KR20230054445A - 중추신경 질환의 치료용 조성물, 중추신경 질환의 치료용 조성물의 제조 방법 및 중추신경 질환의 치료용 제재의 제조 방법 - Google Patents
중추신경 질환의 치료용 조성물, 중추신경 질환의 치료용 조성물의 제조 방법 및 중추신경 질환의 치료용 제재의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
중추신경 질환의 치료용 조성물, 중추신경 질환의 치료용 조성물의 제조 방법 및 중추신경 질환의 치료용 제재의 제조·보존 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 중추신경 질환의 치료용 조성물로서, 무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 함유하는 치료용 조성물에 의해 상기 과제를 해결한다.
Description
본 발명은 중추신경 질환의 치료용 조성물, 중추신경 질환의 치료용 조성물의 제조 방법, 중추신경 질환의 치료용 제재의 제조 방법 및 중추신경 질환의 치료용 제재의 보존 방법에 관한 것이다.
뇌경색, 두부 외상, 척수 손상, 뇌혈관성 인지증, 알츠하이머병 및 파킨슨병 등의 뇌 또는 척수와 같은 중추신경계의 이상 또는 손상을 원인으로 하는 질환(이하, '중추신경 질환'이라고도 한다)의 치료로서 경구 혹은 주사에 의한 투약 또는 외과적 치료 등이 행해지고 있다. 그러나, 이들 치료는 대증요법(symptomatic therapy)으로, 중추신경 질환에 대한 치료 방법은 충분히 확립되어 있지 않다.
중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)는 골수, 지방, 활막, 치조골 및 치근막 등의 조직으로부터 뿐만이 아니라, 태반, 제대혈 및 탯줄 등의 여러 가지의 조직으로부터도 단리할 수 있다. 또한, 중간엽 줄기세포는 생체외에서 배양해 증식시킬 수도 있다. 게다가 중간엽 줄기세포는, 중간엽 세포(예를 들면, 골아세포, 지방 세포 및 연골 세포) 뿐만이 아니라, 비중간엽 세포(예를 들면, 신경 전구 세포 및 간 세포)로 분화 가능한 다분화능을 갖는 것으로부터, 재생 의료 또는 세포 치료에 이용되는 세포를 제조하기 위한 원료로서의 이용이 기대되고 있다.
중간엽 줄기세포의 배양은, 예를 들면 소태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) 등의 혈청 함유 배지를 이용해 행해진다. 이 혈청은 생체외에서의 세포의 성장 혹은 증식을 촉진하기 위한 영양원 또는 호르몬 등의 생리 활성 물질의 공급원으로서 이용되고 있다. 그러나, 혈청 함유 배지에서 세포를 배양하면, 혈청중에 혼입되어 있는 미지의 병원체(바이러스, 병원성 프리온 등)에 의해 배양 세포가 오염될 위험성이 있다. 이 문제를 회피하기 위해, 혈청을 함유하지 않는 무혈청 배지를 이용하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 특허 문헌 1∼3에는 중간엽 줄기세포의 배양에 이용되는 무혈청 배양이 기재되어 있다.
중간엽 줄기세포가 갖는 기능은 다종 다양하여, 현재 이용되고 있는 중간엽 줄기세포의 기능은 그 일부이다. 이 때문에, 중추신경 질환 등의 질환에 대해 중간엽 줄기세포를 이용한 새로운 치료 어프로치의 개발이 기대되고 있지만, 어떤 중간엽 줄기세포가 중추신경 질환의 치료에 적합한지에 대해서는 불명확했다.
본 발명의 일 형태는, 중추신경 질환의 치료에 바람직하게 이용되는, 중간엽 줄기세포를 함유하는 중추신경 질환의 치료용 조성물 등을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 중간엽 줄기세포가 중추신경 질환에 미치는 영향에 대해 예의 검토하는 과정에서, 무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포가 혈청 배지내에서 배양한 중간엽 줄기세포에 비해 현저히 높은 중추신경 질환에 대한 유효성(예를 들면, 면역 조절 작용, 항염증 효과, 혈관 신생 효과 및 신경 보호 효과)을 갖는 것을 알아내 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 일 실시 형태는 다음과 같은 구성이다.
본 발명의 중추신경 질환의 치료용 조성물은, 무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 중추신경 질환의 치료용 조성물의 제조 방법은, 무혈청 배지내에서 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 중추신경 질환의 치료용 제재의 제조 방법은, 무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 동결을 위한 보존액에 현탁시키고, 얻어진 현탁액을 동결하는 동결 보존 공정과, 현탁액을 융해해, 중간엽 줄기세포가 투여에 적절한 농도가 되도록, 현탁액을 희석하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명의 중추신경 질환의 치료용 조성물을 구성하는 중간엽 줄기세포에 대해, '무혈청 배지내에서 배양' 등의 제조 공정으로 특정하고 있다. 본 발명자들은 본 발명에 이용되는 중간엽 줄기세포와 종래의 중간엽 줄기세포(구체적으로는, 혈청 배지내에서 배양된 중간엽 줄기세포)의 사이에, 발현량이 상이한 유전자(환언하면, 유전자 마커)가 존재하는지 시험을 실시했다. 그 결과, 방대한 종류의 유전자의 발현량이 상이한 것이 밝혀졌지만, 이들 유전자 가운데 어느 유전자가 본 발명에 이용되는 중간엽 줄기세포와 종래의 중간엽 줄기세포를 구별하는데 있어서 중요한 것인지를 특정하는데에는 도달하지 못했다. 어느 유전자가 본 발명에 이용되는 중간엽 줄기세포와 종래의 중간엽 줄기세포를 구별하는데 있어서 중요한지를 특정하기 위해서는 더욱 방대한 시간과 노력이 필요하다. 따라서 출원시에 있어서, 본 발명의 중추신경 질환의 치료용 조성물에서의 중간엽 줄기세포를 구조 또는 특성에 의해 직접 특정하는 것은 불가능하거나 또는 실제적이지 않은 사정이 존재하는 것으로 결론 지었다.
중추신경 질환의 치료에 바람직하게 이용되는, 중간엽 줄기세포를 함유하는 중추신경 질환의 치료용 조성물 등을 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 1에 따른 평가 방법 순서의 개요를 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예 1에서 신경증상 점수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 1에서 총뇌경색소의 면적을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예 2에 따른 평가 방법 순서의 개요를 나타낸 도면이다.
