CN101558163A - L-氨基酸的生产方法 - Google Patents

L-氨基酸的生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101558163A
CN101558163A CNA2007800456915A CN200780045691A CN101558163A CN 101558163 A CN101558163 A CN 101558163A CN A2007800456915 A CNA2007800456915 A CN A2007800456915A CN 200780045691 A CN200780045691 A CN 200780045691A CN 101558163 A CN101558163 A CN 101558163A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
phenylalanine
bacterium
gene
substratum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2007800456915A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101558163B (zh
Inventor
奥谷聪志
藤木伸哉
岩谷真太郎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
Publication of CN101558163A publication Critical patent/CN101558163A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101558163B publication Critical patent/CN101558163B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/22—Processes using, or culture media containing, cellulose or hydrolysates thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/222—Phenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227—Tryptophan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种通过发酵法进行的L－氨基酸的生产方法，该方法中在液体培养基中培养具有L－氨基酸生产能力的微生物，并在使L－氨基酸析出到所述培养基中的同时在所述培养基中积累，其中，所述培养基中包含选自水溶性纤维素衍生物、能溶于极性有机溶剂的聚乙烯基化合物、水溶性淀粉衍生物、海藻酸盐和聚丙烯酸盐中的聚合物。

Description

L-氨基酸的生产方法
技术领域
本发明涉及发酵工业，本发明涉及利用微生物的发酵法高效地生产L-氨基酸、特别是疏水性氨基酸以及L-苏氨酸和L-谷氨酸的方法。疏水性L-氨基酸被用作医疗目的的营养混合物的成分。而且，其作为动物用饲料添加剂、以及制药工业和化学工业中的试剂有着广泛的应用。此外，L-苯丙氨酸还用作甜味剂的原料。此外，L-苏氨酸在饲料方面有广泛应用，而L-谷氨酸作为调味品原料等有广泛的应用。
背景技术
L-氨基酸是使用具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌、或者属于肠杆菌科的氨基酸生产菌通过发酵法在工业上生产的。作为这些氨基酸生产菌，为了改善生产性能，使用天然分离株或其人工突变株，或者通过基因重组技术增强了L-氨基酸生物合成酶的重组体等。
例如，在疏水性氨基酸L-色氨酸的发酵中，可以列举出增强了邻氨基苯甲酸合酶活性、磷酸甘油酸脱氢酶活性、色氨酸合酶活性的细菌(参见WO94/08031号)，以及色氨酸操纵子得到扩增的细菌(特开昭57-71397号、特开昭62-244382号、美国专利第4,371,614)。
此外，在L-谷氨酸发酵中，可以列举出通过增强谷氨酸脱氢酶基因(gdh)、异柠檬酸脱氢酶基因(icdA)、乌头酸水合酶基因(acnA，acnB)和柠檬酸合酶基因(gltA)来提高L-谷氨酸的生产能力的技术(特开昭63-214189号公报)。
此外，在L-苏氨酸发酵中，可以列举出增强了天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、以及由苏氨酸操纵子编码的天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)和苏氨酸合酶基因(thrC)的微生物(特开2001-346578号)等。
通过诸如上述的微生物育种和生产方法的改进，使得L-氨基酸生产能力大幅提高，但为了应对今后需求的进一步增加，需要开发更廉价且有效的疏水性L-氨基酸的生产方法。
另一方面，已知在使培养液中积累的L-氨基酸晶析的同时进行发酵的方法(特开昭62-288号、欧洲专利公报第1078989号)。该方法通过使培养液中积累的L-氨基酸晶析，来实现将养液中L-氨基酸的浓度维持在一定水平。
此外，在L-谷氨酸方面，公开了使用能够在析出L-谷氨酸的同时积累L-谷氨酸的微生物来生产L-谷氨酸的方法(美国专利第6905819号)。
此外，目前为止，作为疏水性L-氨基酸的晶析方法，已知有使用水溶性纤维素衍生物对L-氨基酸进行纯化的方法(特公平5-76463)。但是，下述方法是未知的：在析出(precipitation)L-氨基酸的同时进行发酵的方法中，在培养基中添加水溶性纤维素衍生物等聚合物，在提高L-氨基酸的生产能力的同时使L-氨基酸析出到培养基中。
发明内容
本发明所要解决的问题
本发明的目的是：改善L-氨基酸发酵生产中的生产性能，或者改善L-氨基酸晶体中L-氨基酸的纯度。
解决问题的方法
本发明人通过深入研究发现：通过在发酵培养基中添加选自下组的聚合物：水溶性纤维素衍生物、聚乙烯基化合物、水溶性淀粉衍生物、海藻酸盐和聚丙烯酸盐，可以改善L-氨基酸的生产性能，并且可以减少析出到培养基中的L-氨基酸的晶体中的杂质；从而完成了本发明。
即，本发明如下述。
(1)一种通过发酵法进行的L-氨基酸的生产方法，该方法中在液体培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的微生物，并在使L-氨基酸析出到所述培养基中的同时在所述培养基中积累，其中，所述培养基中包含选自下组的聚合物：水溶性纤维素衍生物、水溶性聚乙烯基化合物、能溶于极性有机溶剂的聚乙烯基化合物、水溶性淀粉衍生物、海藻酸盐和聚丙烯酸盐。
(2)上述方法，其中，所述聚合物选自下组：羧甲基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基纤维素邻苯二甲酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩乙醛二乙胺乙酸酯(polyvinylacetaldiethylaminoacetate)、海藻酸钠(sodium arginate)、和聚丙烯酸钠。
(3)上述方法，其中，所述微生物为属于肠杆菌科的细菌或棒状杆菌型细菌。
(4)上述方法，其中，所述属于肠杆菌科的微生物是属于埃希氏菌属(Escherichia)或泛菌属(Pantoea)的细菌。
(5)上述方法，其中，所述L-氨基酸选自下组：L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-苏氨酸和L-谷氨酸。
(6)上述方法，其中，所述聚合物为甲基纤维素，并且所述液体培养基中含有1g/L以上的甲基纤维素。
(7)上述方法，其中，所述L-氨基酸为L-苯丙氨酸。
(8)一种α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯的生产方法，该方法包括根据前面所述的方法生产L-苯丙氨酸、以及由天冬氨酸或其衍生物和得到的L-苯丙氨酸，来合成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯。
(9)上述方法，该方法还包括：将L-苯丙氨酸酯化为L-苯丙氨酸的低级烷基酯，然后使该L-苯丙氨酸的低级烷基酯与作为所述天冬氨酸衍生物的N-酰基-L-天冬氨酸酐缩合，并从该反应混合物中分离出N-酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯，再对N-酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯进行氢化，从而生成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯。
发明的具体实施方式
本发明的生产方法是一种通过发酵法进行的L-氨基酸的生产方法，该方法包括在液体培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的微生物，并在使L-氨基酸析出到所述培养基中的同时在所述培养基中积累，其中，所述培养基中包含选自下组的聚合物：水溶性纤维素衍生物、水溶性聚乙烯基化合物、能溶于极性有机溶剂的聚乙烯基化合物、水溶性淀粉衍生物、海藻酸盐和聚丙烯酸盐。
在本发明中，对于“L-氨基酸”没有特殊限制，只要其能够在使用微生物的发酵法中析出到所述培养基中的同时在所述培养基中积累即可。具体地，可以列举出疏水性氨基酸和酸性氨基酸。作为疏水性氨基酸，可以列举出作为支链L-氨基酸的L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸，作为芳香族L-氨基酸的L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸。此外，作为酸性氨基酸，可以列举出L-谷氨酸。此外，所述L-氨基酸中还包括L-苏氨酸。
在本发明中，作为水溶性纤维素衍生物，可以列举出羧甲基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基纤维素邻苯二甲酸酯等；作为水溶性聚乙烯基化合物或能溶于极性有机溶剂的聚乙烯基化合物，可以列举出聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩乙醛二乙胺乙酸酯等；作为水溶性淀粉衍生物，可以列举出羟丙基淀粉、明胶等；作为海藻酸盐，可以列举出海藻酸钠等海藻酸碱金属盐等；此外，作为聚丙烯酸盐，可以列举出聚丙烯酸钠等。
这些聚合物可以单独添加在培养基中，也可以任意2种或2种以上的组合添加在培养基中。
对于添加到培养基中的聚合物的浓度没有特殊限制，只要为不抑制目的L-氨基酸的生成和析出的浓度即可。合适的聚合物浓度，可以根据所使用的微生物、目的L-氨基酸以及所使用的聚合物的种类适当地设定。例如，通过将聚合物以各种浓度添加到培养基中，并测定L-氨基酸的收率或生产速度、和析出量，可以确定合适的浓度。作为聚合物的浓度，具体地可以列举出例如：优选10mg/L以上、更优选1g/L以上、特别优选1.7g/L以上。浓度的上限可以是任何值，只要为不抑制目的L-氨基酸的生成和析出的浓度即可，可以列举出例如2g/L。
培养基中的聚合物的量，可以根据聚合物的具体种类，采用合适的方法来测定。例如，甲基纤维素等可以采用甲氧基测定法来测定。甲氧基测定法是这样的方法：向样品中加入氢碘酸并加热混合物，用溴将生成的碘甲烷氧化，用硫代硫酸钠溶液滴定生成的碘酸，从而对甲氧基进行定量(参考http://www.tokyo-eiken.go.jp/additives/kijun-1.html)。
在本发明中，向培养基中添加聚合物的时期可以是任何时期，只要目的L-氨基酸在析出的同时积累即可，可以从培养开始时就将聚合物添加在培养基中，也可以在培养过程中添加。此外，还可以通过后述的补料分批培养来将聚合物添加到培养基中。
在本发明中使用的培养基可以是任何培养基，只要其包含碳源、氮源和聚合物作为营养源即可。此外，本发明的方法可以采用分批培养(Batchculture)、补料分批培养(fed-batch culture)和/或连续培养(continuous culture)。
这里，在本发明中，补料分批培养(fed batch culture)指下述培养方法：其中在培养期间将培养基连续地或间歇地添加至培养容器中，并且在培养完成之前不从容器中取出(extract)培养基。连续培养指下述培养方法：在培养期间连续地或间歇地将培养基添加至容器中，并且从容器中提取培养基(通常而言，以等同于补加的培养基的量)。术语“初始培养基”的意思是在补料分批培养或连续培养中，添加补料培养基之前用于分批培养的培养基；术语“补料培养基”的意思是在进行补料分批培养或连续培养时，提供至发酵罐的培养基。补料培养基可包含微生物生长所必需的全部或部分成分。在本发明中，术语“发酵培养基”的意思是包含在发酵罐中的培养基，并且从此发酵培养基中收集疏水性L-氨基酸。此外，在本发明中，术语“发酵罐(fermenter)”的意思是在其中进行疏水性L-氨基酸生产的容器，并且不限定其形状。可使用发酵罐(fermentation tank)或发酵缸(jar fermenter)。此外，只要能够产生和收集疏水性L-氨基酸，不限定发酵罐的容积。
而且，如前述，聚合物可以在培养初期添加，也可以在培养过程中添加。但是，例如当本发明的方法包括具有L-氨基酸生产能力的微生物的增殖阶段(增殖期)(proliferation phase)和L-氨基酸产生阶段(L-氨基酸产生期)时，优选至少在L-氨基酸生产期含有一定浓度的聚合物。
术语“增殖期”用于本发明中的意思是自开始培养起3小时，优选6小时，特别优选10小时之内的时期，在这段时期中碳源主要用于细胞的生长，即，微生物以对数增殖的时期。术语“L-氨基酸产生期”用于本发明中的意思是自开始培养起在3小时，优选6小时，特别优选10小时之后的时期，在这段时期碳源被主要用于L-氨基酸产生。
本发明中使用的培养基中包含的碳源的实例包括糖，例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜(molasses)。葡萄糖和蔗糖是特别优选的。此外，有机酸例如乙酸和柠檬酸，和醇例如乙醇，也能够单独使用或与其它碳源组合使用。此外，碳源的原料可以是蔗糖蜜、甜菜糖蜜、高级糖蜜(high test molasses)和柑橘类糖蜜(citrusmolasses)，和天然原料如纤维素、淀粉、玉米、谷物和木薯淀粉(tapioca)的水解物。此外，溶解在培养基中的二氧化碳也能够用作碳源。这些碳源能够用在初始培养基中和/或补料培养基中。培养基可包含这些碳源的一种或两种以上类型。此外，可将相同的碳源用于初始培养基和补料培养基，或补料培养基的碳源可不同于初始培养基的碳源。例如，可将葡萄糖用作初始培养基中的碳源，而将蔗糖用作补料培养基中的碳源。
