TWI361834B - A method for producing amino acids - Google Patents

Description

1361834 修正本 • 九、發明說明： ， 【發明所屬之技術領域】 本發明關係胺基酸之製法》 【先前技術】 在胺基酸之製造方法當中，有使用屬於棒狀桿菌 ()屬、短桿菌（hhc/er/w/n )屬、 • 埃希氏菌（)屬、細桿菌（) 屬、沙雷氏菌（5^7*3^ )屬、桿菌屬（仏)以及假單 0 胞菌屬（/*?(? ϋί/〇/77 0/73 ?)之微生物等之發酵生產法，已經爲 人所熟知（非專利文獻1 )。 在上述發酵生產法方面，已經有多項以提高生產效率 爲目的之技術被開發，其方法之一乃藉由培養基之溫度與 pH之調整，或界面活性劑之添加於培養液中，使L-胺基酸 自培養液中發生晶析，以維持培養液中之胺基酸濃度在一 個固定値以下、迴避L-胺基酸高濃度蓄積對生產性所造成 之阻礙（專利文獻1 ) » Φ 又，促使溶解度較低的L -麩醯胺酸（L-Glu)在培養基中 晶析之方法中，已知者有使用將pH値調整到使L-Glu析出 之條件之培養基（專利文獻2 )，也有在培養液中之苯丙胺酸 (L-Phe )濃度高於飽和溶解度之條件下、將L-Phe之α晶 添加於培養液中、或變更該培養液之pH値到7.8至8.3範 圍’使L-Phe之α晶在培養液中析出等方法（專利文獻3 )。 但是’使用上述方法時，因爲培養液中也含有微細之胺 基酸結晶’所以’若以結晶與菌體粒子在粒徑上之差異爲 1361834 v 修正本 * 基礎直接對兩者進行分離，則胺基酸之回收率低；因此， ' 爲了要提高胺基酸之回收率，必須先將蓄積在培養液中之 胺基酸溶解，即、對培養液進行加水等、加熱等操作後， 以離心式或過濾式分離機將培養液內之菌體分離，然後行 濃縮、晶析。 將胺基酸結晶與菌體直接分離之方法中，有使用液體旋 * 流式分離機（cyclone)之方法者，已爲人所知（專利文獻4); 但是，其胺基酸的結晶之回收率僅只在80%以下。 • 如上述，胺基酸之發酵生產法當中，有在培養基內胺基 酸晶析的同時進行培養之方法，此法雖然優良，但是，人 們依然在尋求效率更高的方法。 [非專利文獻1]胺基酸發酵，學會出版中心，1986年 [專利文獻1]特開昭62-28 8號公報 [專利文獻2]特開2002-23 8 593號公報 [專利文獻3]特許第3239905號公報 [專利文獻4]特許第295 87 89號公報 ® 【發明內容】 本發明之目的在於提供簡便且生產效率高之胺基酸之 製法。 本發明關係下列 （1)至 （7)項。 (1)胺基酸之製造方法’其特徵爲在培養基中添加平均粒 徑爲1 ~ 1 2 0 M m的胺基酸之結晶至該胺基酸結晶之濃 度達0.5g/L以上後，以該培養基培養具有生產該胺 基酸的能力之微生物，使該胺基酸之結晶在該培養基 修正本 中生成、蓄積，然後，自培養物中採收該胺基酸之結 晶。 (2) 胺基酸之製造方法，其特徵爲胺基酸之結晶添加於培 養基中至培養基中胺基酸結晶之總表面積達 0.02m2/L後，以該培養基培養具有生產該胺基酸的能 力之微生物，使該胺基酸之結晶在該培養基中生成、 蓄積，然後自培養物中採收該胺基酸之結晶。 (3) 上述（1)或（2)之方法，其添加之胺基酸結晶爲具有比 表面積在0.06 m2/cm3以上之胺基酸之結晶。 (4) (1)至（3)中之一種方法，其生成、蓄積之胺基酸結晶 之平均粒徑在15#m以上。 (5) (1)至（4)中之一種方法，其特徵爲其自培養物中採集 胺基酸方法，乃是將胺基酸生產微生物與蓄積之胺基 酸結晶，以兩者在粒徑上之差異爲基礎加以分離。 (6) (1)至（4)中之任何一種方法，其特徵爲其自培養物採 集胺基酸之方法，乃是將胺基酸生產微生物與蓄積 之胺基酸結晶，以兩者在比重上之差異爲基礎加以 分離。 (7 )(1)至（6)中之任何一種方法，其中胺基酸爲L-麩醯胺 酸（L-glutamine) ，L-顧胺酸（L-valine)， L-白胺酸 (L-leucine)，異白胺酸 L-(L-isoleucine)，L-苯丙胺酸 (L-phenylalanine)，L-酪胺酸（L-tyrocine)或 L-色胺 酸（L-tryptophan)。 1361834 修正本 * [發明之效果] * 本發明可提供簡便且高生產效率之胺基酸製法。 1.本發明之製造方法所使用之微生物 本發明之製造方法所使用之微生物，只要是具有胺 基酸生產能力之微生物即可，並無特別限制；該微生物 ' 可以是從自然界分離出來之微生物，也可以是經人爲方 • 法改善過胺基酸生產性之微生物。 經人爲方法改善過胺基酸生產性之微生物可以是 • 經過利用： (a) 緩和或解除控制胺基酸生合成機制中的至少一個機 制之方法； (b) 表現、強化與胺基酸生合成相關的至少一種酵素之方 法； (c) 與胺基酸生合成相關之至少一種酵素基因的拷貝數 之增加方法： (d) 將至少一個脫離胺基酸生合成路徑、導向該胺基酸以 # 外的代謝產物的分歧代謝路徑弱化或遮斷之方法；以 及 (e) 選擇胺基酸類似物 （analog)耐性度低於野生型株的 細胞株之方法， 等方法之單獨或組合而取得之微生物。 上述（a)之具體方法已記載在 Agric. Biol. Chem.，41, 1 05 - 1 1 1 ( 1 979 ) ' J. Bacteriol., 1 1 0. 76 1 -763 ( 1 972)、以及 Appl. Microbiol. Biotechnol., 39_, 318-323 (1993)等文獻上； 1361834 修正本 _ 上述（b)之具體方法已記載在 Agric. Biol. Chem.，43， • 1 05 - 1 1 1 ( 1 979)及 J_ Bacteriol.，1 1 0, 76 1 -763 ( 1 972)等文 獻上；上述（c)之具體方法已記載在 Appl. Microbiol. Biotechnol., 19_, 318-323 (1993)及 Agri. Biol. Chem·，39., 37 1 -377 ( 1 987)等文獻上；上述（d)之具體方法已記載在Appl. Microbiol. Biotechnol., 38_, 181-190 (1979)及 Agri. Biol·