도 5는 실시예 2의 실험예 2-1에서 BBB 점수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 실시예 2의 실험예 2-2에서 BBB 점수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예 1에서 신경증상 점수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 1에서 총뇌경색소의 면적을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예 2에 따른 평가 방법 순서의 개요를 나타낸 도면이다.
도 5는 실시예 2의 실험예 2-1에서 BBB 점수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 실시예 2의 실험예 2-2에서 BBB 점수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명의 일 실시 형태에 대해 설명한다. 하지만, 본 발명이 이하에 설명하는 각 구성으로 한정되는 것은 아니며, 특허 청구의 범위에 기재하는 범위에서 여러 가지 변경이 가능하다. 또한, 다른 실시 형태 및 실시예에 각각 개시된 기술적 수단을 적절히 조합해 얻어지는 실시 형태 및 실시예에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 한편, 본 명세서에 기재된 학술 문헌 및 특허 문헌은 모두 본 명세서에 있어서 참고 문헌으로서 원용된다. 또한, 본 명세서에 있어서 특별히 기재하지 않는 한, 수치 범위를 나타내는 'A∼B'는 'A 이상(A를 포함하고 A보다 큼) B 이하(B를 포함하고 B보다 작음)'를 의도한다.
본 명세서에 있어서, '무혈청 배지'란 혈청을 함유하지 않는 배지인 것이 의도되고, '무혈청 배양'이란 혈청을 이용하지 않는 배양인 것이 의도된다. 또한, 본 명세서에 있어서, '중간엽 줄기세포'는 중간엽에 속하는 세포에 유래하는 줄기세포를 의미한다. 또한, 중간엽 줄기세포로부터 특정의 성질을 갖는 것을 다시 단리한 것, 중간엽 줄기세포에 대해 사이토카인 자극 등의 어떠한 자극을 준 것, 유전자 도입한 것도 포함된다. 예를 들면, MUSE 세포, MAPC 세포 등도 포함된다. 중간엽 줄기세포는 인간 중간엽 줄기세포인 것이 바람직하지만, 래트, 마우스 등의 비인간 포유동물 유래 중간엽 줄기세포라도 된다. 또한, 활막은 관절 내의 대퇴골 또는 관절포를 덮는 섬유성 활막과 슬개하 지방체의 지방성 활막으로 대별된다. 본 명세서에 있어서 '활막 유래의 중간엽 줄기세포'란, 섬유성 활막 유래의 중간엽 줄기세포 및 지방성 활막 유래의 중간엽 줄기세포의 양쪽 모두를 의도한다.
또한, 본 명세서에 있어서 '중추신경 질환의 치료용 조성물'은, 중추신경 질환의 회복·재생을 촉진하는 효과를 갖는 약제를 의도한다. 중추신경 질환의 치료용 조성물은, 중간엽 줄기세포를 본래의 상태인 채로 기능을 변화시키지 않고 이용한 것 뿐만 아니라, 특정 조건하에서 배양 및 증식시킴으로써 분비능 및 분화능 등의 기능을 향상시킨 세포를 이용한 것도 포함한다.
[1. 중추신경 질환의 치료용 조성물의 제조 방법]
본 발명의 일 실시 형태에 따른 중추신경 질환의 치료용 조성물의 제조 방법(이하, '본 실시 형태의 제조 방법'이라고도 한다)은, 무혈청 배지내에서 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 배양하는 공정을 포함하는 방법이다.
(1-1. 무혈청 배지)
본 실시 형태의 제조 방법에 있어서, 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 배양하는 무혈청 배지의 조성은 특별히 한정되지 않고, 공지의 무혈청 배지의 조성을 적절하게 사용할 수 있다. 무혈청 배지를 구성하기 위한 기초 배지는, 공지의 포유동물 세포용 배지라면 특별히 한정되지 않고, 바람직한 기초 배지로는, 예를 들면 Ham's F12 배지, DMEM 배지, RPMI-1640 배지, MCDB 배지 등을 들 수 있다. 이들 기초 배지는 단독으로 사용되어도 되고, 복수를 혼합해 사용되어도 된다. 일 실시 형태에 있어서, 무혈청 배지를 구성하기 위한 기초 배지는 MCDB와 DMEM을 1:1의 비율로 혼합한 배지가 바람직하다.
일 실시 형태에 있어서, 상기 기초 배지에, 예를 들면 PDGF(Platelet-derived Growth Factor), EGF(Epidermal Growth Factor), TGF-β(Transforming Growth Factor-β), HGF(Hepatocyte Growth Factor), 적어도 1개의 인 지방질 및 적어도 1개의 지방산 등을 첨가한 무혈청 배지가 이용되어도 된다.
이와 같은 무혈청 배지를 중간엽 줄기세포의 배양에 사용함으로써, 무혈청 배지내로의 미지의 병원체(바이러스, 병원성 프리온 등)의 혼입에 의한 배양 세포의 오염을 방지할 수 있고, 또한 혈청 함유의 배지를 사용한 경우와 동등 이상의 증식 촉진 효과를 얻을 수 있다.
기초 배지에 대한 PDGF의 함유량은, 최종 농도로 0.5∼100 ng/mL인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 10 ng/mL이다. 기초 배지에 대한 EGF의 함유량은, 최종 농도로 0.5∼200 ng/mL인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 20 ng/mL이다.
기초 배지가 TGF-β를 함유하는 경우, 기초 배지에 대한 TGF-β의 함유량은, 최종 농도로 0.5∼100 ng/mL인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 10 ng/mL이다. 기초 배지가 HGF를 함유하는 경우, 기초 배지에 대한 HGF의 함유량은, 최종 농도로 0.1∼50 ng/mL인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 5 ng/mL이다.
기초 배지에 대한 인 지방질의 총함유량은, 최종 농도로 0.1∼30 μg/mL인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 10 μg/mL이다. 기초 배지에 대한 지방산의 총함유량은 기초 배지의 중량의 1/1000∼1/10인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 1/100이다.
기초 배지에 첨가하는 인 지방질로는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 포스파티드산, 리조포스파티드산, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜글리세롤 등을 들 수 있으며, 이들의 인지질을 단독으로 이용해도 되고, 조합(예를 들면, 포스파티드산과 포스파티딜콜린을 조합)하여 이용해도 된다. 이들의 인지질은 동물 유래의 것이라도 되고, 식물 유래의 것이라도 된다.
