CN115698264A - 制备含有由脐带血干细胞分泌的高水平高效外来体的培养基的方法及其用途 - Google Patents

制备含有由脐带血干细胞分泌的高水平高效外来体的培养基的方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及制备含有由脐带血干细胞释放的外来体的培养基的方法。制备方法基于在补充有GDF‑11、EGF、FGF2、TFG‑β1和/或VEGF的无血清培养基中培养脐带血干细胞。通过用补充有5种生长因子的无血清培养基处理脐带血干细胞来生产培养基，与在不添加生长因子的仅无血清培养基处理从培养基分离的外来体的情况相比，所述培养基含有高水平的总蛋白和细胞外基质蛋白。此外，在含五种生长因子的无血清培养基中培养的由脐带血干细胞释放的外来体的数量较高，因而浓度较高，并具有小且均匀的尺寸分布。根据本发明制备的脐带血干细胞培养基具有由于含有高水平的高效外来体而具有高的皮肤再生作用，因此可有利地用于皮肤涂覆和需要皮肤渗透的化妆品组合物和用于治疗伤口的药物组合物。

Description

制备含有由脐带血干细胞分泌的高水平高效外来体的培养基 的方法及其用途
技术领域
本发明涉及一种制备由脐带血干细胞释放高含量高效外来体的培养基的方法及其用途。
根据本发明制备的脐带血干细胞培养基含有高含量的高效外来体，该高效外来体可应用于并诱导渗透进入生物膜，如皮肤。因此，它可以有效地用作药物组合物，如伤口治疗和化妆品组合物。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells)释放各种生长因子，如表皮生长因子(epidermal growth factor)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor)和多种生长因子。因此，已知它们通过促进由成纤维细胞生产胶原蛋白(图7)而在皮肤再生中发挥重要作用。人们对使用具有这些特性的干细胞开发化妆品很感兴趣。特别是，正在进行能增加干细胞有效因子进入皮肤的渗透能力的技术开发相关研究，其中之一就是利用外来体。
外来体(exosome)是由多种类型的细胞释放出来的具有膜结构的小泡。外来体的直径据报道约为30～150nm。通过电镜研究观察到，外来体起源于被称为多泡体(MVB)的细胞内的特定区室，而不是直接从质膜上分离，并被释放和分泌出细胞外。即当多泡体与质膜融合时，小泡被释放到细胞外环境中，该小泡称为外来体。虽然还不清楚这些外来体是由什么分子机制形成的，已知的是几乎所有活细胞释放的外来体都含有如受体、蛋白质和miRNA多种成分，并在细胞间信号传导中发挥着重要作用。此外，与干细胞相比，外来体含有的动物血清相对较少，因此也可以排除由动物血清感染而引起的人畜共患病(zoonosis)的风险。考虑到外来体的这些特性，使用外来体治疗有望成为能够克服现有干细胞疗法局限性的新范例。
皮肤由表皮和真皮组成。
填充表皮的细胞包括角质细胞、黑色素细胞、树突细胞和触觉细胞。大多数表皮细胞为角质细胞(图8)。角质细胞的主要功能是形成一道屏障以抵御热、紫外线、水分流失、致病菌、真菌、寄生虫和病毒的环境破坏。许多结构蛋白(丝聚蛋白、角蛋白)、酶(蛋白酶)、脂类和抗菌肽(防御素)有助于维持皮肤的重要屏障功能。角质形成是物理屏障形成(角化)的一部分，其中，角质细胞产生越来越多的角蛋白并进行末端分化。形成最外层的完全角质化的角质细胞不断地被移除并被新细胞替代。
真皮层的厚度是表皮层(0.04mm～1.6mm)的15～40倍，占据皮肤的大部分，维持皮肤的弹性，是表皮和皮下组织之间的结缔组织。有皮肤附属器、血管、淋巴管、肌肉、神经等，真皮层主要分为两层：乳头真皮层和网状真皮层。
乳头状真皮只占真皮总厚度的一小部分，由胶原蛋白、血管和纤维细胞组成，为无血管表皮的基底层提供营养。网状真皮是占真皮大部分的层，由弹性纤维和多种基质蛋白组成，其中弹性蛋白和胶原蛋白纤维以紧密丝束排列以赋予皮肤力量和弹性。胶原蛋白占结缔组织中蛋白质总量的约25％，对真皮层的抗拉强度起着重要作用。同时，基质金属蛋白酶(MMP)是一种锌依赖性内肽酶，可水解细胞外基质(ECM)。MMP分解ECM以增加细胞移动性并使皮肤组织循环，但形成皱纹以促进皮肤老化并促进癌细胞转移。MMP的形成是由紫外线、压力、抗生素等促进的。纤连蛋白是一种存在于细胞表面、结缔组织和血液中的糖蛋白。细胞不是直接与胶原蛋白连接的，而是通过纤连蛋白。