Chem.，生2_，Π7 3 - 1 7 7 8 ( 1 978)等文獻上；上述（e)之具體方法 已記載在 Agric. Biol. Chem·, 36_, 1675-1684 (1972), Agric. Biol. C h e m., 4 1., 1 09- 1 1 6 (1 977) ' Agric. Biol. Chem., 37， 201 3-2023 ( 1 97 3)、以及 Agri. Biol. Chem., 2089- 2094 ( 1 987)等文獻上。 .， 又、至於使用上述（a)〜（e)之一種方法或其組合以調製 具有胺基酸生成、蓄積能力的微生物之方法，已經有許多 例子記載在 Biotechnology 2nd ed·, Vol. 6，Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft m b H,

Weinheim, 1 9 9 6) section 14a, 14b、Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79_, 1-35 (2003)、胺基酸發酵 (學會出版中心、相田浩等，1 986 )等文獻上。此外，調 製具有胺基酸生成、蓄積能力的微生物之具體方法，也有 特開 2003 - 1 642 97、Agric. Biol. Chem·，U，1 5 3 - 1 60 ( 1 97 5)、 Agric. Biol. Chem., 39., 1 1 4 9 - 1 1 5 3 ( 1 9 7 5)、特開昭 58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol·，£，272-283 (1958)、特 開昭 63-94985、Agric. Biol. Chem.，YL, 20 1 3 -2023 ( 1 97 3 ) ' W097/15673、特開昭 56-18596、特開昭 56-144092 及特表 1361834 修正本 200 3-511086等多數報告。參考上述諸文獻即可調製出具有 胺基酸生產能力之微生物。 上述之具有胺基酸生產能力之微生物，可以是適用上述 (a)至（e)方法而得之微生物、也可以是含有上述遺傳形質之 微生物，其中、較理想的是原核生物，而更理想的是細菌。

可使用之原核生物之例有屬於埃希氏菌屬 (Escherichia)、沙雷氏菌屬（Serratia)、桿菌屬（Bacillus)、短 桿菌屬（Brevibacterium)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium)、細 桿菌屬（Microbacterium)、假單胞菌屬（Pseudomonas)' 農桿 菌屬（Agrobacteium)、脂環桿菌屬（Alicyclobacillus)屬、太 湖念珠藻屬（Anabena)、Anacystis、^ 節菌屬（Arthrobacter)、 固氮菌屬（Azotobacter)、Chromatium、歐文氏菌屬（Erwinia) 屬' Methylobacterium、Phormidium、紅菌屬（Rhodobacter)、 紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas)、 紅螺菌屬

(Rhodospirilum)、S c e n e d e s m u s、鏈黴菌屬（S t re p t o my c e s)、 Synechoccus、酵單胞菌屬（Zymomonas)等微生物；例如大腸 桿菌（Escherichia coli),枯草桿菌（Bacillus subtilis),巨大芽 胞桿菌（Bacillus megaterium),激粉液化桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)，凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans)，地 衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)，Bacillus pumilus,產 氨短桿菌（Brevibacterium ammoniagenes)，Brevibacterium immariophilum, 解糖 短桿菌 （Brevibacterium saccharolyticum)，黃色短桿菌（Brevibacterium flavum)，乳 發酵短桿菌（Brevibacterium lactofermentum)，鞋醯胺酸棒 -10- 1361834 修正本

桿菌（Corynebacterium glutamicum)，嗜醋酸棒桿菌 (Corynebacterium acetoacidophilum),嗜氨 細桿菌 (Microbacterium ammoniaphi lum)， Serrartia ficaria， Serratia fonticola，無色沙雷氏菌（Serratia liquefaciens),黏 質沙雷氏菌（Serratia marcescens)， 銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)，惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)，放射形農桿菌（Agrobacteium radiobacter)，產根濃 桿菌（Agrobacterium rhizogenes), Agrobacterium rubi， Anabaena cylindrica， Anabaena doliolum， Anabaena flos-aquae， Arthrobacter aurescens， Arthrobacter citreus， Arhrobacter globfprmis，Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter mysorens， Arthrobacter nicotianae，

Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter protophormiae， Arthrobacter roseoparaffinus， Arthrobacter sulfureus, Arthrobacter ureafaciens，Chromatium buderi, Chromatium tepidum ， Chromatium vinosum, Chromatium warmingii， Chromatium fluviatile，Erwinia uredovoras 紅蘿蔔軟腐歐文 氏菌（Erwinia carotovora)，Erwinia ananas，草生歐文氏菌 (Erwinia herbicola), Erwinia punctata, Erwinia terreus， Methylobacterim rhodesianum， Methylobacterium extorquens, Phormidium sp. ATCC29409, Rhodobacter capsulatus， Rhodobacter sphaeroides， Rhodopseudomonas blastica， Rhodopseudomonas marina， Rhodopseudomonas palustris, Rhodospirillum rubrum， Rhodospeirillum -11- 1361834 修正本 salexigens, Rhodospirillum salinarum，鏈黴素鏈霉菌 (Streptomyces ambofaciens)，金徵素鏈霉菌（Streptomyces aureofaciens), 金色 鏈霉菌(Streptomyces aureus), Streptomyces fungicidicus, Streptomyces

griseochromogenes, Streptomyces lividans, Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus， Streptomyces tanashiensis, 葡萄色鏈霉菌(Streptomyces vinaceus), Zymomonas mobilis等，較理想之原核生物有屬於埃希氏菌 麗（Escherichia)、沙雷氏菌屬（Serratia)、桿菌屬（Bacillus)、 短桿菌屬（Brevibacterium)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium)、 假單胞菌屬（Pseudomonas)、鏈徵菌屬（Streptomyces)等之細 菌，例如屬於上述埃希氏菌屬（Escherichia)、沙雷氏菌屬 (Serratia)、桿菌屬（Bacillus)、短桿菌屬（Brevibacterium)、 棒狀桿菌屬（Corynebacterium)、假單胞菌屬（Pseudomonas) 或鏈黴菌屬（Streptomyces)等屬之菌種，其中較理想之細菌 有大腸桿菌（Escherichia coli), 麩醯胺酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum), 產 氨 棒 桿 菌 (Corynebacterium ammoniagenes)， 乳 發 酵棒 桿 菌 (Corynebacterium 1 actofermentum)， 黃 色棒 桿 菌 (Corynebacterium. flavum)，Corynebacteriu m i ificasis ;，黃色 短桿菌（B re vib ac ter i um flavum)， 乳 發 酵短 桿 菌

(Brevibacterium lactofermentum),枯草桿菌（Bacillus subtilis), Bacillus megaterium,黏質沙雷氏菌（Serratia marcescens)，惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida),銅綠假 1361834 修正本 單胞菌（Pseudom onas aeruginosa), Streptomyces sericalar, Streptomyces lividans ,而更理想的則有大腸桿菌 (Escherichia coli),鞋醒胺酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum),產氨短桿菌（Brevibacterium ammoniagenes); 更具體言之，具L-麩醯胺酸生產能力的有FERM P-4806、 ATCC 1 475 1 及 ATCC 1 4752 等，具 L-纈胺酸（Valine)生產 能力的有ATCC 1 3 005及ATCC19561等，具L-白胺酸生產能 力的有FERM BP-4704及ATCC2 1 3 02等，具L-異白胺酸生 產能力的有FERM BP-375 7及ATCC14310等，具L-苯丙胺 酸生產能力的有ATCC13281及ATCC21669等，具L-酪胺酸 生產能力的ATCC2 1 652等，以及具L-色胺酸生產能力的有 DSM10118、DSMIOm、DSM10123 及 FERM BP-1777 等等。 又，上述代號FERM所表示之菌株乃得自獨立行政法 人產業技術總合硏究所專利生物寄存中心（曰本）、代號 ATCC 所表示之菌株乃得自 American Type Culture Collection (美國）、代號DSM所表示之菌株乃得自 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (德國）。 2.本發明之胺基酸之製造方法 本發明之胺基酸之製造方法有（1)以於培養基中添加平 均粒徑爲1〜120 /z m之胺基酸之結晶至該胺基酸結晶之濃 度達0.5 g/L以上後，用該培養基培養上述1之具有生產該 胺基酸能力之微生物，使該胺基酸之結晶在該培養基中生 成、蓄積，自培養物中採收該胺基酸之結晶爲特徵之胺基酸 -13- 1361834 * 修正本 *之製造方法；以及（2)以培養基中經過添加胺基酸之結晶至 •胺基酸結晶之總表面積爲0.02 m2/L以上後，用該培養基培 養上述1之具有生產該胺基酸能力之微生物，使該胺基酸之 結晶在該培養基中生成、蓄積，自培養物中採收該胺基酸之 結晶爲特徵之胺基酸之製造方法β 上述以培養基培養微生物之方法，除了胺基酸之添加以 ’ 外，可以依照一般使用於微生物培養之方法行之。 即’使用之培養基，只要含有該微生物可利用之碳源、氮 • 源、無機鹽類等’可用來有效培養該微生物之培養基（較理 想的是液體培養基）即可，可以是天然培養基，也可以是合 成培養基。 其碳源只要是能夠被該微生物利用者即可，有葡萄糖、果 糖、蔗糖，含有此等之糖蜜、澱粉或澱粉加水分解物等碳 水化合物，醋酸、丙酸等有機酸，乙醇、丙醇等醇類。 可用之氮源有氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等 之無機酸或有機酸銨鹽，其它含氮化合物，以及消化蛋白 • 質（peptone)、肉萃取物（meat extract) ' 酵母萃取物（yeast extract)、玉米浸出液（cornsteep liquor)、酪蛋白加水解 物 （casein hydrolysate)、大豆粕及大豆粕加水分解物、各 種發酵菌體及其消化物等。 可用之無機鹽有磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫 酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。

上述（1)之製造方法所添加之胺基酸之結晶’只要是粒徑 爲1〜120 ym、而能夠使培養基內之結晶濃度達到〇.5g/L 1361834 修正本 •以上之胺基酸之結晶即可，對添加之胺基酸結晶之粒徑、

