭素源として含む培地で腸内細菌科に属し、 L アミノ酸生産能を有する細菌を培養して、培養物中に L アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物から L アミノ酸を採取する。

[0076] 使用するグリセロールは、 L アミノ酸を製造するのに適した濃度であればどのような濃度で用いてもかまわない。培地中の単独の炭素源として用いる場合、好ましくは 0. lw/v%〜50w/v%程度、より好ましくは 0· 5w/v%〜40w/v%程度、特に好ましくは lwZv%〜30w/v%程度培地に含有させる。グリセロールは、ダルコ一ス、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの他の炭素源と組み合わせて用いることも出来る。この場合、グリセロールと他の炭素源は任意の比率で混合することが可能である力 S、炭素源中のグリセロールの比率は、 10重量％以上、より好ましくは 50重量％以上、より好ましくは 70重量％であることが望ましい。他の炭素原として好ましいのは、グルコース、フラクトース、スクロース、ラタトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物やバイオマスの加水分解により得られた糖液などの糖類、ェタノールなどのアルコール類、フマール酸、クェン酸、コハク酸等の有機酸類である。これらの中ではグノレコースが好ましい。また、特に好ましいのは、粗グリセロールとグノレコースを 50： 50〜90： 10の重量比で含む混合物である。

培養開始時のグリセロールの好ましレ、初発濃度は上記のとおりであるが、培養中のグリセロールの消費に応じて、グリセロールを添加してもよい。

[0077] 本発明において好ましい培地は、粗グリセロールを添カ卩した培地である。粗グリセ口ールを用いる場合は、グリセロールの純度に応じて、グリセロールの量として上記濃度となるように粗グリセロールを培地に添加すればよい。

また、グリセロール及び粗グリセロールの両方を培地に添加してもよい。

[0078] 使用する培地は、微生物を用いた L_アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源に加えて、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、窒素源としては、硫酸アンモニゥム、塩化アンモニゥム、リン酸アンモニゥム等の無機アンモニゥム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミン B、 L—ホモセリンなど

1

の要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれであよい。

[0079] 培養は好気的条件下で：!〜 7日間実施するのがよぐ培養温度は 24°C〜45°C、培養中の pHは 5〜9がよレ、。尚、 pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアル力リ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。培養液からの L—アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内に L—アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、 L—アミノ酸を回収することができる。

実施例 [0080] 以下、実施例にて、本発明を更に具体的に説明する。実施例には、試薬グリセロールとして試薬特級グレード (ナカライテスタ社製)、粗グリセロールとしてはバイオディーゼル燃料製造過程で生じた粗グリセロール（GLYREX、 Nowit DCA_F、及び R Glycer in)を用いた。この粗グリセロールのグリセロール純度は、粗グリセロール GLYREXでは 86重量％、粗グリセロール Nowit DCA-Fでは 79重量％、粗グリセロール R Glyceri nでは 78重量％であった。

GLYREXはイタリア F〇X PETROLI社（FOX PETROLI S.P.A. Sede legale e uffici, vi a Senigallia 29, 61100 Pesaro)により製造され、イタリア SVG社（SVG ITALIA SrL Via A. Majani, 2, 40122 Bologna (BO))より動物飼料添加物として販売されている粗ダリセローノレを入手した。 Nowit DCA—Fはドイツ Nordische Oelwerke Walther Carrouxy 社（Nordische Oelwerke Walther Carroux GmbH & Co KG, Postfach 930247 Industri estrasse 61-65， 21107 Hamburg)より販売されている。 R Glycerinはドイツ Inter-Harz 社（Inter- Harz GmbH Postfach 1411 Rostock- Koppel 17, 25314 Elmshom, 25365 Kl . Oifenseth-Sparrieshoop)より販売されてレ、る粗グリセロールである。