기초 배지에 첨가하는 지방산으로는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 리놀레산, 올레인산, 리놀렌산, 아라키돈산, 미리스틴산, 팔미토일산, 팔미트산 및 스테아린산 등을 들 수 있으며, 이들 지방산을 단독으로 이용해도 되고, 조합해 이용해도 된다. 또한, 본 실시 형태에 따른 무혈청 배지는, 상기 지방산 이외에 콜레스테롤을 더 함유해도 된다.
본 명세서에 있어서, PDGF는 혈소판 유래 증식 인자(PDGF) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자가 의도되어, PDGF-BB 또는 PDGF-AB인 것이 바람직하다. 또한, 본 명세서에 있어서, EGF는 상피 증식 인자(EGF) 패밀리로부터 선택되는 증식 인자가 의도된다.
또한, 무혈청 배지는, 결합 조직 증식 인자(Connective Tissue Growth Factor, CTGF), 혈관내피 증식 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 및 아스코르브산 화합물 중 어느 하나를 더 함유하고 있어도 된다.
본 명세서에 있어서, 아스코르브산 화합물은 아스코르브산(비타민 C) 혹은 아스코르브산 2인산, 또는 이들과 유사한 화합물이 의도된다.
또한, 무혈청 배지는 지방질 산화 방지제를 함유하고 있어도 되고, 지방질 산화 방지제로는 DL-α-토코페롤 아세테이트(비타민 E) 등을 들 수 있다. 또한, 무혈청 배지는 계면활성제를 한층 더 함유하고 있어도 되고, 계면활성제로는 Pluronic(등록상표) F-68 또는 Tween(등록상표) 80 등을 들 수 있다.
무혈청 배지는 인슐린, 트랜스페린, 덱사메타손, 혈청 알부민 및 셀레네이트를 더 함유하고 있어도 된다. 본 명세서에 있어서 인슐린은, 인슐린 유사 증식 인자라도 되고, 천연의 세포 유래라도 되고, 유전자 재조합에 의해 제조된 것 이라도 된다. 한편, 무혈청 배지가 덱사메타손, 인슐린 및 혈청 알부민 중 적어도 어느 1개를 함유하면, 중간엽 줄기세포의 생존 기간의 연장 및 중간엽 줄기세포의 증식 항진이라고 하는 효과를 나타낸다.
또한, 본 실시 형태의 제조 방법에서의 무혈청 배지는 공지의 무혈청 배지를 사용해도 된다. 공지의 무혈청 배지로는, 예를 들면 STK(등록상표)1(주식회사 투셀), STK(등록상표)2(주식회사 투셀), 인간 중간엽 줄기세포 전용 완전 합성 배지 키트(MSCGM-CD BulletKit)(Lonza), 중간엽 줄기세포 증식 배지 DXF: Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF(Ready-touse)(PromoCell GmbH.), Stem Pro MSC SFM Xeno Free(Thermo Fisher Scientific Inc.) 및 MesenCult-ACF Medium Kit(STEMCELL Technologies Inc.) 등을 들 수 있다.
(1-2. 배양 조건)
본 실시 형태의 제조 방법에서는, 전술한 무혈청 배지에, 인간 등의 동물 조직 또는 세포로부터 종래 공지의 방법에 의해 단리한 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 파종해 배양한다. 배양 조건으로 예를 들면, 배지 1 mL에 대해 1∼500 mg의 조직편(중간엽 줄기세포를 포함한다)으로부터 분리한 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 파종하는 것이 바람직하고, 배양 온도는 37℃±1℃, 5% CO2하인 것이 바람직하다.
배양 시간은 특별히 한정되지 않고, 활막 유래의 중간엽 줄기세포가 목적하는 농도에 도달하는 배양 시간이면 된다. 예를 들면, 배양 시간은 1∼5시간이라도 되고, 1∼10시간이라도 되고, 1∼20시간이라도 되고, 1시간∼1일간이라도 되고, 1시간∼10일간이라도 되고, 1시간∼30일간이라도 되고, 1시간∼50일간이라도 되고, 30시간∼70시간이라도 되고, 40시간∼70시간이라도 되고, 50시간∼70시간이라도 된다. 이와 같이 배양하는 것에 의해, 면역 억제능을 유지 또는 향상시킨 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 효율 높게 대량으로 얻을 수 있다.
본 실시 형태의 제조 방법에서 이용되는 활막 유래의 중간엽 줄기세포는, 특별히 제한되지 않지만, 초대의 중간엽 줄기세포, 즉, 인간 등의 동물 조직으로부터 채취한 후 한번도 계대 배양을 거치지 않은 세포인 것이 바람직하다.
배양에 이용하는 배양 용기는, 활막 유래의 중간엽 줄기세포가 증식할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 팔콘(Falcon)사의 75㎠ 플라스크, Sumitomo Bakelite의 75㎠ 플라스크 등을 바람직하게 이용할 수 있다. 단, 세포에 따라서는, 이용하는 배양 용기의 종류에 따라 세포의 증식이 영향을 받는 경우가 있다. 이 때문에, 중간엽 줄기세포를 보다 효율적으로 증식시키기 위해, 증식시키는 대상이 되는 중간엽 줄기세포(이하, '증식 대상 세포'라고도 한다)마다, 증식에 적합한 배양 용기를 이용해 배양을 실시하는 것이 바람직하다.
증식에 적합한 배양 용기의 선택 방법으로는, 예를 들면 최적인 배양 용기를 증식 대상 세포에게 선택시키는 방법을 들 수 있다. 구체적으로 설명하면, 복수 종류의 배양 용기를 준비해, 배양 용기의 종류가 다른 것 외에는 동일한 배양 조건으로 증식 대상 세포를 증식시키고, 배양 개시로부터 2주 후의 세포수를 공지의 방법에 따라 계측해, 세포수가 많은 것으로부터 차례로 증식 대상 세포의 증식에 적합한 배양 용기라고 판단할 수 있다. 또한, 증식 대상 세포의 증식 속도가 빠른 경우는, 배양 개시로부터 2주가 경과하기 전이라도, 컨플루언트(confluent) 상태의 80∼90%의 세포수에 도달하는 기간이 짧은 것으로부터 차례로 증식 대상 세포의 증식에 적합한 배양 용기이라고 판단할 수 있다.
