WO2006109830A1 - アミノ酸の製造法 - Google Patents

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Tsuyoshi Shimose
Ryou Ohashi
Katsumi Fujinaga
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an amino acid.
  • Non-Patent Document 1 Fermentative production methods using microorganisms belonging to the genus Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Microbacterium, Serratia, Bacillus and Syudomonas are well known as amino acid production methods.
  • the amino acid yield is low in the method in which both are directly separated based on the difference in particle diameter between the crystals and the cells. Therefore, in order to increase the yield of amino acids, the amino acid crystals accumulated in the culture solution are once dissolved, that is, after performing operations such as addition of water to the culture solution, heating of the culture solution, etc. After separating the cells and the culture solution using a filtration separator, etc., it must be concentrated and crystallized.
  • Patent Document 4 As a method for directly separating amino acid crystals and bacterial cells, a method using a liquid cyclone is known (Patent Document 4), but the recovery rate of amino acid crystals is only 80% or less. As described above, in the method for fermenting amino acids, the method of culturing while crystallization of amino acids in a medium is excellent, but a more efficient method is required.
  • Non-Patent Document 1 Amino Acid Fermentation, Academic Publishing Center, 1986
  • Patent Document 1 JP-A 62-288
  • Patent Document 2 JP 2002-238593 A
  • Patent Document 3 Japanese Patent No. 3239905
  • Patent Document 4 Japanese Patent No. 2958789
  • An object of the present invention is to provide a method for producing an amino acid that is simple and has high production efficiency.
  • the present invention relates to the following (1) to (7).
  • a method for producing an amino acid comprising culturing a microorganism having the above, producing and accumulating crystals of the amino acid in the medium, and collecting the amino acid crystals from the culture.
  • a method for producing an amino acid comprising producing and accumulating a crystal of the amino acid in a medium, and collecting the crystal of the amino acid from a culture.
  • the method for collecting amino acids from the culture is characterized in that the microorganisms that produce amino acids and the crystals of accumulated amino acids are separated on the basis of the difference in their particle diameters. ) Any one way.
  • amino acid is L-glutamine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine, L-phenylalanine, L-tyrosine or L-tryptophan .
  • the present invention provides a simple and highly efficient production method of amino acids.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the average particle diameter, specific surface area, and total surface area of amino acid crystals to be added and the shape and recovery rate of amino acid crystals accumulated in a medium.
  • the vertical side is 1000 ⁇ m.
  • the microorganism used in the production method of the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism having the ability to produce amino acids.
  • the microorganism may be a microorganism isolated from nature, or artificially contains amino acids. Microorganisms with improved productivity may be used.
  • the microorganism having the ability to produce the above-mentioned amino acid is any microorganism as long as it is a microorganism to which the methods (a) to (e) can be applied or a microorganism having the above-described genetic character. More preferred are prokaryotes, more preferably bacteria.
  • Prokaryotes include Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corvnebacterium, Microbacterium, and Pseudomonas (Pseudomonas).
  • Genus Agronoku Genus Agrobacterium, Alicyclobacinolus, Anabena G1 ⁇ 4 abena, Anacvstis, Arthrobacter, Azotobacter, Chromatium , Genus Erwinia, genus Methvlobacterium, genus Phormidium, genus Rhodobacter, genus Rhodopseudomonas, genus Rhodo soirillum , Microorganisms belonging to the genus Scenedesmus, the genus Strentomvces, the genus Svnechoccus, the genus Zvmomonas, such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis Bacillus megatenum
  • Rhodobacter ⁇ ⁇ ⁇ Rhodobacter capsulatus Rhodobacter sphaero
  • Rhodes Monas' Brushtica Rhodopseudomonas blastica
  • Rhodopseudomonas marina Rhodopseudomonas marma, Rhodopseudo monas palustns
  • Mouth spirium * Ribum Rhodosoirillum s alinarum, Streptomaces.
  • Ambonoaciens (Streptomvces ambofaciens), Streptomices aureofaciens, Streptomyces, rep Streptomvc es fungicidicus, Streptomaces griseochrom ogenes, Streptomys griseus, Streptomvces griseus, Streptomvces lividans, Streptomvces lividans Seth 'Olyvogriseus (Streptomvces olivogriseus), Streptomyces fumeus (Streptomvces rameus), Streptomyces' Streptomvces tanashiensis, Streptomyces' Streptomes (Strepto mvces vinaceus), mobil Zym mobilis ym.
  • Preferable prokaryotes include Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibateri Bacteria belonging to the genus Rum, Corynebacterium, Syudomonas or Streptomyces, such as Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibaterium, Corynebacterium, Syudomonas or Streptomyces Species belonging to the genus Seth etc.
  • bacteria Escherichia coli, Corynebacterium gnoletamicum, Corynebata trum 'Ammoniagenes, Corynebatarum' Ratatofamentum, Corynebacterium ' Flavam, Corynebaterium 'Ehucasis, Brevibaterium' Flavam, Brevibaterium, Ratatofumentumum, Bacillus 'Sacils, Bacillus' Megatium, Serratia 'Manorescens', 'Pudida' Nosa, Streptomyces' sericolor or Streptomyces' lividans can be mentioned, particularly preferably Escherichia coli, Corynebatarum 'Gnoretamicum, Brevibaterumum ammoniagenes, more specifically L-gnoretamine.
  • FERM P-4806, ATCC14751 and ATCC14752 which have the ability to produce L-valine, such as ATCC13005 and ATCC19561, which have the ability to produce L-valine, FERM BP-4704 and ATCC21302, etc.
  • L-tryptophan such as FERM BP-3757 and ATCC14310, which have the ability to produce, such as ATCC 13281 and ATCC21669, which have the ability to produce L-phenylalanine, and ATCC21652, which has the ability to produce L-tyrosine DSM10118, DSM10121, DSM10123 and Or the like
  • FERM BP-1777 Such as FERM P-4806, ATCC14751 and ATCC14752, which have the ability to produce L-valine, such as ATCC13005 and ATCC19561, which have the ability to produce L-valine, FERM BP-4704 and ATCC21302, etc.
  • L-tryptophan such as FERM BP-
  • the strain represented by the above FERM number is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary (Japan), and the strain represented by the ATCC number is the American Type Culture Collection (US), DSM number.
  • the strains represented can be obtained from Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Germany), respectively.
  • the method for producing an amino acid of the present invention (1) after adding an amino acid crystal having an average particle diameter of 1 to 120 ⁇ m to a medium so that the crystal concentration of the amino acid is 0.5 g / l or more, Culturing a microorganism capable of producing the amino acid (1) in the medium, generating and accumulating the amino acid crystals in the medium, and collecting the amino acid crystals from the culture; And (2) the total surface area of the amino acid crystals in the medium is 0.02. After adding amino acid crystals to the medium so as to be m 2 / l or more, microorganisms having the ability to produce the amino acid of 1 above are cultured in the medium, and the amino acid crystals are produced in the medium. And a method for producing an amino acid characterized by accumulating and collecting crystals of the amino acid from the culture.