[0081] 〔実施例 1〕最小培地における野生株の生育

ェシエリヒア 'コリ MG1655株を LB寒天培地（トリプトン 10gん、酵母エキス 5g/L、 NaC 1 10g/L、寒天 15g/L)にて 37°Cで 16時間培養し、エーゼで細胞を搔き取り、 0.9% NaC 1に懸濁した。これを、炭素源として 0.4% (w/v)のグルコース、試薬グリセロール又は粗グリセロールを含む 5mlの M9培地（Na HPO · 7Η Ο 12.8 g/L、 K HPO 0.6 gん、 NaCl

2 4 2 2 4

0.5 g/L、 NH CI lgん、 2mM MgSO 、 O. lmM CaCl )に植菌して、 37°Cで 24時間、試

4 4 2

験管にて培養を行った。

[0082] この培養液を希釈して、 LB寒天培地に撒き、 37°Cで 16時間培養した。生育度を正確に測定するため、生育したコロニー数を生菌数として数えた。試験管二本ずつ行つた培養の結果の平均値を表 1に示す。

[0083] [表 1]

—表 1

炭素源生菌数（mlあたり）

グルコース 1. 0 X 10⁵

試薬グリセロール 1. 2 10⁵

粗グリセロール GLYREX 6. 6 10⁶ [0084] 試薬グリセロールではグノレコースと同等以上の生育を示し、粗グリセロールでは、グルコースの 50倍以上という予想外のよい生育を示した。

〔実施例 2〕 Lースレオニン生産培養

[0085] L—スレオニン生産菌であるェシエリヒア.コリ VKPM B-5318を、ストレプトマイシン硫酸塩 20mg/Lを含有する LB寒天培地（トリプトン 10g/L、酵母エキス 5g/レ NaCl 10g /L、寒天 15g/L)にて 37°Cで 24時間培養した。寒天培地上の細胞を搔き取り、ストレプトマイシン硫酸塩 20mg/Lを含有する L—スレオニン生産培地 20mLを入れた 500ml 容坂ロフラスコに植菌し、培養温度 40°Cにて、 24時間培養を行った。本培養は、炭素源として、グルコース、試薬グリセロール、粗グリセロールをそれぞれ単独で用いた培地と、グルコースと試薬グリセロールを 1 : 1、又はグルコースと粗グリセロールを 1： 1 で用いた培地で実施した。総炭素源量はレ、ずれも 40g/Lとした。

[0086] (Lースレオニン生産培地組成）

(A区）

炭素源 40g/L

MgSO · 7Η 0 lg/L

4 2

(Β区）

酵母エキス 2g/L

FeSO · 7Η 0 lOmg/L

4 2

MnSO ·4Η 0 lOmg/L

4 2

ΚΗ ΡΟ lg/L

2 4

(ΝΗ ) SO 16g/L

4 2 4

(C区）

炭酸カルシウム 30g/L

A区、 B区は 115°C 10分オートクレーブ殺菌、 C区は 180°C 3時間乾熱滅菌室温に冷却後 3者を混合して使用。

培養終了後、添加した糖とグリセロールの消費を BF-5 (王子計測機器）にて確認し、生育度を 600nmにおける濁度（OD)にて測定した。 L—スレォニン量は液体クロマトグラフィ一により測定を行った。フラスコ二本ずつ行った培養の結果の平均値を表 2 に示す。

本培養条件ではグルコースを炭素源としたときの Lースレオニン量は低くとどまったのに対し、試薬グリセロールを混合又は単独で添加すると著しい Lースレオニン量の向上が認められた。さらに、粗グリセリンを単独で用いた場合、試薬グリセリンを単独で用いた場合よりも大きな L—スレオニン量の増加が認められた。

[表 2] 表 2

素^ 0D Thr (g/l) グルコース 40g/l 9.6 3.8 グルコース 20g/l + 試薬グリセロール 20g/l 11.6 12.3 試薬グリセロール 40g/l 10.1 9.9 グルコース 20g/l + 粗グリセロール GLYREX 20g/l 11.2 12.5 粗グリセロール GLYREX 40g/l 10.4 12.0

