WO2007080919A1 - 動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤、キット及びこれらの利用 - Google Patents

動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤、キット及びこれらの利用 Download PDF

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Jin Chang Shao
Yuki Katsura
Koichiro Tsuji
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development

Definitions

  • the present invention relates to a composition, kit, and use thereof that are added to a culture medium for animal cells, and more specifically, for culturing animal cells under serum-free or low-serum conditions.
  • the present invention relates to yarns and products, kits and their use.
  • a mesenchymal stem cell is one of somatic stem cells present in tissues such as bone marrow, and is a stem cell having multipotency to differentiate into fat cells, bone cells, chondrocytes, etc., and self-proliferating ability.
  • mesenchymal stem cells are used as transplantation cells in the field of regenerative medicine, and the diseases to which mesenchymal stem cells are applied are bone defects, cartilage defects, periodontal diseases, myocardial infarction, refractory skin diseases , Osteoporosis, osteoarthritis, spinal cord injury, hematopoietic support, suppression of rejection in organ transplantation, etc.
  • the number of diseases to which mesenchymal stem cells are applied is expected to increase further (for example, cerebral infarction, obstructive arteriosclerosis, kidney disease, etc.).
  • mesenchymal stem cells exist in tissues such as bone marrow and periosteum.
  • the mesenchymal stem cells from which these biological tissue forces are also collected are proliferated and further differentiated into desired cells to prepare tissues that can be used in tissue regeneration medicine.
  • the cells from which tissue force has been collected are sufficiently proliferated. It is necessary to let
  • animal cells are cultured using a medium supplemented with 5 to 20% serum derived from a non-human animal such as urchin fetal serum.
  • serum is used as a nutrient source for promoting cell growth and Z or proliferation in vitro, or as a source of physiologically active substances such as hormones.
  • serum is very expensive, and because it is a natural product, there is a difference in ingredients from mouth to mouth.
  • cell strength after culturing needs to be purified in order to remove serum-derived proteins and the like, and the work becomes complicated. Furthermore, it is mixed in serum There is a risk of contamination of cultured cells by unknown pathogens (viruses, pathogenic prions, etc.).
  • Patent Documents 3 and 4 A method of culturing chondrocytes for therapeutic application by incorporating a fatty acid in addition to a growth factor in a serum-free medium is also known (see, for example, Patent Documents 3 and 4). Furthermore, Patent Document 5 describes a method and a composition for culturing neural stem cells for a long period of time.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication “JP-A-8-308561 (Publication date: November 26, 1996)”
  • Patent Document 3 Japanese Patent Publication “JP-A-9-191874 (Publication Date: July 29, 1997)”
  • Patent Document 4 Japanese Patent Publication “Special Table 2005-515777 Publication (published June 2, 2005)” [Patent Document 4]
  • Patent Document 5 Japanese Patent Publication “Special Table 2002-529071 Publication (published on September 10, 2002)” [Patent Document 5]
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a technique having an effect of promoting the growth of animal cells comparable to a 10% serum-containing medium while being a serum-free medium. It is in.
  • the culture medium additive according to the present invention comprises at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF—8 and HGF, and at least 1 for culturing animal cells without serum. It contains two phospholipids.
  • the phospholipid includes phosphatidic acid, lysophosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and Phosphatidylglycerol is also preferably selected from the group consisting of:
  • the culture medium additive according to the present invention preferably further contains at least one fatty acid.
  • the fatty acid is selected from the group consisting of linoleic acid, oleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, myristic acid, palmitoyl acid, normitic acid, and stearic acid power. Particularly preferred are the essential nutritional fatty acids linoleic acid, linolenic acid and arachidonic acid.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain cholesterol.
  • the culture medium additive according to the present invention may further contain at least two factors selected from the group consisting of EGF, CTGF, VEGF and ascorbic acid compound strength.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain a lipid antioxidant.
  • the lipid antioxidant is DL-a-tocopherol acetate (vitamin E), L-glutathione (L-glutthione) or 2-mercap.
  • Toethanol (2-mercaptoethanol) is preferred, but other reducing agents.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain lithium chloride.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain a surfactant.
  • the surfactant is Pluronic F-68 or
  • Tween 80 is preferred, but other surfactants may be used.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain insulin, transferrin, and selenate.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain dexamethasone or another glucocorticoid.
  • the animal cell is preferably an unbroken cell.
  • the animal cell is preferably a mesenchymal stem cell.
  • the animal cell is preferably a cell (for example, a monkey kidney-derived cos cell) that has lost a special differentiation ability and is close to an undifferentiated state. .
  • the culture medium according to the present invention is characterized in that it contains a component constituting the above-mentioned supplementary supplement for medium for serum-free culture of animal cells.
  • the culture method according to the present invention is characterized by including a step of culturing animal cells in the above culture medium for serum-free culture of the animal cells.
  • the culture medium additive kit according to the present invention comprises the above culture medium additive for serum-free culturing of animal cells.
  • the culture medium additive kit according to the present invention provides FGF, P for culturing animal cells in serum-free culture.
  • It is characterized by having at least three growth factors selected from the group consisting of DGF, TGF—8 and HGF, and at least one phospholipid separately.
  • the culture medium additive kit according to the present invention preferably further comprises at least one fatty acid.
  • the phospholipid includes phosphatidic acid, Preferably, lysophosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and phosphatidylglycerol are also selected.
  • the fatty acid is preferably selected from the group consisting of linoleic acid, oleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, myristic acid, palmitoyl acid, palmitic acid, and stearic acid. Better ,.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further comprise cholesterol.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further comprise at least two factors selected from the group consisting of EGF, CTGF, VEGF, and ascorbine oxide.
  • the culture medium additive kit according to the present invention may further include a lipid acidification inhibitor.
  • the lipid antioxidant is DL-a tocopherol acetate (vitamin E), L-glutathione (L-glutthione) or 2-mercaptoethanol (2-mercaptoethanol). Although it is preferred, it may be another reducing agent.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further comprise lithium chloride.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further include a surfactant.
  • the surfactant is Pluronic F-68 or
  • Tween 80 is preferred, but other surfactants may be used.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further include insulin, transferrin, and selenate.
  • the culture medium additive kit according to the present invention may further include dexamethasone or other darcocorticoid.
  • the animal cell is an unbroken cell.
  • the animal cell is preferably a mesenchymal stem cell.
  • the animal cell may be a cell that has lost a special separation ability and is close to an undivided state (for example, a monkey kidney-derived COS cell). Like Yes.
  • the culture medium according to the present invention is characterized by containing the components provided in the above-mentioned additive kit for medium for serum-free culture of animal cells.
  • the culture method according to the present invention is characterized by including a step of culturing animal cells in the above-mentioned culture medium in order to culture the animal cells without serum.
  • the culture method according to the present invention comprises at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF—8 and HGF, and at least one for culturing animal cells in serum-free culture. It includes the step of simultaneously adding phospholipids to the basal medium.
  • the culture method according to the present invention preferably includes a step of further adding at least one fatty acid to the basal medium!
  • the culture medium additive according to the present invention comprises at least three proliferations selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF-j8, and HGF in order to continuously subculture stem cells while maintaining differentiation potential. It is characterized by containing a factor as well as at least one phospholipid.
  • the culture medium additive according to the present invention preferably further contains at least one fatty acid.
  • the culture medium additive kit according to the present invention is at least selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF—8 and HGF in order to continuously culture stem cells while maintaining differentiation potential. Featuring three growth factors and at least one phospholipid
  • the culture medium additive kit according to the present invention preferably further comprises at least one fatty acid.
  • the culture medium according to the present invention is characterized by containing at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF- ⁇ and HGF, and at least one phospholipid.
  • the culture medium according to the present invention preferably further contains at least one fatty acid.
  • the culture method according to the present invention is for continuously subculturing stem cells while maintaining differentiation ability. And a step of simultaneously adding at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF-j8 and HGF and at least one phospholipid to the basal medium.
  • the culture method according to the present invention preferably includes a step of further adding at least one fatty acid to the basal medium!
  • the culture medium additive according to the present invention is a combination of PDGF, at least one phospholipid, at least one fatty acid, and EGF, CTGF, VEGF, and ascorbic acid for culturing primary cultured stem cells. It is characterized by containing at least two factors selected from the group of physical strength.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain at least one factor selected from the group consisting of FGF, TGF- ⁇ , and HGF force.
  • the phospholipid is phosphatidic acid, lysophosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidyl.
  • Choline, and phosphatidylglycerol are also preferably selected from the group consisting of:
  • the fatty acid is selected from the group consisting of linoleic acid, oleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, myristic acid, palmitoyl acid, normitic acid, and stearic acid power. Particularly preferred are the essential nutritional fatty acids linoleic acid, linolenic acid and arachidonic acid.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain cholesterol.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain a lipid antioxidant.
  • the lipid antioxidant is preferably DL-a-tocopherol acetate (vitamin E).
  • the culture medium additive of the present invention may further contain a surfactant.
  • the surfactant is Pluronic F-68 or
  • Tween 80 is preferred, but other surfactants may be used.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain insulin, transferrin, and selenate. [0067] The culture medium additive of the present invention may further contain dexamethasone or another glucocorticoid.
  • the culture medium additive kit according to the present invention comprises PDGF, at least one phospholipid, at least one fatty acid, and EGF, CTGF, VEGF and ascorbic acid compound for culturing primary cultured stem cells. It is characterized by having at least two factors selected from the group.
  • the culture medium additive kit according to the present invention may further include at least one factor selected from the group consisting of FGF, TGF- ⁇ , and HGF power.
  • the phospholipid contains phosphatidic acid, lysophosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidyl.
  • choline and phosphatidyl glycerol are also selected from the group.
  • the fatty acid is selected from the group consisting of linoleic acid, oleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, myristic acid, noremitoylic acid, palmitic acid, and stearic acid. Linoleic acid, linolenic acid and arachidonic acid, which are essential nutritional fatty acids, are particularly preferred.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further comprise cholesterol.
  • the culture medium additive kit according to the present invention may further include a lipid acidification inhibitor.
  • the lipid antioxidant is preferably DL-hytocopherol acetate (vitamin E)! /.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further include a surfactant.
  • the surfactant is preferably Pluronic F-68 or Tween 80, but may be other surfactants.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further comprise insulin, transferrin, and selenate.
  • the culture medium additive kit according to the present invention may further include dexamethasone or other darcocorticoid.
  • the culture method according to the present invention includes PDGF, at least a method for culturing primary cultured stem cells. Characterized in that it comprises the step of simultaneously adding one phospholipid, at least one fatty acid, and at least two factors selected from the group consisting of EGF, CTGF, VEGF and ascorbic acid to the basal medium. RU
  • the culture method according to the present invention may further include a step of adding at least one factor selected from the group consisting of FGF, TGF- ⁇ , and HGF to the basal medium.
  • the medium additive according to the present invention comprises TGF- ⁇ , PDGF, at least one phospholipid, at least one fatty acid, as well as EGF, CTGF, VEGF in order to continuously subculture mouse fibroblasts. And at least two factors selected from the group consisting of ascorbic acid compounds.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain FGF and / or HGF.
  • the phospholipid is phosphatidic acid, lysophosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidyl.
  • Choline, and phosphatidylglycerol are also preferably selected from the group consisting of:
  • the fatty acid is selected from the group consisting of linoleic acid, oleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, myristic acid, palmitoyl acid, normitic acid, and stearic acid power. Particularly preferred are the essential nutritional fatty acids linoleic acid, linolenic acid and arachidonic acid.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain cholesterol.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain a lipid antioxidant.
  • the lipid antioxidant is preferably DL-a-tocopherol acetate (vitamin E).
  • the culture medium additive of the present invention may further contain a surfactant.
  • the surfactant is Pluronic F-68 or
  • Tween 80 is preferred, but other surfactants may be used.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain insulin, transferrin, and selenate.
  • the culture medium additive according to the present invention includes dexamethasone or other group.
  • a lucocorticoid may further be contained.
  • the culture medium additive kit according to the present invention comprises TGF- ⁇ , PDGF, at least one phospholipid, at least one fatty acid, and EGF, CTGF, in order to continuously subculture mouse fibroblasts. It comprises at least two factors selected from the group consisting of VEGF and ascorbic acid compounds.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further comprise FGF and Z or HGF.
  • the phospholipid includes phosphatidic acid, lysophosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidyl.
  • choline and phosphatidyl glycerol are also selected from the group.
  • the fatty acid is selected from the group consisting of linoleic acid, oleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, myristic acid, noremitoylic acid, palmitic acid, and stearic acid. Linoleic acid, linolenic acid and arachidonic acid, which are essential nutritional fatty acids, are particularly preferred.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further comprise cholesterol.
  • the culture medium additive kit according to the present invention may further include a lipid acidification inhibitor.
  • the lipid antioxidant is DL-hytocopherol acetate (vitamin E)! /.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further include a surfactant.
  • the surfactant is preferably Pluronic F-68 or Tween 80, but may be other surfactants.
  • the culture medium additive kit according to the present invention may further comprise insulin, transferrin, and selenate.
  • the culture medium additive kit according to the present invention may further comprise dexamethasone or another darcocorticoid.
  • the culture method according to the present invention comprises TGF- ⁇ , PDGF, at least one phospholipid, at least one fatty acid, and EGF, CTG in order to continuously subculture mouse fibroblasts. It includes the step of simultaneously adding at least two factors selected from the group consisting of F, VEGF, and ascorbic acid compound to the basal medium.
  • the culture method according to the present invention may further include a step of adding FGF and Z or HGF to the basal medium.
  • the medium additive according to the present invention comprises PDGF, at least one phospholipid, at least one fatty acid, and EGF, CTGF, VEGF, and ascorbic acid for the continuous passage culture of Chinese nomstar ovary-derived cells. It is characterized by containing at least two factors selected from the group consisting of compounds.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain at least one factor selected from the group consisting of FGF, TGF- ⁇ , and HGF.
  • the phospholipid comprises phosphatidic acid, lysophosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and Phosphatidylglycerol is also preferably selected from the group consisting of:
  • the fatty acid is selected from the group consisting of linoleic acid, oleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, myristic acid, palmitoyl acid, normitic acid, and stearic acid power. Particularly preferred are the essential nutritional fatty acids linoleic acid, linolenic acid and arachidonic acid.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain cholesterol.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain a lipid antioxidant.
  • the lipid antioxidant is preferably DL-a-tocopherol acetate (vitamin E).
  • the culture medium additive of the present invention may further contain a surfactant.
  • the surfactant is Pluronic F-68 or
  • Tween 80 is preferred, but other surfactants may be used.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain insulin, transferrin, and selenate.
  • the culture medium additive according to the present invention includes dexamethasone or other group.
  • a lucocorticoid may further be contained.
  • the culture medium additive kit according to the present invention comprises PDGF, at least one phospholipid, at least one fatty acid, and EGF, CTGF, VEGF, and ascorbine for continuous subculture of Chinese hamster ovary-derived cells. Featuring at least two factors selected from the group consisting of acid compounds! /
  • the culture medium additive kit according to the present invention may further include at least one factor selected from the group consisting of FGF, TGF- ⁇ , and HGF force.
  • the phospholipid comprises phosphatidic acid, lysophosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidyl.
  • choline and phosphatidyl glycerol are also selected from the group.
  • the fatty acid is selected from the group consisting of linoleic acid, oleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, myristic acid, noremitoylic acid, palmitic acid, and stearic acid. Linoleic acid, linolenic acid and arachidonic acid, which are essential nutritional fatty acids, are particularly preferred.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further comprise cholesterol.
  • the culture medium additive kit according to the present invention may further comprise a lipid acidification inhibitor.
  • the lipid antioxidant is preferably DL-a-tocopherol acetate (vitamin E)! /.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further comprise a surfactant.
  • the surfactant is preferably Pluronic F-68 or Tween 80, but may be other surfactants.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further comprise insulin, transferrin, and selenate.
  • the culture medium additive kit according to the present invention may further comprise dexamethasone or another darcocorticoid.
  • the culture method according to the present invention comprises PDGF, at least one phospholipid, at least one fatty acid, and EG in order to continuously subculture Chinese, Muster ovary-derived cells. It includes the step of simultaneously adding at least two factors selected from the group consisting of F, CTGF, VEGF and ascorbic acid compound to the basal medium.
  • the culture method according to the present invention may further include a step of adding at least one factor selected from the group consisting of FGF, TGF- ⁇ , and HGF to the basal medium.
  • the medium additive according to the present invention comprises FGF, at least one phospholipid, at least one fatty acid, and EGF, CTGF, VEGF, and ascorbic acid for continuous subculture of human skin-derived fibroblasts. It is characterized by having at least two factors selected from the group consisting of
  • the culture medium additive of the present invention may further contain at least one factor selected from the group consisting of TGF- ⁇ , HGF and PDGF power.
  • the phospholipid includes phosphatidic acid, lysophosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and Phosphatidylglycerol is also preferably selected from the group consisting of:
  • the fatty acid is selected from the group consisting of linoleic acid, oleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, myristic acid, palmitoyl acid, normitic acid, and stearic acid power. Particularly preferred are the essential nutritional fatty acids linoleic acid, linolenic acid and arachidonic acid.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain cholesterol.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain a lipid antioxidant.
  • the lipid antioxidant is preferably DL-a-tocopherol acetate (vitamin E).
  • the culture medium additive of the present invention may further contain a surfactant.
  • the surfactant is Pluronic F-68 or
  • Tween 80 is preferred, but other surfactants may be used.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain insulin, transferrin, and selenate.
  • the culture medium additive according to the present invention includes dexamethasone or other group.
  • a lucocorticoid may further be contained.
  • the culture medium additive kit according to the present invention comprises FGF, at least one phospholipid, at least one fatty acid, and EGF, C for continuous subculture of human skin-derived fibroblasts.
  • TGF TGF
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • ascorbic acid compounds TGF, VEGF and ascorbic acid compounds.
  • the culture medium additive kit according to the present invention may further include at least one factor selected from the group consisting of TGF- ⁇ , HGF, and PDGF power.
  • the phospholipid includes phosphatidic acid, lysophosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidyl.
  • choline and phosphatidyl glycerol are also selected from the group.
  • the fatty acid is selected from the group consisting of linoleic acid, oleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, myristic acid, noremitoylic acid, palmitic acid, and stearic acid. Linoleic acid, linolenic acid and arachidonic acid, which are essential nutritional fatty acids, are particularly preferred.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further comprise cholesterol.
