JPWO2010055616A1 - 分化誘導培地用添加剤およびその利用 - Google Patents

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Abstract

幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤およびその利用を提供する。本発明に係る、幹細胞を無血清条件下で分化誘導するための分化誘導培地用添加剤は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンとβ−グリセロリン酸とを少なくとも含有する。通常アスコルビン酸２−リン酸とＩＴＳは骨分化に必須であるが、本発明の分化誘導培地用添加剤には不必要である。また、リン脂質を添加することで骨分化を促進できた。

Description

本発明は、分化誘導用培地添加剤およびその利用に関するものであり、より詳細には、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤およびその利用に関するものである。
幹細胞は、自己複製能と分化能を有する細胞である。上記幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、および体性幹細胞等が知られている。上記体性幹細胞としては、例えば、造血幹細胞、神経幹細胞、および間葉系幹細胞等がある。上記ＥＳ細胞および上記ｉＰＳ細胞は、あらゆる組織へと分化することができる多分化能を有している。上記造血幹細胞は、血液細胞へと分化する能力を有しており、上記神経幹細胞は、神経細胞へと分化する能力を有している。また、上記間葉系幹細胞は、骨髄等の組織中に存在し、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞等へ分化する多分化能を有する幹細胞として知られている。
上記幹細胞のうち、例えば、間葉系幹細胞は、現在、再生医療分野において移植用細胞として利用されており、間葉系幹細胞の適応対象である疾患は、骨欠損、軟骨欠損、歯周病、心筋梗塞、難治性皮膚疾患、骨粗しょう症、変形性関節病、脊髄損傷、造血支持、臓器移植での拒絶反応抑制等、多岐にわたる。今後、間葉系幹細胞の適応対象となる疾患は、さらに増えるものと予想される（例えば、脳梗塞、閉塞性動脈硬化症、腎臓疾患等）。
上記幹細胞から各種機能性細胞への分化誘導培地としては、現在、動物血清（通常１０〜１５％ウシ胎仔血清）が添加された培地が広く用いられている。この血清は、生体外での細胞の成長および／または増殖を促進するための栄養源、またはホルモン等の生理活性物質の供給源として用いられている。
しかしながら、血清は、非常に高価であり、また天然製品であるがゆえにロット毎に成分の差が生じる。そのため、細胞分化の促進効果にばらつきが生じやすい。また、培養後の細胞から血清由来のタンパク質等を除去するために精製する必要があり、作業が煩雑になる。さらに、血清中に混入している未知の病原体（ウイルス、病原性プリオン等）により培養細胞が汚染される危険性がある。また、例えば、間葉系幹細胞を分化誘導する場合、血清中には、間葉系幹細胞の骨分化を阻害する成分が含まれる可能性があり、骨分化の効率を低下させうる。それゆえ、無血清条件下で上記幹細胞を分化誘導させうる技術が、再生医療の実現および普及には不可欠である。
例えば、間葉系幹細胞を骨芽細胞へと分化誘導する場合、これまでに、血清の使用量を低減させて骨分化を行う方法は知られており、例えば、ウシ胎仔血清の量を１％に低減した培地に上皮増殖因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を添加することによって、間葉系幹細胞の骨形成細胞への分化を誘導する方法が開示されている（非特許文献１）。
また、特定の増殖因子およびリン脂質を含有する組成物を基礎培地に添加することにより、間葉系幹細胞を無血清条件下で培養した細胞を、血清含有培地で骨芽細胞または脂肪細胞へ分化誘導させる技術も知られている（特許文献１）。
国際公開第２００７／０８０９１９Ａ１号パンフレット（２００７年７月１９日公開）
ＳＣＩＥＮＣＥ，３０８，１４７２‐１４７７，２００５．
しかしながら、特許文献１の構成では、間葉系幹細胞を無血清条件下で培養することはできるものの、分化誘導を無血清条件下で行うことはできていない。
また、非特許文献１の構成では、血清の使用量は低減されているとはいえ、依然として血清含有培地で分化誘導を行うため、分化の促進効果にばらつきが生じるという問題、精製作業の煩雑さという問題、培養細胞汚染の問題、安価に分化誘導を行うことができないという問題などの、血清に起因する問題点を内包している。一方、無血清条件下で間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する方法については、これまでに存在する知見はない。
また、他の幹細胞に関しても、同様に無血清条件下で分化誘導する方法についてはほとんど知見が無い。例えば、ＥＳ細胞を無血清条件下で神経細胞へと分化誘導する場合に用いられる無血清培地は、市販のＮ２添加剤およびＢ２７添加剤（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）という高価な添加剤を基本培地に加える必要があり、無血清条件下での分化誘導が可能であるとしても、血清の代わりに高価な添加剤を加える必要があるという問題を有する。
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で安価に効率よく骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤およびその利用を提供することにある。
本発明に係る、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β−グリセロリン酸とを少なくとも含有することを特徴としている。
上記の構成によれば、上記増殖因子は幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞（以下、これらの細胞を総称して「骨分化誘導対象細胞」ともいう）の骨分化プログラムを促進する作用を有し、デキサメタゾンは細胞の生存と分化を促進し、β−グリセロリン酸はリン酸を供給し、かつ石灰化を促進しうる作用を有する。それゆえ、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を基礎培地に添加することにより、無血清条件下で骨分化誘導対象細胞を効率よく骨分化誘導することができると考えられる。
したがって、ばらつきのない安定した分化促進効果を得ることができる。また、培養後の細胞から血清由来のタンパク質等を除去するための精製を行うことなく、且つ血清中に混入している未知の病原体による培養細胞の汚染を防ぐことができる。さらに、高価な血清を用いる必要が無いので安価に上記分化誘導を行うことができる。また、従来、骨分化誘導に必要と考えられていたヒトインシュリン組み替え体、トランスフェリン、セレネート、およびアスコルビン酸を添加する必要が必ずしも無いため、分化誘導培地用添加剤をより安価に提供することができる。
本発明に係る分化誘導培地用添加剤は、少なくとも１つのリン脂質をさらに含有することが好ましい。さらに、上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、およびフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることが好ましい。
上記構成によれば、上記増殖因子、デキサメタゾン、およびβ−グリセロリン酸の働きによって骨分化誘導対象細胞を分化誘導することができるとともに、少なくとも１つのリン脂質の働きによって、骨分化誘導対象細胞の骨分化を誘導するシグナル伝達系が活性化されるため、さらに骨分化を促進することができる。したがって、骨分化誘導対象細胞をより効率よく骨分化誘導することができ、骨分化誘導に必要な時間を短縮することができる。結果として、骨分化誘導にかかるコストを削減することができる。
本発明に係る分化誘導培地用添加剤は、酸化防止剤をさらに含有することが好ましく、上記酸化防止剤はＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であることが好ましい。
上記構成によれば、リン脂質の劣化を防止することができるので、骨分化誘導対象細胞をより効率的に骨に分化させることが可能になる。
また、上記分化誘導培地用添加剤は、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用いる骨分化誘導に用いることが好ましい。
上記の構成によれば、上記増殖因子は骨分化プログラムを促進する作用を有し、デキサメタゾンは骨形成因子（ＢＭＰ）を誘導し、β−グリセロリン酸はアルカリホスファターゼにより無機リン酸に変換されてリン酸を供給し、かつ石灰化を促進しうる作用を有する。それゆえ、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を基礎培地に添加することにより、無血清条件下で間葉系幹細胞を効率よく骨芽細胞に分化誘導することができると考えられる。したがって、ばらつきのない安定した分化促進効果を得ることができる。また、少なくとも１つのリン脂質をさらに含有することによって、間葉系幹細胞の骨分化を誘導するシグナル伝達系が活性化されるため、さらに骨分化を促進することができる。したがって、間葉系幹細胞をより効率よく骨芽細胞に分化誘導することができ、骨分化誘導に必要な時間を短縮することができる。結果として、骨分化誘導にかかるコストを削減することができる。
本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養培地は、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分および基礎培地を含有し、血清を含まないことを特徴としている。
また、上記培養培地は、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用いる骨分化誘導に用いることが好ましい。
本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法は、上記培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を分化培養する工程を包含することを特徴としている。
また、上記培養方法は、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用いることが好ましい。
本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するためのキットは、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分を備えていることを特徴としている。
また、上記キットは、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用いる骨分化誘導に用いることが好ましい。
本発明に係る分化誘導培地用添加剤は、上述のように、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β−グリセロリン酸とを少なくとも含有することにより、骨分化誘導対象細胞を無血清条件下で骨分化誘導することができる。さらに、少なくとも１つのリン脂質を含有することにより、無血清条件下における骨分化誘導対象細胞の骨分化をさらに促進させることができる。
よって、上記培養培地中で骨分化誘導対象細胞を培養することにより、骨分化誘導対象細胞の骨分化誘導を効率的に行うことができる。さらに、上記キットを用いることにより、従来無血清下で行うことが困難であった骨分化誘導対象細胞の骨分化を容易に行うことができる。