如图9所示，成纤维细胞产生并分泌角质细胞所需的生长因子和细胞因子。角质细胞是最容易暴露在环境中的表皮细胞。成纤维细胞可以通过角质细胞激活，且通过激活，细胞外基质被改造以使皮肤层平坦。
生物膜(覆盖膜和衬里膜)是皮肤的通用术语。覆盖膜和衬里膜是连续的多细胞片层，由上皮组织与下层的结缔组织结合而成。生物膜(覆盖膜和衬里膜)包括皮肤膜(皮膜)、粘膜和浆膜(图6)。
随着现代人生活水平的提高老龄化人口增加，人们对抗衰老、改善皱纹、美白和防UV等功能化妆品的兴趣和需求逐渐增加。但是，由于大部分基本化妆品或功能化妆品是用化学物质制造的，对人体的安全问题不断被提出。因此，人们对含有天然和有机原料的产品的兴趣逐渐增加，相关产品的市场规模也逐渐增加。
在制药领域使用这些天然原料的产品的开发正在积极进行，形成了生物制药市场。生物制药是基于传统化学成分的制药的一个进步。生物制药原料是使用来源于人类或其他活生物体的细胞、组织和激素开发的。现有的化学药物具有副作用严重且只能暂时改善的缺点，但生物制药具有从根本上解决疾病的病因且没有副作用的优点，并且目前全球正在积极研究。因此，本发明旨在使用脐带血干细胞衍生的外来体作为下一代生物制药领域的主要原料。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种由脐带血干细胞以高含量释放高效外来体的培养基，以增加如皮肤的生物膜(覆盖膜和衬里膜(covering and lining membranes))的再生能力。
在本发明中，作为分析通过在补偿由含有两种或更多种生长因子的特定生长因子混合物的无血清培养基中生长脐带血干细胞而获得的培养基的结果，发现细胞外基质蛋白的含量高。作为从培养基中分离外来体并分析外来体的结果，发现外来体中活性成分的浓度高，且其功效提高。此外，还发现，当本发明的高效外来体用人成纤维细胞和角质细胞处理时，通过细胞增殖和迁移能力提高了伤口愈合能力。本发明基于这些发现。
技术方案
本发明的第一个方面提供了一种生产含有由脐带血干细胞释放的外来体的培养基的方法，包括：在补充有浓度分别为1～20ng/ml的选自由GDF-11、EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF组成的组中的一种或两种或更多种的生长因子的无血清培养基中培养脐带血干细胞的步骤，以在培养脐带血干细胞过程中，产生含有释放浓度为0.5～5×109/ml、优选1～3×109/ml的外来体的培养基。
例如，脐带血干细胞可以在补充有浓度分别为1～20ng/ml的GDF-11；以及选自由EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF组成的组中的一种或多种生长因子的无血清培养基中培养。
优选地，脐带血干细胞可以在全部添加浓度分别为1～20ng/ml的GDF-11、EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF的无血清培养基中培养。
本发明的第二方面提供了一种用于应用于皮肤或覆盖膜和衬里膜的组合物，包含通过根据本发明的第一方面的方法获得的含有外来体的培养基或从培养基中分离的外来体，作为活性成分。
本发明的第三方面提供了一种用于治疗伤口或切口的药物组合物，包含通过根据本发明第一方面的方法获得的含有外来体的培养基或从培养基中分离的外来体，作为活性成分。
以下，说明本发明。
1.干细胞培养基
成体干细胞是在必要时分化为特定组织细胞的未分化状态的细胞。成体干细胞可以是间充质干细胞、间充质基质细胞或多能干细胞，但不限于此。与从人类胚胎中提取的胚胎干细胞不同，成体干细胞具有避免伦理争议的优势，因为它们是从已经成长的人体组织如骨髓或脑细胞中提取的。在本发明中，成体干细胞可以从脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜或胎盘中提取，但不限于此。
脐带血来源的干细胞使用在供体妊娠周期(40周)期间形成的脐带血，因此与脂肪源性或骨髓源性成体干细胞不同，其优点是没有依赖于供体的情况而产生的疗效差异。
