KR20210116726A - 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 고농도 성장인자 함유 배양액 제조 방법 - Google Patents

동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 고농도 성장인자 함유 배양액 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210116726A
KR20210116726A KR1020200030707A KR20200030707A KR20210116726A KR 20210116726 A KR20210116726 A KR 20210116726A KR 1020200030707 A KR1020200030707 A KR 1020200030707A KR 20200030707 A KR20200030707 A KR 20200030707A KR 20210116726 A KR20210116726 A KR 20210116726A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
medium
stem cells
serum
culture medium
growth factor
Prior art date
Application number
KR1020200030707A
Other languages
English (en)
Inventor
이동열
명수진
안희진
김윤진
이미혜
Original Assignee
주식회사 프리모리스인터내셔널
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 프리모리스인터내셔널 filed Critical 주식회사 프리모리스인터내셔널
Priority to KR1020200030707A priority Critical patent/KR20210116726A/ko
Publication of KR20210116726A publication Critical patent/KR20210116726A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1808—Epidermal growth factor [EGF] urogastrone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A61K8/981—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of mammals or bird
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0056—Xeno-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/19—Growth and differentiation factors [GDF]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동하여 성장인자 함유 배양액을 제조하는 방법; 상기 방법으로 제조된 성장인자 함유 배양액; 및 상기 배양액의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따라 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동하여 성장인자 함유 배양액을 제조하는 방법은 4 ~ 5 계대배양 후 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 준비하는 제1단계; 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동 후 1 ~ 2 계대배양 하면서 안정화 및 성장시키는 제2단계; 및 해동 후 계대배양을 통해 안정화된 줄기세포를 배양하면서 성장인자 함유 배양액을 생산하는 제3단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 EGF, bFGF 및/또는 GDF-11를 다량 함유하는 배양액을 생산할 수 있다.

Description

동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 고농도 성장인자 함유 배양액 제조 방법 { Method for preparing culture medium containing high concentration of growth factors using frozen stored human umbilical cord blood stem cells }
본 발명은 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동하여 성장인자 함유 배양액을 제조하는 방법; 상기 방법으로 제조된 성장인자 함유 배양액; 및 상기 배양액의 용도에 관한 것이다.
동물세포 배양은 초대배양과 계대배양(subculture)이 있다. 초대배양이란 조직편(片)에서 세포를 분리하여 배양하는 과정이다. 계대배양이란 초대배양을 통해 얻은 세포를 지속적으로 유지하기 위해 배양하는 방법이다. 동결보존을 위해서는 혈청 배지에 동결 보호제인 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)가 첨가된 배지와 2Х106 cells/mL 농도의 세포를 혼합하여 -80 ℃ 냉동기에서 24 시간 동결한다. 동결된 세포는 액체 질소용기에 넣어 장기간 보존한다.
한편, 동물세포 배양이란 체외(in vitro)에서 인공으로 체내(in vivo)와 유사한 조건을 제공하여 세포를 대량 증식시키는 방법이다. 이때 동물세포는 현탁(suspension) 상태나 단층부착(monolayer attachment) 상태로 생장한다. 대부분의 동물세포는 표면에 부착하여 생장한다. 동물세포는 미생물보다 크고 세포 내 구성 조직이 복잡한 세포로, 생장속도가 미생물에 비하여 매우 느리기 때문에 생산성이 낮고 배양 도중 미생물에 의해 오염되기 쉽다. 배양에 필요한 고가의 혈청(serum)의 경우 조성이 완전히 알려져 있지 않다. 동물세포는 섬세한 플라스마 막(plasma membrane)으로 둘러 쌓여 있어서 전단력 (shear force)에 약하므로 산소 공급을 목적으로 한 심한 교반을 피해야 한다.
정상적인 동물세포 계통(cell line)들은 사멸성(mortal)이어서 세포분열 횟수가 한정되어 있다. 정상세포를 배양하는 경우에는 대부분 미분화 줄기세포(undifferentiated stem cell)나 전구 세포의 상태로 생장하다가 분화가 시작되면서 증식이 정지한다. 반면에 종양조직에서 유래된 세포의 경우에는 생장과 분화가 섞여 있으므로 지속으로 생장한다.
포유동물세포 배양을 위해 사용되는 배지는 미생물 배양용 배지보다 복잡하며 고가이다. 미생물 배지를 구성하는 탄소원과 에너지원, 질소원, 무기염류, 미량원소 외에도, 비타민, 생장인자, 완충제(buffering agent) 등이 포함되어야 하며 특히 5～20 %의 혈청 (serum)이 추가되어야 한다. 혈청은 호르몬, 생장인자, 비타민을 공급해 줌으로써 동물세포의 생장과 활성을 촉진시킨다. 혈청은 또한 호르몬, 미네랄, 지방 등을 운반하는 수송 단백질을 제공해 주는 등 필수적인 역할을 한다. 이외에도 단백질 분해효소(protease)의 활성을 억제하고, pH 조절용 완충제 역할을 하는 등의 장점이 있다. 그러나 그 가격이 고가이며, 혈청 내에 포함되어 있는 단백질 및 펩타이드 성분 때문에 세포배양 후 얻어지는 제품의 분리정제 공정이 매우 복잡해진다. 또한, 혈청을 멸균하기 위하여 가열법을 사용하지 못하고 여과(filtration)해야 하기 때문에 마이코플라즈마(mycoplasma). 바이러스 등에 의한 오염의 가능성을 증가시킨다. 그러나, 혈청 사용의 가장 큰 문제점은 배치(batch) 마다 혈청의 조성이 달라지기 때문에 혈청을 사용한 실험은 재현성을 얻기 어렵다는 점이다. 동일한 세포를 같은 성분의 배지에서 배양한다 하더라도 그 배양의 결과가 항상 다르게 나타난다.