  • the culture medium additive kit according to the present invention may further comprise a lipid acidification inhibitor.
  • the lipid antioxidant is preferably DL-hytocopherol acetate (vitamin koji)! /.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further include a surfactant.
  • the surfactant is preferably Pluronic F-68 or Tween 80, but may be other surfactants.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further comprise insulin, transferrin, and selenate.
  • the culture medium additive kit of the present invention may further comprise dexamethasone or another darcocorticoid.
  • the culture method according to the present invention comprises FGF, at least one phospholipid, at least one fatty acid, and EGF, CTGF, VE, for continuous subculture of human skin-derived fibroblasts. It includes the step of simultaneously adding at least two factors selected from the group consisting of GF and ascorbic acid compound to the basic medium.
  • the culture method according to the present invention may further include a step of adding at least one factor selected from the group consisting of TGF- ⁇ , HGF and PDGF to the basal medium.
  • FIG. 1 A graph showing the effect of addition of a serum replacement substance to a serum-free medium on the proliferation of human mesenchymal stem cells (MSC).
  • FIG. 2 shows morphological changes of human mesenchymal stem cells (MSC) cultured in serum-free medium.
  • FIG. 3 shows the evaluation of bone differentiation ability of human mesenchymal stem cells (MSC) cultured in serum-free medium.
  • FIG. 4 is a diagram showing the evaluation of adipogenic potential of human mesenchymal stem cells (MSC) cultured in a serum-free medium.
  • FIG. 5 shows the evaluation of the cartilage differentiation ability of human mesenchymal stem cells (MSC) cultured in serum-free medium.
  • FIG. 6 is a graph showing the evaluation of cartilage differentiation ability of human mesenchymal stem cells (MSC) cultured in serum-free medium.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of adding a serum replacement substance to a serum-free medium on the proliferation of human mesenchymal stem cells (MSC).
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of adding a serum replacement substance to a serum-free medium on the proliferation of human mesenchymal stem cells (MSC).
  • FIG. 9 is a graph showing the effect of addition of a serum replacement substance to a serum-free medium on the proliferation of human mesenchymal stem cells (MSC).
  • FIG. 10 is a graph showing the effect on the growth of C2C12 cells by adding a serum replacement substance to a serum-free medium.
  • FIG. 11 is a graph showing the influence of human mesenchymal stem cells (MSCs) on the cell proliferation signal transduction system by adding a serum replacement substance to a serum-free medium.
  • MSCs human mesenchymal stem cells
  • FIG. 12 shows the effect of human mesenchymal stem cells (MSCs) on the cell proliferation signaling system by the addition of a serum replacement substance to a serum-free medium.
  • FIG. 13 is a diagram showing a serum replacement substance added to a serum-free medium of mesenchymal stem cells (MSC).
  • MSC mesenchymal stem cells
  • FIG. 14 is a view showing a serum replacement substance added to a serum-free medium of C2C 12 cells.
  • FIG. 15 (a) shows the effect of addition of a serum replacement substance on a serum-free medium on the proliferation of human mesenchymal stem cells (MSC).
  • FIG. 15 (b) shows the effect on the proliferation of human mesenchymal stem cells (MSCs) by adding a serum replacement substance to a serum-free medium.
  • FIG. 16 (a) shows the effect of addition of a serum replacement substance to a serum-free medium on the proliferation of primary human mesenchymal stem cells (MSC).
  • FIG. 16 (b) shows the effect of the addition of a serum replacement substance on serum-free medium on the proliferation of primary human mesenchymal stem cells (MSC).
  • FIG. 17 (a) shows the effect on the growth of 10T1Z2 cells by adding a serum substitute to serum-free medium.
  • FIG. 17 (b) shows the effect on the growth of CHO cells due to the addition of a serum replacement substance to a serum-free medium.
  • FIG. 17 (c) is a graph showing the effect of adding a serum replacement substance to a serum-free medium on the proliferation of human Hiff fibroblasts (Fibroblast).
  • various peptide hormones, growth factors, lipids, and the like are used for culturing cells in a medium (serum-free medium) without serum without losing growth.
  • the medium supplemented with these serum substitute components does not necessarily have a sufficient cell growth promoting effect as compared with the serum-containing medium. Therefore, the present inventors examined a human mesenchymal stem cell culture method comparable to the conventional culture method using a 10% serum-containing medium even under conditions of low serum (0.5 to 2%). did.
  • animal cells can be grown in large quantities in a culture system under low serum conditions or serum-free conditions.
  • cells having regenerative medical uses such as mesenchymal stem cells
  • cell proliferation not only in a test tube but also on an industrial scale can be realized, and the production cost can be greatly reduced.
  • the present invention provides a medium additive for serum-free culture of animal cells.
  • the culture medium additive according to the present invention contains at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF- ⁇ and HGF, and at least one phospholipid.
  • Examples of the phospholipid contained in the culture medium additive according to the present invention include phosphatidic acid, lysophosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, and phosphatidylethanolamine.
  • Phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol, and the like, and the culture medium additive according to the present invention may contain these phospholipids alone or in combination.
  • the culture medium additive according to the present invention contains phosphatidic acid and phosphatidylcholine in combination.
  • these phospholipids may be derived from animals or plants.
  • the culture medium additive according to the present invention preferably further contains at least one fatty acid.
  • the fatty acid contained in the medium additive according to the present embodiment include linoleic acid, oleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, myristic acid, normitoyl acid, palmitic acid, stearin, and the like.
  • the culture medium additive according to this embodiment may contain these fatty acids alone or in combination!
  • the culture medium additive according to the present embodiment may further contain cholesterol in addition to the fatty acid.
  • FGF is fibroblast growth factor (FGF).
  • Growth factor is also a growth factor of choice and is preferably FGF-2 (bFGF), although other FGF family efforts such as FGF-1 may also be selected.
  • bFGF FGF-2
  • PDGF is intended to be a growth factor selected from the platelet-derived growth factor (PDGF) family and is PDG F—BB or PDGF—AB. It is preferable.
  • TGF- ⁇ is intended to be a growth factor for which the transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ) family is also selected, and TGF- ⁇
  • TGF- ⁇ 3 is preferred, but may be selected from other TGF- ⁇ families.
  • the culture medium additive according to the present invention includes epidermal growth factor (EGF), connective tissue growth factor (CTGF), vascular endothelial growth factor (VEGF). And at least two factors selected from the group consisting of ascorbic acid compounds.
  • EGF epidermal growth factor
  • CGF connective tissue growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Ascorbic acid compound as used herein is intended to be ascorbic acid (vitamin C) or ascorbic acid diphosphate, or a similar compound.
  • the growth factor contained in the culture medium additive of the present invention may be natural or produced by genetic recombination.
  • the culture medium additive according to the present invention preferably contains a lipid antioxidant.
  • the lipid antioxidant contained in the medium additive according to the present embodiment may be DL-a-tocopherol acetate (vitamin E).
  • the culture medium additive according to the present invention may further contain a surfactant.
  • the surfactant contained in the medium additive according to this embodiment may be Plur onic F-68 or Tween 80.
  • the culture medium additive of the present invention may further contain insulin, transferrin, and selenate.
  • insulin may be an insulin-like growth factor, may be derived from natural cells, or may be produced by genetic recombination.
  • the culture medium additive according to the present invention may further contain dexamethasone or other darcocorticoid.
  • the present invention provides a medium additive kit for serum-free culture of animal cells.
  • the culture medium additive kit according to the present invention comprises at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF- ⁇ and HGF, and at least one phospholipid.
  • the culture medium additive kit according to the present invention comprises at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF- ⁇ and HGF and at least one phospholipid in the same container. These components may be provided separately.
  • the culture medium additive kit according to the present invention preferably further comprises at least one fatty acid.
  • the culture medium additive kit according to the present embodiment comprises at least three growth factors selected from the group consisting of FG F, PDGF, TGF- ⁇ , and HGF, at least one phospholipid, and at least one fatty acid. Even if it is provided in the same container, these components may be provided separately.
  • composition is a form in which each main component is contained in one substance, and a “kit” contains at least one of each main ingredient in another substance.
  • the present invention provides a culture medium for serum-free culture of animal cells.
  • the culture medium according to the present invention contains at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF- ⁇ and HGF, and at least one phospholipid.
  • the culture medium according to the present invention only needs to contain at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF- ⁇ and HGF, and at least one phospholipid. May be added to the basal medium simultaneously or separately. That is, the culture medium according to the present invention includes the components contained in the above-described medium additive or the medium additive calorie kit, and contains the above components.
  • the culture medium according to the present invention preferably further contains at least one fatty acid.
  • the medium additive kit according to the present embodiment comprises at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF- ⁇ and HGF, and a small amount. These ingredients, as long as they contain at least one phospholipid and at least one fatty acid, may be added simultaneously or separately to the basal medium. That is, the culture medium according to the present invention may be contained in the above-described medium additive or included in the medium additive kit, and may contain the component. .
  • the basal medium for constituting the culture medium according to the present invention is not particularly limited as long as it is a well-known animal cell medium in the art, and preferred basal media include, for example, Ham's F12 medium, Examples include DMEM medium, RPMI-1640 medium, and MCDB medium. These basal media may be used alone or in combination.
  • the basal medium for constituting the culture medium according to the present invention is preferably a medium in which MCDB and DMEM are mixed at a ratio of 1: 1.
  • the present invention provides a culture method for serum-free culture of animal cells.
  • the culture method according to the present invention comprises animal cells in a culture medium containing at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF- ⁇ and HGF, and at least one phospholipid.
  • the step of culturing The culture medium may further contain at least one fatty acid. That is, the culture method according to the present invention can be obtained by using the culture medium described above when culturing animal cells.
  • the culture method according to the present invention comprises at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF- ⁇ and HGF, and at least one phospholipid in a basal medium. You may include the process of adding simultaneously.
  • the basal medium is not particularly limited as long as it is a well-known animal cell medium in the art as described above.
  • animal cells can be grown while maintaining their characteristics at a rate equal to or higher than that when cultured in a 10% serum-containing medium even in a serum-free medium.
  • stem cells particularly human mesenchymal stem cells
  • they can be continuously subcultured while maintaining their characteristics (bone differentiation ability, fat content, etc.) at a high level.
  • the serum-free medium according to the present invention when used, the number of cells can be increased at least 10,000 times or more at the start of the culture.
  • this departure Akira also provides a culture medium additive, a culture medium additive kit, a culture medium, and a culture method for continuously subculturing stem cells.
  • the present invention provides a medium additive for continuously subculturing stem cells.
  • the culture medium additive according to the present invention contains at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF- ⁇ and HGF power, and at least one phospholipid.
  • the culture medium additive according to the present invention preferably further contains at least one fatty acid.
  • the present invention provides a culture medium additive kit for continuously subculturing stem cells.
  • the culture medium additive kit according to the present invention contains at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF- ⁇ and HGF, and at least one phospholipid.
  • the culture medium additive kit according to the present invention preferably further contains at least one fatty acid.
  • the present invention provides a culture medium for continuously subculturing stem cells.
  • the culture medium according to the present invention contains at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF- ⁇ and HGF, and at least one phospholipid.
  • the culture medium according to the present invention further comprises at least one fatty acid.
  • the present invention provides a culture method for serially culturing stem cells.
  • the culture method according to the present invention comprises at least three growth factors selected from the group consisting of FGF, PDGF, TGF- ⁇ , and HGF, and at least one phospholipid in a culture medium. Including culturing animal cells.
  • the culture medium may further contain at least one fatty acid. That is, it can be said that the culture method according to the present invention may use the culture medium described above when continuously subculturing stem cells.
  • the present invention shows a stronger effect on undifferentiated cells such as stem cells, but loses a special dividing ability and is close to an undivided state. It is also very effective in culturing cells (eg, monkey kidney-derived COS cells) under serum-free conditions. That is, the cell that can be applied to the present invention is an undifferentiated cell that is preferable to an undifferentiated cell.
  • undifferentiated cells such as stem cells
  • culturing cells eg, monkey kidney-derived COS cells
  • Bone marrow undifferentiated mesenchymal stem cells skeletal muscle stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, hepatic stem cells, fat, tissue stem cells, adipose precursor cells, vascular endothelial precursor cells, cartilage precursor cells, lymphoid precursor cells, They can be stem cells such as NK progenitor cells, embryonic stem cells, or fibroblasts, and mesenchymal stem cells are more preferred.
  • the culture method to be noted when using these cells may follow a known culture method for each cell.
  • FIG. 13 shows components in the medium used for culturing mesenchymal stem cells (MSC)
  • FIG. 14 shows components in the medium used for culturing C2C12 cells. Note that these components may have higher concentrations than the upper limits of the values shown in FIG. 13 and FIG.
  • Example 1 Bloodless culture of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC)]
  • Mesenchymal stem cells derived from human iliac bone marrow (3rd pass: purchased from Bio—Whitterker (Walkersville, MD)) 3 times with serum-free DMEM medium, and the cells are placed on a 24-well plate. The cells were seeded at a density of Zcm2 and cultured at 37 ° C in a C02 incubator in the presence of 5% C02.
  • DMEMZMCDB 1: 1 as the basal medium was added to the following additives and used for culture:
  • FBS urchin fetal serum
  • Table 1 shows the composition of the basal medium of the serum-free medium.
  • the company components shown in Fig. 13 and Fig. 14 were also purchased for the various components added to the medium.
  • the MCDB201 (Sigma: M-67 70) medium which is the basal medium, was developed for clonal expansion of chick avian embryo fibroblasts and contains complete trace elements!
  • MCDB201ZDMEM (1: 1) compared to the conventional basal medium DMEM or DMEMZHam's F-12 of mesenchymal stem cells, the optimal proliferation promotion of mesenchymal stem cells was shown (not shown) ).
  • Linoleic Acid 0.000042 0.000042
  • the basic medium (medium 3) comprises a growth factor group (FGF, HGF, TGF- ⁇ , PDGF) and a fatty acid complex (arachidonic acid, retinoic acid, linolenic acid, oleic acid, linolenic acid, myristic acid).
  • FGF growth factor group
  • HGF growth factor group
  • TGF- ⁇ TGF- ⁇
  • PDGF vascular endothelial growth factor group
  • a fatty acid complex arachidonic acid, retinoic acid, linolenic acid, oleic acid, linolenic acid, myristic acid.
  • insulin, transferrin, selenate such as sodium selenate
  • SSA dexamethasone
  • BSA ushi serum albumin
  • vitamin E as a lipid acidification inhibitor
  • Pluroni c F-68 and Tween 80 surfactants.
  • the basic medium (medium 3) according to the present invention showed a cell growth effect equivalent to that of a conventional 10% FBS-containing medium when 2% FBS was added (not shown).
  • this basal medium was used under serum-free conditions, it was inferior to the medium containing 10% FBS but showed an excellent cell proliferation effect (about 45% of the cell proliferation level in the medium containing 10% FBS: Fig. 1).
  • phospholipids derived from animals phosphatidic acid (PA), phosphatidylcholine (PC)
  • PA phosphatidic acid
  • PC phosphatidylcholine
  • the cell proliferation effect was shown (about 8.5 times the cell proliferation level in a medium containing 10% FBS: Fig. 1).
  • Lecithin from Soybean, Wako (120-00832) 200mg was added to Chloroform. After drying this using a nitrogen gas distillation method, 20 ml of PBS (—) was added. This solution is sonicated for 15 minutes at room temperature. The mixture was equilibrated by sonication, further sonicated for 30 seconds to 2 minutes on ice under nitrogen gas, and then centrifuged (2500 rpm) at room temperature for 5 minutes. If there was a precipitate, it was further sonicated on ice for 5 minutes, and then centrifuged (2500 rpm) at room temperature for 5 minutes. The supernatant collected after repeating this process was filtered through a 0.45 m filter, sealed with nitrogen gas, and stored refrigerated in the dark.
  • medium 5 showed an excellent cell growth effect equivalent to that of the basic medium (medium 3) even in the absence of serum (the cell growth level in the medium containing 10% FBS). About 40%: Figure 1).
  • FIG. 1 The morphology of mesenchymal stem cells cultured in the serum-free medium used in this example is shown in FIG.
  • FIG. 2 cells cultured in serum-free medium (passage 3) show a spindle-shaped shape typical of mesenchymal stem cells compared to cells cultured in medium containing 10% FBS. It was. Cell growth was reduced in serum-free medium except for TGF- ⁇ or HGF alone.
  • the third-generation human iliac bone subcultured continuously in serum-free medium After collecting the mesenchymal stem cells derived from it, osteogenesis induction medium (containing ⁇ - ⁇ , 10% FBS, ⁇ Dex amethasone, lOmM ⁇ -Lrlycerophosphoric acid, and 50 gz ml L-As corbie acid 2-phosphate).
  • osteogenesis induction medium containing ⁇ - ⁇ , 10% FBS, ⁇ Dex amethasone, lOmM ⁇ -Lrlycerophosphoric acid, and 50 gz ml L-As corbie acid 2-phosphate.
  • Mesenchymal stem cells in bone differentiation-inducing medium were cultured at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide and replaced with the same medium induction medium every 2-3 days for a total of 28 days.
  • Cell layers differentiated from bone and calcified were stained with alizarin red. The results are shown in Figure 3.
  • alizarin red which shows calcification characteristic of osteoblasts as a result of culturing mesenchymal stem cells (passage 4) cultured in serum-free medium for 28 days in bone differentiation-inducing medium. , And calcium deposits were observed.
  • mesenchymal stem cells cultured in the serum-free medium maintained high bone differentiation ability (calcification ability). In particular, the highest bone function was observed with the addition of two phospholipids.
  • the third-generation human iliac bone subcultured continuously in serum-free medium Proliferate mesenchymal stem cells derived to confluence, disperse with trypsin, and collect , Transferred to adipogenic differentiation medium (consisting of high glucose-containing DMEM, 10 / z gZml Insulin, 0.2 mM Indometnacm, 1 M Dexamethasone, 0.5 mM 3-Isobutyl-1, 1-methnyl xanthine, and 10% FBS).
  • adipogenic differentiation medium consisting of high glucose-containing DMEM, 10 / z gZml Insulin, 0.2 mM Indometnacm, 1 M Dexamethasone, 0.5 mM 3-Isobutyl-1, 1-methnyl xanthine, and 10% FBS.
