KR20110084281A

KR20110084281A - 분화 유도 배지용 첨가제 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20110084281A
Application number: KR1020117012508A
Authority: KR
Inventors: 유키오 카토; 진 창 샤오; 코이치로 츠지
Original assignee: 고쿠리츠다이가쿠호진 히로시마다이가쿠; 가부시키가이샤 투셀
Priority date: 2008-11-11
Filing date: 2009-10-22
Publication date: 2011-07-21
Also published as: US10131877B2; US20110212523A1; WO2010055616A1; AU2009315204B2; EP2351831A1; JPWO2010055616A1; US20160032247A1; AU2009315204A8; EP2351831B1; EP2351831A4; AU2009315204A1; JP5660572B2; KR101712501B1

Abstract

줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 분화 유도 배지용 첨가제 및 그의 이용을 제공한다. 본 발명에 관련되는 줄기세포를 무혈청 조건하에서 분화 유도하기 위한 분화 유도 배지용 첨가제는 EGF, FGF 및 PDGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 증식인자와 덱사메타손과 β-글리세로인산을 적어도 함유한다. 통상 아스코르브산 2-인산과 ITS는 골분화에 필수이지만, 본 발명의 분화 유도 배지용 첨가제에는 불필요하다. 또한, 인지질을 첨가함으로써 골분화를 촉진할 수 있었다.

Description

분화 유도 배지용 첨가제 및 그의 용도{ADDITIVE FOR DIFFERENTIATION INDUCTION CULTURE MEDIUM, AND USE THEREOF}

본 발명은 분화 유도 배지용 첨가제 및 그의 용도에 관한 것이며, 더욱 상세하게는, 줄기세포(幹細胞), 치수(齒髓)세포, 치근막(齒根膜)세포, 태반(胎盤), 양막(羊膜) 및 섬유아(纖維芽)세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 분화 유도 배지용 첨가제 및 그의 용도에 관한 것이다.

줄기세포는 자기복제능와 분화능(differentiation potential)을 갖는 세포이다. 상기 줄기세포로서는, 예를 들면 배아줄기세포(ES세포), 인공 다능성 줄기세포(iPS세포) 및 신체줄기세포(somatic stem cell) 등이 알려져 있다. 상기 체성 줄기세포로서는, 예를 들면 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포 및 간엽계 줄기세포 등이 있다. 상기 ES세포 및 상기 iPS세포는 모든 조직으로 분화할 수 있는 다분화능을 갖고 있다. 상기 조혈 줄기세포는 혈액세포로 분화하는 능력을 갖고 있으며, 상기 신경 줄기세포는 신경세포로 분화하는 능력을 갖고 있다. 또한, 상기 간엽계 줄기세포는 골수 등의 조직 속에 존재하며, 지방세포, 골세포, 연골세포 등으로 분화하는 다분화능을 갖는 줄기세포로서 알려져 있다.

상기 줄기세포 중, 예를 들면 간엽계 줄기세포는 현재 재생의료분야에 있어서 이식용 세포로서 이용되고 있으며, 간엽계 줄기세포의 적응 대상인 질환은 골결손, 연골결손, 치주병, 심근경색, 난치성 피부질환, 골다공증, 변형성 관절병, 척수손상, 조혈지지, 장기이식에서의 거절반응억제 등 광범위하다. 금후, 간엽계 줄기세포의 적응대상이 되는 질환은 더욱더 증가할 것으로 예상된다(예를 들면, 뇌경색, 폐색성 동맥경화증, 신장질환 등).

상기 줄기세포로부터 각종 기능성 세포로의 분화 유도 배지로서는 현재 동물혈청(통상 10∼15％ 우태아혈청)이 첨가된 배지가 널리 이용되고 있다. 이 혈청은 생체 외에서의 세포의 성장 및/또는 증식을 촉진하기 위한 영양원, 또는 호르몬 등의 생리활성물질의 공급원으로서 이용되고 있다.

그러나, 혈청은 매우 고가이며, 또한 천연제품이므로 로트(lot)마다 성분의 차이가 생긴다. 그로 인해, 세포분화의 촉진효과에 격차가 생기기 쉽다. 또한, 배양 후의 세포로부터 혈청 유래의 단백질 등을 제거하기 위해 정제할 필요가 있으며, 작업이 번잡하게 된다. 또한, 혈청 속에 혼입되어 있는 미지의 병원체(바이러스, 병원성 프리온(prion) 등)에 의해 배양세포가 오염될 위험성이 있다. 또한, 예를 들면, 간엽계 줄기세포를 분화 유도하는 경우, 혈청 속에는 간엽계 줄기세포의 골분화를 저해하는 성분이 포함될 가능성이 있으며, 골분화의 효율을 저하시킬 수 있다. 그러므로, 무혈청 조건하에서 상기 줄기세포를 분화 유도시킬 수 있는 기술이 재생 의료의 실현 및 보급에는 불가결하다.

예를 들면, 간엽계 줄기세포를 골아세포로 분화 유도할 경우, 지금까지 혈청의 사용량을 저감시켜서 골분화를 실시하는 방법은 알려져 있으며, 예를 들면, 우태아혈청의 양을 1％로 저감한 배지에 상피증식인자(EGF: epidermal　growth　factor)를 첨가함으로써 간엽계 줄기세포의 골형성 세포로의 분화를 유도하는 방법이 개시되어 있다(비특허문헌 1).

또한, 특정의 증식인자 및 인(燐)지질을 함유하는 조성물을 기초 배지에 첨가함으로써 간엽계 줄기세포를 무혈청 조건하에서 배양한 세포를 혈청함유배지에서 골아세포 또는 지방세포로 분화 유도시키는 기술도 알려져 있다(특허문헌 1).

[특허문헌 1] 국제공개 제2007/080919A1호 팜플렛(2007년 7월 19일 공개)

[비특허문헌 1] SCIENCE, 308, 1472-1477, 2005.

그러나, 특허문헌 1의 구성에서는 간엽계 줄기세포를 무혈청 조건하에서 배양하는 것은 가능하지만, 분화 유도를 무혈청 조건하에서 실시하는 것은 가능하지 않다.

또한, 비특허문헌 1의 구성에서는 혈청의 사용량은 저감되고 있다고는 해도, 여전히 혈청 함유 배지에서 분화 유도를 실시하기 때문에 분화의 촉진효과에 격차가 생긴다고 하는 문제, 정제작업의 번잡함이라고 하는 문제, 배양세포오염의 문제, 염가로 분화 유도를 실시할 수가 없다고 하는 문제 등의 혈청에 기인하는 문제점을 내포하고 있다. 한편, 무혈청 조건하에서 간엽계 줄기세포를 골아세포로 분화 유도하는 방법에 대한 발견은 지금까지 이루어지지 않았다.

또한, 다른 줄기세포에 관해서도 마찬가지로 무혈청 조건하에서 분화 유도하는 방법에 대해서는 거의 발견이 이루어지지 않았다. 예를 들면, ES세포를 무혈청 조건하에서 신경세포로 분화 유도하는 경우에 이용되는 무혈청 배지는, 시판의 N2첨가제 및 B27첨가제(Gibco　BRL사제)라고 하는 고가의 첨가제를 기본배지에 첨가할 필요가 있으며, 무혈청 조건하에서의 분화 유도가 가능하다고 해도 혈청 대신에 고가인 첨가제를 첨가할 필요가 있다고 하는 문제를 갖는다.

본 발명은 상기의 문제점에 감안하여 이루어진 것이며, 그의 목적은 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 저렴한 비용으로 효율적으로 골분화 유도하기 위한 분화 유도 배지용 첨가제 및 그의 용도를 제공하는 것에 있다.

본 발명에 따른 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 분화 유도 배지용 첨가제는 EGF, FGF 및 PDGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 증식인자와 덱사메타손(dexamethasone)과 β-글리세로인산(β-glycerophosphate)을 적어도 함유하는 것을 특징으로 하고 있다.

상기의 구성에 따르면, 상기 증식인자는 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포(이하, 이들의 세포를 총칭해서 「골분화 유도 대상 세포」라고도 말한다)의 골분화 프로그램을 촉진하는 작용을 가지며, 덱사메타손은 세포의 생존과 분화를 촉진하고, β-글리세로인산은 인산을 공급하며, 또한 석회화를 촉진할 수 있는 작용을 갖는다. 그러므로, 본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제를 기초 배지에 첨가함으로써, 무혈청 조건하에서 골분화 유도 대상 세포를 효율적으로 골분화 유도할 수 있다고 생각된다.

따라서, 균일하고 안정한 분화 촉진 효과를 얻을 수 있다. 또한, 배양 후의 세포로부터 혈청 유래의 단백질 등을 제거하기 위한 정제를 실시하는 일없이, 또한 혈청 속에 혼입되어 있는 미지의 병원체에 의한 배양세포의 오염을 방지할 수 있다. 또한, 고가인 혈청을 사용할 필요가 없으므로 저렴한 비용으로 상기 분화 유도를 실시할 수 있다. 또한, 종래, 골분화 유도에 필요하다고 생각되고 있었던 인간 인슐린 재조합체, 트랜스페린(transferrin), 셀레네이트(selenate) 및 아스코르브산(ascorbic acid)을 첨가할 필요가 반드시 없기 때문에 분화 유도 배지용 첨가제를 더욱 저렴한 비용으로 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제는 적어도 하나의 인지질을 추가로 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 인지질은 포스파티딘산(phosphatidic acid), 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid), 포스파티딜이노시톨( phosphatidyl inositol), 포스파티딜세린(phosphatidyl serine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine), 포스파티딜콜린(phosphatidyl choline) 및 포스파티딜글리세롤(phosphatidyl glycerol)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기 구성에 따르면, 상기 증식인자, 덱사메타손 및 β-글리세로인산의 작용에 의해 골분화 유도 대상 세포를 분화 유도할 수 있는 동시에, 적어도 하나의 인지질의 작용에 의해 골분화 유도 대상 세포의 골분화를 유도하는 시그널 전달계가 활성화되기 때문에 더욱더 골분화를 촉진할 수 있다. 따라서, 골분화 유도 대상 세포를 더욱 효율적으로 골분화 유도할 수 있으며, 골분화 유도에 필요한 시간을 단축할 수 있다. 결과적으로, 골분화 유도에 드는 비용을 삭감할 수 있다.

본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제는 산화방지제를 추가로 함유하는 것이 바람직하고, 상기 산화방지제는 DL-α-토코페롤 아세테이트(비타민E)인 것이 바람직하다.

상기 구성에 따르면, 인지질의 열화를 방지할 수 있으므로 골분화 유도 대상 세포를 더욱 효율적으로 골에 분화시키는 것이 가능하게 된다.

또한, 상기 분화 유도 배지용 첨가제는 상기 줄기세포로서 간엽계 줄기세포를 사용하는 골분화 유도에 사용하는 것이 바람직하다.