[0089] 〔実施例 3〕L リジン生産培養

L リジン生産菌として国際公開第 2006/078039号パンフレット記載のェシエリヒア' コリ WC196DcadADldc/pCABD2 (本菌株を「WC196LC/pCABD2」と呼ぶ)を用いた。ェシエリヒア'コリ WC196LC/pCABD2を、ストレプトマイシン硫酸塩 20mg/Lを含有する LB寒天培地（トリプトン 10g/L、酵母エキス 5g/L、 NaCl 10g/レ寒天 15g/L)にて 37°C で 24時間培養した。寒天培地上の細胞を搔き取り、ストレプトマイシン硫酸塩 20mg/L を含有する L—リジン生産培地 20mLを入れた 500ml容坂ロフラスコに植菌し、培養温度 37°Cにて、 48時間培養を行った。本培養は、炭素源として、グルコース、試薬ダリセロール、粗グリセロールをそれぞれ単独で用いた培地と、グルコースと試薬グリセ口ールを 1： 1、又はグルコースと粗グリセロールを 1： 1で用いた培地で実施した。総炭素源量はレ、ずれも 40g/Lとした。

[0090] (L リジン生産培地組成）

(A区）

炭素源 40g/L

(B区）

酵母エキス 2g/L

FeSO ·7Η O 10mg/L MnSO ·4Η O lOmg/L

KH PO lg/L

(NH ) SO 24g/L

(C区）

炭酸カルシウム 30g/L

[0091] 培養終了後、添加した糖とグリセロールの消費を BF-5 (王子計測機器）にて確認し、生育度を 600匪における濁度（OD)にて測定した。 L—リジン量はバイオテックアナライザ一 AS210 (サクラ精機）により測定した。フラスコ二本ずつ行った培養の結果の平均値を表 3に示す。

グノレコースを炭素源としたときの L—リジン量に対し、試薬グリセロールを混合又は単独で添加すると著しい L リジン量は低下した。しかし、粗グリセリンを混合又は単独で用いた場合、試薬グリセリンを用いた場合よりも L リジン量の増加が認められ、グノレコースを炭素源としたときの L リジン量に匹敵する量を得ることが出来た。

[0092] [表 3] 炭素源 OD Lys (g/ l ) グルコース 40g/ l 8. 6 14. 9 グルコース 20g/ l + 試薬グリセロール 20g/ l 10. 4 13. 3 試薬グリセロール 40g/ l 10. 0 13. 4 グルコース 20g/ l + 粗グリセロール GLYREX 20g/ l 10. 7 14. 3 粗グリセロール GLYREX 40g/ l 9. 9 14. 5

〔実施例 4〕各種粗グリセロールによる L リジン生産培養

L リジン生産菌であるェシエリヒア'コリ WC196LC/pCABD2を、ストレプトマイシン硫酸塩 20mg/Lを含有する LB寒天培地（トリプトン 10g/L、酵母エキス 5g/L、 NaCl 10g /L、寒天 15g/L)にて 37°Cで 24時間培養した。寒天培地上の細胞を搔き取り、ストレプトマイシン硫酸塩 20mg/Lを含有する L リジン生産培地 20mLを入れた 500ml容坂口フラスコに植菌し、培養温度 37°Cにて、 48時間培養を行った。本培養は、炭素源として、グルコース、試薬グリセロール、粗グリセロールとして GLYREX、 Nowit DCA_F、あるいは R Glycerinを用いた。総炭素源量はいずれも 40g/Lとした。

[0094] 培養終了後、添加したグルコースとグリセロールの消費を BF-5 (王子計測機器）にて確認し、生育度を 600nmにおける濁度（OD)にて測定した。 L—リジン量はバイオテックアナライザー AS210 (サクラ精機）により測定した。フラスコ二本ずつ行った培養の結果の平均値を表 4に示す。

試薬グリセロールを炭素源としたときの L—リジン量に対し、 GLYREX、 Nowit DCA-

F、あるいは R Glycerin,いずれの粗グリセロールを用いた場合も L—リジン量は増加した。

[0095] [表 4]