  • Mesenchymal stem cells in adipose differentiation-inducing medium were cultured at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide gas, and replaced with the same fractionation-inducing medium every 2-3 days for a total of 28 days. . Adipose differentiation was assessed by staining the cells with Oil Red O. The results are shown in Fig. 4.
  • mesenchymal stem cells (passage 4) cultured in serum-free medium were cultured for 28 days in an adipogenic medium, and as a result, stained with oil red O indicating fat. .
  • all the mesenchymal stem cells cultured in the serum-free medium maintained a high fat content.
  • chondrocyte induction medium high glucose a-MEM, lOng / mlT GF— j8 ⁇
  • ITS—Puffus (6.25 gZml Transf errin, 6.25 ⁇ gZ ml Insulin, 6.25 ngZ ml selenate, 5.33 ⁇ gZ ml linolei c acid, 1.25 mgZml ushi serum albumin: BSA). Moved to).
  • 200,000 cells were placed in a centrifuge tube (for 15 ml) and incubated with 0.5-ml of the following medium.
  • mesenchymal stem cells were transferred to a control medium in which TGF- ⁇ was removed from the cartilage differentiation induction medium.
  • GAGs in the pellets after culturing were quantified using a kit for quantification of glycosaminoglycan (GAG) sulfate (manufactured by Biocolor). The results are shown in FIG. The amount of GAG was normalized according to the DNA content of the cells.
  • the cartilage-separated cells in the cartilage induction medium after culture were stained with toluidine blue.
  • Fig. 6 The results are shown in Fig. 6.
  • Fig. 5 mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium and a medium containing 10% FBS were cultured in a cartilage differentiation induction medium for 21 days.
  • Cells (passage 5) showed significantly higher amounts of GAG compared to mesenchymal stem cells cultured in medium containing 10% FBS (p ⁇ 0.01).
  • no increase in the amount of GAG was observed in any medium. Indicates the average value SD of the experiment conducted in triplicate).
  • mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium and a medium containing 10% FBS were cultured in a cartilage differentiation-inducing medium for 21 days.
  • mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium Compared to mesenchymal stem cells cultured in a medium containing 10% FBS (passage 5), matrix staining was observed with a significantly higher level of toluidine blue staining.
  • Example 3 Effect of growth factors in serum-free culture of bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • Human iliac bone marrow-derived mesenchymal stem cells (3rd generation) contain no serum! /, DMEM medium After washing 3 times with, cells are seeded on a 24-well plate at a density of 5000 Zcm2, 5% CO
  • the cells were cultured at 37 ° C in a C02 incubator in the presence of 2.
  • DMEMZMCDB 1: 1 as the basal medium was added to the following additives and used for culture:
  • mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium (medium 3-8, medium 4, medium 41, or medium 5) are compared with those cultured in medium 3,
  • the cell growth rate on the 8th day of culture was enhanced (the value indicates the average value SD of the experiment conducted in triplicate). In particular, this effect was remarkable when cultured in the medium 4 or the medium 4-1. From this, it was found that EGF, VC and high concentrations of VE, which are not only phospholipids, are also effective in promoting the proliferation of mesenchymal stem cells.
  • TGF- ⁇ or HGF was removed from the basic medium (medium 3)
  • the cell proliferation rate of the mesenchymal stem cells was significantly reduced. This indicates that ⁇ GF- ⁇ and HGF are essential for serum-free culture of mesenchymal stem cells.
  • a medium (medium 5) containing a lipid mixture mainly composed of plant-derived lecithin (corresponding to animal-derived phosphatidylcholine (PC)) is also mainly composed of many fatty acids. It was found to be useful for serum-free culturing of mesenchymal stem cells in the same manner as the medium containing the lipid mixture (Medium 4) (Fig. 7).
  • mesenchymal stem cells cultured in serum-free medium had an increased cell growth rate on day 8 of culture compared to medium 3 (numerical values) Indicates the average value SD of the experiment conducted in triplicate).
  • Mesenchymal stem cells derived from human iliac bone marrow (3rd generation) were washed 3 times with serum-free DMEM medium, and the cells were seeded on a 24-well plate at a density of 5000 Zcm2, 5% CO
  • the cells were cultured at 37 ° C in a C02 incubator in the presence of 2.
  • DMEMZMCDB 1: 1 as basal medium was added to the following additives and used for culture:
  • mesenchymal stem cells cultured in serum-free medium showed the same cell growth rate as that cultured in medium 3 (the values are in triplicate). (Indicates the mean value SD of the experiment conducted in).
  • mesenchymal stem cells cultured in a medium containing a phospholipid lecithin derived from a plant and a medium containing retinoic acid are the same as those cultured in a basic medium (medium 3). The growth rate was shown.
  • Mouse mesenchymal stem cells C2C12 cells (or mouse chondrocyte line ATDC5 or monkey kidney-derived undifferentiated cell line COS 7 cells), DMEM containing 10% urine fetal serum, 100 units Zml penicillin, and 100 ⁇ g Zml streptomycin The cells were cultured at 37 ° C. in a C02 incubator in the presence of 5% C02 on a 10 cm plate containing the medium. Cells were washed twice with PBS and detached from the plate by incubating for 2 minutes in PBS containing 0.05% trypsin and 0.2 mM EDTA, and plant-derived try psin inhibitor (Sigma : T6522) and resuspended. After washing the cells three times in serum-free DMEM medium, the number of cells was counted with a Coulter counter (Z1 single, Coulter). The result is shown in FIG.
  • the resuspended cells were replated at a density of 5000 Zcm2 in 24-well plates using the following different media conditions.
  • the cell line C2C 12 cells cultured in serum-free medium showed much better cell growth than normal 10% FBS-containing medium (medium 2).
  • the growth ability of this cell line was markedly reduced when a medium from which only the medium strength HGF was removed (medium 43) was used (the figure shows the mean value SD of the experiment carried out in triplicate).
  • the serum-free medium (medium 42) can be used even if this serum-free medium (medium 42) is used. )
  • the effect of promoting cell proliferation to such an extent was not possible. That is, this serum-free medium (medium 5) was shown to be more effective with undifferentiated cells.
  • the serum-free medium of the present invention is also effective for culturing cells (for example, monkey kidney-derived COS7 cells) under serum-free conditions that have lost their special differentiation ability and are 10% A growth promoting effect comparable to that of the FBS-containing medium (medium 2) was obtained.
  • the cultured cells were washed twice with PBS and further cultured for 16 hours in a serum-free medium containing 25 mg / ml BSA (usi serum albumin).
  • the cultured cells are then treated with each growth factor (E: EGF, F: FGF, G: PDGF, H: HGF, I: Insulin, J: TGF- ⁇ ), Dexamethasone (D), Transferrin (T), and fatty acids.
  • FIG. 11 shows protein fractions when cells were stimulated with growth factors (E to J), Dexamethasone (D), and Transferrin (T). As shown in Figure 11, compared to control cells (stimulated, non-viable cells), by EGF ( ⁇ ), FGF (F), PDGF (G), Insulin (1), and HGF (H) It was shown that ErklZ2 is phosphorylated in stimulated cells. In particular, in cells stimulated with HGF, phosphorylation of ErklZ2 was promoted in a concentration-dependent manner, and phosphorylation of Akt was also promoted.
  • EGF growth factor
  • D Dexamethasone
  • T Transferrin
  • Figure 12 shows protein fractions when cells were stimulated with fatty acid-related factors (A1-A7).
  • A1-A7 fatty acid-related factors
  • FIG. 12 shows protein fractions when cells were stimulated with fatty acid-related factors (A1-A7).
  • the phosphorylation of ErklZ2 and Akt was strongly promoted in cells stimulated with phosphatidic acid (A6) compared to control cells (unstimulated cells).
  • ErklZ2 phosphorylation was promoted in cells stimulated by Arachidonic acid (Al), Linoleic acid (A2), L inolenic acid (A3), Oleic acid (A4), and Phosphatidyl choline (A7).
  • these fatty acid-related factors have been shown to activate the cell proliferation signaling system as a growth factor that simply supplies energy and membrane components to cultured cells.
  • Example 8 Action of additional basic factors in serum-free culture of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • lithium chloride (LiCl) can promote the proliferation of human mesenchymal stem cells by activating the wingles s / int (wnt) signaling pathway.
  • ES cells embryonic stem cells
  • L-glutthione human kidney as an antioxidant (reducing agent). Therefore, in order to examine the effects on the proliferation of mesenchymal stem cells of lithium chloride (Li C1) and L glutathione, the following serum-free medium supplemented with lithium chloride or L-glutthione was used for humans.
  • Mesenchymal stem cells were cultured.
  • the cultured cells were washed twice with PBS (-) and dispersed by incubating in PBS containing 0.05% trypsin and 0.2 mM EDTA for 2 minutes. It was resuspended with Trypsin inhibitor (Sigma: T6522) derived from a plant not containing sucrose. Furthermore, the cultured cells were washed three times with serum-free DMEM medium, and the number of cells was counted with a Coulter counter (Z1 single, Coulter). The resuspended cells were then replated at a density of 5000 Zcm 2 on 96-well plates using the following media.
  • Trypsin inhibitor Sigma: T6522
  • the proliferation ability of the cells cultured in the culture medium 4-4 compared with the proliferation ability of the cells cultured in the culture medium 4-2 and the culture medium 2 was as follows. Remarkably high strength (values indicate the average value of the experiments conducted in triplicate, SD).
  • the growth ability of the cells cultured in the culture medium 4-5 was as follows. Remarkably high strength (values indicate the average value of the experiments conducted in triplicate, SD).
  • Bone marrow fluid from the iliac was collected from the patient.
  • the mononuclear cell fraction (including MSC) was separated from the collected iliac bone marrow fluid by density gradient centrifugation.
  • 24 well plates were seeded at a density of IX 10 6 (nucleated) cells Zcm 2 and cultured at 37 ° C in a CO incubator in the presence of 5% CO. .