培养细胞的培养基是指含有细胞在体外生长和增殖所必需的必需成分的组合物，并包含在培养干细胞的现有技术中常用的任何培养基，例如DMEM(杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium))、MEM(最低必需培养基(Minimal EssentialMedium))、BME(基础伊格尔培养基(Basal Medium Eagle))、RPMI 1640、DMEM/F-10(杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物F-10(Dulbecco's Modified Eagle's Medium:NutrientMixture F-10))、DMEM/F-12(杜氏改良伊格尔培养基:营养混合物F-12(Dulbecco'sModified Eagle's Medium:Nutrient Mixture F-12))、α-MEM(α-最低必需培养基(α-Minimal essential Medium))、G-MEM(格拉斯哥最低必需培养基(Glasgow's MinimalEssential Medium))、IMDM(Isocove's改良杜氏培养基(Isocove's Modified Dulbecco'sMedium))、KnockOut DMEM等，但不限于此。可以使用商业制备的培养基或人工合成的培养基。本发明的培养基一般包括碳源、氮源和微量元素成分，并可进一步包括各种生长因子以及氨基酸和抗生素。
在本发明中，可以将生长因子如GDF-11、EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF加入到用于培养细胞和/或由脐带血干细胞生产的培养基中。
生长因子是指促进细胞分裂、生长和分化的蛋白质类生理活性物质，如GDF-11(生长与分化因子11)、脑源性神经营养因子(BDNF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、骨源性生长因子(BDF)、集落刺激因子(CSF)、表皮生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)等。
如实施例1～实施例5证实的，根据本发明，在无血清培养基中添加GDF-11、EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF，被解释为刺激脐带血干细胞上的对应于各自生长因子的受体的信号传导途径，并促进SMAD信号传导途径等。因此，解释为胶原蛋白和纤连蛋白的合成增加，且外来体、胶原蛋白和纤连蛋白中的生长因子的含量增加。这被解释为含有胶原蛋白、纤连蛋白和生长因子的外来体的增加影响了人成纤维细胞和角质细胞的增殖和迁移能力。此外，由于自分泌作用和旁分泌作用，EGF、FGF2、TGF-β1、VEGF和/或GDF-11的再分泌增加，促进其他生长因子的再分泌，从而影响周围细胞的增殖和迁移能力。
因此，在本发明中，培养基可以是指培养脐带血干细胞后的细胞培养基的上清液。所述脐带血干细胞培养基含有在培养脐带血干细胞过程中细胞分泌的多种生理活性物质。生理活性物质是可以影响细胞或机体功能的细胞因子、细胞生长因子、免疫调节因子等的总称，生理活性物质的例子包括VEGF(血管内皮生长因子)、EGF(表皮生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)、TFG-β(肿瘤生长因子-β)和IGF(胰岛素样生长因子)等，但不限于此。
2.由干细胞释放的外来体
外来体被评价为理想的药物递送囊泡，因为它们可以跨越细胞膜递送物质。由于这种脂双层囊泡系统可以克服皮肤渗透问题，因此被认为是将药物输送到皮肤真皮层的最有效策略之一(Saahil Arora等人，Asian Journal of Pharmaceutics，6,4,237-244,2012)。
外来体包含RNA、蛋白质、脂质和代谢物，其反映了外来体来源的细胞类型。外来体包含其来源的细胞的多种分子成分(如蛋白质和RNA)。外来体中的不同蛋白质组成取决于其来源的细胞和组织，但大多数外来体包含一组共同的进化上保守的蛋白质分子。
外来体可通过从培养细胞后获得的培养基中分离得到，外来体的尺寸和含量可受产生外来体的细胞所接收到的分子信号的影响。
在本发明中，培养基本身可以作为原材料而不分离外来体，但外来体可以分离并使用。此外，可以分离外来体以确认外来体在培养基中的尺寸和物理性质，用于质量保证等。