  • the method of culturing the microorganism in the medium can be carried out according to a usual method used for culturing microorganisms, except that amino acid crystals are added.
  • the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism, and can be used to efficiently culture the microorganism, preferably a liquid medium, either a natural medium or a synthetic medium. Can also be used.
  • the carbon source may be glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolyzate, acetic acid, propionic acid, etc. as long as the microorganism can assimilate.
  • Alcohols such as organic acids, ethanol, and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogenous compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn. Steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermentation cells, digested products thereof, and the like can be used.
  • inorganic salt monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the amino acid crystals added by the production method of (1) above have an average particle size of:! To 120 ⁇ m, and are amino acid crystals that provide a medium having a crystal concentration of 0.5 g / l or more.
  • the average particle size, amount, amino acid type and crystal form type of amino acid crystals to be added is:! ⁇ 120 zm, preferably 2 ⁇ 110 ⁇ , more preferably 5 to 70 xm, still more preferably 7 to 50 ⁇ m, particularly preferably 10 to 35 ⁇ m, and most preferably 11 to 13 ⁇ m.
  • the amount of amino acid crystals is such that the amino acid crystal concentration in the medium after addition is 0.5 g / l or more. Above, preferably 2-30 g / l, more preferably 3-25 g / l, even more preferably 4-22 g / l, particularly preferably 5-20 g / l, most preferably 5.5-16.5 g / l Can be increased.
  • the combination of the above-mentioned average particle size and addition amount of the amino acid crystals to be added is not particularly limited as long as it is a combination having an average particle size of 1 to 120 xm and a medium having a crystal concentration of 0.5 gZl or more.
  • the average particle size is:!
  • the crystal concentration is 0.5 gZl or more, preferably the average particle size is 2 to l lO xm and the crystal concentration is 2 to 30 g / l, more preferably the average particle size A diameter of 5 to 70 ⁇ m and a crystal concentration of 3 to 25 g / l, more preferably an average particle size of 7 to 50 ⁇ m and a crystal concentration of 4 to 22 g / l, particularly preferably an average particle size of 10 to 35
  • Examples of the combination include a medium having a crystal concentration of 5 to 20 g / l at ⁇ m, most preferably an average particle diameter of 11 to 13 ⁇ m and a crystal concentration of 5.5 to 16.5 g / l.
  • the amino acid crystals are added to the medium either before the microorganism having the ability to produce amino acids is cultured in the medium or during the culture period after the microorganism having the ability to produce amino acids is cultured in the medium.
  • the amino acid crystals are precipitated in the medium from before and after the amino acid concentration in the medium reaches the saturation solubility, it is more preferable.
  • the amino acid concentration in the medium has reached saturation solubility, before the crystals of amino acids are precipitated in the medium, more preferably when the amino acid concentration in the medium is supersaturated, and the amino acid concentration in the medium is This can be done before the crystal is deposited.
  • the time when no amino acid crystals are observed in the culture medium is preferable. If it is within the range, a small amount of amino acid crystals may be precipitated.
  • the amount of amino acid crystals is 0.5 g / l or more as the amount relative to the amount of medium at the time of addition, Preferably 2 to 30 g / l, more preferably 3 to 25 g / l, still more preferably 4 to 22 g / l, particularly preferably 5 to 20 g / l, and most preferably 5.5 to 16.5 gZl. .
  • the average particle diameter is 1 as a combination of the average particle diameter and the amount of the amino acid crystal to be added.
  • ⁇ 120 xm of crystals as an amount with respect to the amount of medium at the time of adding 0.5 gZl or more, preferably 2 to 30 gZl as an amount with respect to the amount of medium at the time of adding an average particle diameter of 2 to ⁇ ⁇ m, More preferably, the amount of crystals having an average particle size of 5 to 70 am is 3 to 25 gZl relative to the amount of medium when added, and more preferably the amount of crystals having an average particle size of 7 to 50 ⁇ m is based on the amount of medium when added.
  • amino acid crystals added by the production method of (2) above are added if they are amino acid crystals such that the total surface area of the amino acid crystals in the culture medium is 0 ⁇ 02 m 2 / l or more. There are no restrictions on the average particle size, amount, type of amino acid, and type of crystal form of amino acid crystals.
  • the total surface area of the amino acid crystals in the medium after addition is 0.02 m 2 / l or more, preferably 0.08 to 70 m 2 / l, more preferably 0.2 to 23 m 2 / l, still more preferably 0.4 to: 15 m 2 / l, particularly preferably 0.7 to 9.3 m 2
  • a crystal of an amino acid that is / l, most preferably 2.0 to 7.0 m 2 / l can be mentioned.
  • Specific amino acid crystals added by the production method of (2) above have an average particle diameter of 1 to: 120 xm and a crystal concentration of 0.5 g / l or more, preferably an average particle diameter of 2 to : Crystal concentration of 110 / m at 2-30 g / l, more preferably average particle size of 5-70 ⁇ m and crystal concentration of 3-25 gZl, more preferably average particle size of 7-50 xm Of 4 to 22 g / l, particularly preferably an average particle size of 10 to 35 xm and a crystal concentration of 5 to 20 g / l, most preferably an average particle size of 11 to 13 zm and a crystal concentration of 5.5 to 16 Ability to raise crystals of amino acids to give 5g / l of medium.
  • the amino acid crystals When amino acid crystals are added when the amino acid concentration in the medium is supersaturated, the amino acid crystals should have a total surface area of 0.02 ml or more, preferably calculated from the amount of medium at the time of addition. is 0. 08 ⁇ 70m 2 Zl, more preferably 0. 2 ⁇ 23m 2 / l, more preferably 0. 4 ⁇ :. 15m 2 / l , particularly preferably 0. 7 ⁇ 9 3m 2 / l, most preferably Can give crystals of amino acids of 2.0 to 7. OmVl. [0025] As specific crystals of the amino acid, the average particle size is:! To 120 ⁇ m, and the amount of the medium is 0.5 gZl or more, preferably the average particle size is 2 to 1 10 ⁇ m.
  • the method for measuring the amount of the medium in the culture may be a known method, but for example, by centrifuging the culture, the insoluble medium and the microbial cells are insoluble. Separating substances, measuring the volume of sedimented insoluble matter, and subtracting the amount of culture, etc.
  • the amino acid crystals to be added are amino acid crystals having an average specific surface area of 0.06 m 2 / cm 3 or more, preferably from 0.07 to 7.2 m 2 / cm 3 , more preferably 0 ⁇ 07 ⁇ : 1.43m 2 / cm 3 , still more preferably 0.:! ⁇ 1.0m 2 / cm 3 , particularly preferably 0 ⁇ 14 ⁇ 0.72m 2 / cm 3
  • amino acid crystals can be mentioned.
  • any amino acid can be used as long as it can be produced by a microorganism, but preferably L-glutamine, L-valine. , L-leucine, L-isoleucine, L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan, more preferably L-gnoretamine, L-parin and L-leucine, more preferably L -I can give you gnoretamine.
  • L-phenylalanine a crystal may be excluded from the amino acid crystal added by the production method of the present invention.
  • the medium-added amino acid crystal used in the present invention is a commercially available product or a known method, for example, an amino acid crystal obtained by a fermentation production method and a purification method, or a commercially available amino acid crystal or the above-mentioned crystals.
  • Amino acid crystals obtained by a known method can be obtained from commercially available crushers such as M4 type free crusher (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), Atomizer TAP-20 type (manufactured by Tokyo Atomizer 1 Manufacturing), Air Classifying Mill ( HOSOKAWA MICRON PO It can also be obtained by preparing a crystal of an amino acid having a target average particle size using WDER SYSTEMS).
  • an amino acid crystal having an average particle size of about 110 ⁇ m obtained by a known fermentation production method and purification method is screened using an M4 type free pulverizer with a screen of ⁇ 1. Omm, a rotation speed of 4500 rpm, By grinding at a processing speed of about 400 kG / h, an amino acid crystal having an average particle diameter of about 45 xm can be obtained, and the amino acid crystal is further screen ⁇ 0.3 mm, rotation speed 6000 rpm, By grinding at a processing speed of about 200 kG / h, amino acid crystals with an average particle size of about 11 ⁇ m can be obtained.
  • the specific surface area of the amino acid crystal is measured using a commercially available measuring machine such as SK manufactured by Seishin Enterprise Co., Ltd.
  • LASER MICRON SIZER LMS-24 laser diffraction, scattering type particle size distribution analyzer
  • LASER MICRON SIZER LMS-24 laser diffraction, scattering type particle size distribution analyzer
  • the total surface area of amino acid crystals can be calculated from the specific surface area of amino acid crystals and the amount added.
  • the culture is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is 15-40 ° C.
  • the culture time is usually 5-7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the medium as needed during culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer For example, when cultivating a microorganism transformed with an expression vector using a promoter, use isopropyl-1- ⁇ _D_thiogalatatopyranoside, etc.
  • Acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • the amino acid accumulated in the medium by the above method may be any amino acid as long as it is an amino acid that can be produced by a microorganism.
  • L-glutamine, L-valine, L- Examples include amino acids selected from leucine, L-isoleucine, L-phenenolealanine, L-tyrosine and L-tryptophan, more preferably L-glutamine, L-parin and L-leucine. be able to.
  • the amino acid crystals accumulated in the medium by the above method have an average particle size of 15 ⁇ m or more, preferably 20 zm or more, more preferably 30 zm or more, and even more preferably 40 zm or more, particularly Crystals of preferably 50 zm or more, most preferably 60 xm or more can be mentioned.
  • any method may be used as long as it is a normal amino acid purification method.
  • the cells and amino acids in the culture after completion of the culture are used.
  • a method of separating and purifying amino acid crystals directly using the difference in particle diameter and specific gravity of these crystals can be mentioned.
  • Examples of methods for separating and purifying amino acid crystals using the difference in particle diameter and specific gravity described above include conventionally known methods such as gravity classification and centrifugal classification. More preferably, among the centrifugal force classification and separation method, and among the centrifugal force classification and separation method, a decanter type centrifugal separation method is more preferable.
  • Corynebaterum glutamicum ATCC14752 was added to the production medium [250 g / L glucose, 30 g NH Cl, 1.0 g / L K ⁇ , 1.0 g / L ⁇ 0.5, 0.5 g / L MgSO 7 ⁇ 0, 20 mg / L FeSO
  • the cells were cultured while adjusting pH and culture temperature as appropriate. After the start of the culture, after the concentration of L-glutamine in the medium has reached its saturation solubility, before the L-gnoretamine crystals are precipitated in the medium, L-daltami with an average particle size of 40 / im was added to the medium so that the crystal concentration was 16.5 g / l. Thereafter, the culture was continued, and the culture was continued while growing L-glutamine crystals in the medium. By terminating the culture in about 96 hours from the start of the culture, 210 L of a culture containing 90 g / l L-gnoretamine was obtained.
  • L-gnoretamine crystals were obtained by culturing in the same manner as in Example 1 except that crystals of L dartamine having an average particle size of the particle size shown in FIG.
  • the specific surface area of the L-glutamine crystals was measured using SK LASER MICRON SIZER LMS — 24 (laser diffraction 'scattering type particle size distribution measuring device) manufactured by Seishin Enterprise Co., Ltd.
  • the calculations were made assuming that the crystals were spherical and similar.
  • Fig. 1 shows the crystals of L_glutamine added, the shape of L_glutamine crystals obtained by fermentation, the recovery rate of L-glutamine crystals, the dry matter content, and the like.
  • the degree of hypersaturation of the amino acids in the medium is kept below a certain level.
  • an appropriate number of amino acid crystals as seed crystals are present in the medium, that is, by adjusting the average particle size and amount of the amino acid crystals added to the medium, or the total surface area of the crystals. Amino acid crystal particles precipitated on It was found that the diameter can be controlled, and as a result, amino acid crystals that can be easily separated from the bacterial cells and have a high recovery rate can be obtained.
  • an amino acid can be produced easily and efficiently.

Abstract

　本発明によれば、平均粒子径が１～１２０μｍのアミノ酸の結晶を該アミノ酸の結晶濃度が０．５ｇ／ｌ以上となるように培地に添加した後、該培地中で該アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培養し、該培地中に該アミノ酸の結晶を生成、蓄積させ、培養物中から該アミノ酸の結晶を採取することを特徴とするアミノ酸の製造方法、および培地中のアミノ酸の結晶の総表面積が０．０２ｍ２／ｌとなるようにアミノ酸の結晶を培地に添加した後、該培地中で該アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培養し、該培地中に該アミノ酸の結晶を生成、蓄積させ、培養物中から該アミノ酸の結晶を採取することを特徴とするアミノ酸の製造方法が提供される。

Description

明 細 書
アミノ酸の製造法
技術分野
[0001] 本発明は、アミノ酸の製造法に関する。
背景技術
[0002] アミノ酸の製造法としては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ェシエリヒア 属、ミクロバクテリウム属、セラチア属、バチルス属およびシユードモナス属に属する 微生物などを用いた発酵生産法がよく知られている（非特許文献 1)。
上記した発酵生産法においては、その生産効率を高めるための様々な技術が開発 されており、その 1つとして培地の温度および pHの調整、または界面活性剤を培養 液に添加することにより培養液中に L_アミノ酸を晶析せしめ、もって培養液中の L_ アミノ酸の濃度を一定量以下に維持させ、 L—アミノ酸の高濃度蓄積による生産性の 阻害を回避する方法が知られている（特許文献 1)。
[0003] また、比較的溶解度が低い L—グノレタミン酸 (L- Glu)を培地中に晶析させる方法と しては、 L-Gluが析出する条件に pHを調整した培地を用いる方法（特許文献 2)、培 養液中の L_フエ二ルァラニン (L-Phe)の濃度が飽和溶解度以上の条件下で該培 養液中に L-Pheのひ晶を添加するカ または該培養液の pHを 7. 8〜8. 3の範囲に 変更することにより培養液中に L-Pheのひ晶を析出させる方法（特許文献 3)も知られ ている。
[0004] し力 ながら、上記方法では培養液中には微細なアミノ酸の結晶も含まれるため、 結晶と菌体の粒子径の差に基づき直接両者を分離する方法ではアミノ酸の収率が 低ぐよってアミノ酸の収率をあげるためには、培養液中に蓄積したアミノ酸の結晶を 一旦溶解する、すなわち培養液への水等の添加、培養液の加熱等の操作を行った 後、遠心式または濾過式分離機などを用いて菌体と培養液を分離した後、濃縮晶析 しなければならない。
[0005] アミノ酸の結晶と菌体を直接分離する方法としては、液体サイクロンを用いる方法（ 特許文献 4)が知られているが、アミノ酸の結晶の回収率は 80%以下にすぎない。 以上のように、アミノ酸の発酵生産法において、アミノ酸を培地中に晶析させながら 培養する方法は優れているが、さらなる効率の良い方法が求められている。
非特許文献 1 :アミノ酸発酵、学会出版センター、 1986年
特許文献 1 :特開昭 62— 288号公報
特許文献 2：特開 2002— 238593号公報
特許文献 3：特許第 3239905号公報
特許文献 4：特許第 2958789号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の目的は、簡便で生産効率が高いアミノ酸の製造法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明は、以下の（1)〜（7)に関する。
(1)平均粒子径が 1〜： 120 / mのアミノ酸の結晶を該アミノ酸の結晶濃度が 0. 5g/l 以上となるように培地に添加した後、該培地中で該アミノ酸を生産する能力を有する 微生物を培養し、該培地中に該アミノ酸の結晶を生成、蓄積させ、培養物中から該ァ ミノ酸の結晶を採取することを特徴とするアミノ酸の製造方法。
(2)培地中のアミノ酸の結晶の総表面積が 0. 02m2Zlとなるようにアミノ酸の結晶を 培地に添加した後、該培地中で該アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培養し 、該培地中に該アミノ酸の結晶を生成、蓄積させ、培養物中から該アミノ酸の結晶を 採取することを特徴とするアミノ酸の製造方法。
(3)添加するアミノ酸の結晶が 0. 06m2/cm3以上の比表面積を有するアミノ酸の結 晶である、上記（1)または（2)の方法。
(4)生成、蓄積させるアミノ酸の結晶の平均粒子径が 15 μ m以上である上記（1)〜（ 3)のいずれか 1つの方法。
(5)培養物中からアミノ酸を採取する方法がアミノ酸を生産する微生物と蓄積させた アミノ酸の結晶を、それらの粒子径の差に基づいて分離することを特徴とする上記（1 )〜（4)のいずれか 1つの方法。
(6)培養物中からアミノ酸を採取する方法がアミノ酸を生産する微生物と蓄積させた アミノ酸の結晶を、それらの比重の差に基づいて分離することを特徴とする上記（1) 〜（4)のいずれか 1つの方法。
(7) アミノ酸が L—グルタミン、 L—バリン、 L—ロイシン、 L—イソロイシン、 L—フエ二 ルァラニン、 L—チロシンまたは L—トリプトファンである上記（1 )〜（6)のいずれか 1 つの方法。
発明の効果
[0008] 本発明により、簡便で生産効率の高いアミノ酸の製造法が提供される。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]図 1は、添加するアミノ酸の結晶の平均粒子径、比表面積、および総表面積と 培地に蓄積するアミノ酸の結晶の形状および回収率との関係を示す図である。なお 、図中の写真は、縦方向の辺が 1000 x mである。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 1.本発明の製造方法に用いられる微生物
本発明の製造方法に用いられる微生物は、アミノ酸を生産する能力を有する微生 物であれば特に制限はなぐ該微生物は自然から分離された微生物であってもよい し、また人為的にアミノ酸の生産性が改善された微生物であってもよい。
人為的にアミノ酸の生産性が改善された微生物とは、
(a)アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも 1つを緩和または解除する方法、
(b)アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも 1つを発現強化する方法、
(c)アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも 1つのコピー数を増加させ る方法、
(d)アミノ酸の生合成経路力 該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少 なくとも 1つを弱化または遮断する方法、および
(e)野生型株に比べ、アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する 方法、
などの方法を単独または組み合わせて用いて取得される微生物をあげることができる [0011] 上記（a)の具体的な方法は、 Agric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、 J. Bacteriol., 110, 761-763(1972)および AppL Microbiol. BiotechnoL , 39, 318-323(1993)など、上 記（b)の具体的な方法は、 Agric. Biol. Chem., 43, 105- 111(1979)および J. Bacteriol. , 110, 761-763(1972)など、上記（c)の具体的な方法は、 Appl. Microbiol. BiotechnoL , 39, 318-323(1993)および Agric. Biol. Chem., 39, 371-377(1987)など、上記（d)の 具体的な方法は、 Appl. Environ. MicribioL , 38, 181-190(1979)および Agric. Biol. C hem. , 42, 1773-1778(1978)など、上記（e)の具体的な方法は、 Agric. Biol. Chem., 3 6, 1675-1684(1972)、 Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1977)、 Agric. Biol. Chem., 37 , 2013-2023(1973)および Agri Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)などに記載されて いる。
[0012] さらに上記（a)〜（e)のいずれ力または組み合わせた方法によるアミノ酸を生成、蓄 積する能力を有する微生物の調製方法については、 Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (Vし H Verlagsgesellschaft mbH, Weinneim, 1996) s ection 14a, 14bや Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1-35 (20 03)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田 浩ら（1986)に多くの例が記載されてお り、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製 方法は、特開 2003-164297、 Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、 Agric. Biol. C hem. , 39, 1149-1153(1975)、特開昭 58- 13599、 J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283 (1958)、特開昭 63-94985、 Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、 W097/15673、 特開昭 56-18596、特開昭 56-144092および特表 2003-511086など数多くの報告があ り、上記文献等を参照することによりアミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製 すること力 Sできる。
[0013] 上記したアミノ酸を生産する能力を有する微生物としては、上記（a)〜（e)の方法が 適用することができる微生物または上記遺伝的形質を有する微生物であればいずれ の微生物であってもよぐ好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあげることができ る。
原核生物としては、ェシエリヒア（Escherichia)属、セラチア（Serratia)属、バチルス 属、ブレビバタテリゥム（Brevibacterium)属、コリネバタテリゥム（Corvnebacterium)属 、ミクロバタテリゥム属 (Microbacterium)、シユードモナス (Pseudomonas)属、ァグロノく クテリゥム (Agrobacterium)属、アリシクロバチノレス属 (Alicvclobacillus)、アナべナ G¼ abena)属、アナシステイス（Anacvstis)属、ァスロバクタ一（Arthrobacter)属、ァゾトバ クタ一 (Azotobacter)属、クロマチゥム (Chromatium)属、エノレビユア (Erwinia)属、メチ ロノ クテリウム (Methvlobacterium)属、フオノレミディウム（Phormidium)属、口ドノくクタ一 (Rhodobacter)属、ロドシユードモナス (Rhodopseudomonas)属、ロドスピリゥム（Rhodo soirillum)属、セネデスムス（Scenedesmus)属、ストレプトマイセス（Strentomvces)属、 シネコッカス（Svnechoccus)属、ザィモモナス（Zvmomonas)属等に属する微生物、例 えば、ェシエリヒア'コリ、バチルス ·サチリス（Bacillus subtilis)、バチルス 'メガテリゥム (Bacillus megatenum)、ノヽチノレス'ダ ロリケファシエンス (Bacillus amvlohquefaciens) 、バチルス 'コアギュランス (Bacillus coagulans)、バチルス ·リケニフォルミス (Bacillus 1 icheniformis)、バチルス *プミノレス（Bacillus pumilus)、ブレビバタテリゥム'アンモニア ケ不ス (Brevibacterium ammoniagenes)、フレビノくクテリゥム'イマリオフイノレム (Brevib actenum immariophilumj、ブレヒノヽクァリウム .サッカロリアイカム (Brevibacterium sac charolvticum)、ブレビバタテリゥム ·フラバム（Brevibacterium flavum)、ブレビバタテリ ゥム ·ラタトフアーメンタム（Brevibacterium lactofermentum)、コリネバタテリゥム 'グノレタ ミカム (Corvnebacterium glutamic醒)、コリネバタテリゥム 'ァセトァシドフイノレム (Cory nebacterium acetoaciaophilum)、 クロノくクァリ1ノム · ,ンモニアクイノレム ( icrobacten 醒 ammoniaphilum)、セラチア'フイカリア（Serratia ficaria)、セラチア'フォンチコラ erratia fonticola)、セラチア .リケファシエンス (Serratia liquefaciens)、セラチア .マノレ ~gッセンス err at ia marcescensj、ンュ1 ~トモナス'ェノレキノ1 ~サ (Pseudomonas aerug inosa)、シユードモナス ·プチダ（Pseudomonas putida)、ァグロバタテリゥム 'ラジオバ クタ1 ~ ί, Agrobacterium radiobacterj、ァグロノ グァリゥム ·リン、ノーンズ (Agrobacterium rhizogenes)、ァグロバタテリゥム 'ノレビ（Agrobacterium rubi)、アナべナ'シリンドリカ ( Anabaena cvlin rica)、アナべナ ·ドリ才ノレム Anabaenadoliolum)、アナべナ ·フロスァ クノ (Anabaena flos-aquaej、 ) ~スロノヽクタ1 ~ ·ォ1 ~レツセンス (Arthroり acter auresce π )、アースロバクタ一 ·シトレウス（Arthrobacter citreus)、アースロバクタ一'グロブフ オノレミス (Arthrobacter globformis)、アースロバクタ一 ·ヒドロカーボグノレタミカス (Arthr obacter hydrocarboglutamicus)、 ースロノヽクグー' ソレンス（Arthrobacter mysorens )、アースロバクタ一 ·ニコチアナ（Arthrobacter nicotianae)、アースロバクタ一'パラフ イネウス（Arthrobacter paraffineus)、アースロバクタ一'プロトフオノレミェ（Arthrobacter protophormiae)、 Γ ~スロノ クタ" ~ ·ロセオノヽフフイナス
Figure imgf000007_0001
roseoparaffmu s)、アースロバクタ一'スルフレウス（Arthrobacter sulftireus.)、アースロバクタ一'ウレ ァファシエンス (Arthrobacter ureafaciens)、クロマテゥム'
Figure imgf000007_0002
クロマチゥム 'テピダム (Chromatium tepidum)、クロマチゥム ·ビノサム（Chromatiu m vinos醒)、クロマテゥム 'ヮ一ミンキ (Chromatium warmingii)、クロマチゥム 'フノレビ ァタティレ (Chromatium fluviatile)、エノレビユア .ウレドノくラ (Erwinia uredovoraj、ェノレ ビニァ '力ロトノくラ（Erwinia carotovora)、エノレビニァ ·ァナス（Erwinia ananas)、エノレビ ユア ·ヘリコラ（Erwinia herbicola)、エノレビユア ·パンクタタ（Erwinia punctata)、エノレビ ニァ ·テレウス (Erwinia terreus)、メチロバクテリウム ·口デシァナム (Methvlobacterium rhodesianumj、メテロノヽクテリゥム.ェクソトノレクエンス (Methvlobacterium extorguens )、フオルミディウム 'エスピー（Phormidium so.) ATCC29409、ロドパクタ^ ~ ·力プスラ タス (Rhodobacter capsulatus)、ロトノヽクタ一'スフエロ ァス (Rhodobacter sphaeroide s) ,ロドシユードモナス'ブラスチカ (Rhodopseudomonas blastica)、ロドシユードモナス 'マリナ (Rhodopseudomonas marma 、ロドシユードモナス 'ノヽノレストリス (Rhodopseudo monas palustns)、口 スピリウム*リブフム (Rhodospirill醒 rubrum)、口トスピリゥム .サ レキシゲンス (Rhodospirillum salexieens)、ロドスピリゥム ·サリナラム（Rhodosoirillum s alinarum)、ストレフトマ セス.アンボノァシエンス (Streptomvces ambofaciens)、ストレ ブトマイセス 'オーレ才ファシエンス（Streotomvces aureofaciens) 、ストレプトマイセス • ,ウレウス (Streptomvces aureus)、ストレプトマ セス.フンンンアイ刀ス (Streptomvc es fungicidicus)、ストレフ卜マ セス.グリセ才クロモヮ'ナス (Streptomvces griseochrom ogenes)、ストレプトマイセス*グリセウス（Strentomvces griseus)、ストレプトマイセス 'リ ビダンス (Streptomvces lividans)、ストレプトマイセス 'オリボグリセウス (Streptomvces olivogriseus)、ストレプトマイセス ·フメウス (Streptomvces rameus)、ストレフトマイセス 'タナシェンシス (Streptomvces tanashiensis)、ストレプトマイセス'ビナセウス (Strepto mvces vinaceus)、サイモモナス .モビリス (Zymomonas mobilis)等をあけること力 ^でき、 好ましい原核生物としては、ェシエリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバタテリ ゥム属、コリネバクテリウム属、シユードモナス属またはストレプトマイセス属等に属す る細菌、例えば上記したェシエリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバタテリゥム 属、コリネバクテリウム属、シユードモナス属またはストレプトマイセス属等に属する種 をあげることができ、より好ましい細菌としてはェシエリヒア'コリ、コリネバクテリウム'グ ノレタミクム、コリネバタテリゥム 'アンモニアゲネス、コリネバタテリゥム'ラタトフアーメンタ ム、コリネバクテイルム 'フラバム、コリネバタテリゥム 'エフイカシス、ブレビバタテリゥム 'フラバム、ブレビバタテリゥム、ラタトフアーメンタム、バチルス'サチルス、バチルス'メ ガテリゥム、セラチア'マノレセッセンス、シユードモナス'プチダ、シユードモナス'エノレ ギノーサ、ストレプトマイセス'セリカラーまたはストレプトミセス'リビダンスをあげること ができ、特に好ましくはェシエリヒア'コリ、コリネバタテリゥム 'グノレタミカム、ブレビバタ テリゥム ·アンモニアゲネスをあげることができ、より具体的には Lーグノレタミンを生産 する能力を有する FERM P-4806、 ATCC14751および ATCC14752など、 L—バリンを 生産する能力を有する ATCC13005および ATCC19561など、 L一口イシンを生産する 能力を有する FERM BP-4704および ATCC21302など、 L イソロイシンを生産する能 力を有する FERM BP-3757および ATCC14310など、 L フエ二ルァラニンを生産する 能力を有する ATCC13281および ATCC21669など、 L チロシンを生産する能力を有 する ATCC21652など、および L トリプトファンを生産する能力を有する DSM10118、 DSM10121, DSM10123および FERM BP-1777などをあげることができる。
なお、上記の FERM番号で表される菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特 許生物寄託センター（日本）、 ATCC番号で表される菌株は、 American Type Culture Collection (米国)、 DSM番号で表される菌株は Deutsche Sammlung von Mikroorgani smen und Zellkulturen (ドイツ）からそれぞれ入手することができる。
2.本発明のアミノ酸の製造方法
本発明のアミノ酸の製造方法としては、（ 1 )平均粒子径が 1〜： 120 μ mのアミノ酸の 結晶を該アミノ酸の結晶濃度が 0. 5g/l以上となるように培地に添加した後、該培地 中で上記 1の該アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培養し、該培地中に該アミ ノ酸の結晶を生成、蓄積させ、培養物中から該アミノ酸の結晶を採取することを特徴 とするアミノ酸の製造方法、および（2)培地中のアミノ酸の結晶の総表面積が 0. 02 m2/l以上となるようにアミノ酸の結晶を培地に添加した後、該培地中で上記 1の該 アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培養し、該培地中に該アミノ酸の結晶を生 成、蓄積させ、培養物中から該アミノ酸の結晶を採取することを特徴とするアミノ酸の 製造方法をあげることができる。
[0015] 上記培地中で該微生物を培養する方法は、アミノ酸の結晶を添加する以外、微生 物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生 物の培養を効率的に行える培地、好ましくは液体培地であれば、天然培地、合成培 地のいずれも用いることができる。
[0016] 炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース 、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭 水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール 類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、酢酸アンモニ ゥム、リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩、その他の含窒 素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカ一、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化 物等を用いることができる。
[0017] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸 マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。
上記（1)の製造方法で添加するアミノ酸の結晶は、平均粒子径が:!〜 120 μ mであ り、結晶濃度が 0. 5g/l以上の培地をあたえるアミノ酸の結晶であれば、添加するァ ミノ酸の結晶の平均粒子径、量、アミノ酸の種類および結晶形の種類などに制限は ないが、添加するアミノ酸の結晶の平均粒子径としては、：!〜 120 z m、好ましくは 2 〜110 μ πι、より好ましくは 5〜70 x m、さらに好ましくは 7〜50 μ m、特に好ましくは 10〜35 μ m、最も好ましくは 11〜13 μ mをあげることができる。
[0018] アミノ酸の結晶の量としては、添加後の培地中のアミノ酸の結晶濃度が 0. 5g/l以 上、好ましくは 2〜30g/l、より好ましくは 3〜25g/l、さらに好ましくは 4〜22g/l、 特に好ましくは 5〜20g/l、最も好ましくは 5. 5- 16. 5g/lになる量をあげることが できる。
また、上記した添加するアミノ酸の結晶の平均粒子径と添加量の組み合わせとして は、平均粒子径が 1〜： 120 x mであり、結晶濃度が 0. 5gZl以上の培地をあたえる 組み合わせであれば特に制限はないが、平均粒子径が:!〜 120 μ mで結晶濃度が 0. 5gZl以上、好ましくは平均粒子径が 2〜： l lO x mで結晶濃度が 2〜30g/l、より 好ましくは平均粒子径が 5〜70 μ mで結晶濃度が 3〜25g/l、さらに好ましくは平均 粒子径が 7〜50 μ mで結晶濃度が 4〜22g/l、特に好ましくは平均粒子径が 10〜3 5 μ mで結晶濃度が 5〜20g/l、最も好ましくは平均粒子径が 11〜： 13 μ mで結晶 濃度が 5. 5〜16. 5g/lの培地をあたえる組み合わせをあげることができる。
[0019] アミノ酸の結晶を培地に添加する時期は、アミノ酸を生産する能力を有する微生物 を培地に培養する前、またはアミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地に培養 した後の培養期間中のいずれの時期でもよいが、好ましくはアミノ酸を生産する能力 を有する微生物を培地に培養した後で、培地中のアミノ酸濃度が飽和溶解度に達す る前後から培地中にアミノ酸の結晶が析出する前、より好ましくは培地中のアミノ酸濃 度が飽和溶解度に達した後であって、培地中にアミノ酸の結晶が析出する前、さらに 好ましくは培地中のアミノ酸濃度が過飽和にあるときであって、培地中にアミノ酸の結 晶が析出する前をあげることができる。ただし、上記において培地中にアミノ酸の結 晶が析出する前とは、好ましくは培地中に全くアミノ酸の結晶が観察されない時期の ことである力 結晶回収率の面などにおいて、本発明の効果が達成できる範囲にあ れば、微量のアミノ酸の結晶の析出がみられてもよい。
[0020] 培地中のアミノ酸の濃度が過飽和にあるときにアミノ酸の結晶を添加する場合のァ ミノ酸の結晶の量としては、添カ卩時の培地量に対する量として 0. 5g/l以上、好ましく は 2〜30g/l、より好ましくは 3〜25g/l、さらに好ましくは 4〜22g/l、特に好ましく は 5〜20g/l、最も好ましくは 5. 5- 16. 5gZlをあげることができる。
[0021] 培地中のアミノ酸の濃度が過飽和にあるときにアミノ酸の結晶を添加する場合は、 添加するアミノ酸の結晶の平均粒子径と量の組み合わせとしては、平均粒子径が 1 〜 120 x mの結晶を添カ卩時の培地量に対する量として 0. 5gZl以上、好ましくは平 均粒子径が 2〜： ί ΐθ μ mの結晶を添加時の培地量に対する量として 2〜30gZl、よ り好ましくは平均粒子径が 5〜70 a mの結晶を添加時の培地量に対する量として 3 〜25gZl、さらに好ましくは平均粒子径が 7〜50 μ mの結晶を添加時の培地量に対 する量として 4〜22g/l、特に好ましくは平均粒子径が 10〜35 μ mの結晶を添加時 の培地量に対する量として 5〜20g/l、最も好ましくは平均粒子径が 11〜： 13 z mの 結晶を添加時の培地量に対する量として 5. 5〜16. 5gZl添加する組み合わせをあ げること力 Sできる。
[0022] また、上記（2)の製造方法で添加するアミノ酸の結晶は、培地中のアミノ酸の結晶 の総表面積が 0· 02m2/l以上となるようなアミノ酸の結晶であれば、添加するァミノ 酸の結晶の平均粒子径、量、アミノ酸の種類および結晶形の種類などに制限はない 力 添加するアミノ酸の結晶としては、添加後の培地中のアミノ酸の結晶の総表面積 0. 02m2/l以上、好ましくは 0. 08〜70m2/l、より好ましくは 0. 2〜23m2/l、 さらに好ましくは 0. 4〜： 15m2/l、特に好ましくは 0. 7〜9. 3m2/l、最も好ましくは 2 . 0〜7· 0m2/lとなるようなアミノ酸の結晶をあげることができる。
[0023] 上記（2)の製造方法で添加する具体的なアミノ酸の結晶としては、平均粒子径が 1 〜： 120 x mで結晶濃度が 0. 5g/l以上、好ましくは平均粒子径が 2〜： 110 / mで結 晶濃度が 2〜30g/l、より好ましくは平均粒子径が 5〜70 μ mで結晶濃度が 3〜25 gZl、さらに好ましくは平均粒子径が 7〜50 x mで結晶濃度が 4〜22g/l、特に好ま しくは平均粒子径が 10〜35 x mで結晶濃度が 5〜20g/l、最も好ましくは平均粒子 径が 11〜： 13 z mで結晶濃度が 5. 5-16. 5g/lの培地を与えるアミノ酸の結晶をあ げること力 Sできる。
[0024] アミノ酸の結晶を培地に添加する時期は、上記（1)の製造法と同様である。
培地中のアミノ酸の濃度が過飽和にあるときにアミノ酸の結晶を添加する場合のァ ミノ酸の結晶としては、添カ卩時の培地量から計算したときの総表面積が 0. 02m l 以上、好ましくは 0. 08〜70m2Zl、より好ましくは 0. 2~23m2/l,さらに好ましくは 0. 4〜： 15m2/l、特に好ましくは 0. 7〜9. 3m2/l、最も好ましくは 2. 0〜7. OmVl であるアミノ酸の結晶をあげることができる。 [0025] 具体的な該アミノ酸の結晶としては、平均粒子径が：!〜 120 μ mで添加時の培地量 に対する量として 0. 5gZl以上の結晶、好ましくは平均粒子径が 2〜： 1 10 x mで添カロ 時の培地量に対する量として 2〜30g/lの結晶、より好ましくは平均粒子径が 5〜70 μ mで添加時の培地量に対する量として 3〜25g/lの結晶、さらに好ましくは平均粒 子径が 7〜50 μ mで添加時の培地量に対する量として 4〜22gZlの結晶、特に好ま しくは平均粒子径が 10〜35 μ mで添加時の培地量に対する量として 5〜20g/lの 結晶、最も好ましくは平均粒子径が 1 1〜： 13 μ mで添加時の培地量に対する量として 5. 5- 16. 5g/lの結晶をあげることができる。
[0026] 上記において、培養物中の培地量を測定する方法としては、公知のレ、かなる方法 であってもよいが、例えば培養物を遠心分離することにより、培地と菌体等の不溶物 を分離し、沈降した不溶物の体積を測定し、培養物量力 差し引く方法などをあげる こと力 Sできる。
さらに、上記（1 )および（2)の製造方法において、添加するアミノ酸の結晶は、平均 比表面積が 0. 06m2/cm3以上のアミノ酸の結晶、好ましくは 0. 07〜7. 2m2/ cm3 、より好ましくは 0· 07〜： 1. 43m2/cm3、さらに好ましくは 0.：!〜 1. 0m2/cm3、特 に好ましくは 0· 14〜0. 72m2/cm3のアミノ酸の結晶をあげることができる。
[0027] 上記（1 )および（2)の製造方法で添加するアミノ酸としては、微生物が生産すること ができるアミノ酸であればいずれのアミノ酸でもよレ、が、好ましくは L—グルタミン、 L - バリン、 L—ロイシン、 L—イソロイシン、 L—フエ二ルァラニン、 L—チロシンおよび L— トリプトファンから選ばれるアミノ酸、より好ましくは L—グノレタミン、 L—パリンおよび L —ロイシンから選ばれるアミノ酸、さらに好ましくは L—グノレタミンをあげることができる 。ただし、 L—フエ二ルァラニンの a晶は本発明の製造方法で添カ卩するアミノ酸の結 晶から除かれてもよい。
[0028] 本発明で用いられる培地添加用のアミノ酸の結晶は、市販品または公知の方法、 例えば発酵生産法および精製法で得られるアミノ酸の結晶などをそのまま、あるいは 市販のアミノ酸の結晶または上記した公知の方法で得られるアミノ酸の結晶を、市販 の粉砕機、例えば M4型自由粉砕機 (奈良機械製作所社製）、アトマイザ一 TAP— 2 0型（東京アトマイザ一製造社製)、 Air Classifying Mill (HOSOKAWA MICRON PO WDER SYSTEMS社製）などを用いて目的とする平均粒子径を有するアミノ酸の結晶 を調製することによつても取得すること力 Sできる。
[0029] 例えば、公知の発酵生産法および精製法で得られる平均粒子径が約 110 μ mの アミノ酸の結晶を、 M4型自由粉砕機を用いて、スクリーン Φ 1. Omm,回転数 4500r pm、処理速度約 400kG/hの条件で粉砕することにより、平均粒子径が約 45 x mの アミノ酸の結晶を取得することができ、該アミノ酸の結晶をさらに、スクリーン Φ 0. 3m m,回転数 6000rpm、処理速度約 200kG/hの条件で粉砕することにより、平均粒子 径が約 11 μ mのアミノ酸の結晶を取得することができる。
[0030] アミノ酸の結晶の比表面積は、市販の測定機、例えばセイシン企業株式会社製 SK
LASER MICRON SIZER LMS— 24 (レーザー回折.散乱式粒度分布測定装置 )を用いて測定できるが、アミノ酸の結晶の比表面積の測定に際しては、該結晶は球 状、かつ相似系と仮定し計算することが好ましい。
アミノ酸の結晶の総表面積は、アミノ酸の結晶の比表面積と添加する量とから計算 すること力 Sできる。