在本发明中使用的培养基中包含的氮源的实例包括氨、铵盐例如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵和尿素、硝酸盐等。用于调节pH的氨气和氨水也能够用作氮源。此外，也能够使用蛋白胨、酵母提取物、肉膏(meat extract)、麦芽提取物(malt extract)、玉米浆(corn steep liquor)、大豆水解物等。培养基可包含这些氮源的一种或多种类型。这些氮源也能够用在初始培养基中和/或补料培养基中。此外，可将相同的氮源用于初始培养基和补料培养基二者，或者补料培养基的氮源可不同于初始培养基的氮源。
此外，本发明的培养基除碳源、氮源之外优选还包含磷酸源。作为磷酸源，能够使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和磷酸聚合物例如焦磷酸等。
此外，本发明的培养基除碳源、氮源之外可包含生长促进因子(具有生长促进作用的营养物)。能够使用的生长促进因子包括痕量金属、氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸以及含有前述物质的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白降解产物等。特别是，对于芳香族氨基酸和支链氨基酸而言，其生物合成体系是共同的，因此，如后所述，微生物中目的氨基酸以外的氨基酸的生物合成体系减弱。这种情况下，优选在培养基中添加其生物合成体系减弱的氨基酸。例如，当目的氨基酸为L-色氨酸时，理想的是添加L-苯丙氨酸和/或酪氨酸；当目的氨基酸为L-苯丙氨酸时，理想的是添加L-色氨酸和/或L-酪氨酸(WO2003048374)。
痕量金属的实例包括铁、锰、镁、钙等。维生素的实例包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酰胺、维生素B12、吡哆醇等。可将这些生长促进因子包含在初始培养基中或补料培养基中。
此外，在使用其生长需要氨基酸等的营养缺陷突变体(auxotrophicmutant)时，优选将所需营养物补充至本发明的培养基。特别是，在能够用于本发明的L-氨基酸生产菌中，由于L-氨基酸生物合成途径通常是增强的而L-氨基酸降解能力通常是减弱的，所以优选添加L-赖氨酸、L-高丝氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸中的1种或2种以上。
初始培养基和补料培养基可具有相同或不同的培养基组成。此外，当初始培养基和补料培养基这两者都含有聚合物时，聚合物浓度可以相同也可以不同。此外，当在多个阶段添加补料培养基时，在各个阶段所添加的补料培养基的组成可以是相同或不同的。
培养优选在通气条件下进行，发酵温度优选在20至45℃，特别优选在30至42℃。优选将氧浓度调节到5至50％，更优选调节至大约10％。此外，进行通气时优选将pH调节到5至9。如果在培养期间pH降低，例如，可添加碳酸钙或碱例如氨气和氨水以中和培养物。此外，当目的氨基酸为酸性氨基酸例如L-谷氨酸时，可以在pH 3～9、优选pH 3～5的条件下进行。在这些条件下进行培养时，优选进行大约10至120小时，显著量的L-氨基酸积累在培养基中。只要积累的L-氨基酸的浓度高于在野生型菌株中所观察到的浓度并且能够将L-氨基酸从培养基分离和收集，则对积累的L-氨基酸的浓度不进行限定，并且L-氨基酸的浓度为50g/L或更高，理想的是75g/L或更高，更理想的是100g/L或更高。
此外，L-氨基酸可以溶解在培养基中，也可以从培养基中析出，但优选至少有一部分从培养基中析出。
就培养结束后从培养液中L-氨基酸的方法而言，可以按照公知的收集方法来进行。例如，析出到培养基中的L-氨基酸可以通过离心分离或过滤来收集。此外，当L-氨基酸从培养基中析出时，可以在对溶解在培养基中的L-氨基酸进行晶析操作，然后将所述晶体与析出到培养基中的L-氨基酸一起分离出来。
在本发明中，微生物的培养可以通过种子培养(seed culture)和主培养(main culture)来进行，以确保高于一定水平的L-氨基酸积累。种子培养可通过使用摇瓶等的摇动培养或通过分批培养来进行，而主培养可作为补料分批培养或连续培养进行。或者，种子培养和主培养均可作为分批培养进行。
在这些培养方法中，当L-氨基酸浓度达到预定水平时，可取出一部分L-氨基酸，并且可新添加培养基以重复培养。作为新添加的培养基，包含碳源和具有生长促进作用的营养物(生长促进因子)的培养基是优选的。作为碳源，葡萄糖、蔗糖、果糖是优选的。作为生长促进因子，氮源、磷酸、氨基酸等是优选的。作为氮源，能够使用氨、铵盐例如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵和尿素、硝酸盐等。此外，作为磷酸源，能够使用磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。至于氨基酸，在使用营养缺陷突变菌株时，优选补充所需的营养物。
当根据本发明进行补料分批培养或连续培养时，可间歇地添加补料培养基，从而将糖或营养源的供给暂停。优选将补料培养基的添加暂停补料时间(feeding time)的至多30％，理想的是至多20％，特别理想的是至多10％。当间歇添加补料培养基时，起初可在预定的时间添加补料培养基，并且可控制第二次和之后的添加以使其在计算机检测到pH或溶氧浓度增加时开始。这种检测发现通常发生在某个添加期前的添加-停止期间发酵培养基中的碳源耗尽后，并且因此培养罐(culture tank)中的底物浓度可自动地保持在低水平(美国专利号5,912,113)。
作为碳源，葡萄糖、蔗糖和果糖是优选的。作为生长促进因子，氮源、磷酸、氨基酸等是优选的。作为氮源，能够使用氨、铵盐例如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵和尿素、硝酸盐等。此外，作为磷酸源，能够使用磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。至于氨基酸，在使用营养缺陷突变菌株时，优选补充以所需的营养物。此外，补料培养基可以是一种类型的培养基，或两种或多种类型的培养基的混合物。在使用两种或两种类型的补料培养基时，可将培养基混合并且通过使用一个补料罐(feed can)来添加，或通过使用两个或更多个补料罐来添加。
此外，在进行补料分批培养时，优选添加补料培养基以使作为补料培养基或全部发酵培养基中碳源量的糖量不超过30g/L，优选控制到20g/L或更低，更优选10g/L或更低。具体而言，在微生物的对数增殖结束之后，优选将糖浓度控制在前述浓度范围之内。能够通过美国专利号5,912,113中所述方法控制碳源的补料速率(feeding rate)。此外，优选补料糖和磷酸以使其浓度可使糖和磷酸成为细菌细胞生长的限制因素。磷酸包含在补料培养基中，使得磷/碳(P/C)比率为2或更低，优选1.5或更低，更优选1或更低(美国专利号5,763,230)。
在将连续培养方法用于本发明时，可将培养基同时取出和添加；或可取出部分培养基，并且可随后添加培养基。此外，所述方法也可以是连续培养方法，其中将包含L-氨基酸和细菌细胞的培养基取出，并且仅将细胞再循环至发酵罐(法国专利号2669935)。作为连续或间歇添加营养源的方法，使用与补料分批培养中所用的相同方法。
将培养基间歇取出时，优选在L-氨基酸浓度达到预定浓度时取出部分L-氨基酸，并且新添加培养基以继续培养。此外，至于新添加的培养基的量，优选进行培养使得添加新鲜培养基之后，培养中培养基的最终量等于取出之前培养基的量。术语“等于”用于本文的意思是添加培养基后的量相当于取出前培养基的量的大约93～107％。
在将培养基连续取出时，优选在添加营养培养基的同时或之后开始取出。例如，取出开始于添加开始之后的最多5小时，优选3小时，更优选最多1小时。此外，培养基的取出量优选等于添加的培养基的量。
再利用细菌细胞的连续培养方法是如下所述的方法：在氨基酸浓度达到预定水平时，将发酵培养基间歇或连续地取出，仅取出L-氨基酸，并且将包含细菌细胞的过滤残余物再循环(re-circulating)到发酵罐中，这种方法能够通过参考例如法国专利号2669935来进行。
采用本发明的方法制造的苯丙氨酸，例如可以用于制造α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯(也称为“阿司帕坦(aspartame)”)。即，本发明的方法包括使用L-苯丙氨酸作为原料来生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯的方法。该方法包括由天冬氨酸或其衍生物、以及采用上述本发明的方法生产的L-苯丙氨酸，来合成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯的步骤。作为低级烷基酯，可以列举出甲酯、乙酯和丙酯等。
在本发明的方法中，对于由L-苯丙氨酸、以及天冬氨酸或其衍生物来合成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯的方法，没有特殊限制，只要在α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯的合成中使用L-苯丙氨酸或其衍生物即可。例如，α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯可以采用例如下述方法来生产(美国专利第3,786,039号)。将L-苯丙氨酸酯化以获得L-苯丙氨酸的低级烷基酯。使该L-苯丙氨酸烷基酯与L-天冬氨酸衍生物反应，所述天冬氨酸衍生物中，β-羧基被保护起来，而α-羧基被酯化因而被活化。作为所述衍生物，可以列举出N-酰基-L-天冬氨酸酐，例如N-甲酰基-L-天冬氨酸酐、N-苄氧羰基-L-天冬氨酸酐、或N-对甲氧基苄氧羰基-L-天冬氨酸酐。通过该缩合反应，可以得到N-酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸和N-酰基-β-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的混合物。如果在37℃的酸解离常数为10-4以下的有机酸的存在下进行该缩合反应，则α-异构体/β-异构体的比例提高(特开昭51-113841)。然后，从混合物中分离出N-酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸，并进行氢化，从而得到α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸。
本发明中使用的微生物是具有L-氨基酸生产能力、且在液体培养基中进行培养时能够在培养基中析出L-氨基酸同时积累L-氨基酸的微生物。
各种氨基酸在20℃的溶解度如表1所示，理想的是能够积累下述量的L-氨基酸的菌株：对于L-色氨酸发酵为10.6g/L以上，对于L-苯丙氨酸发酵为27.4g/L以上，对于L-酪氨酸发酵为0.38g/L，对于L-异亮氨酸发酵为41.2g/L以上，对于L-亮氨酸发酵为23.8g/L以上，对于L-缬氨酸发酵为57.5g/L以上，对于L-谷氨酸发酵为7.2g/L，对于L-苏氨酸发酵为90.0g/L以上。
表1
Figure A20078004569100121
如果含有L-谷氨酸的水溶液的pH降低，则L-谷氨酸的溶解度在γ-羧基的pKa(4.25)附近显著减小，而在等电点(pH 3.2)处为最低。虽然因培养基的组成而异，但通常在约30℃，L-谷氨酸的溶解量为：pH 3.2时10～20g/L，pH 4.0时30～40g/L，pH 4.7时50～60g/L。
作为本发明的微生物或者用于育种本发明的微生物的亲本株，可以使用以埃希氏菌属细菌、泛菌属细菌为代表实例的属于肠杆菌科的微生物，或者使用棒状杆菌型细菌等。此外，也可以使用能够由甲醇生产L-氨基酸的利用甲醇的细菌，例如甲基菌属(Methylobacillus)细菌、嗜甲基菌属(Methylophilus)细菌等。其它属于肠杆菌科的微生物实例包括γ-变形细菌(γ-Proteobacteria)如肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯杆菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)和摩根氏菌属(Morganella)等。此外，作为其它微生物的例子，可以列举出：脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)细菌、芽孢杆菌属(Bacillus)细菌以及属于(糖)酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)等的酵母等。
作为埃希氏菌属细菌的实例，可以列举出Neidhardt等所列的菌株(Neidhardt，F.C.等，Escherichia coli and Salmonella Typhimurium，AmericanSociety for Microbiology，Washington，D.C.，1028表1)。例如可以利用大肠杆菌。作为大肠杆菌的野生株，可以列举出：K12株或其衍生株、大肠杆菌MG1655株(ATCC 47076)、以及大肠杆菌W3110株(ATCC 27325)等。这些可以从例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(地址：P.O.Box 1549Manassas，VA 20108，USA))获得。
肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。泛菌属细菌的实例是Pantoea ananatis。在近几年中，基于16S rRNA核苷酸序列分析，有时将成团肠杆菌重分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis和斯氏泛菌(Pantoeastewartii)等。对于本发明，可以使用归类在肠杆菌科中的任何细菌，无论属于肠杆菌属或泛菌属。菌株Pantoea ananatis AJ13355(FERM BP-6614)、AJ13356(FERM BP-6615)、AJ13601(FERM BP-7207)和它们的任何衍生物可用于通过基因工程方法培育Pantoea ananatis。在分离时，将这些菌株鉴定并且保藏为成团肠杆菌。但如上所述，通过使用16S rRNA核苷酸序列的分析，已将这些细菌重分类为Pantoea ananatis。