作为从培养基中分离外来体的方法，可以使用离心法、免疫结合法、过滤法等。
超速离心法是最常用的外来体分离方法，但不能一次性分离大量的外来体，需要昂贵的设备，分离时间长，且由于强离心可能会对外来体产生物理损伤，特别是有分离的外来体的纯度降低等缺点。在改善此缺点的方法中，可以使用PS亲和法，PS亲和法通过使用与外来体膜中存在的磷脂酰丝氨酸(PS)特异结合的物质，来提高分离的外来体的纯度。与超速离心法相比，此方法可以分离高纯度的外来体，但有收率低的缺点。
脐带血间充质干细胞(UCB-MSC)培养基中的外来体含有诸如EGF、VEGF、TGF、HGF、FGF、IGF和PDGF等多种生长因子，其含量高于脂肪组织源性间充质干细胞或骨髓源性间充质干细胞培养基中的外来体。生长因子如EGF促进成纤维细胞的增殖，成纤维细胞是皮肤的组成细胞，促进细胞迁移和胶原合成，因此UCB-MSC源性外来体可以表现出优异的皮肤状况改善效果和伤口愈合效果，如皮肤再生、皮肤弹性改善、皮肤皱纹的预防或改善、皮肤衰老的预防或改善、毛发生长或毛囊减少的恢复。
根据本发明制备的干细胞培养基不仅含有大量的外来体，而且由于其与细胞膜具有相同的脂双层结构，还提供大量的可穿透皮肤真皮层并增强再生效果的纳米级外来体。由于外来体中含有大量的生长因子，所以外来体可以通过作为皮肤细胞的成纤维细胞的增殖和活化，发挥皮肤再生和抗衰老的作用、促进胶原合成、促进毛发生长、修复减少的毛囊和伤口愈合的作用。
本发明的外来体可以产生或用作含有外来体的培养基，或可以在细胞从培养基中移除的状态下产生或使用。由于从其中去除细胞的含外来体的培养基是无细胞的制剂，所以癌症的风险很小，且没有移植排斥的问题，当全身给药时也没有微血管阻塞的风险。因为是无细胞制剂，所以有可能将药物开发为现成产品，从而降低生产成本。
本发明的特点是在补充有浓度分别为1～20ng/ml的EGF、FGF2、TGF-β1、VEGF和/或GDF-11的无血清培养基中培养脐带血干细胞，以产生具有在培养脐带血干细胞的过程中释放的0.5～5×109/ml、优选1～3×109/ml的高浓度外来体的培养基。
根据本发明，由于在加入浓度分别为1～20ng/ml的生长因子EGF、FGF2、TGF-β1、VEGF和/或GDF-11的特定培养条件下培养脐带血间充质干细胞，因此发现与通过在不添加生长因子的无血清培养基中培养脐带血干细胞产生的培养基相比，培养基中含有更高浓度的外来体(1～3×109/ml)，本发明的外来体提高人成纤维细胞和人角质细胞的迁移和增殖能力。此外，发现通过在补充有浓度分别为1～20ng/ml的EGF、FGF2、TGF-β1、VEGF和/或GDF-11的无血清培养基中培养脐带血干细胞所产生的培养基含有大量的细胞外基质纤连蛋白和/或胶原蛋白。此外，发现产生大量直径为100nm±20nm的小颗粒尺寸的外来体，其容易渗透到皮肤中。本发明基于这些发现。
根据本发明培养脐带血干细胞时产生的培养基含有大量的外来体，所述外来体含有高浓度的生长因子，分泌的外来体在高浓度下具有统一的尺寸。本发明的培养基或从培养基分离的外来体可以是生物膜(即，覆盖膜和衬里膜)如皮肤的涂覆用组合物的活性成分。
本发明可通过脐带血干细胞的细胞培养，大量生产穿透皮肤的尺寸为约100nm的外来体。此外，根据本发明的在培养脐带血干细胞后获得的细胞培养基具有高含量的外来体，所述外来体可提高人成纤维细胞的移动性和增殖，具有培养基中生物膜(覆盖膜和衬里膜)如皮肤的高通透性，且含有大量的纤连蛋白和/或胶原蛋白。因此，所述外来体是涂覆于生物膜(即，覆盖膜和衬里膜)如皮肤的制剂(如药物组合物、化妆品、准药物)的优选活性成分，或用于处理伤口或切口的药物组合物的优选活性成分，且使用时可表现出优异的疗效。
3.多种制剂
根据本发明的通过脐带血源性干细胞获得的含有外来体的培养基和/或从培养基中分离的外来体可以根据使用目的以多种方式配制。
例如，含有外来体的培养基或从培养基中分离出的外来体在处于液相时使用；被胶凝；或者被冷冻和/或干燥成粉末。
它可以与水凝胶、明胶等成分混合，然后在皮肤或生物膜(覆盖膜和衬里膜)涂覆用组合物中使用，根据这些成分的含量比例由于粘度的差异可以控制凝胶化和溶胶化。通过与组分如泊洛沙姆(poloxamer)混合，可以设计出在4℃下胶凝且在体温下溶解的制剂。