さらに、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用いることにより、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導を効率的に行うことができる。さらに、上記キットを用いることにより、従来無血清下で行うことが困難であった間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を容易に行うことができる。
また、本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法では、本発明に係る培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を分化培養する上記工程よりも前に、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有し、且つ血清を含まない培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を増殖培養する前工程を包含することが好ましい。
骨分化誘導対象細胞を、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有し、且つ血清を含まない培養培地（以下、「無血清増殖培養培地」と称する）を用いて培養することによって、骨分化誘導対象細胞の分化能を高く維持することができる。これは、上記無血清増殖培養培地には血清に含まれる骨分化誘導対象細胞の増殖促進因子の全てが含まれている訳ではないが、骨分化誘導対象細胞の増殖抑制因子は全く含まれないため、血清含有培地よりも骨分化誘導対象細胞の増殖能および多分化能を高く保つことができるためであると考えられる。
従って、上記無血清増殖培養培地中で増殖培養された骨分化誘導対象細胞を、本発明に係る培養培地中で骨分化誘導させることは、骨分化誘導対象細胞の増殖能および多分化能が高く保たれた骨分化誘導対象細胞を、本発明に係る培養培地中で効率よく骨分化誘導することになる。このため、通常の血清を含む増殖培養培地を用いて培養された骨分化誘導対象細胞を用いて、本発明に係る培養培地中で骨分化誘導を行った場合と比較して、効率よく骨分化誘導を行うことができる。その結果、骨分化誘導にかかる期間をより短縮させることができる。
また、本発明に係る骨芽細胞は、本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法によって生産されたことを特徴としている。
本発明に係る骨芽細胞は、従来の骨分化誘導培地を用いる従来の骨分化誘導方法によって分化誘導された骨芽細胞と比較して、骨芽細胞の石灰化を示すアリザリンレッドの染色性が強い。つまり、本発明に係る骨芽細胞は、従来の骨分化誘導培地を用いる従来の骨分化誘導方法によって分化誘導された骨芽細胞と比較してカルシウムがより沈着した骨芽細胞であるという特性を有している。
このため、本発明に係る骨芽細胞を用いれば、整形、歯科など骨欠損部位および骨粗鬆症に無血清培地で培養した細胞を用い再生医療に役立てることができる。
本発明に係る、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤は、以上のように、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β−グリセロリン酸とを少なくとも含有する。それゆえ、基礎培地に添加することにより、骨分化誘導対象細胞を無血清条件下で効率よく骨分化誘導することができ、高価であり、かつ、病原体混入や分化のばらつき等の危険性がある血清の使用を回避することができるという効果を奏する。また、従来、骨分化誘導に必要と考えられていたヒトインシュリン組み替え体、トランスフェリン、セレネート、およびアスコルビン酸を添加する必要が無いため、分化誘導培地用添加剤をより安価に提供することができる。
１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地と、無血清骨分化誘導培地：Ｂとを用いた場合の、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導を確認した結果を示す図である。 増殖因子が間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導に与える影響について検討した結果を示す図である。 １０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用い、ＥＧＦが間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導に与える影響について検討した結果を示す図である。 間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導の結果を示す図である。
本発明の実施の形態について説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を示す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」であることを示す。
〔１．幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤〕
本発明に係る、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤（以下、単に「本発明に係る分化誘導培地用添加剤」という）は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β−グリセロリン酸とを少なくとも含有する。
本明細書において、上記「幹細胞」は、ヒト由来であってもよいし、動物由来であってもよい。上記「幹細胞」としては、骨芽細胞へと分化する能力を有しているものであれば特に限定されない。このような「幹細胞」としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系幹細胞等の体性幹細胞等を挙げることができる。
上記幹細胞としては、支持細胞とともに用いてもよいし、幹細胞単独で用いてもよい。上記体性幹細胞としては、組織から採取したプライマリーな体性幹細胞を用いてもよいし、株化されたものを用いてもよい。また、上記ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞等から分化誘導して得られた体性幹細胞を用いてもよい。また、例えば、分化途中のものであってもよいし、未分化なものであってもよい。また、分化させる幹細胞は、コンフルエントに達した細胞でもよいし、達していない細胞でもよい。
上記幹細胞として、間葉系幹細胞を例に挙げると、例えば、骨髄由来、脂肪由来、骨膜由来、滑膜由来、臍帯血由来、胎盤由来、指由来等の間葉系幹細胞を用いることができる。また、間葉系幹細胞の分化誘導の中でも、骨芽細胞へと分化誘導させる場合を例に挙げると、上記間葉系幹細胞は、骨芽細胞に分化途中のものであってもよいし、未分化なものであってもよい。また、分化させる間葉系幹細胞は、コンフルエントに達した細胞でもよいし、達していない細胞でもよい。
歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞としては、ヒト由来であってもよいし、動物由来であってもよい。また、支持細胞とともに用いてもよいし、単独で用いてもよい。また、組織から採取したプライマリーな細胞を用いてもよいし、株化されたものを用いてもよい。
幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞は、それぞれを単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。
デキサメタゾンおよびβ−グリセロリン酸は、上記増殖因子と組み合わせて基礎培地に添加することにより、骨分化誘導対象細胞を無血清条件下で効率よく骨分化誘導することができる。具体的には、骨芽細胞の細胞外マトリックス形成と石灰化を効率よく行うことができる。
各化合物の使用量は特に限定されるものではないが、上記分化誘導培地用添加剤を添加した培地中での最終濃度として、例えば、デキサメタゾンは、１０−６〜１０−１０Ｍの範囲内で用いることが好ましく、１０−7〜１０−9Ｍの範囲内で用いることがより好ましい。また、β−グリセロリン酸は、１〜１００ｍＭの範囲内で用いることが好ましく、１〜３０ｍＭの範囲内で用いることがより好ましい。
上記ＥＧＦとは上皮増殖因子（ＥＧＦ：epidermal growth factor）のことであり、ＥＧＦファミリーから選択される増殖因子が意図される。ＥＧＦファミリーとしては、例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α（transforming growth factor-α）、ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ、ＨＢ−ＥＧＦ（heparin-binding EGF-like growth factor）、ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ、ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ等が挙げられるが、ＥＧＦファミリーの中でＥＧＦが最も一般的で安価であることから、ＥＧＦであることが好ましい。
上記ＦＧＦとは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：fibroblast growth factor）のことであり、ＦＧＦファミリーから選択される増殖因子が意図される。ＦＧＦとしては、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）であることが好ましいが、ＦＧＦ−１などの他のＦＧＦファミリーから選択されてもよい。また、本明細書中で使用される場合、ＰＤＧＦとは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ：platelet derived growth factor）ファミリーから選択される増殖因子が意図され、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢであることが好ましい。
ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される増殖因子は、上記本発明に係る分化誘導培地用添加剤中に少なくとも１つ含まれていればよい。中でもＥＧＦまたはＰＤＧＦが好ましく、ＥＧＦが特に好ましく用いられるが、２以上の増殖因子を任意に組み合わせて用いてもよい。特に、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用いて、骨分化誘導を行う場合、上記増殖因子の中でも、ＥＧＦおよびＦＧＦを組み合わせて用いると、それぞれを単独で用いた場合と比較して、様々な異なる間葉系幹細胞株を、骨芽細胞へ分化誘導することができ、且つ上記分化を促進することができるため好ましい。他の幹細胞についても、２以上の増殖因子を任意に組み合わせて用いると、分化を促進できるため好ましい。
本発明に係る分化誘導培地用添加剤における上記増殖因子の含有量は、特に限定されるものではないが、上記分化誘導培地用添加剤を添加した培地中での最終濃度として、ＥＧＦは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦは０．５〜１００ｎｇ／ｍｌとなるように用いることが好ましい。ＦＧＦは０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌとなるように用いることが好ましい。例えば、ＦＧＦとしてｂＦＧＦを用いる場合は、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌとなるように用いることが好ましい。
なお、上記化合物および増殖因子は、増殖因子としての活性を有している限り、天然のものであっても合成されたものであってもよく、遺伝子組み換え等の方法によって製造されたものであってもよい。