作为嗜甲基菌属细菌，具体地可以列举出食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)，作为其代表性菌株可以列举出AS1菌株(NCIMB 10515)等。食甲基嗜甲基菌AS1菌株可以从国立工业、食品和海洋细菌保藏中心(地址：NCIMB Lts.，Torry Research Station 135，Abbey Road，Aberdeen AB98DG，United Kingdom)获得。
作为甲基菌属细菌，具体地可以列举出：糖原甲基菌(Methylobacillusglycogenes)、鞭毛甲基菌(Methylobacillus flagellatum)等。作为糖原甲基菌，可以列举出T-11菌株(NCIMB 11375)、ATCC 21276菌株、ATCC 21371菌株、ATR80菌株(见Appl.Microbiol.Biotechnol.，(1994)，vol.42，p67-72)和A513菌株(见Appl.Microbiol.Biotechnol.，(1994)，vol.42，p67-72)等。糖原甲基菌NCIMB 11375菌株可以从国立工业、食品和海洋细菌保藏中心(地址：NCIMB Lts.，Torry Research Station 135，Abbey Road，Aberdeen AB98DG，United Kingdom)获得。作为鞭毛甲基菌例如有KT菌株(Arch.Microbiol.，vol.149，pp.441-446，1988)等。
作为棒状杆菌型细菌，可以利用下述微生物，所述微生物是在《Bergey’sManual of Determinative Bacteriology)》中定义的一组微生物，其被分类为需氧性、革兰氏阳性、非耐酸性、无孢子形成能力的杆菌。此外，棒状杆菌型细菌包括棒杆菌属细菌，和曾经归类于短杆菌属(Brevibacterium)，但是已经重新归类于棒杆菌属的那些细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，并且进一步包括属于与棒杆菌属极其近缘的短杆菌属或微杆菌属(Microbacterium)的细菌。
棒状杆菌型细菌具体实例包括以下：
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
烷醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)
美棒杆菌(Corynebacterium callunae)
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)
栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)
嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)(Corynebacteriumefficiens)
力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)
二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)
Brevibacterium immariophilum
乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)
玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)
解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)
生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)
产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)
白色短杆菌(Brevibacterium album)
蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)
嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)
具体而言，可包括以下菌株：
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870
醋谷棒杆菌ATCC 15806
烷醇棒杆菌ATCC 21511
美棒杆菌ATCC 15991
谷氨酸棒杆菌ATCC 13020、ATCC 13032、ATCC 13060
百合花棒杆菌ATCC 15990
栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965
嗜热产氨棒杆菌AJ 12340(FERM BP-1539)
力士棒杆菌ATCC 13868
二歧短杆菌ATCC 14020
黄色短杆菌ATCC 13826、ATCC 14067、AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
乳发酵短杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒杆菌ATCC 13869)
玫瑰色短杆菌ATCC 13825
解糖短杆菌ATCC 14066
生硫短杆菌ATCC 19240
产氨短杆菌ATCC 6871、ATCC 6872
白色短杆菌ATCC 15111
蜡状短杆菌ATCC 15112
嗜氨微杆菌ATCC 15354
这些菌株可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)获得。即，给予每个菌株唯一的登记号。使用该登记号能够订购菌株。对应于各菌株的登记号列于ATCC的目录。根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定，将AJ12340菌株于1987年10月27日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscience andHuman Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology，Ministry ofinternational Trade and Industry)(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)，位于Tsukuba Central6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-5466，Japan)，并给予登录号FERM BP-1539。根据布达佩斯条约的规定，将AJ12418菌株于1989年1月5日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，并给予登录号FERM BP-2205。
下文将描述用于将产生L-氨基酸的能力赋予如上所述的亲本菌株的方法。
为了赋予产生L-氨基酸的能力，可以获得营养缺陷突变体、类似物抗性菌株或代谢调节突变体，或可以构建将L-氨基酸生物合成酶的表达增强的重组菌株。也可使用在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌的培育中常规使用的方法(参见“Amino Acid Fermentation”，Gakkai Shuppan Center(Ltd.)，第1版，1986年5月30日发表，pp.77-100)。在本文中，在产生L-氨基酸的细菌的培育中，可赋予一种或多种性质，例如营养缺陷突变、类似物抗性、代谢调节突变。也可将一种或两种或三种以上L-氨基酸生物合成酶的表达增强。另外，可以将赋予性质与增强生物合成酶的活性组合进行，所述性质例如营养缺陷突变、类似物抗性突变或代谢调节突变。
具有产生L-氨基酸的能力的营养缺陷突变体菌株、L-氨基酸类似物抗性菌株或代谢调节突变体菌株可通过如下获得：对亲本菌株或野生型菌株施以常规突变处理，例如用X-射线或UV照射处理，或用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等处理；其后选择显示营养缺陷突变、类似物抗性突变或代谢调节突变并且还具有产生L-氨基酸的能力的那些菌株。
以下，具体示例赋予氨基酸生产能力的方法和氨基酸生产菌。
L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸均为芳族氨基酸，并且共享生物合成系统。编码芳族氨基酸生物合成酶的基因的实例包括脱氧阿拉伯-庚酮糖酸磷酸合酶(deoxyarabino-heptulosonate phosphate synthase)(aroG)、分支酸变位酶-预苯酸脱水酶(chorismate mutase-prephenate dehydratase)(pheA)、3-脱氢奎宁酸合酶(aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)(aroA)和分支酸合酶(chorismate synthase)(aroC)(欧洲专利申请公开No.763127)。已知这些基因由酪氨酸抑制子(tyrR)调控，所以也可通过缺失tyrR基因来增加芳族氨基酸的生物合成酶活性(参考欧洲专利763127的说明书)。此外，酶名称后的括号内为基因名称(同样应用于后面的表述中)。
为了增强细菌的每种氨基酸生产能力，可以减弱目的芳香族氨基酸以外的生物合成系统。例如当目的氨基酸为L-色氨酸时，可以减弱L-苯丙氨酸、L-酪氨酸的生物合成系统(US4,371,614)。
此外，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸酯合成酶(aroF，aroG)受到芳香族氨基酸的反馈抑制，因此可以对其进行修饰，以使其不受反馈抑制。对于aroF，可以将N末端起第147位的L-天冬氨酸或第181位的L-丝氨酸取代为其它氨基酸的突变型aroF基因导入宿主，而对于aroG，可以将N末端起第146位的L-天冬氨酸、第147位的L-甲硫氨酸、第150位的L-脯氨酸或第202位的L-丙氨酸中的1个氨基酸、或者第157位的L-甲硫氨酸和第219位的L-丙氨酸这两个氨基酸取代为其它氨基酸的突变型aroG基因导入宿主，从而获得芳香族生产氨基酸生产菌(EP0488424)。此外，分支酸变位酶-预苯酸脱水酶(chorismate mutase-prephenate dehydratase)也受到芳香族氨基酸的反馈抑制，因此可以对其进行修饰，以使其不受反馈抑制。
此外，作为与支链氨基酸合成相关的基因，可以列举出ilvGMEDA操纵子。该操纵子受L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸的表达调控(弱化)，因此，通过使微生物携带除去或突变了弱化所必需的区域的ilvGMEDA操纵子，能够提高微生物的L-氨基酸生产性能。
芳香族氨基酸、支链氨基酸分别共享生物合成系统，因此优选使用除目的L-氨基酸以外的芳香族氨基酸、支链氨基酸的固有生物合成系统减弱的菌株。例如，当目的氨基酸为L-色氨酸时可以通过减弱L-苯丙氨酸、L-酪氨酸的固有生物合成系统，当目的氨基酸为L-苯丙氨酸时可以通过减弱L-色氨酸、L-酪氨酸的固有生物合成系统，当目的氨基酸为L-缬氨酸时可以通过减弱L-亮氨酸、L-异亮氨酸的固有生物合成系统，当目的氨基酸为L-异亮氨酸时可以通过减弱L-缬氨酸、L-亮氨酸的固有生物合成系统，当目的氨基酸为L-亮氨酸时可以通过减弱L-缬氨酸、L-异亮氨酸的固有生物合成系统，来获得高效生产目的L-氨基酸的菌株。可以通过下述方法实现减弱生物合成系统的目的：对编码该生物合成系统的酶的基因导入突变；或者使用由希望减弱的生物合成系统合成的L-氨基酸的合成培养基来获得需要该L-氨基酸的菌株。
以下，示例出赋予L-氨基酸生产能力的方法以及可在本发明中使用的赋予了L-氨基酸生产能力的微生物。
L-色氨酸生产菌
作为L-色氨酸生产菌和用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的例子，可以列举出下列属于埃希氏菌属的菌株，但不限于此：大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)(美国专利第5,756,345号)，它们缺损了由突变trpS基因编码的色氨酰-tRNA合成酶；大肠杆菌AGX 17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRLB-12264)(美国专利第4,371,614号)，它们缺损了色氨酸酶；大肠杆菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps(WO9708333，美国专利第6,319,696号)，其中磷酸烯醇丙酮酸生产能力增强；等等。此外，还可以使用下述属于埃希氏菌属的L-色氨酸生产菌，其中由yedA或yddG基因编码的蛋白的活性增强(美国专利申请公开2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
作为L-色氨酸生产菌或用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株，可以列举出以下酶中一种或多种的活性增强的菌株：即邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)或色氨酸合酶(trpAB)。由于邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶均受到L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因而可以在这些酶中导入使反馈抑制脱敏(desensitize)的突变。这种菌株的具体实例是大肠杆菌SV164(其携带脱敏的邻氨基苯甲酸合酶)，以及将含有突变serA基因的质粒pGH5导入大肠杆菌SV164而得到的SV164(pGH5)，所述突变serA基因编码反馈抑制脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶。