한편, 중간엽 줄기세포의 증식에는 세포가 배양 용기에 접착하는 것이 필수 조건이므로, 배양 용기에 대한 증식 대상 세포의 접착이 약한 경우에는, 무혈청 배양시에 무혈청 배지에 세포 접착 분자를 더 함유시키는 것이 바람직하다. 세포 접착 분자로는, 예를 들면 피브로넥틴, 콜라겐, 젤라틴 등을 들 수 있다. 이들 세포 접착 분자는 1종을 단독으로 이용해도 되고, 복수 종류를 조합해 이용해도 된다.
무혈청 배지에 대한 세포 접착 분자의 함유량은, 최종 농도로 1∼50 μg/mL인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 5 μg/mL이다. 일 실시 형태에 있어서, 세포 접착 분자로서 피브로넥틴을 이용하는 경우에는, 무혈청 배지에 대한 피브로넥틴의 최종 농도가 5 μg/mL가 되도록 첨가함으로써 배양 용기에 대한 증식 대상 세포의 접착 효율을 향상시킬 수 있다.
또한, 무혈청 배양에서는, 중간엽 줄기세포를 적어도 1회 계대해도 된다. 중간엽 줄기세포는 부착 의존적으로 증식(anchorage dependent growth)하므로, 중간엽 줄기세포가 국소적으로 치우쳐 증식하고 있는 등의 경우에, 중간엽 줄기세포의 증식 도중에 중간엽 줄기세포를 계대함으로써 배양 조건을 개선할 수 있다.
중간엽 줄기세포의 계대 방법으로는 특별히 한정되지 않고, 종래 공지의 중간엽 줄기세포의 계대 방법을 이용해 계대할 수 있다. 계대 후의 중간엽 줄기세포 상태가 양호한 것으로부터, 계대를 실시하는 경우에 포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하지 않은 세포 박리제를 이용해 중간엽 줄기세포를 박리하는 것이 바람직하다. '포유류 및 미생물 유래의 성분을 함유하지 않은 세포 박리제'로는, 예를 들면 TrypLE Select(Life Technologies) 또는 ACCUTASE(Innovative Cell Technologies, Inc.)를 들 수 있다.
[2. 중추신경 질환의 치료용 조성물]
본 발명의 일 실시 형태에 따른 중추신경 질환의 치료용 조성물(이하 '본 실시 형태의 치료용 조성물'이라고 한다)은 무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 함유하고 있다.
본 실시 형태의 치료용 조성물에 함유되는 활막 유래의 중간엽 줄기세포는, [1. 중추신경 질환의 치료용 조성물의 제조 방법]의 란에서 설명한, 무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포이다. 즉, 본 실시 형태의 치료용 조성물에 함유되는 중간엽 줄기세포는, 전술한 중추신경 질환의 치료용 조성물의 제조 방법에서 증식한 활막 유래의 중간엽 줄기세포이다.
본 실시 형태의 치료용 조성물은, 중추신경 질환의 회복·재생을 촉진하는 효과를 갖는다. 중간엽 줄기세포는 골수, 지방 및 탯줄 등의 유래 조직에 따라 분화능 및 분비 인자의 발현이 상이한 것이 알려져 있다. 본 발명자들은, 무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포가 혈청 함유의 배지내에서 배양한 중간엽 줄기세포에 비해 높은 면역 조절 작용, 항염증 효과, 혈관 신생 효과 및 신경 보호 효과를 갖는다는 것을 알아냈다. 이 때문에, 혈청 함유의 배지내에서 배양한 중간엽 줄기세포를 이용한 경우에는 실현할 수 없는, 현저히 높은(환언하면, 임상 현장에서 이용 가능한 정도로 높은) 중추신경 질환에 대한 치료 효과를 가질 것으로 생각된다. 중간엽 줄기세포를 이용한 중추신경 질환의 치료를 목적으로 하는 연구는 많이 행해져 왔지만, 이와 같은 연구에서는 통상, 중추신경계의 중간엽 줄기세포(예를 들면, 골수 등)가 많이 이용되어 왔다. 그러나, 중추신경계와 관련이 적다고 생각되고 있었던, 운동기의 구조체인 활막에 유래하는 중간엽 줄기세포가 무혈청 배지내에서 배양됨으로써, 중추신경 질환의 회복·재생을 현저히 촉진하는 효과를 나타낸다는 것은 본 발명자들에 의한 신규 지견이다.
또한, 본 실시 형태의 치료용 조성물은 무혈청 배양한 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 함유하고 있으므로, 혈청중에 혼입되어 있는 미지의 병원체(바이러스, 병원성 프리온 등)가 환자의 체내로 투여될 위험성이 없다. 또한, 혈청은 매우 고가이고, 또한 천연 제품이기 때문에 로트별로 성분의 차이가 생기므로, 세포 증식 효과에 편차가 생기기 쉽지만, 본 발명에서는 혈청을 사용하지 않기 때문에 이러한 문제가 생기지 않는다. 게다가 배양 후의 중간엽 줄기세포로부터 혈청 유래의 단백질 등을 제거하기 위해서 정제를 실시할 필요가 없기 때문에, 작업의 효율화를 도모할 수 있다.
본 실시 형태의 치료용 조성물이 효능을 나타내는 중추신경 질환은 특별히 한정되지 않는다. 이와 같은 중추신경 질환으로서 예를 들면, 뇌경색, 뇌출혈, 두부 외상, 척수 손상, 알츠하이머병, 뇌혈관성 인지증, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다발성 경화증 및 근위축성 측색경화증 등을 들 수 있다.
본 실시 형태의 치료용 조성물은, 무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포로 이루어지는 약제라도 되지만, 무혈청 배지내에서 배양된 중간엽 줄기세포 외에 약학적으로 허용되는 첨가제(예를 들면, 완충제, 산화 방지제, 증점제 및 부형제)를 함유할 수 있다.
상기 첨가제의 양은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 본 실시 형태의 치료용 조성물의 0.01∼50 중량%, 0.01∼40 중량%, 0.01∼30 중량%, 0.01∼20 중량%, 0.01∼10 중량% 또는 0.01∼1 중량%일 수 있다.