化妆品组合物可以制备成选自由以下组成的组中的制剂：溶液、外用软膏、面霜、泡沫、营养乳液、软化乳液、香水、包装、软水、隔离霜、香精、肥皂、液体洗涤剂、沐浴剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳液、膏体、凝胶、乳液、粉状、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉状粉底、乳状粉底、蜡质粉底、贴片和喷雾，但不限于此。
化妆品组合物可以进一步包括一种或多种可在一般皮肤化妆品中配制的化妆上可接受的载体，并且可以适当地混合如油、水、表面活性剂、保湿剂、低级醇、增稠剂、螯合剂、色素、防腐剂、香料等常规成分，但本发明不限于此。
化妆品组合物中所包含的化妆品上可接受的载体根据化妆品组合物的制剂而改变。
当制剂为软膏、膏体、面霜或凝胶时，可以使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石粉、氧化锌等载体成分使用，但不限于此。这些成分可以单独使用，或两种或更多种组合使用。
当制剂为粉末或喷雾时，可以使用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末等作为载体成分。尤其是在喷雾的情况下，可以另外含有推进剂，例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚，但不限于此。这些组分可以单独使用，或两种或更多种组合使用。
当制剂为溶液或乳液时，可以使用溶剂、增溶剂或乳化剂作为载体成分。例如，水、甘油、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇或1,3-丁二醇油等，但不限于此，特别是可以使用棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇的脂肪酸酯或山梨醇。这些可以单独使用，或两种或更多种组合使用。
当制剂为悬浮液时，可以使用液体稀释剂如水、甘油、乙醇或丙二醇，悬浮剂如乙氧基异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等作为载体成分，但不限于此。这些可以单独使用，或两种或更多种组合使用。
当制剂为肥皂时，可以使用脂肪酸的碱金属盐、脂肪酸半酯盐、脂肪酸蛋白水解物、羟乙磺酸盐、羊毛脂衍生物、脂肪族醇、植物油、甘油、糖等作为载体成分，但不限于此。这些可以单独使用，或两种或更多种组合使用。
在化妆品组合物中，可以包含化妆品组合物总重量的0.0001～50重量％的量的外来体，更具体地说，它可以包含0.0005～10重量％的量的外来体。当包含上述范围内的外来体时，具有表现出优异的皮肤状况改善效果的优点，且具有组合物制剂稳定的优点。
在用于诊断、治疗、改善、减轻、治疗或预防人或动物疾病目的的项目中，一般来说，准药物是指作用比药品或产品温和的产品，不包括用于制药目的的产品。其包括用于治疗或预防人类或动物疾病的产品，以及对人体有轻微或无直接作用的产品。
准药物组合物可以制备成选自由以下组成的组中的制剂：身体清洁剂、泡沫、肥皂、面膜、软膏、面霜、乳液、香精和喷雾，但不限于此。
当本发明是用于涂覆覆盖膜和衬里膜(如皮肤)的组合物，或用于治疗伤口或切口的药物组合物时，可以包括药学上可接受的载体。
“药学上可接受的”是指它可以在制药领域常规使用，在给药时不刺激机体，并且不损害给药化合物的生物活性和特性。
剂量可以是改善皮肤状况的药物有效量。“药物有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理效益/风险比治疗疾病的量，有效剂量水平可以取决于以下因素，包括受试者类型和严重程度、年龄、性别、疾病类型、药物活性、药物敏感性、给药时间、给药途径和排泄率、治疗持续时间、伴随药物以及医学领域众所周知的其他因素。此外，有效量可根据治疗途径、赋形剂的使用以及与其他试剂使用的可能性而有所不同，如本领域技术人员所了解的。
载体的类型没有特别的限制，可以使用本技术中常用的任何载体。虽然不限于此，例子包括生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、麦芽糊精、甘油、乙醇等。这些可以单独使用，或两种或更多种组合使用。