[0031] 培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養 温度は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 5時間〜 7日間である。培養中 pHは 3.0〜9 .0に保持する。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシ ゥム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に 添加してもよい。
[0032] プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微 生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例 えば、 プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するとき にはイソプロピル一 β _D_チォガラタトピラノシド等を、 プロモーターを用いた発 現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地 に添加してもよい。
[0033] 上記方法で培地中に蓄積されるアミノ酸としては、微生物が生産することができるァ ミノ酸であればいずれのアミノ酸でもよぐ好ましくは、 L—グルタミン、 Lーバリン、 L— ロイシン、 L—イソロイシン、 L—フエニノレアラニン、 L—チロシンおよび L—トリプトファ ンから選ばれるアミノ酸、より好ましくは L—グルタミン、 L パリンおよび L ロイシン 力も選ばれるアミノ酸、さらに好ましくは L—グルタミンをあげることができる。
[0034] また、上記方法で培地中に蓄積されるアミノ酸の結晶としては、平均粒子径が 15 μ m以上、好ましくは 20 z m以上、より好ましくは 30 z m以上、さらに好ましくは 40 z m 以上、特に好ましくは 50 z m以上、最も好ましくは 60 x m以上の結晶をあげることが できる。
本発明の製造方法において、培養物中のアミノ酸の結晶を採取する方法としては、 通常のアミノ酸の精製方法であればいずれの方法でもよぐ好ましくは培養終了後の 培養物中の菌体とアミノ酸の結晶を直接、それらの粒子径、並びに比重の差を利用 してアミノ酸の結晶を分離、精製する方法をあげることができる。
[0035] 上記した粒子径、並びに比重の差を利用してアミノ酸の結晶を分離、精製する方法 としては、従来公知の方法である重力分級分離法、遠心力分級分離法をあげること ができ、より好ましくは遠心力分級分離方法、この遠心力分級分離方法の中でも、さ らに好ましくはデカンタ型遠心分離方法をあげることができる。
上記採取方法により、十分に精製されたアミノ酸の結晶を高い回収率で得ることが できる力 必要に応じて、さらに活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あ るいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトダラ フィ一等により精製することができる。
[0036] 以下、実施例を記載するが、本発明は該実施例に限定されるものではない。
実施例 1
[0037] Lーグノレタミンの結晶の製造（1)
コリネバタテリゥム.グルタミカム ATCC14752を、生産培地 [250g/Lグルコース、 30g ん NH Cl、 1.0g/L K ΗΡΟ、 1.0g/L ΚΗ ΡΟ、 0.5g/L MgSO · 7Η 0、 20mg/L FeSO
4 2 4 2 4 4 2 4
、 2mg/L MnSO -4H 0、 10 /i g/Lビォチン、 lmg/Lサイアミン塩酸塩、 pH6.8]が入つ
4 2
ている 500L容ジャーフアーメンター中で、適宜 pH、培養温度を調整しながら培養し た。培養開始後、培地中の L グルタミンの濃度がその飽和溶解度に達した後であり 、培地中に Lーグノレタミンの結晶が析出する前に、平均粒子径 40 /i mの L-ダルタミ ンの結晶を、培地中に結晶濃度が 16. 5g/lとなるように添加した。その後、培養を 継続し、培地中で L -グルタミンの結晶を成長させつつ培養を継続した。培養開始か ら約 96時間で培養を終了することで、 90g/lの L—グノレタミンを含有する培養物を 2 10L取得した。巴工業 (株)製デカンタ（PTM006型）を用いて、該培養物から 6. 2kg の L_グルタミン結晶を分離、取得した。この結晶の平均粒子径は 62 z mであった。 この際、培地中に析出した結晶のデカンタによる回収率は 98. 9%であった。
実施例 2
[0038] Lーグノレタミンの結晶の製造（2)
培養中に添加する結晶として、平均粒子径が図 1に示す粒子径である L ダルタミ ンの結晶を用いる以外は、実施例 1と同様の方法で培養し、 L—グノレタミンの結晶を 取得した。また、 L—グルタミンの結晶の比表面積は、セイシン企業株式会社製 SK LASER MICRON SIZER LMS _ 24 (レーザー回折'散乱式粒度分布測定装置 )を用いて測定した。ただし、 L—グノレタミンの結晶の比表面積の測定に際しては、該 結晶は球状、且つ相似系と仮定し計算した。
[0039] 添加した L_グルタミンの結晶および発酵生産で得られた L_グルタミンの結晶の 形状、 L一グルタミンの結晶の回収率、乾燥物含量などを図 1に示す。
図 1にあるとおり、培地中に結晶を添加しない場合は、培地中に微細な結晶が析出 するため、遠心分離による結晶回収率が低下し、また添加するアミノ酸の粒子径は小 さい方が結晶回収率が上昇する傾向にあることがわかった。また、結晶を添加した場 合は、培養終了時に得られる培地中のアミノ酸の結晶の平均粒子径はいずれも 30 μ η以上であった。さらに、デカンタで分離した結晶をバスケット型遠心分離機で脱 液し、乾燥して得られた結晶の含量 (乾物含量）は、総表面積の大きな結晶を添加す ることにより向上することもわかった。
[0040] 以上より、本発明の製造法により、 Lーグノレタミンだけでなぐ種々のアミノ酸の発酵 生産において、アミノ酸の結晶を培地に添加することにより培地中のアミノ酸の過飽 和度を一定以下にし、かつ種晶として適度な数のアミノ酸の結晶を培地に存在させる こと、すなわち培地に添加するアミノ酸の結晶の平均粒子径および量、または該結晶 の総表面積を調整することにより、培養中に培地中に析出するアミノ酸の結晶の粒子 径をコントロールすることができ、その結果、菌体との分離が容易であり、かつ回収率 も高いアミノ酸の結晶が得られることがわかった。
産業上の利用可能性
本発明により、簡便に効率よくアミノ酸を製造法することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 平均粒子径が 1〜： 120 / mのアミノ酸の結晶を該アミノ酸の結晶濃度が 0. 5g/l以 上となるように培地に添加した後、該培地中で該アミノ酸を生産する能力を有する微 生物を培養し、該培地中に該アミノ酸の結晶を生成、蓄積させ、培養物中から該アミ ノ酸の結晶を採取することを特徴とするアミノ酸の製造方法。
[2] 培地中のアミノ酸の結晶の総表面積が 0. 02m2/lとなるようにアミノ酸の結晶を培地 に添加した後、該培地中で該アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培養し、該 培地中に該アミノ酸の結晶を生成、蓄積させ、培養物中から該アミノ酸の結晶を採取 することを特徴とするアミノ酸の製造方法。
[3] 添加するアミノ酸の結晶が 0. 06m2/cm3以上の比表面積を有するアミノ酸の結晶 である、請求項 1または請求項 2記載の方法。
[4] 生成、蓄積させるアミノ酸の結晶の平均粒子径が 15 z m以上である請求項 1〜3の レ、ずれか 1項に記載の方法。
[5] 培養物中からアミノ酸を採取する方法がアミノ酸を生産する微生物と蓄積させたァミノ 酸の結晶を、それらの粒子径の差に基づいて分離することを特徴とする請求項 1〜4 のいずれか 1項に記載の方法。
[6] 培養物中からミノ酸を採取する方法がアミノ酸を生産する微生物と蓄積させたァミノ 酸の結晶を、それらの比重の差に基づいて分離することを特徴とする請求項 1〜4の レ、ずれか 1項に記載の方法。
[7] アミノ酸が L—グルタミン、 L—バリン、 L—ロイシン、 L—イソロイシン、 L—フエニルァ ラニン、 Lーチロシンまたは L—トリプトファンである請求項 1〜6のいずれ力 1項に記 載の製造法。
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