表 4

炭素源 OD Lys (g/ l ) 試薬グリセロール 40g/ l 9. 7 14. 9 粗グリセロール GLYREX 40g/ l 9. 8 16. 6 粗グリセロール Now i t DCA-F 40g/ l 10. 0 15. 9 粗グリセロール R G l ycer i n 40g/ l 9. 9 16. 4

[0096] 〔実施例 5〕パントエア'アナナティスの L グルタミン酸生産菌の構築

ェシエリヒア 'コリ由来のクェン酸シンターゼ遺伝子（gltA)、ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc)、及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA) を搭載するプラスミド RSFCPG (欧州出願公開 1233068号明細書参照）の gltA遺伝子を、ェシエリヒア'コリのメチルクェン酸シンターゼ遺伝子（p卬 C) (国際公開 2006/0516 60号パンフレット)で置きかえたプラスミド RSFPPGを構築した。

[0097] RSFCPGの gltA遺伝子の ORF以外の部分を増幅するプライマー 1 (配列番号 1)とプライマー 2 (配列番号 2)を設計した。このプライマーを用いて、 RSFCPGを錡型に PCR を行い、約 14.9kbの断片を取得した。一方、ェシエリヒア'コリ由来のメチルタエン酸シンターゼ遺伝子 (p卬 C)をプライマー 3 (配列番号 3)とプライマー 4 (配列番号 4)を用レ、、ェシエリヒア'コリ W3110株の染色体 DNAを錡型として PCRを行レ、、約 1.2kbの断片を取得した。両 PCR産物をそれぞれ BglII、 Kpnlで処理し、ライゲーシヨン後、ェシヱリヒア 'コリ JM109株を形質転換した。出現したコロニーを全て集菌し、混合物としてプラスミドを抽出した。このプラスミド混合物でクェン酸シンターゼ (CS)欠損株であるェシエリヒア 'コリ ΜΕ8330株を形質転換し、 50mg/Lゥラシル、 5mg/Lチアミン- HC1を含有する M9最少培地（Na HPO · 7Η Ο 12.8 g/L、 Κ HPO 0.6 gん、 NaCl 0.5 g/L、 NH C

2 4 2 2 4 4

1 lg/L、 2mM MgSO、 O.lmM CaCl )に塗布した。出現した株よりプラスミドを抽出し、

4 2

これを RSFPPGとした。 L グルタミン酸生産菌であるパントエア.アナナティス NP106 株に前記プラスミド RSFPPGを導入し、 L—グルタミン酸生産菌 NP106/RSFPPG (本菌株を「NA1株」と呼ぶ）を構築した。

[0098] NP106株は、以下のようにして得られた。先に例示したパントエア'アナナティス AJ1 3601株を、 LBGM9液体培地で 34°Cにて終夜振とう培養を行い、 1プレートにっき 100 〜200コロニーとなるよう希釈し、テトラサイクリン 12.5mg/Lを含む LBGM9プレートに塗布した。出現したコロニーについて、テトラサイクリン 12.5mg/レ及びクロラムフエニコール 25mg/Lを含む LBGM9プレートにレプリカし、クロラムフエ二コール感受性となつた株を選択し、 pSTVCBが脱落した菌株を取得し、 G106Sと命名した。さらに、 G106S 株を、 LBGM9液体培地で 34°Cにて終夜振とう培養を行い、 1プレートにっき 100〜20 0コロニーとなるよう希釈し、薬剤を含まない LBGM9プレートに塗布した。出現したコロニーについて、テトラサイクリン 12.5mg/Lを含む LBGM9プレート及び薬剤を含まない LBGM9プレートにレプリカし、テトラサイクリン感受性となった株を選択し、 RSFCPGが脱落した菌株を取得し、 NP106と命名した。こうして得られた NP106株は AJ13601株が保持する 2つのプラスミド RSFCPGと pSTVCBの両方を持たない株である。