이러한 문제를 극복하기 위해 무혈청(serum-free) 배지가 개발되어 왔다. 무혈청 배지 내에는 포도당, 글루타민, 다른 아미노산, 염들 이외에도 혈청 대체 물질로서 인슐린, 트렌스페린(transferrin), 셀늄(selenium)을 포함하기도 한다. 무혈청 배지는 그 구성 물질의 조성을 분명히 알 수 있어 배지 조성이 표준화되며 실험의 재현성을 높힌다. 또한, 멸균이 용이하고, 생성물의 정제가 쉽고, 가격이 비교적 저렴한 장점이 있다. 무혈청 배지는 특정 호르몬이나 성장인자를 첨가할 수 있고, 용도에 따라 맞춤 생산될 수 있으며, 통상 세포의 생장 속도가 혈청이 함유된 배지보다 느리고, 세포 계통마다 서로 다른 무혈청 배지 조성을 요구한다. 대표적인 무혈청 배지에는 Eagle's MEM(Minimal essential medium), DME(Dulbecco's modified Eagle's medium), Ham's F 12, SF 12, RPMI 1640 등이 있다.
한편, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)는 조직이나 기관의 분화된 세포들 사이에 존재하는 미분화된 성체 줄기세포로서, 골수, 지방 등 인체 내 여러 조직으로부터 분리할 수 있으며, 스스로 증식하는 자가 재생능력(self-renewal)을 가지고 있다. 또한, 체외에서 쉽게 증식이 가능하고 지방세포, 골세포, 연골세포, 근세포 등 여러 가지 다양한 조직 세포로 분화 가능하여 기존 줄기세포 연구들은 분화 기능을 이용한 재생 연구에 집중되어 왔다.
또한, 중간엽 줄기 세포를 이용한 세포치료기술이 각광을 받기 시작하면서, 인체로부터 분리된 중간엽 줄기세포를 치료에 적합하도록 개선하기 위한 기술이 개발되고 있으며, 줄기세포로부터 분비되는 다양한 성장인자 또는 단백질을 이용하여 면역조절, 항염증 등 다양한 질환에 적용하는 연구가 이루어지고 있다.
세포외기질(extracellular matrix)은 세포가 세포 밖으로 분비한 여러 가지 물질들이 형성하는 세포의 구조이다. 세포외기질은 세포의 구조적 지지와 세포 간의 연결을 마련할 뿐만 아니라, 신호전달을 비롯한 세포와 세포 사이의 소통을 위한 역할과 배아의 발생과 세포의 분화에서도 중요한 기능을 한다. 기본적으로 세포외기질은 물과 단백질, 다당류 등으로 이루어져 있으며, 각각의 조직은 생성이 시작될 때부터 나름에 맞는 형태와 위상의 세포외기질을 형성시켜 보유하고 있다. 세포외기질과 세포와의 접합은 인테그린(integrins), 디스코이딘 복합 수용체(discoidin domain receptor), 신데칸(syndecans)과 같은 세포외기질 수용체(Extracellular matrix receptor)를 통해 이루어지며, 이러한 접합은 세포 골격과 세포외기질을 연결시켜 준다. 또한 세포외기질은 매우 다이나믹한 구조를 가지고 있어 지속적으로 재형성되며, 세포외기질의 물리적, 생화학적 특성은 생물체 내 기관들이 인장력이나 탄력 등 고유한 물리적 특성을 가질 수 있게 한다. 세포외기질은 두 개의 큰 분자로 이루어져 있는데, 하나는 단백질과 복합된 다당류인 프로테오글라이칸(proteoglycan, PG)이며, 또 하나는 콜라겐, 케라틴과 같은 물에 녹지 않는 섬유상 단백질(fibrous protein)이다.
프로테오글라이칸은 세포와 조직 사이에 가장 많이 존재하는 물질로 수소화 겔(hydrated gel) 형태로 존재하며, 완충작용, 수화작용, 결합 및 저항작용 등의 성질을 이용하여, 여러가지 역할을 담당하고 있다.
섬유상 단백질의 여러 종류 중에 가장 풍부한 단백질인 콜라겐은 다세포 동물의 총 단백질의 약 30%를 차지하고 있다. 콜라겐은 세포외기질의 구조를 담당하고 탄성력과 세포 부착기작 및 세포이동과 조직의 발달에 관여하며, 또 다른 섬유상 단백질인 엘라스틴(elastin)과 연계되어 있다. 엘라스틴 섬유는 반복적인 신장 작용을 요구하는 조직의 신축성에 관여한다. 하지만 엘라스틴 섬유의 신장은 콜라겐 섬유와 긴밀히 연결되어 있기 때문에 매우 제한적이다. 또 다른 섬유상 단백질로는 파이브로넥틴(fibronectin, FN)이 있는데, 이는 세포외기질 사이를 조직화하고 세포와 세포외기질의 연결을 담당한다.