상기의 구성에 따르면, 상기 증식인자는 골분화 프로그램을 촉진하는 작용을 가지며, 덱사메타손은 골형성 인자(BMP)를 유도하고, β-글리세로인산은 알칼리 포스파타아제에 의해 무기 인산으로 변환되어 인산을 공급하며, 또한 석회화를 촉진할 수 있는 작용을 갖는다. 그러므로, 본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제를 기초 배지에 첨가함으로써 무혈청 조건하에서 간엽계 줄기세포를 효율적으로 골아세포에 분화 유도할 수 있다고 생각된다. 따라서, 균일하고 안정한 분화 촉진 효과를 얻을 수 있다. 또한, 적어도 하나의 인지질을 추가로 함유함으로써 간엽계 줄기세포의 골분화를 유도하는 시그널 전달계가 활성화 되기 때문에 더욱더 골분화를 촉진할 수 있다. 따라서, 간엽계 줄기세포를 더욱 효율적으로 골아세포에 분화 유도할 수가 있으며, 골분화 유도에 필요한 시간을 단축할 수 있다. 결과적으로, 골분화 유도에 드는 비용을 삭감할 수 있다.

본 발명에 관련되는 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 배양 배지는 본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제를 구성하는 성분 및 기초 배지를 함유하며, 혈청을 포함하지 않는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 상기 배양 배지는 상기 줄기세포로서 간엽계 줄기세포를 이용하는 골분화 유도에 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 관련되는 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 배양방법은 상기 배양 배지 속에서 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 분화 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 상기 배양방법은 상기 줄기세포로서 간엽계 줄기세포를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 관련되는 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 키트(kit)는 본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제를 구성하는 성분을 구비하고 있는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 상기 키트는 상기 줄기세포로서 간엽계 줄기세포를 이용하는 골분화 유도에 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제는 상술한 바와 같이, EGF, FGF 및 PDGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 증식인자와 덱사메타손과 β-글리세로인산을 적어도 함유함으로써 골분화 유도 대상 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도할 수 있다. 또한, 적어도 하나의 인지질을 함유함으로써 무혈청 조건하에 있어서의 골분화 유도 대상 세포의 골분화를 더욱더 촉진시킬 수 있다.

따라서, 상기 배양 배지 속에서 골분화 유도 대상 세포를 배양함으로써 골분화 유도 대상 세포의 골분화 유도를 효율적으로 실시할 수 있다. 또한, 상기 키트를 이용함으로써 종래 무혈청하에서 실시하는 것이 곤란했었던 골분화 유도 대상 세포의 골분화를 용이하게 실시할 수 있다.

또한, 상기 줄기세포로서 간엽계 줄기세포를 이용함으로써 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화 유도를 효율적으로 실시할 수 있다. 또한, 상기 키트를 이용함으로써 종래 무혈청하에서 실시하는 것이 곤란했었던 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화를 용이하게 실시할 수 있다.

또한, 본 발명에 관련되는 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 배양방법에서는 본 발명에 관련되는 배양 배지 속에서 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 분화 배양하는 상기 공정보다도 전에 FGF, PDGF, EGF, TGF-β 및 HGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 증식인자, 및 적어도 하나의 인지질을 함유하며, 또한 혈청을 포함하지 않는 배양 배지 속에서 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 증식 배양하기 전(前) 공정을 포함하는 것이 바람직하다.

골분화 유도 대상 세포를 FGF, PDGF, EGF, TGF-β 및 HGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 증식인자, 및 적어도 하나의 인지질을 함유하며, 또한 혈청을 포함하지 않는 배양 배지(이하, 「무혈청 증식 배양 배지」라고 칭한다)를 이용하여 배양함으로써 골분화 유도 대상 세포의 분화능을 높게 유지할 수 있다. 이것은 상기 무혈청 증식 배양 배지에는 혈청에 포함되는 골분화 유도 대상 세포의 증식 촉진 인자의 모두가 포함되어 있는 것은 아니지만, 골분화 유도 대상 세포의 증식 억제 인자는 전혀 포함되지 않기 때문에 혈청 함유 배지보다도 골분화 유도 대상 세포의 증식능 및 다분화능을 높게 유지할 수 있기 때문이라고 생각된다.

따라서, 상기 무혈청 증식 배양 배지 속에서 증식 배양된 골분화 유도 대상 세포를 본 발명에 관련되는 배양 배지 속에서 골분화 유도시키는 것은, 골분화 유도 대상 세포의 증식능 및 다분화능이 높게 유지된 골분화 유도 대상 세포를 본 발명에 관련되는 배양 배지 속에서 효율적으로 골분화 유도하게 된다. 이로 인해, 통상의 혈청을 포함하는 증식 배양 배지를 이용해서 배양된 골분화 유도 대상 세포를 이용하여 본 발명에 관련되는 배양 배지 속에서 골분화 유도를 실시한 경우와 비교해서 효율적으로 골분화 유도를 실시할 수 있다. 그 결과, 골분화 유도에 걸리는 기간을 더욱 단축시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 골아세포(osteoblast cell)는 본 발명에 관련되는 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 배양방법에 의해서 생산된 것을 특징으로 하고 있다.

본 발명에 따른 골아세포는 종래의 골분화 유도 배지를 이용하는 종래의 골분화 유도방법에 의해서 분화 유도된 골아세포와 비교하여 골아세포의 석회화를 나타내는 알리자린 레드(alizarin red)의 염색성이 강하다. 즉, 본 발명에 따른 골아세포는 종래의 골분화 유도 배지를 이용하는 종래의 골분화 유도방법에 의해서 분화 유도된 골아세포와 비교하여 칼슘이 더욱 침착(沈着)한 골아세포라고 하는 특성을 갖고 있다.

이로 인해, 본 발명에 따른 골아세포를 이용하면, 정형, 치과 등 골결손 부위 및 골다공증에 무혈청 배지에서 배양한 세포를 이용하여 재생 의료에 유용하게 쓸 수 있다.

본 발명에 관련되는, 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 분화 유도 배지용 첨가제는, 이상과 같이 EGF, FGF 및 PDGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 증식인자와 덱사메타손과 β-글리세로인산을 적어도 함유한다. 그러므로, 기초 배지에 첨가함으로써 골분화 유도 대상 세포를 무혈청 조건하에서 효율적으로 골분화 유도할 수가 있으며, 고가이고, 또한 병원체 혼입이나 분화의 격차 등의 위험성이 있는 혈청의 사용을 회피할 수 있다고 하는 효과를 나타낸다. 또한, 종래, 골분화 유도에 필요하다고 생각되고 있었던 인간 인슐린 재조합체, 트랜스페린, 셀레네이트 및 아스코르브산을 첨가할 필요가 없기 때문에 분화 유도 배지용 첨가제를 더욱 저렴한 비용으로 제공할 수 있다.

도 1은 10％ FBS함유 골분화 유도 배지와 무혈청 골분화 유도 배지:B를 이용한 경우의 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화 유도를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 증식인자가 간엽계 줄기세포의 골아세포로에의 분화 유도에 부여하는 영향에 대해서 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 10％ FBS함유 골분화 유도 배지를 이용하고, EGF가 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화 유도에 부여하는 영향에 대해서 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화 유도의 결과를 나타내는 도면이다.

본 발명의 실시형태에 대해서 설명하면 이하와 같지만, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에 별도로 명시하지 않는 한, 수치 범위를 나타내는 「A∼B」는 「A 이상, B 이하」인 것을 나타낸다.

[1. 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 분화 유도 배지용 첨가제]

본 발명에 관련되는 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 분화 유도 배지용 첨가제(이하, 단지 「본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제」라고 한다)는 EGF, FGF 및 PDGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 증식인자와 덱사메타손과 β-글리세로인산을 적어도 함유한다.

본 명세서에 있어서, 상기 「줄기세포」는 인간 유래이어도 좋고, 동물 유래이어도 좋다. 상기 「줄기세포」로서는 골아세포로 분화하는 능력을 갖고 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 이와 같은 「줄기세포」로서는, 예를 들면 배아줄기세포(ES세포), 인공 다능성 줄기세포(iPS세포), 간엽계 줄기세포 등의 체줄기세포 등을 들 수 있다.

상기 줄기세포로서는 지지(支持)세포와 함께 이용해도 좋고, 줄기세포 단독으로 이용해도 좋다. 상기 체줄기세포로서는 조직으로부터 채취한 프라이머리(primary)인 체줄기세포를 이용해도 좋고, 주화(株化)된 체줄기세포를 이용해도 좋다. 또한, 상기 ES세포 및 iPS세포 등으로부터 분화 유도해서 얻어진 체줄기세포를 이용해도 좋다. 또한, 예를 들면, 분화 도중의 것이라도 좋고, 미분화인 것이라도 좋다. 또한, 분화시키는 줄기세포는 컨플루언트(Confluent)에 도달한 세포라도 좋고, 도달하지 않은 세포라도 좋다.

상기 줄기세포로서 간엽계 줄기세포를 예로 들면, 예를 들면 골수 유래, 지방 유래, 골막 유래, 활막 유래, 재대혈(臍帶血) 유래, 태반 유래, 손가락 유래 등의 간엽계 줄기세포를 이용할 수 있다. 또한, 간엽계 줄기세포의 분화 유도 중에서도, 골아세포로 분화 유도시키는 경우를 예로 들면, 상기 간엽계 줄기세포는 골아세포에 분화 도중의 것이라도 좋고, 미분화인 것이라도 좋다. 또한, 분화시키는 간엽계 줄기세포는 컨플루언트에 도달한 세포라도 좋고, 도달하지 않은 세포라도 좋다.

치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로서는 인간 유래이어도 좋고, 동물 유래이어도 좋다. 또한, 지지세포와 함께 이용해도 좋고, 단독으로 이용해도 좋다. 또한, 조직으로부터 채취한 프라이머리인 세포를 이용해도 좋고, 주화된 것을 이용해도 좋다.

줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포는 각각을 단독으로 이용해도 좋고, 조합해서 이용해도 좋다.

덱사메타손 및 β-글리세로인산은 상기 증식인자와 조합해서 기초 배지에 첨가함으로써 골분화 유도 대상 세포를 무혈청 조건하에서 효율적으로 골분화 유도할 수 있다. 구체적으로는 골아세포의 세포 외 매트릭스 형성과 석회화를 효율적으로 실시할 수 있다.

각 화합물의 사용량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 분화 유도 배지용 첨가제를 첨가한 배지 속에서의 최종 농도로서 예를 들면, 덱사메타손은 10^-6∼10^-10M의 범위 내에서 이용하는 것이 바람직하고, 10^-7∼10^-9M의 범위 내에서 이용하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, β-글리세로인산은 1∼100mM의 범위 내에서 이용하는 것이 바람직하고, 1∼30mM의 범위 내에서 이용하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 EGF란, 상피증식인자(EGF: epidermal growth factor)의 것이며, EGF패밀리로부터 선택되는 증식인자가 의도된다. EGF패밀리로서는 예를 들면, EGF, TGF-α(transforming growth factor-α), amphiregulin, HB-EGF(heparin-binding EGF-like growth factor), epiregulin, neuregulin 등을 들 수 있지만, EGF패밀리 중에서도 EGF가 가장 일반적이며 염가인 것으로부터 EGF인 것이 바람직하다.

상기 FGF란, 섬유아세포 증식인자(FGF: fibroblast growth factor)의 것이며, FGF패밀리로부터 선택되는 증식인자가 의도된다. FGF로서는, FGF-2(bFGF)인 것이 바람직하지만, FGF-1 등의 다른 FGF패밀리로부터 선택되어도 좋다. 또한, 본 명세서 중에서 사용되는 경우, PDGF란, 혈소판 유래 증식인자(PDGF: platelet derived growth factor)패밀리로부터 선택되는 증식인자가 의도되며, PDGF-BB 또는 PDGF-AB인 것이 바람직하다.