本発明者らが開発した、動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤（特許文献１）は、１０％血清含有培地において培養した場合と同等またはそれ以上の速度で、その特性（例えば、間葉系幹細胞であれば骨分化能、脂肪分化能など）を保持したまま幹細胞を増殖させることができる。しかしながら、骨分化誘導対象細胞の分化誘導、例えば、上記幹細胞が間葉系幹細胞の場合、骨芽細胞、脂肪細胞等への分化誘導を無血清条件下で行うことはできず、上記分化誘導は血清存在下で行う必要があった。
そこで本発明者は、無血清条件下であっても骨分化誘導対象細胞の骨分化誘導を行うことができる培養法を検討した。その結果、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β−グリセロリン酸とを少なくとも含有する分化誘導培地用添加剤を基礎培地に添加することによって、無血清条件下であっても骨分化誘導対象細胞を骨芽細胞へと分化誘導することができ、中でも特に、間葉系幹細胞を骨芽細胞へと効率よく分化誘導することができることを見出した。さらに、本発明の分化誘導培地用添加剤を添加した培養培地を用いて骨分化誘導を行うと、血清存在下で骨分化誘導を行う場合よりも、分化誘導効率に優れ、骨分化誘導の期間を短縮することができることを見出したものである。
一実施形態において、本発明に係る分化誘導培地用添加剤は、少なくとも１つのリン脂質をさらに含有することが好ましい。少なくとも１つのリン脂質を含まない分化誘導培地用添加剤を用いた場合も、骨分化誘導対象細胞を骨分化誘導することは可能であるが、少なくとも１つのリン脂質を添加することにより、骨分化誘導対象細胞の骨分化誘導効率をより一層高めることができ、骨分化誘導に要する時間をさらに短縮することができるため好ましい。なお、リン脂質が無血清条件下で骨分化誘導対象細胞の骨分化誘導を促進することは、本発明によって初めて確認された知見である。
上記リン脂質としては、特に限定されるものではないが、例えば、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、フォスファチジルグリセロールなどが挙げられ、本発明に係る分化誘導培地用添加剤はこれらのリン脂質を単独で含有しても組み合わせて含有してもよい。組み合わせて用いる場合は、フォスファチジン酸とフォスファチジルコリンとを用いることが好ましい。また、これらのリン脂質は、動物由来であっても、植物由来であってもよい。
上記分化誘導培地用添加剤におけるリン脂質の含有量は、特に限定されるものではないが、上記分化誘導培地用添加剤を添加した培地中での最終濃度として、最終濃度としてリン脂質の総量として０．１〜３０μｇ／ｍｌであることが好ましく、最終濃度としてリン脂質の総量として１０μｇ／ｍｌであることが最も好ましい。また、組み合わせて用いる場合、それぞれのリン脂質の最終濃度が等しくなるように加えることが好ましい。リン脂質の総量の最終濃度が３０μｇ／ｍｌを超えると、細胞に対して毒性が発生する可能性があるため好ましくない。
上記分化誘導培地用添加剤は、酸化防止剤を含有していることが好ましい。これにより、リン脂質の劣化を防止することができる。上記酸化防止剤としては、例えばＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、カテキン等を挙げることができ、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）を特に好ましく用いることができる。
上記分化誘導培地用添加剤における酸化防止剤の含有量は、特に限定されるものではないが、上記分化誘導培地用添加剤を添加した培地中での最終濃度として、０．１〜５０μｇ／ｍｌであることが好ましい。
上記分化誘導培地用添加剤は、インスリン、トランスフェリンおよびセレネートをさらに含有してもよい。ただし、本発明に係る分化誘導培地用添加剤では、インスリン、トランスフェリンおよびセレネートを含む必要は必ずしもなく、これらが含まれていなくても十分に骨分化誘導対象細胞の骨分化誘導を行うことができる。このように、本発明に係る分化誘導培地用添加剤は、従来、幹細胞の骨分化誘導には必須であると考えられていたインスリン、トランスフェリンおよびセレネートを含有する必要がないので、より安価に骨分化誘導を行うことが可能である。
上記インスリンは、インスリン様増殖因子であってもよく、天然の細胞由来であっても、遺伝子組換えによって製造されたものでもよい。上記分化誘導培地用添加剤におけるインスリン、トランスフェリンおよびセレネートの含有量は、特に限定されるものではないが、上記分化誘導培地用添加剤を添加した培地中での最終濃度として、インスリンは０．５〜５０μｇ／ｍｌ、トランスフェリンは０．５〜５０μｇ／ｍｌであることが好ましい。セレネートは０．１〜５０ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、０．５〜５０ｎｇ／ｍｌであることがより好ましい。
また、インスリン、トランスフェリンおよびセレネートは、市販のＩＴＳサプリメントを用いてもよいし、インスリンとトランスフェリンとセレネートとを適宜混合して調製したものを用いてもよいし、インスリンとトランスフェリンとセレネートとを別々に上記分化誘導培地用添加剤に添加したものであってもよい。
本発明に係る分化誘導培地用添加剤は、骨分化誘導対象細胞を無血清条件下で骨分化誘導するという本発明の効果を損なわない限り、上述した成分以外の他の成分を含んでいてもよい。例えば他のグルココルチコイド、例えばコルチゾール、コルチコステロン、コルチゾン、プレドニソロン等を含有していてもよい。これらその他の成分の含有量は上記分化誘導培地用添加剤を添加した培地中での最終濃度として、１０−１０〜１０−６Ｍであることが好ましく、１０−９〜１０−７Ｍであることがより好ましい。
本発明に係る分化誘導培地用添加剤を調製する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法に従って調製することができる。例えば、上述した成分（ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸等）を適宜混合することによって調製することができる。
本発明に係る分化誘導培地用添加剤には、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、乳化剤、浸透圧調整剤、基剤などの添加成分を必要に応じて使用することができる。本発明に係る分化誘導培地用添加剤は、上記添加成分を用いて、通常の製剤化技術によって製剤化することができ、錠剤、粉剤、顆粒剤、水溶剤、乳剤、油性剤、もしくは懸濁剤などの固体または液体の剤型として使用することができる。
また、上記分化誘導培地用添加剤は、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用い、間葉系幹細胞を骨芽細胞へと分化誘導するために用いることが好ましい。本発明の分化誘導培地用添加剤に含まれる増殖因子は骨分化プログラムを促進する作用を有し、デキサメタゾンは骨形成因子（ＢＭＰ）を誘導し、且つβ−グリセロリン酸はリン酸の供給および骨芽細胞の石灰化を促進しうる作用を有するため、効率よく骨芽細胞の骨分化を誘導できる。また、リン脂質をさらに添加することにより、上記骨芽細胞の骨分化をより促進することができる。よって、本発明の分化誘導培地用添加剤は、骨芽細胞の骨分化を促進することに対しても有用である。
〔２．幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で分化誘導するための培養培地〕
本発明に係る、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養培地（以下、単に「本発明に係る培養培地」という）は、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分および基礎培地を含有し、血清を含まない。当該成分とは、〔１．〕で説明した各成分を指す。すなわち、本発明に係る培養培地は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β−グリセロリン酸とを少なくとも含有する。
また、リン脂質は、無血清条件下での骨芽細胞への分化をさらに促進することができるため、上記成分として少なくとも１つのリン脂質をさらに含有することが好ましい。
また、上記培養培地は、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分および基礎培地を含有していればよいので、上記成分は、〔１．〕で説明した分化誘導培地用添加剤の形態で添加してもよいし、〔１．〕で説明した各成分を別々に基礎培地に添加したものであってもよい。
基礎培地とは、動物細胞用の培養培地を意味し、従来公知の動物細胞用の培養培地を用いることができる。例えば、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、α−ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ２０１培地などが挙げられる。これらの基礎培地は、単独で使用されても、複数を混合して使用されてもよい。一実施形態において、本発明に係る培養培地を構成するための基礎培地は、α−ＭＥＭ培地とＭＣＤＢ２０１培地とを１：１の比率で混合した培地が好ましい。
本発明に係る培養培地は、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分と基礎培地とを混合することによって得ることができる。例えば、基礎培地に、〔１．〕で説明した成分を〔１．〕で説明した最終濃度になるように添加することによって調製することができる。調製した培養培地は、使用前に適宜滅菌して用いればよい。
また、上記培養培地は、骨分化誘導対象細胞を無血清条件下で分化誘導することができるが、中でも、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用い、間葉系幹細胞を骨芽細胞へと分化誘導するために用いることがより好ましい。本発明の培養培地は、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分を含有する。当該分化誘導培地用添加剤中に含まれる増殖因子は骨分化プログラムを促進する作用を有し、デキサメタゾンは骨形成因子（ＢＭＰ）を誘導し、且つβ−グリセロリン酸はリン酸の供給および骨芽細胞の石灰化を促進しうる作用を有するため、効率よく骨芽細胞の骨分化を誘導できる。また、リン脂質をさらに添加することにより、上記骨芽細胞の骨分化をより促進することができる。よって、本発明の培養培地は、骨芽細胞の骨分化を促進することに対しても有用である。
〔３．幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法〕
本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法（以下、単に「本発明の培養方法」ともいう）は、本発明に係る培養培地中で、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を分化培養する工程を包含する。
培養条件は、骨分化誘導対象細胞を骨芽細胞に分化させることができる限り特に限定されるものではない。例えば、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用い、骨芽細胞へと分化誘導する場合、後述する実施例に示すように、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中でコンフルエント状態になるまで培養した間葉系幹細胞を、本発明に係る培養培地中で３７℃、５％ＣＯ２存在下で７日間以上培養することにより、間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化させることができる。ただし、これに限定されるものではない。