上述大肠杆菌SV164(trpE8)是通过在trpE缺陷型菌株大肠杆菌KB862(DSM7196)中引入编码脱敏了反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶的突变型trpE基因而获得的菌株(参见WO94/08031，特表平7-507693)。大肠杆菌SV164(pGH5)是通过将含有突变型serA5基因的质粒pGH5(WO94/08031)导入SV164株而得到的，所述突变型serA5基因编码脱敏了丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶。大肠杆菌SV164(pGH5)不仅生产L-色氨酸，还生产L-丝氨酸(美国专利7,045,320)。
上述大肠杆菌KB862命名为AJ13828，于2000年12月21日基于布达佩斯条约国际作为国际保藏保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency ofIndustrial Science and Technology(现为独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(independent administrative agency，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，International Patent OrganismDepositary)，305-8566号邮政信箱，日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan))，保藏号为FERM BP-7405。
此外，作为L-色氨酸生产菌或用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的例子，可以列举出：增强了3-磷酸丝氨酸磷酸化酶(serB)活性的菌株(美国专利4,371,614)、增强了磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pckA)活性的菌株(WO2004/090125)、组成型表达马来酸合酶-异柠檬酸裂合酶-异柠檬酸脱氢酶-激酶/磷酸酶操纵子(ace操纵子)或者增强了该操纵子的表达的菌株(WO2005/103275)。
作为L-色氨酸生产菌或用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的例子，可以列举出：用含有编码抑制被脱敏的邻氨基苯甲酸合酶(trpAB)的基因的色氨酸操纵子转化的菌株(特开昭57-71397号、特开昭62-244382号、美国专利No.4,371,614)。另外，在色氨酸操纵子中，能够通过增强编码色氨酸合酶的基因(trpBA)的表达来赋予产生L-色氨酸的能力。色氨酸合酶由α和β亚基组成，其分别由trpA和trpB基因编码(WO2005/103275)。另外，可以通过增强异柠檬酸裂合酶-苹果酸合酶(マレ一トシンタ一ゼオペロン)操纵子的表达来改善L-色氨酸生产能力(WO2005/103275)。
作为棒状杆菌型细菌，可以使用磺胺胍(sulfaguanidine)抗性株谷氨酸棒状杆菌AJ12118(FERM BP-478)，日本专利01681002)、用色氨酸操纵子导入的棒状杆菌型细菌(特开S63240794号公报)，用编码棒状杆菌型细菌来源的莽草酸激酶的基因导入的棒状杆菌型细菌(特开01994749号公报)。
L-苯丙氨酸生产菌
作为L-苯丙氨酸生产菌或用于衍生L-苯丙氨酸生产菌的亲本株的例子，可以列举出下列属于埃希氏菌属的菌株，但不限于此：大肠杆菌AJ12479(FERM BP-4796)(EP1484410A，参见实施例2)，大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPM B-8197)，携带有突变pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC 55371)(美国专利5,354,672)，大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681)，大肠杆菌NRRL B-12141，NRRL B-12145，NRRL B-12146和NRRL B-12147(美国专利4,407,952)。此外，作为亲本株，还可以使用大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB(FERM BP-3566)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)和命名为AJ12604(FERM BP-3579)的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB]。而且，还可以使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白的活性增强的属于埃希氏菌属的L-苯丙氨酸-生产菌(美国专利申请公开2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
作为产苯丙氨酸棒状杆菌型细菌，可以使用：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或丙酮酸激酶活性减弱的谷氨酸棒状杆菌BPS-13(FERM BP-1777)，K77(FERM BP-2062)，和K78(FERM BP-2063)(欧洲专利公开公报No.331145，JP02303495)，以及酪氨酸营养缺陷株(JP05049489)等。
作为苯丙氨酸生产菌，通过进行修饰使得将副产物摄入细胞内，例如通过增加L-色氨酸摄取基因tnaB或mtr、或者L-酪氨酸摄取基因tyrP的表达量，也可以获得有效地生产L-苯丙氨酸的菌株(EP1484410)。
L-酪氨酸生产菌
作为酪氨酸生产菌的例子，包括具有脱敏的预苯酸脱水酶基因(tyrA)的埃希氏菌属细菌，该基因的表达产物脱敏于色氨酸的抑制(欧洲专利申请公开公报No.1616940)。
L-缬氨酸生产菌
作为L-缬氨酸生产菌或用于衍生L-缬氨酸生产菌的亲本株的例子，可以列举出下列菌株，但不限于此：经过修饰使得过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利5,998,178)。优选除去ilvGMEDA操纵子的弱化所必需的区域，使得该操纵子的表达不因产生的L-缬氨酸而减弱。而且，优选破坏操纵子的ilvA基因，使得苏氨酸脱氨酶活性降低。
作为用于衍生L-缬氨酸生产菌的亲本株的例子，还可以列举出氨基酰基t-RNA合成酶存在突变的突变菌株(美国专利5,658,766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，该菌株的编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中有突变。大肠杆菌VL1970于1988年6月24日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM)(1Dorozhny proezd.，1Moscow 117545，Russia)，保藏号为VKPM B-4411。
而且，生长需要硫辛酸和/或缺失H+-ATPase的突变株也可以用作亲本株(WO96/06926)。
作为棒状杆菌型细菌中的L-缬氨酸生产菌，例如有通过修饰而增强了编码L-缬氨酸生物合成酶的基因的表达的菌株。L-缬氨酸生物合成酶的实例包括由ilvBNC操纵子编码的酶，即，由ilvBN编码的乙酰羟酸合成酶和由ilvC编码的异构还原酶(isomero-reductase)(WO00/50624)。由于ilvBNC操纵子受到L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸的转录调控(transcriptional regulation)，所以最好解除弱化，以避免作为产物的L-缬氨酸的转录抑制。
可以通过减少或消除至少一种酶的活性将产生L-缬氨酸的能力赋予棒状杆菌型细菌，所述酶与减少L-缬氨酸的产生的物质代谢途径相关。例如，可以通过减少涉及异亮氨酸合成的苏氨酸脱水酶的活性，或通过减少涉及D-泛酸合成的酶的活性赋予产生L-缬氨酸的能力(国际公开小册子WO00/50624号)。
也可以通过将对氨基酸类似物等的抗性赋予棒状杆菌型细菌来赋予产生L-缬氨酸的能力。
实例包括例如，可以使用对于L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸是营养缺陷的，并对D-核糖、嘌呤核糖核苷或嘧啶核糖核苷有抗性的产生L-缬氨酸的突变菌株(FERM P-1841，FERM P-29，特公昭53-025034)，对聚酮化合物有抗性的产生L-缬氨酸的突变菌株(FERM P-1763，FERM P-1764；特公平06-065314)，在含醋酸为唯一碳源的培养基中对L-缬氨酸有抗性、且在含葡萄糖为唯一碳源的培养基中对丙酮酸类似物如氟丙酮酸(fluoropyruvic acid)敏感的产生L-缬氨酸的突变菌株(FERM BP-3006，BP-3007，专利3006929号)。
L-异亮氨酸生产菌
作为L-异亮氨酸生产菌或用于衍生L-异亮氨酸生产菌的亲本株的例子，包括可以列举出下列菌株，但不限于此：对6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突变体(特开平5-304969A)，对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸具有抗性的突变体，以及额外对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变体(特开平5-130882号)。此外，还可以使用以编码涉及L-异亮氨酸生物合成的蛋白(如苏氨酸脱氨酶和乙酰羟酸合酶(acetohydroxate synthase))的基因转化的重组菌株(特开平2-458A、FR 0356739和美国专利第5,998,178号)。
棒状杆菌型细菌中的L-异亮氨酸生产菌的例子包括：扩增了编码支链氨基酸分泌蛋白的brnE基因的棒状杆菌型细菌(特开2001-169788)、通过与L-赖氨酸生产菌进行原生质体融合而赋予了L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌(特开昭62-74293)、增强了高丝氨酸脱氢酶的棒状杆菌型细菌(特开昭62-91193)、苏氨酸氧肟酸(threonine hydroxamete)抗性菌株(特开昭62-195293)、α-酮丙二酸(α-ketomalonic acid)抗性菌株(特开昭61-15695)和甲基赖氨酸抗性菌株(特开昭61-15696)。
L-亮氨酸生产菌
作为L-亮氨酸生产菌或用于衍生L-亮氨酸生产菌的亲本株的例子，可以列举出下列属于埃希氏菌属的菌株，但不限于此：对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株57(VKPM B-7386，美国专利第6,124,121号))或对亮氨酸类似物(包括β-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸)有抗性的大肠杆菌菌株(特公昭62-34397号和特开平8-70879号)；通过WO96/06926中描述的遗传工程方法获得的大肠杆菌菌株；大肠杆菌H-9068(特开平8-70879号)，等等。
可以通过增强涉及L-亮氨酸生物合成的一个或多个基因的表达来改进本发明的细菌。这些基因的实例包括leuABCD操纵子中的基因，所述操纵子优选地由经过突变的leuA基因代表，该基因编码对L-亮氨酸反馈抑制具有脱敏性的异丙基苹果酸合酶(美国专利第6,403,342号)。此外，可以通过增强编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的一个或多个基因的表达来改进本发明的细菌。这类基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。
棒状杆菌型细菌中的L-亮氨酸-生产菌的例子包括：2-噻唑丙氨酸和β-羟基亮氨酸抗性菌株(特开平8-266295)，缬氨酸类似物抗性菌株(特开昭63-248392)，缬氨酸营养缺陷菌株(特公昭38-4395)，S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)抗性菌株(特公昭51-37347)和苯丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸营养缺陷菌株(特公昭54-36233)。
L-谷氨酸生产菌
作为L-谷氨酸生产菌的优选实例包括，但不限于，编码L-谷氨酸生物合成相关酶的一个或多个基因的表达增强的菌株。所述基因的实例包括，但不限于，编码如下酶的基因：谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、乌头酸水合酶(acnA，acnB)、柠檬酸合酶(citrate synthase；gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF，lpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA，pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA，pfkB)和葡糖磷酸异构酶(pgi)，等等。
经修饰以使柠檬酸合成酶(citrate synthetase)基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、异柠檬酸脱氢酶基因、丙酮酸脱氢酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达增强的菌株的实例包括在EP1078989A、EP955368A和EP952221A、EP1033407A中公开的那些菌株。
用于赋予L-谷氨酸生产能力的修饰，还可以通过将下述酶的活性减少或去除来实现，所述酶催化反应，所述反应产生除L-谷氨酸外的化合物，并且从L-谷氨酸生物合成途径中分支。这类催化从L-谷氨酸生物合成途径中分支并产生除L-谷氨酸外的化合物的反应的酶的实例包括异柠檬酸裂合酶，α-酮戊二酸脱氢酶，乙酰羟酸合酶(acetohydorxy acid synthase)，乙酰乳酸合酶，甲酸乙酰转移酶，乳酸脱氢酶，谷氨酸脱羧酶，1-吡咯啉-5-羧酸盐脱氢酶(1-pyrroline-5-carboxilate dehydrogenase)等。