EGF, FGF 및 PDGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 증식인자는 상기 본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제 중에 적어도 1개 포함되어 있으면 좋다. 그 중에서도 EGF 또는 PDGF가 바람직하고, EGF가 특히 바람직하게 이용되지만, 2 이상의 증식인자를 임의로 조합해서 이용해도 좋다. 특히, 상기 줄기세포로서 간엽계 줄기세포를 이용해서 골분화 유도를 실시할 경우, 상기 증식인자 중에서도 EGF 및 FGF를 조합해서 이용하면, 각각을 단독으로 이용한 경우와 비교해서 여러 가지 다른 간엽계 줄기세포주를 골아세포로 분화 유도할 수가 있으며, 또한 상기 분화를 촉진할 수가 있기 때문에 바람직하다. 다른 줄기세포에 대해서도 2 이상의 증식인자를 임의로 조합해서 이용하면, 분화를 촉진할 수 있기 때문에 바람직하다.

본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제에 있어서의 상기 증식인자의 함유량은 특별히 한정되는 것은 아니지만 상기 분화 유도 배지용 첨가제를 첨가한 배지 속에서의 최종 농도로서 EGF는 0. 5∼200ng/㎖, PDGF는 0. 5∼100ng/㎖가 되도록 이용하는 것이 바람직하다. FGF는 0. 1ng/㎖∼10㎍/㎖가 되도록 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, FGF로서 bFGF를 이용하는 경우는 0. 1ng/㎖∼100ng/㎖가 되도록 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 화합물 및 증식인자는 증식인자로서의 활성을 갖고 있는 한, 천연의 것이어도 합성된 것이어도 좋고, 유전자 조작 등의 방법에 의해서 제조된 것이어도 좋다.

본 발명자들이 개발한 동물세포를 무혈청 배양하기 위한 배지용 첨가제(특허문헌 1)는 10％ 혈청 함유 배지에 있어서 배양한 경우와 동등 또는 그 이상의 속도로 그 특성(예를 들면, 간엽계 줄기세포이면 골분화능, 지방분화능 등)을 유지한 채 줄기세포를 증식시킬 수 있다. 그러나, 골분화 유도 대상 세포의 분화 유도, 예를 들면, 상기 줄기세포가 간엽계 줄기세포인 경우, 골아세포, 지방세포 등으로의 분화 유도를 무혈청 조건하에서 실시하지 못하고, 상기 분화 유도는 혈청 존재하에서 실시할 필요가 있었다.

그래서 본 발명자는 무혈청 조건하에서도 골분화 유도 대상 세포의 골분화 유도를 실시할 수 있는 배양법을 검토했다. 그 결과, EGF, FGF 및 PDGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 증식인자와 덱사메타손과 β-글리세로인산을 적어도 함유하는 분화 유도 배지용 첨가제를 기초 배지에 첨가함으로써 무혈청 조건하에서도 골분화 유도 대상 세포를 골아세포로 분화 유도할 수 있고, 그 중에서도 특히, 간엽계 줄기세포를 골아세포로 효율적으로 분화 유도할 수 있는 것을 밝혀냈다. 또한, 본 발명의 분화 유도 배지용 첨가제를 첨가한 배양 배지를 이용해서 골분화 유도를 실시하면, 혈청 존재하에서 골분화 유도를 실시하는 경우보다도 분화 유도 효율이 우수하고, 골분화 유도의 기간을 단축할 수 있는 것을 밝혀낸 것이다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제는 적어도 하나의 인지질을 추가로 함유하는 것이 바람직하다. 적어도 하나의 인지질을 포함하지 않는 분화 유도 배지용 첨가제를 이용한 경우도, 골분화 유도 대상 세포를 골분화 유도하는 것은 가능하지만, 적어도 하나의 인지질을 첨가함으로써 골분화 유도 대상 세포의 골분화 유도 효율을 더욱 한층 높일 수 있으며, 골분화 유도에 필요로 하는 시간을 더욱더 단축할 수 있기 때문에 바람직하다. 또한, 인지질이 무혈청 조건하에서 골분화 유도 대상 세포의 골분화 유도를 촉진하는 것은 본 발명에 의해서 처음으로 확인된 발견이다.

상기 인지질로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 포스파티딘산, 리소포스파티딘산, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 글리세롤 등을 들 수 있으며, 본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제는 이들의 인지질을 단독으로 함유해도 조합해서 함유해도 좋다. 조합해서 이용할 경우는 포스파티딘산과 포스파티딜 콜린을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 이들의 인지질은 동물 유래 또는, 식물 유래일 수 있다.

상기 분화 유도 배지용 첨가제에 있어서의 인지질의 함유량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 분화 유도 배지용 첨가제를 첨가한 배지 속에서의 최종 농도로서 인지질의 총량으로서 0. 1∼30㎍/㎖인 것이 바람직하고, 최종 농도로서 인지질의 총량으로서 10㎍/㎖인 것이 가장 바람직하다. 또한, 조합해서 이용할 경우, 각각의 인지질의 최종 농도가 동등하게 되도록 부가하는 것이 바람직하다. 인지질의 총량의 최종 농도가 30㎍/㎖를 넘으면, 세포에 대해서 독성이 발생할 가능성이 있기 때문에 바람직하지 않다.

상기 분화 유도 배지용 첨가제는 산화방지제를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 이에 따라, 인지질의 열화를 방지할 수 있다. 상기 산화방지제로서는, 예를 들면 DL-α-토코페롤 아세테이트(비타민E), 디부틸히드록시톨루엔 (dibutylhydroxytoluene, BHT), 부틸히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 카테킨(catechin) 등을 들 수 있으며, DL-α-토코페롤 아세테이트(비타민E)를 특히 바람직하게 이용할 수 있다.

상기 분화 유도 배지용 첨가제에 있어서의 산화방지제의 함유량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 분화 유도 배지용 첨가제를 첨가한 배지 속에서의 최종 농도로서 0. 1∼50㎍/㎖인 것이 바람직하다.

상기 분화 유도 배지용 첨가제는, 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트를 추가로 함유할 수 있다. 단, 본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제에서는 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트를 포함할 필요는 반드시 없으며, 이들이 포함되어 있지 않아도 충분히 골분화 유도 대상 세포의 골분화 유도를 실시할 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 관련되는 분화 유도 배지용 첨가제는 종래, 줄기세포의 골분화 유도에는 필수라고 생각되고 있었던 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트를 함유할 필요가 없으므로 더욱 염가로 골분화 유도를 실시하는 것이 가능하다.

상기 인슐린은 인슐린과 같은 증식인자이어도 좋고, 천연의 세포 유래이어도, 유전자 재조합에 의해서 제조된 것이라도 좋다. 상기 분화 유도 배지용 첨가제에 있어서의 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트의 함유량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 분화 유도 배지용 첨가제를 첨가한 배지 속에서의 최종 농도로서 인슐린은 0. 5∼50㎍/㎖, 트랜스페린은 0. 5∼50㎍/㎖인 것이 바람직하다. 셀레네이트는 0. 1∼50ng/㎖인 것이 바람직하고, 0. 5∼50ng/㎖인 것이 더욱 바람직하다.

또한, 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트는 시판의 ITS서플러먼트 (supplement)를 이용해도 좋고, 인슐린과 트랜스페린과 셀레네이트를 적절히 혼합해서 조제한 것을 이용해도 좋으며, 인슐린과 트랜스페린과 셀레네이트를 따로따로 상기 분화 유도 배지용 첨가제에 첨가한 것이어도 좋다.

본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제는 골분화 유도 대상 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도한다고 하는 본 발명의 효과를 손상하지 않는 한, 상술한 성분 이외의 다른 성분을 포함하고 있어도 좋다. 예를 들면 다른 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 예를 들면 코르티솔(cortisol), 코르티코스테론 (corticosterone), 코르티손(cortisone), 프레드니솔론(prednisolone) 등을 함유하고 있어도 좋다. 이들 그 밖의 성분의 함유량은 상기 분화 유도 배지용 첨가제를 첨가한 배지 속에서의 최종 농도로서 10^-10∼10^-6M인 것이 바람직하고, 10^-9∼10^-7M인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제를 조제하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니고, 종래 공지의 방법에 따라서 조제할 수 있다. 예를 들면, 상술한 성분(EGF, FGF 및 PDGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 증식인자, 덱사메타손, β-글리세로인산 등)을 적절히 혼합함으로써 조제할 수 있다.

본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제에는 부형제, 결합제, 보존제, 안정제, 유화제, 삼투압조정제, 기제 등의 첨가성분을 필요에 따라서 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제는 상기 첨가성분을 이용하여 통상의 제재화 기술에 의해서 제재화할 수 있으며, 정제, 분제, 과립제, 수용제, 유제, 유성제, 혹은 현탁제 등의 고체 또는 액체의 제형으로서 사용할 수 있다.

또한, 상기 분화 유도 배지용 첨가제는 상기 줄기세포로서 간엽계 줄기세포를 이용하고, 간엽계 줄기세포를 골아세포로 분화 유도하기 위해 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 분화 유도 배지용 첨가제에 포함되는 증식인자는 골분화 프로그램을 촉진하는 작용을 가지며, 덱사메타손은 골형성 인자(BMP)를 유도하고, 또한 β-글리세로인산은 인산의 공급 및 골아세포의 석회화를 촉진할 수 있는 작용을 갖기 때문에 효율적으로 골아세포의 골분화를 유도할 수 있다. 또한, 인지질을 추가로 첨가함으로써 상기 골아세포의 골분화를 더욱 촉진할 수 있다. 따라서, 본 발명의 분화 유도 배지용 첨가제는 골아세포의 골분화를 촉진하는 것에 대해서도 유용하다.

[2. 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 분화 유도하기 위한 배양 배지]

본 발명에 관련되는, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 배양 배지(이하, 단지 「본 발명에 따른 배양 배지」라고 한다)는 본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제를 구성하는 성분 및 기초 배지를 함유하고, 혈청을 포함하지 않는다. 해당 성분이란, [1.]에서 설명한 각 성분을 가리킨다. 즉, 본 발명에 따른 배양 배지는 EGF, FGF 및 PDGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 증식인자와 덱사메타손과 β-글리세로인산을 적어도 함유한다.

또한, 인지질은 무혈청 조건하에서의 골아세포로의 분화를 더욱더 촉진할 수가 있기 때문에 상기 성분으로서 적어도 하나의 인지질을 추가로 함유하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 배양 배지는 본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제를 구성하는 성분 및 기초 배지를 함유할 수 있으므로, 상기 성분은 [1.]에서 설명한 분화 유도 배지용 첨가제의 형태로 첨가해도 좋고, [1.]에서 설명한 각 성분을 따로따로 기초 배지에 첨가한 것이어도 좋다.

기초 배지란, 동물세포용의 배양 배지를 의미하고, 종래 공지의 동물세포용의 배양 배지를 이용할 수 있다. 예를 들면, Ham’s　F12 배지, α-MEM 배지, DMEM 배지, RPMI-1640 배지, MCDB201 배지 등을 들 수 있다. 이들의 기초 배지는 단독으로 사용되어도, 복수를 혼합해서 사용되어도 좋다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 배양 배지를 구성하기 위한 기초 배지는 α-MEM 배지와 MCDB201 배지를 1:1의 비율로 혼합한 배지가 바람직하다.