本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法では、本発明に係る培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を分化培養する上記工程よりも前に、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有し、且つ血清を含まない培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を増殖培養する前工程を包含することが好ましい。
上記無血清増殖培養培地を用いて培養された骨分化誘導対象細胞を用いて、本発明に係る培養培地中で骨分化誘導を行えば、通常の血清を含む増殖培養培地（例えば、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地等）を用いて培養された骨分化誘導対象細胞を用いて、本発明に係る培養培地中で骨分化誘導を行った場合と比較して、効率よく骨分化誘導を行うことができる。その結果、骨分化誘導にかかる期間をより短縮させることができる。
上記無血清増殖培地は、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有し、且つ血清を含まない。上記無血清増殖培地が含有しているＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、およびリン脂質については、〔１．〕で説明したとおりであるので省略する。
上記ＴＧＦ−βとはトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β：transforming growth factor−β）のことであり、ＴＧＦ−βファミリーから選択される増殖因子が意図される。ＴＧＦ−βとしては、ＴＧＦ−β３であることが好ましいが、他のＴＧＦ−βファミリーから選択されてもよい。上記ＨＧＦとは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ：hepatocyte growth factor）である。
上記無血増殖持培地における上記増殖因子の含有量は、特に限定されるものではないが、上記無血清増殖培地中での最終濃度として、ＰＤＧＦは０．５〜１００ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ−βは０．５〜１００ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦは０．５ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、ＨＧＦは０．１〜５０ｎｇ／ｍｌとなるように用いることが好ましい。ＦＧＦは０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌとなるように用いることが好ましい。例えば、ＦＧＦとしてｂＦＧＦを用いる場合は、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌとなるように用いることが好ましい。
上記無血清増殖培地におけるリン脂質の含有量は、特に限定されるものではないが、上記無血清増殖培地中での最終濃度として、最終濃度としてリン脂質の総量として０．１〜３０μｇ／ｍｌであることが好ましく、最終濃度としてリン脂質の総量として１０μｇ／ｍｌであることが最も好ましい。また、組み合わせて用いる場合、それぞれのリン脂質の最終濃度が等しくなるように加えることが好ましい。リン脂質の総量の最終濃度が３０μｇ／ｍｌを超えると、細胞に対して毒性が発生する可能性があるため好ましくない。
上記無血清増殖培地は、リン脂質を単独で含有しても組み合わせて含有してもよい。一実施形態において、上記無血清増殖培地は、フォスファチジン酸とフォスファチジルコリンとを組み合わせて含有する。
また、上記無血清増殖培地は、少なくとも１つの脂肪酸をさらに含有していることが好ましい。上記無血清増殖培地が含有している脂肪酸としては、例えば、リノール酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸およびステアリン等が挙げられる。これらの脂肪酸は、単独で含有しても組み合わせて含有してもよい。また、上記脂肪酸以外にさらにコレステロールを含有していてもよい。上記無血清増殖培地における脂肪酸の含有量は、特に限定されるものではないが、例えば、脂質濃縮物（１１９０５−０３１、Ｇｉｂｃｏ製）を用いる場合は、体積比で上記無血清増殖培地の１／１０００量以上１／１０量以下の脂質濃縮物の原液を添加することが好ましい。
上記無血清増殖培地は、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ：connective tissue growth factor）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：vascular endothelial growth factor）およびアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子をさらに含有していてもよい。
上記無血清増殖培地が含有しているＥＧＦおよびアスコルビン酸化合物については、〔１．〕で説明したとおりであるので省略する。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦファミリーから選択される増殖因子が意図される。ＶＥＧＦとしては、ＶＥＧＦ−Ａであることが好ましいが、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＰｌＧＦ（胎盤増殖因子：placental growth factor）−１、ＰｌＧＦ−２など他のＶＥＧＦファミリーから選択されてもよい。
上記無血清増殖培地における上記因子の含有量は、特に限定されるものではないが、上記無血清増殖培地中での最終濃度として、ＣＴＧＦは０．１〜２０μｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦは０．５〜１００ｎｇ／ｍｌ、アスコルビン酸化合物は０．５〜２００μｇ／ｍｌとなるように用いることが好ましい。例えば、市販されているＶＥＧＦ（ｖ３３８８、Ｓｉｇｍａ社製）や、ＣＴＧＦ（０３６−１９４７１、Ｗａｋｏ社製）を用いることができる。
また、上記無血清増殖培地は、リン脂質の酸化防止剤を含有していることが好ましい。リン脂質の酸化防止剤については、〔１．〕で説明したとおりであるので省略する。一実施形態において、上記無血清増殖培地は、リン脂質の酸化防止剤として、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）を含有する。上記無血清増殖培地における酸化防止剤の含有量は、特に限定されるものではないが、上記無血清増殖培地中での最終濃度として、０．１〜５０μｇ／ｍｌであることが好ましい。
上記無血清増殖培地は、また、界面活性剤をさらに含有していてもよい。一実施形態において、上記無血清増殖培地は、界面活性剤として、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８またはＴｗｅｅｎ ８０を含有する。
上記無血清増殖培地は、また、インスリン、トランスフェリンおよびセレネートをさらに含有していてもよい。上記無血清増殖培地はさらに、デキサメタゾン、あるいは他のグルココルチコイドを含有していてもよい。インスリン、トランスフェリン、セレネート、デキサメタゾン、および他のグルココルチコイドについては、〔１．〕で説明したとおりであるので省略する。上記無血清増殖培地におけるインスリン、トランスフェリンおよびセレネートの含有量は、特に限定されるものではないが、上記無血清増殖培地中での最終濃度として、インスリンは０．５〜５０μｇ／ｍｌ、トランスフェリンは０．５〜５０μｇ／ｍｌ、セレネートは０．１〜５０ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。他のグルココルチコイドの含有量は、特に限定されるものではないが、上記無血清増殖培地中での最終濃度として、１０−１０〜１０−６Ｍであることが好ましい。
上記無血清増殖培地を調製する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法に従って調製することができる。例えば、上述した成分（ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質等）を基礎培地に対して適宜混合することによって調製することができる。このような無血清増殖培地の一実施形態として、後述する実施例で用いた無血清のＳＴＫ２培地を挙げることができる。
上記無血清増殖培地を用いて、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を増殖培養する方法としては、骨分化誘導対象細胞の分化能を維持しつつ、骨分化誘導対象細胞を増殖させることができる限り、特に限定されない。例えば、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用い、後述する実施例に示すように、５０００個／ｃｍ２の密度で播種した間葉系幹細胞を、２日または３日毎に培地を交換しながら、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養することにより、間葉系幹細胞の分化能を維持しつつ、幹細胞を増殖させることができる。ただし、これに限定されるものではない。
培養後の骨分化誘導対象細胞の骨芽細胞への分化の程度は、従来公知の骨分化マーカーを用いて確認することができる。例えば骨分化誘導対象細胞をアリザリンレッドで染色することによって確認することができる。
また、上記培養方法によれば、骨分化誘導対象細胞を無血清条件下で骨分化誘導することができるが、中でも、上記培養方法は、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用い、間葉系幹細胞を骨芽細胞へと分化誘導するために用いることがより好ましい。本発明の培養方法によれば、本発明に係る培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を培養する工程を包含する。当該培養培地中に含まれる増殖因子は骨分化プログラムを促進する作用を有し、デキサメタゾンは骨形成因子（ＢＭＰ）を誘導し、且つβ−グリセロリン酸はリン酸の供給および骨芽細胞の石灰化を促進しうる作用を有するため、効率よく骨芽細胞の骨分化を誘導できる。また、リン脂質をさらに添加することにより、上記骨芽細胞の骨分化をより促進することができる。よって、本発明の培養方法は骨芽細胞の骨分化を促進することに対しても有用である。
〔４．幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で分化誘導するためのキット〕
本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するためのキット（以下、単に「キット」という）は、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分を備えている。また、さらに基礎培地を備えていてもよい。
つまり、上記キットは、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β−グリセロリン酸とを備えている。また、分化がさらに促進されることから、上記成分として少なくとも１つのリン脂質をさらに含有することが好ましい。
上記リン脂質は、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、およびフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることが好ましい。
また、上記キットは、インスリン、トランスフェリンおよびセレネートを含んでいてもよい。
キットの構成としては上記したものに限定されるものではなく、他の試薬や器具を含んでもよい。例えば、骨分化誘導対象細胞を培養するための培養プレートや骨芽細胞への分化状態を評価可能な試薬（例えば、アリザリンレッド等）を含んでもよいし、培養する対象となる骨分化誘導対象細胞を備えていてもよい。