  • DMEMZMCDB 1: 1 as a basal medium with the following additives and used for culture (Medium 1) No addition
  • medium 3 and medium 10 exhibiting a high cell proliferation effect in subculture had a low ability to promote cell proliferation in the primary culture of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. This is probably because it affects the proliferation of many hematopoietic cells other than mesenchymal stem cells contained in the bone marrow mononuclear cell fraction. These non-adherent hematopoietic cells are removed every time the medium is changed, and hardly exist after one subculture. However, when 1 to 3 growth factors contained in medium 10 were removed (medium 10-1 to medium 10-7), the proliferation ability of mesenchymal stem cells under serum-free conditions was improved. For example, in culture medium 10-1, the proliferation of cultured cells was promoted.
  • culture medium 10-4 clearly improved the proliferation ability of cultured cells.
  • culture medium 10-7 the proliferative capacity of cultured cells is significantly increased. (The figure shows the average value of the experiment conducted in triplicate.) Thus, it was shown that the optimal composition of the serum replacement substance changes when many cells other than mesenchymal stem cells, such as hematopoietic cells, are present in the serum-free medium.
  • mouse mesenchymal cell line 10T1Z2 (provided by RIKEN BioResource Center)
  • Chinese ovum and Muster ovary Cell lines
  • CHO cells (provided by RIKEN Bioresource Center)
  • human Hiff fibroblasts (Fibroblast) (provided by Human Science Research Resource Bank) were cultured in the following media.
  • 10T1Z2 cells, CHO cells, and Fibroblast were placed in a 10 cm plate containing DMEM medium containing 10% ushi fetal serum, 100 units Zml penicillin, and 100 ⁇ g Zml streptomycin in a CO incubator in the presence of 5% CO. Incubate at 37 ° C
  • Subconfluent cells were washed twice with PBS (—) and detached from the plate by incubating for 2 minutes in PBS containing 0.05% trypsin and 0.2 mM EDTA. .
  • the detached cells were resuspended with plant-derived Trypsin inhibit or (Sigma: T6522) without serum.
  • Cells in DMEM medium without serum 3 After washing twice, the number of cells was counted with a Coulter counter (Z1 single, manufactured by Coulter).
  • the cell line 10T1Z2 cells cultured in medium 10-5 showed almost the same cell proliferating ability as the cell line 10T1Z2 cells cultured in medium 2 (the values are in triplicate).
  • the mean value of the experiment conducted at is shown as SD.
  • CHO cells cultured in medium 10-7 showed effective cell growth ability (the figures show the mean value SD of the experiment conducted in triplicate). ).
  • the growth ability of 1:01) 1 & st cultured in medium 10-8 compared to the growth capacity of Fibroblast cultured in medium 2 was 8 It was significantly higher on the first day (the figure shows the mean value of the experiment conducted in triplicate, SD).
  • animal cells can be proliferated while maintaining their characteristics at a rate equivalent to or higher than that when cultured in a medium containing 10% serum even in a serum-free medium.
  • a medium containing 10% serum even in a serum-free medium.
  • human mesenchymal stem cells can be continuously subcultured while maintaining their characteristics (bone differentiation ability, fat content ability, etc.) at a high level.

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Abstract

　特定の増殖因子及び少なくとも１つのリン脂質を含有する培地、並びに当該培地を作製するための組成物、キット及び方法を提供する。これにより、無血清培地又は低血清培地でありながら血清含有培地に匹敵する動物細胞増殖促進効果を有する技術を実現する。

Description

明 細 書
動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤、キット及びこれらの利 用
技術分野
[0001] 本発明は、動物細胞の培養培地に添加する組成物、キット及びその利用に関する ものであり、より詳細には、動物細胞を、無血清条件下又は低血清条件下において 培養するための糸且成物、キット及びその利用に関するものである。
背景技術
[0002] 間葉系幹細胞は、骨髄等の組織中に存在する体性幹細胞の一つであり、脂肪細 胞、骨細胞、軟骨細胞等へ分化する多分化能、及び自己増殖能を有する幹細胞とし て知られている。現在、間葉系幹細胞は、再生医療分野において移植用細胞として 利用されており、間葉系幹細胞の適用対象である疾患は、骨欠損、軟骨欠損、歯周 病、心筋梗塞、難治性皮膚疾患、骨粗しょう症、変形性関節病、脊髄損傷、造血支 持、臓器移植での拒絶反応抑制等、多岐にわたる。今後、間葉系幹細胞の適用対 象となる疾患は、さらに増えるものと予想される（例えば、脳梗塞、閉塞性動脈硬化症 、腎臓疾患等)。
[0003] この間葉系幹細胞は、骨髄、骨膜等の組織中に存在して ヽる。これらの生体組織 力も採取された間葉系幹細胞を、増殖させ、さらに所望の細胞へと分化させることに より、組織再生医療において利用され得る組織を調製する。しカゝしながら、生体組織 中に存在する間葉系幹細胞の数は少量であるので、間葉系幹細胞を移植用細胞と して用いるためには、組織力も採取された細胞を十分に増殖させる必要がある。
[0004] 通常、動物細胞の培養は、ゥシ胎仔血清等の非ヒト動物由来の血清が 5〜20%添 カロされた培地を用いて行われる。この血清は、生体外での細胞の成長及び Z又は増 殖を促進するための栄養源、又はホルモン等の生理活性物質の供給源として用いら れている。し力しながら、血清は、非常に高価であり、また天然製品であるがゆえに口 ット毎に成分の差が生じる。また、培養後の細胞力も血清由来のタンパク質等を除去 するために精製する必要があり、作業が煩雑になる。さらに、血清中に混入している 未知の病原体 (ウィルス、病原性プリオン等）により培養細胞が汚染される危険性が ある。
[0005] 一方、非ヒト動物由来の血清を用いることなく動物細胞を培養する技術が開発され ている。例えば、自家移植治療 (すなわち、患者から採取した細胞を培養後に同じ患 者へと戻す治療法）において用いられる細胞の培養には、その同じ患者から得た自 家ヒト血清を用いる。これにより、培養細胞の汚染は回避される。しかし、血清作製の ために大量の血液が必要となるため、患者に多大な負担を与える。
[0006] これらの問題を回避するために、血清を含まな!/、培地 (無血清培地)又は血清含有 量の低い培地 (低血清培地）の開発が進められている。培地中の血清濃度を低下さ せることにより、細胞はその増殖性を著しく低下させるか又は死滅する。このため、細 胞の増殖性を失うことなく培養することが可能な培地を作製するために、血清に替わ る細胞増殖因子を培地中に添加する必要がある。従来、血清に替わる細胞増殖因 子として、各種ペプチドホルモン、増殖因子等が用いられている（例えば、特許文献 1及び 2を参照のこと）。このような無血清培地として、例えば、 HAMの F12培地を基 礎培地とし、この培地中にインスリン、トランスフェリン等を添加した無血清培地が知ら れている。
[0007] 無血清培地に増殖因子以外に脂肪酸を含ませることにより、治療に適用するため の軟骨細胞を培養する方法もまた知られている（例えば、特許文献 3及び 4を参照の こと)。さらに、特許文献 5には、神経幹細胞を長期培養するための方法及び組成物 が記載されている。
〔特許文献 1〕
日本国公開特許公報「特開平 8— 308561号公報 (公開日： 1996年 11月 26日）」 〔特許文献 2〕
日本国公開特許公報「特開平 9— 191874号公報 (公開日： 1997年 7月 29日）」 〔特許文献 3〕
日本国公開特許公報「特表 2005— 515777号公報（平成 17年 6月 2日公開）」 〔特許文献 4〕
日本国公開特許公報「特表 2002— 529071号公報（平成 14年 9月 10日公開）」 〔特許文献 5〕
日本国公開特許公報「特表 2003— 516141号公報（平成 15年 5月 13日公開）」 発明の開示
[0008] し力しながら、上記のような培地を用いた場合においても、 10%血清含有培地と比 較して、必ずしも十分な細胞増殖促進効果を得るに至っていない。特に、従来の技 術では、大量培養に必須の長期培養ができな力つた。
[0009] 本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、無血清培地で ありながら 10%血清含有培地に匹敵する動物細胞増殖促進効果を有する技術を提 供することにある。
[0010] 本発明に係る培地用添加剤は、動物細胞を無血清培養するために、 FGF、 PDG F、 TGF— |8及び HGF力 なる群より選択される少なくとも 3つの増殖因子、並びに 少なくとも 1つのリン脂質を含有することを特徴としている。
[0011] 本発明に係る培地用添加剤において、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフ ォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファ チジルエタノールァミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロール 力もなる群より選択されることが好まし 、。
[0012] 本発明に係る培地用添加剤は、少なくとも 1つの脂肪酸をさらに含有することが好ま しい。
[0013] 本発明に係る培地用添加剤において、上記脂肪酸は、リノール酸、ォレイン酸、リノ レイン酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、ノ ルミチン酸、及びステアリン 酸力 なる群より選択されることが好ましぐ栄養学的必須脂肪酸であるリノール酸、リ ノレイン酸及びァラキドン酸が特に好まし 、。
[0014] 本発明に係る培地用添加剤は、コレステロールをさらに含有してもよい。
[0015] 本発明に係る培地用添加剤は、 EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸ィ匕合物 力もなる群より選択される少なくとも 2つの因子をさらに含有してもよい。
[0016] 本発明に係る培地用添加剤は、脂質酸化防止剤をさらに含有してもよい。
[0017] 本発明に係る培地用添加剤において、上記脂質酸化防止剤は DL— a—トコフエ ロールアセテート（ビタミン E)、 L—グルタチオン（L— glutathione)又は 2—メルカプ トエタノール（2— mercaptoethanol)であることが好ましいが、他の還元剤であって ちょい。
[0018] 本発明に係る培地用添加剤は、塩化リチウムをさらに含有してもよい。
[0019] 本発明に係る培地用添加剤は、界面活性剤をさらに含有してもよい。
[0020] 本発明に係る培地用添加剤において、上記界面活性剤は Pluronic F— 68又は
Tween 80であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
[0021] 本発明に係る培地用添加剤は、インスリン、トランスフェリン (transferrin)及びセレ ネート（selenate)をさらに含有してもよい。
[0022] 本発明に係る培地用添加剤は、デキサメタゾン（Dexamethasone)、または他のグ ルココルチコイドをさらに含有してもよい。
[0023] 本発明に係る培地用添加剤において、上記動物細胞は未分ィ匕細胞であることが好 ましい。
[0024] 本発明に係る培地用添加剤において、上記動物細胞は間葉系幹細胞であることが 好ましい。
[0025] 本発明に係る培地用添加剤において、上記動物細胞は特別な分ィ匕能を失って未 分化状態に近 、細胞 (例えば、サル腎臓由来の cos細胞)であることが好まし 、。
[0026] 本発明に係る培養培地は、動物細胞を無血清培養するために上記の培地用添カロ 剤を構成する成分を含有して 、ることを特徴として 、る。
[0027] 本発明に係る培養方法は、動物細胞を無血清培養するために上記の培養培地中 にて動物細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。
[0028] 本発明に係る培地用添加剤キットは、動物細胞を無血清培養するために上記の培 地用添加剤を備えて 、ることを特徴として 、る。
[0029] 本発明に係る培地用添加剤キットは、動物細胞を無血清培養するために、 FGF、 P
DGF、 TGF— |8及び HGF力 なる群より選択される少なくとも 3つの増殖因子、並 びに少なくとも 1つのリン脂質を別々に備えていることを特徴としている。
[0030] 本発明に係る培地用添加剤キットは、少なくとも 1つの脂肪酸をさらに備えているこ とが好ましい。
[0031] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、 リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォス ファチジルエタノールァミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロー ルカもなる群より選択されることが好まし 、。
[0032] 本発明に係る培地用添加剤キットは、脂肪酸はリノール酸、ォレイン酸、リノレイン 酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸から なる群より選択されることが好まし 、。
[0033] 本発明に係る培地用添加剤キットは、コレステロールをさらに備えていてもよい。
[0034] 本発明に係る培地用添加剤キットは、 EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化 合物からなる群より選択される少なくとも 2つの因子をさらに備えていてもよい。
[0035] 本発明に係る培地用添加剤キットは、脂質酸ィ匕防止剤をさらに備えていてもよい。
[0036] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、脂質酸化防止剤は DL— a トコフエ ロールアセテート（ビタミン E)、 L グルタチオン（L— glutathione)又は 2—メルカプ トエタノール（2— mercaptoethanol)であることが好ましいが、他の還元剤であって ちょい。
[0037] 本発明に係る培地用添加剤キットは、塩化リチウムをさらに備えていてもよい。
[0038] 本発明に係る培地用添加剤キットは、界面活性剤をさらに備えていてもよい。
[0039] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、界面活性剤は Pluronic F— 68又は
Tween 80であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
[0040] 本発明に係る培地用添加剤キットは、インスリン、トランスフェリン及びセレネートをさ らに備えていてもよい。
[0041] 本発明に係る培地用添加剤キットは、デキサメタゾン、または他のダルココルチコィ ドをさらに備えていてもよい。
[0042] 本発明に係る培地用添加剤キットにぉ 、て、動物細胞は未分ィ匕細胞であることが 好ましい。
[0043] 本発明に係る培地用添加剤キットにぉ 、て、動物細胞は間葉系幹細胞であること が好ましい。
[0044] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記動物細胞は特別な分ィ匕能を失つ て未分ィ匕状態に近い細胞 (例えば、サル腎臓由来の COS細胞)であることが好まし い。
[0045] 本発明に係る培養培地は、動物細胞を無血清培養するために、上記の培地用添 加剤キットに備えられた成分を含有して 、ることを特徴として 、る。
[0046] 本発明に係る培養方法は、動物細胞を無血清培養するために、上記の培養培地 中にて動物細胞を培養する工程を包含することを特徴として 、る。
[0047] 本発明に係る培養方法は、動物細胞を無血清培養するために、 FGF、 PDGF、 T GF— |8及び HGF力 なる群より選択される少なくとも 3つの増殖因子、並びに少なく とも 1つのリン脂質を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴として いる。
[0048] 本発明に係る培養方法は、上記基礎培地に少なくとも 1つの脂肪酸をさらに添加す る工程を包含することが好まし!/、。
[0049] 本発明に係る培地用添加剤は、分化能を維持したまま幹細胞を連続継代培養する ために、 FGF、 PDGF、 TGF— j8及び HGFからなる群より選択される少なくとも 3つ の増殖因子、並びに少なくとも 1つのリン脂質を含有することを特徴としている。
[0050] 本発明に係る培地用添加剤は、少なくとも 1つの脂肪酸をさらに含有することが好ま しい。
[0051] 本発明に係る培地用添加剤キットは、分化能を維持したまま幹細胞を連続継代培 養するために、 FGF、 PDGF、 TGF— |8及び HGF力 なる群より選択される少なくと も 3つの増殖因子、並びに少なくとも 1つのリン脂質を備えていることを特徴としている
[0052] 本発明に係る培地用添加剤キットは、少なくとも 1つの脂肪酸をさらに備えているこ とが好ましい。
[0053] 本発明に係る培養培地は、 FGF、 PDGF、 TGF— β及び HGFからなる群より選択 される少なくとも 3つの増殖因子、並びに少なくとも 1つのリン脂質を含有していること を特徴としている。
[0054] 本発明に係る培養培地は、少なくとも 1つの脂肪酸をさらに含有していることが好ま しい。
[0055] 本発明に係る培養方法は、分化能を維持したまま幹細胞を連続継代培養するため に、 FGF、 PDGF、 TGF— j8及び HGFからなる群より選択される少なくとも 3つの増 殖因子、並びに少なくとも 1つのリン脂質を、基礎培地に同時に添加する工程を包含 することを特徴としている。
[0056] 本発明に係る培養方法は、上記基礎培地に少なくとも 1つの脂肪酸をさらに添加す る工程を包含することが好まし!/、。
[0057] 本発明に係る培地用添加剤は、初代培養幹細胞を培養するために、 PDGF、少な くとも 1つのリン脂質、少なくとも 1つの脂肪酸、並びに EGF、 CTGF、 VEGF及びァ スコルビン酸ィ匕合物力 なる群より選択される少なくとも 2つの因子を含有することを 特徴としている。
[0058] 本発明に係る培地添加剤は、 FGF、 TGF - β及び HGF力 なる群より選択される 少なくとも 1つの因子をさらに含有してもよい。
[0059] 本発明に係る培地用添加剤にぉ 、て、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフ ォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファ チジルエタノールァミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロール 力もなる群より選択されることが好まし 、。
[0060] 本発明に係る培地用添加剤において、上記脂肪酸は、リノール酸、ォレイン酸、リノ レイン酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、ノ ルミチン酸、及びステアリン 酸力 なる群より選択されることが好ましぐ栄養学的必須脂肪酸であるリノール酸、リ ノレイン酸及びァラキドン酸が特に好まし 、。