본 발명에 따른 배양 배지는 본 발명에 관련되는 분화 유도 배지용 첨가제를 구성하는 성분과 기초 배지를 혼합함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 기초 배지에 [1.]에서 설명한 성분을 [1.]에서 설명한 최종 농도가 되도록 첨가함으로써 조제할 수 있다. 조제한 배양 배지는 사용 전에 적절히 멸균해서 이용하면 좋다.

또한, 상기 배양 배지는 골분화 유도 대상 세포를 무혈청 조건하에서 분화 유도할 수 있지만, 그 중에서도 상기 줄기세포로서 간엽계 줄기세포를 이용하여 간엽계 줄기세포를 골아세포로 분화 유도하기 위해 이용하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 배양 배지는 본 발명에 관련되는 분화 유도 배지용 첨가제를 구성하는 성분을 함유한다. 해당 분화 유도 배지용 첨가제 속에 포함되는 증식인자는 골분화 프로그램을 촉진하는 작용을 가지며, 덱사메타손은 골형성 인자(BMP)를 유도하고, 또한 β-글리세로인산은 인산의 공급 및 골아세포의 석회화를 촉진할 수 있는 작용을 갖기 때문에 효율적으로 골아세포의 골분화를 유도할 수 있다. 또한, 인지질을 추가로 첨가함으로써 상기 골아세포의 골분화를 더욱 촉진할 수 있다. 따라서, 본 발명의 배양 배지는 골아세포의 골분화를 촉진하는 것에 대해서도 유용하다.

[3. 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 배양방법]

본 발명에 관련되는 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 배양방법(이하, 단지 「본 발명의 배양방법」이라고도 말한다)은 본 발명에 관련되는 배양 배지 속에서 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 분화 배양하는 공정을 포함한다.

배양조건은 골분화 유도 대상 세포를 골아세포에 분화시킬 수 있는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 줄기세포로서 간엽계 줄기세포를 이용해서 골아세포로 분화 유도할 경우, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 10％ FBS함유 DMEM 배지 속에서 컨플루언트 상태가 될 때까지 배양한 간엽계 줄기세포를 본 발명에 따른 배양 배지 속에서 37℃, 5％ CO₂ 존재하에서 7일간 이상 배양함으로써 간엽계 줄기세포를 골아세포로 분화시킬 수 있다. 단, 이것에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 관련되는 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 배양방법에서는 본 발명에 따른 배양 배지 속에서 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 분화 배양하는 상기 공정보다도 전에 FGF, PDGF, EGF, TGF-β 및 HGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 증식인자, 및 적어도 하나의 인지질을 함유하고, 또한 혈청을 포함하지 않는 배양 배지 속에서 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 증식 배양하기 전 공정을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 무혈청 증식 배양 배지를 이용해서 배양된 골분화 유도 대상 세포를 이용하여 본 발명에 따른 배양 배지 속에서 골분화 유도를 실시하면, 통상의 혈청을 포함하는 증식 배양 배지(예를 들면, 10％ FBS함유 DMEM 배지 등)를 이용해서 배양된 골분화 유도 대상 세포를 이용하여 본 발명에 따른ㄴ 배양 배지 속에서 골분화 유도를 실시한 경우와 비교해서 효율적으로 골분화 유도를 실시할 수 있다. 그 결과, 골분화 유도에 걸리는 기간을 더욱 단축시킬 수 있다.

상기 무혈청 증식 배지는 FGF, PDGF, EGF, TGF-β 및 HGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 증식인자, 및 적어도 하나의 인지질을 함유하고, 또한 혈청을 포함하지 않는다. 상기 무혈청 증식 배지가 함유하고 있는 FGF, PDGF, EGF 및 인지질에 대해서는 [1.]에서 설명한 바와 같으므로 생략한다.

상기 TGF-β란, 트랜스포밍 증식인자-β(TGF-β: transforming growth factor-β)의 것이며, TGF-β패밀리로부터 선택되는 증식인자가 의도된다. TGF-β로서는 TGF-β₃인 것이 바람직하지만, 다른 TGF-β패밀리로부터 선택되어도 좋다. 상기 HGF란, 간(肝)세포 증식인자(HGF: hepatocyte growth factor)이다.

상기 무혈형 증식 배지에 있어서의 상기 증식인자의 함유량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 무혈청 증식 배지 속에서의 최종 농도로서 PDGF는 0. 5∼100ng/㎖, TGF-β는 0. 5∼100ng/㎖, EGF는 0. 5ng/㎖∼200ng/㎖, HGF는 0. 1∼50 ng/㎖가 되도록 이용하는 것이 바람직하다. FGF는 0. 1ng/㎖∼10㎍/㎖가 되도록 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, FGF로서 bFGF를 이용할 경우는 0. 1∼100ng/㎖가 되도록 이용하는 것이 바람직하다.

상기 무혈청 증식 배지에 있어서의 인지질의 함유량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 무혈청 증식 배지 속에서의 최종 농도로서 인지질의 총량으로서 0. 1∼30㎍/㎖인 것이 바람직하고, 최종 농도로서 인지질의 총량으로서 10㎍/㎖인 것이 가장 바람직하다. 또한, 조합해서 이용할 경우, 각각의 인지질의 최종 농도가 동등하게 되도록 부가하는 것이 바람직하다. 인지질의 총량의 최종 농도가 30㎍/㎖를 넘으면, 세포에 대해서 독성이 발생할 가능성이 있기 때문에 바람직하지 않다.

상기 무혈청 증식 배지는 인지질을 단독으로 함유하거나 조합되게 함유할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 상기 무혈청 증식 배지는 포스파티딘산과 포스파티딜 콜린을 조합해서 함유한다.

또한, 상기 무혈청 증식 배지는 적어도 하나의 지방산을 추가로 함유하고 있는 것이 바람직하다. 상기 무혈청 증식 배지가 함유하고 있는 지방산으로서는, 예를 들면 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 아라키돈산 , 미리스트산, 올레산, 팔미토일산, 팔미트산, 스테아르산 등을 들 수 있다. 이들의 지방산은 단독으로 함유하거나 조합되게 함유할 수 있다. 또한, 상기 지방산 이외에 추가로 콜레스테롤을 함유하고 있어도 좋다. 상기 무혈청 증식 배지에 있어서의 지방산의 함유량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 지질 농축물(11905-031, Gibco제)을 이용할 경우는, 체적비로 상기 무혈청 증식 배지의 1/1000량 이상 1/10량 이하의 지질 농축물의 원액을 첨가하는 것이 바람직하다.

상기 무혈청 증식 배지는 결합조직증식인자(CTGF: connective tissue growth factor), 혈관내피증식인자(VEGF: vascular endothelial growth factor) 및 아스코르브산 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 인자를 추가로 함유할 수 있다.

상기 무혈청 증식 배지가 함유하고 있는 EGF 및 아스코르브산 화합물에 대해서는 [1.]에서 설명한 바와 같으므로 생략한다. VEGF는 VEGF패밀리로부터 선택되는 증식인자가 의도된다. VEGF로서는 VEGF-A인 것이 바람직하지만, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-D, VEGF-E, PlGF(태반증식인자: placental growth factor)-1, PlGF-2 등 상이한 VEGF패밀리로부터 선택된 상이한 것일 수 있다.

상기 무혈청 증식 배지에 있어서의 상기 인자의 함유량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 무혈청 증식 배지 속에서의 최종 농도로서 CTGF는 0. 1∼20㎍/㎖, VEGF는 0. 5∼100ng/㎖, 아스코르브산 화합물은 0. 5∼200㎍/㎖가 되도록 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 시판되고 있는 VEGF(ｖ3388, Sigma사제)나, CTGF(036-19471, Wako사제)를 이용할 수 있다.

또한, 상기 무혈청 증식 배지는 인지질의 산화방지제를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 인지질의 산화방지제에 대해서는 [1.]에서 설명한 바와 같으므로 생략한다. 일 실시형태에 있어서, 상기 무혈청 증식 배지는 인지질의 산화방지제로서 DL-α-토코페롤 아세테이트(비타민E)를 함유한다. 상기 무혈청 증식 배지에 있어서의 산화방지제의 함유량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 무혈청 증식 배지 속에서의 최종 농도로서 0. 1∼50㎍/㎖인 것이 바람직하다.

상기 무혈청 증식 배지는 또한, 계면활성제를 추가로 함유할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 상기 무혈청 증식 배지는 계면활성제로서 Pluronic F-68 또는 Tween 80을 함유한다.

상기 무혈청 증식 배지는 또한, 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트를 추가로 함유할 수 있다. 상기 무혈청 증식 배지는 추가로, 덱사메타손, 혹은 다른 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 함유할 수 있다. 인슐린, 트랜스페린, 셀레네이트, 덱사메타손 및 다른 글루코코르티코이드에 대해서는 [1.]에서 설명한 바와 같으므로 생략한다. 상기 무혈청 증식 배지에 있어서의 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트의 함유량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 무혈청 증식 배지 속에서의 최종 농도로서 인슐린은 0. 5∼50㎍/㎖, 트랜스페린은 0. 5∼50㎍/㎖, 셀레네이트는 0. 1∼50ng/㎖인 것이 바람직하다. 다른 글루코코르티코이드의 함유량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 무혈청 증식 배지 속에서의 최종 농도로서 10^-10∼10^-6M인 것이 바람직하다.

상기 무혈청 증식 배지를 조제하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니고, 종래 공지의 방법에 따라서 조제할 수 있다. 예를 들면, 상술한 성분(FGF, PDGF, TGF-β 및 HGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 증식인자 및 적어도 하나의 인지질 등)을 기초 배지에 대해서 적절히 혼합함으로써 조제할 수 있다. 이와 같은 무혈청 증식 배지의 일 실시형태로서 후술하는 실시예에서 이용한 무혈청의 STK2 배지를 들 수 있다.

상기 무혈청 증식 배지를 이용하여 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 증식 배양하는 방법으로서는, 골분화 유도 대상 세포의 분화능을 유지하면서 골분화 유도 대상 세포를 증식시킬 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 상기 줄기세포로서 간엽계 줄기세포를 이용하고, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 5000개/㎠의 밀도로 파종한 간엽계 줄기세포를 2일 또는 3일마다 배지를 교환하면서 37℃, 5％ CO₂ 존재하에서 배양함으로써 간엽계 줄기세포의 분화능을 유지하면서 줄기세포를 증식시킬 수 있다. 단, 이것에 한정되는 것은 아니다.

배양 후의 골분화 유도 대상 세포의 골아세포로의 분화의 정도는 종래 공지의 골분화 마커를 이용해서 확인할 수 있다. 예를 들면 골분화 유도 대상 세포를 알리자린 레드로 염색함으로써 확인할 수 있다.

또한, 상기 배양방법에 따르면, 골분화 유도 대상 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도할 수 있지만, 그 중에서도 상기 배양방법은 상기 줄기세포로서 간엽계 줄기세포를 이용하고, 간엽계 줄기세포를 골아세포로 분화 유도하기 위해 이용하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 배양방법에 따르면, 본 발명에 따른 배양 배지 속에서 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 배양하는 공정을 포함한다. 해당 배양 배지 속에 포함되는 증식인자는 골분화 프로그램을 촉진하는 작용을 가지며, 덱사메타손은 골형성 인자(BMP)를 유도하고, 또한 β-글리세로인산은 인산의 공급 및 골아세포의 석회화를 촉진할 수 있는 작용을 갖기 때문에 효율적으로 골아세포의 골분화를 유도할 수 있다. 또한, 인지질을 추가로 첨가함으로써 상기 골아세포의 골분화를 더욱 촉진할 수 있다. 따라서, 본 발명의 배양방법은 골아세포의 골분화를 촉진하는 것에 대해서도 유용하다.