また、本発明に係るキットの提供形態は、分化誘導培地用添加剤、または上記化合物および上記増殖因子、または上記化合物、上記増殖因子および上記リン脂質、基礎培地、並びにその他の試薬全てを、適切な容量および／または形態で含有した一つの容器として提供してもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。また、本発明に係るキットには、上述した本発明に係る方法を行うための手順等を記載した説明書を備えてもよい。
また、本発明に係るキットを用いることにより、骨分化誘導対象細胞を骨分化誘導することが可能であるが、中でも、上記キットは、上記幹細胞として間葉系幹細胞を用い、骨分化を誘導するために用いられることがより好ましい。本発明のキットは、本発明に係る分化誘導培地用添加剤を構成する成分を備える。当該分化誘導培地用添加剤中に含まれる増殖因子は骨分化プログラムを促進する作用を有し、デキサメタゾンは骨形成因子（ＢＭＰ）を誘導し、且つβ−グリセロリン酸はリン酸の供給および骨芽細胞の石灰化を促進しうる作用を有するため、効率よく骨芽細胞の骨分化を誘導できる。また、リン脂質をさらに添加することにより、上記骨芽細胞の骨分化をより促進することができる。よって、本発明のキットは、骨芽細胞の骨分化を促進することに対して有用である。
〔５．骨芽細胞〕
本発明に係る骨芽細胞は、本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法によって生産される。本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法については、〔３．〕で説明したとおりであるので省略する。
本発明に係る骨芽細胞は、後述する実施例に示すように、従来の骨分化誘導培地を用いる従来の骨分化誘導方法によって分化誘導された骨芽細胞と比較して、骨芽細胞の石灰化を示すアリザリンレッドの染色性が強い。つまり、本発明に係る骨芽細胞は、従来の骨分化誘導培地を用いる従来の骨分化誘導方法によって分化誘導された骨芽細胞と比較してカルシウムがより沈着した骨芽細胞であるという特性を有している。
このため、本発明に係る骨芽細胞を用いれば、整形、歯科など骨欠損部位および骨粗鬆症に無血清培地で培養した細胞を用い再生医療に役立てることができる。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
＜細胞の培養条件＞
本発明の実施例は、幹細胞として間葉系幹細胞を用いて行った。全ての細胞の培養は、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて３７℃の条件下において行った。
＜ＳＴＫ２培地＞
本発明の実施例において、間葉系幹細胞の増殖培養に用いた培地（無血清増殖培養培地）をＳＴＫ２培地と称する。ＳＴＫ２培地は、基礎培地としてのＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ製：Ｄ６０４６）／ＭＣＤＢ２０１＝１：１にＦＧＦ−２、デキサメタゾン、ヒトインシュリン組み替え体、トランスフェリン、セレネート、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脂質濃縮物（Chemically defined lipid concentrate）、大豆レシチン、コレステロール、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート、ＨＧＦ、ＴＧＦ−β３、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、Ｌ−アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩、フォスファチジルコリン、フォスファチジン酸塩、塩化リチウム、還元型Ｌ−グルタチオン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、Ｔｗｅｅｎ ８０を添加した無血清培地である。
ＳＴＫ２培地の組成を表１に示す。本実施例で用いたＳＴＫ２培地は、表１に記載の各成分を、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１＝１：１に、最終濃度が表１中の「Optimum Concentration」となるように添加したものである。
表１中、「Source」は、表１に示す各物質の入手先および型番を示す。「Effective concentration」は、ＳＴＫ２培地を構成する各物質の、ＳＴＫ２培地における最終濃度の許容範囲を示す。脂質濃縮物（ＣＤ）については、「１／１０００〜１／１０」と記載されているが、これは、体積比でＳＴＫ２培地の１／１０００量以上１／１０量以下の脂質濃縮物の原液を添加することを意味する。尚、界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、Ｔｗｅｅｎ ８０は、脂質濃縮物中に含まれている。
また、表１中、「Optimum Concentration」は、ＳＴＫ２培地を構成する各物質の好適な使用量を表している。
＜ＳＴＫ０培地＞
本発明の実施例において、骨芽細胞の分化誘導に用いた培地をＳＴＫ０培地と称する。ＳＴＫ０培地は、基礎培地としてのα−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ製：Ｍ４５２６）／ＭＣＤＢ２０１＝１：１にＦＧＦ−２、デキサメタゾン、ヒトインシュリン組み替え体、トランスフェリン、セレネート、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脂質濃縮物（Chemically defined lipid concentrate）、大豆レシチン、コレステロール、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート、ＨＧＦ、ＴＧＦ−β３、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、Ｌ−アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩、フォスファチジルコリン、フォスファチジン酸塩、塩化リチウム、還元型Ｌ−グルタチオン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、Ｔｗｅｅｎ ８０を添加した無血清培地である。
ＳＴＫ０培地の組成を表２に示す。本実施例で用いたＳＴＫ０培地は、表２に記載の各成分を、α−ＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１＝１：１に、最終濃度が表２中の「Optimum Concentration」となるように添加したものである。
表２中、「Source」は、表２に示す各物質の入手先および型番を示す。「Effective concentration」は、ＳＴＫ０培地を構成する各物質の、ＳＴＫ０培地における最終濃度の許容範囲を示す。脂質濃縮物（ＣＤ）については、「１／１０００〜１／１０」と記載されているが、これは、体積比でＳＴＫ０培地の１／１０００量以上１／１０量以下の脂質濃縮物の原液を添加することを意味する。尚、界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、Ｔｗｅｅｎ ８０は、脂質濃縮物中に含まれている。「Optimum Concentration」は、ＳＴＫ０培地を構成する各物質の好適な使用量を表している。
＜骨芽細胞への分化の評価＞
本発明の実施例において、骨芽細胞への分化の評価は、分化誘導後の細胞をアリザリンレッド（Ｗａｋｏ製、型番：０１１−０１１９２）で染色することによって行った。アリザリンレッドの染色方法は、その取り扱い説明書の方法に従って行った。
また、本明細書中において、骨芽細胞への分化度を、アリザリンレッドの染色性から判断して、「軽度」、「中度」および「強度」と評価した。
上記「軽度」の分化とは、アリザリンレッドによる弱い染色が目視により確認できる段階である。例えば、図１の「無血清骨分化誘導培地Ｂ＋ＰＤＧＦ」のウェルの写真に表される程度の染色性を示した場合を「軽度」の分化と判断した。
また、上記「中度」の分化とは、アリザリンレッドによる中程度の染色が目視で確認できる段階である。例えば、図１の「無血清骨分化誘導培地Ｂ＋ＦＧＦ」のウェルの写真に表される程度の染色性を示した場合を「中度」の分化と判断した。
さらに、上記「強度」の分化とは、２４穴マイクロプレートのウェルの全面に、アリザリンレッドの強い染色が目視で確認できる段階である。例えば、図１の「無血清骨分化誘導培地Ｂ＋ＥＧＦ」のウェルの写真に表される程度の染色性を示した場合を「強度」の分化と判断した。
〔実施例１：間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の検討（１）〕
間葉系幹細胞としては、ヒト腸骨骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より購入）３株（以下、Ａ株、Ｂ株、Ｃ株と表記する）を用いた。尚、Ａ株は、５回継代したものを用い、Ｂ株およびＣ株は、４回継代したものを用いた。上記間葉系幹細胞の培養は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用い、培地を入れた６穴マイクロプレートに、上記間葉系幹細胞を５０００個／ｃｍ２の密度で播種した。細胞培養期間中、培地は２日または３日毎に交換した。
なお、上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地とは、基礎培地としてのＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ製：Ｄ−６０４６）／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ製：Ｍ−６７７０）＝１：１にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を最終濃度が１０重量％となるように添加して調製した培地である。
細胞がコンフルエント状態になる前に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％トリプシンおよび０．２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中にて２分間インキュベートすることにより、プレートから剥離し、血清を含有しない植物由来のTrypsin inhibitor（Ｓｉｇｍａ製：Ｔ６５２２）とともに再懸濁させた。
続いて、無血清ＤＭＥＭ培地で上記細胞を３回洗浄し、２４穴マイクロプレートに上記細胞を１００００細胞／ｃｍ２の密度となるように、１細胞株につき、１条件あたり２穴（ｎ＝２）に播種した。上記細胞は、無血清のＳＴＫ２培地中で、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて３７℃でコンフルエント状態になるまで培養した。
培養４日目に、細胞が底面に接着した状態の２４穴マイクロプレートを、無血清ＤＭＥＭ培地を用いて２回洗浄し、表３に示す各培養培地中で、３日間、７日間、１４日間、または２１日間培養した。分化誘導期間中、培地は２日ないし３日毎に新しい同一の培地に交換した。表３に示す各培養培地中で分化培養を開始してから３日目または７日目に、上記細胞をアリザリンレッドで染色することによって骨芽細胞への分化の評価を行った。