如有必要，其他药学上可接受的添加剂，如赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、缓冲剂或抑菌剂可添加和使用，并且可添加填料、增量剂、润湿剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂。
有益效果
根据本发明制备的脐带血间充质干细胞培养基含有高含量的具有尺寸均匀分布的高效外来体，并可有效地用于需要渗透皮肤的化妆品组合物和用于治疗伤口或切口的药物组合物。
附图说明
图1是根据实施例1的每种条件制备的脐带血干细胞培养基中总蛋白浓度和细胞外基质蛋白含量的对比分析结果。
图2是根据实施例1的每种条件制备的脐带血来源的干细胞培养基中存在的外来体的分布、尺寸和浓度的对比分析结果。
图3是根据实施例1的每种条件制备的脐带血来源的干细胞培养基的外来体对人成纤维细胞和角质细胞移动性影响的对比分析结果。
图4是根据实施例1的每种条件制备的脐带血来源的干细胞培养基的外来体对人成纤维细胞和角质细胞增殖能力影响的对比分析结果。
图5是用根据实施例1按照各条件准备脐带血干细胞培养基的外来体处理动物伤口模型而比较分析对皮肤细胞再生产生的影响的结果。
图6是说明皮肤的上位概念即覆盖膜和衬里膜(covering and liningmembranes)的概念图。
图7是示出由成纤维细胞产生的多种活性成分的概念图。
图8是示出皮肤表皮的主要结构特征的概念图。
图9是示出成纤维细胞和角质细胞之间相互作用的概念图。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例只是为了说明的目的，对于本领域的普通技术人员来说明显的是，本发明的范围不被解释为受这些实施例的限制。
实施例1.制备脐带血干细胞培养基及提取由脐带血干细胞释放的外来体
人脐带血干细胞在含有10％胎牛血清的KSB-3(基础培养基)中，在5％CO2培养箱中于37℃下培养1～4天，然后去除培养基，并用PBS洗涤。
分别将含有GDF-11(1～20ng/ml)、EGF(1～20ng/ml)、FGF2(1～20ng/ml)、TGF-β1(1～20ng/ml)和VEGF(1～20ng/ml)的DMEM培养基和不含这些生长因子的DMEM培养基添加到洗涤的细胞中，然后，在37℃、5％CO2培养箱中培养1～4天，然后以500g离心5分钟。分离后，分离上清液并经0.2μm～0.8μm过滤器过滤。
使用CapturemTM外来体分离试剂盒(Takara Bio)从在每种条件下生产的培养基中提取外来体，通过0.2μm～0.8μm过滤器过滤。在用PBS交换缓冲液后，使用Amicon Ultra离心过滤器(Merck Millipore)，将提取的外来体用于每次测试。
实验例1.分析脐带血干细胞培养基中细胞外基质蛋白含量
结缔组织中的细胞外基质负责细胞的结构支持，通常包含如纤连蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白成分，并在损伤组织的再生中发挥作用。
采用BCA法分析脐带血干细胞培养基中蛋白质的总量，采用酶联免疫吸附测定(ELISA测定)分析脐带血干细胞培养基中细胞外基质蛋白含量。在实施例1制备的各条件培养基与人纤连蛋白Quantikine ELISA试剂盒(R&DSystem,MN,USC)和I型前胶原C-肽(PIP)EIA试剂盒(Takara bio inc,日本)进行对比分析。
具体地，通过用不含生长因子的培养基制备的培养基(DMEM)和通过用添加浓度分别为1～20ng/ml的GDF-11、EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF的培养基制备的培养基中的总蛋白含量和细胞外基质蛋白成分含量进行比较和分析。
结果如图1(A)所示，确定在通过用添加浓度分别为1～20ng/ml的GDF-11、EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF的培养基制备的培养基中，蛋白总量和纤连蛋白含量高于对照组(DMEM)。另外，如图1(B)所示，证实了培养基中胶原蛋白(PIP)的含量高于对照组(DMEM)。
实验例2.分析脐带血干细胞培养基中存在的外来体的尺寸和浓度
从实施例1中各条件下培养制备的脐带血干细胞培养基中分离外来体后，使用Nanosight对培养基中存在的外来体的尺寸和浓度进行比较和分析。通过观察和分析以10nm～2000nm尺寸分散在溶液中的单个颗粒，Nanosight可以分析纳米颗粒尺寸的分布和浓度。