[4. 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 분화 유도하기 위한 키트]

본 발명에 관련되는 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 키트(이하, 단지 「키트」라고 한다)는 본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제를 구성하는 성분을 구비하고 있다. 또한, 추가로 기초 배지를 구비하고 있어도 좋다.

즉, 상기 키트는 EGF, FGF 및 PDGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 증식인자와 덱사메타손과 β-글리세로인산을 구비하고 있다. 또한, 분화가 더욱더 촉진되는 것으로부터 상기 성분으로서 적어도 하나의 인지질을 추가로 함유하는 것이 바람직하다.

상기 인지질은 포스파티딘산, 리소포스파티딘산, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜글리세롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 키트는 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트를 포함하고 있어도 좋다.

키트의 구성으로서는 상기한 것에 한정되는 것은 아니고, 다른 시약이나 기구를 포함해도 좋다. 예를 들면, 골분화 유도 대상 세포를 배양하기 위한 배양 플레이트나 골아세포로의 분화 상태를 평가 가능한 시약(예를 들면, 알리자린 레드 등)을 포함해도 좋고, 배양하는 대상이 되는 골분화 유도 대상 세포를 구비하고 있어도 좋다.

또한, 본 발명에 따른 키트의 제공형태는 분화 유도 배지용 첨가제, 또는 상기 화합물 및 상기 증식인자, 또는 상기 화합물, 상기 증식인자 및 상기 인지질, 기초 배지와 그 외의 시약 모두를 적절한 용량 및/또는 형태로 함유한 하나의 용기로서 제공하거나, 각각 다른 용기에 의해 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 키트에는 상술한 본 발명에 따른 방법을 실시하기 위한 순서 등을 기재한 설명서를 구비해도 좋다.

또한, 본 발명에 따른 키트를 이용함으로써 골분화 유도 대상 세포를 골분화 유도하는 것이 가능하지만, 그 중에서도 상기 키트는 상기 줄기세포로서 간엽계 줄기세포를 이용하고, 골분화를 유도하기 위해 이용되는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 키트는 본 발명에 따른 분화 유도 배지용 첨가제를 구성하는 성분을 구비한다. 해당 분화 유도 배지용 첨가제 중에 포함되는 증식인자는 골분화 프로그램을 촉진하는 작용을 가지며, 덱사메타손은 골형성 인자(BMP)를 유도하고, 또한 β-글리세로인산은 인산의 공급 및 골아세포의 석회화를 촉진할 수 있는 작용을 갖기 때문에 효율적으로 골아세포의 골분화를 유도할 수 있다. 또한, 인지질을 추가로 첨가함으로써 상기 골아세포의 골분화를 더욱 촉진할 수 있다. 따라서, 본 발명의 키트는 골아세포의 골분화를 촉진하는 것에 대해서 유용하다.

[5. 골아세포]

본 발명에 따른 골아세포는 본 발명에 관련되는 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 배양방법에 의해서 생산된다. 본 발명에 관련되는 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 배양방법에 대해서는 [3.]에서 설명한 바와 같으므로 생략한다.

본 발명에 따른 골아세포는 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 종래의 골분화 유도 배지를 이용하는 종래의 골분화 유도 방법에 의해서 분화 유도된 골아세포와 비교하여 골아세포의 석회화를 나타내는 알리자린 레드의 염색성이 강하다. 즉, 본 발명에 따른 골아세포는 종래의 골분화 유도 배지를 이용하는 종래의 골분화 유도 방법에 의해서 분화 유도된 골아세포와 비교하여 칼슘이 더욱 침착된 골아세포라고 하는 특성을 갖고 있다.

이로 인해, 본 발명에 따른 골아세포를 이용하면, 정형, 치과 등 골결손 부위 및 골다공증에 무혈청 배지에서 배양한 세포를 이용하여 재생 의료에 유용할 수 있다.

본 발명은 상술한 각 실시형태에 한정되는 것은 아니고, 청구항에 나타낸 범위에서 여러 가지의 변경이 가능하며, 다른 실시형태에 각각 개시된 기술적 수단을 적절히 조합해서 얻어지는 실시형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 또한, 본 명세서 중에 기재된 학술문헌 및 특허문헌의 모두가 본 명세서 중에 있어서 참고로서 원용된다.

[실시예]

＜세포의 배양조건＞

본 발명의 실시예는 줄기세포로서 간엽계 줄기세포를 이용해서 실시했다. 모든 세포의 배양은 5％ CO₂ 존재하의 CO₂인큐베이터 내에서 37℃의 조건하에서 실시했다.

＜STK2 배지＞

본 발명의 실시예에 있어서, 간엽계 줄기세포의 증식 배양에 이용한 배지(무혈청 증식 배양 배지)를 STK2 배지라고 칭한다. STK2 배지는 기초 배지로서의 DMEM(Sigma제: D6046)/MCDB201=1:1에 FGF-2, 덱사메타손, 인간 인슐린 재조합체, 트랜스페린, 셀레네이트, 우혈청 알부민(BSA), 지질 농축물(Chemically defined lipid concentrate), 대두 레시틴, 콜레스테롤, DL-α-토코페롤 아세테이트, HGF, TGF-β₃, PDGF-BB, EGF, L-아스코르브산2-인산세스퀴마그네슘염(L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt), 포스파티딜콜린, 포스파티딘산염, 염화 리튬, 환원형 L-글루타티온, Pluronic　F-68, Tween　80을 첨가한 무혈청 배지이다.

STK2 배지의 조성을 표 1에 나타낸다. 본 실시예에서 이용한 STK2 배지는 표 1에 기재한 각 성분을 DMEM/MCDB201=1:1에 최종 농도가 표 1 중의 「Optimum Concentration」이 되도록 첨가한 것이다.

[표 1]

표 1 중, 「Source」는 표 1에 나타내는 각 물질의 입수처 및 모델번호를 나타낸다. 「Effective concentration」는 STK2 배지를 구성하는 각 물질의 STK2 배지에 있어서의 최종 농도의 허용 범위를 나타낸다. 지질 농축물(CD)에 대해서는 「1/1000∼1/10」이라고 기재되어 있지만, 이것은 체적비로 STK2 배지의 1/1000량 이상 1/10량 이하의 지질 농축물의 원액을 첨가하는 것을 의미한다. 또한, 계면활성제 Pluronic　F-68, Tween　80은 지질 농축물 속에 포함되어 있다.

또한, 표 1 중, 「Optimum Concentration」은 STK2 배지를 구성하는 각 물질의 매우 적합한 사용량을 나타내고 있다.

＜STK0 배지＞

본 발명의 실시예에 있어서, 골아세포의 분화 유도에 이용한 배지를 STK0 배지라고 칭한다. STK0 배지는 기초 배지로서의 α-MEM(Sigma제: M4526)/MCDB201=1:1에 FGF-2, 덱사메타손, 인간 인슐린 재조합체, 트랜스페린, 셀레네이트, 우혈청 알부민(BSA), 지질 농축물(Chemically defined lipid concentrate), 대두 레시틴, 콜레스테롤, DL-α-토코페롤 아세테이트, HGF, TGF-β₃, PDGF-BB, EGF, L-아스코르브산2-인산세스퀴마그네슘염, 포스파티딜콜린, 포스파티딘산염, 염화 리튬, 환원형 L-글루타티온, Pluronic　F-68, Tween　80을 첨가한 무혈청 배지이다.

STK0 배지의 조성을 표 2에 나타낸다. 본 실시예에서 이용한 STK0 배지는 표 2에 기재한 각 성분을 α-MEM/MCDB201=1:1에 최종 농도가 표 2 중의 「Optimum Concentration」이 되도록 첨가한 것이다.

[표 2]

표 2 중, 「Source」는 표 2에 나타내는 각 물질의 입수처 및 모델번호를 나타낸다. 「Effective concentration」는 STK0 배지를 구성하는 각 물질의 STK0 배지에 있어서의 최종 농도의 허용 범위를 나타낸다. 지질 농축물(CD)에 대해서는 「1/1000∼1/10」이라고 기재되어 있지만, 이것은 체적비로 STK0 배지의 1/1000량 이상 1/10량 이하의 지질 농축물의 원액을 첨가하는 것을 의미한다. 또한, 계면활성제 Pluronic　F-68, Tween　80은 지질 농축물 속에 포함되어 있다. 「Optimum Concentration」은 STK0 배지를 구성하는 각 물질의 매우 적합한 사용량을 나타내고 있다.

＜골아세포로의 분화의 평가＞

본 발명의 실시예에 있어서, 골아세포로의 분화의 평가는 분화 유도 후의 세포를 알리자린 레드(Wako제, 모델번호: 011-01192)로 염색함으로써 실시했다. 알리자린 레드의 염색방법은 그 취급설명서의 방법에 따라서 실시했다.

또한, 본 명세서 중에 있어서, 골아세포로의 분화도를 알리자린 레드의 염색성으로부터 판단해서 「경도」, 「중도」 및 「강도」라고 평가했다.

상기 「경도」의 분화란, 알리자린 레드에 의한 약한 염색이 시각에 의해 확인할 수 있는 단계이다. 예를 들면, 도 1의 「무혈청 골분화 유도 배지 B＋PDGF」의 웰의 사진에 나타내어지는 정도의 염색성을 나타낸 경우를 「경도」의 분화라고 판단했다.

또한, 상기 「중도」의 분화란, 알리자린 레드에 의한 중간 정도의 염색이 시각으로 확인할 수 있는 단계이다. 예를 들면, 도 1의 「무혈청 골분화 유도 배지 B＋FGF」의 웰의 사진에 나타내어지는 정도의 염색성을 나타낸 경우를 「중도」의 분화라고 판단했다.

또한, 상기 「강도」의 분화란, 24 구멍 마이크로 플레이트의 웰의 전체면에 알리자린 레드의 강한 염색이 시각으로 확인할 수 있는 단계이다. 예를 들면, 도 1의 「무혈청 골분화 유도 배지 B＋EGF」의 웰의 사진에 나타내어지는 정도의 염색성을 나타낸 경우를 「강도」의 분화라고 판단했다.

[실시예 1: 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화의 검토(1)]

간엽계 줄기세포로서는, 인간 장골(腸骨) 골수 유래의 간엽계 줄기세포(Bio-Whittaker사(Walkersｖille, MD)부터 구입) 3주(이하, A주, B주, C주로 표기한다)를 이용했다. 또한, A주는 5회 계대(繼代)한 것을 이용하고, B주 및 C주는 4회 계대한 것을 이용했다. 상기 간엽계 줄기세포의 배양은 10％ FBS 함유 DMEM을 이용하고, 배지를 넣은 6 구멍 마이크로 플레이트에 상기 간엽계 줄기세포를 5000개/㎠의 밀도로 파종했다. 세포배양기간 중, 배지는 2일 또는 3일마다 교환했다.

또한, 상기 10％ FBS 함유 DMEM 배지란, 기초 배지로서의 DMEM(Sigma제: D-6046)/MCDB201(Sigma제: M-6770)=1:1에 우태아혈청(FBS)을 최종 농도가 10중량％가 되도록 첨가해서 조제한 배지이다.