ここで、表３に示した実施例１において用いた骨分化誘導用培地について説明する。表３中、「１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ」は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地である。上記「１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ」は、コントロール培地として用いた。尚、「１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地」は、α−ＭＥＭに、ＦＢＳを最終濃度１０重量％、デキサメタゾンを最終濃度１００ｎＭ、β−グリセロリン酸を最終濃度１０ｍＭ、およびＬ−アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩を最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように添加して調製した培地であり、特許文献１で用いられている従来公知の骨分化誘導培地と同じである。
「無血清骨分化誘導培地：Ａ」は、無血清培地であるＳＴＫ０培地にβ−グリセロリン酸を最終濃度１０ｍＭとなるように添加した培地である。「Ａ−（ＦＧＦ‐２）」とは、無血清骨分化誘導培地：ＡからＦＧＦ−２を除去した培地である。尚、本明細書中において、例えば、無血清骨分化誘導培地：ＡからのＦＧＦ−２の除去は、無血清骨分化誘導培地：Ａを作製する際にＦＧＦ−２のみを添加しないことによって行うことができる。以下「無血清骨分化誘導培地：ＡからＴＧＦ−β３を除去した」等についても同様である。「Ａ−（ＴＧＦ−β３）」とは、無血清骨分化誘導培地：ＡからＴＧＦ−β３を除去した培地である。「Ａ−ＨＧＦ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＡからＨＧＦを除去した培地である。「Ａ−ＥＧＦ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＡからＥＧＦを除去した培地である。「Ａ−（ＰＤＧＦ‐ＢＢ）」とは、無血清骨分化誘導培地：ＡからＰＤＧＦ‐ＢＢを除去した培地である。
「無血清骨分化誘導培地：Ｂ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＡからＦＧＦ‐２、ＴＧＦ−β３、ＨＧＦ、ＥＧＦ、およびＰＤＧＦ‐ＢＢを除去した培地である。「Ｂ＋ＥＧＦ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦを最終濃度が２０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地である。「Ｂ＋（ＦＧＦ‐２）」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＦＧＦ‐２を最終濃度が１ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地である。「Ｂ＋（ＴＧＦ−β３）」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＴＧＦ−β３を最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地である。「Ｂ＋ＨＧＦ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＨＧＦを最終濃度が５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地である。「Ｂ＋（ＰＤＧＦ‐ＢＢ）」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＰＤＧＦ‐ＢＢを最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地である。
結果を表３、および図１〜３に示した。図１は、上記「１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地」、すなわち従来公知の１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地と、無血清骨分化誘導培地：Ｂとを用いた場合の、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導を確認した結果を示す図である。結果は３連で示してあるが、左からＡ株、Ｂ株、Ｃ株の結果を示している。図２は、増殖因子が間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導に与える影響について検討した結果を示す図である。図３は、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用い、ＥＧＦが間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導に与える影響について検討した結果を示す図である。
表３に示すように、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いた場合、７日間培養後も骨芽細胞への分化は見られなかった。また、図１に示すように、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用いた場合、培養７日目までは未分化であったが、１４日目に、骨芽細胞に特徴的な石灰化を示すアリザリンレッドによる染色性を示し、カルシウムの沈着が観察されるようになった。さらに２１日目まで培養すると、カルシウムの沈着が顕著となった。
一方、図１に示す無血清骨分化誘導培地：Ｂとは、表３に示す無血清骨分化誘導培地：Ｂのことであり、ＳＴＫ０培地に１０ｍＭのβ−グリセロリン酸を添加した培地からＥＧＦ、ＴＧＦ−β３、ＨＧＦ、ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦ−ＢＢを除いたものである。図１において、例えば「無血清骨分化誘導培地：Ｂ＋ＥＧＦ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦを最終濃度２０ｎｇ／ｍｌとなるように加えたものである。以下「無血清骨分化誘導培地：Ｂ＋ＦＧＦ」等についても同様である。
図１、表３に示すように、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦを添加した培地を用いた場合、３日目で中程度の分化が見られ、７日目で、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用いた場合の２１日目よりもはるかに分化誘導が進んでいることが確認された。無血清骨分化誘導培地：Ｂは、上述のように、ＳＴＫ０培地に１０ｍＭのβ−グリセロリン酸を添加した培地からＥＧＦ、ＴＧＦ−β３、ＨＧＦ、ＦＧＦ−２およびＰＤＧＦ−ＢＢを除いたものである。つまり、基礎培地（ＭＣＤＢとα−ＭＥＭ）とを１：１の比率で混合した培地）にデキサメタゾン、Ｌ−アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩、β−グリセロリン酸、脂肪酸（リノール酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、およびステアリン酸）、リン脂質（フォスファチジン酸およびフォスファチジルコリン）、コレステロール、酸化防止剤ＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）、界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８およびＴｗｅｅｎ ８０などを含有させた培地である。ここに、さらにＥＧＦを添加することによって、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用いた場合よりも非常に短期間で、強く骨芽細胞への分化誘導を促進できることが明らかとなった。
また、図１、表３に示すように、無血清骨分化誘導培地：ＢにＦＧＦ−２を加えた場合は、３日目には間葉系幹細胞は未分化であったが、７日目には中程度の骨芽細胞への分化が見られ、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用いた場合の２１日目よりもはるかに分化誘導が進んでいることが確認された。さらに、無血清骨分化誘導培地：ＢにＰＤＧＦ−ＢＢを加えた場合は、３日目には未分化であったが、７日目には軽度の分化が見られ、当該分化は、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用いた場合の１４日目よりも顕著であった。
図２において、例えば「無血清骨分化誘導培地：Ｂ＋ＥＧＦ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦを最終濃度２０ｎｇ／ｍｌになるように加えたものを意味する。図２において例えば「無血清骨分化誘導培地：Ａ−（ＦＧＦ−２）」とあるのは無血清骨分化誘導培地：ＡからＦＧＦ−２を除いた培地を意味する。図２における培養期間は７日間である。図２、表３に示すように、無血清骨分化誘導培地：Ａを用いた場合、そこからＴＧＦ−β３を除いた培地を用いた場合のみ、分化が見られた。また、無血清骨分化誘導培地：ＢにＴＧＦ−β３を加えた場合は分化が見られなかった。よって、増殖因子には、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦ−ＢＢのように間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させるために好適なものと、ＴＧＦ−β３のように不適当なものがあることが分かった。
なお、図２におけるウェルの写真のうち、「コントロール」と表示した左の列はβ−グリセロリン酸を含まない試験区であり、右の列はβ−グリセロリン酸を最終濃度１０ｍＭで含む試験区である。
図３は、１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地にＥＧＦを添加することによって骨芽細胞への分化が促進されることを示しているが、培養１４日目であっても、分化の程度は図１に示す無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦを添加した試験区よりも劣っていた。
〔実施例２：間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の検討（２）〕
間葉系幹細胞としては、ヒト腸骨骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より購入）５株（以下、Ｆ株、Ｇ株、Ｈ株、Ｉ株、Ｊ株と表記する）を用いた。尚、Ｆ株、Ｈ株、およびＩ株は、５回継代したものを用い、Ｇ株およびＪ株は、４回継代したものを用いた。上記間葉系幹細胞の増殖培養には、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用い、培地を入れた６穴マイクロプレートに、上記間葉系幹細胞を５０００個／ｃｍ２の密度で播種した。細胞培養期間中、培地は２日または３日毎に交換した。
間葉系幹細胞がコンフルエント状態になる前に、実施例１と同様の方法で、６穴マイクロプレートから間葉系幹細胞を回収した。続いて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で上記細胞を３回洗浄し、２４穴マイクロプレートに上記細胞を１００００個／ｃｍ２の密度となるように、１細胞株につき、１条件あたり２穴（ｎ＝２）に播種した。上記細胞は、上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で、コンフルエント状態になるまで培養した。
培養４日目に、細胞が接着した状態の２４穴マイクロプレートを、無血清ＤＭＥＭ培地を用いて２回洗浄し、表４に示す各培養培地中で、７日間、１４日間、または２１日間培養した。分化誘導期間中、培地は２日ないし３日毎に新しい同一の培地に交換した。表４に示す各培養培地中で分化培養を開始してから７日目、１４日目、または２１日目に、上記細胞をアリザリンレッドで染色することによって骨芽細胞への分化の評価を行った。