한편, 줄기세포로부터 분비되는 다양한 성장인자 또는 단백질을 의약 또는 화장품 등 산업적으로 활용하기 위해, 줄기세포 배양액 또는 줄기세포 유래 조성물에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있다. 그러나, 배양액 또는 조성물 내 성장인자를 고농도로 함유하도록 하는 기술은 아직 미비한 실정이며, 고농도의 성장인자를 포함하는 세포외기질 합성 촉진을 위한 배양액 또는 조성물을 제조하기 위한 새로운 방법이 요구된다.
본 발명은 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동하여 콜라겐과 같은 세포외기질 합성을 촉진하는 성장인자(들)을 고농도로 함유 배양액을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 제1양태는 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동하여 성장인자 함유 배양액을 제조하는 방법에 있어서,
제1단계: 4 ~ 5 계대배양 후 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 준비하는 단계;
제2단계: 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동 후 1 ~ 2 계대배양 하면서 안정화 및 성장 유도 단계; 및
제3단계; 해동 후 계대배양을 통해 안정화된 줄기세포를 배양하면서 성장인자 함유 배양액을 생산하는 단계를 포함하는 것이 특징인 성장인자 함유 배양액 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 제2양태는 제1양태에 따른 방법으로 제조된 성장인자 함유 배양액으로서, 배양액에 함유된 성장인자는 EGF, bFGF 및 GDF-11로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 성장인자를 함유하는 것이 특징인 배양액을 제공한다.
본 발명의 제3양태는 제2양태의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 재생 또는 주름 개선용 화장 조성물을 제공한다.
본 발명의 제4양태는 제2양태의 배양액을 유효성분으로 함유하는 경피 투여형 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 제5양태는 제2양태의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 재생 또는 주름 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 설명한다.
본 발명자들은, 동결된 제대혈 유래 줄기세포를 해동 후 1 계대배양하면서 안정화 및 성장시킨 실시예 1 및 2의 경우, 동결된 제대혈 유래 줄기세포를 바로 해동 후 사용하는 비교예 1에 비해 1계대 추가 배양을 통해서 세포 상태를 개선할 수 있을 뿐만 아니라, EGF, bFGF 및/또는 GDF-11를 고농도로 함유하는 배양액을 생산할 수 있고(도 4), 상기 고농도 배양액으로 배양한 섬유아세포에서 제1형 콜라겐인 PIP 생산량이 높다는 효능(도 5)을 발견하였다. 한편, 실시예 2는 실시예 1 및 비교예 1에 비해 wash-out 이후 무혈청 배지를 교체하는 단계를 없애면서, 원가를 절감시키고 제조공정의 간편화를 이루며 효능도 개선하는 최상의 공정을 확립한 것이다. 본 발명은 이에 기초한 것이다.
따라서, 본 발명에 따라 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동하여 성장인자 함유 배양액을 제조하는 방법은
4 ~ 5 계대배양 후 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 준비하는 제1단계;
동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동 후 1 ~ 2 계대배양 하면서 안정화 및 성장시키는 제2단계; 및
해동 후 계대배양을 통해 안정화된 줄기세포를 배양하면서 성장인자 함유 배양액을 생산하는 제3단계를 포함한다.
계대배양(繼代培養)은 세포 증식을 위해 2~7일마다 주기적으로 새로운 배양접시에 옮겨 세포의 대(代)를 계속 이어서 배양하는 방법이다. 제한된 배양접시 내에선 영양분이 부족하고 분비하는 대사산물에 의해 세포가 증식을 멈추게 되므로 이를 막고 세포가 증식할 수 있게끔 새로운 공간을 제공하는 것이다. 계대배양 방법은, 세포가 단층으로 자라고 멈추기 때문에 배양접시에서 세포를 떼어내어 새로운 배양접시에서 배양한다.
동물 조직에서 유래된 세포는 1차, 2차, 3차 등 계속하여 배양 가능하다. 그러나, 대부분의 세포들은 이러한 계대배양을 계속할 경우 어느 정도 배양하다 보면 더 이상 증식되지 않고 세포들이 죽게 된다. 대부분의 세포는 분열횟수가 증가함에 따라 세포노화(culture senescence)현상이 나타나고 세포의 성질이 시간에 따라 변화하기 때문에 일정 횟수만큼만 계대배양을 할 수 있다.
제1단계에서 제대혈 유래 줄기세포는 혈청 함유 배지에서 4 ~ 5 계대배양 후 동결 저장된 것일 수 있다. 상기 제대혈 유래 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있다. 예컨대, ZNF 281을 발현하는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있다.
제1단계에서 동결 저장 대상인 제대혈 유래 줄기세포는 4 ~ 5 계대배양한 것이나, 중간엽 줄기세포 기능을 잃지 않는 한, 계대배양 횟수는 가감될 수 있으며, 이 역시 본 발명의 범주에 속한다. 4 계대배양 이전의 초기(early) 세포는 안정적이지 않아 줄기세포 기능 확보 전일 수도 있으며, 6 계대배양 이후의 줄기세포는 노화 속도가 빨라질 수 있다.
본 발명은 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 이용하여 성장인자 함유 배양액을 생산하기 이전에, 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동 후 제대혈 유래 줄기세포를 혈청 함유 배지에서 1 ~ 2 계대배양하는 제2단계를 포함하는 것이 특징이다.