[0099] 〔実施例 6〕 L グルタミン酸生産培養

L グノレタミン酸生産菌であるパントエア'アナナティス NA1株を、テトラサイクリン塩酸塩 12.5mg/Lを含有する LBGM9寒天培地（トリプトン 10gん、酵母エキス 5g/L、 NaCl 10gん、 Na HPO · 7Η O 12.8 g/し、 K HPO 0.6 g/し、 NaCl 0.5 g/L、 NH CI lg/L、グ

2 4 2 2 4 4 ルコース 5g/l、寒天 15g/L)にて 34°Cで 24時間培養した。寒天培地上の細胞を搔き取り、テトラサイクリン塩酸塩 12.5mg/Lを含有する L—グルタミン酸生産培地 5mLを注入した試験管に植菌し、培養温度 34°Cにて、 24時間培養を行った。本培養では、炭素源として、スクロース、グルコース、試薬グリセロール、粗グリセロール GLYREXをそれぞれ用いた。総炭素源量はいずれも 30g/Lとした。

[0100] (L一グルタミン酸生産培地組成）

(A区）炭素源 30g/L

MgSO ·7Η O 0.5g/L

4 2

(B区）

(NH ) SO 20g/L

4 2 4

KH PO 2g/L

2 4

FeSO -7H O 20mg/L

4 2

MnSO -5H O 20mg/L

4 2

酵母エキス 2g/L

パントテン酸カルシウム 18mg/L

(C区）

炭酸カルシウム 20g/L

[0101] 培養終了後、生育度を 600nmにおける濁度（OD)にて測定し、添カ卩したグルコースとグリセロールの消費を BF_5(王子計測機器）にて確認した。スクロースと L—ダルタミン酸量はバイオテックアナライザー AS210(サクラ精機）により測定した。試験管二本ずつ行った培養の結果の平均値を表 5に示す。

グノレコースを炭素源としたときの L—グルタミン酸量に対し、試薬グリセロールを用い場合、 L—グルタミン酸量を増加させることが出来た。さらに、粗グリセロール GLYR EXを用いた場合には、グルコースや試薬グリセロールを用いた場合よりも、著しく高レ、 L—グルタミン酸量が認められ、スクロースを用いた場合よりも高い L—グルタミン酸量を得ることが出来た。

[0102] [表 5] 表 5

炭素源 0D Glu (g/l) スクロース 40g/l 12.4 16.8 グルコース 40g/l 13.6 14.1 試薬グリセロール 40g/l 14.0 14.9 粗グリセロール GLYREX 40g/l 13.6 17.7 [0103] 〔実施例 7〕粗グリセロールの成分分析

GLYREX、 Nowit DCA_F、及び R Glycerinの各粗グリセロールの成分分析を実施した。測定方法は、グリセロール、メタノールはガスクロマトグラフ法により測定した。全窒素はケルダール法、エーテル可溶分はソックスレー抽出法により測定した。ギ酸、酢酸は高速液体クロマトグラフ法、塩化物イオン、硫酸イオンはイオンクロマトグラフ法により測定した。ナトリウム、カリウム、銅は原子吸光光度法、リン、鉄、カルシウム、マグネシウム、マンガン、亜鉛は ICP (Inductively Coupled Plasma)発光分析法にて測定を実施した。 100g当たりの含有量 (g)の測定結果を表 6に示した。

[0104] [表 6] 表 6

測定項目 GLYREX No i t DCA-F R G l cer i n グリセロール 85. 9 78. 5 78. 2 全窒 at く 0. 01 く 0. 01 く 0. 01 エーテル可溶分 0. 1 0. 3 <0. 1

Na 0. 16 2. 09 2. 1 1

K 2. 45 0. 0062 0. 144 ci- 2. 33 2. 62 3. 38

S0₄ ²" <0. 05 0. 06 <0. 05 メタノール 0. 0054 0. 1 1 0. 0015 ギ酸 0. 02 0. 01 く 0. 01 酢酸 0. 03 0. 02 0. 03