例如，可以通过使用编码α-酮戊二酸脱氢酶的Elo亚基的sucA(odhA)基因来进行修饰，从而降低α-酮戊二酸脱氢酶的活性。α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的菌株包括例如如下菌株：
乳发酵短杆菌ΔS菌株(WO 95/34672)
乳发酵短杆菌AJ12821(FERM BP-4172；FR 9401748A)
黄色短杆菌AJ12822(FERM BP-4173；FR 9401748A)
谷氨酸棒杆菌AJ12823(FERM BP-4174；FR 9401748A)
Pantoea ananatis AJ 13601(FERM BP-7207)
植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)AJ13410菌株(FERM BP-6617)
Pantoea ananatis AJ13355(FERM BP-6614)
这里，Pantoea ananatis AJ13356因αKGDH-E1亚基基因(sucA)的损坏而在α-酮戊二酸脱氢酶活性上有缺陷。该菌株在分离时被鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)，作为成团肠杆菌AJ13356进行了保藏。但是，基于16S rRNA核苷酸测序等，其被重新分类为Pantoea ananatis。尽管AJ13356在上述保藏机构中是作为成团肠杆菌保藏的，而在本说明书中描述为Pantoea ananatis。
此外，可以通过下述方法赋予棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力：扩增yggB基因(NCgl 1221；NP_600492.Reports small-conductance.[gi：19552490]；WO2006/070944)的方法，和引入在其编码区中导入突变的突变yggB基因的方法。
可以使用另外的方法赋予或增强L-谷氨酸产生能力，这些方法包括赋予对有机酸类似物、呼吸链抑制剂等的抗性的方法，和赋予对细胞壁合成抑制剂的敏感性的方法。这类方法的实例包括赋予单氟乙酸抗性的方法(特开昭50-113209)、赋予腺嘌呤或胸腺嘧啶抗性的方法(特开昭57-065198)、削弱脲酶的方法(特开昭52-038088)、赋予丙二酸抗性的方法(特开昭52-038088)、赋予苯并吡喃酮或萘醌抗性的方法(特开昭56-1889)、赋予HOQNO抗性的方法(特开昭56-140895)、赋予α-酮丙二酸抗性的方法(特开昭57-2689)、赋予胍抗性的方法(特开昭56-35981)和赋予青霉素敏感性的方法(特开平4-88994)等等。
这些抗性菌株的具体实例包括如下菌株：
黄色短杆菌AJ3949(FERM BP-2632；参考特开昭50-113209)
谷氨酸棒杆菌AJ11628(FERM P-5736；参考特开昭57-065198)
黄色短杆菌AJ11355(FERM P-5007；参考特开昭56-1889)
谷氨酸棒杆菌AJ11368(FERM P-5020；参考特开昭56-1889)
黄色短杆菌AJ11217(FERM P-4318；参考特开昭57-2689)
谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERM P-4319；参考特开昭57-2689)
黄色短杆菌AJ11564(FERM P-5472；参考特开昭56-140895)
黄色短杆菌AJ11439(FERM P-5136；参考特开昭56-35981)
谷氨酸棒杆菌H7684(FERM BP-3004；参考特开平04-88994)
乳发酵短杆菌AJ11426(FERM P-5123；参考特开平56-048890)
谷氨酸棒杆菌AJ11440(FERM P-5137；参考特开平56-048890)
乳发酵短杆菌AJ11796(FERM P-6402；参考特开平58-158192)
用于本发明的L-苏氨酸生产菌优选实例是属于肠杆菌科的细菌，其中已将所述L-苏氨酸生物合成系统酶的一种或多种活性增强。编码L-苏氨酸生物合成酶的基因的实例包括天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、编码thr操纵子的天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)和苏氨酸合酶基因(thrC)。可引入这些基因中的两种以上。可将L-苏氨酸生物合成酶的编码基因引入已将苏氨酸分解受阻抑的肠杆菌科的细菌。已将苏氨酸分解受阻抑的埃希氏菌属的细菌实例包括例如将苏氨酸脱氢酶活性缺失的TDH6菌株(特开2001-346578)等等。
某些L-苏氨酸生物合成酶的活性受终产物(endo product)L-苏氨酸抑制。因此，为了构建L-苏氨酸生产菌，优选对L-苏氨酸生物合成酶进行修饰以使所述酶脱敏于L-苏氨酸的反馈抑制。上述thrA、thrB和thrC基因组成苏氨酸操纵子，所述操纵子具有弱化子(attenuator)结构。苏氨酸操纵子的表达受到培养液中异亮氨酸和苏氨酸的抑制，并且受到弱化作用的抑制。可通过去除弱化区中的前导序列或弱化子来实现消除或降低弱化作用(Lynn，S.P.，Burton，W.S.，Donohue，T.J.，Gould，R.M.，Gumport，R.I.，和Gardner，J.F.J.，Mol.Biol.194：59-69(1987)；WO02/26993；WO2005/049808)。
可将位于苏氨酸操纵子上游的天然启动子用非天然启动子取代(参考WO 98/04715号小册子)。或者，可将苏氨酸操纵子而使苏氨酸生物合成中涉及的基因的表达受到λ噬菌体的阻抑物和启动子的调控(参考欧洲专利第0593792号说明书)。而且脱敏于L-苏氨酸的反馈抑制的突变埃希氏菌属细菌的修饰也可通过选择α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)抗性的细菌菌株来获得。
如上所述优选在宿主微生物中增加经修饰而使得脱敏于L-苏氨酸的反馈抑制的苏氨酸操纵子的拷贝数，或通过将修饰的操纵子连接至强启动子以增加其表达量。除了通过使用质粒扩增来增加所述基因的拷贝数，还可通过使用转座子、Mu噬菌体等在基因组上转入苏氨酸操纵子来增加基因的拷贝数。
对于编码天冬氨酸激酶III的基因(lysC)，优选的是将其修饰以使所述酶脱敏于L-赖氨酸的反馈抑制。能够使用在美国专利No.5,932,453中描述的方法获得经修饰以防止反馈抑制的lysC基因。
期望的是，除了L-苏氨酸生物合成酶外将糖酵解系统、TCA循环和呼吸链中涉及的基因、调控这些基因表达的基因、诱导糖摄取的基因增强。在L-苏氨酸产生中有效的这些基因的实例包括转氢酶基因(pntAB)(欧洲专利733712号说明书)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(pepC)(国际公开95/06114号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(欧洲专利877090号说明书)和棒状杆菌型细菌或芽孢杆菌属细菌中的丙酮酸羧化酶基因(国际公开99/18228号小册子、欧洲申请公开1092776号说明书)。
生产L-苏氨酸的细菌还优选通过下述获得：增强赋予对L-苏氨酸的抗性的基因和/或赋予对L-高丝氨酸的抗性的基因的表达，或赋予宿主L-苏氨酸抗性和/或L-高丝氨酸抗性。这些基因的实例是rhtA基因(Res Microbiol.2003Mar；154(2)：123-135)、rhtB基因(欧洲专利申请公开第0994190号说明书)、rhtC基因(欧洲专利申请公开第1013765号说明书)和yfiK、yeaS基因(欧洲专利申请公开第1016710号说明书)。对于赋予宿主L-苏氨酸抗性的方法，可参考欧洲专利申请公开第0994190号说明书、国际公开第90/04636号小册子记载的方法。
产生L-苏氨酸的细菌另外的实例是大肠杆菌VKPM B-3996菌株(美国专利No.5,175,107)。这种VKPM B-3996菌株在1987年11月19日以登录号VKPM B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(the Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms(VKPM)，GNII Genetika)(住所：Russia，117545Moscow，1Dorozhny Proezd，1)。此外，VKPM B-3996菌株含有质粒pVIC40(WO90/04636)，所述质粒pVIC40通过将苏氨酸生物合成基因(苏氨酸操纵子：thrABC)插入包含链霉素抗性标记的广宿主(wide-host)质粒载体pAYC32中而获得(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.，Plasmid，1986，16，161-167)。在这种pVIC40中，苏氨酸操纵子含有突变的thrA基因，其编码对苏氨酸的反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I。
进一步的实例是大肠杆菌VKPM B-5318菌株(参考欧洲专利第0593792号说明书)。VKPM B-5318菌株在1990年5月3日以登录号VKPM B-5318保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，GNII Genetika。这种VKPMB-5318菌株是异亮氨酸非营养缺陷型菌株，并且携带重组质粒DNA，将所述重组质粒DNA构建成使苏氨酸操纵子，即苏氨酸生物合成中涉及的基因，即将弱化子区(其为天然包含的转录调节区)缺失的苏氨酸操纵子位于λ噬菌体温度敏感C1阻抑物、PR启动子和编码Cro蛋白N末端的基因的下游，并且苏氨酸生物合成中涉及的所述基因的表达由源于所述λ噬菌体阻抑物和启动子调控。
在本发明中使用的产生L-氨基酸的细菌中，除编码天然生物合成酶的基因之外，可将糖摄取、糖代谢(糖酵解系统)和能量代谢中涉及的基因增强。
糖代谢中涉及的基因的实例是编码糖酵解途径的酶的基因或糖摄取的基因，并包括编码葡糖-6-磷酸异构酶的基因(pgi；国际公开第01/02542号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps欧洲申请公开877090号说明书)、磷酸葡糖变位酶基因(pgm；国际公开03/04598号小册子)、果糖二磷酸醛缩酶基因(fbp；国际公开03/04664号小册子)、丙酮酸激酶基因(pykF；国际公开03/008609号小册子)、转醛醇酶(transaldolase)基因(talB；国际公开03/008611号小册子)、延胡索酸酶基因(fum；国际公开01/02545号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps；欧洲申请公开877090号小册子)、非-PTS蔗糖摄取基因(csc；欧洲申请公开149911号小册子)和蔗糖同化基因(scrAB操纵子；国际公开90/04636号小册子)。
编码能量代谢中涉及的酶的基因的实例包括转氢酶基因(pntAB；美国专利5,830,716号说明书)和细胞色素bo型氧化酶基因(cyoB；欧洲专利申请公开1070376号说明书)。
实施例
以下通过实施例具体说明本发明，但本发明不受以下实施例的限制。
参考例1：L-色氨酸生产细菌的构建
<1-1>serA基因的导入
使用转座子Mud将质粒pGH5(国际公开第9408031号小册子)上的磷酸甘油酸脱氢酶基因(serA)插入到基因组中。将包含MudII1734的质粒pCE1134(特开平2-109985号公报)用BamHI消化以除去包含lac操纵子的DNA片段，末端平滑化，并且插入SmaI接头。再次将该质粒用SmaI消化并将消化的质粒自身环化，将获得的质粒命名为pMu1134。通过用ScaI和SalI进行消化，将包含serA的DNA片段从包含大肠杆菌serA基因的质粒pGH5上切下来，末端平滑化，并插入到上述pMul134的SmaI位点，从而构建了质粒pMudserA，该质粒携带插入了源自pGH5的serA基因的Mud(命名为MudserA)。
以具有脱敏型邻氨基苯甲酸合成酶的L-色氨酸生产细菌SV164菌株(国际公开第94/08031号小册子)为受体菌株，按常规方法以赋予卡那霉素抗性为标记，使用pMudserA将MudserA转移到上述受体菌株的基因组上，得到了菌株L1。根据Southern杂交实验结果推测，L1菌株仅在一个位点有MudserA插入。此外，通过PCR对包含MudserA的基因组DNA片段进行克隆和核苷酸测序，从而鉴定出其插入到了大肠杆菌K-12基因组(GenBank登录号.U00096)的No.240,950的位置。
<1-2>trp操纵子的导入
然后，试图通过使用转座子将trp操纵子插入基因组，来增加trp操纵子的拷贝数。将trp操纵子基因从质粒pGX100上切下来。pGX100是通过具有脱敏型trpE基因的大肠杆菌MTR#2菌株的DNA片段插入pBR313而获得的质粒(美国专利第4,371,614号说明书)，通过XhoI和SmaI消化可从中切下包含trp操纵子的约7.6kb的DNA片段。通过XhoI和SmaI消化，将包含trp操纵子的DNA片段从pGX100上切下来，末端平滑化，并且将其插入上述pCE1134的SmaI位点。使用序列表中所示的引物SEQ ID NOS：1和2通过PCR，也可以从大肠杆菌MTR#2菌株基因组DNA中直接克隆相似的包含trp操纵子的DNA片段。如上所述，构建了质粒pMudtrpG′lac，该质粒携带插入了MTR#2菌株的trp操纵子基因的Mud(命名为MudtrpG′lac)。
在通过将MudtrpG′lac插入基因组来增加其拷贝数之前，出于利用乳糖同化能力的互补作为插入菌株的选择标记的目的，对宿主菌株赋予了乳糖同化能力缺陷的性质。通过源自L-苏氨酸生产细菌VKPM B-3996的ilvG基因的P1转导(美国专利第5,175,107号说明书)，对L1菌株赋予了L-缬氨酸抗性(参见国际公开WO2005/103228号小册子)。P1转导实验按常规方法进行，将细胞涂布在M9基本培养基(4g/L葡萄糖，12.8g/L Na2HPO4·7H2O，3g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，1g/L NH4Cl，5mM MgSO4，0.1mM CaCl2，1mg/L硫胺素，20mg/l L-Phe，20mg/L L-Tyr，20mg/L L-Met，3mg/L吡哆醇，20mg/L L-Val，20mg/L四环素)上，并且获取出现的菌落作为Val-抗性菌株，并命名为L1ValR。