제2단계는 제대혈 유래 줄기세포를 해동 후 1 ~ 2 계대배양하면서 안정화 및 성장시켜, 제3단계에서 성장인자 함유 배양액을 생산할 수 있는 줄기세포의 세포수를 확보할 수 있다. 제2단계에서 1 계대 배양에는 2 내지 5일 소요될 수 있다.
해동 방법의 비제한적인 예로, 액체 질소에 저장 상태인 동결 세포 vial은 액체 질소에서 외부로 나오는 즉시 37 ~ 40°C 정도의 수조에서 신속히 해동하고, 미리 준비한 배지에 세포 현탁액을 넣어준다.
제3단계에서 배양액을 수득하는데 2 내지 6일 소요될 수 있다.
제3단계는 혈청 함유 배지에서 배양을 통해 세포수를 확보하고, 혈청 함유 배지를 무혈청 배지로 교체한 후 성장인자 함유 배양액을 생산하거나(도 1); 파종 세포수를 조절하여 무혈청 함유 배지에 시딩(seeding)하고 배지 교체없이(배지를 wash out 없이) 무혈청 배지에서 성장인자 함유 배양액을 생산할 수 있다(도 2).
놀랍게도, 배지 교체 없이 초기부터 무혈청 배지로 줄기세포를 배양하였을 때, 성장인자와 콜라겐 합성인자의 함유량이 증가되는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 일구체 예에서 제3단계는 도 1에 예시된 바와 같이, 혈청 함유 배지에서 배양을 통해 세포수를 확보하고, 혈청 함유 배지를 무혈청 배지로 교체한 후 성장인자 함유 배양액을 생산하는 것일 수 있다.
배지 교체 방법으로 wash out이 있다.
본 발명의 다른 일구체 예에서 제3단계는 도 2에 예시된 바와 같이, 파종 세포수를 조절하여 무혈청 함유 배지에 시딩(seeding)하고 배지 교체없이 무혈청 배지에서 성장인자 함유 배양액을 생산하는 것일 수 있다. 이 경우 세포 seeding 초기부터 무혈청 배지로 배양액을 제조하여 배양 단계를 단순화하고 배지교체에 따른 비용을 줄일 수 있다(실시예 2).
이때, 무혈청 함유 배지에 시딩(seeding)하는 파종 세포수를 6.0ⅹ104 내지 8.0ⅹ104 cells/cm2로 조절할 수 있다.
세포수가 하한값 미만인 경우 세포밀집도(Cell confluence)가 낮아 유효성분의 분비 효율이 감소하는 문제점이 발생할 수 있고, 세포수가 상한값 초과로 세포밀집도가 과도하게 높은 경우 세포 간격에 의한 물리적 압박로 인해 유효 성분의 분비가 감소하는 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명에서 "배지"는 생체외 (in vitro)에서 세포의 성장과 증식에 필요한 필수성분을 포함하는 조성물을 의미하는 것으로, 당해 분야에 통상적으로 사용되는 줄기세포 배양용 배지를 모두 포함하며, 예를 들어 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), KnockOut DMEM 등 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 이용할 수 있고, 이에 한정되지 않다. 본 발명의 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함하며, 아미노산, 항생제 등을 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 혈청 함유 배지에서 혈청의 비제한적인 예로는 소태아 혈청(fetal bovine serum), 송아지 혈청(bovine calf serum), 인간 혈청 및/또는 말 혈청 등이 있다.
줄기세포 배양 시 생산되는 성장인자의 종류, 이의 조합 및 그 함량은 줄기세포 유래에 따라 이의 배양방법에 따라 다르다.
본 발명의 경우는 제대혈 유래 줄기세포를 배양하여 성장인자 함유 배양액을 생산하는 것이다. 구체적으로, 본 발명은 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포 해동 후 계대배양을 통해 안정화된 줄기세포를 사용하여, 성장인자 함유 배양액을 생산하는 것이다.
본 발명에서 생산되는 배양액 내 성장인자는 엑소좀으로 분비된 것일 수 있다.
본 발명의 일구체 예에서, 제3단계는 줄기세포를 EGF, bFGF, GDF11 및 TGFb1 함유 무혈청 배지에서 배양하면서 성장인자 함유 배양액을 생산하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 성장인자 함유 배양액 제조 방법은, 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동 후 1 ~ 2 계대배양 하는 제2단계가 생략된 배양액 제조 방법 대비, EGF, bFGF 및 GDF-11로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 성장인자의 농도가 더 높은 배양액을 생산할 수 있다(도 5).
본 발명에 따른 성장인자 함유 배양액 제조 방법은, 제3단계에서 EGF을 10,000 내지 15,000 pg/ml 포함하는 배양액을 수득할 수 있고/있거나, bFGF을 200 내지 400 pg/ml 포함하는 배양액을 수득할 수 있고/있거나, GDF-11을 4,000 내지 8,000 pg/ml 포함하는 배양액을 수득할 수 있다.
GDF-11 (Growth and differentiation factor 11)은 성장분화인자로서, 섬유아세포 및 콜라겐, 엘라스틴 등 증식에 의해 피부 재생과 탄력에 도움을 줄 수 있다.