P • 量、胺基酸之種類、以及結晶型之種類等並無限制；不過， •添加之胺基酸結晶之平均粒徑爲1〜120 #m;較理想者爲 2〜110 /zm，更理想者爲5〜70 ，最理想者爲7〜50 β m ，最最理想者爲10〜35 //m、特別理想者爲11〜13 β m 〇 胺基酸結晶之量爲添加後培養基中胺基酸結晶之濃度爲 0.5 g/L以上、較理想者爲2〜30 g/L，更理想者爲3〜25 g/L，最理想者爲4〜22 g/L，最最理想者爲5〜20 g/L，特 別理想者爲5.5〜16.5 g/L。 又，對於上述添加之胺基酸結晶之平均粒徑與其添加量之 組合並無特別限制，只要是能夠使培養基中平均粒徑爲1 〜120 // m、結晶濃度在0.5 g/L以上之組合者即可；其組 合可以是使培養基之平均粒徑1〜120 /zm/結晶濃度0.5 g/L以上之組合，但是，較理想者爲平均粒徑2〜11 0〆m /結晶濃度2〜30 g/L之組合，再理想考爲平均粒徑5〜70 从m /結晶濃度3〜25 g/L，最理想者爲平均粒徑7〜50 /結晶濃度4〜22 g/L，最最理想者爲平均粒徑10〜35 // m /結晶濃度5〜20 g/L，特別理想者爲平均粒徑1 1〜1 3 // m /結晶濃度5.5〜16.5 g/L之組合。 培養基之胺基酸結晶添加時間可以是在以培養基培養具 胺基酸生產能力之微生物之前，也可以是在以培養基培養 具胺基酸生產能力之微生物以後之培養期間；但是較理想 的時間是在將具胺基酸生產能力之微生物以培養基培養 -15- 1361834 k 修正本 ' 後’自培養基內之胺基酸濃度達飽和溶解度左右開始到培 • _基內胺基酸結晶析出前之間，再理想者爲在培養基內胺 基酸濃度達飽和溶解度之後、培養基內胺基酸結晶析出之 前’最理想者爲培養基內胺基酸濃度處於過飽和狀態之 時 '培養基內胺基酸結晶析出之前。但是，上述所謂之培 養基內胺基酸結晶析出之前，雖然是以胺基酸結晶再培養 s內完全未被觀察到之期間爲理想；但是結晶回收率方面 考量’只要是在能夠達成本發明之效果之範圍內，即使是 有微量的胺基酸結晶之析出被觀察到亦無妨。 在培養基內胺基酸濃度處於過飽和之情況下添加胺基酸 結晶時’其胺基酸結晶之添加量爲、以添加時之培養基爲 基礎、0_5 g/L以上，較理想者爲2〜30g/L，再理想者爲3 〜25 g/L ’最理想者爲4〜22 g/L，最最理想者爲5〜20 g/L ’特別理想者爲5〜1 6.5 g/L。 在培養基內之胺基酸濃度處於過飽和之情況下添加胺基 酸之結晶時，其添加之胺基酸結晶之平均粒徑與量之組合 可以爲、結晶之平均粒徑爲1〜1 20 μ m、而結晶之添加量 爲對添加時之培養基量0.5 g/L以上；較理想者爲結晶之平 均粒徑爲2〜110 vm、而結晶之添加量爲對添加時之培養 基量2〜30 g/L ;再理想者爲結晶之平均粒徑爲5〜70 "m、而結晶之添加量爲對添加時之培養基量3〜25 g/L ; 最理想者爲結晶之平均粒徑爲7〜50 V m、而結晶之添加量 爲對添加時之培養基量4〜22 g/L ;最最理想者爲結晶之平 均粒徑爲10〜35 /zm、而結晶之添加量爲對添加時之培養 -16- 1361834 修正本 ； 基量5〜20 VL ;特別理想者爲結晶之平均粒徑爲η〜13 • 、而結晶之添加量爲對添加時之培養基量5.5〜16.5 g/L。 又’在上述（2)之製法中添加之胺基酸之結晶，只要是能 夠使培養基內胺基酸結晶之總表面積達〇.〇2 m2/L以上之 胺基酸結晶即可，對添加之胺基酸結晶之平均粒徑、量、 胺基酸之種類、以及結晶型之種類等並無限制；不過，添 加之胺基酸結乃是能夠在添加後培養基中胺基酸結晶之總 表面積爲0.02 m2/L ;較理想者爲〇.〇8〜70 m2/L ;再理想 者爲0.2〜23 m2/L;更理想者爲〇.4〜15 m\/L; 最理想者 爲0.7〜9.3 m2/L ; 特別理想者爲2.0〜7.0 m2/L。 上述（2)之製造方法中添加之具體之胺基酸結晶，其平均 粒徑爲1〜120 // m、結晶濃度在〇· 5 g/L以上；2〜30 g/L , 較理想者爲結晶平均粒徑2〜110 /zm、結晶濃度2〜30 g / L ;再理想者爲結晶平均粒徑5〜7 0 // m、結晶濃度3〜 25 g/L;更理想者爲平均粒徑5〜70 /zm、結晶濃度4〜22 g/L;最理想者爲平均粒徑1〇〜35 ；um、結晶濃度5〜20 g/L;特別理想者爲平均粒徑11〜13 ym、結晶濃度5.5〜 16.5 g/L 。 培養基之胺基酸添加時間與上述（1)之製造方法同樣。 在培養基中之胺基酸濃度處於過飽和狀態下添加胺基酸 結晶時，其添加之胺基酸之結晶爲、以添加時之培養基量 爲基準計算，其胺基酸結晶之總表面積爲〇.〇2 m2/L以上， 較理想者爲0.08〜70 m2/L，再理想者爲〇.2〜23 mvL，更

1361834 理想者爲0.4〜15 m2/L，最理想者爲0.7〜9.3 m2/L， 理想者爲2.0〜7.0 m2/L。 具體之該胺基酸之結晶爲平均粒徑爲1〜120 加量爲對添加時培養基量0.5 g/L以上之結晶；較j 爲平均粒徑爲2〜110 //m時之添加量爲對添加時培； 2〜30 g/L之結晶：再理想者爲平均粒徑爲5〜70 μ j 添加量爲對添加時培養基量3〜25 g/L之結晶；更ϊ 爲平均粒徑爲7〜50 //m時之添加量爲對添加時培i 4〜22 g/L之結晶；更理想者爲平均粒徑爲10〜35 之添加量爲對添加時培養基量5〜20 g/L之結晶；理^ 平均粒徑爲11〜13 時之添加量爲對添加時培弓 5.5〜1 6.52 g/L之結晶； 上述方法、其培養物內培養基量之測定方法可以j 之任何方法，例如，以離心分離法分離出培養物內： 基與菌體等不溶物，測定沈降之不容物之體積，再}) 之體積自培養物量減掉。 更且，上述（1)及（2)之製造方法中，其添加之胺基f 晶乃是平均比表面積在0.06 m2/cm3以上之胺基酸之; 其較理想者爲0.07〜7.2 m2/cm3:再理想者爲 0.07 m2/cm3;更理想者爲0.1〜1.0 m2/cm3;最理想者爲0.14 m2/cm3 ° 上述（1)及（2)之製造方法中，其添加之胺基酸可以 物所能夠生產之任何胺基酸；但是，較理想者爲自 胺酸（L-glutamine)、L-纈胺酸（L-valine)、L-白胺酸 修正本 特別 之添 想者 基量 時之 想者 基量 m時 者爲 基量 公知 培養 測得 :之結 i晶； -1.43 -0.72 :微生 -麩醯 、L-異 1361834 修正本 白胺酸、L-苯丙胺酸、L-酪胺酸、以及L-色胺酸中選出之 胺基酸：再理想者爲自L-麩醯胺酸、L-纈氨酸及L-白氨酸 中選出之胺基酸；最理想者爲L-麩醯胺酸〃不過，將L·苯 丙胺酸之 α 晶自本發明之製造方法上添加之胺基酸結晶 中排除也無妨。 本發明所使用之培養基添加用胺基酸結晶之來源可以爲 市售品，或以公知方法、如發酵生產法與精製法、製得之 胺基酸結晶，或直接使用，或以市售之粉碎機，如Μ4型 自由粉碎機（奈良機械製作所公司製）、Atomizer ΤΑΡ-20 (東京 Atomizer 製造公司製）' Air C1 assifying Mi 11 (HOSOKAWA MICRON POWDER SYSTEMS 公司製），調製成 具有合乎適用目的之平均粒徑之胺基酸結晶。 例如’將以公知之發酵生產法與精製法製出之平均粒徑爲 ll〇#m之胺基酸結晶，以M4型自由粉碎機、在濾網Φ1.0 mm、迴轉數45 00 rpm、處理速度400 kG/h之條件下進行粉 碎時’可得平均粒徑爲45 M m之胺基酸結晶。再將此胺基 酸結晶以濾網Φ0.3 mm、迴轉數6000 rpm、處理速度約200 kG/h之條件粉碎時、可得平均粒徑爲1 1 μ m之胺基酸結 晶》 胺基酸結晶之比表面積可以用市面上賣的測定機、如用 誠信（SEISHIN)企業股份公司製SK LASER MICRO SIZER LMS-24 (雷射繞射、散亂式粒度分布測定裝置）測定。在 測IfKS酸結晶之比表面積時，最好是將該結晶假設爲球 狀、且屬相似系計算。 -19- 1361834 - 修正本 ；, 胺基酸結晶之總表面積可以從胺基酸結晶之比表面積 • 及添加量計算出來。 培養通常是在振盪培養或深部通氣攪拌培養等好氣條 件下進行。培養溫度可以在1 5 ~ 40°C :培養時間通常爲5 小時〜7日。培養期間之pH維持在3.0〜9.0，pH之調整 ' 以無機或有機之酸、鹼性溶液、尿素、碳酸鈣、氨等行之。 ' 又，在培養時也可因應必要性、在培養基中加入安比西 林、四環素等抗生素》 # 在培養以利用誘導性啓動子（promoter )爲promoter之 表現載體（expression vector)完成形質移轉之微生物時， 假如有必要，也可添加誘導劑（inducer )。例如，培養以 利用In啓動子之表現載體完成形質移轉之微生物時，可 以在培養基中添力Π異丙· ·硫吡喃半乳糖 (isopropyl -石-thiogalactopyranoside)等：培養以利用 trp 啓 動子之表現載體r完成形質移轉之微生物時，可以在培養 基中添加吲哚丙烯酸等。 • 依上述方法在培養基中蓄積之胺基酸，只要是可以用微 生物生產之胺基酸，任何胺基酸皆可。