由ME8581菌株(HfrH(valS←uxuAB):lacZ98::Tn10relA1thi-1，保藏于国立遗传学研究所)，按常规方法以源自Tn10的四环素抗性为标记，进行了将lacZ98::Tn10转入L1ValR中的P1转导。如预想的那样，所获得的菌株缺乏乳糖同化能力。然后，为了获得缺乏乳糖同化能力、且已消除了Tn10的菌株，通过复制由转导菌株获得了四环素敏感菌株14-1-lac-tets。该14-1-lac-tets菌株依然缺乏乳糖同化能力。当通过Southern杂交确认了该菌株的Tn10的状况时，未检出与tet基因杂交的条带，但检出了与Tn10的IS10区域杂交的条带，因此认为该菌株的lacZ基因上残存有IS10。
同化能力使用pMudtrpG′lac以常规方式将MudtrpG′lac转移到作为受体菌株的14-1-lac-tets菌株的基因组上，并使用乳糖利用能力的互补作为标记，得到了No.202菌株。当插入的转座子或转座子上的基因容易从所得转座子插入菌株上脱落时，可以将该菌株在营养培养基上传代培养，并可选择稳定显示卡那霉素抗性、乳糖同化能力等的菌株。根据Southern杂交实验结果，推测No.202菌株仅在一个位置具有MudtrpG′lac插入。此外，通过PCR对包含MudtrpG′lac的基因组DNA片段进行克隆和核苷酸测序，鉴定出：其插入到大肠杆菌K-12基因组(GenBank登录号U00096)的No.530,249位置。
然后，通过P1转导，将蔗糖利用性质相关基因scrK，scrY，scrA，scrB和scrR导入到No.202菌株中，并将该菌株命名为No.202scr(参见国际公开小册子WO90/04636号)。
<1-3>用于破坏iclR的质粒的构建
使用Pyrobest DNA Polymerase(宝酒造(Takara Shuzo))按其附带的说明书，采用PCR方法扩增了iclR片段。PCR反应中，以使用RNA/DNA MaxiKit(Quiagen)提取的W3110基因组作为模板，并以序列表SEQ ID NOS：3和4所示的寡核苷酸作为引物。PCR后，使用Wizard PCR Preps(Promega)纯化了扩增的DNA片段。将纯化的DNA片段用限制酶EcoRI和HindIII(宝酒造)消化，然后通过酚氯仿处理、乙醇沉淀进行了纯化。使用DNA ligationKit Ver.2(宝酒造)将该消化片段与用相同酶消化并纯化的pUC18(宝酒造)连接。用该连接反应液转化JM109感受态细胞(宝酒造)，并涂布于包含50μg/mL氨苄青霉素(Amp，明治制药(Meiji Seika))的LB琼脂平板(LB+Amp板)上，于37℃选择菌落。将菌落在包含50μg/mL Amp的LB培养基中于37℃在试管中进行培养，并使用自动质粒提取仪PI-50(Kurabo Industries)进行质粒提取。
将获得的质粒pUCiclR用EcoO65I(宝酒造)消化，然后使用BKL Kit(宝酒造)进行了末端平滑化和连接。用该连接反应液转化JM109，并如上所述进行菌落选择和质粒提取。将获得的质粒用EcoRI和HindIII进行消化，并进行纯化，然后与用相同酶消化并经过纯化的温度敏感质粒pTS1(通过重组pMAN031(J.Bacteriol.162，1196-1202(1985)，参见图1)和pBR322(宝酒造)的PstI-HindIII片段而获得)连接。用该连接反应液转化JM109，并于30℃在LB+Amp平板上选择菌落。将菌落在包含50μg/mL Amp的LB培养基中于30℃在试管中进行培养，并如上所述提取了质粒。将用EcoRI和HindIII消化后能够获得目的长度的片段的质粒作为iclR破坏用质粒pTSΔiclR。
<1-4>iclR破坏菌株的获得
用pTSΔiclR转化No.202scr菌株，并于30℃在LB+Amp平板上选择菌落。将选出的菌株于30℃液体培养过夜，然后稀释至10-3(diluted 10-3times)，接种于LB+Amp平板，并于42℃选择菌落。将选择的菌落于30℃涂布于LB+Amp平板，然后将1/8平板的菌体悬浮于2mL的LB培养基中，在42℃振荡培养4至5小时。将稀释至10-5的菌体接种于LB平板上，确认所得菌落中有数百个在LB平板和LB+Amp平板上生长，因此确认了Amp敏感性或抗性。对于氨苄青霉素敏感菌株，使用SEQ ID NOS：3和4的寡核苷酸作为引物进行菌落PCR，将扩增片段不能被EcoO65I消化的菌落作为iclR缺陷菌株(No.202ΔiclR)。
实施例1：L-色氨酸的生产
在LB-琼脂糖平板培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，1.5％琼脂糖)上接种一接种环的色氨酸生产细菌No.202ΔiclR的甘油保存液，并于30℃静置培养24小时。在装有50ml的LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠)的500-ml坂口(Sakaguchi)培养瓶中接种一接种环(约10μl)的上述培养菌体，于30℃振荡条件下(115rpm)进行7～8小时的前培养。
在具有表2所示组成的300ml种子培养基中接种上述前培养培养基1ml。使用总容积1L的小型发酵罐培养约14小时，培养条件为30℃、800rpm、同时通入1vvm的使用灭菌滤器灭菌的压缩空气。此外，培养中保持温度为30℃，并用氨气将pH保持在6.5。
表2：种子培养基组成
Figure A20078004569100301
Figure A20078004569100311
制备了通过将浓度为1.95g/L的甲基纤维素(MC：和光纯药工业株式会社(Wako Pure Chemical Industries，Co.，Ltd.)，″甲基纤维素100cP″)添加至300ml具有表3所示组成的主培养培养基而获得的培养基和300ml未添加MC的培养基，分别在其中接种种子培养液30ml。使用总容积1L的小型发酵罐进行主培养，培养条件为31℃、800rpm搅拌、同时通入1vvm的使用灭菌滤器灭菌的压缩空气。此外，培养中保持温度为31℃，并用氨气将pH保持在6.7。培养中，通过适宜地流加700g/L的葡萄糖溶液，将小型发酵罐内的糖浓度调控在5～20g/L。
表3：主培养基组成
Figure A20078004569100312
主培养进行49.5小时后，测定了培养基中的L-色氨酸浓度。基于糖的收率和生产速度示于表4。表4中所示的比率以未添加甲基纤维素的情况为1。其结果，与未添加甲基纤维素的情况相比，可以判定：添加甲基纤维素可以提高基于糖的收率和生产速度。
表4：主培养发酵结果
  未添加MC   添加了MC
  收率(％)   1   1.26
  生产速度(g/L/h)   1   1.33
培养结束后，利用HPLC分析了发酵液中的杂质，结果确认：当以未添加甲基纤维素的情况为1时，添加甲基纤维素的情况为0.637，除色氨酸以外的主要杂质的总量减少。
实施例2：L-苯丙氨酸的生产
在LB-琼脂糖平板培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，1.5％琼脂糖)上接种一接种环的苯丙氨酸生产细菌AJ12741(FERMBP-4796)的甘油保存液，并于37℃静置培养24小时。将一接种环(约10μl)的该培养菌体接种在500ml的LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠)中，并在振荡条件下(115rpm)于37℃进行7小时前培养。该AJ12741菌株是这样获得的菌株：在缺失tyrR和tyrA基因的大肠杆菌K-12W3110菌株中导入质粒pMGAL1，该质粒pMGAL1包含分别编码脱敏反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶、脱敏反馈抑制的分支酸变位酶-预苯酸脱水酶、和莽草酸激酶的基因(W3110(tyrR，tyrA)/pMGAL1，特许第3225597号公报)。该菌株于平成4年(1992年)6月11日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心)，305-8566号邮政信箱，日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，其保藏号为FERM P-13000。并且，平成6年(1994年)9月14日该原始保藏转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号为FERM BP-4796。
在具有表5所示组成的300ml种子培养基中接种上述前培养液1ml。使用总容积1L的小型发酵罐培养约14小时，培养条件为37℃、800rpm、同时通入1vvm的使用灭菌滤器灭菌的压缩空气。此外，培养中保持温度为37℃，并用氨气将pH保持在6.5。
表5：种子培养基组成
制备了通过将浓度为0.5g/L的甲基纤维素(MC：和光纯药工业株式会社，″甲基纤维素100cP″)添加至300ml具有表3所示组成的主培养培养基而获得的培养基和300ml未添加MC的培养基，分别在其中接种种子培养液30ml。使用总容量1L的小型发酵罐进行主培养，培养条件为37℃、800rpm搅拌、同时通入1vvm的使用灭菌滤器灭菌的压缩空气。此外，培养中保持温度为37℃，并用氨气将pH保持在7.0。培养中，通过适宜地流加700g/L的葡萄糖溶液，将小型发酵罐内的糖浓度调控在0～10g/L。在培养的第21小时后，向发酵罐中添加L-苯丙氨酸7g。
表6：主培养基组成
Figure A20078004569100332
主培养进行46小时后，测定了培养基中的L-苯丙氨酸浓度。基于糖的收率和生产速度示于表7。表7中所示的比率以未添加甲基纤维素的情况为1。其结果，与未添加甲基纤维素的情况相比，可以判定：添加甲基纤维素可以提高基于糖的收率和生产速度。
表7：主培养发酵的结果
  未添加MC   添加了MC
  收率(％)   1   1.07
  生产速度(g/L/h)   1   1.08
工业实用性
根据本发明，在使用具有L-氨基酸生产能力的微生物的、通过发酵法进行的L-氨基酸的生产方法中，可以改善L-氨基酸的生产性能，和/或可以减少析出到培养基中的L-氨基酸的晶体中的杂质。L-氨基酸的生产性能包括基于糖的收率的提高和/或生产速度的提高。
序列表
<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)
<120>L-氨基酸的生产方法
<130>C871-C7227
<150>JP2006-276659
<151>2006-10-10
<160>4
<170>PatentIn version    3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>1
gggttaattg tttttctgcg    20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>2
cgcatctcga ctgcacggtg    20
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>3
gccgaattca agtgtgtgaa gtgtatg    27
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>4
gccaagcttc cgacacgctc aacccag    27

Claims (9)

1.一种通过发酵法生产L-氨基酸的方法，该方法包括在液体培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的微生物，并在使L-氨基酸析出到所述培养基中的同时在所述培养基中积累L-氨基酸，其中，所述培养基中包含选自下组的聚合物：水溶性纤维素衍生物、水溶性聚乙烯基化合物、能溶于极性有机溶剂的聚乙烯基化合物、水溶性淀粉衍生物、海藻酸盐和聚丙烯酸盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述聚合物选自下组：羧甲基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基纤维素邻苯二甲酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩乙醛二乙胺乙酸酯、海藻酸钠和聚丙烯酸钠。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述微生物为属于肠杆菌科的细菌或棒状杆菌型细菌。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述属于肠杆菌科的微生物是属于埃希氏菌属或泛菌属的细菌。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述L-氨基酸选自下组：L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-苏氨酸和L-谷氨酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述聚合物为甲基纤维素，并且所述液体培养基中含有1g/L以上的甲基纤维素。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述L-氨基酸为L-苯丙氨酸。
8.一种α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯的生产方法，该方法包括根据权利要求7所述的方法生产L-苯丙氨酸、以及由天冬氨酸或其衍生物和得到的L-苯丙氨酸，来合成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯。
9.根据权利要求8所述的方法，该方法还包括：将L-苯丙氨酸酯化为L-苯丙氨酸的低级烷基酯，然后使该L-苯丙氨酸的低级烷基酯与作为所述天冬氨酸衍生物的N-酰基-L-天冬氨酸酐缩合，并从该反应混合物中分离出N-酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯，再对N-酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯进行氢化，从而生成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸的低级烷基酯。
CN200780045691.5A 2006-10-10 2007-09-06 L-氨基酸的生产方法 Active CN101558163B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP276659/2006 2006-10-10