结果如图2所示，在通过使用补充有浓度为1～20ng/ml的GDF-11、EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF的培养基制备时，与使用不含这些生长因子的培养基的对照组(DMEM)相比，证实外来体的数量较高，且尺寸均匀分布在约100nm。
实验例3.脐带血干细胞培养基中外来体对人成纤维细胞和角质细胞迁移能力的作用
表皮细胞的迁移能力是伤口愈合的主要机制。为了确定脐带血干细胞培养基中的外来体对人真皮成纤维细胞(HDF)和角质细胞(HKC)迁移能力的作用，进行了Trans-well迁移测定。
将人成纤维细胞和角质细胞各自以2×104细胞/孔的比例等分到trans-well中，在37℃、5％CO2条件下培养1天，除去培养基，然后用PBS洗涤。含有在实施例1中每种条件下制备和提取的外来体的无血清DMEM以100ul/孔处理，2小时后，在底板中加入含10％血清的400ul DMEM，在37℃、5％CO2条件下培养1天。用结晶紫溶液对迁移细胞染色后，在光学显微镜下进行对比分析。
具体地，从通过使用无生长因子培养基(DMEM)和含有添加浓度分别为1～20ng/ml的GDF-11、EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF的培养基制备的培养基中提取的2×108外来体，处理人成纤维细胞。未培养脐带血干细胞的基础培养基(基础DMEM)用作阴性对照(无处理)。
结果如图3所示，证实了从通过使用添加浓度分别为1～20ng/ml的GDF-11、EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF的培养基制备的脐带血干细胞培养基中分离得到的外来体处理的人成纤维细胞和角化细胞的迁移能力与对照组相比增加。
实验例4.脐带血干细胞培养基中的外来体对人成纤维细胞和角质细胞的增殖能力的作用
在伤口愈合过程中，成纤维细胞和角质细胞的增殖也是再生过程的重要部分。为了证实培养基对人成纤维细胞和角质细胞的增殖的作用，进行了增殖测定。人成纤维细胞和角质细胞各自以1×105细胞/孔在6孔板中分配，在37℃、5％CO2条件下培养。每隔24小时测量细胞数量。
具体地，从通过使用无生长因子培养基(DMEM)和含有添加浓度分别为1～20ng/ml的GDF-11、EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF的培养基制备的培养基中提取的2×108外来体，处理人成纤维细胞和角质细胞。未培养脐带血干细胞的基础培养基(基础DMEM)用作阴性对照(无处理)。
结果如图4所示，证实了从通过使用补充有浓度分别为1～20ng/ml的GDF-11、EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF的培养基制备的脐带血干细胞培养基中分离得到的外来体处理的人成纤维细胞和角质细胞的增殖能力与对照组相比增加。
实验例5.脐带血干细胞培养中的外来体对动物伤口模型中皮肤组织再生的作用
如在体外所证实的那样，为了确认脐带血干细胞释放的外来体是否以同样的方式改善人类皮肤细胞的增殖和迁移能力，在体内(in-vivo)进行了动物伤口模型测试。在6周龄SD大鼠背部打孔形成15mm尺寸的伤口，然后用2×108外来体进行处理。14天后，确认皮肤组织的再生效果。
具体地，实施例1中从使用分别以1～20ng/ml浓度添加了GDF-11、EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF的培养基的培养基中提取2×108个各外来体，处理动物伤口模型。无任何处理的动物伤口模型用作阴性对照(NC)。
结果如图4所示，证实了从通过使用添加浓度分别为1～20ng/ml的GDF-11、EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF的培养基制备的脐带血干细胞培养基中分离得到的外来体处理的动物伤口模型的皮肤组织再生能力，显著优于对照组。

Claims (15)

1.一种生产含有由脐带血干细胞释放的外来体的培养基的方法，包括：
在补充有浓度分别为1～20ng/ml的选自由GDF-11、EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF组成的组中的一种或两种或更多种生长因子的无血清培养基中培养脐带血干细胞的步骤，以在培养脐带血干细胞的过程中生产含有释放浓度为0.5～5×109/ml的外来体的培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在补充有浓度分别为1～20ng/ml的GDF-11以及选自由EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF组成的组中的一种或多种生长因子的无血清培养基中培养脐带血干细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在补充有浓度分别为1～20ng/ml的GDF-11、EGF、FGF2、TGF-β1和VEGF的无血清培养基中培养脐带血干细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，与通过在不添加生长因子的无血清培养基中培养脐带血干细胞生产的培养基相比，在添加生长因子的无血清培养基中含有由脐带血干细胞释放的外来体的培养基，具有更高水平的细胞外基质蛋白纤连蛋白和/或胶原蛋白含量。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，与通过在不添加生长因子的无血清培养基中培养脐带血干细胞生产的培养基相比，在添加生长因子的无血清培养基中含有由脐带血干细胞释放的外来体的培养基，含有更高浓度的外来体活性成分，并且具有更高的再生皮肤的能力。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，大量生产直径为100nm±20nm的小颗粒尺寸的外来体，其容易渗透到皮肤中。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述无血清培养基为选自由DMEM(杜氏改良伊格尔培养基)、MEM(最低必需培养基)、BME(基础伊格尔培养基)、RPMI 1640、DMEM/F-10(杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物F-10)、DMEM/F-12(杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物F-12)、α-MEM(α-最低必需培养基)、G-MEM(格拉斯哥最低必需培养基)、IMDM(Isocove's改良杜氏培养基)和KnockOut DMEM组成的组中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：根据使用目的配制含有由脐带血干细胞释放的外来体的培养基或从培养基中分离出的外来体的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述含有外来体的培养基或从培养基中分离出的外来体被胶凝；或者被冷冻和/或干燥成粉末。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，与在不添加生长因子的无血清培养基中培养脐带血干细胞的过程中释放的外来体相比，在添加生长因子的无血清培养基中培养脐带血干细胞的过程中释放的外来体提高人成纤维细胞和/或人角质细胞的迁移和/或增殖能力。
11.一种皮肤或覆盖膜和衬里膜涂覆用组合物，包含通过根据权利要求1至10中任一项所述的方法获得的含有外来体的培养基或从培养基中分离的外来体，作为活性成分。
12.根据权利要求11所述的皮肤或覆盖膜和衬里膜涂覆用组合物，该组合物是化妆品组合物、准药物组合物、药物组合物。
13.根据权利要求11所述的皮肤或覆盖膜和衬里膜涂覆用组合物，其中，来自脐带血干细胞的小外来体被用作透皮载体。
14.根据权利要求11所述的皮肤或覆盖膜和衬里膜涂覆用组合物，所述组合物是通过与聚合物混合胶凝的制剂，其中所述胶凝的制剂在体温条件下溶解。
15.一种用于治疗伤口或切口的药物组合物，包含通过根据权利要求1至10中任一项所述的方法获得的含有外来体的培养基或从培养基中分离的外来体，作为活性成分。
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