본 실시 형태의 치료용 조성물에 함유되는 중간엽 줄기세포의 수는, 특별히 한정되지 않고, 투여 대상의 체중에 따라 적절하게 설정하는 것이 가능하다. 예를 들면, 1투여당 1×102 세포∼1×1010 세포, 1×103 세포∼1×1010 세포, 1×104 세포∼1×1010 세포, 1×105 세포∼1×1010 세포 또는 1×106 세포∼1×1010 세포일 수 있다. 물론, 1투여당 1×1010 세포 이상이라도 된다.
상기 치료용 조성물의 투여 방법으로 예를 들면, 정맥 주사, 동맥 주사 및 국소(척수(예를 들면, 척수강), 근육, 관절, 뇌실 등)에의 주사를 들 수 있다. 이들 투여 방법 가운데, 카테터를 이용한 국소 근방 동맥으로의 투여 방법이면, 투여에 필요한 세포수를 줄일 수 있는 유리한 효과를 갖는다.
본 실시 형태의 치료용 조성물의 투여 대상은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 본 실시 형태의 치료용 조성물이 인간 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 함유하는 경우, 상기 투여 대상은 인간이라도 되고, 인간 이외의 포유동물(소, 돼지, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 마우스, 래트 등)이라도 된다. 또한, 본 실시 형태의 치료용 조성물이, 인간 이외의 포유동물의 활막 유래 중간엽 줄기세포를 함유하는 경우, 상기 투여 대상은 당해 포유동물이라도 되고, 인간 등의 당해 포유동물 이외라도 된다. 즉, 본 실시 형태의 치료용 조성물의 중간엽 줄기세포는 이종 동물에 이식되어도 되고, 동종 동물에 이식된 것이라도 된다. 동종 동물로의 이식은 자가 이식이라도 되고, 타가 이식이라도 된다.
본 실시 형태의 치료용 조성물의 투여량은 특별히 한정되지 않지만, 투여 대상의 체중 1kg당 투여되는 중간엽 줄기세포의 수가 1×102 세포∼1×109 세포, 1×103 세포∼1×109 세포, 1×104 세포∼1×109 세포, 1×105 세포∼1×109 세포 또는 1×106 세포∼1×109 세포가 되는 양일 수 있다.
[3. 중추신경 질환의 치료용 제재의 제조 방법]
본 발명의 일 실시 형태에 따른 중추신경 질환의 치료용 제재의 제조 방법(본 실시 형태의 치료용 제재의 제조 방법)은, 무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포를, 동결을 위한 보존액에 현탁시키고, 얻어진 현탁액을 동결하는 동결 보존 공정과, 상기 현탁액을 융해해, 상기 중간엽 줄기세포가 투여에 적절한 농도가 되도록 상기 현탁액을 희석하는 공정을 포함한다.
여기에서, '중추신경 질환의 치료용 제재'란, 중추신경 질환의 회복·재생을 촉진하는 효과를 갖는 약제를 투여에 적합한 상태가 되도록 제재화한 것을 의도한다. 중추신경 질환의 치료용 제재는, 중간엽 줄기세포를 본래의 상태인 채로 기능을 변화시키지 않고 제재화한 것 뿐만 아니라, 특정 조건하에서 배양 및 증식시킴으로써 분화능 등의 기능을 향상시킨 세포를 제재화한 것도 포함한다.
본 실시 형태의 치료용 제재의 제조 방법에서의 활막 유래의 중간엽 줄기세포는, [1. 중추신경 질환의 치료용 조성물의 제조 방법]의 란에서 설명한, 무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포이다. 즉, 본 실시 형태의 치료용 제재의 제조 방법에서의 활막 유래의 중간엽 줄기세포는, 전술한 중추신경 질환의 치료용 조성물의 제조 방법으로 증식한 활막 유래의 중간엽 줄기세포이다.
본 실시 형태의 치료용 제재의 제조 방법은, 무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포를, 동결을 위한 보존액에 현탁시키고, 얻어진 현탁액을 동결하는 동결 보존 공정을 포함한다.
본 실시 형태의 치료용 제재의 제조 방법에 있어서, 전술한 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 동결하기 위한 보존액의 조성은 특별히 한정되지 않고, 공지의 보존액의 조성을 적절하게 사용할 수 있다. 예를 들면, 보존액은 수액, 동결 보호제, 알부민 등을 함유해도 된다.
수액으로는 중탄산 링거액을 예로 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 중탄산 링거액으로는 상업적으로 입수 가능한 것을 사용 가능하고, 예를 들면 BICARBON(등록상표) 수액(에이와이파마 주식회사)을 바람직하게 사용할 수 있다. 수액은 일종을 단독으로 이용해도 되고, 복수 종류를 조합해 이용해도 된다.
동결·해동 과정에서 세포내에 빙결정이 성장하는 것을 억제하는 동결 보호제로는, DMSO(디메틸술폭시드) 등을 들 수 있지만 이것으로 한정되지 않는다. 본 발명의 일 실시 형태에 따른 보존액의 동결 보호제의 양은, 보존액 전체량에 대해 0.5%∼50%(v/v)가 보다 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에 따른 보존액은, 동결·해동 과정에서 보다 바람직하게 세포를 보호하기 위해 알부민을 함유하고 있어도 된다. 알부민을 첨가하는 경우의 농도는, 보존액 전체량에 대해 0.25%∼25%(v/v)가 보다 바람직하다.
동결 보존 공정에서는, 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 전술한 보존액에 현탁시킨다. 현탁 방법으로는, 예를 들면 동결 보존 가능한 용기에 보존액을 넣고, 당해 보존액중에 중간엽 줄기세포를 현탁시키는 것이 바람직하다.
현탁할 때의 보존액의 양과 중간엽 줄기세포의 양의 비는 동결 보존 가능한 양이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 50만 cells/mL∼1000만 cells/mL 정도이다. 이와 같은 양이면 보존액중에 충분히 중간엽 줄기세포를 현탁시킬 수 있다.
활막 유래의 중간엽 줄기세포를 보존액에 현탁시킨 현탁액을 동결한다. 동결 온도는 중간엽 줄기세포가 동결하는 온도로 적절하게 설정하면 되지만, 예를 들면 -80℃ 이하 또는 -196℃ 이하를 들 수 있다. -80℃ 이하에서 동결하는 경우에는, 예를 들면 종래 공지의 예 등을 이용하면 되고, -196℃ 이하에서 동결하는 경우에는, 액체 질소를 이용하면 좋다.