EGF (Epidermal growth factor)은 상피세포 성장인자로서, 피부성장과 재생을 촉진, 항염작용, 피부노화방지, 주름개선, 트러블개선 효과를 발휘할 수 있다.
bFGF (Fibroblast growth factor 2)는 섬유아세포 성장인자로서, 세포성장을 도와주는 피부재생 촉진자, 피부성장과 재생을 촉진, 항염작용, 피부노화방지, 주름개선, 트러블개선 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명에서 제조되는 배양액 내 성장인자들은 세포외기질(ECM) 합성을 촉진할 수 있다.
이때, 합성되는 세포외기질의 비제한적인 예로는 콜라겐, 케라틴, 엘라스틴, 파이브로넥틴 및/또는 이들의 전구체 등이 있다.
따라서, 본 발명에서 제조되는 EGF, bFGF 및/또는 GDF-11 함유 배양액은 세포외기질(ECM) 합성촉진용 원료로 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명에서 제조되는 EGF, bFGF 및/또는 GDF-11 함유 배양액은 피부 재생 또는 주름 개선용 화장 조성물, 경피 투여형 약학 조성물, 또는 피부 재생 또는 주름 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
따라서, 제3단계에서 성장인자 함유 배양액을 생산하기 위해 사용하는 무혈청 배지는 상기 배양액의 사용용도 원료에서 배제되어야 하는 물질(예, 염화콜린, 페놀레드)을 배제한 무혈청 배지인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 전술한 바와 같이 본 발명에 따라 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 이용하여 생산된 성장인자 함유 배양액을 유효성분으로 함유하는, 피부 재생 또는 주름 개선용 화장 조성물; 경피 투여형 약학 조성물; 및 피부 재생 또는 주름 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 유효성분의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
“피부 재생”은 피부 외부 및 내부 원인에 의한 손상에 대하여 피부 조직이 회복되는 것을 의미할 수 있다. 상기 외부 원인에 의한 손상은 자외선, 외부 오염 물질, 창상, 외상 등을 들 수 있으며, 상기 내부 원인에 의한 손상은 스트레스 등을 들 수 있다.
"피부 주름"은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미할 수 있는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐과 엘라스틴의 감소, 외부환경 등에 의해 유발될 수 있다.
"피부 주름 개선"이란 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 피부 재생 및 주름 개선은 피부 탄력 증진을 포함하는 것일 수 있다.
“주름 치료”는 피부에 주름이 생성되는 것을 적어도 부분적/일시적으로 정지시키는 것을 의미할 수 있다.
"피부 탄력"은 진피층에 존재하는 엘라스틴(elastin)으로 구성된 탄력섬유에 의해 나타나는데, 이러한 탄력섬유는 고무와 같이 매우 낮은 탄성계수를 가지고 있어서, 작은 힘에 의해서도 쉽게 변형되고, 또 그 힘이 제거되었을 때는 쉽게 원형으로 되돌아온다. 또한, 탄력섬유는 엘라스틴이라는 무정형의 기질에 미원섬유(microfibrils)들이 박혀 있는 형태를 띠고 있으며, 엘라스틴은 라이신에서 유래한 데스모신(desmosine)과 아이소데스모신(isodesmosine)이라는 탄력섬유에서만 발견되는 아주 톡특한 아미노산으로 구성된 단백질이다. 이러한 데스모신과 아이소데스모신 등은 긴 펩타이드사슬안에서 가교(cross-links)를 형성하고 있는데, 이러한 구조가 엘라스틴으로 하여금 고무와 같은 성질을 갖게 한다.
"피부 탄력 증진"은 엘라스틴으로 구성된 탄력섬유가 콜라겐(collagen)이라고 하는 교원섬유와 함께 존재하는데, 엘라스틴과 콜라겐이 충분히 존재하는 상태에서 피부 탄력이 유지 또는 증가되는 것을 의미할 수 있다.
상기 유효성분을 화장 조성물로 사용하는 경우, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수, 훼이셜 로션, 바디로션 등과 같은 유액, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등과 같은 크림, 에센스, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 액체 타입, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제, 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있다.
또한, 상기 화장 조성물은 상기 유효성분에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
상기 유효성분을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
또한, 상기 유효성분이 피부 외용제 제형으로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제와 같은 제형을 가질 수 있다.
상기 유효성분의 약제학적으로 허용 가능한 염은 유기산 또는 무기산을 이용하여 형성된 산 부가염일 수 있으며, 상기 유기산은, 예를 들면 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 부티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신산 모노아미드, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 시트르산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 디클로로아세트산, 아미노옥시 아세트산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 및 메탄술폰산계 염을 포함하며 무기산은 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산, 탄산 및 붕산계 염을 포함한다.　바람직하게는 염산염 또는 아세트산염 형태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 염산염 형태일 수 있다.
상기 언급된 산 부가염은 a) 상기 유효성분 및 산을 직접 혼합하거나, b) 이들 중 한 가지를 용매 또는 함수 용매 중에 용해시키고 혼합시키거나, 또는 c) 유효성분을 용매 또는 수하 용매 중의 산에 위치시키고 이들을 혼합하는 일반적인 염 제조방법으로 제조된다.
위와는 별도로 추가적으로 염이 가능한 형태는 가바염, 가바펜틴염, 프레가발린염, 니코틴산염, 아디페이트염, 헤미말론산염, 시스테인염, 아세틸시스테인염, 메티오닌염, 아르기닌염, 라이신염, 오르니틴염, 아스파르트산염 등이 있다.
또한, 본 발명의 상기 유효성분을 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 예컨대, 공지의 피부 재생 또는 주름 개선 성분을 포함할 수 있을 것이다. 추가적인 피부 재생 또는 주름 개선 성분을 포함하게 되면 본 발명의 배양액의 피부 재생 또는 주름 개선 효과는 더욱 증진될 수 있을 것이다. 상기 성분 추가 시에는 복합 사용에 따른 피부 안전성, 제형화의 용이성, 유효성분들의 안정성을 고려할 수 있다. 추가의 성분은 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 함량 범위는 피부 안전성, 상기 유효성분의 제형화 시의 용이성 등의 요건에 따라 조절될 수 있을 것이다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 주사용 멸균수, 일반 식염수 또는 인산염 완충 식염수, 슈크로스, 히스티딘, 염 및 폴리솔베이트 등과 같은 여러 성분을 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구(예, 경피)로 투여할 수 있으며, 일반 의약품 제제의 형태, 예를 들어, 임상 투여 시 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.
단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동하여 성장인자 함유 배양액을 제조하는 방법은 EGF, bFGF 및/또는 GDF-11를 다량 함유하는 배양액을 생산할 수 있다. 따라서, 상기 고농도의 성장인자 함유 배양액은 세포외기질 합성 효과가 우수하여, 세포외기질 합성을 통한 피부 재생 및 주름 개선/치료도 가능하다.
도 1은 실시예 1에 따라 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동하여 성장인자 함유 배양액을 제조하는 방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 실시예 2에 따라 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동하여 성장인자 함유 배양액을 제조하는 방법을 나타낸 순서도이다.
도 3은 비교예 1에 따라 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동하여 성장인자 함유 배양액을 제조하는 방법을 나타낸 순서도이다.
도 4는 실시예 1 및 2, 비교예 1에서 제조된 배양액 내 다양한 성장인자 함유량을 비교한 그래프이다.
도 5는 실시예 1 및 2, 비교예 1에서 제조된 배양액의 세포외기질 합성 효능을 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1. 동결 저장된 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 이용하여 세포외기질 합성 촉진용 줄기세포 배양액 제조
제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 10% 소태아 혈청을 함유하는 KSB-3(KSB-3 Complete Medium®, 강스템바이오텍, 한국)에서 5 계대 배양을 통해 충분한 세포를 확보한 후 동결 저장하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 동결되어 있는 5 계대(passage 5)의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 해동(thawing)하고, 세포를 안정화시키기 위해 10% 소태아혈청을 함유하는 KSB-3 배지를 이용하여 1 계대를 더 배양하였다. 총 6 계대 배양된 줄기세포를 이용하여 배양액을 제조하기 위해, 해동 후 계대 배양된 세포를 10% 소태아혈청을 함유하는 KSB-3 배지에 세포 부착시킨 후 대략 3일 정도 되었을 때, 즉 세포수가 80% 정도 찼을 때, PBS로 세척하고 화장품에 포함되는 것이 금지된 성분인 염화콜린(Choline chloride)과 페놀레드(phenol red)가 제외되고 EGF, bFGF, GDF11 및 TGFb1가 첨가된 DMEM(low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red) 배지 기반의 무혈청 배지로 교체하고, 배지 교체 후 4일 간 더 배양하여 배양액을 수득하였다.
실시예 2. 배지 교체 단계 없는 세포외기질 합성 촉진용 줄기세포 배양액 제조
제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 10% 소태아 혈청을 함유하는 KSB-3(KSB-3 Complete Medium®, 강스템바이오텍, 한국)에서 5 계대 배양을 통해 충분한 세포를 확보한 후 동결 저장하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, 동결되어 있는 5 계대(passage 5)의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 해동(thawing)하고, 세포를 안정화시키기 위해 10% 소태아혈청을 함유하는 KSB-3 배지를 이용하여 1 계대를 더 배양하였다. 총 6 계대 배양된 세포를 세포수 7.84ⅹ104 cells/cm2로 조절하여 시딩(seeding)하고(실시예 1에서 6 계대 배양 후 세포수가 80% 정도 찼을 때의 세포수를 시딩함), 화장품에 포함되는 것이 금지된 성분인 염화콜린(Choline chloride)과 페놀레드(phenol red)가 제외되고 EGF, bFGF, GDF11 및 TGFb1가 첨가된 DMEM 배지 기반의 무혈청 배지에서 배지 교체 단계 없이 배양하고, 배양 후 4일 째에 배양액을 수득하였다(도 2).
비교예 1. 일반 줄기세포 배양액 제조
제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 10% 소태아 혈청을 함유하는 KSB-3(KSB-3 Complete Medium®, 강스템바이오텍, 한국)에서 5 계대 배양을 통해 충분한 세포를 확보한 후 동결 저장하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 동결되어 있는 5 계대(passage 5)의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 혈청 함유 배지를 이용하여 해동(thawing)하고, 10% 소태아혈청을 함유하는 KSB-3 배지에 세포를 부착 및 4일간 배양하여, 세포수를 확보하였다. 이어서, PBS로 세척(wash out)하고, EGF, bFGF, GDF11 및 TGFb1가 첨가된 DMEM 배지 기반의 무혈청 배지로 교체하고, 배지 교체 후 4일 간 더 배양하여, 배양액을 수득하였다.