[0061] 本発明に係る培地用添加剤は、コレステロールをさらに含有してもよい。
[0062] 本発明に係る培地用添加剤は、脂質酸化防止剤をさらに含有してもよい。
[0063] 本発明に係る培地用添加剤において、上記脂質酸化防止剤は DL— a—トコフエ ロールアセテート（ビタミン E)であることが好まし 、。
[0064] 本発明に係る培地用添加剤は、界面活性剤をさらに含有してもよ ヽ。
[0065] 本発明に係る培地用添加剤において、上記界面活性剤は Pluronic F— 68又は
Tween 80であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
[0066] 本発明に係る培地用添加剤は、インスリン、トランスフェリン (transferrin)及びセレ ネート（selenate)をさらに含有してもよい。 [0067] 本発明に係る培地用添加剤は、デキサメタゾン（Dexamethasone)、または他のグ ルココルチコイドをさらに含有してもよい。
[0068] 本発明に係る培地用添加剤キットは、初代培養幹細胞を培養するために、 PDGF 、少なくとも 1つのリン脂質、少なくとも 1つの脂肪酸、並びに EGF、 CTGF、 VEGF 及びァスコルビン酸ィ匕合物からなる群より選択される少なくとも 2つの因子を備えてい ることを特徴としている。
[0069] 本発明に係る培地添加剤キットは、 FGF、 TGF- β及び HGF力 なる群より選択 される少なくとも 1つの因子をさらに備えてもょ 、。
[0070] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、 リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォス ファチジルエタノールァミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロー ルカもなる群より選択されることが好ま 、。
[0071] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記脂肪酸は、リノール酸、ォレイン 酸、リノレイン酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸、ノ レミトイル酸、パルミチン酸、及びステ アリン酸力 なる群より選択されることが好ましぐ栄養学的必須脂肪酸であるリノール 酸、リノレイン酸及びァラキドン酸が特に好ましい。
[0072] 本発明に係る培地用添加剤キットは、コレステロールをさらに備えていてもよい。
[0073] 本発明に係る培地用添加剤キットは、脂質酸ィ匕防止剤をさらに備えていてもよい。
[0074] 本発明に係る培地用添加剤キットにぉ 、て、上記脂質酸化防止剤は DL—ひ—トコ フエロールアセテート（ビタミン E)であることが好まし!/、。
[0075] 本発明に係る培地用添加剤キットは、界面活性剤をさらに備えていてもよい。
[0076] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記界面活性剤は Pluronic F—68 又は Tween 80であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
[0077] 本発明に係る培地用添加剤キットは、インスリン、トランスフェリン (transferrin)及 びセレネート (selenate)をさらに備えて 、てもよ ヽ。
[0078] 本発明に係る培地用添加剤キットは、デキサメタゾン（Dexamethasone)、または 他のダルココルチコイドをさらに備えて 、てもよ 、。
[0079] 本発明に係る培養方法は、初代培養幹細胞を培養するために、 PDGF、少なくとも 1つのリン脂質、少なくとも 1つの脂肪酸、並びに EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコル ビン酸ィ匕合物力 なる群より選択される少なくとも 2つの因子を基礎培地に同時に添 加する工程を包含することを特徴として 、る。
[0080] 本発明に係る培養方法は、上記基礎培地に、 FGF、 TGF- β及び HGF力 なる 群より選択される少なくとも 1つの因子を添加する工程をさらに包含してもよい。
[0081] 本発明に係る培地用添加剤は、マウス線維芽細胞を連続継代培養するために、 T GF - β、 PDGF、少なくとも 1つのリン脂質、少なくとも 1つの脂肪酸、並びに EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物力 なる群より選択される少なくとも 2つの 因子を含有することを特徴として 、る。
[0082] 本発明に係る培地用添加剤は、 FGF及び/又は HGFをさらに含有してもよい。
[0083] 本発明に係る培地用添加剤にぉ 、て、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフ ォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファ チジルエタノールァミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロール 力もなる群より選択されることが好まし 、。
[0084] 本発明に係る培地用添加剤において、上記脂肪酸は、リノール酸、ォレイン酸、リノ レイン酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、ノ ルミチン酸、及びステアリン 酸力 なる群より選択されることが好ましぐ栄養学的必須脂肪酸であるリノール酸、リ ノレイン酸及びァラキドン酸が特に好まし 、。
[0085] 本発明に係る培地用添加剤は、コレステロールをさらに含有してもよい。
[0086] 本発明に係る培地用添加剤は、脂質酸化防止剤をさらに含有してもよい。
[0087] 本発明に係る培地用添加剤において、上記脂質酸化防止剤は DL— a—トコフエ ロールアセテート（ビタミン E)であることが好まし 、。
[0088] 本発明に係る培地用添加剤は、界面活性剤をさらに含有してもよ ヽ。
[0089] 本発明に係る培地用添加剤において、上記界面活性剤は Pluronic F— 68又は
Tween 80であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
[0090] 本発明に係る培地用添加剤は、インスリン、トランスフェリン (transferrin)及びセレ ネート（selenate)をさらに含有してもよい。
[0091] 本発明に係る培地用添加剤は、デキサメタゾン（Dexamethasone)、または他のグ ルココルチコイドをさらに含有してもよい。
[0092] 本発明に係る培地用添加剤キットは、マウス線維芽細胞を連続継代培養するため に、 TGF- β、 PDGF、少なくとも 1つのリン脂質、少なくとも 1つの脂肪酸、並びに E GF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも 2 つの因子を備えて 、ることを特徴として 、る。
[0093] 本発明に係る培地用添加剤キットは、 FGF及び Z又は HGFをさらに備えていても よい。
[0094] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、 リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォス ファチジルエタノールァミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロー ルカもなる群より選択されることが好ま 、。
[0095] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記脂肪酸は、リノール酸、ォレイン 酸、リノレイン酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸、ノ レミトイル酸、パルミチン酸、及びステ アリン酸力 なる群より選択されることが好ましぐ栄養学的必須脂肪酸であるリノール 酸、リノレイン酸及びァラキドン酸が特に好ましい。
[0096] 本発明に係る培地用添加剤キットは、コレステロールをさらに備えていてもよい。
[0097] 本発明に係る培地用添加剤キットは、脂質酸ィ匕防止剤をさらに備えていてもよい。
[0098] 本発明に係る培地用添加剤キットにぉ 、て、上記脂質酸化防止剤は DL—ひ—トコ フエロールアセテート（ビタミン E)であることが好まし!/、。
[0099] 本発明に係る培地用添加剤キットは、界面活性剤をさらに備えていてもよい。
[0100] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記界面活性剤は Pluronic F—68 又は Tween 80であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
[0101] 本発明に係る培地用添加剤キットは、インスリン、トランスフェリン (transferrin)及 びセレネート (selenate)をさらに備えて 、てもよ ヽ。
[0102] 本発明に係る培地用添加剤キットは、デキサメタゾン（Dexamethasone)、または 他のダルココルチコイドをさらに備えて 、てもよ 、。
[0103] 本発明に係る培養方法は、マウス線維芽細胞を連続継代培養するために、 TGF- β、 PDGF、少なくとも 1つのリン脂質、少なくとも 1つの脂肪酸、並びに EGF、 CTG F、 VEGF及びァスコルビン酸ィ匕合物力 なる群より選択される少なくとも 2つの因子 を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴として 、る。
[0104] 本発明に係る培養方法は、上記基礎培地に、 FGF及び Z又は HGFを添加するェ 程をさらに包含してもよい。
[0105] 本発明に係る培地用添加剤は、チャイニーズノヽムスター卵巣由来細胞を連続継代 培養するために、 PDGF、少なくとも 1つのリン脂質、少なくとも 1つの脂肪酸、並びに EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくと も 2つの因子を含有することを特徴としている。
[0106] 本発明に係る培地用添加剤は、 FGF、 TGF - β及び HGFからなる群より選択さ れる少なくとも 1つの因子をさらに含有してもよい。
[0107] 本発明に係る培地用添加剤において、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフ ォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファ チジルエタノールァミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロール 力もなる群より選択されることが好まし 、。
[0108] 本発明に係る培地用添加剤において、上記脂肪酸は、リノール酸、ォレイン酸、リノ レイン酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、ノ ルミチン酸、及びステアリン 酸力 なる群より選択されることが好ましぐ栄養学的必須脂肪酸であるリノール酸、リ ノレイン酸及びァラキドン酸が特に好まし 、。
[0109] 本発明に係る培地用添加剤は、コレステロールをさらに含有してもよい。
[0110] 本発明に係る培地用添加剤は、脂質酸化防止剤をさらに含有してもよい。
[0111] 本発明に係る培地用添加剤において、上記脂質酸化防止剤は DL— a—トコフエ ロールアセテート（ビタミン E)であることが好まし 、。
[0112] 本発明に係る培地用添加剤は、界面活性剤をさらに含有してもよい。
[0113] 本発明に係る培地用添加剤において、上記界面活性剤は Pluronic F— 68又は
Tween 80であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
[0114] 本発明に係る培地用添加剤は、インスリン、トランスフェリン (transferrin)及びセレ ネート（selenate)をさらに含有してもよい。
[0115] 本発明に係る培地用添加剤は、デキサメタゾン（Dexamethasone)、または他のグ ルココルチコイドをさらに含有してもよい。
[0116] 本発明に係る培地用添加剤キットは、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞を連続 継代培養するために、 PDGF、少なくとも 1つのリン脂質、少なくとも 1つの脂肪酸、並 びに EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物からなる群より選択される少な くとも 2つの因子を備えて 、ることを特徴として！/、る。
[0117] 本発明に係る培地用添加剤キットは、 FGF、 TGF- β及び HGF力 なる群より選 択される少なくとも 1つの因子をさらに備えて 、てもよ 、。
[0118] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、 リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォス ファチジルエタノールァミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロー ルカもなる群より選択されることが好ま 、。
[0119] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記脂肪酸は、リノール酸、ォレイン 酸、リノレイン酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸、ノ レミトイル酸、パルミチン酸、及びステ アリン酸力 なる群より選択されることが好ましぐ栄養学的必須脂肪酸であるリノール 酸、リノレイン酸及びァラキドン酸が特に好ましい。
[0120] 本発明に係る培地用添加剤キットは、コレステロールをさらに備えていてもよい。
[0121] 本発明に係る培地用添加剤キットは、脂質酸ィ匕防止剤をさらに備えていてもよい。
[0122] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記脂質酸化防止剤は DL— a—トコ フエロールアセテート（ビタミン E)であることが好まし!/、。
[0123] 本発明に係る培地用添加剤キットは、界面活性剤をさらに備えていてもよい。
[0124] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記界面活性剤は Pluronic F—68 又は Tween 80であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
[0125] 本発明に係る培地用添加剤キットは、インスリン、トランスフェリン (transferrin)及 びセレネート (selenate)をさらに備えて 、てもよ ヽ。
[0126] 本発明に係る培地用添加剤キットは、デキサメタゾン（Dexamethasone)、または 他のダルココルチコイドをさらに備えて 、てもよ 、。
[0127] 本発明に係る培養方法は、チャイニーズノ、ムスター卵巣由来細胞を連続継代培養 するために、 PDGF、少なくとも 1つのリン脂質、少なくとも 1つの脂肪酸、並びに EG F、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸ィ匕合物からなる群より選択される少なくとも 2 つの因子を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴としている。
[0128] 本発明に係る培養方法は、上記基礎培地に、 FGF、 TGF- β及び HGFカゝらなる 群より選択される少なくとも 1つの因子を添加する工程をさらに包含してもよい。
[0129] 本発明に係る培地用添加剤は、ヒト皮膚由来線維芽細胞を連続継代培養するため に、 FGF、少なくとも 1つのリン脂質、少なくとも 1つの脂肪酸、並びに EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸ィ匕合物力 なる群より選択される少なくとも 2つの因子を含 有することを特徴としている。
[0130] 本発明に係る培地用添加剤は、 TGF - β、 HGF及び PDGF力もなる群より選択さ れる少なくとも 1つの因子をさらに含有してもよい。
[0131] 本発明に係る培地用添加剤において、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフ ォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファ チジルエタノールァミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロール 力もなる群より選択されることが好まし 、。
[0132] 本発明に係る培地用添加剤において、上記脂肪酸は、リノール酸、ォレイン酸、リノ レイン酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、ノ ルミチン酸、及びステアリン 酸力 なる群より選択されることが好ましぐ栄養学的必須脂肪酸であるリノール酸、リ ノレイン酸及びァラキドン酸が特に好まし 、。
[0133] 本発明に係る培地用添加剤は、コレステロールをさらに含有してもよい。
[0134] 本発明に係る培地用添加剤は、脂質酸化防止剤をさらに含有してもよい。
[0135] 本発明に係る培地用添加剤において、上記脂質酸化防止剤は DL— a—トコフエ ロールアセテート（ビタミン E)であることが好まし 、。
[0136] 本発明に係る培地用添加剤は、界面活性剤をさらに含有してもよい。
[0137] 本発明に係る培地用添加剤において、上記界面活性剤は Pluronic F— 68又は
Tween 80であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
[0138] 本発明に係る培地用添加剤は、インスリン、トランスフェリン (transferrin)及びセレ ネート（selenate)をさらに含有してもよい。
[0139] 本発明に係る培地用添加剤は、デキサメタゾン（Dexamethasone)、または他のグ ルココルチコイドをさらに含有してもよい。
[0140] 本発明に係る培地用添加剤キットは、ヒト皮膚由来線維芽細胞を連続継代培養す るために、 FGF、少なくとも 1つのリン脂質、少なくとも 1つの脂肪酸、並びに EGF、 C
TGF、VEGF及びァスコルビン酸化合物力 なる群より選択される少なくとも 2つの 因子を備えて 、ることを特徴として 、る。
[0141] 本発明に係る培地用添加剤キットは、 TGF— β、 HGF及び PDGF力もなる群より 選択される少なくとも 1つの因子をさらに備えて 、てもよ 、。
[0142] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、 リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォス ファチジルエタノールァミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロー ルカもなる群より選択されることが好ま 、。
[0143] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記脂肪酸は、リノール酸、ォレイン 酸、リノレイン酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸、ノ レミトイル酸、パルミチン酸、及びステ アリン酸力 なる群より選択されることが好ましぐ栄養学的必須脂肪酸であるリノール 酸、リノレイン酸及びァラキドン酸が特に好ましい。
[0144] 本発明に係る培地用添加剤キットは、コレステロールをさらに備えていてもよい。
[0145] 本発明に係る培地用添加剤キットは、脂質酸ィ匕防止剤をさらに備えていてもよい。
[0146] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記脂質酸化防止剤は DL—ひ—トコ フエロールアセテート（ビタミン Ε)であることが好まし!/、。
[0147] 本発明に係る培地用添加剤キットは、界面活性剤をさらに備えていてもよい。
[0148] 本発明に係る培地用添加剤キットにおいて、上記界面活性剤は Pluronic F—68 又は Tween 80であることが好ましいが、他の界面活性剤であってもよい。
[0149] 本発明に係る培地用添加剤キットは、インスリン、トランスフェリン (transferrin)及 びセレネート (selenate)をさらに備えて 、てもよ ヽ。
[0150] 本発明に係る培地用添加剤キットは、デキサメタゾン（Dexamethasone)、または 他のダルココルチコイドをさらに備えて 、てもよ 、。
[0151] 本発明に係る培養方法は、ヒト皮膚由来線維芽細胞を連続継代培養するために、 FGF、少なくとも 1つのリン脂質、少なくとも 1つの脂肪酸、並びに EGF、 CTGF、 VE GF及びァスコルビン酸ィ匕合物力 なる群より選択される少なくとも 2つの因子を、基 礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴として ヽる。
[0152] 本発明に係る培養方法は、上記基礎培地に、 TGF— β、 HGFおよび PDGFから なる群より選択される少なくとも 1つの因子を添加する工程をさらに包含してもよい。
[0153] 本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分か るであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであ ろう。
図面の簡単な説明
[0154] [図 1]無血清培地への血清代替物質の添加によるヒト間葉系幹細胞 (MSC)の増殖 に対する影響を示した図である。
[図 2]無血清培地中で培養したヒト間葉系幹細胞 (MSC)の形態学的な変化を示す 図である。
[図 3]無血清培地中で培養したヒト間葉系幹細胞 (MSC)の骨分化能の評価を示す 図である。
[図 4]無血清培地中で培養したヒト間葉系幹細胞 (MSC)の脂肪分化能の評価を示 す図である。
[図 5]無血清培地中で培養したヒト間葉系幹細胞 (MSC)の軟骨分化能の評価を示 す図である。
[図 6]無血清培地中で培養したヒト間葉系幹細胞 (MSC)の軟骨分化能の評価を示 す図である。
[図 7]無血清培地への血清代替物質の添加によるヒト間葉系幹細胞 (MSC)の増殖 に対する影響を示した図である。
[図 8]無血清培地への血清代替物質の添加によるヒト間葉系幹細胞 (MSC)の増殖 に対する影響を示した図である。
[図 9]無血清培地への血清代替物質の添加によるヒト間葉系幹細胞 (MSC)の増殖 に対する影響を示した図である。
[図 10]無血清培地への血清代替物質の添カ卩による C2C12細胞の増殖に対する影 響を示した図である。 [図 11]無血清培地への血清代替物質の添カ卩によるヒト間葉系幹細胞 (MSC)の細胞 増殖シグナル伝達系に対する影響を示した図である。
[図 12]無血清培地への血清代替物質の添加によるヒト間葉系幹細胞 (MSC)の細胞 増殖シグナル伝達系に対する影響を示した図である。
[図 13]間葉系幹細胞 (MSC)の無血清培地に添加する血清代替物質を示す図であ る。
[図 14]C2C 12細胞の無血清培地に添加する血清代替物質を示す図である。