세포가 컨플루언트상태가 되기 전에 세포를 PBS로 2회 세정하고, 0. 05％ 트립신 및 0. 2mM　EDTA를 함유하는 PBS 속에서 2분간 인큐베이트함으로써 플레이트로부터 박리하고, 혈청을 함유하지 않는 식물 유래의 Trypsin inhibitor(Sigma제: T6522)와 함께 재현탁시켰다.

이어서, 무혈청 DMEM 배지에서 상기 세포를 3회 세정하고, 24 구멍 마이크로 플레이트에 상기 세포를 10000세포/㎠의 밀도가 되도록 1 세포주에 대해 1 조건당 2 구멍(n=2)에 파종했다. 상기 세포는 무혈청의 STK2 배지 속에서 5％ CO₂ 존재하의 CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃로 컨플루언트상태가 될 때까지 배양했다.

배양 4일째에 세포가 저면에 접착한 상태의 24 구멍 마이크로 플레이트를 무혈청 DMEM 배지를 이용해서 2회 세정하고, 표 3에 나타내는 각 배양 배지 속에서 3일간, 7일간, 14일간 또는 21일간 배양했다. 분화유도기간 중, 배지는 2일 내지 3일마다 새로운 동일한 배지로 교환했다. 표 3에 나타내는 각 배양 배지 속에서 분화 배양을 개시하고 나서 3일째 또는 7일째에 상기 세포를 알리자린 레드로 염색함으로써 골아세포로의 분화의 평가를 실시했다.

여기에서, 표 3에 나타낸 실시예 1에 있어서 이용한 골분화 유도용 배지에 대해서 설명한다. 표 3 중, 「10％ FBS-DMEM」은 10％ FBS 함유 DMEM 배지이다. 상기 「10％ FBS-DMEM」은 컨트롤 배지로서 이용했다. 또한, 「10％ FBS-골분화 유도 배지」는 α-MEM에 FBS를 최종 농도 10중량％, 덱사메타손을 최종 농도 100nM, β-글리세로인산을 최종 농도 10mM 및 L-아스코르브산2-인산세스퀴마그네슘염을 최종 농도 50㎍/㎖가 되도록 첨가해서 조제한 배지이며, 특허문헌 1에서 이용되고 있는 종래 공지의 골분화 유도 배지와 같다.

「무혈청 골분화 유도 배지: A」는, 무혈청 배지인 STK0 배지에 β-글리세로인산을 최종 농도 10mM가 되도록 첨가한 배지이다. 「A-(FGF-2)」란, 무혈청 골분화 유도 배지: A로부터 FGF-2를 제거한 배지이다. 또한, 본 명세서 중에 있어서, 예를 들면, 무혈청 골분화 유도 배지: A로부터의 FGF-2의 제거는, 무혈청 골분화 유도 배지: A를 제작할 때에 FGF-2만을 첨가하지 않음으로써 실시할 수 있다. 이하 「무혈청 골분화 유도 배지: A로부터 TGF-β₃을 제거한」 등에 대해서도 마찬가지이다. 「A-(TGF-β₃)」이란, 무혈청 골분화 유도 배지: A로부터 TGF-β₃을 제거한 배지이다. 「A-HGF」란, 무혈청 골분화 유도 배지: A로부터 HGF를 제거한 배지이다. 「A-EGF」란, 무혈청 골분화 유도 배지: A로부터 EGF를 제거한 배지이다. 「A-(PDGF-BB)」란, 무혈청 골분화 유도 배지: A로부터 PDGF-BB를 제거한 배지이다.

「무혈청 골분화 유도 배지: B」란, 무혈청 골분화 유도 배지: A로부터 FGF-2, TGF-β₃, HGF, EGF 및 PDGF-BB를 제거한 배지이다. 「B＋EGF」란, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 EGF를 최종 농도가 20ng/㎖가 되도록 첨가한 배지이다. 「B＋(FGF-2)」란, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 FGF-2를 최종 농도가 1ng/㎖가 되도록 첨가한 배지이다. 「B＋(TGF-β₃)」란, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 TGF-β₃을 최종 농도가 10ng/㎖가 되도록 첨가한 배지이다. 「B＋HGF」란, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 HGF를 최종 농도가 5ng/㎖가 되도록 첨가한 배지이다. 「B＋ (PDGF-BB)」란, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 PDGF-BB를 최종 농도가 10ng/㎖가 되도록 첨가한 배지이다.

결과를 표 3 및 도 1∼3에 나타냈다. 도 1은 상기 「10％ FBS-골분화 유도 배지」, 즉 종래 공지의 10％ FBS 함유 골분화 유도 배지와 무혈청 골분화 유도 배지: B를 이용한 경우의 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화 유도를 확인한 결과를 나타내는 도면이다. 관찰 결과는 배양 배지 당 3개의 샘플에 대하여 나타내고 있으며, 3개의 샘플은 왼쪽부터 A주, B주, C주이다. 도 2는 증식인자가 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화 유도에 부여하는 영향에 대해서 검토한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3은 10％ FBS 함유 골분화 유도 배지를 이용하고, EGF가 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화 유도에 부여하는 영향에 대해서 검토한 결과를 나타내는 도면이다.

[표 3]

표 3에 나타내는 바와 같이, 10％ FBS 함유 DMEM 배지를 이용한 경우, 7일간 배양 후에도 골아세포로의 분화는 볼 수 없었다. 또한, 도 1에 나타내는 바와 같이, 10％ FBS 함유 골분화 유도 배지를 이용한 경우, 배양 7일째까지는 미분화이었지만, 14일째에 골아세포에 특징적인 석회화를 나타내는 알리자린 레드에 의한 염색성을 나타내고, 칼슘의 침착이 관찰되게 되었다. 또한, 21일째까지 배양하면, 칼슘의 침착이 현저하게 되었다.

한편, 도 1에 나타내는 무혈청 골분화 유도 배지: B란, 표 3에 나타내는 무혈청 골분화 유도 배지: B의 것이며, STK0 배지에 10mM의 β-글리세로인산을 첨가한 배지로부터 EGF, TGF-β₃, HGF, FGF-2 및 PDGF-BB를 제외한 것이다. 도 1에 있어서, 예를 들면 「무혈청 골분화 유도 배지: B＋EGF」란, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 EGF를 최종 농도 20ng/㎖가 되도록 부가한 것이다. 이하 「무혈청 골분화 유도 배지: B＋FGF」 등에 대해서도 마찬가지이다.

도 1, 표 3에 나타내는 바와 같이, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 EGF를 첨가한 배지를 이용한 경우, 3일째에서 중간 정도의 분화가 보이고, 7일째에서 10％ FBS 함유 골분화 유도 배지를 이용한 경우의 21일째보다 훨씬 분화 유도가 진행되고 있는 것이 확인되었다. 무혈청 골분화 유도 배지: B는 상술한 바와 같이, STK0 배지에 10mM의 β-글리세로인산을 첨가한 배지로부터 EGF, TGF-β₃, HGF, FGF-2 및 PDGF-BB를 제외한 것이다. 즉, 기초 배지(MCDB와 α-MEM)를 1:1의 비율로 혼합한 배지)에 덱사메타손, L-아스코르브산2-인산세스퀴마그네슘염, β-글리세포인산염, 지방산(리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 미리스트산, 올레산, 파르미트일산, 팔미틴산, 및 스테아인산), 인지질(포스파티딘산 및 포스파티딜콜린), 콜레스테롤, 산화방지제 DL-α-토코페롤 아세테이트(비타민E), 계면활성제 Pluronic　F-68 및 Tween　80 등을 함유시킨 배지이다. 여기에, 추가로 EGF를 첨가함으로써 10％ FBS 함유 골분화 유도 배지를 이용한 경우보다도 매우 단기간에 강하게 골아세포로의 분화 유도를 촉진할 수 있는 것이 분명해졌다.

또한, 도 1, 표 3에 나타내는 바와 같이, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 FGF-2를 부가한 경우는, 3일째에는 간엽계 줄기세포는 미분화이었지만, 7일째에는 중간 정도의 골아세포로의 분화가 보이고, 10％ FBS 함유 골분화 유도 배지를 이용한 경우의 21일째보다도 훨씬 분화 유도가 진행되고 있는 것이 확인되었다. 또한, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 PDGF-BB를 부가한 경우는, 3일째에는 미분화이었지만, 7일째에는 경도의 분화가 보이고, 해당 분화는 10％ FBS 함유 골분화 유도 배지를 이용한 경우의 14일째보다도 현저했다.

도 2에 있어서, 예를 들면 「무혈청 골분화 유도 배지: B＋EGF」란, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 EGF를 최종 농도 20ng/㎖가 되도록 부가한 것을 의미한다. 도 2에 있어서 예를 들면 「무혈청 골분화 유도 배지: A-(FGF-2)」라고 있는 것은 무혈청 골분화 유도 배지: A로부터 FGF-2를 제외한 배지를 의미한다. 도 2에 있어서의 배양기간은 7일간이다. 도 2, 표 3에 나타내는 바와 같이, 무혈청 골분화 유도 배지: A를 이용한 경우, 그곳으로부터 TGF-β₃을 제외한 배지를 이용한 경우에만 분화를 볼 수 있었다. 또한, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 TGF-β₃을 부가한 경우는 분화를 볼 수 없었다. 따라서, 증식인자에는 EGF, FGF-2, PDGF-BB와 같이 간엽계 줄기세포를 골아세포에 분화시키기 위해 매우 적합한 것과, TGF-β₃과 같이 부적당한 것이 있는 것을 알았다.

또한, 도 2에 있어서의 웰의 사진 중, 「컨트롤」이라고 표시한 왼쪽의 열은β-글리세로인산을 포함하지 않는 시험플롯이며, 오른쪽의 열은 β-글리세로인산을 최종 농도 10mM로 포함하는 시험플롯이다.

도 3은 10％ FBS-골분화 유도 배지에 EGF를 첨가함으로써 골아세포로의 분화가 촉진되는 것을 나타내고 있지만, 배양 14일째라도 분화의 정도는 도 1에 나타내는 무혈청 골분화 유도 배지: B에 EGF를 첨가한 시험구보다도 뒤떨어져 있었다.

[실시예 2: 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화의 검토(2)]

간엽계 줄기세포로서는 인간 장골 골수 유래 간엽계 줄기세포(Bio-Whittaker사(Walkersｖille, MD)부터 구입) 5주(이하, F주, G주, H주, I주, J주로 표기한다)를 이용했다. 또한, F주, H주 및 I주는 5회 계대한 것을 이용하고, G주 및 J주는 4회 계대한 것을 이용했다. 상기 간엽계 줄기세포의 증식 배양에는 10％ FBS 함유 DMEM를 이용하고, 배지를 넣은 6 구멍 마이크로 플레이트에 상기 간엽계 줄기세포를 5000개/㎠의 밀도로 파종했다. 세포배양기간 중, 배지는 2일 또는 3일마다 교환했다.

간엽계 줄기세포가 컨플루언트상태가 되기 전에, 실시예 1과 똑같은 방법으로 6 구멍 마이크로 플레이트로부터 간엽계 줄기세포를 회수했다. 계속해서, 10％ FBS 함유 DMEM 배지에서 상기 세포를 3회 세정하고, 24 구멍 마이크로 플레이트에 상기 세포를 10000개/㎠의 밀도가 되도록 1 세포주에 대해 1 조건당 2 구멍(n=2)에 파종했다. 상기 세포는 상기 10％ FBS 함유 DMEM 배지 속에서 컨플루언트상태가 될 때까지 배양했다.