실험예 1. 배양액의 성장인자 함량 검정
실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1에서 수득된 배양액이 포함하고 있는 성장인자를 확인하기 위해, 정량 샌드위치 효소 면역분석법(Quantitative sandwich enzyme immunoassay)을 이용하여 EGF, bFGF, 및 GDF-11 양을 조사하였다. 마이크로플레이트 리더기로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료의 함량 정도는 표준곡선의 결과를 바탕으로 계산하였다.
그 결과, 도 4와 같이 실시예 1 및 실시예 2의 배양액에서의 EGF, bFGF 및 GDF-11 함량이 비교예 1보다 높았으며, 특히, 실시예 2의 배양액에 모든 성장인자가 가장 높은 농도로 함유되어 있음을 확인하였다.
실험예 2. 배양액의 세포외기질 합성 효과 검정
실험예 2-1: RT-PCR 분석
섬유아세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2ⅹ105 세포수의 밀도로 접종하고, 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 실시예1, 실시예 2 및 비교예 1에서 수득한 각 배양액을 가하고 24시간 동안 배양하였다. 이때, 대조군(Control)으로는 염화콜린(Choline chloride)가 제외된 DMEM 배지를 가하였다. 배양된 각 섬유아세포로부터 총 RNA를 수득하고, RT-Premix(Bioneer)를 이용하여 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고 하기 프라이머를 사용하여 실시간(real-time) qPCR을 수행하여, mRNA 수준에서 콜라겐 타입 1(Collagen type 1)과 엘라스틴(Elastin)의 발현 수준을 비교하였다. 이때, 내부대조군으로는 RPL13A를 사용하였다.
collagen type I F: 5'-tcaaggtttccaaggacctg-3'(서열번호 1)
collagen type I R: 5'-tcaaggtttccaaggacctg-3'(서열번호 2)
Elastin F: 5'-atcaacgttggtgctactgctt-3'(서열번호 3)
Elastin R: 5'-atctttagaggagccccaggta-3'(서열번호 4)
RPL13A F: 5'-gcacgaccttgagggcagcc-3'(서열번호 5)
RPL13A R: 5'-catcgtggctaaacaggtactg-3'(서열번호 6)
그 결과, 도 5a와 같이 실시예 2의 배양액에서 비교예 1보다 세포외기질인 콜라겐, 엘라스틴의 합성이 높은 수준으로 증가함을 확인하였다. 본 발명에 따른 제조방법은 세포외기질 합성을 촉진시키는 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 2-2: ELISA 분석
상기 실험예 2-1에서 배양된 각 섬유아세포로부터 상층액(supernatant)을 수득하고, 제1형 콜라겐인 PIP 생산량을 ELISA kit(Procollagen type 1 C-peptide ELISA kit, TAKARA MK101)를 이용하여 분석하였다(도 5b).
그 결과, 도 5b와 같이 실시예 1 및 실시예 2의 배양액에서의 PIP 생산량이 비교예 1보다 높았으며, 특히, 실시예 2의 배양액에서 PIP 생산량이 가장 높았다.
<110> Primoris International Co., Ltd. <120> Method for preparing culture medium containing high concentration of growth factors using frozen stored human umbilical cord blood stem cells <130> PMI-IP-001 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tcaaggtttc caaggacctg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcaaggtttc caaggacctg 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atcaacgttg gtgctactgc tt 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atctttagag gagccccagg ta 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcacgacctt gagggcagcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tcaaggtttc caaggacctg 20

Claims (19)

  1. 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동하여 성장인자 함유 배양액을 제조하는 방법에 있어서, 아래의 총 3단계의 내용을 포함하는 것이 특징적인 성장인자 함유 배양액 제조 방법:
    1단계 : 4~5 계대배양 후 동결저장 된 제대혈 유래 줄기세포 준비;
    2단계 : 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 해동 후 1~2계대배양하면서 안정화 및 성장 유도; 및
    3단계 : 해동 후 계대배양을 통해 안정화된 줄기세포를 배양하면서 성장인자 함유 배양액을 생산.
  2. 제1항에 있어서, 제3단계는 혈청 함유 배지에서 배양을 통해 세포수를 확보하고, 혈청 함유 배지를 무혈청 배지로 교체한 후 성장인자 함유 배양액을 생산하는 것이 특징인 성장인자 함유 배양액 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제3단계는 파종 세포수를 조절하여 무혈청 함유 배지에 시딩(seeding)하고 배지 교체 없이 무혈청 배지에서 성장인자 함유 배양액을 생산하는 것이 특징인 성장인자 함유 배양액 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 무혈청 함유 배지에 시딩(seeding)하는 파종 세포수를 6.0ⅹ104 내지 8.0ⅹ104 cells/cm2로 조절하는 것이 특징인 성장인자 함유 배양액 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 제2단계는 해동 후 제대혈 유래 줄기세포를 혈청 함유 배지에서 1 ~ 2 계대배양 하는 것이 특징인 성장인자 함유 배양액 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 제3단계는 줄기세포를 EGF, bFGF, GDF11 및 TGFb1 함유 무혈청 배지에서 배양하면서 성장인자 함유 배양액을 생산하는 것이 특징인 성장인자 함유 배양액 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서, 제3단계는, 제2단계가 생략된 배양액 제조 방법 대비, EGF, bFGF 및 GDF-11로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 성장인자의 농도가 더 높은 배양액을 생산하는 것이 특징인 성장인자 함유 배양액 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서, 제3단계에서 수득 되는 성장인자 함유 배양액은 EGF을 10,000 내지 15,000 pg/ml 포함하는 것이 특징인 성장인자 함유 배양액 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서, 제3단계에서 수득 되는 성장인자 함유 배양액은 bFGF을 200 내지 400 pg/ml 포함하는 것이 특징인 성장인자 함유 배양액 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서, 제3단계에서 수득 되는 성장인자 함유 배양액은 GDF-11을 4,000 내지 8,000 pg/ml 포함하는 것이 특징인 성장인자 함유 배양액 제조 방법.