ここで、表４に示した実施例２において用いた骨分化誘導用培地について説明する。表４中、「１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地」は、実施例１で用いられた「１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地」と同じである。また、「１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地（α：Ｍ＝１：１）」は、実施例１で用いられた「１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地」の基礎培地をα−ＭＥＭからα-ＭＥＭとＭＣＤＢ２０１とを１：１の比率で混合したものに変えた以外は、実施例１で用いられた「１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地」と同じである。
「無血清骨分化誘導培地：Ｂ」とは、実施例１で用いた「無血清骨分化誘導培地：Ｂ」と同じである。また、「Ｂ＋ＥＧＦ」、「Ｂ＋（ＦＧＦ‐２）」、「Ｂ＋（ＴＧＦ−β３）」、「Ｂ＋ＨＧＦ」、および「Ｂ＋（ＰＤＧＦ‐ＢＢ）」についても、実施例１で用いた培地と同じである。
「無血清骨分化誘導培地：Ｃ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＢにＦＧＦ‐２およびＥＧＦを、それぞれ最終濃度が１ｎｇ／ｍｌおよび２０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地である。「Ｃ−Ｄｅｘ」とは、無血清骨分化誘導培地：Ｃからデキサメタゾンを除去した培地である。「Ｃ−ＶＣ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＣからＬ−アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩を除去した培地である。「Ｃ−（β−グリセロリン酸）」とは、無血清骨分化誘導培地：Ｃからβ-グリセロリン酸を除去した培地である。「Ｃ−ＰＡ−ＰＣ」とは、無血清骨分化誘導培地：Ｃからフォスファチジルコリンおよびフォスファチジン酸ナトリウム塩を除去した培地である。「Ｃ−ＣＤ」とは、無血清骨分化誘導培地：Ｃから脂質濃縮物を除去した培地である。「Ｃ−ＬｉＣｌ」とは、無血清骨分化誘導培地：ＣからＬｉＣｌを除去した培地である。「Ｃ−ＩＴＳ」とは、無血清骨分化誘導培地：Ｃからインスリン、トランスフェリンおよびセレネートを除去した培地である。「Ｃ−ＣＤ−ＬｉＣｌ」とは、無血清骨分化誘導培地：Ｃから脂質濃縮物およびＬｉＣｌを除去した培地である。「Ｃ−ＣＤ−ＬｉＣｌ−ＶＣ＋（ＰＤＧＦ−ＢＢ）」とは、無血清骨分化誘導培地：Ｃから脂質濃縮物、ＬｉＣｌ、およびＬ−アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩を除去し、且つＰＤＧＦ−ＢＢを最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地である。分化誘導後７日目の骨分化の結果を表４に、１４日目の骨分化の結果を表５に、２１日目の骨分化の結果を表６にそれぞれ示した。
表４〜６に示すように、１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地を用いた場合、実施例１で得られた結果と同様、培養７日目までは間葉系幹細胞は未分化であったが、１４日目には骨芽細胞への軽度の分化が見られ、さらに２１日目まで培養すると、さらに分化が進んだ。また、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地（Ｄ：Ｍ＝１：１）を用いた場合も、ほぼ同様の結果が得られた。
一方、無血清骨分化誘導培地：Ｂ、すなわちＳＴＫ０培地に１０ｍＭのβ−グリセロリン酸を添加した培地からＥＧＦ、ＴＧＦ−β３、ＨＧＦ、ＦＧＦ−２、およびＰＤＧＦ−ＢＢを除いたものを用いた場合、分化誘導後２１日目においても骨芽細胞の分化を確認することができなかった。よって、無血清条件下において骨分化誘導を行うには、何らかの増殖因子の添加が必須であることが明らかになった。
さらに、表４〜６中、培地４〜培地９を用いて分化誘導を行った結果から、いずれの増殖因子を添加することが必要であるか明らかになった。表６に示すように、無血清骨分化誘導培地：ＢにＴＧＦ−β３、またはＨＧＦを添加した場合は、分化誘導後２１日目においても骨芽細胞の分化を確認することができなかった。一方、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦまたはＰＤＧＦ−ＢＢをそれぞれ単独で添加した場合は、分化誘導後７日目には既に軽度の分化が確認され、当該分化は、１０％ＦＢＳ含有骨分化誘導培地を用いた場合の１４日目の結果よりも顕著に促進されていた。よって、増殖因子には、ＥＧＦおよびＰＤＧＦ−ＢＢのように、非常に効率よく間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることができるものと、ＴＧＦ−β３およびＨＧＦのように骨芽細胞の分化に不適当なものがあることが明らかになった。
また、無血清骨分化誘導培地：ＢにＦＧＦ−２を単独で添加した場合は、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦまたはＰＤＧＦ−ＢＢをそれぞれ単独で添加した場合と比較して、骨芽細胞の分化誘導効率が低く、Ｂ株においてのみ骨芽細胞への分化誘導が可能であった。しかしながら、無血清骨分化誘導培地：Ｃ、すなわち無血清骨分化誘導培地：ＢにＦＧＦ−２およびＥＧＦを添加した培地を用いた場合、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦを単独で添加した場合と比較して、Ｃ株における分化誘導効率が高くなることが明らかになった。よって、無血清骨分化誘導培地：ＢにＰＤＧＦ−ＢＢを単独で添加すること、無血清骨分化誘導培地：ＢにＥＧＦを単独で添加すること、または無血清骨分化誘導培地：ＢにＦＧＦ−２およびＥＧＦを組み合わせて添加することにより、無血清条件下で、非常に効率よく骨芽細胞への分化を誘導することができることが明らかになった。
さらに、表４〜６中、培地９〜培地１８を用いて分化誘導を行った結果から、無血清骨分化誘導培地：Ｃにおいて、増殖因子の他に、さらに骨芽細胞への分化誘導に必要であるその他の因子が明らかになった。表４に示すように、培地１１、培地１４〜培地１６を用いて分化誘導を行った場合、すなわちＬ−アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩、脂質濃縮物、ＩＴＳ、および塩化リチウムは、これらの因子のいずれかを培地に添加しない場合であっても、分化誘導後７日目には骨芽細胞への軽度の分化が確認された。さらに、培地１７および培地１８を用いて分化誘導を行った結果から、Ｌ−アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩、脂質濃縮物、ＩＴＳ、および塩化リチウムの複数の因子を培地に同時に添加しない場合であっても、分化誘導後7日目には骨芽細胞への軽度の分化が確認された。このことから、Ｌ−アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩、脂質濃縮物、ＩＴＳ、および塩化リチウムは、無血清条件下での骨芽細胞の分化誘導に必須とはいえないことが明らかになった。また、従来、ＩＴＳおよびアスコルビン酸は、骨芽細胞の分化誘導に必須の因子であると考えられていたが、実施例２の結果から、必ずしも必要ではないことが明らかになった。よって、本発明によれば、骨分化誘導用培地添加剤にＩＴＳおよびアスコルビン酸を添加しなくてもよい分、骨分化誘導用培地添加剤をより安価に提供することができる。
さらに、「Ｃ−ＣＤ」培地、すなわち無血清骨分化誘導培地：Ｃから脂質濃縮物を除去した培地を用いた場合に、無血清骨分化誘導培地：Ｃを用いた場合と比較して、骨芽細胞への分化が促進されることから、脂肪酸は骨芽細胞への分化に抑制的に働くことが明らかになった。
一方、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸に関しては、どちらか一方を除去すると骨芽細胞への分化が誘導されないことから、これら２つの因子は、無血清骨分化誘導培地に必須の因子であることが明らかになった。
さらに、「Ｃ−ＰＡ−ＰＣ」培地、すなわち無血清骨分化誘導培地：Ｃからリン脂質（フォスファチジルコリンおよびフォスファチジン酸塩）を除去した培地を用いた場合に、無血清骨分化誘導培地：Ｃを用いた場合と比較して、骨芽細胞への分化効率が低下することから、リン脂質を添加することにより、骨芽細胞への分化がより促進されることが明らかになった。
以上、図１〜３および表３〜６に示したように、好適な増殖因子および化合物を無血清培地に含有させることによって、間葉系幹細胞を、高濃度血清を用いて培養する場合よりも強く骨芽細胞へ分化誘導することができることが明らかとなった。
実施例の結果から、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β−グリセロリン酸とが少なくとも含まれている場合に、間葉系幹細胞を無血清条件下で骨芽細胞に分化誘導することができることが明らかになった。また、上記増殖因子、デキサメタゾン、およびβ−グリセロリン酸に加えて、少なくとも１つのリン脂質がさらに含まれている場合に、骨芽細胞への分化がより促進されることも明らかになった。このことから、基礎培地にＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β−グリセロリン酸とを添加剤として添加することにより、間葉系幹細胞を無血清条件下で骨芽細胞に分化誘導することができ、さらに少なくとも１つのリン脂質を添加剤として添加することにより、骨芽細胞への分化をより効率的に誘導することができるといえる。尚、表７に好ましい無血清培地の組成の例を示す。本明細書中では、表７に表した組成を有する無血清培地を、以後「ＳＴＫ３培地」と称する。
〔実施例３：間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の検討（３）〕
間葉系幹細胞としては、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より購入）３株（以下、Ｋ株、Ｌ株、Ｍ株と表記する）を用いた。尚、Ｋ株は、８回継代したものを用い、Ｌ株は、７回継代したものを用い、Ｍ株は、１０回継代したものを用いた。
（１．無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養を行った間葉系幹細胞の骨分化誘導）
上記間葉系幹細胞を、無血清のＳＴＫ２培地を用い、培地を入れた６穴マイクロプレートに、上記間葉系幹細胞を５０００個／ｃｍ２の密度で播種した。細胞培養期間中、培地は２日または３日毎に交換した。
細胞がコンフルエント状態になる前に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％トリプシンおよび０．２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中にて２分間インキュベートすることにより、プレートから剥離し、血清を含有しない植物由来のTrypsin inhibitor（Ｓｉｇｍａ製：Ｔ６５２２）とともに再懸濁させた。
続いて、無血清のＳＴＫ２培地で上記細胞を３回洗浄し、２４穴マイクロプレートに上記細胞を５０００細胞／ｃｍ２の密度となるように、１細胞株につき、１条件あたり３穴（ｎ＝３）に播種した。上記細胞は、無血清のＳＴＫ２培地中で、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて３７℃でコンフルエント状態になるまで培養した。