[図 15(a)]無血清培地への血清代替物質の添加によるヒト間葉系幹細胞 (MSC)の増 殖に対する影響を示した図である。
[図 15(b)]無血清培地への血清代替物質の添加によるヒト間葉系幹細胞 (MSC)の増 殖に対する影響を示した図である。
[図 16(a)]無血清培地への血清代替物質の添加による初代ヒト間葉系幹細胞 (MSC) の増殖に対する影響を示した図である。
[図 16(b)]無血清培地への血清代替物質の添加による初代ヒト間葉系幹細胞 (MSC) の増殖に対する影響を示した図である。
[図 17(a)]無血清培地への血清代替物質の添カ卩による 10T1Z2細胞の増殖に対す る影響を示した図である。
[図 17(b)]無血清培地への血清代替物質の添加による CHO細胞の増殖に対する影 響を示した図である。
[図 17(c)]無血清培地への血清代替物質の添加によるヒトのヒフ由来の線維芽細胞（ Fibroblast)の増殖に対する影響を示した図である。
発明を実施するための最良の形態
上述したように、血清を含まな 、培地 (無血清培地）にお 、て増殖性を失わせること なく細胞を培養するために、各種ペプチドホルモン、増殖因子、脂質等が用いられて いる。しかし、これらの血清代替成分を添加した培地は、血清含有培地と比較して、 十分な細胞増殖促進効果を必ずしも有していない。そこで、本発明者らは、低血清（ 0. 5〜2%)の条件下であっても、 10%血清含有培地を用いる従来の培養方法に匹 敵するヒト間葉系幹細胞培養法を検討した。その結果、特定の増殖因子群と脂肪酸 複合物とを基礎培地に添加することにより、低血清条件下であっても 10%血清の場 合と同等以上の細胞増殖を導くことを見出し、ヒト間葉系幹細胞を培養するための「 基本培地」を完成させた。また、この条件をさらに検討することにより、特定の因子をさ らに添加することにより無血清条件下であっても 10%血清の場合と同等以上の細胞 増殖を導く条件を見出した。
[0156] 本発明を用いれば、動物細胞を低血清条件下又は無血清条件下の培養系におい て大量に増殖させることができる。特に、間葉系幹細胞のような再生医療用途を有す る細胞について、試験管内だけでなく工業規模での細胞増殖を実現し得、生産コス トを大きく低減し得る。
[0157] (1)動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤
本発明は、動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤を提供する。本発明 に係る培地用添加剤は、 FGF、 PDGF、 TGF- βおよび HGF力 なる群より選択さ れる少なくとも 3つの増殖因子、並びに少なくとも 1つのリン脂質を含有している。
[0158] 本発明に係る培地用添加剤が含有しているリン脂質としては、例えば、フォスファチ ジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリ ン、フォスファチジルエタノールァミン、フォスファチジルコリン及びフォスファチジルグ リセロールなどが挙げられ、本発明に係る培地用添加剤はこれらのリン脂質を単独で 含有しても組み合わせて含有してもよい。一実施形態において、本発明に係る培地 用添加剤はフォスファチジン酸とフォスファチジルコリンとを組み合わせて含有してい る。また、これらのリン脂質は、動物由来であっても、植物由来であってもよい。
[0159] 一実施形態において、本発明に係る培地用添加剤は、少なくとも 1つの脂肪酸をさ らに含有して 、ることが好ま 、。本実施形態に係る培地用添加剤が含有して 、る脂 肪酸としては、例えば、リノール酸、ォレイン酸、リノレイン酸、ァラキドン酸、ミリスチン 酸、ノルミトイル酸、パルミチン酸及びステアリン等が挙げられ、本実施形態に係る培 地用添加剤はこれらの脂肪酸を単独で含有しても組み合わせて含有してもよ!ヽ。ま た、本実施形態に係る培地用添加剤は、上記脂肪酸以外にさらにコレステロールを 含有していてもよい。
[0160] 本明細書中で使用される場合、 FGFは、線維芽細胞増殖因子 (FGF : fibroblast growth factor)ファミリ一力も選択される増殖因子が意図され、 FGF— 2 (bFGF )であることが好ましいが、 FGF— 1など他の FGFファミリ一力も選択されてもよい。ま た、本明細書中で使用される場合、 PDGFは、血小板由来増殖因子 (PDGF : platel et derived growth factor)ファミリーから選択される増殖因子が意図され、 PDG F— BBまたは PDGF— ABであることが好ましい。さらに、本明細書中で使用される 場合、 TGF— βは、トランスフォーミング増殖因子— β (TGF- β： transforming growth factor— j8 )ファミリ一力も選択される増殖因子が意図され、 TGF— β で
3 あることが好ましいが、他の TGF— βファミリーから選択されてもよい。
[0161] 本発明に係る培地用添加剤は、上皮増殖因子（EGF : epidermal growth fact or)、結合組織増殖因子（CTGF : connective tissue growth factor)、血管内 皮増殖因子（VEGF : vascular endothelial growth factor)及びァスコルビン 酸ィ匕合物からなる群より選択される少なくとも 2つの因子をさらに含有していてもよい。
[0162] 本明細書中で使用される場合、ァスコルビン酸ィ匕合物は、ァスコルビン酸 (ビタミン C)もしくはァスコルビン酸 2リン酸、またはこれらに類似する化合物が意図される。
[0163] なお、本発明に係る培地用添加剤に含有されている増殖因子は、天然のものであ つても、遺伝子組換えによって製造されたものであってもよい。
[0164] 1つの局面において、本発明に係る培地用添加剤は、脂質酸化防止剤を含有して いることが好ましい。一実施形態において、本実施形態に係る培地用添加剤に含有 される脂質酸化防止剤は、 DL- a—トコフエロールアセテート（ビタミン E)であり得る 。本発明に係る培地用添加剤はまた、界面活性剤をさらに含有していてもよい。一実 施形態にぉ ヽて、本実施形態に係る培地用添加剤に含有される界面活性剤は Plur onic F— 68または Tween 80であり得る。
[0165] 本発明に係る培地用添加剤は、インスリン、トランスフェリンおよびセレネートをさら に含有していてもよい。本明細書中で使用される場合、インスリンは、インスリン様増 殖因子であってもよぐ天然の細胞由来であっても、遺伝子組換えによって製造され たものでもよい。本発明に係る培地用添加剤はさらに、デキサメタゾン、あるいは他の ダルココルチコイドを含有して 、てもよ 、。
[0166] (2)動物細胞を無血清培養するためのキット 本発明は、動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤キットを提供する。本 発明に係る培地用添加剤キットは、 FGF、 PDGF、 TGF- βおよび HGF力 なる群 より選択される少なくとも 3つの増殖因子、並びに少なくとも 1つのリン脂質を備えてい る。本発明に係る培地用添加剤キットは、 FGF、 PDGF、 TGF— βおよび HGFから なる群より選択される少なくとも 3つの増殖因子と、少なくとも 1つのリン脂質とを同一 容器内に備えていても、これらの成分を別々に備えていてもよい。
[0167] 一実施形態において、本発明に係る培地用添加剤キットは、少なくとも 1つの脂肪 酸をさらに備えていることが好ましい。本実施形態に係る培地用添加剤キットは、 FG F、 PDGF、 TGF— βおよび HGFからなる群より選択される少なくとも 3つの増殖因 子と、少なくとも 1つのリン脂質と、少なくとも 1つの脂肪酸とを同一容器内に備えてい ても、これらの成分を別々に備えていてもよい。
[0168] 本明細書中で使用される場合、「組成物」は各主成分が一物質中に含有されてい る形態であり、「キット」は各主成分の少なくとも 1つが別物質中に含有されている形態 であることが意図される。よって、本発明に係る培地用添加剤キットに備えられている 増殖因子、リン脂質及び脂肪酸は、培地用添加剤について上述したものと同一であ ることが容易に理解される。
[0169] (3)動物細胞を無血清培養するための培養培地
本発明は、動物細胞を無血清培養するための培養培地を提供する。本発明に係る 培養培地は、 FGF、 PDGF、 TGF— βおよび HGFからなる群より選択される少なく とも 3つの増殖因子、並びに少なくとも 1つのリン脂質を含有している。本発明に係る 培養培地は、 FGF、 PDGF、 TGF— βおよび HGFからなる群より選択される少なく とも 3つの増殖因子と、少なくとも 1つのリン脂質とを含有していればよぐこれらの成 分は基礎培地に同時に添加されても別々に添加されてもよい。すなわち、本発明に 係る培養培地は、上述した培地用添加剤に含有されて ヽる成分または培地用添カロ 剤キット中に備えられて 、る成分を含んで 、ればよ 、と!/、える。
[0170] 一実施形態において、本発明に係る培養培地は、少なくとも 1つの脂肪酸をさらに 含有していることが好ましい。本実施形態に係る培地用添加剤キットは、 FGF、 PDG F、 TGF— βおよび HGF力 なる群より選択される少なくとも 3つの増殖因子と、少な くとも 1つのリン脂質と、少なくとも 1つの脂肪酸とを含有していればよぐこれらの成分 は基礎培地に同時に添加されても別々に添加されてもよい。すなわち、本発明に係 る培養培地は、上述した培地用添加剤に含有されて!ヽる成分または培地用添加剤 キット中に備えられて 、る成分を含んで 、ればよ 、と 、える。
[0171] 本発明に係る培養培地を構成するための基礎培地は、当該分野において周知の 動物細胞用培地であれば特に限定されず、好ましい基礎培地としては、例えば、 Ha m' s F12培地、 DMEM培地、 RPMI— 1640培地、 MCDB培地などが挙げられる 。これらの基礎培地は、単独で使用されても、複数を混合して使用されてもよい。一 実施形態において、本発明に係る培養培地を構成するための基礎培地は、 MCDB と DMEMとを 1： 1の比率で混合した培地が好ましい。
[0172] (4)動物細胞を無血清培養するための培養方法
本発明は、動物細胞を無血清培養するための培養方法を提供する。本発明に係る 培養方法は、 FGF、 PDGF、 TGF— βおよび HGFからなる群より選択される少なく とも 3つの増殖因子、並びに少なくとも 1つのリン脂質を含有している培養培地中にお いて動物細胞を培養する工程を包含している。上記培養培地は、少なくとも 1つの脂 肪酸をさらに含有していてもよい。すなわち、本発明に係る培養方法は、動物細胞を 培養する際に、上述した培養培地を用いればょ 、と 、える。
[0173] 一実施形態において、本発明に係る培養方法は、 FGF、 PDGF、 TGF— β及び HGF力 なる群より選択される少なくとも 3つの増殖因子、並びに少なくとも 1つのリン 脂質とを、基礎培地に同時に添加する工程を包含してもよい。上記基礎培地は、上 述したように当該分野にぉ 、て周知の動物細胞用培地であれば特に限定されな 、。
[0174] (5)さらなる用途
上述したように、本発明は、無血清培地であっても 10%血清含有培地において培 養した場合と同等又はそれ以上の速度で、動物細胞をその特性を保持したまま増殖 させることができる。本発明に従って幹細胞 (特に、ヒト間葉系幹細胞)を培養すると、 その特性 (骨分化能、脂肪分ィ匕能など)を高レベルに維持したまま連続的に継代培 養することができる。実施例に示すように、本発明に係る無血清培地を用いれば、培 養開始時の少なくとも 10000倍以上に細胞数を増やすことができる。すなわち、本発 明はまた、幹細胞を連続継代培養するための培地用添加剤、培地用添加剤キット、 培養培地及び培養方法を提供する。
[0175] 1つの局面において、本発明は、幹細胞を連続継代培養するための培地用添加剤 を提供する。本発明に係る培地用添加剤は、 FGF、 PDGF、 TGF- βおよび HGF 力もなる群より選択される少なくとも 3つの増殖因子、並びに少なくとも 1つのリン脂質 を含有している。一実施形態において、本発明に係る培地用添加剤は、少なくとも 1 つの脂肪酸をさらに含有して 、ることが好ま 、。
[0176] 他の局面において、本発明は、幹細胞を連続継代培養するための培地用添加剤 キットを提供する。本発明に係る培地用添加剤キットは、 FGF、 PDGF、 TGF- βお よび HGF力 なる群より選択される少なくとも 3つの増殖因子、並びに少なくとも 1つ のリン脂質を含有している。一実施形態において、本発明に係る培地用添加剤キット は、少なくとも 1つの脂肪酸をさらに含有して 、ることが好ま 、。
[0177] 別の局面において、本発明は、幹細胞を連続継代培養するための培養培地を提 供する。本発明に係る培養培地は、 FGF、 PDGF、 TGF- βおよび HGFからなる 群より選択される少なくとも 3つの増殖因子、並びに少なくとも 1つのリン脂質を含有し ている。一実施形態において、本発明に係る培養培地は、少なくとも 1つの脂肪酸を さらに含有して 、ることが好まし 、。
[0178] さらなる局面において、本発明は、幹細胞を連続継代培養するための培養方法を 提供する。本発明に係る培養方法は、 FGF、 PDGF、 TGF— βおよび HGFからな る群より選択される少なくとも 3つの増殖因子、並びに少なくとも 1つのリン脂質を含有 して 、る培養培地中にお 、て動物細胞を培養する工程を包含して 、る。上記培養培 地は、少なくとも 1つの脂肪酸をさらに含有していてもよい。すなわち、本発明に係る 培養方法は、幹細胞を連続継代培養する際に、上述した培養培地を用いればよいと いえる。
[0179] なお、実施例において詳述するように、本発明は、幹細胞などの未分化細胞に対し てより強い効果を示すが、特別な分ィ匕能を失って未分ィ匕状態に近い細胞 (例えば、 サル腎臓由来の COS細胞）の無血清条件での培養においても非常に有効である。 すなわち、本発明の適用対象となり得る細胞は、未分化細胞が好ましぐ未分化細胞 は、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹 細胞、脂肪,袓織幹細胞、脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ 球系前駆細胞、 NK前駆細胞、胚性幹細胞等の幹細胞、または線維芽細胞であり得 、間葉系幹細胞がより好ましい。なお、これらの細胞を用いる際に留意すべき培養方 法は、各細胞について既知の培養方法に従えばよい。
[0180] 尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様およ び以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そ のような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ当業者は、本発 明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
[0181] また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中に ぉ ヽて参考として援用される。
実施例
[0182] 〔材料の調製〕
lOmgの 3— sn— phosphatidylcholine from egg yolk (PC, Wako : l6d— 2 1181)又は 3— sn— phosphatidic acid from egg yolk (PA, Sigma : P9511) を 0. 01 %丁 661180 (—)を含有する1¾3101111に添カ卩し、次いで、超音波を用いて この液体を 5分間懸濁した。この懸濁液を、氷中にて 30秒間超音波処理した後、室 温にて 5分間遠心分離（2500rpm)した。沈殿が生じた場合は氷上にて 5分間さらに 超音波処理を行い、沈殿が消失するまでこの操作を繰り返した。得られた溶液を 0. 4 5 /z m径のフィルタ一にて濾過し、窒素ガスで封入した後、遮光下にて冷蔵保存した 。これらをいずれも培地の 1Z100量添カ卩した。脂肪酸複合体としての Chemically defined lipid concentrate (CD, Gibco : 11905— 031)を培地の 1/100量添 加した。なお、この脂肪酸複合体に含有される脂質を図 13及び図 14に示す。図 13 は、間葉系幹細胞 (MSC)の培養に用いた培地中の成分を示し、図 14は、 C2C12 細胞の培養に用いた培地中の成分を示す。なお、これらの成分については、図 13及 び図 14に示した値の上限より高濃度であってもよい。
[0183] 300ng/mlの FGF— 2を、 lmg/ml BS A (ゥシ血清アルブミン）を含む培地に 溶解してストック溶液（100倍溶液)を作製した。 lOOOngZmlの EGFを、培地に溶 解してストック溶液（100倍溶液)を作製した。 1000 μ g/mlの Insulinを培地に溶解 してストック溶液（ 100倍溶液)を作製した。これらを ヽずれも 100倍希釈で使用した。 Dexamethasoneを最終濃度 10— 8Mで使用した。
[0184] 〔実施例 1 :骨髄由来の間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell: MSC)の無血 清培養〕
〔I：リン脂質の効果〕
ヒト腸骨骨髄由来の間葉系幹細胞（3継代目： Bio— Whittaker社 (Walkersville, MD)より購入）を、血清を含まない DMEM培地で 3回洗浄した後、細胞を 24ゥエル のプレートに 5000個 Zcm2の密度で播種し、 5%C02存在下の C02インキュベー タ内にて 37°Cで培養した。
[0185] 基礎培地としての DMEMZMCDB= 1 : 1に以下の添加物を添カ卩して培養に用い た：
(培地 1)添加なし
(培地 2) 10%FBS (ゥシ胎仔血清）
(培地 3)増殖因子群及び脂肪酸群
(培地 4)増殖因子群及び脂肪酸群、並びにリン脂質 (PA、 PC)。
[0186] なお、ゥシ胎仔血清（FBS)の成分はロット毎に差があるので、 FBSのロット毎に培 養細胞への増殖効果が異なる。そこで、本実施例において培地 2に添加する FBSと して、間葉系幹細胞に特に高い増殖効果をもたらすものを用いた。
[0187] 無血清培地の基礎培地の組成を表 1に示す。培地に添カ卩した種々の成分は図 13 及び図 14に示した会社力も購入した。基礎培地である MCDB201 (Sigma : M- 67 70)培地は、 -ヮトリ胚線維芽細胞のクローン増殖用に開発されたものであり、完全な 微量元素（trace element)を含んで!/、る。従来の間葉系幹細胞の基礎培地 DME M又は DMEMZHam' s F— 12と比べて、 MCDB201ZDMEM (1： 1)を用いる ことにより、間葉系幹細胞の最適な増殖促進が示された（図示せず)。
[0188] [表 1] DMEM/F— 12 MCDB201 /DMEM
(g/L) (g/L)
AMINO ACIDS
L一 Alanine 0.00445 0.00445 L-Arginine-HCI 0.1474 0.0736
L-Asparagine"H20 0.0075 0.0075
L一 Aspartic Acid 0.00665 0.00665 し一 Gystine'HC卜 H2ひ 0.03129 0.01756
L-Cysteine-2HCI 0.01756 0.0313 し一 Glutamic Acid 0.00735 0.00735 " L-Glutamine 0.365 0.292
Glycine 0.01875 0.01875
L-Histidine-HCI-H20 0.031 0.0314
L-Isoleucjne 0.05447 、' 0.05906
L— Leucine 0.05905 0.07217
L-Lysine-HCI 0 9125 0.09125
L— Methionine 0.01724 0.01724
L— Phenylalanine -， 0.03548 0.03548
L— Proline 0.01725 0.00288： , L— Serine 0.02625 0.03676 ： し—Threonine 0.05345 0.06537
L一 Tryptophan 0.00902 0.01 106
L-Tyrosine'2Na-2H20 0.05579 0.05757
L-Valine 0.05285 0.06456
VITAMINS .
D-Biotin 0.0000035 0.0000035 Choline Chloride 0.00898 0.00898
Folic Acid 0.00266 0.00266
Folinic Acid-Ca 0扁 00256 myo— Inositol 0.0126 0.0126
Niacinamide 0.00202 0.00505
D— Pantothenic .Acid'½Ga 0.00224 0.00224
Pyridoxal-HCI 0.0020506
Pyridoxine-HCI 0.0020308 Riboflavin 0.000219 0 0002565
Dし— Thioctic Acid · ... - 0.000105 0.0001 D5 Thiamine-HCI ' 0.00219 0.00219
Vitamin B— 12 0.00068 0.00068 MAGOR INORGANIC SALTS
CaCI2-2H20 0.1545 0.2795
KGI 0.31 18 0.31 18
MgS04 0.04884 . 0.13912
NaCI 6.996 6.996
NaHC03 1.2 1.85
Na2HP04(anhyd) 0.07102 0.0355
NaH2P04 ' 0.0543 0.0543
TRACE ELEMENTS
CuS04-5H20 0.0000013 0.00000025
FeS04-7H20 0.000417 0.000834.
Fe(N03)3-9H20 0.00005 0.00005
Na2Se03 ― 0.0000004325
NaSi03-9H20 ― 0.000071
(NH4)2M04-4H20 一 0.000000309
NH4V03 ― 0.000000003
NiCI2'6¾0 ― 0.0000000006
MgCI-6H20 0.0612 ― nS04 ― 0.000000375
ZnS04-7H20 0.000432 0.00001437
OTHER ORGANIC COMPOUNDS
Adenine ― 0.00086 .
D - Glucose 3.15 1.2205
HEPES ■― 3.5745
Hypoxanthine 0.0021 ―
Linoleic Acid 0.000042 0.000042
Phenol Red-Na 0.00863 0.00863
Putrescine'HCl 0.000081 0.0000000805
Pyruvic Acid-Na 0.055 0.0275
Thymidine 0.000365 0.00003635
[0189] 本発明に係る基本培地（培地 3)は、増殖因子群（FGF、 HGF、 TGF— β、 PDGF )及び脂肪酸複合物（ァラキドン酸、レチノイン酸、リノレン酸、ォレイン酸、リノレイン 酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸及びステアリン酸)を含み、これら以外 に、培地添加サプリメントとして知られるインスリン、トランスフェリン、セレネート（セレ ン酸ナトリウムなど）、並びにコレステロール、デキサメタゾン（Dex)、ゥシ血清アルブ ミン (BSA)を含み、脂質酸ィ匕防止剤としてのビタミン E、界面活性剤としての Pluroni c F— 68及び Tween 80をさらに含んでいる。