  11. 제1항에 있어서, 제1단계에서 제대혈 유래 줄기세포는 혈청 함유 배지에서 4 ~ 5 계대배양 후 동결 저장된 것이 특징인 성장인자 함유 배양액 제조 방법.
  12. 제1항에 있어서, 제대혈 유래 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것이 특징인 성장인자 함유 배양액 제조 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 성장인자 함유 배양액은 세포외기질(ECM) 합성촉진용 원료로 사용되는 것이 특징인 성장인자 함유 배양액 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 제3단계에서 성장인자 함유 배양액을 생산하기 위해 사용하는 무혈청 배지는 상기 배양액의 사용용도 원료에서 배제되어야 하는 물질을 배제한 무혈청 배지인 것이 특징인 성장인자 함유 배양액 제조 방법.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 성장인자 함유 배양액으로서, 배양액에 함유된 성장인자는 EGF, bFGF 및 GDF-11로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 성장인자인 것이 특징인 배양액.
  16. 제15항에 있어서, 배양액은 피부 재생, 및/또는 주름을 개선 또는 치료할 수 있는 것이 특징인 배양액.
  17. 제15항에 기재된 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 재생, 탄력 또는 주름 개선용 화장 조성물.
  18. 제15항에 기재된 배양액을 유효성분으로 함유하는 경피 투여형 약학 조성물.
  19. 제15항에 기재된 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 재생 또는 주름 치료용 약학 조성물.
KR1020200030707A 2020-03-12 2020-03-12 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 고농도 성장인자 함유 배양액 제조 방법 KR20210116726A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200030707A KR20210116726A (ko) 2020-03-12 2020-03-12 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 고농도 성장인자 함유 배양액 제조 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200030707A KR20210116726A (ko) 2020-03-12 2020-03-12 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 고농도 성장인자 함유 배양액 제조 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210116726A true KR20210116726A (ko) 2021-09-28

Family

ID=77923080

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200030707A KR20210116726A (ko) 2020-03-12 2020-03-12 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 고농도 성장인자 함유 배양액 제조 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20210116726A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2017202287B2 (en) Composition for differentiation induction of adipocyte containing stem cell-derived exosome, regeneration of adipose tissue, and skin whitening or wrinkle improvement
RU2280459C2 (ru) Средство для изменения скорости роста или репродукции клеток, способ его получения, способ стимуляции заживления ран или лечения ожогов, способ коррекции косметического дефекта, способ ингибирования старения кожи и способ стимуляции роста волос
US20050287182A1 (en) Cosmetic or dermatological preparation comprising a nutrient medium phase
US20070292400A1 (en) Media conditioned by human embryonic stem cells or other progenitor cells and uses therefor
US20110294731A1 (en) Skin cream
EP1609462B1 (en) Cosmetic or dermatological preparation comprising a nutrient medium phase
US20120027732A1 (en) Thermoreversible collagen
EP4137561A1 (en) Method for preparing culture medium containing high levels of high-potency exosomes secreted by cord blood stem cells, and use thereof
KR20120104771A (ko) 3차원 세포배양으로 수득한 조건 배지를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물
JP6583679B2 (ja) 酵母抽出物を用いた幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤
US10842735B2 (en) Hair growth-promoting composition
JP6535505B2 (ja) マンネンタケ抽出物を用いた幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤
KR20220079490A (ko) Gdf-3를 고발현하는 제대혈 줄기세포 분리 및 배양 방법 및 gdf-3의 용도
KR20210116726A (ko) 동결 저장된 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 고농도 성장인자 함유 배양액 제조 방법
KR102053707B1 (ko) 섬유아세포의 조건배지와 기능성 펩타이드를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물
JP6571494B2 (ja) アイヌワカメを用いた幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤
KR20100126945A (ko) 피부세포 재생용 조성물, 그 제조 방법, 피부세포 재생 방법 및 화장료 조성물
JP6867726B1 (ja) 皮膚の健康状態を増進及び／又は改善するための組成物
JP6468895B2 (ja) 幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤
EP3216858A1 (en) Agent for maintaining stem cells in undifferentiated state and agent for promoting growth thereof
KR20160064954A (ko) 발모촉진 방법
JP6529791B2 (ja) 幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤
CN111939176B (zh) 一种含有脂肪干细胞的皮肤损伤修复剂及制备方法
JP2018030787A (ja) 幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤
KR102083211B1 (ko) 발효 용암해수염을 함유하는 탈모방지 또는 발모개선용 조성물