JP2006276659A JP2010017082A (ja) 2006-10-10 2006-10-10 Ｌ−アミノ酸の製造法
PCT/JP2007/067440 WO2008044409A1 (en) 2006-10-10 2007-09-06 Method for production of l-amino acid

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101558163A true CN101558163A (zh) 2009-10-14
CN101558163B CN101558163B (zh) 2014-11-05

Family

ID=39282618

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200780045691.5A Active CN101558163B (zh) 2006-10-10 2007-09-06 L-氨基酸的生产方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8859243B2 (zh)
EP (1) EP2080808B1 (zh)
JP (1) JP2010017082A (zh)
CN (1) CN101558163B (zh)
BR (1) BRPI0717826B1 (zh)
DK (1) DK2080808T3 (zh)
ES (1) ES2800999T3 (zh)
PL (1) PL2080808T3 (zh)
WO (1) WO2008044409A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105695383A (zh) * 2016-03-02 2016-06-22 廊坊梅花生物技术开发有限公司 重组菌株及其应用
CN106086099A (zh) * 2016-08-27 2016-11-09 河北圣雪大成制药有限责任公司 L‑缬氨酸发酵培养基及用其生产l‑缬氨酸的发酵方法
CN108484423A (zh) * 2018-07-05 2018-09-04 秦皇岛华恒生物工程有限公司 一种从l-丙氨酸发酵液中分离纯化l-丙氨酸的方法
CN113046398A (zh) * 2021-05-18 2021-06-29 通辽梅花生物科技有限公司 一种稳定高效生产l-异亮氨酸的发酵方法及发酵稳定剂
CN114015632A (zh) * 2020-12-01 2022-02-08 廊坊梅花生物技术开发有限公司 产l-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7992293B2 (en) * 2006-04-04 2011-08-09 Hanita Coatings R.C.A. Ltd Method of manufacturing a patterned conductive layer
US20090165296A1 (en) * 2006-04-04 2009-07-02 Yoash Carmi Patterns of conductive objects on a substrate and method of producing thereof
KR101843586B1 (ko) * 2012-05-23 2018-03-30 에스케이이노베이션 주식회사 탄소원 기질과 염기의 유가식 공급에 의한 유기산 제조 방법
WO2016133134A1 (ja) * 2015-02-17 2016-08-25 味の素株式会社 有機化合物又は微生物の製造システム及び製造方法
CN106591209A (zh) * 2016-12-29 2017-04-26 廊坊梅花生物技术开发有限公司 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法
CN107227324A (zh) * 2017-08-07 2017-10-03 天津科技大学 一种谷氨酸发酵工艺
CN109402039B (zh) * 2018-10-16 2020-12-29 江南大学 一种强化MutS型毕赤酵母表达异源蛋白的方法
CN113151000B (zh) * 2021-01-21 2022-06-03 大连民族大学 一株海洋真菌及其在生产邻苯二甲酸二丁酯中的应用

Family Cites Families (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS384395B1 (zh) 1959-01-14 1963-04-24
US3786039A (en) 1969-04-30 1974-01-15 Ajinomoto Kk Method of producing alpha-l-aspartyl-l-phenylalanine lower alkyl esters
JPS50113209A (zh) 1974-02-13 1975-09-05
JPS5222417B2 (zh) 1974-09-26 1977-06-17
JPS51113841A (en) 1975-03-28 1976-10-07 Ajinomoto Co Inc Process for preparing lower alkyl esters of n-formyl-alpha -l-aspartyl-l-phenylalanine
JPS5238088A (en) 1975-09-19 1977-03-24 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid
JPS5325034A (en) 1976-08-19 1978-03-08 Fujii Denko Anti precipitation device for horizontal movement
JPS6033104B2 (ja) 1977-08-22 1985-08-01 住友化学工業株式会社 スレオ−３−（３，４−ジベンジルオキシフエニル）−ｎ−カルボベンジルオキシ−セリンの光学活性体の取得方法
JPS561890A (en) 1979-06-15 1981-01-10 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-phenylalanine by fermentation
JPS561889A (en) 1979-06-20 1981-01-10 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid by fermentation
JPS5832596B2 (ja) 1979-08-10 1983-07-14 味の素株式会社 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造方法
JPS5810075B2 (ja) 1979-08-31 1983-02-24 味の素株式会社 新規変異株
JPS56140895A (en) 1980-04-02 1981-11-04 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid by fermentation
JPS572869A (en) 1980-06-10 1982-01-08 Tohoku Electric Power Co Inc Austenite stainless steel for hot corrosive environment
US4371614A (en) 1980-08-22 1983-02-01 Ajinomoto Co., Inc. E.Coli bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-tryptophan
JPS5765198A (en) 1980-10-09 1982-04-20 Ajinomoto Co Inc Fermentative production of l-glutamic acid
JPS572689A (en) 1981-03-23 1982-01-08 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid
JPS58158192A (ja) 1982-03-15 1983-09-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造方法
JPS58219213A (ja) 1982-06-15 1983-12-20 Toyo Tire & Rubber Co Ltd ポリウレタン水性分散溶液
JPS60137298A (ja) 1983-12-23 1985-07-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法
JPS60237054A (ja) 1984-05-10 1985-11-25 Nippon Kayaku Co Ltd アミノ酸の晶析法
JPS6115696A (ja) 1984-06-29 1986-01-23 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法
JPS6115695A (ja) 1984-06-29 1986-01-23 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造方法
JPH0724591B2 (ja) 1984-09-27 1995-03-22 味の素株式会社 組換えｄｎａを有するコリネ型細菌を用いる芳香族アミノ酸の製造法
JPS62288A (ja) 1985-03-09 1987-01-06 Sanraku Inc 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造方法
JPS6291193A (ja) 1985-06-05 1987-04-25 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Ｌ−スレオニンおよびｌ−イソロイシンの製造法
JPS6234397A (ja) 1985-08-08 1987-02-14 Mitsubishi Electric Corp ダイナミツクメモリ装置
JPS6274293A (ja) 1985-09-28 1987-04-06 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Ｌ−イソロイシンの製造法
JPS62195293A (ja) 1986-02-22 1987-08-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法
JPH06102024B2 (ja) 1986-04-16 1994-12-14 味の素株式会社 新規プロモーター及び該プロモーターを用いた遺伝子発現方法
JP2520895B2 (ja) 1987-03-04 1996-07-31 旭化成工業株式会社 Ｌ―グルタミン酸の製造方法
KR890003681B1 (ko) 1987-03-26 1989-09-30 주식회사 미원 미생물에 의한 l-페닐 알라닌의 제조방법
JPS63240794A (ja) 1987-03-30 1988-10-06 Ajinomoto Co Inc Ｌ−トリプトフアンの製造法
JPH0644871B2 (ja) 1987-04-06 1994-06-15 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ−ロイシンの製造法
JP2536570B2 (ja) 1987-10-12 1996-09-18 味の素株式会社 発酵法によるｌ―イソロイシンの製造法
FR2627508B1 (fr) 1988-02-22 1990-10-05 Eurolysine Procede pour l'integration d'un gene choisi sur le chromosome d'une bacterie et bacterie obtenue par ledit procede
JP2578488B2 (ja) 1988-03-04 1997-02-05 協和醗酵工業株式会社 アミノ酸の製造法
JP2748418B2 (ja) 1988-08-03 1998-05-06 味の素株式会社 組換えｄｎａ、該組換えｄｎａを有する微生物
WO1990004636A1 (en) 1988-10-25 1990-05-03 Vsesojuzny Nauchno-Issledovatelsky Institut Genetiki I Selektsii Promyshlennykh Mikroorganizmov (Vniigenetika) Strain of bacteria escherichia coli, producer of l-threonine
JP2810697B2 (ja) 1989-05-17 1998-10-15 協和醗酵工業株式会社 芳香族アミノ酸の製造法
JPH0488994A (ja) 1990-07-30 1992-03-23 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるｌ―グルタミン酸の製造法
DE69133342T2 (de) 1990-11-30 2004-07-22 Ajinomoto Co., Inc. Rekombinante DNS-Sequenzen kodierend für Enzyme frei von Feedback-Inhibition, Plasmide, die diese Sequenzen enthalten, transformierte Mikroorganismen, nützlich für Produktion aromatischer Aminosäuren, und deren Verfahren zur Herstellung durch Fermentation
BE1008008A3 (fr) 1990-11-30 1995-12-12 Ajinomoto Kk Procede et appareil pour regler la concentration en source de carbone dans la culture aerobie d'un micro-organisme.