較理想者爲從L-麩 醯胺酸（.L-glutamine) 、L-纈胺酸（L-valine) 、L·白胺酸 (L-leucine ) 、L-異白胺酸（L-isoleucine ) 、L-苯丙胺酸 (L-phenylalanine) 、L-酪胺酸（L-tyrosine)、以及 L-色 胺酸（L-tryptophan )中選出之胺基酸，更理想者爲從L-麩醯胺酸（L-glutamine) 、L-纈胺酸（L-valine)、以及 L-白胺酸（L_leucine)中選出之胺基酸；最理想者爲L-麩醯 -20 - 1361834 修正本 胺酸（L-glutamine)。 又’依上述方法在培養基中蓄積之胺基酸之結 均粒徑爲15 um以上；較理想者爲2〇 _以上； 爲30μπι以上；更理想者爲4〇nm以上；最理想: 爲以上；特別理想者爲60 μηι以上。 本發明之製造方法、其自培養物中採收胺基酸 法’只要是通常之胺基酸精製方法，任何方法都 其較爲理想者爲在培養結束後、將培養物內之菌 酸之結晶’利用兩者在粒徑、以及比重上之差異 胺基酸之結晶分離、精製之方法。 上述之利用粒徑與比重上之差異、將胺基酸 離、精製之方法，有從來已經公知之重力分級分 心力分級分離法；其較理想者爲離心力分級分離 離心力分級分離法當中’更以傾析型離心分離法赁 以上述方法可以以高收率獲得充分精製之 晶；不過’必要時，可以再以活性碳、離子交換 用之方法、或以有機溶劑進行抽出、結晶化、薄 離法、高速液體色層分離法等方法精製。 【實施方式】 以下記載實施例；但是，本發明並非爲該實施 者。 (實施例1) L -魅醯胺酸（L-glutamine)之結晶之製造（1) 晶，其平 再理想者 者爲50|um 結晶之方 可以用； 體與胺基 ，直接將 之結晶分 離法、離 法；而在 I最理想》 胺基酸結 樹脂等常 層色層分 例所限定 1361834 修正本 :養基[250 g/L glucose、30 g/L NHWl、1.0 g/L Κ2ΗΡ〇4、 1.0 、 g/L KH2PO, ' 0.5 g/L MgS〇4-7H2〇 、 20 mg/L FeS〇4 、 2 mg/L MnS〇4-4H2〇 ' 10 μ. g/L biotin ' 1 mg/L thiamine HC1 ' pH 6.8]、500-L 容積之發酵槽（Jar Fermenter)在適切 pH 與溫度調整中進行培養。培養開始後、當培養基中之L-麩 醯胺酸之濃度達到其飽和溶解度後、而培養基中L-麩醯胺 酸之結晶尙未析出前、將平均粒徑爲40 /zm之L-麩醯胺酸 之結晶加入至培養基中之結晶濃度達1 6.5 g/L。之後，繼 續培養，在使L-麩醯胺酸結晶成長之同時繼續培養。培養 在培養開始後大約96小時結束，得體積爲210 L、L-麩醯 胺酸含量爲90 g/L之培養液。以巴工拳（股份公司）製傾 析器 （PTM006型）從該培養物分離、取得6.2 Kg之L-麩 醯胺酸。此結晶之平均粒徑爲62 // m。此時，傾析器之培 養基中析出結晶之產率爲9 8.9 %。 (實施例2) L -麩醯胺酸之結晶之製造（2) 以與實施例1同樣之方法製得L-麩醯胺酸之結晶，唯 其培養基中添加之結晶乃是具有第1圖所示之平均粒徑之 L-麩醯胺酸結晶。同時，以SEISHIN企業有限公司製SK LASER MICRON SIZER LMS-24 (雷射繞射·散亂式粒度 分布測定裝置）測定L-麩醯胺酸結晶之比表面積；不過， 在測定L-麩醯胺酸結晶之比表面積時，乃是將該結晶假設 爲球狀、且屬相似系計算。 第1圖列示添加之L-麩醯胺酸結晶及發酵生產所得之 -22- 1361834 修正本 )L -麩醯胺酸結晶之形狀、L -麩醯胺酸結晶之產率、乾燥物 、 含量等。 正如第1圖所示，培養基中未添加結晶時，其培養基 中就有微細結晶析出’以離心分離法回收結晶時之產率就 低；另外，添加之胺基酸結晶之粒徑較小時之結晶產率有 上升之頃向。又，在有添加結晶之情況下，培養終了時培 養基中胺基酸結晶之平均粒徑皆在30 /zm以上。更且，將 結晶以傾析器分離，再以筐型離心分離機進行脫液、乾燥 後得到之結晶含量（乾物含量）因添加總表面機大的結晶 而提高。 由上述可知，本發，明之製造法能夠在L-麩醯胺酸以及 其他種種胺基酸之發酵生產過程中，藉由胺基酸結晶之添 加使胺基酸之濃度在一定之過飽和度以下、同時、讓適度 數目之胺基酸種晶存在於培養基中，亦即藉由調整添加胺 基酸結晶之平均粒徑與量、或該結晶之總表面積，以控制 在培養中培養基內析出之胺基酸結晶之粒徑。其結果，菌 體容易分離，並且可以獲得高回收率之胺基酸結晶。 【圖式簡單說明】 第1圖係顯示所添加胺基酸之結晶的平均粒徑、比表面 積、及總表面積與蓄積於培養基之胺基酸的結晶形狀和回 收率間之關係圖。另外，圖中之照片的縱向邊長爲1 000 y m» -23 -