또한, 본 실시 형태의 치료용 제재의 제조 방법은, 전술한 현탁액을 융해해, 중간엽 줄기세포가 투여에 적절한 농도가 되도록, 당해 현탁액을 희석하는 공정을 포함한다.
본 실시 형태의 치료용 제재의 제조 방법에 있어서, 융해 방법으로는 세포가 손상되지 않는 온도에서 융해시키면 되고, 10℃ 이상 45℃ 이하가 바람직하고, 20℃ 이상 40℃ 이하가 보다 바람직하고, 35℃ 이상 40℃ 이하가 보다 바람직하다. 예를 들면, 35∼38℃의 온수욕(湯浴)을 이용해 융해하는 것이 보다 바람직하다. 신속하면서도, 세포의 회수율, 생존률이 보다 높기 때문이다.
또한, 융해시킨 현탁액은 생리 식염액 또는 링거액 등의 희석액으로 희석한다. 희석액으로는 특별히 한정되지 않고, 활막 유래의 중간엽 줄기세포의 기능을 유지할 수 있는 것이면 된다. 희석 농도는 중간엽 줄기세포가 투여에 적합한 농도가 되도록 적절하게 조제하면 되지만, 예를 들면 중간엽 줄기세포의 수가 50만 cells/mL∼300만 cells/mL 정도가 되도록 조제하면 된다.
본 발명의 일 실시 형태는 이하와 같은 구성이라도 된다.
[1] 무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 함유하는, 중추신경 질환의 치료용 조성물.
[2] 상기 중추신경 질환은, 뇌경색, 뇌출혈, 두부 외상 및 척수 손상 중 적어도 어느 하나인, [1]에 기재된 중추신경 질환의 치료용 조성물.
[3] 상기 중추신경 질환은, 알츠하이머병, 뇌혈관성 인지증, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다발성 경화증 및 근위축성 측색경화증 중 적어도 어느 하나인, [1]에 기재된 중추신경 질환의 치료용 조성물.
[4] 무혈청 배지내에서 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 배양하는 공정을 포함하는, 중추신경 질환의 치료용 조성물의 제조 방법.
[5] 무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포를, 동결을 위한 보존액에 현탁시키고, 얻어진 현탁액을 동결하는 동결 보존 공정과, 상기 현탁액을 융해해, 상기 중간엽 줄기세포가 투여에 적절한 농도가 되도록 상기 현탁액을 희석하는 공정을 포함하는, 중추신경 질환의 치료용 제재의 제조 방법.
《실시예》
[실시예 1]
(뇌경색에 대한 활막 유래 중간엽 줄기세포의 유효성 평가)
무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래 중간엽 줄기세포의 이식에 의한 뇌경색 후유증의 개선에 대해 검토를 실시했다.
도 1에 본 실시예에 따른 평가 방법 순서의 개요를 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에서는 뇌경색 모델 래트를 제작해, 뇌허혈 재관류 직후에 중간엽 줄기세포(MSC)를 투여하고 1일 경과후, 행동학적 평가 및 조직학적 평가를 실시했다.
인간의 활막 또는 골수 조직으로부터, 주지의 방법(예를 들면, 익스플랜트법 또는 콜라게나아제법)에 따라, 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지 STK(등록상표)1(주식회사 투셀) 또는 10% 소 혈청 함유 DMEM 배지(Sigma-Aldorich)에서 분리·배양했다. 무혈청 배지 STK(등록상표)1에서 분리한 활막의 중간엽 줄기세포를, 무혈청 배지 STK(등록상표)2(주식회사 투셀)에 파종하고, 10% 소 혈청 함유 DMEM 배지에서 분리한 활막 또는 골수의 중간엽 줄기세포를 동일한 배지에 파종해, 각각 37℃, 5% CO2 조건하에서 10∼15일간 중간엽 줄기세포를 배양했다.
다음으로, 중추신경 질환의 일례로서 뇌경색 모델의 래트를 제작했다(SPHPR-710-2 래트 뇌경색 모델(코이즈미 모델)). 래트의 내경동맥을 향해 색전물을 삽입해, 좌중대뇌동맥을 폐색함으로써 뇌허혈 처치를 실시했다. 뇌허혈 120분후에 색전물을 제거해 혈류를 재개통함으로써 뇌경색 모델 래트를 제작했다.
뇌허혈 재관류 직후에 실시예(A)로서, 무혈청 배지를 이용해 배양한 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 0.8 mL/min의 속도로 뇌경색 모델 래트의 꼬리 정맥으로부터 1분간 투여한 군을 제작했다(A-G2). 또한, 비교예(B)로서, 10% 소 혈청 함유 DMEM 배지를 이용해 배양한 활막 유래 또는 골수 유래의 중간엽 줄기세포를, 각각에 대해 0.8 mL/min의 속도로 뇌경색 모델 래트의 꼬리 정맥으로부터 1분간 투여한 군을 제작했다(B-G2 또는 B-G3). 이 때, 실시예(A) 및 비교예(B)에 대해, 음성 대조군(NC)으로서 중간엽 줄기세포를 함유하지 않은 SOLULACT(등록상표) 수액(TERUMO 제품)을 상기와 같이 뇌경색 모델 래트의 꼬리 정맥에 투여한 군을 제작했다(A-G1 또는 B-G1). 또한, 실시예(A) 및 비교예(B)에 대해, 양성 대조군(PC)으로서 뇌경색소를 축소시키는 것으로 알려져 있는 FK-506(타크로리무스, 아스텔라스 제약) 0.5 mg/kg을 뇌경색 모델 래트의 꼬리 정맥에 투여한 군을 제작했다(A-G3 또는 B-G4). 중간엽 줄기세포를 투여하고 나서 1일 후에 각각의 실시예(A) 및 비교예(B)의 뇌경색 모델 래트군에 대해 행동학적 평가 및 조직학적 평가를 실시했다.
(행동학적 평가)
실시예(A) 및 비교예(B)의 뇌경색 모델 래트군에 대해, 신경증상의 관찰을 실시해 행동학적 평가를 실시했다. 개체별로 (1) 앞다리 마비, (2) 뒷다리 마비, (3) 회전 운동, (4) 체측면 저항성 및 (5) 일반 상태의 5항목에 대해 0∼12(병태:수치가 높을수록 나쁨)로 점수화해, 5항목의 합계를 신경증상 점수로서 평가했다.