P 0. 0085 0. 0787 0. 0219

Mg 0. 001 0. 0003 0. 0003

Fe 0. 0036 0. 00043 0. 00054

Ca 0. 0032 0. 001 1 く 0. 001

Mn 0. 00003 0. 00001 0. 00001

Cu 0. 00002 0. 00008 <0. 00001

Zn 0. 00077 <0. 00001 く 0. 00001

Na + K + Gに + SO/" * 4. 94 4. 7762 5. 63

Mg + Fe + Ca * 0. 0078 0. 00183 0. 00084

Mn + Cu + Zn * 0. 00082 0. 00009 0. 00001

* ：測定限界以下のものを 0として計算

[0105] 〔配列表の説明〕

配列番号 1： gltA遺伝子の ORF以外の部分を増幅するためのプライマー

配列番号 2： gltA遺伝子の ORF以外の部分を増幅するためのプライマー

配列番号 3： prpC遺伝子増幅用プライマー配列番号 4： prpC遺伝子増幅用プライマー

産業上の利用可能性

本発明によれば、新たな安価な炭素源を用いることにより、安価に L_アミノ酸を製造すること力 Sできる。

Claims

請求の範囲

[I] 腸内細菌科に属し、 L_アミノ酸生産能を有する細菌をグリセロールを炭素源として含む培地に培養し、培養物中に L一アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物から L一アミノ酸を採取することを特徴とする L一アミノ酸の製造法。

[2] 培地中のグリセロールの初発濃度が l〜30w/v%である請求項 1記載の方法。

[3] 前記培地が粗グリセロールを添加した培地である請求項 1又は 2に記載の方法。

[4] 前記粗グリセロールがバイオディーゼル燃料生産にぉレ、て産生される粗グリセロールである請求項 3に記載の方法。

[5] 前記粗グリセロール力炭素源として用いたときに試薬グリセロールと比較して、より多くの L—アミノ酸を生産することが出来るグリセロールである、請求項 3または 4に記載の方法。

[6] 前記細菌がェシエリヒア属に属する細菌である請求項 1〜5のいずれか一項に記載の方法。

[7] 前記細菌がパントエア属に属する細菌である請求項 1〜5のいずれか一項に記載の方法。

[8] 前記細菌がェシエリヒア'コリである請求項 6に記載の方法。

[9] 前記 L—アミノ酸が L—スレオニン、 L—グノレタミン酸、 L—リジンからなる群より選ばれる 1種以上の L_アミノ酸である、請求項 1〜8のいずれか一項に記載の方法。

[10] 前記 L—アミノ酸が L—スレオニンであり、前記細菌がァスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、 thrオペロンにコードされるァスバルトキナーゼ I、ホモセリンキナーゼ、ァスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及び、スレオニンシンターゼからなる群より選択される 1種または 2種以上の酵素の活性が増強されている請求項 9に記載の方法。

[II] 前記 L_アミノ酸が L_リジンであり、前記細菌がジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールビルベートカルボキシラーゼ、ァスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸ェピメラーゼ、ァスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシ二ラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼからなる群より選択される 1種または 2種以上の酵素の活性が増強されている、及び/または、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている請求項 9に記載の方法。

[12] 前記 L アミノ酸が Lーグノレタミン酸であり、前記細菌がグルタメートデヒドロゲナーゼ、クェン酸シンターゼ、ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ、メチルクェン酸シンターゼからなる群より選択される 1種または 2種以上の酵素の活性が増強されている、及び/または、ひ一ケトグノレタル酸デヒドロゲナーゼの活性が弱化されている請求項 9に記載の方法。

[13] 前記 L—アミノ酸が L—トリプトファンであり、前記細菌がフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、 3—デォキシ一D—ァラピノへプッロン酸一 7_リン酸シンターゼ、 3_ デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、 5 _エノール酸ピルビルシキミ酸 3 _リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼからなる群より選択される 1種または 2種以上の酵素の活性が増強されている請求項 9に記載の方法。