Claims (1)

1. Ι3.6Γ834 修正本 |辦\翎 修正替換頁 第0951 128 14號「胺基酸之製法」專利案 (2011年12月28曰修正） 十、申請專利範圍： 1·—種胺基酸之製法，其特徵爲將平均粒徑爲1〜120 μπι 之胺基酸結晶添加於培養基中至該胺基酸之結晶濃度達 0.5 g/L以上後’於該培養基內培養具有生產該胺基酸能 力之微生物，使該胺基酸之結晶在該培養基中生成、蓄 積，自該培養物中採集該胺基酸之結晶，且將生產該胺 基酸的微生物與蓄積之胺基酸結晶依照兩者在粒徑或比 重上之差異予以分離。 2. —種胺基酸之製法，其特徵爲將胺基酸結晶添加於培養 基中至胺基酸結晶之總表面積達0.02 m2/L後，於該培養 基內培養具有生產該胺基酸能力之微生物，使該胺基酸 之結晶在培養基內生成、蓄積，自該培養物中採集該胺 基酸之結晶，且將生產該胺基酸的微生物與蓄積之胺基 酸結晶依照兩者在粒择或比重上之差異予以分離。 3. 如申請專利範圍第1或2項之胺基酸之製法，其中添加 之胺基酸之結晶係具有0.06 m2/cm3以上比表面積之胺基 酸結晶。 4·如申請專利範圍第丨或2項之胺基酸之製法，其中生成、 蓄積之胺基酸結晶之粒徑爲1 5 μ m以上。 5.如申請專利範圍第3項之胺基酸之製法，其生成、蓄積 之胺基酸結晶之粒徑爲1 5 // m以上。 Ι36Γ834 《日修正替换頁j 修正本 ’· 6·如申請專利範圍第i或2項之胺基酸之製法，其胺基酸 爲 L -鍵醯胺酸（L-glutamine) 、L -纈胺酸（L-valine)、 L -白胺酸（L-leucine) 、L -異白胺酸（L-isoleucine)、 L-苯丙胺酸（L-phenylalanine)、L-酪胺酸（L-tyrosine)、 或 L-色胺酸（L-tryptophan)。 7.如申請專利範圍第3項之胺基酸之製法，其胺基酸爲L-鞋酿胺酸（L-glutamine) 、L -纈胺酸（L-valine) 、L -白 胺酸（L-leucine) 、L-異白胺酸（L-isoleucine) 、L -苯 丙胺酸（L-phenylalanine)、L -酷胺酸（L-tyrosine) ' 或 L-色胺酸（L-tryptophan)。 1361834 修正本 * 七、指定代表圖： 磉 • (一）本案指定代表圖為：無 (二)本代表圖之元件符號簡單說明： 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：