구체적으로는, (1) 앞다리 마비에서는, 래트의 꼬리를 잡고 바닥에서 10cm 정도 들어 올렸을 때의 오른쪽 앞다리의 굴곡의 정도를 관찰해, 굴곡의 좌우 차이가 없는 경우를 0점, 경도의 굴곡이 있는 경우를 1점, 90도 정도의 굴곡이 있는 경우를 2점, 운동 불가능한 경우를 3점으로 하여 계측했다. 마찬가지로, (2) 뒷다리 마비에서는, 안정시에 래트의 뒷다리를 잡아 당겼을 때 뒷다리를 원래대로 되돌리는 힘을 관찰해, 좌우 뒷다리에 근력 차이가 없는 경우를 0점, 좌우 뒷다리에 근력 차이가 있는 경우를 1점, 부자연스러운 상태가 되지만 자극에 의해 원래대로 되돌리는 경우를 2점, 부자연스러운 상태가 되어 자극에 무반응인 경우를 3점으로 하여 계측했다. (3) 회전 운동에서는, 래트의 꼬리를 잡고 앞다리를 바닥면에 붙인 상태에서의 회전 운동을 관찰해, 전방으로 이동하는 경우를 0점, 주로 전방으로 이동하지만 오른쪽으로 회전하는 경우를 1점, 주로 오른쪽으로 회전하고 전방으로도 이동하는 경우를 2점, 오른쪽으로만 회전하는 경우를 3점으로 하여 계측했다. (4) 체측면 저항성에서는, 안정시에 좌우 한쪽씩 래트의 몸의 측면을 눌렀을 경우의 저항성을 관찰해, 좌우 차이가 없는 경우를 0점, 몸의 자세는 무너지지 않지만 왼쪽으로부터의 자극에 약한 경우를 1점, 왼쪽으로부터의 자극에 의해 뒷다리의 유지가 곤란한 경우를 2점, 왼쪽으로부터의 자극에 의해 넘어지는 경우를 3점으로 하여 계측했다. (5) 일반 상태에서는, 안정 상태에서의 래트의 몸의 자세를 관찰해, 정상 동물과 차이가 없는 경우를 0점, 왼쪽 다리가 몸의 밖으로 나와 있는 경우를 1점, 우측으로 기울어져 있는 경우를 2점, 우측으로 상당히 기울어져 있는 경우를 3점으로 하여 계측했다.
도 2에 신경증상 점수의 측정 결과를 나타낸다. 한편, 신경증상 점수의 통계 해석은 Steel test를 이용해 실시하고, 모든 해석에서 음성 대조군을 대조군으로 하고, 유의 수준은 양측 5%로 했다. 도 2의 측정 결과에 있어서, 통계적인 유의차에 대해 '*: P＜0.05' 및 '**: P＜0.01'로 나타낸다.
도 2의 측정 결과로부터, 래트의 신경증상의 통계 해석을 실시한 결과, 양성 대조군(A-G3 및 B-G4)에서 음성 대조군(A-G1 및 B-G1)에 비해 통계학적으로 유의(P＜0.05)한 신경증상 점수의 개선이 인정되었다. 따라서, 신경증상 점수의 조건은 뇌경색의 회복을 행동학적으로 평가 가능하다는 것이 나타났다. 무혈청 배지내에서 배양한 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 투여한 A-G2에서는, 음성 대조군에 비해 통계학적으로 유의(P＜0.01)한 신경증상 점수의 개선이 인정되었다. 한편, 혈청 함유 배지내에서 배양한 활막 유래 또는 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 투여한 B-G2 또는 B-G3에서는, 음성 대조군에 비해 통계학적으로 유의미한 차이가 인정되지 않았다. 따라서, 행동학적 평가에서, 혈청 함유 배지내에서 배양한 중간엽 줄기세포를 이용한 경우보다, 무혈청 배지내에서 배양한 활막 유래의 중간엽 줄기세포가 뇌경색의 증상을 개선하는 것이 나타났다.
(조직학적 평가)
계속해서, 실시예(A) 및 비교예(B)의 뇌경색 모델 래트군에 대해, 뇌경색소의 용적을 측정해 조직학적 평가를 실시했다. 신경증상의 관찰 후, 전체 뇌를 적출해 래트용 브레인 매트릭스를 이용해 절편을 제작했다. 각 절편을 2% 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(Triphenyltetrazolium chloride(TTC))를 함유하는 생리식염액 중에서 염색해, 뇌경색소 용적 정량용 화상을 스캐너로 읽어들였다. 당해 화상을 OsiriX version 8.0.2(Pixmeo SARL)에서 TTC 비염색 부분을 뇌경색소로서 마킹해 면적을 측정했다. 면적의 측정은 대뇌피질 및 기저핵에 대해 실시했다. 각 단면의 뇌경색소의 면적과 단면 두께(2mm)의 곱으로부터 대뇌피질 및 기저핵의 총뇌경색소(mm3)를 산출해, 이들의 합계를 총뇌경색소 용적으로 했다.
도 3에 총뇌경색소의 면적을 측정한 결과를 나타낸다. 한편, 총뇌경색소의 통계 해석은 Dunnett's test를 이용해 실시하고, 모든 해석에서 음성 대조군을 대조군으로 하고, 유의 수준은 양측 5%로 했다. 도 3의 측정 결과에 있어서, 통계적인 유의차에 대해 '*: P＜0.05' 및 '***: P＜0.001'로 나타낸다.
도 3의 측정 결과로부터, 래트의 총뇌경색소의 통계 해석을 실시한 결과, 무혈청 배지내에서 배양한 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 투여한 A-G2에서는, 음성 대조군에 비해 통계학적으로 유의(P＜0.001)한 신경증상 점수의 개선이 인정되었다. 게다가 양성 대조군과 비교해도 총뇌경색소가 작아지고 있는 것으로 나타났다. 한편, 혈청 함유 배지내에서 배양한 활막 유래 또는 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 투여한 B-G2 또는 B-G3에서는, 음성 대조군에 비해 통계학적으로 유의미한 차이가 인정되지 않았다. 따라서, 조직학적으로 평가해도, 혈청 함유 배지내에서 배양한 중간엽 줄기세포를 이용한 경우보다, 무혈청 배지내에서 배양한 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 이용한 경우에서 뇌경색소의 크기가 감소하는 것이 나타났다.
행동학적 평가 및 조직학적 평가를 실시한 결과, 무혈청 배지내에서 배양한 활막 유래의 중간엽 줄기세포는, 혈청 함유 배지내에서 배양한 중간엽 줄기세포를 이용한 경우에는 실현할 수 없는, 현저히 높은(환언하면, 임상 현장에서 이용 가능한 정도로 높은) 중추신경 질환에 대한 효과를 갖고 있는 것으로 나타났다.
[실시예 2]
(척수 손상에 대한 활막 유래 중간엽 줄기세포의 유효성 평가)
무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포의 이식에 의한 척수 손상 후유증의 개선에 대해 검토를 실시했다.
도 4에 본 실시예에 따른 평가 방법 순서의 개요를 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에서는 척수 손상 모델 래트를 제작해, 척수 손상 다음날에 중간엽 줄기세포(MSC)를 투여하고, 척수 손상 후 4주째(28일째)까지 뒷다리 운동 기능의 평가를 실시했다.
(실험예 2-1)
[실시예 1]과 마찬가지로 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 배양했다. 계속해서, 중추신경 질환의 일례로서 MASCIS Impactor를 이용한 50mm 중추 낙하법에 의한 척수 손상 모델의 래트를 제작했다.
실험예 2-1로서, 척수 손상 다음날(24시간 후)에 무혈청 배지를 이용해 배양한 활막 유래의 중간엽 줄기세포 1 mL를 척수 손상 모델 래트의 꼬리 정맥으로부터 30초 이상에 걸쳐 서서히 투여한 군을 제작했다(Cells, 샘플수(n=3)). 이 때, 음성 대조군로서, 중간엽 줄기세포를 함유하지 않은 SOLULACT(등록상표) 수액을 상기와 같이 척수 손상 모델 래트의 꼬리 정맥에 투여한 군을 제작했다(Solvent, 샘플수(n=3)). 척수 손상 다음날, 7일 후, 21일 후 및 28일 후에 척수 손상 모델 래트군에 대해, 각각 BBB(Basso-Beattie-Bresnahan) 스케일(Basso et al., "A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats." J. Neurotrauma 1995; 12:1-21. 참조)을 이용해 뒷다리 운동 기능 평가를 실시했다.
(뒷다리 운동 기능 평가)
도 5에 뒷다리 운동 기능 평가의 측정 결과를 나타낸다. 한편, BBB 점수의 통계 해석은 Kruskal-Wallis의 검정법으로 해석해, 통계학적 유의성 검토를 실시하고, 위험률 5% 미만을 유의차 있음으로 했다.
도 5의 측정 결과로부터, 무혈청 배지내에서 배양한 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 투여한 Cells군에서는, Solvent군에 비해 BBB 점수의 개선 경향을 확인할 수 있었다. 따라서, 뒷다리 운동 기능 평가에 있어서, 무혈청 배지내에서 배양한 활막 유래의 중간엽 줄기세포는 척수 손상의 증상을 개선하는 것이 시사되었다.
(실험예 2-2)
[실시예 1]과 마찬가지로 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 배양했다. 계속해서, 중추신경 질환의 일례로서 실험예 2-1과는 다른 래트를 이용해, MASCIS Impactor를 이용한 50mm 중추 낙하법에 의한 척수 손상 모델의 래트를 제작했다.
실험예 2-2로서, 척수 손상 다음날(24시간 후)에, 무혈청 배지를 이용해 배양한 활막 유래의 중간엽 줄기세포 1 mL를 척수 손상 모델 래트의 꼬리 정맥으로부터 30초 이상에 걸쳐 서서히 투여한 군을 제작했다(Cells, 샘플수(n=6)). 이 때, 음성 대조군로서 중간엽 줄기세포를 함유하지 않은 SOLULACT(등록상표) 수액을 상기와 같이 척수 손상 모델 래트의 꼬리 정맥에 투여한 군을 제작했다(Solvent, 샘플수(n=6)). 척수 손상의 다음날, 14일 후 및 28일 후에, 척수 손상 모델 래트군(Cells 및 Solvent군)에 대해 각각 BBB 스케일을 이용해 뒷다리 운동 기능 평가를 실시했다.
(뒷다리 운동 기능 평가)
도 6에 뒷다리 운동 기능 평가의 측정 결과를 나타낸다. 한편, BBB 점수의 통계 해석은 t 검정법으로 해석해 통계학적 유의성의 검토를 실시했다. p치가 0.10 미만인 경우를 유의 경향 있음으로 했다. 도 6의 측정 결과에 있어서, 통계적인 유의 경향을 '†: P＜0.10'로서 나타낸다.
도 6의 측정 결과로부터, 무혈청 배지내에서 배양한 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 투여한 Cells군에서는, 음성 대조군인 Solvent군에 비해 BBB 점수가 유의미하게 개선되는 경향이 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 뒷다리 운동 기능 평가에 있어서, 무혈청 배지내에서 배양한 활막 유래의 중간엽 줄기세포는 척수 손상의 증상을 개선하는 것이 재차 시사되었다.
본 발명은 중간엽 줄기세포를 이용한 보다 안전하면서도 이용 가치가 높은 중추신경 질환의 치료용 조성물을 제공할 수 있으므로, 중간엽 줄기세포를 이용한 중추신경 질환의 회복·재생을 목적으로 하는 의료에 바람직하게 이용 가능하다.
Claims (5)
- 무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 함유하는, 중추신경 질환의 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 중추신경 질환은 뇌경색, 뇌출혈, 두부 외상 및 척수 손상 중 적어도 어느 하나인, 중추신경 질환의 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 중추신경 질환은 알츠하이머병, 뇌혈관성 인지증, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다발성 경화증 및 근위축성 측색경화증 중 적어도 어느 하나인, 중추신경 질환의 치료용 조성물. - 무혈청 배지내에서 활막 유래의 중간엽 줄기세포를 배양하는 공정을 포함하는, 중추신경 질환의 치료용 조성물의 제조 방법.
- 무혈청 배지내에서 배양된 활막 유래의 중간엽 줄기세포를, 동결을 위한 보존액에 현탁시키고, 얻어진 현탁액을 동결하는 동결 보존 공정과,
상기 현탁액을 융해해, 상기 중간엽 줄기세포가 투여에 적절한 농도가 되도록 상기 현탁액을 희석하는 공정을 포함하는, 중추신경 질환의 치료용 제재의 제조 방법.
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