コンフルエント状態になった細胞が底面に接着した状態の２４穴マイクロプレートを、無血清ＤＭＥＭ培地を用いて２〜３回洗浄し、１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地または無血清骨分化誘導培地（ＳＴＫ３培地）を用いて分化培養した。尚、上記「１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地」は、実施例１で説明したようにα−ＭＥＭに、ＦＢＳを最終濃度１０重量％、デキサメタゾンを最終濃度１００ｎＭ、β−グリセロリン酸を最終濃度１０ｍＭ、およびＬ−アスコルビン酸２-リン酸セスキマグネシウム塩を最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように添加して調製した培地であり、特許文献１で用いられている従来公知の骨分化誘導培地と同じである。分化誘導期間中、培地は２日ないし３日毎に新しい同一の培地に交換した。各培養培地中で培養を開始してから４日目、７日目、１４日目、または２１日目に、上記細胞をアリザリンレッドで染色することによって骨芽細胞への分化の評価を行った。結果を図４および表８〜１１に示した。
（２．１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養を行った間葉系幹細胞の骨分化誘導）
上記間葉系幹細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用い、培地を入れた６穴マイクロプレートに、上記間葉系幹細胞を５０００個／ｃｍ２の密度で播種した。細胞培養期間中、培地は２日または３日毎に交換した。
細胞がコンフルエント状態になる前に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％トリプシンおよび０．２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中にて２分間インキュベートすることにより、プレートから剥離し、血清を含有しない植物由来のTrypsin inhibitor（Ｓｉｇｍａ製：Ｔ６５２２）とともに再懸濁させた。
続いて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で、２４穴マイクロプレートに上記細胞を５０００細胞／ｃｍ２の密度となるように、１細胞株につき、１条件あたり３穴（ｎ＝３）に播種した。上記細胞は、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベータ内にて３７℃でコンフルエント状態になるまで培養した。
コンフルエント状態になった細胞が底面に接着した状態の２４穴マイクロプレートを、無血清ＤＭＥＭ培地を用いて２〜３回洗浄し、１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地または無血清骨分化誘導培地（ＳＴＫ３培地）を用いて分化培養した。分化誘導期間中、培地は２日ないし３日毎に新しい同一の培地に交換した。培養培地中で培養を開始してから４日目、７日目、１４日目、または２１日目に、上記細胞をアリザリンレッドで染色することによって骨芽細胞への分化の評価を行った。結果を図４および表８〜１１に示した。
図４は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導の結果を示す図である。また、図４に示した分化誘導後４日目の骨分化の結果を表８に、分化誘導後７日目の骨分化の結果を表９に、１４日目の骨分化の結果を表１０に、２１日目の骨分化の結果を表１１にそれぞれ示した。図４および表８に示すように、骨分化誘導を開始してから４日目において、無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞では、すでに骨芽細胞への分化が始まっていることが確認された。
これに対して、ＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ従来法の１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞では、骨芽細胞への分化は確認されなかった。また、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞、および１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞では、いずれも骨芽細胞への分化は確認されなかった。
図４および表９に示すように、骨分化誘導を開始してから７日目において、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞、および無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞は、いずれも骨芽細胞に分化していることが確認された。
無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞の方が、やや強く骨芽細胞に分化していた。
これに対して、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞では、骨芽細胞への分化は確認されなかった。
図４および表１０に示すように、骨分化誘導を開始してから１４日目において、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞は、骨芽細胞に分化していることが確認された。
しかし、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞よりも、骨芽細胞への分化の程度が軽かった。
これに対して、無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞よりも骨芽細胞に強く分化していることが確認された。
図４および表１１に示すように、骨分化誘導を開始してから２１日目において、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞、および無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞は、いずれも骨芽細胞に強く分化していることが確認された。
これに対して、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養し、且つ１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞は、無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞よりも骨芽細胞への分化の程度が軽かった。
実施例３の結果から、従来法の１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地を用いた場合と比較して、無血清のＳＴＫ３培地を用いた場合は、間葉系幹細胞をより高い効率で、且つより早く骨芽細胞に分化させることができることが明らかになった。この結果から、無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養した間葉系幹細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて増殖培養を行った間葉系幹細胞よりも間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化能が高く維持されていることが明らかになった。
また、従来法の１０％ＦＢＳ−骨分化誘導培地を用いると、間葉系幹細胞が骨芽細胞へと分化するまでに２〜３週間を要する。これに対して、無血清のＳＴＫ２培地を用いて増殖培養し、且つ無血清のＳＴＫ３培地を用いて分化誘導を行った間葉系幹細胞は、分化誘導開始４日目において、既に骨芽細胞へと分化していることが確認された。これは、無血清のＳＴＫ２培地と無血清のＳＴＫ３培地とを組み合わせて用いることによって、相乗的に骨芽細胞への分化誘導が促進されていると考えられた。
本発明に係る幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で細胞に骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤を無血清培地に添加することにより、血清を含有する従来の分化誘導培地よりも強く、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を骨分化させることができる。したがって、上記分化誘導培地用添加剤は、再生医療などにおいて好適に利用できる。

Claims (14)

  1. ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦからなる群より選択される１以上の増殖因子と、デキサメタゾンと、β−グリセロリン酸とを少なくとも含有することを特徴とする、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための分化誘導培地用添加剤。
  2. 少なくとも１つのリン脂質をさらに含有することを特徴とする、請求項１に記載の分化誘導培地用添加剤。
  3. 上記リン脂質が、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、およびフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることを特徴とする、請求項２に記載の分化誘導培地用添加剤。
  4. 酸化防止剤をさらに含有することを特徴とする、請求項２に記載の分化誘導培地用添加剤。
  5. 上記酸化防止剤がＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であることを特徴とする、請求項４に記載の分化誘導培地用添加剤。
  6. 上記幹細胞が、間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の分化誘導培地用添加剤。
  7. 請求項１から５のいずれか１項に記載の分化誘導培地用添加剤を構成する成分および基礎培地を含有し、血清を含まないことを特徴とする、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養培地。
  8. 上記幹細胞が、間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項７に記載の培養培地。
  9. 請求項７に記載の培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を分化培養する工程を包含することを特徴とする、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するための培養方法。
  10. 上記幹細胞が、間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の培養方法。
  11. 請求項１から５のいずれか１項に記載の分化誘導培地用添加剤を構成する成分を備えていることを特徴とする、幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を無血清条件下で骨分化誘導するためのキット。
  12. 上記幹細胞が、間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
  13. 請求項７に記載の培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を分化培養する工程よりも前に、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＨＧＦからなる群より選択される少なくとも３つの増殖因子、並びに少なくとも１つのリン脂質を含有し、且つ血清を含まない培養培地中で幹細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞、胎盤、羊膜および線維芽細胞からなる群より選択される１種以上の細胞を増殖培養する前工程を包含することを特徴とする、請求項９または１０に記載の培養方法。
  14. 請求項９、１０または１３に記載の培養方法によって生産されたことを特徴とする骨芽細胞。
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