[0190] 各々の培地毎に実験を三連にて行った (n= 3)。培地を 2日又は 3日毎に交換した 。細胞を、コンフルェントになる前に PBSで 2回洗浄し、 0. 05%トリプシン及び 0. 2m M EDTAを含有する PBS中にて 2分間インキュベートすることにより、プレートから 剥離し、血清を含有しない植物由来の Trypsin inhibitor (Sigma :T6522)ととも に再懸濁させた。血清を含まない DMEM培地で細胞を 3回洗浄した後、細胞数を C oulterカウンター（Z1シングル、コールター社製)で計測した。結果を図 1に示す。
[0191] また、細胞を継代するために、各々の培地を使用して、再懸濁した細胞を 24ゥエル プレートに 5000個 Zcm2の密度で再播種した。 7日毎に継代培養を繰り返して、 5 継代目まで培養した。各々の培地毎に実験を三連にて行った実験の平均値士 SDを 図 1に示す (n= 3)。
[0192] 本発明に係る基本培地 (培地 3)は、 2%FBSを添加すると従来の 10%FBS含有 培地と同等の細胞増殖効果を示した (図示せず)。この基本培地を無血清条件下で 用いた場合、 10%FBS含有培地よりは劣るが、優れた細胞増殖効果を示した（10% FBS含有培地における細胞増殖レベルの約 45% :図 1)。基本培地 (培地 3)に動物 由来のリン脂質 (フォスファチジン酸 (PA)、フォスファチジルコリン (PC) )をさらに添 加した場合 (培地 4)、血清非存在下であっても優れた細胞増殖効果を示した（10% FBS含有培地における細胞増殖レベルの約 8. 5倍：図 1)。
[0193] 以上より、増殖因子群及び脂肪酸群を含有する無血清培地中にリン脂質を添加す ることにより、ヒト間葉系幹細胞の無血清培養を有意に改善することができることがわ かった。
[0194] 〔II：脂肪酸の効果〕
次!、で、基本培地における脂肪酸の重要性にっ 、て検討した。
(培地 1)添加なし
(培地 2) 10%FBS (ゥシ胎仔血清）
(培地 3)増殖因子群及び脂肪酸群
(培地 5)増殖因子群 +リノレイン酸 +レシチン + EGF +ビタミン C (VC)。
[0195] 培地 5は、基本培地 (培地 3)からリノレイン酸以外の脂肪酸群を除去して植物由来 のリン脂質 (レシチン）を添加した。なお、植物由来のリン脂質 (レシチン）は以下の方 法で調製した。
[0196] 植物由来のレシチン（Lecithin from Soybean, Wako : 120-00832) 200mg をクロ口ホルム（Chloroform)に添カ卩した。これを、窒素ガス蒸留法を用いて乾燥さ せた後、 PBS (— ) 20mlを添カ卩した。この溶液を、室温にて 15分間超音波処理を行 うことにより平衡ィ匕し、窒素ガス下で氷上にてさらに 30秒〜 2分間超音波処理を行つ た後、室温にて 5分間遠心分離（2500rpm)した。沈殿があればさらに氷上にて 5分 間超音波処理を行った後、室温にて 5分間遠心分離（2500rpm)した。この工程を 繰り返した後に回収した上清を 0. 45 m径のフィルタ一にて濾過し、窒素ガスで封 入した後、遮光下にて冷蔵保存した。
[0197] 図 1に示すように、培地 5は、血清非存在下であっても基本培地 (培地 3)と同等の 優れた細胞増殖効果を示した（10%FBS含有培地における細胞増殖レベルの約 40 % :図 1)。
[0198] 以上より、増殖因子群を含有する無血清培地中に脂肪酸が少なくとも 1種類含まれ ていれば、ヒト間葉系幹細胞の無血清培養におけるリン脂質の効果を導くことができ ることがわかった。
[0199] 〔III：増殖因子の効果〕
次!、で、基本培地 (培地 3)力 増殖因子を 、ずれか 1つ除去した培地を用いて、 無血清条件下での間葉系幹細胞の増殖を比較することにより、培地中に添加する増 殖因子について検討した：
(培地 1)添加なし
(培地 3)増殖因子群及び脂肪酸群
(培地 3— 1)培地 3より PDGFのみを除去
(培地 3— 2)培地 3より TGF— βのみを除去
(培地 3— 3)培地 3より HGFのみを除去
(培地 3— 4)培地 3より FGFのみを除去
(培地 3— 5)培地 3よりデキサメタゾン（Dex)のみを除去。
(培地 3— 6)培地 3よりインスリン、トランスフェリン、セレネートを除去。
[0200] 図 1に示すように、増殖因子群に含まれる増殖因子が 1つでも欠落すると無血清条 件下での間葉系幹細胞の活発な増殖は阻害されることがわ力つた。例えば、 HGF、
TGF— βのみを除去すると本培養での増殖が明らかに低下した。また、 HGF及び Τ
GF- βの両者を除去すると細胞増殖は著しく阻害された (データ示さず)。
[0201] また、図 1には示さないが、リン脂質に加えて EGF及び VCをさらに添カ卩した培地（ 培地 4 + EGF+VC)を用いることにより無血清培地での間葉系幹細胞の増殖をさら に促進し得ることがわかった（図 10：培地 4 - 2)。
[0202] 〔IV：培地による間葉系幹細胞の形態に対する影響〕
本実施例において用いた無血清培地にて培養した間葉系幹細胞の形態を図 2に 示す。図 2に示されるように、無血清培地で培養した細胞（3継代目）は、 10%FBS 含有培地で培養した細胞と比較して、間葉系幹細胞に典型的な紡錘形の形を示し ていた。また、 TGF— β又は HGFのみを除いた無血清培地では、細胞増殖が低減 した。
[0203] 〔実施例 2：無血清培養した間葉系幹細胞の分化能の評価〕
〔I：骨芽細胞への分化誘導〕
実施例 1にて示した無血清培地を用いて増殖させた間葉系幹細胞の分ィ匕能を評 価するために、無血清培地にて連続的に継代培養した 3代目のヒト腸骨由来の間葉 系幹細胞を収集した後、骨分化誘導培地（α— ΜΕΜ、 10% FBS、 ΙΟΟηΜ Dex amethasone、 lOmM β— Lrlycerophosphoric acid、及び 50 gz ml L— As corbie acid 2— phosphateを含む。）へ移した。骨分化誘導培地中の間葉系幹 細胞を、 5%炭酸ガス存在下にて 37°Cで培養し、さらに 2〜3日おきに同一の分ィ匕誘 導培地と交換し、合計 28日間培養した。骨分化して石灰化した細胞層をァリザリン赤 にて染色した。結果を図 3に示す。
[0204] 図 3に示すように、無血清培地で培養した間葉系幹細胞 (4継代目）を骨分化誘導 培地で 28日間培養した結果、骨芽細胞に特徴的な石灰化を示すァリザリン赤による 染色性を示し、カルシウムの沈着が観察された。し力も、 10%FBS含有培地と比較し て、無血清培地で培養した間葉系幹細胞はいずれも、高い骨分化能力 (石灰化能） を保持していた。特に、 2種類のリン脂質を追加したもので最も高い骨分ィ匕能が観察 された。
[0205] [II：脂肪細胞への分化誘導〕
実施例 1にて示した無血清培地を用いて増殖させた間葉系幹細胞の分ィ匕能を評 価するために、無血清培地にて連続的に継代培養した 3代目のヒト腸骨由来の間葉 系幹細胞をコンフルェントになるまで増殖させ、トリプシンにて分散させた後に収集し 、脂肪分化誘導培地（高グルコース含有 DMEM、 10 /z gZml Insulin, 0. 2mM Indometnacm、 1 M Dexamethasone、 0. 5mM 3— Isobutyl— 1— metnyl xanthine,及び 10%FBSからなる）に移した。脂肪分化誘導培地中の間葉系幹細 胞を、 5%炭酸ガス存在下にて 37°Cで培養し、さらに 2〜3日おきに同一の分ィ匕誘導 培地と交換し、合計 28日間培養した。細胞をオイルレッド Oにて染色することによつ て脂肪分化の評価を行った。結果を図 4に示す。
[0206] 図 4に示すように、無血清培地で培養した間葉系幹細胞 (4継代目）を脂肪分化誘 導培地で 28日間培養した結果、脂肪を示すオイルレッド Oによる染色性を示した。し 力も、 10%FBS含有培地と比較して、無血清培地で培養した間葉系幹細胞はいず れも、高い脂肪分ィ匕能力を保持していた。
[0207] 〔III：軟骨細胞への分化誘導〕
実施例 1にて示した無血清培地を用いて増殖させた間葉系幹細胞の分ィ匕能を評 価するために、無血清培地にて連続的に継代培養した 5代目のヒト腸骨由来の間葉 系幹細胞を収集した後、軟骨分ィ匕誘導培地（高グルコース a—MEM、 lOng/mlT GF— j8 ΙΟΟηΜ Dexamethasone^ 50 μ / ml L— Ascorbic acid 2-phos
3、
phate、 100 gZml Sodium pyruvate、 ITS—プフス (6. 25 gZml Transf errin、 6. 25 μ gZ ml Insulin、 6. 25ngZ ml selenate、 5. 33 μ gZ ml linolei c acid, 1. 25mgZmlゥシ血清アルブミン： BSA)を含む。）へ移した。なお、遠心 管（15ml用）に、 20万個の細胞を入れ、 0. 5— lmlの以下の培地でインキュベートし た。また、上記の軟骨分化誘導培地から TGF— βを除いたコントロール培地に間葉 系幹細胞を移した。軟骨分ィ匕誘導培地およびコントロール培地中の間葉系幹細胞を 、 5%炭酸ガス存在下にて 37°Cで培養した。培養開始から 24時間後には、細胞は球 状のペレットを形成した。さらに 2〜3日おきに同一の分ィ匕誘導培地と交換し、 21日 間培養した。硫酸ィ匕グリコサミノダリカン (glycosaminoglycan： GAG)定量用キット ( Biocolor社製）を用いて培養後のペレットの GAGを定量した。結果を図 5に示す。な お GAG量は細胞の DNA含量によってノーマライズした。また、培養後の軟骨分ィ匕 誘導培地中の軟骨分ィ匕した細胞をトルィジンブルーにより染色した。結果を図 6に示 す。 [0208] 図 5に示すように、無血清培地および 10%FBS含有培地で培養した間葉系幹細 胞を軟骨分化誘導培地で 21日間培養した結果、無血清培地で培養した間葉系幹 細胞（5継代目）は、 10%FBS含有培地で培養した間葉系幹細胞と比較して、著しく 高い GAG量を示した (p< 0. 01)。なお、無血清培地および 10%FBS培地で培養 した間葉系幹細胞をそれぞれコントロール培地で 21日間培養した結果、いずれの培 地中にお 、ても GAG量の増加が観察されな力つた (数値は三連にて行った実験の 平均値士 SDを示す)。
[0209] また、図 6に示すように、無血清培地および 10%FBS含有培地で培養した間葉系 幹細胞を軟骨分化誘導培地で 21日間培養した結果、無血清培地で培養した間葉 系幹細胞（5継代目）は、 10%FBS含有培地で培養した間葉系幹細胞と比較して、 著しく高いレベルのトルイジンブルーによる染色性を示し、マトリックスの蓄積が観察 された。
[0210] 〔実施例 3 :骨髄由来の間葉系幹細胞の無血清培養における増殖因子の作用〕 ヒト腸骨骨髄由来の間葉系幹細胞（3代目）を、血清を含まな!/、DMEM培地で 3回 洗浄した後、細胞を 24ゥエルのプレートに 5000個 Zcm2の密度で播種し、 5%CO
2存在下の C02インキュベータ内にて 37°Cで培養した。
[0211] 基礎培地としての DMEMZMCDB= 1 : 1に以下の添加物を添カ卩して培養に用い た：
(培地 1)添加なし
(培地 2) 10%FBS (ゥシ胎仔血清）
(培地 3)増殖因子群及び脂肪酸群
(培地 3— 2)培地 3より TGF— βのみを除去
(培地 3— 3)培地 3より HGFのみを除去
(培地 3— 7)培地 3より TGF— j8及び HGFを除去
(培地 3— 8)培地 3 +EGF
(培地 3— 9)培地 3+ VC
(培地 4)増殖因子群及び脂肪酸群、並びにリン脂質 (PA、 PC)
(培地 4 1 )培地 4 + EGF +ビタミン C (VC) +ビタミン E (VE) (培地 5)増殖因子群 +リノレイン酸 +レシチン + EGF+VC。
[0212] 各々の培地毎に実験を三連にて行った (n= 3)。培地を 2日又は 3日毎に交換した 。培養 8日目の細胞数を cell counting kit WST— 8 (同仁ィ匕学)を用いて測定 した。結果を図 7に示す。
[0213] 図 7に示すように、無血清培地（培地 3— 8、培地 4、培地 4 1、又は培地 5)で培養 した間葉系幹細胞は、培地 3で培養した場合と比較して、培養 8日目の細胞増殖率 が亢進した (数値は三連にて行った実験の平均値士 SDを示す)。特に、この効果は 、培地 4又は培地 4—1で培養した場合に、顕著であった。このことより、リン脂質だけ でなぐ EGF、 VC及び高濃度の VEもまた間葉系幹細胞の増殖を促進するに有効で あることがわかった。一方、 TGF— β又は HGFの少なくとも一方を基本培地（培地 3 )から除去した場合、間葉系幹細胞の細胞増殖率が顕著に低下した。このことより、 Τ GF - β及び HGFは間葉系幹細胞の無血清培養に必須であることがわかった。
[0214] また、植物由来のレシチン (動物由来のフォスファチジルコリン (PC)に相当する）を 主成分とする脂質混合物を含有する培地 (培地 5)もまた、多数の脂肪酸を主成分と する脂質混合物を含有する培地 (培地 4)と同様に間葉系幹細胞の無血清培養に有 用であることがわかった（図 7)。
[0215] 〔実施例 4 :ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の無血清培養における追加増殖因子の作 用〕
ヒト腸骨骨髄由来の間葉系幹細胞（3継代目）を、血清を含まな!/、DMEM培地で 3 回洗浄した後、細胞を 24ゥエルのプレートに 5000個 Zcm2の密度で播種し、 5%C 02存在下の C02インキュベータ内にて 37°Cで培養した。
[0216] 基礎培地としての DMEMZMCDB= 1 : 1に以下の添加物を添カ卩して培養に用い た：
(培地 1)添加なし
(培地 3)増殖因子群及び脂肪酸群
(培地 6)培地 3 +VEGF
(培地 7)培地 3 + CTGF。
[0217] 各々の培地毎に実験を三連にて行った (n= 3)。培地を 2日又は 3日毎に交換した 。培養 8日目の細胞数を cell counting kit WST— 8 (同仁ィ匕学)を用いて測定 した。結果を図 8に示す。
[0218] 図 8に示すように、無血清培地 (培地 6又は培地 7)で培養した間葉系幹細胞は、培 地 3と比較して、培養 8日目の細胞増殖率が亢進した (数値は三連にて行った実験の 平均値士 SDを示す)。
[0219] 〔実施例 5 :骨髄由来間葉系幹細胞の無血清培養〕
ヒト腸骨骨髄由来の間葉系幹細胞（3代目）を、血清を含まな!/、DMEM培地で 3回 洗浄した後、細胞を 24ゥエルのプレートに 5000個 Zcm2の密度で播種し、 5%CO
2存在下の C02インキュベータ内にて 37°Cで培養した。
[0220] 基礎培地としての DMEMZMCDB= 1： 1に以下の添加物を添カ卩して培養に用い た：
(培地 1)添加なし
(培地 3)増殖因子群及び脂肪酸群
(培地 7)増殖因子群 +リノレイン酸 +PC
(培地 8)増殖因子群 +リノレイン酸 +PA
(培地 9)増殖因子群 +リノレイン酸 +レシチン。
[0221] 各々の培地毎に実験を三連にて行った (n= 3)。培地を 2日又は 3日毎に交換した 。培養 8日目の細胞数を cell counting kit WST— 8 (同仁ィ匕学)を用いて測定 した。結果を図 9に示す。
[0222] 図 9に示すように、無血清培地 (培地 7又は培地 8)で培養した間葉系幹細胞は、培 地 3で培養した場合と同等の細胞増殖率を示した (数値は三連にて行った実験の平 均値士 SDを示す)。また、植物由来のリン脂質レシチンを主成分とする脂質混合物 及びレチノイン酸を含有する培地 (培地 9)で培養した間葉系幹細胞も、基本培地 (培 地 3)で培養した場合と同等の細胞増殖率を示した。すなわち、脂肪酸 1種類とリン脂 質 1種類との組み合わせであっても、本発明を特徴付ける増殖因子が培地中に含有 されている場合は、増殖速度は低いものの間葉系幹細胞の増殖が可能であり、より 多くの脂質が組み合わされている場合は、脂肪酸 1種類とリン脂質 1種類との組み合 わせ又は多数の脂肪酸を主成分とする脂質混合物単独もしくは植物由来のリン脂質 レシチンを主成分とする脂質混合物単独の場合よりも、大量培養を高速にて行うこと ができることがわかった（図 1と図 9との比較)。
[0223] 〔実施例 6：未分化細胞株の無血清培養〕
マウス間葉系幹細胞 C2C12細胞 (あるいはマウス軟骨細胞株 ATDC5又はサル腎 臓由来未分化細胞株 COS 7細胞）を、 10%ゥシ胎仔血清、 100単位 Zmlペニシリン 、及び 100 μ gZmlストレプトマイシンを含有する DMEM培地を含む 10cmプレート にて、 5%C02存在下の C02インキュベータ内にて 37°Cで培養した。細胞を PBSで 2回洗浄し、 0. 05%トリプシン及び 0. 2mM EDTAを含有する PBS中にて 2分間 インキュベートすることにより、プレートから剥離し、血清を含有しない植物由来の Try psin inhibitor (Sigma :T6522)とともに再懸濁させた。血清を含まない DMEM培 地で細胞を 3回洗浄した後、細胞数を Coulterカウンター（Z1シングル、コールター 社製)で計測した。結果を図 10に示す。
[0224] さらに、再懸濁した細胞を、以下の異なる培地条件を使用して、 24ゥ ルプレート に 5000個 Zcm2の密度で再播種した。
(培地 1)無添カロ
(培地 2) 10%FBS
(培地 4— 2)増殖因子群及び脂肪酸群、並びにリン脂質 (PA、 PC) +EGF+VC (培地 4— 3)増殖因子群及び脂肪酸群、並びにリン脂質 (PA、 PC) +EGF+VC- HGF0
[0225] 各々の培地毎に実験を三連にて行った (n= 3)。培地を 2日又は 3日毎に交換した 。培養 8日目の細胞数を cell counting kit WST— 8 (同仁ィ匕学)を用いて測定 した。結果を図 10に示す。
[0226] 図 10に示すように、無血清培地（培地 4 2)で培養した細胞株 C2C 12細胞は、通 常の 10%FBS含有培地 (培地 2)よりはるかに優れた細胞増殖を示した。しかしその 培地力 HGFのみを除去した培地 (培地 4 3)を用いると、この細胞株の増殖能は 著しく低下した (数値は三連にて行った実験の平均値士 SDを示す)。
[0227] なお、間葉系幹細胞力 すでに軟骨へと分ィ匕したマウス ATDC5細胞株を用いた 場合は、本無血清培地 (培地 4 2)を用いても、 10%FBS含有培地 (培地 2)に匹敵 するほどの細胞増殖促進効果を導くことはできな力つた。すなわち、本無血清培地（ 培地 5)は、未分ィ匕細胞により効果が強いことが示された。また、特別な分化能を失つ て未分化状態に近 、細胞 (例えば、サル腎臓由来の COS7細胞）の無血清条件で の培養にも、本発明の無血清培地は有効であり、 10%FBS含有培地 (培地 2)に匹 敵する増殖促進効果が得られた。
〔実施例 7：無血清培地中における細胞増殖メカニズム〕
無血清培地中における細胞増殖メカニズムを明らかにするために、無血清培地中 に添加された各添カ卩因子による細胞増殖シグナル伝達系の活性ィ匕について検討し た。各添カ卩因子による細胞増殖シグナル伝達系の活性状態を、ウェスタンプロット法 により検出した。ここで、特に細胞増殖に密接に関連しているタンパク質リン酸ィ匕酵素 のうち、細胞外シグナル制御キナーゼ ErklZ2 (Extracellular signal -regulated kinase 1/2)、および Akt (PI3Kの下流に位置して細胞機能の制御に関連するタ ンパク質リン酸化酵素）に注目した。 ErklZ2および Aktはリン酸ィ匕されると活性型 に変換される。 12ゥエルプレートの 10%FBS含有培地において、ヒト間葉系幹細胞（ 3株）をサブコンフルェントまで培養した。培養細胞を PBSで 2回洗浄し、 1. 25mg/ mlBSA (ゥシ血清アルブミン）を含有する無血清培地において、さらに 16時間培養 した。その後、培養細胞を、各成長因子（E:EGF、 F:FGF、 G : PDGF、 H :HGF、 I : Insulin, J :TGF- β )、 Dexamethasone (D)、 Transferrin (T)、および脂肪酸 関連因子 (Al : Arachidonic acid、 A2： Linoleic acid、 A3 : Linolenic acid、 A 4： Oleic acid、 A5： Bl、 A6： Phosphatidic acid、 A7： Phosphatidyl choline) をそれぞれ含有する刺激液中、ならびにこれらを含有しな ヽコントロール溶液中にお いて 5分間インキュベートした。さらに、各刺激液およびコントロール溶液を氷上にお いて吸引除去し、 PBSで 2回洗浄した。洗浄後の細胞を、 lysis bufferに溶解させ た。細胞溶解液を 6. 500gで、 10分間遠心し、上清を 10%の SDS—ポリアクリルアミ ドゲル上で電気泳動を行った。分画されたタンパク質を PVDFメンブラン（Millipore 社製)上に移し、抗リン酸ィ匕 ErklZ2抗体、または抗リン酸化 Akt抗体 (いずれも Cel 1 Signaling Technology社製)を用いて、分画を検出した。結果を図 11および 12 に示す。 [0229] 図 11に成長因子（E〜J)、 Dexamethasone (D)、および Transferrin (T)によつ て細胞を刺激したときのタンパク質分画を示す。図 11に示すように、コントロール細 胞（刺激されて 、な ヽ細胞）と比較して、 EGF (Ε)、 FGF (F)、 PDGF (G)、 Insulin ( 1)、および HGF (H)によって刺激された細胞において、 ErklZ2がリン酸ィ匕されるこ とを示した。特に HGFによって刺激された細胞においては、濃度依存的に ErklZ2 のリン酸化が促進されると共に、 Aktのリン酸化も促進された。
[0230] 図 12に脂肪酸関連因子 (A1 -A7)によって細胞を刺激したときのタンパク質分画を 示す。図 12に示すように、コントロール細胞 (刺激されていない細胞）と比較して、 Ph osphatidic acid (A6)によって刺激された細胞において、 ErklZ2および Aktのリ ン酸化が強く促進された。また、 Arachidonic acid (Al)、 Linoleic acid (A2)、 L inolenic acid (A3)、 Oleic acid (A4)、および (Phosphatidyl choline (A7)に よって刺激された細胞において、 ErklZ2のリン酸ィ匕が促進された。すなわち、これ らの脂肪酸関連因子は、培養細胞に対して単にエネルギーや膜成分を供給するだ けでなぐ成長因子として細胞増殖シグナル伝達系を活性ィ匕することが示された。
[0231] 〔実施例 8 :ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の無血清培養における追加基本因子の作 用〕
10%FBSを含有する培地に塩化リチウム（LiCl)を添加することによって、 wingles s/int (wnt)シグナル経路が活性ィ匕されることにより、ヒト間葉系幹細胞の増殖を促 進することが知られている。また、抗酸化剤（還元剤）としての L— glutathione力 ヒ トの胚性幹細胞 (ES細胞）の無血清培養に用いられている。そこで、塩化リチウム (Li C1)及び L glutathioneの間葉系幹細胞の増殖に対する影響を検討するために、 以下に示す無血清培地に塩化リチウム又は L - glutathioneを添カ卩した培地を用 ヽ てヒト間葉系幹細胞を培養した。
[0232] ヒト腸骨骨髄液由来の間葉系幹細胞を、 10%FBS、 100単位 Zmlペニシリン及び 100 μ g/mlストレプトマイシンを含有する DMEM培地を含む 10cmプレートにおい て、 5%CO存在下の COインキュベータ内にて 37°Cで培養した。サブコンフルェン
2 2
トになった培養細胞を、 PBS (―)で 2回洗浄し、 0. 05%トリプシン及び 0. 2mM E DTAを含有する PBS中にて 2分間インキュベートすることにより分散させた後、血清 を含有しない植物由来の Trypsin inhibitor (Sigma :T6522)とともに再懸濁した 。さらに、培養細胞を、血清を含まない DMEM培地で 3回洗浄した後、細胞数を Co ulterカウンター（Z1シングル、コールター社製)で計数した。次に、再懸濁した細胞 を以下に示す各培地を用いて、 96ゥエルのプレートに 5000個 Zcm2の密度で再播 種した。
(培地 2) 10%FBS
(培地 4— 2)増殖因子群及び脂肪酸群、並びにリン脂質 (PA、 PC) +EGF+VC
(培地 4 4)培地 4 2+塩化リチウム（ ImM： Sigma - L4408)
(培地 4 - 5)培地 4 - 2+L- glutathione ( 2 μ g/ml： Sigma -G6013) 各々の培地毎に実験を三連にて行つた (n = 3)。培地を 2日または 3日毎に交換し た。培養 8日目の細胞の数を cell counting kit WST—8 (同仁化学）を用いて測 定した。結果を図 15 (a)および (b)に示す。
[0233] 図 15 (a)に示すように、培地 4 - 2および培地 2で培養した細胞の増殖能と比較し て、培地 4— 4で培養した細胞の増殖能は、培養 8日目で著しく高力つた (数値は三 連にて行った実験の平均値士 SDを示す)。
[0234] 図 15 (b)に示すように、培地 4 - 2および培地 2で培養した細胞の増殖能と比較し て、培地 4— 5で培養した細胞の増殖能は、培養 8日目で著しく高力つた (数値は三 連にて行った実験の平均値士 SDを示す)。
[0235] 〔実施例 9 :骨髄由来の間葉系幹細胞の無血清初代培養における増殖因子の作用
]
初代培養幹細胞を培養する培地中に添加する増殖因子にっ ヽて検討するために 、広島大学附属病院倫理審査委員会の承認および入院患者の同意を得た上で、広 島大学付属病院の入院患者から腸骨由来の骨髄液を採取した。採取した腸骨由来 の骨髄液を、密度勾配遠心法によって単核球画分 (MSCを含む）を分離した。次に 、以下に示す各培地において、 24ゥエルのプレートに I X 106個（有核)細胞 Zcm2 の密度で播種し、 5%CO存在下の COインキュベータ内にて、 37°Cで培養した。
2 2
[0236] 基礎培地としての DMEMZMCDB= 1： 1に以下の添加物を添カ卩して培養に用い (培地 1)添加なし
(培地 2) 10%FBS (ゥシ胎仔血清）
(培地 3)増殖因子群および脂肪酸群
(培地 10)増殖因子群および脂肪酸群、ならびにリン脂質 (PA、 PC) +EGF+VC ( 図 10 :培地 4 2)
(培地 10— 1)培地 10より FGFのみを除去
(培地 10— 2)培地 10より TGF— βのみを除去
(培地 10— 3)培地 10より HGFのみを除去
(培地 10— 4)培地 10より FGFおよび TGF— βを除去
(培地 10— 5)培地 10より FGFおよび HGFを除去
(培地 10— 6)培地 10より TGF— βおよび HGFを除去
(培地 10— 7)培地 10より FGF、 TGF— βおよび HGFを除去
(培地 11)間葉系幹細胞増殖培地 MF-medium (TOYOBO製、 No :TMMFM—
001)
各々の培地毎に実験を三連（三培養系）にて行った (n= 3)。培地を 2日または 3日 毎に交換した。培養 14日後、培地を PBSで 2回洗浄した後、 0. 05%トリプシンおよ び 0. 2mM EDTAを含有する PBS中にて 2分間インキュベートすることによって細 胞を回収した。回収した細胞数を Coulterカウンター（Z1シングル、コールター社製） を用いて測定した。結果を図 16 (a)および (b)に示す。
図 16 (a)に示すように、継代培養で高い細胞増殖効果を示す培地 3および培地 10 は、骨髄由来の間葉系幹細胞の初代培養では細胞増殖促進能力が低力つた。この ことは、おそらく骨髄単核球画分に含まれる間葉系幹細胞以外の多数の造血系細胞 力 間葉系幹細胞の増殖に影響するためであると考えられる。これらの非接着性造 血系細胞は、培地を交換する毎に除去され、一回継代培養した後はほとんど存在し ない。しかしながら、培地 10に含まれる増殖因子を 1〜3つ除去したとき (培地 10— 1 〜培地 10— 7)、無血清条件下での間葉系幹細胞の増殖能は向上した。例えば、培 地 10— 1では培養細胞の増殖が促進された。また、培地 10— 4では、培養細胞の増 殖能が明らかに向上した。さらに、培地 10— 7では、培養細胞の増殖能が著しく上昇 した (数値は三連にて行った実験の平均値士 SDを示す)。このように、間葉系幹細胞 以外の細胞、例えば造血細胞等が無血清培地中に多数存在するとき、最適な血清 代替物質の組成が変化することが示された。
また、図 16 (b)に示すように、骨髄液から採取した初代間葉系幹細胞を培地 2、お よび市販されて ヽる培地 11で培養した培養細胞と比較して、骨髄液から採取した初 代間葉系幹細胞を培地 10— 7で培養した培養細胞は、著しく高いレベルの増殖能 を示した (いずれも p< 0. 001) (数値は三連にて行った実験の平均値士 SDを示す）
〔実施例 10：未分ィヒ細胞株の無血清培養〕
未分ィ匕細胞株を継代培養する培地中に添加する増殖因子について検討するため に、マウス間葉系細胞株 10T1Z2(理ィ匕学研究所 バイオリソースセンター提供)、 チャイニーズノ、ムスターの卵巣由来細胞株 CHO細胞 (理化学研究所 バイオリソー スセンター提供）、およびヒトのヒフ由来の線維芽細胞 (Fibroblast) (ヒューマンサイ エンス研究資源バンク提供)を以下に示す培地にぉ ヽて培養した。
基礎培地としての DMEMZMCDB= 1： 1に以下の添加物を添カ卩して培養に用い た：
(培地 1)添加なし
(培地 2) 10%FBS (ゥシ胎仔血清）
(培地 10— 5)培地 10より FGFおよび HGFを除去
(培地 10— 7)培地 10より FGF、 TGF- βおよび HGFを除去
(培地 10— 8)培地 10より TGF— β、 HGFおよび PDGFを除去
10T1Z2細胞、 CHO細胞、および Fibroblastを、 10%ゥシ胎仔血清、 100単位 Zmlペニシリン、および 100 μ gZmlストレプトマイシンを含有する DMEM培地を含 む 10cmプレートにて、 5%CO存在下の COインキュベータ内にて 37°Cで培養した
2 2
。サブコンフルェントになった細胞を PBS (—）で 2回洗浄し、 0. 05%トリプシンおよ び 0. 2mM EDTAを含有する PBS中にて 2分間インキュベートすることにより、プレ ートから剥離した。剥離した細胞を、血清を含有しない植物由来の Trypsin inhibit or (Sigma :T6522)とともに再懸濁させた。血清を含まない DMEM培地で細胞を 3 回洗浄した後、細胞数を Coulterカウンター（Z1シングル、コールター社製)で計測 した。さらに、再懸濁した細胞を、上記異なる培地条件を使用して、 96ゥエルのプレ ートに 5000個 Zcm2の密度で再播種した。各々の培地毎に実験を三連にて行った（ n= 3)。培地を 2日または 3日毎に交換した。培養 8日目の細胞数を cell counting kit WST— 8 (同仁ィ匕学)を用いて測定した。結果を図 17 (a)〜（c)に示す。
[0239] 図 17(a)に示すように、培地 10— 5で培養した細胞株 10T1Z2細胞は、培地 2で 培養した細胞株 10T1Z2細胞とほぼ同等の細胞増殖能を示した (数値は三連にて 行った実験の平均値士 SDを示す)。また、図 17 (b)に示すように、培地 10— 7で培 養した CHO細胞は、有効な細胞増殖能を示した (数値は三連にて行った実験の平 均値士 SDを示す）。さら〖こ、図 17 (c)〖こ示すよう〖こ、培地 10— 8で培養した 1：01)1& stの増殖能は、培地 2で培養した Fibroblastの増殖能と比較して、培養 8日目で著し く高かった (数値は三連にて行った実験の平均値士 SDを示す)。
[0240] 本発明に従えば、動物細胞を、無血清培地であっても 10%血清含有培地におい て培養した場合と同等又はそれ以上の速度で、その特性を保持したまま増殖させる ことができる。血清に起因する細胞増殖効果には個体差があるが、本発明に従えば 、その個体差を考慮しなくてもよい。また、本発明に従えば、ヒト間葉系幹細胞を、そ の特性 (骨分化能、脂肪分ィ匕能など)を高レベルに維持したまま連続的に継代培養 することができる。
[0241] 発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あく までも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限 定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に記載する請求の範 囲内で、 、ろ 、ろと変更して実施することができるものである。
産業上の利用可能性
[0242] 本発明を用いれば、細胞培養に必要な血清の濃度を減らすことによりコストを削減 することができるとともに、再生医療で用いられる間葉系幹細胞を安全かつ低コストに て供給することができる。

Claims

請求の範囲
[I] FGF、 PDGF、 TGF— β及び HGFからなる群より選択される少なくとも 3つの増殖 因子、並びに少なくとも 1つのリン脂質を含有することを特徴とする動物細胞を無血 清培養するための培地用添加剤。
[2] 前記リン脂質が、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノ シトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールァミン、フォスファチジ ルコリン、及びフォスファチジルグリセロール力 なる群より選択されることを特徴とす る請求の範囲第 1項に記載の培地用添加剤。
[3] 少なくとも 1つの脂肪酸をさらに含有することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載 の培地用添加剤。
[4] 前記脂肪酸がリノール酸、ォレイン酸、リノレイン酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸、パ ルミトイル酸、ノルミチン酸、及びステアリン酸力 なる群より選択されることを特徴と する請求の範囲第 3項に記載の培地用添加剤。
[5] コレステロールをさらに含有することを特徴とする請求の範囲第 4項に記載の培地 用添加剤。
[6] EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物力 なる群より選択される少なくと も 2つの因子をさらに含有することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の培地用添 加剤。
[7] 脂質酸化防止剤をさらに含有することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の培 地用添加剤。
[8] 前記脂質酸化防止剤が DL— a—トコフエロールアセテート（ビタミン E)、 L—ダル タチオン（L - glutathione)又は 2—メノレカプトエタノーノレ ( 2 - mercaptoethanol) であることを特徴とする請求の範囲第 7項に記載の培地用添加剤。
[9] 塩化リチウムをさらに含有することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の培地用 添加剤。
[10] 界面活性剤をさらに含有することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の培地用 添加剤。
[I I] 前記界面活性剤が Pluronic F— 68又は Tween 80であることを特徴とする請求 の範囲第 10項に記載の培地用添加剤。
[12] インスリン、トランスフェリン（transferrin)及びセレネート (selenate)をさらに含有 することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の培地用添加剤。
[13] デキサメタゾン（Dexamethasone)をさらに含有することを特徴とする請求の範囲 第 1項に記載の培地用添加剤。
[14] 前記動物細胞が未分化細胞であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の培 地用添加剤。
[15] 前記動物細胞が間葉系幹細胞であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の 培地用添加剤。
[16] 請求の範囲第 1項に記載の培地用添加剤を構成する成分を含有していることを特 徴とする動物細胞を無血清培養するための培養培地。
[17] 請求の範囲第 16項に記載の培養培地中にて動物細胞を培養する工程を包含する ことを特徴とする動物細胞を無血清培養するための培養方法。
[18] 請求の範囲第 1項に記載の培地用添加剤を備えていることを特徴とする動物細胞 を無血清培養するための培地用添加剤キット。
[19] FGF、 PDGF、 TGF— β及び HGFからなる群より選択される少なくとも 3つの増殖 因子、並びに少なくとも 1つのリン脂質を別々に備えていることを特徴とする動物細胞 を無血清培養するための培地用添加剤キット。
[20] 前記リン脂質が、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノ シトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールァミン、フォスファチジ ルコリン、及びフォスファチジルグリセロール力 なる群より選択されることを特徴とす る請求の範囲第 19項に記載の培地用添加剤キット。
[21] 少なくとも 1つの脂肪酸をさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第 19項に 記載の培地用添加剤キット。
[22] 前記脂肪酸がリノール酸、ォレイン酸、リノレイン酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸、パ ルミトイル酸、ノルミチン酸、及びステアリン酸力 なる群より選択されることを特徴と する請求の範囲第 21項に記載の培地用添加剤キット。
[23] コレステロールをさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第 22項に記載の培 地用添加剤キット。
[24] EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物力 なる群より選択される少なくと も 2つの因子をさらに備えて 、ることを特徴とする請求の範囲第 19項に記載の培地 用添加剤キット。
[25] 脂質酸ィ匕防止剤をさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第 19項に記載の 培地用添加剤キット。
[26] 前記脂質酸化防止剤が DL— a トコフエロールアセテート（ビタミン E)、 L ダル タチオン（L - glutathione)又は 2—メノレカプトエタノーノレ ( 2 - mercaptoethanol) であることを特徴とする請求の範囲第 25項に記載の培地用添加剤キット。
[27] 塩化リチウムをさらに含有することを特徴とする請求の範囲第 19項に記載の培地用 添加剤。
[28] 界面活性剤をさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第 19項に記載の培地 用添加剤キット。
[29] 前記界面活性剤が Pluronic F— 68又は Tween 80であることを特徴とする請求 の範囲第 28項に記載の培地用添加剤キット。
[30] インスリン、トランスフェリン及びセレネートをさらに備えていることを特徴とする請求 の範囲第 19項に記載の培地用添加剤キット。
[31] デキサメタゾン（Dexamethasone)をさらに備えていることを特徴とする請求の範囲 第 19項に記載の培地用添加剤キット。
[32] 前記動物細胞が未分ィ匕細胞であることを特徴とする請求の範囲第 19項に記載の 培地用添加剤キット。
[33] 前記動物細胞が間葉系幹細胞であることを特徴とする請求の範囲第 19項に記載 の培地用添加剤キット。
[34] 請求の範囲第 19項に記載の培地用添加剤キットに備えられた成分を含有している ことを特徴とする動物細胞を無血清培養するための培養培地。
[35] 請求の範囲第 34項に記載の培養培地中にて動物細胞を培養する工程を包含する ことを特徴とする動物細胞を無血清培養するための培養方法。
[36] 動物細胞を無血清培養するための培養方法であって、 FGF、 PDGF、 TGF— β 及び HGF力 なる群より選択される少なくとも 3つの増殖因子、並びに少なくとも 1つ のリン脂質を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴とする培養方 法。
[37] 前記基礎培地に少なくとも 1つの脂肪酸をさらに添加する工程を包含することを特 徴とする請求の範囲第 36項に記載の培養方法。
[38] 分ィ匕能を維持したまま幹細胞を連続継代培養するための培地用添加剤であって、
FGF、 PDGF、 TGF— j8及び HGFからなる群より選択される少なくとも 3つの増殖 因子、並びに少なくとも 1つのリン脂質を含有することを特徴とする培地用添加剤。
[39] 少なくとも 1つの脂肪酸をさらに含有することを特徴とする請求の範囲第 38項に記 載の培地用添加剤。
[40] 分化能を維持したまま幹細胞を連続継代培養するための培地用添加剤キットであ つて、 FGF、 PDGF、 TGF— j8及び HGFからなる群より選択される少なくとも 3つの 増殖因子、並びに少なくとも 1つのリン脂質を含有することを特徴とする培地用添カロ 剤キット。
[41] 少なくとも 1つの脂肪酸をさらに含有することを特徴とする請求の範囲第 40項に記 載の培地用添加剤キット。
[42] 分化能を維持したまま幹細胞を連続継代培養する培養方法であって、 FGF、 PDG
F、 TGF— |8及び HGF力 なる群より選択される少なくとも 3つの増殖因子、並びに 少なくとも 1つのリン脂質を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴と する培養方法。
[43] 前記基礎培地に少なくとも 1つの脂肪酸をさらに添加する工程を包含することを特 徴とする請求の範囲第 42項に記載の培養方法。
[44] 初代培養間葉系幹細胞を培養するための培地用添加剤であって、
•PDGF、
-少なくとも 1つのリン脂質、
•少なくとも 1つの脂肪酸、並びに
•EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくと も 2つの因子 を含有することを特徴とする培地用添加剤。
[45] 初代培養間葉系幹細胞を培養するための培地用添加剤キットであって、
•PDGF、
-少なくとも 1つのリン脂質、
•少なくとも 1つの脂肪酸、並びに
•EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくと も 2つの因子
を備えて ヽることを特徴とする培地用添加剤キット。
[46] 初代培養間葉系幹細胞を培養するため培養方法であって、
•PDGF、
-少なくとも 1つのリン脂質、
•少なくとも 1つの脂肪酸、並びに
•EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくと も 2つの因子
を基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴とする培養方法。
[47] マウス線維芽細胞を連続継代培養するための培地用添加剤であって、
•TGF— j8、
•PDGF、
-少なくとも 1つのリン脂質、
•少なくとも 1つの脂肪酸、並びに
•EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくと も 2つの因子
を含有することを特徴とする培地用添加剤。
[48] マウス線維芽細胞を連続継代培養するための培地用添加剤キットであって、
•TGF— j8、
•PDGF、
-少なくとも 1つのリン脂質、
•少なくとも 1つの脂肪酸、並びに •EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくと も 2つの因子
を備えて ヽることを特徴とする培地用添加剤キット。
[49] マウス線維芽細胞を連続継代培養する培養方法であって、
•TGF— j8 、
•PDGF、
-少なくとも 1つのリン脂質、
•少なくとも 1つの脂肪酸、並びに
•EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくと も 2つの因子
を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴とする培養方法。
[50] チャイニーズノ、ムスター卵巣由来細胞を連続継代培養するための培地用添加剤で あって、
•PDGF、
-少なくとも 1つのリン脂質、
•少なくとも 1つの脂肪酸、並びに
•EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくと も 2つの因子
を含有することを特徴とする培地用添加剤。
[51] チャイニーズハムスター卵巣由来細胞を連続継代培養するための培地用添加剤キ ットであって、
•PDGF、
-少なくとも 1つのリン脂質、
•少なくとも 1つの脂肪酸、並びに
•EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくと も 2つの因子
を備えて ヽることを特徴とする培地用添加剤キット。
[52] チャイニーズノ、ムスター卵巣由来細胞を連続継代培養する培養方法であって、 •PDGF、
-少なくとも 1つのリン脂質、
•少なくとも 1つの脂肪酸、並びに
•EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくと も 2つの因子
を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴とする培養方法。
[53] ヒト線維芽細胞を連続継代培養するための培地用添加剤であって、
•FGF、
-少なくとも 1つのリン脂質、
•少なくとも 1つの脂肪酸、並びに
•EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくと も 2つの因子
を含有することを特徴とする培地用添加剤。
[54] ヒト線維芽細胞を連続継代培養するための培地用添加剤キットであって、
•FGF、
-少なくとも 1つのリン脂質、
•少なくとも 1つの脂肪酸、並びに
•EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくと も 2つの因子
を備えて ヽることを特徴とする培地用添加剤キット。
[55] ヒト線維芽細胞を連続継代培養する培養方法であって、
•FGF、
-少なくとも 1つのリン脂質、
•少なくとも 1つの脂肪酸、並びに
•EGF、 CTGF、 VEGF及びァスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくと も 2つの因子
を、基礎培地に同時に添加する工程を包含することを特徴とする培養方法。
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