배양 4 일째에 세포가 접착한 상태의 24 구멍 마이크로 플레이트를 무혈청DMEM 배지를 이용해서 2회 세정하고, 표 4에 나타내는 각 배양 배지 속에서 7일간, 14일간 또는 21일간 배양했다. 분화유도기간 중, 배지는 2일 내지 3일마다 새로운 동일한 배지로 교환했다. 표 4에 나타내는 각 배양 배지 속에서 분화 배양을 개시하고 나서 7일째, 14일째 또는 21일째에 상기 세포를 알리자린 레드로 염색함으로써 골아세포로의 분화의 평가를 실시했다.

여기에서, 표 4에 나타낸 실시예 2에 있어서 이용한 골분화 유도용 배지에 대해서 설명한다. 표 4 중, 「10％ FBS-골분화 유도 배지」는 실시예 1에서 이용된 「10％ FBS-골분화 유도 배지」와 같다. 또한, 「10％ FBS-골분화 유도 배지(α:M=1:1)」는 실시예 1에서 이용된 「10％ FBS-골분화 유도 배지」의 기초 배지를 α-MEM으로부터 α-MEM과 MCDB201를 1:1의 비율로 혼합한 것으로 바꾼 이외는 실시예 1에서 이용된 「10％ FBS-골분화 유도 배지」와 같다.

「무혈청 골분화 유도 배지: B」란, 실시예 1에서 이용한 「무혈청 골분화 유도 배지: B」와 같다. 또한, 「B＋EGF」, 「B＋(FGF-2)」, 「B＋(TGF-β₃)」, 「B＋HGF」 및 「B＋(PDGF-BB)」에 대해서도 실시예 1에서 이용한 배지와 같다.

「무혈청 골분화 유도 배지: C」란, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 FGF-2 및 EGF를 각각 최종 농도가 1ng/㎖ 및 20ng/㎖가 되도록 첨가한 배지이다. 「C-Dex」란, 무혈청 골분화 유도 배지: C로부터 덱사메타손을 제거한 배지이다. 「C-VC」란, 무혈청 골분화 유도 배지: C로부터 L-아스코르브산2-인산세스퀴마그네슘염을 제거한 배지이다. 「C-(β-글리세로인산)」이란, 무혈청 골분화 유도 배지: C로부터 β-글리세로인산을 제거한 배지이다. 「C-PA-PC」란, 무혈청 골분화 유도 배지: C로부터 포스파티딜콜린 및 포스파티딘산나트륨염을 제거한 배지이다. 「C-CD」란, 무혈청 골분화 유도 배지: C로부터 지질 농축물을 제거한 배지이다. 「C-LiCl」란, 무혈청 골분화 유도 배지: C로부터 LiCl를 제거한 배지이다. 「C-ITS」란, 무혈청 골분화 유도 배지: C로부터 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트를 제거한 배지이다. 「C-CD-LiCl」란, 무혈청 골분화 유도 배지: C로부터 지질 농축물 및 LiCl를 제거한 배지이다. 「C-CD-LiCl-VC＋(PDGF-BB)」란, 무혈청 골분화 유도 배지: C로부터 지질 농축물, LiCl 및 L-아스코르브산2-인산세스퀴마그네슘염을 제거하고, 또한 PDGF-BB를 최종 농도가 10ng/㎖가 되도록 첨가한 배지이다. 분화 유도 후 7일째의 골분화의 결과를 표 4에, 14일째의 골분화의 결과를 표 5에, 21일째의 골분화의 결과를 표 6에 각각 나타냈다.

[표 4]

[표 5]

[표 6]

표 4∼6에 나타내는 바와 같이, 10％ FBS-골분화 유도 배지를 이용한 경우, 실시예 1에서 얻어진 결과와 마찬가지로, 배양 7일째까지는 간엽계 줄기세포는 미분화이었지만, 14일째에는 골아세포로의 경도의 분화가 보이고, 또한, 21일째까지 배양하면, 더욱더 분화가 진행되었다. 또한, 10％ FBS 함유 골분화 유도 배지(D: M=1:1)를 이용한 경우도, 거의 동일한 결과가 얻어졌다.

한편, 무혈청 골분화 유도 배지: B, 즉 STK0 배지에 10mM의 β-글리세로인산을 첨가한 배지로부터 EGF, TGF-β₃, HGF, FGF-2 및 PDGF-BB를 제외한 것을 이용한 경우, 분화 유도 후 21일째에 있어서도 골아세포의 분화를 확인할 수 없었다. 따라서, 무혈청 조건하에 있어서 골분화 유도를 실시하려면, 무엇인가의 증식인자의 첨가가 필수인 것이 밝혀졌다.

또한, 표 4∼6 중, 배지 4∼배지 9를 이용하여 분화 유도를 실시한 결과는 어느 증식인자를 첨가할 필요가 있는지를 보여준다. 표 6에 나타내는 바와 같이, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 TGF-β₃, 또는 HGF를 첨가한 경우는, 분화 유도 후 21일째에 있어서도 골아세포의 분화를 확인할 수 없었다. 한편, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 EGF 또는 PDGF-BB를 각각 단독으로 첨가한 경우는, 분화 유도 후 7일째에는 이미 경도의 분화가 확인되고, 해당 분화는 10％ FBS 함유 골분화 유도 배지를 이용한 경우의 14일째의 결과보다도 현저하게 촉진되고 있었다. 따라서, 증식인자에는 EGF 및 PDGF-BB와 같이 매우 효율적으로 간엽계 줄기세포를 골아세포에 분화시킬 수 있는 것과, TGF-β₃ 및 HGF와 같이 골아세포의 분화에 부적당한 것이 있는 것이 밝혀졌다.

또한, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 FGF-2를 단독으로 첨가한 경우는, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 EGF 또는 PDGF-BB를 각각 단독으로 첨가한 경우와 비교해서 골아세포의 분화 유도 효율이 낮고, B주에 있어서만 골아세포로의 분화 유도가 가능했다. 그러나, 무혈청 골분화 유도 배지: C, 즉 무혈청 골분화 유도 배지: B에 FGF-2 및 EGF를 첨가한 배지를 이용한 경우, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 EGF를 단독으로 첨가한 경우와 비교해서 C주에 있어서의 분화 유도 효율이 높아지는 것이 밝혀졌다. 따라서, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 PDGF-BB를 단독으로 첨가하는 것, 무혈청 골분화 유도 배지: B에 EGF를 단독으로 첨가하는 것, 또는 무혈청 골분화 유도 배지: B에 FGF-2 및 EGF를 조합해서 첨가함으로써 무혈청 조건하에서 매우 효율적으로 골아세포로의 분화를 유도할 수 있는 것이 밝혀졌다.

또한, 표 4∼6 중, 배지 9∼배지 18을 이용해서 분화 유도를 실시한 결과로부터, 무혈청 골분화 유도 배지: C에 있어서, 증식인자 외에, 추가로 골아세포로의 분화 유도에 필요한 그 밖의 인자가 밝혀졌다. 표 4에 나타내는 바와 같이, 배지 11, 배지 14∼배지 16을 이용해서 분화 유도를 실시한 경우, 즉 L-아스코르브산2-인산세스퀴마그네슘염, 지질 농축물, ITS 및 염화 리튬은 이들 인자의 어느 하나를 배지에 첨가하지 않는 경우라도 분화 유도 후 7일째에는 골아세포로의 경도의 분화가 확인되었다. 또한, 배지 17 및 배지 18을 이용해서 분화 유도를 실시한 결과로부터 L-아스코르브산2-인산세스퀴마그네슘염, 지질 농축물, ITS 및 염화 리튬의 복수의 인자를 배지에 동시에 첨가하지 않는 경우라도 분화 유도 후 7일째에는 골아세포로의 경도의 분화가 확인되었다. 이것으로부터 L-아스코르브산2-인산세스퀴마그네슘염, 지질 농축물, ITS 및 염화 리튬은 무혈청 조건하에서의 골아세포의 분화 유도에 필수라고는 할 수 없는 것이 밝혀졌다. 또한, 종래, ITS 및 아스코르브산은 골아세포의 분화 유도에 필수의 인자라고 생각되고 있었지만, 실시예 2의 결과로부터 반드시 필요하지 않은 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따르면, 골분화 유도용 배지 첨가제에 ITS 및 아스코르브산을 첨가하지 않아도 되는 만큼 골분화 유도용 배지 첨가제를 더욱 염가로 제공할 수 있다.

또한, 「C-CD」배지, 즉 무혈청 골분화 유도 배지: C로부터 지질 농축물을 제거한 배지를 이용한 경우에, 무혈청 골분화 유도 배지: C를 이용한 경우와 비교해서 골아세포로의 분화가 촉진되는 것으로부터 지방산은 골아세포로의 분화에 억제적으로 작용하는 것이 분명해졌다.

한편, 덱사메타손, β-글리세로인산에 관해서는 어느 쪽인가 한쪽을 제거하면 골아세포로의 분화가 유도되지 않는 것으로부터, 이들 2개의 인자는 무혈청 골분화 유도 배지에 필수의 인자인 것이 분명해졌다.

또한, 「C-PA-PC」배지, 즉 무혈청 골분화 유도 배지: C로부터 인지질(포스파티딜콜린 및 포스파티딘산염)을 제거한 배지를 이용한 경우에, 무혈청 골분화 유도 배지: C를 이용한 경우와 비교해서 골아세포로의 분화 효율이 저하하는 것으로부터, 인지질을 첨가함으로써 골아세포로의 분화가 더욱 촉진되는 것이 분명해졌다.

이상, 도 1∼3 및 표 3∼6에 나타낸 바와 같이, 매우 적합한 증식인자 및 화합물을 무혈청 배지에 함유시킴으로써 간엽계 줄기세포를, 고농도 혈청을 이용해서 배양하는 경우보다도 강하게 골아세포에 분화 유도할 수 있는 것이 분명해졌다.

실시예의 결과로부터, EGF, FGF, 및 PDGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 증식인자와 덱사메타손과 β-글리세로인산이 적어도 포함되어 있는 경우에, 간엽계 줄기세포를 무혈청 조건하에서 골아세포에 분화 유도할 수 있는 것이 분명해졌다. 또한, 상기 증식인자, 덱사메타손 및 β-글리세로인산에 부가해서 적어도 하나의 인지질이 추가로 포함되어 있는 경우에, 골아세포로의 분화가 더욱 촉진되는 것도 분명해졌다. 이것으로부터, 기초 배지에 EGF, FGF, 및 PDGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 증식인자와 덱사메타손과 β-글리세로인산을 첨가제로서 첨가함으로써 간엽계 줄기세포를 무혈청 조건하에서 골아세포에 분화 유도할 수 있으며, 또한, 적어도 하나의 인지질을 첨가제로서 첨가함으로써 골아세포로의 분화를 더욱 효율적으로 유도할 수 있다고 말할 수 있다. 또한, 표 7에 바람직한 무혈청 배지의 조성의 예를 나타낸다. 본 명세서 중에서는 표 7에 나타낸 조성을 갖는 무혈청 배지를 이후 「STK3 배지」라고 칭한다.

[표 7]

[실시예 3: 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화의 검토(3)]

간엽계 줄기세포로서는, 인간 골수 유래 간엽계 줄기세포(Bio-Whittaker사(Walkersｖille, MD)부터 구입) 3주(이하, K주, L주, M주로 표기한다)를 이용했다. 또한, K주는 8회 계대한 것을 이용하고, L주는 7회 계대한 것을 이용하며, M주는 10회 계대한 것을 이용했다.

(1. 무혈청의 STK2 배지를 이용하여 증식 배양을 실시한 간엽계 줄기세포의 골분화 유도)

상기 간엽계 줄기세포를 무혈청의 STK2 배지를 이용하고, 배지를 넣은 6 구멍 마이크로 플레이트에 상기 간엽계 줄기세포를 5000개/㎠의 밀도로 파종했다. 세포배양기간 중 배지는 2일 또는 3일마다 교환했다.

세포가 컨플루언트상태가 되기 전에 세포를 PBS로 2회 세정하고, 0. 05％ 트립신 및 0. 2mM　EDTA를 함유하는 PBS 속에서 2분간 인큐베이트함으로써 플레이트로부터 박리하며, 혈청을 함유하지 않는 식물 유래의 Trypsin inhibitor(Sigma제: T6522)와 함께 재현탁시켰다.

계속해서 무혈청의 STK2 배지에서 상기 세포를 3회 세정하고, 24 구멍 마이크로 플레이트에 상기 세포를 5000 세포/㎠의 밀도가 되도록 1 세포주에 대해서 1 조건당 3 구멍(n=3)에 파종했다. 상기 세포는 무혈청의 STK2 배지 속에서 5％ CO₂ 존재하의 CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃로 컨플루언트상태가 될 때까지 배양했다.

컨플루언트상태가 된 세포가 저면에 접착한 상태의 24 구멍 마이크로 플레이트를 무혈청DMEM 배지를 이용해서 2∼3회 세정하고, 10％ FBS-골분화 유도 배지 또는 무혈청 골분화 유도 배지(STK3 배지)를 이용해서 분화 배양했다. 또한, 상기 「10％ FBS-골분화 유도 배지」는 실시예 1에서 설명한 바와 같이 α-MEM에 FBS를 최종 농도 10중량％, 덱사메타손을 최종 농도 100nM, β-글리세로인산을 최종 농도 10mM 및 L-아스코르브산2-인산세스퀴마그네슘염을 최종 농도 50㎍/㎖가 되도록 첨가해서 조제한 배지이며, 특허문헌 1에서 이용되고 있는 종래 공지의 골분화 유도 배지와 같다. 분화유도기간 중, 배지는 2일 내지 3일마다 새로운 동일한 배지로 교환했다. 각 배양 배지 속에서 배양을 개시하고 나서 4일째, 7일째, 14일째 또는 21일째에 상기 세포를 알리자린 레드로 염색함으로써 골아세포로의 분화의 평가를 실시했다. 결과를 도 4 및 표 8∼11에 나타냈다.

(2. 10％ FBS 함유 DMEM 배지를 이용하여 증식 배양을 실시한 간엽계 줄기세포의 골분화 유도)

상기 간엽계 줄기세포를 10％ FBS 함유 DMEM 배지를 이용해서 배지를 넣은 6 구멍 마이크로 플레이트에 상기 간엽계 줄기세포를 5000개/㎠의 밀도로 파종했다. 세포배양기간 중, 배지는 2일 또는 3일마다 교환했다.

계속해서 10％ FBS 함유 DMEM 배지 속에서 24 구멍 마이크로 플레이트에 상기 세포를 5000 세포/㎠의 밀도가 되도록 1 세포주에 대해서 1 조건당 3 구멍(n=3)에 파종했다. 상기 세포는 5％ CO₂ 존재하의 CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃로 컨플루언트상태가 될 때까지 배양했다.

컨플루언트상태가 된 세포가 저면에 접착한 상태의 24 구멍 마이크로 플레이트를 무혈청DMEM 배지를 이용해서 2∼3회 세정하고, 10％ FBS-골분화 유도 배지 또는 무혈청 골분화 유도 배지(STK3 배지)를 이용해서 분화 배양했다. 분화유도기간 중, 배지는 2일 내지 3일마다 새로운 동일한 배지로 교환했다. 배양 배지 속에서 배양을 개시하고 나서 4일째, 7일째, 14일째 또는 21일째에 상기 세포를 알리자린 레드로 염색함으로써 골아세포로의 분화의 평가를 실시했다. 결과를 도 4 및 표 8∼11에 나타냈다.

[표 8]

[표 9]

[표 10]

[표 11]

도 4는 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화 유도의 결과를 나타내는 도면이다. 또한, 도 4에 나타낸 분화 유도 후 4일째의 골분화의 결과를 표 8에, 분화 유도 후 7일째의 골분화의 결과를 표 9에, 14일째의 골분화의 결과를 표 10에, 21일째의 골분화의 결과를 표 11에 각각 나타냈다. 도 4 및 표 8에 나타내는 바와 같이, 골분화 유도를 개시하고 나서 4일째에 있어서, 무혈청의 STK2 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 무혈청의 STK3 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포에서는, 이미 골아세포로의 분화가 시작되어 있는 것이 확인되었다.

이에 대해서, STK2 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 종래법의 10％ FBS-골분화 유도 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포에서는, 골아세포로의 분화는 확인되지 않았다. 또한, 10％ FBS 함유 DMEM 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 무혈청의 STK3 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포 및 10％ FBS 함유 DMEM 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 10％ FBS-골분화 유도 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포에서는, 어느 것이나 골아세포로의 분화는 확인되지 않았다.

도 4 및 표 9에 나타내는 바와 같이, 골분화 유도를 개시하고 나서 7일째에 있어서, 10％ FBS 함유 DMEM 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 무혈청의 STK3 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포 및 무혈청의 STK2 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 무혈청의 STK3 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포는, 어느 것이나 골아세포에 분화하고 있는 것이 확인되었다.

무혈청의 STK2 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 무혈청의 STK3 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포 쪽이 약간 강하고 골아세포에 분화하고 있었다.

이에 대해서, 10％ FBS 함유 DMEM 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 10％ FBS-골분화 유도 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포에서는, 골아세포로의 분화는 확인되지 않았다.

도 4 및 표 10에 나타내는 바와 같이, 골분화 유도를 개시하고 나서 14일째에 있어서, 10％ FBS 함유 DMEM 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 10％ FBS-골분화 유도 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포는, 골아세포에 분화하고 있는 것이 확인되었다.

그러나, 10％ FBS 함유 DMEM 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 STK3 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포보다도 골아세포로의 분화의 정도가 가벼웠다.

이에 대해서, 무혈청의 STK2 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 무혈청의 STK3 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포는, 10％ FBS 함유 DMEM 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 무혈청의 STK3 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포보다도 골아세포에 강하게 분화하고 있는 것이 확인되었다.

도 4 및 표 11에 나타내는 바와 같이, 골분화 유도를 개시하고 나서 21일째에 있어서, 10％ FBS 함유 DMEM 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 무혈청의 STK3 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포 및 무혈청의 STK2 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 무혈청의 STK3 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포는, 어느 것이나 골아세포에 강하게 분화하고 있는 것이 확인되었다.

이에 대해서, 10％ FBS 함유 DMEM 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 10％ FBS-골분화 유도 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포는, 무혈청의 STK2 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 10％ FBS-골분화 유도 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포보다도 골아세포로의 분화의 정도가 가벼웠다.

실시예 3의 결과로부터 종래법의 10％ FBS-골분화 유도 배지를 이용한 경우와 비교해서, 무혈청의 STK3 배지를 이용한 경우는 간엽계 줄기세포를 더욱 높은 효율로, 또한 더욱 빨리 골아세포에 분화시킬 수 있는 것이 분명해졌다. 이 결과로부터, 무혈청의 STK2 배지를 이용해서 증식 배양한 간엽계 줄기세포는, 10％ FBS 함유 DMEM 배지를 이용해서 증식 배양을 실시한 간엽계 줄기세포보다도 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화능이 높게 유지되고 있는 것이 분명해졌다.

또한, 종래법의 10％ FBS-골분화 유도 배지를 이용하면, 간엽계 줄기세포가 골아세포로 분화하기까지 2∼3주간을 필요로 한다. 이에 대해서, 무혈청의 STK2 배지를 이용해서 증식 배양하고, 또한 무혈청의 STK3 배지를 이용해서 분화 유도를 실시한 간엽계 줄기세포는, 분화 유도 개시 4일째에 있어서, 이미 골아세포로 분화하고 있는 것이 확인되었다. 이것은 무혈청의 STK2 배지와 무혈청의 STK3 배지를 조합하여 이용함으로써 상승적으로 골아세포로의 분화 유도가 촉진되고 있다고 생각되었다.

본 발명에 관련되는 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 세포에 골분화 유도하기 위한 분화 유도 배지용 첨가제를 무혈청 배지에 첨가함으로써, 혈청을 함유하는 종래의 분화 유도 배지보다도 강하게 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 골분화시킬 수 있다. 따라서, 상기 분화 유도 배지용 첨가제는 재생 의료 등에 있어서 매우 적합하게 이용할 수 있다.

Claims

EGF, FGF 및 PDGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 증식인자와 덱사메타손과 β-글리세로인산을 적어도 함유하는 것을 특징으로 하는 줄기세포(幹細胞), 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 분화 유도 배지용 첨가제.
제 1 항에 있어서,
적어도 하나의 인지질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 분화 유도 배지용 첨가제.
제 2 항에 있어서,
상기 인지질이 포스파티딘산(phosphatidic acid), 리소포스파티딘산 (lysophosphatidic acid), 포스파티딜 이노시톨( phosphatidyl inositol), 포스파티딜 세린(phosphatidyl serine), 포스파티딜 에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline) 및 포스파티딜 글리세롤(phosphatidyl glycerol)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분화 유도 배지용 첨가제.
제 2 항에 있어서,
산화방지제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 분화 유도 배지용 첨가제.
제 4 항에 있어서,
상기 산화방지제가 DL-α-토코페롤 아세테이트(비타민E)인 것을 특징으로 하는 분화 유도 배지용 첨가제.
제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 있어서,
상기 줄기세포가 간엽계 줄기세포인 것을 특징으로 하는 분화 유도 배지용 첨가제.
제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 기재된 분화 유도 배지용 첨가제를 구성하는 성분 및 기초 배지를 함유하고, 혈청을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 배양 배지.
제 7 항에 있어서,
상기 줄기세포가 간엽계 줄기세포인 것을 특징으로 하는 배양 배지.
제 7 항에 기재된 배양 배지 속에서 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 분화 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 배양방법.
제 9 항에 있어서,
상기 줄기세포가 간엽계 줄기세포인 것을 특징으로 하는 배양방법.
제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 기재된 분화 유도 배지용 첨가제를 구성하는 성분을 구비하고 있는 것을 특징으로 하는, 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 무혈청 조건하에서 골분화 유도하기 위한 키트.
제 11 항에 있어서,
상기 줄기세포가 간엽계 줄기세포인 것을 특징으로 하는 키트.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
제 7 항에 기재된 배양 배지 속에서 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 분화 배양하는 공정 이전에 FGF, PDGF, EGF, TGF-β 및 HGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 증식인자, 및 적어도 하나의 인지질을 함유하고, 또한 혈청을 포함하지 않는 배양 배지 속에서 줄기세포, 치수세포, 치근막세포, 태반, 양막 및 섬유아세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 증식 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
제 9 항, 제 10 항 또는 제 13 항에 기재된 배양방법에 의해서 생산된 것을 특징으로 하는 골아세포.