US5168056A (en) 1991-02-08 1992-12-01 Purdue Research Foundation Enhanced production of common aromatic pathway compounds
US5534421A (en) 1991-05-30 1996-07-09 Ajinomoto Co., Inc. Production of isoleucine by escherichia coli having isoleucine auxotrophy and no negative feedback inhibition of isoleucine production
JPH0549489A (ja) 1991-08-22 1993-03-02 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法
JPH0576463A (ja) 1991-09-24 1993-03-30 Sekisui Chem Co Ltd 浴槽ならびに浴室ユニツト
JP3036930B2 (ja) 1991-11-11 2000-04-24 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法
US5856148A (en) 1991-12-12 1999-01-05 Wacker Chemie Gmbh Materials and methods for biosynthesis of serine and serine-related products
TW313589B (zh) 1991-12-12 1997-08-21 Wacker Chemie Gmbh
IT1262934B (it) 1992-01-31 1996-07-22 Montecatini Tecnologie Srl Componenti e catalizzatori per la polimerizzazione di olefine
JP3151073B2 (ja) 1992-02-25 2001-04-03 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるアミノ酸の製造法
JP3225597B2 (ja) 1992-06-15 2001-11-05 味の素株式会社 発酵法によるｌ−フェニルアラニンの製造法
DE4232468A1 (de) 1992-09-28 1994-03-31 Consortium Elektrochem Ind Mikroorganismen für die Produktion von Tryptophan und Verfahren zu ihrer Herstellung
EP0593792B2 (en) 1992-10-14 2004-01-07 Ajinomoto Co., Inc. Novel L-threonine-producing microbacteria and a method for the production of L-threonine
JPH0777689B2 (ja) 1992-11-24 1995-08-23 三菱マテリアル株式会社 スローアウェイチップ
US5354672A (en) 1992-11-24 1994-10-11 Ian Fotheringham Materials and methods for hypersecretion of amino acids
US5776736A (en) 1992-12-21 1998-07-07 Purdue Research Foundation Deblocking the common pathway of aromatic amino acid synthesis
SK283369B6 (sk) 1993-08-24 2003-06-03 Ajinomoto Co., Inc. Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza, mikroorganizmus, rekombinantná DNA a spôsob výroby aminokyseliny
AU687458B2 (en) 1993-10-28 1998-02-26 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing substance
US5998178A (en) 1994-05-30 1999-12-07 Ajinomoto Co., Ltd. L-isoleucine-producing bacterium and method for preparing L-isoleucine through fermentation
WO1995034672A1 (fr) 1994-06-14 1995-12-21 Ajinomoto Co., Inc. GENE A DESHYDROGENASE α-CETOGLUTARIQUE
JP3698758B2 (ja) 1994-06-30 2005-09-21 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ−ロイシンの製造法
CN1124340C (zh) 1994-08-30 2003-10-15 味之素株式会社 L－缬氨酸和l－亮氨酸的生产方法
US5985617A (en) 1997-02-18 1999-11-16 Liao; James C. Microorganisms and methods for overproduction of DAHP by cloned PPS gene
WO1996008567A1 (en) 1994-09-16 1996-03-21 Texas A & M University System Microorganisms and methods for overproduction of dahp by cloned pps gene
JP3704737B2 (ja) * 1995-03-30 2005-10-12 味の素株式会社 Ｌ−ロイシンの製造方法
JPH0928391A (ja) * 1995-07-18 1997-02-04 Mitsubishi Chem Corp Ｌ−トリプトファンの製造法
JP4032441B2 (ja) 1995-08-30 2008-01-16 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造方法
GB2304718B (en) 1995-09-05 2000-01-19 Degussa The production of tryptophan by the bacterium escherichia coli
US5763230A (en) 1996-03-22 1998-06-09 Triple-A B.V. P/A Produkschap Voor Veevoedor Amino acid fermentation processes
JP4088982B2 (ja) 1996-10-15 2008-05-21 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
RU2140450C1 (ru) 1997-10-29 1999-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Штамм бактерий escherichia coli продуцент l-лейцина (варианты)
AU756507B2 (en) 1998-03-18 2003-01-16 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
AU746542B2 (en) 1998-03-18 2002-05-02 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
EP1070376A1 (de) 1998-04-09 2001-01-24 Siemens Aktiengesellschaft Anordnung und verfahren zur elektrischen energieversorgung einer elektrischen last
RU2144564C1 (ru) 1998-10-13 2000-01-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" ФРАГМЕНТ ДНК rhtB, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ БЕЛКА RhtB, ПРИДАЮЩЕГО УСТОЙЧИВОСТЬ К L-ГОМОСЕРИНУ БАКТЕРИЯМ ESCHERICHIA COLI, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ
RU2148642C1 (ru) 1998-12-23 2000-05-10 ЗАО "Научно-исследовательский институт АДЖИНОМОТО-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк rhtc, кодирующий синтез белка rhtc, придающего повышенную устойчивость к l-треонину бактериям escherichia coli, и способ получения l-аминокислоты
RU2175351C2 (ru) 1998-12-30 2001-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот
DE19907567B4 (de) 1999-02-22 2007-08-09 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Valin
JP2003144160A (ja) 1999-07-02 2003-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2003159092A (ja) 1999-07-02 2003-06-03 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2201454C2 (ru) 1999-07-09 2003-03-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Мутантная альфа-изопропилмалат синтаза (ipms), днк, кодирующая мутантную ipms, способ получения штамма escherichia coli, способ получения l-лейцина
PL341895A1 (en) 1999-08-12 2001-02-26 Ajinomoto Kk Plasmide autonomously replicable in corynebacter bacteria
JP4427878B2 (ja) 1999-08-20 2010-03-10 味の素株式会社 析出を伴う発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
RU2207376C2 (ru) 1999-10-14 2003-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
DE19951708A1 (de) 1999-10-27 2001-05-03 Degussa Für den Export verzweigtkettiger Aminosäuren kodierende Nikleotidsequenzen, Verfahren zu deren Isolierung und ihre Verwendung
RU2212447C2 (ru) 2000-04-26 2003-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты)
US7220571B2 (en) 2000-09-28 2007-05-22 Archer-Daniels-Midland Company Escherichia coli strains which over-produce L-threonine and processes for the production of L-threonine by fermentation
JP2002209596A (ja) 2001-01-19 2002-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
DE60219969T2 (de) 2001-02-13 2008-01-17 Ajinomoto Co., Inc. Methode zur Production von L-Aminosäuren mittels Bakterien der Gattung Escherichia
JP2002238592A (ja) * 2001-02-20 2002-08-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸の製造法
JP4599726B2 (ja) 2001-02-20 2010-12-15 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸の製造法
JP4599725B2 (ja) * 2001-02-20 2010-12-15 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸の製造法
US20040241813A1 (en) 2001-07-06 2004-12-02 Mechthild Rieping Procsess for the preration of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
WO2003008605A2 (en) 2001-07-18 2003-01-30 Degussa Ag Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an enhanced male gene
RU2229513C2 (ru) 2001-11-23 2004-05-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
MXPA04004874A (es) 2001-11-23 2004-09-03 Ajinomoto Kk Procedimiento para producir l-aminoacido utilizando escherichia.
EP1451335A1 (en) 2001-12-05 2004-09-01 DSM IP Assets B.V. Process for the production of an aromatic amino acid metabolite or derivative thereof
RU2268300C2 (ru) 2003-04-07 2006-01-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНА pckA
KR20060015582A (ko) 2003-05-07 2006-02-17 아지노모토 가부시키가이샤 Ｌ-글루탐산의 제조법
ATE531803T1 (de) 2003-06-05 2011-11-15 Ajinomoto Kk Fermentierungsverfahren mittels veränderter bakterien mit einer erhöhten aufnahme von nebenprodukten
KR101073370B1 (ko) 2003-07-29 2011-10-17 아지노모토 가부시키가이샤 물질 생산에 영향을 미치는 대사 흐름을 결정하는 방법
JP4380305B2 (ja) 2003-11-21 2009-12-09 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
US7161029B2 (en) 2003-12-17 2007-01-09 Ajinomoto Co., Inc. DiL-lysine monosulfate trihydrate crystal and method of making
US20050191684A1 (en) 2004-02-25 2005-09-01 Zimenkov Danila V. Method for producing L-amino acids
US7300776B2 (en) 2004-04-26 2007-11-27 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing bacterium and a method for producing L-amino acid
WO2005103275A1 (ja) 2004-04-26 2005-11-03 Ajinomoto Co., Ltd. 発酵法によるｌ－トリプトファンの製造法
US7482140B2 (en) 2004-06-15 2009-01-27 Ajinomoto Co., Inc. L-tyrosine-producing bacterium and a method for producing L-tyrosine
AU2005320486B2 (en) 2004-12-28 2009-08-13 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105695383A (zh) * 2016-03-02 2016-06-22 廊坊梅花生物技术开发有限公司 重组菌株及其应用
CN105695383B (zh) * 2016-03-02 2020-06-19 廊坊梅花生物技术开发有限公司 重组菌株及其应用
CN106086099A (zh) * 2016-08-27 2016-11-09 河北圣雪大成制药有限责任公司 L‑缬氨酸发酵培养基及用其生产l‑缬氨酸的发酵方法
CN106086099B (zh) * 2016-08-27 2019-12-13 河北圣雪大成制药有限责任公司 L-缬氨酸发酵培养基及用其生产l-缬氨酸的发酵方法
CN108484423A (zh) * 2018-07-05 2018-09-04 秦皇岛华恒生物工程有限公司 一种从l-丙氨酸发酵液中分离纯化l-丙氨酸的方法
CN108484423B (zh) * 2018-07-05 2021-02-09 秦皇岛华恒生物工程有限公司 一种从l-丙氨酸发酵液中分离纯化l-丙氨酸的方法
CN114015632A (zh) * 2020-12-01 2022-02-08 廊坊梅花生物技术开发有限公司 产l-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN113046398A (zh) * 2021-05-18 2021-06-29 通辽梅花生物科技有限公司 一种稳定高效生产l-异亮氨酸的发酵方法及发酵稳定剂

Also Published As

Publication number Publication date
EP2080808A4 (en) 2012-01-25
CN101558163B (zh) 2014-11-05
US20090239268A1 (en) 2009-09-24
PL2080808T3 (pl) 2020-09-07
EP2080808A1 (en) 2009-07-22
WO2008044409A1 (en) 2008-04-17
EP2080808B1 (en) 2020-06-03
US8859243B2 (en) 2014-10-14
DK2080808T3 (da) 2020-06-29
ES2800999T3 (es) 2021-01-07
BRPI0717826A2 (pt) 2014-04-15
BRPI0717826B1 (pt) 2018-02-14
JP2010017082A (ja) 2010-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101558163B (zh) L-氨基酸的生产方法
CN101563453B (zh) L-氨基酸的生产方法
CN103382492B (zh) L-氨基酸或核酸的生产方法
CN101932718B (zh) 利用发酵法生产目的物质的方法
CN107893089B (zh) 用于生产l-氨基酸的方法
US7300776B2 (en) L-amino acid-producing bacterium and a method for producing L-amino acid
US7470524B2 (en) Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family
CN101405398B (zh) 用于产生l-氨基酸的方法
CN108690856B (zh) 生产l-氨基酸的方法
KR20100014538A (ko) Ｌ-아미노산의 제조방법
CN104120157A (zh) 使用具有弱化的yjjK 基因的表达的肠杆菌科细菌生产L-氨基酸的方法
JP2016192903A (ja) 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
CN103732736B (zh) 使用具有增强的鞭毛形成及运动性级联基因的表达的肠杆菌科细菌生产l-氨基酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant