KR101357345B1

KR101357345B1 - 아미노산의 제조법

Info

Publication number: KR101357345B1
Application number: KR1020077023213A
Authority: KR
Inventors: 츠요시 시모세; 료우 오하시; 가츠미 후지나가
Original assignee: 교와 핫꼬 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 2005-04-12
Filing date: 2006-04-12
Publication date: 2014-02-11
Also published as: EP1870476B1; JPWO2006109830A1; EP1870476A1; TWI361834B; EP1870476A4; BRPI0610516A2; ES2483990T3; WO2006109830A1; US7888078B2; KR20070121729A; CN101155927B; JP5138368B2; TW200716755A; US20090081739A1; CN101155927A; USRE45723E1

Abstract

본 발명에 의하면, 평균 입자 직경인 아미노산의 결정을 그 아미노산의 결정 농도가 0.5g/l 이상이 되도록 배지에 첨가한 후, 그 배지 중에서 그 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배양하고, 그 배지 중에 그 아미노산의 결정을 생성, 축적시켜, 배양물 중에서 그 아미노산의 결정을 채취하는 것을 특징으로 하는 아미노산의 제조 방법, 및 배지 중의 아미노산의 결정의 총 표면적이 0.02㎡/l 가 되도록 아미노산의 결정을 배지에 첨가한 후, 그 배지 중에서 그 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배양하고, 그 배지 중에 그 아미노산의 결정을 생성, 축적시켜, 배양물 중에서 그 아미노산의 결정을 채취하는 것을 특징으로 하는 아미노산의 제조 방법이 제공된다.

Description

아미노산의 제조법{PROCESS FOR PRODUCTION OF AMINO ACID}

본 발명은 아미노산의 제조법에 관한 것이다.

아미노산의 제조법으로는, 코리네박테리움속, 브레비박테리움속, 에쉐리키아속, 마이크로박테리움속, 세라티아속, 바실러스속 및 슈도모나스속에 속하는 미생물 등을 사용한 발효 생산법이 잘 알려져 있다 (비특허 문헌 1).

상기한 발효 생산법에 있어서는, 그 생산 효율을 높이기 위한 여러 가지 기술이 개발되어 있고, 그 한가지로서 배지의 온도 및 pH 의 조정, 또는 계면 활성제를 배양액에 첨가함으로써 배양액 중에 L-아미노산을 정석 (晶析) 시키면서 배양액 중의 L-아미노산의 농도를 일정량 이하로 유지시켜, L-아미노산의 고농도 축적에 의한 생산성의 저해를 회피하는 방법이 알려져 있다 (특허 문헌 1).

또한, 비교적 용해도가 낮은 L-글루타민산 (L-Glu) 을 배지 중에 정석시키는 방법으로는, L-Glu 가 석출되는 조건에 pH 를 조정한 배지를 사용하는 방법 (특허 문헌 2), 배양액 중의 L-페닐알라닌 (L-Phe) 의 농도가 포화 용해도 이상의 조건 하에서 그 배양액 중에 L-Phe 의 α 정을 첨가하거나, 또는 그 배양액의 pH 를 7.8∼8.3 의 범위로 변경함으로써 배양액 중에 L-Phe 의 α 정을 석출시키는 방법 (특허 문헌 3) 도 알려져 있다.

그러나, 상기 방법에서는 배양액 중에는 미세한 아미노산의 결정도 포함되기 때문에, 결정과 균체의 입자 직경의 차이에 기초하여 직접 양자를 분리하는 방법에서는 아미노산의 수율이 낮고, 따라서 아미노산의 수율을 높이기 위해서는, 배양액 중에 축적된 아미노산의 결정을 일단 용해하는, 즉 배양액으로의 물 등의 첨가, 배양액의 가열 등의 조작을 실시한 후, 원심식 또는 여과식 분리기 등을 사용하여 균체와 배양액을 분리한 후, 농축 정석하지 않으면 안된다.

아미노산의 결정과 균체를 직접 분리하는 방법으로는, 액체 사이클론을 사용하는 방법 (특허 문헌 4) 이 알려져 있지만, 아미노산의 결정의 회수율은 80％ 이하에 지나지 않는다.

이상과 같이, 아미노산의 발효 생산법에 있어서, 아미노산을 배지 중에 정석시키면서 배양하는 방법은 우수하지만, 새로운 효율적인 방법이 요구되고 있다.

비특허 문헌 1 : 아미노산 발효, 학회 출판 센터, 1986 년

특허 문헌 1 : 일본 공개특허공보 소62-288호

특허 문헌 2 : 일본 공개특허공보 2002-238593호

특허 문헌 3 : 특허 제 3239905호

특허 문헌 4 : 특허 제 2958789호

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명의 목적은 간편하고 생산 효율이 높은 아미노산의 제조법을 제공하는 것에 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명은 이하의 (1)∼(7) 에 관한 것이다.

(1) 평균 입자 직경이 1∼120㎛ 인 아미노산의 결정을 그 아미노산의 결정 농도가 0.5g/l 이상이 되도록 배지에 첨가한 후, 그 배지 중에서 그 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배양하고, 그 배지 중에 그 아미노산의 결정을 생성, 축적시켜, 배양물 중에서 그 아미노산의 결정을 채취하는 것을 특징으로 하는 아미노산의 제조 방법.

(2) 배지 중의 아미노산의 결정의 총 표면적이 0.02㎡/l 가 되도록 아미노산의 결정을 배지에 첨가한 후, 그 배지 중에서 그 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배양하고, 그 배지 중에 그 아미노산의 결정을 생성, 축적시켜, 배양물 중에서 그 아미노산의 결정을 채취하는 것을 특징으로 하는 아미노산의 제조 방법.

(3) 첨가하는 아미노산의 결정이 0.06㎡/㎤ 이상의 비표면적을 갖는 아미노산의 결정인 상기 (1) 또는 (2) 의 방법.

(4) 생성, 축적시키는 아미노산의 결정의 평균 입자 직경이 15㎛ 이상인 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나의 방법.

(5) 배양물 중에서 아미노산을 채취하는 방법이 아미노산을 생산하는 미생물과 축적시킨 아미노산의 결정을, 그들의 입자 직경의 차이에 기초하여 분리하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나의 방법.

(6) 배양물 중에서 아미노산을 채취하는 방법이 아미노산을 생산하는 미생물과 축적시킨 아미노산의 결정을, 그들의 비중의 차이에 기초하여 분리하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나의 방법.

(7) 아미노산이 L-글루타민, L-발린, L-로이신, L-이소로이신, L-페닐알라닌, L-티로신 또는 L-트립토판인 상기 (1)∼(6) 중 어느 하나의 방법.

발명의 효과

본 발명에 의해, 간편하고 생산 효율이 높은 아미노산의 제조법이 제공된다.

도 1 은 첨가하는 아미노산의 결정의 평균 입자 직경, 비표면적, 및 총 표면적과 배지에 축적되는 아미노산의 결정의 형상 및 회수율과의 관계를 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 사진은 세로 방향의 변이 1000㎛ 이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

1. 본 발명의 제조 방법에 사용되는 미생물

본 발명의 제조 방법에 사용되는 미생물은 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물이면 특별히 제한은 없고, 그 미생물은 자연으로부터 분리된 미생물이어도 되고, 또는 인위적으로 아미노산의 생산성이 개선된 미생물이어도 된다.

인위적으로 아미노산의 생산성이 개선된 미생물이란,

(a) 아미노산의 생합성을 제어하는 기구(機構)의 적어도 1 개를 완화 또는 해제하는 방법,

(b) 아미노산의 생합성에 관여하는 효소의 적어도 1 개를 발현 강화하는 방법,

(c) 아미노산의 생합성에 관여하는 효소 유전자의 적어도 1 개의 카피수를 증가시키는 방법,

(d) 아미노산의 생합성 경로로부터 그 아미노산 이외의 대사 산물로 분기하는 대사 경로의 적어도 1 개를 약화 또는 차단하는 방법, 및

(e) 야생형주에 비해, 아미노산의 아날로그에 대한 내성도가 높은 세포주를 선택하는 방법,

등의 방법을 단독 또는 조합하여 사용해서 취득되는 미생물을 들 수 있다.

상기 (a) 의 구체적인 방법은 Agric. Biol. Chem., 43, 105-111 (1979), J. Bacteriol., 110, 761-763 (1972) 및 Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323 (1993) 등, 상기 (b) 의 구체적인 방법은 Agric. Biol. Chem., 43, 105-111 (1979) 및 J. Bacteriol., 110, 761-763 (1972) 등, 상기 (c) 의 구체적인 방법은 Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323 (1993) 및 Agric. Biol. Chem., 39, 371-377 (1987) 등, 상기 (d) 의 구체적인 방법은 Appl. Environ. Micribiol., 38, 181-190 (1979) Agric. Biol. Chem., 42, 1773-1778 (1978) 등, 상기 (e) 의 구체적인 방법은 Agric. Biol. Chem., 36, 1675-1684 (1972), Agric. Biol. Chem., 41, 109-116 (1977), Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023 (1973) Agric. Biol. Chem., 51, 2089-2094 (1987) 등에 기재되어 있다.

또한 상기 (a)∼(e) 중 어느 1 개 또는 조합한 방법에 의한 아미노산을 생성, 축적하는 능력을 갖는 미생물의 조제 방법에 대해서는, Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996) section 14a, 14b 나 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, 1-35 (2003), 아미노산 발효, 학회 출판 센터, 아이다 히로시 등 (1986) 에 많은 예가 기재되어 있고, 또한 상기 이외에도 구체적인 아미노산을 생성, 축적하는 능력을 갖는 미생물의 조제 방법은 일본 공개특허공보 2003-164297, Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975), Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153 (1975), 일본 공개특허공보 소58-13599, J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283 (1958), 일본 공개특허공보 소63-94985, Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023 (1973), WO97/15673, 일본 공개특허공보 소56-18596, 일본 공개특허공보 소 56-144092 및 일본 공표특허공보 2003-511086 등 수많은 보고가 있고, 상기 문헌 등을 참조함으로써 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 조제할 수 있다.

상기한 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물로는, 상기 (a)∼(e) 의 방법이 적용될 수 있는 미생물 또는 상기 유전적 형질을 갖는 미생물이면 어느 미생물이어도 되고, 바람직하게는 원핵 생물, 보다 바람직하게는 세균을 들 수 있다.

원핵 생물로는, 에쉐리키아 (Escherichia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 바실러스속, 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 마이크로박테리움속 (Microbacterium), 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 아그로박테리움 (Agrobacterium) 속, 알리시클로바실러스속 ( Alicyclobacillus), 아나베나 (Anabena) 속, 아나시스티스 (Anacystis) 속, 아스로박터 (Arthrobacter) 속, 아조토박터 (Azotobacter) 속, 크로마티움 (Chromatium)속, 에르비니아 (Erwinia) 속, 메틸로박테리움 (Methylobacterium) 속, 포르미디움 (Phormidium) 속, 로도박터 (Rhodobacter) 속, 로도슈도모나스 (Rhodopseudomonas) 속, 로도스피리움 (Rhodospirillum) 속, 세네데스무스 (Scenedesmus) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속, 시네코카스 (Synechoccus) 속, 자이모모나스 (Zymomonas) 속 등에 속하는 미생물, 예를 들어, 에쉐리키아·콜라이, 바실러스·서브틸러스 (Bacillus subtilis), 바실러스·메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스·아밀로리퀴페시언스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스·코아귤란스 (Bacillus coagulans), 바실러스·리체니포미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스·푸밀러스 (Bacillus pumilus), 브레비박테리움·암모니아게네스 (Brevibacterium a㎜ oniagenes), 브레비박테리움·이마리오필룸 (Brevibacterium i㎜ariophilum), 브레비박테리움·삭카롤리티캄 (Brevibacterium saccharolyticum), 브레비박테리움·플라범 (Brevibacterium flavum), 브레비박테리움·락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 코리네박테리움·글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움·아세토애시드필룸 (Corynebacterium acetoacidphilum), 마이크로박테리움·암모니아필룸 (Microbacterium a㎜ oniaphilum), 세라티아·피카리아 (Serratia ficaria), 세라티아·폰티콜라 (Serratia fonticola), 세라티아·리퀴페시언스 (Serratia liquefaciens), 세라티아·마르세센스 (Serratia marcescens), 슈도모나스·에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스·푸티다 (Pseudomonas putida), 아그로박테리움·라디오박터 (Agrobacterium radiobacter), 아그로박테리움·리조게네스 (Agrobacterium rhizogenes), 아그로박테리움·루비 (Agrobacterium rubi), 아나베나·실린드리카 (Anabaena cylindrica), 아나베나·돌리올럼 (Anabenadoliolum), 아나베나·플로스아쿠아 (Anabaena flos - aquae), 아스로박터·오레센스 (Arthrobacter aurescens), 아스로박터·시트레우스 (Arthrobacter citreus), 아스로박터·글로브포미스 (Arthrobacter globformis), 아스로박터·히드로카보글루타미커스 (Arthrobacter hydrocarboglutamicus), 아스로박터·미소렌스 (Arthrobacter mysorens), 아스로박터·니코티아나 (Arthrobacter nicotianae), 아스로박터·파라피네우스 (Arthrobacter paraffineus ), 아스로박터·프로토포미에 (Arthrobacter protophormiae), 아스로박터·로세오파라피너스 (Arthrobacter roseoparaffinus), 아스로박터·술푸레우스 (Arthrobacter sulfureus), 아스로박터·우레아파시엔스 (Arthrobacter ureafaciens), 크로마티움·부데리 (Chromatium buderi ), 로마티움·테피덤 (Chromatium tepidum), 크로마티움·비노섬 (Chromatium vinosum), 크로마티움·와밍기 (Chromatium wamingii), 크로마티움·플루비어틸레 (Chomatium fluviatile), 에르비니아·우레도보라 (Erwinia uredovora), 에르비니아·카로토보라 (Erwinia carotovora), 에르비니아·아나나스 (Erwinia ananas), 에르비니아·헤르비콜라 (Erwinia herbicola), 에르비니아·펀크타타 (Erwinia punctata), 에르비니아·테레우스 (Erwinia terreus), 메틸로박테리움·로데시아남 (Methylobacterium rhodesianum), 메틸로박테리움·엑소토퀀스 (Methylobacterium extorquens), 포르미디움·에스피 (Phormidium sp .) ATCC29409, 로도박터·카프슬라터스 (Rhodobacter capsulatus), 로도박터·스페로이데스 (Rhodobacter spharoides), 로도슈도모나스·블라스티카 (Rhodopseudomonas blastica), 로도슈도 모나스·마리나 (Rhodopseudomonas marina), 로도슈도모나스·팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris), 로도스피릴럼·루브룸 (Rhodospirillum rubrum), 로도스피릴럼·살렉시겐스 (Rhodospirillum salexigens), 로도스피릴럼·사릴나럼 (Rhodospirillum salinarum), 스트렙토마이세스·암보파시엔스 (Streptomyces ambofaciens), 스트렙토마이세스·오레오파시엔스 (Streptomyces aureofaciens), 스트렙토마이세스·아우레우스 (Streptomyces aureus), 스트렙토마이세스·펀지시디커스 (Streptomyces fungicidicus), 스트렙토마이세스·그리세오크로모게네스 (Streptomyces griseochromogenes), 스트렙토마이세스·그리세우스 (Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스·리비단스 (Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스·올리보그리세우스 (Streptomyces olivogriseus), 스트렙토마이세스·라메우스 (Streptomyces rameus), 스트렙토마이세스·타나시엔시스 (Streptomyces tanashiensis), 스트렙토마이세스·비나세우스 (Streptomyces vinaceus), 자이모모나스·모빌리스 (Zymomonas mobilis) 등을 들 수 있고, 바람직한 원핵 생물로는, 에쉐리키아속, 세라티아속, 바실러스속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 슈도모나스속 또는 스트렙토마이세스속 등에 속하는 세균, 예를 들어, 상기한 에쉐리키아속, 세라티아속, 바실러스속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 슈도모나스속 또는 스트렙토마이세스속 등에 속하는 종을 들 수 있고, 보다 바람직한 세균으로는 에쉐리키아·콜라이, 코리네박테리움·글루타미쿰, 코리네박테리움·암모니아게네스, 코리네박테리움·락토퍼멘텀, 코리네박테이룸·플라범, 코리네박테리움·에피카시스, 브레비박테리움·플라범, 브레비박테리움, 락토퍼멘텀, 바실러스· 사티루스, 바실러스·메가테리움, 세라티아·마르세센스, 슈도모나스·푸티다, 슈도모나스·에르기노사, 스트렙토마이세스·세리카라 또는 스트렙토마이세스·리비단스를 들 수 있고, 특히 바람직하게는 에쉐리키아·콜라이, 코리네박테리움·글루타미컴, 브레비박테리움·암모니아게네스를 들 수 있고, 보다 구체적으로는 L-글루타민을 생산하는 능력을 갖는 FERM P-4806, ATCC14751 및 ATCC14752 등, L-발린을 생산하는 능력을 갖는 ATCC13005 및 ATCC19561 등, L-로이신을 생산하는 능력을 갖는 FERM BP-4704 및 ATCC21302 등, L-이소로이신을 생산하는 능력을 갖는 FERM BP-3757 및 ATCC14310 등, L-페닐알라닌을 생산하는 능력을 갖는 ATCC13281 및 ATCC21669 등, L-티로신을 생산하는 능력을 갖는 ATCC21652 등, 및 L-트립토판을 생산하는 능력을 갖는 DSM10118, DSM10121, DSM10123 및 FERM BP-1777 등을 들 수 있다.

또한, 상기의 FERM 번호로 표시되는 균주는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (일본), ATCC 번호로 표시되는 균주는 American Type Culture Collection (미국), DSM 번호로 표시되는 균주는 Deutsche Sa㎜lung von Mikroorganismen und Zellkulturen (독일) 로부터 각각 입수할 수 있다.

2. 본 발명의 아미노산의 제조 방법

본 발명의 아미노산의 제조 방법으로는, (1) 평균 입자 직경이 1∼120㎛ 인 아미노산의 결정을 그 아미노산의 결정 농도가 0.5g/l 이상이 되도록 배지에 첨가한 후, 그 배지 중에서 상기 1 의 그 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배양하고, 그 배지 중에 그 아미노산의 결정을 생성, 축적시켜, 배양물 중에서 그 아미노산의 결정을 채취하는 것을 특징으로 하는 아미노산의 제조 방법, 및 (2) 배지 중의 아미노산의 결정의 총 표면적이 0.02㎡/l 이상이 되도록 아미노산의 결정을 배지에 첨가한 후, 그 배지 중에서 상기 1 의 그 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배양하고, 그 배지 중에 그 아미노산의 결정을 생성, 축적시켜, 배양물 중에서 그 아미노산의 결정을 채취하는 것을 특징으로 하는 아미노산의 제조 방법을 들 수 있다.

상기 배지 중에서 그 미생물을 배양하는 방법은 아미노산의 결정을 첨가하는 이외에, 미생물의 배양에 사용되는 통상적인 방법에 따라 행할 수 있다.

즉, 그 미생물이 자화하여 얻는 탄소원, 질소원, 무기 염류 등을 함유하고, 그 미생물의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지, 바람직하게는 액체 배지이면, 천염 배지, 합성 배지의 어느 것이라도 사용할 수 있다.

탄소원으로는 그 미생물이 자화하여 얻는 것이면 되고, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수 분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류 등을 사용할 수 있다.

질소원으로는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 그 외의 질소 함유 화합물, 또는 펩톤, 육 엑기스, 효모 엑기스, 콘스티푸리카, 카세인 가수 분해물, 대두박 및 대두박 가수 분해물, 각종 발효균체, 및 그 소화물 등을 사용할 수 있다.

무기염으로는, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염 화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.

상기 (1) 의 제조 방법에서 첨가하는 아미노산의 결정은 평균 입자 직경이 1∼120㎛ 이고, 결정 농도가 0.5g/l 이상인 배지를 부여하는 아미노산의 결정이면, 첨가하는 아미노산의 결정의 평균 입자 직경, 양, 아미노산의 종류 및 결정형의 종류 등에 제한은 없지만, 첨가하는 아미노산의 결정의 평균 입자 직경으로는 1∼120㎛, 바람직하게는 2∼110㎛, 보다 바람직하게는 5∼70㎛, 더욱 바람직하게는 7∼50㎛, 특히 바람직하게는 10∼35㎛, 가장 바람직하게는 11∼13㎛ 를 들 수 있다.

아미노산의 결정의 양으로는, 첨가 후의 배지 중의 아미노산의 결정 농도가 0.5g/l 이상, 바람직하게는 2∼30g/l, 보다 바람직하게는 3∼25g/l, 더욱 바람직하게는 4∼22g/l, 특별히 바람직하게는 5∼20g/l, 가장 바람직하게는 5.5∼16.5g/l 가 되는 양을 들 수 있다.

또한, 상기한 첨가하는 아미노산의 결정의 평균 입자 직경과 첨가량의 조합으로는, 평균 입자 직경이 1∼120㎛ 이며, 결정 농도가 0.5g/l 이상인 배지를 부여하는 조합이면 특히 제한은 없지만, 평균 입자 직경이 1∼120㎛ 이고 결정 농도가 0.5g/l 이상, 바람직하게는 평균 입자 직경이 2∼110㎛ 이고 결정 농도가 2∼30g/l, 보다 바람직하게는 평균 입자 직경이 5∼70㎛ 이고 결정 농도가 3∼25g/l, 더욱 바람직하게는 평균 입자 직경이 7∼50㎛ 이고 결정 농도가 4∼22g/l, 특히 바람직하게는 평균 입자 직경이 10∼35㎛ 이고 결정 농도가 5∼20g/l, 가장 바람직하게는 평균 입자 직경이 11∼13㎛ 이고 결정 농도가 5.5∼16.5g/l 인 배지를 부여하는 조합을 들 수 있다.

아미노산의 결정을 배지에 첨가하는 시기는 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배지에 배양하기 전, 또는 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배지에 배양한 후의 배양 기간 중의 어느 시기라도 되지만, 바람직하게는 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배지에 배양한 후이고, 배지 중의 아미노산 농도가 포화 용해도에 이르는 전후로부터 배지 중에 아미노산의 결정이 석출되기 전, 보다 바람직하게는 배지 중의 아미노산 농도가 포화 용해도에 이른 후이고, 배지 중에 아미노산의 결정이 석출되기 전, 더욱 바람직하게는 배지 중의 아미노산 농도가 과포화에 있을 때로서, 배지 중에 아미노산의 결정이 석출되기 전을 들 수 있다. 단, 상기에서 배지 중에 아미노산의 결정이 석출되기 전이란, 바람직하게는 배지 중에 전혀 아미노산의 결정이 관찰되지 않는 시기를 말하는데, 결정 회수율의 면 등에 있어, 본 발명의 효과를 달성할 수 있는 범위에 있으면, 미량의 아미노산의 결정이 석출되어도 된다.

배지 중의 아미노산의 농도가 과포화에 있을 때 아미노산의 결정을 첨가하는 경우의 아미노산의 결정의 양으로서는, 첨가시의 배지량에 대한 양으로서 0.5g/l 이상, 바람직하게는 2∼30g/l, 보다 바람직하게는 3∼25g/l, 더욱 바람직하게는 4∼22g/l, 특히 바람직하게는 5∼20g/l, 가장 바람직하게는 5.5∼16.5g/l 를 들 수 있다.

배지 중의 아미노산의 농도가 과포화에 있을 때 아미노산의 결정을 첨가하는 경우에는, 첨가하는 아미노산의 결정의 평균 입자 직경과 양의 조합으로서는, 평균 입자 직경이 1∼120㎛ 인 결정을 첨가시의 배지량에 대한 양으로서 0.5g/l 이상, 바람직하게는 평균 입자 직경이 2∼110㎛ 인 결정을 첨가시의 배지량에 대한 양으로서 2∼30g/l, 보다 바람직하게는 평균 입자 직경이 5∼70㎛ 인 결정을 첨가시의 배지량에 대한 양으로서 3∼25g/l, 더욱 바람직하게는 평균 입자 직경이 7∼50㎛ 인 결정을 첨가시의 배지량에 대한 양으로서 4∼22g/l, 특히 바람직하게는 평균 입자 직경이 10∼35㎛ 인 결정을 첨가시의 배지량에 대한 양으로서 5∼20g/l, 가장 바람직하게는 평균 입자 직경이 11∼13㎛ 인 결정을 첨가시의 배지량에 대한 양으로서 5.5∼16.5g/l 첨가하는 조합을 들 수 있다.

또한, 상기 (2) 의 제조 방법에서 첨가하는 아미노산의 결정은 배지 중의 아미노산의 결정의 총 표면적이 0.02㎡/l 이상이 되는 아미노산의 결정이면, 첨가하는 아미노산의 결정의 평균 입자 직경, 양, 아미노산의 종류 및 결정형의 종류 등에 제한은 없지만, 첨가하는 아미노산의 결정으로는, 첨가 후의 배지 중의 아미노산의 결정의 총 표면적이 0.02㎡/l 이상, 바람직하게는 0.08∼70㎡/l, 보다 바람직하게는 0.2∼23㎡/l, 더욱 바람직하게는 0.4∼15㎡/l, 특히 바람직하게는 0.7∼9.3㎡/l, 가장 바람직하게는 2.0∼7.0㎡/l 이 되는 아미노산의 결정을 들 수 있다.

상기 (2) 의 제조 방법에서 첨가하는 구체적인 아미노산의 결정으로는, 평균 입자 직경이 1∼120㎛ 이고 결정 농도가 0.5g/l 이상, 바람직하게는 평균 입자 직경이 2∼110㎛ 이고 결정 농도가 2∼30g/l, 보다 바람직하게는 평균 입자 직경이 5∼70㎛ 이고 결정 농도가 3∼25g/l, 더욱 바람직하게는 평균 입자 직경이 7∼50㎛ 이고 결정 농도가 4∼22g/l, 특히 바람직하게는 평균 입자 직경이 10∼35㎛ 이고 결정 농도가 5∼20g/l, 가장 바람직하게는 평균 입자 직경이 11∼13㎛ 이고 결정 농도가 5.5∼16.5g/l인 배지를 부여하는 아미노산의 결정을 들 수 있다.

아미노산의 결정을 배지에 첨가하는 시기는 상기 (1) 의 제조법과 동일하다.

배지 중의 아미노산의 농도가 과포화에 있을 때에 아미노산의 결정을 첨가하는 경우의 아미노산의 결정으로는, 첨가시의 배지량으로부터 계산하였을 때의 총 표면적이 0.02㎡/l 이상, 바람직하게는 0.08∼70㎡/l, 보다 바람직하게는 0.2∼23㎡/l, 더욱 바람직하게는 0.4∼15㎡/l, 특히 바람직하게는 0.7∼9.3㎡/l, 가장 바람직하게는 2.0∼7.0 ㎡/l 인 아미노산의 결정을 들 수 있다.

구체적인 그 아미노산의 결정으로는, 평균 입자 직경이 1∼120㎛ 이고 첨가시의 배지량에 대한 양으로서 0.5g/l 이상인 결정, 바람직하게는 평균 입자 직경이 2∼110㎛ 이고 첨가시의 배지량에 대한 양으로서 2∼30g/l 인 결정, 보다 바람직하게는 평균 입자 직경이 5∼70㎛ 이고 첨가시의 배지량에 대한 양으로서 3∼25g/l 인 결정, 더욱 바람직하게는 평균 입자 직경이 7∼50㎛ 이고 첨가시의 배지량에 대한 양으로서 4∼22g/l 인 결정, 특히 바람직하게는 평균 입자 직경이 10∼35㎛ 이고 첨가시의 배지량에 대한 양으로서 5∼20g/l 인 결정, 가장 바람직하게는 평균 입자 직경이 11∼13㎛ 이고 첨가시의 배지량에 대한 양으로서 5.5∼16.5g/l 인 결정을 들 수 있다.

상기에서, 배양물 중의 배지량을 측정하는 방법으로는, 공지된 어떠한 방법 이어도 되지만, 예를 들어 배양물을 원심 분리함으로써, 배지와 균체 등의 불용물을 분리하고, 침강한 불용물의 체적을 측정하여, 배양물량으로부터 공제하는 방법 등을 들 수 있다.

또한, 상기 (1) 및 (2) 의 제조 방법에 있어서, 첨가하는 아미노산의 결정은 평균 비표면적이 0.06㎡/㎤ 이상인 아미노산의 결정, 바람직하게는 0.07∼7.2㎡/㎤, 보다 바람직하게는 0.07∼1.43㎡/㎤, 더욱 바람직하게는 0.1∼1.0㎡/㎤, 특히 바람직하게는 0.14∼0.72㎡/㎤ 인 아미노산의 결정을 들 수 있다.

상기 (1) 및 (2) 의 제조 방법에서 첨가하는 아미노산으로는, 미생물이 생산될 수 있는 아미노산이면 어느 아미노산이라도 되지만, 바람직하게는 L-글루타민, L-발린, L-로이신, L-이소로이신, L-페닐알라닌, L-티로신 및 L-트립토판에서 선택되는 아미노산, 보다 바람직하게는 L-글루타민, L-발린 및 L-로이신에서 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 L-글루타민을 들 수 있다. 단, L-페닐알라닌의α정은 본 발명의 제조 방법에서 첨가하는 아미노산의 결정에서 제외되어도 된다.

본 발명에서 사용되는 배지 첨가용의 아미노산의 결정은, 시판품 또는 공지된 방법, 예를 들어 발효 생산법 및 정제법으로 얻어지는 아미노산의 결정 등을 그대로, 또는 시판되는 아미노산의 결정 또는 상기한 공지된 방법으로 얻어지는 아미노산의 결정을 시판되는 분쇄기, 예를 들어 M4 형 자유 분쇄기 (나라 기계 제작소사 제조), 아토마이저 TAP-20 형 (도쿄 아토마이저 제작조사 제조), Air Classifying Mill (HOSOKAWA MICRON POWDER SYSTEMS사 제조) 등을 사용하여 목적으로 하는 평균 입자 직경을 갖는 아미노산의 결정을 조제함으로써도 취득할 수 있다.

예를 들어, 공지된 발효 생산법 및 정제법으로 얻어지는 평균 입자 직경이 약 110㎛ 인 아미노산의 결정을 M4 형 자유 분쇄기를 사용하여 스크린 Φ1.0㎜, 회 전수 4500rpm, 처리 속도 약 400KG/h 인 조건으로 분쇄함으로써, 평균 입자 직경이 약 45㎛ 인 아미노산의 결정을 취득할 수 있고, 그 아미노산의 결정을 또한 스크린Φ0.3㎜, 회전수 6000rpm, 처리 속도 약 200KG/h 인 조건으로 분쇄함으로써, 평균 입자 직경이 약 11㎛ 인 아미노산의 결정을 취득할 수 있다.

아미노산의 결정의 비표면적은 시판되는 측정기, 예를 들어 세이신 기업 주식회사 제조의 SK LASER MICRON SIZER LMS-24 (레이저 회절·산란식 입도 분포 측정 장치) 를 사용하여 측정할 수 있지만, 아미노산의 결정의 비표면적의 측정 시에는, 그 결정은 구상, 또한 상사계 (相似系) 로 가정하여 계산하는 것이 바람직하다.

아미노산의 결정의 총 표면적은, 아미노산의 결정의 비표면적과 첨가되는 양으로부터 계산할 수 있다.

배양은 통상적으로 진탕 배양 또는 심부 통기 교반 배양 등의 호기적 조건 하에서 행해진다. 배양 온도는 15∼40℃ 가 좋고, 배양 시간은 통상적으로 5 시간∼7 일간이다. 배양 중 pH 는 3.0∼9.0 으로 유지한다. pH 의 조정은 무기 또는 유기의 산, 알칼리 용액, 우레아, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 행한다.

또한, 배양 중 필요에 따라, 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.

프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양하는 때에는, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들어, lac 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양하는 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.

상기 방법에서 배지 중에 축적되는 아미노산으로는, 미생물이 생산될 수 있는 아미노산이면 어느 아미노산이어도 되고, 바람직하게는, L-글루타민, L-발린, L-로이신, L-이소로이신, L-페닐알라닌, L-티로신 및 L-트립토판에서 선택되는 아미노산, 보다 바람직하게는 L-글루타민, L-발린 및 L-로이신에서 선택되는 아미노산, 더욱 바람직하게는 L-글루타민을 들 수 있다.

또한, 상기 방법에서 배지 중에 축적되는 아미노산의 결정으로는, 평균 입자 직경이 15㎛ 이상, 바람직하게는 20㎛ 이상, 보다 바람직하게는 30㎛ 이상, 더욱 바람직하게는 40㎛ 이상, 특히 바람직하게는 50㎛ 이상, 가장 바람직하게는 60㎛ 이상인 결정을 들 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 배양물 중의 아미노산의 결정을 채취하는 방법으로는, 통상적인 아미노산의 정제 방법이면 어느 방법이어도 되고, 바람직하게는 배양 종료 후의 배양물 중의 균체와 아미노산의 결정을 직접, 그들의 입자 직경, 그리고 비중의 차이를 이용하여 아미노산의 결정을 분리, 정제하는 방법을 들 수 있다.

상기한 입자 직경, 그리고 비중의 차이를 이용하여 아미노산의 결정을 분리, 정제하는 방법으로는, 종래 공지된 방법인 중력 분급 분리법, 원심력 분급 분리법을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 원심력 분급 분리 방법, 이 원심력 분급 분리 방법 중에서도, 더욱 바람직하게는 디켄터형 원심 분리 방법을 들 수 있다.

상기 채취 방법에 의해, 충분히 정제된 아미노산의 결정을 높은 회수율로 얻을 수 있지만, 필요에 따라, 또한 활성탄이나 이온 교환 수지 등을 사용하는 통상적인 방법 또는, 유기 용매에 의한 추출, 결정화, 박층 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피 등에 의해 정제할 수 있다.

이하, 실시예를 기재하지만, 본 발명은 그 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

L-글루타민의 결정의 제조 (1)

코리네박테리움·글루타미컴 ATCC14752 를, 생산 배지 [250g/L 글루코오스, 30g/L NH₄Cl, 1.0g/L K₂HPO₄, 1.0g/L KH₂PO₄, 0.5g/L MgSO₄·7H₂O, 20mg/L FeSO₄, 2 mg/L MnSO₄·4H₂O, 10㎍/L 비오틴, 1mg/L 사이아민염산염, pH6.8] 이 들어있는 500 L 용량의 배양기(Jar fermenter) 중에서, 적절 pH, 배양 온도를 조정하면서 배양하였다. 배양 개시 후, 배지 중의 L-글루타민의 농도가 그 포화 용해도에 달한 후이며, 배지 중에 L-글루타민의 결정이 석출되기 전에, 평균 입자 직경 40㎛ 인 L-글루타민의 결정을 배지 중에 결정 농도가 16.5g/l 가 되도록 첨가하였다. 그 후, 배양을 계속하여, 배지 중에서 L-글루타민의 결정을 성장시키면서 배양을 계속하였다. 배양 개시부터 약 96 시간에 배양을 종료함으로써, 90g/l 의 L-글루타민을 함유하는 배양물을 210L 취득하였다. 토모에 공업 (주) 제조의 디켄 터 (PTM006 형) 를 사용하여, 그 배양물로부터 6.2㎏ 인 L-글루타민 결정을 분리, 취득하였다. 이 결정의 평균 입자 직경은 62㎛ 이었다. 이 때, 배지 중에 석출된 결정의 디켄터에 의한 회수율은 98.9％ 이었다.

실시예 2

L-글루타민의 결정의 제조 (2)

배양 중에 첨가하는 결정으로서 평균 입자 직경이 도 1 에 나타내는 입자 직경인 L-글루타민의 결정을 사용하는 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 방법으로 배양하여, L-글루타민의 결정을 취득하였다. 또한, L-글루타민의 결정의 비표면적은 세이신 기업 주식회사 제조의 SK LASER MICRON SIZER LMS-24 (레이저 회절·산란식 입도 분포 측정 장치) 를 사용하여 측정하였다. 단, L-글루타민의 결정의 비표면적의 측정 시에는 그 결정은 구상, 또한 상사계라고 가정하여 계산하였다.

첨가된 L-글루타민의 결정 및 발효 생산으로 얻어진 L-글루타민의 결정의 형상, L-글루타민의 결정의 회수율, 건조물 함량 등을 도 1 에 나타낸다.

도 1 에 있는 대로, 배지 중에 결정을 첨가하지 않는 경우에는, 배지 중에 미세한 결정이 석출되기 때문에, 원심 분리에 의한 결정 회수율이 저하되고, 또한 첨가되는 아미노산의 입자 직경은 작은 것이 결정 회수율이 상승되는 경향이 있다는 것을 알았다. 또한, 결정을 첨가하였을 경우는, 배양 종료시에 얻어지는 배지 중의 아미노산의 결정의 평균 입자 직경은 모두 30㎛ 이상이었다. 또한 디켄터로 분리한 결정을 바스켓형 원심 분리기로 탈액하고, 건조하여 얻어진 결정의 함량 (건조물 함량) 은, 총 표면적이 큰 결정을 첨가함으로써 향상된다는 것도 알았다.

이상으로부터, 본 발명의 제조법에 의해, L-글루타민뿐만이 아니라, 여러 가지의 아미노산의 발효 생산에 있어서, 아미노산의 결정을 배지에 첨가함으로써 배지 중의 아미노산의 과포화도를 일정 이하로 하고, 또한 종자 결정으로서 적당한 수의 아미노산의 결정을 배지에 존재시키는 것, 즉 배지에 첨가하는 아미노산의 결정의 평균 입자 직경 및 양, 또는 그 결정의 총 표면적을 조정함으로써, 배양 중에 배지 중에 석출되는 아미노산의 결정의 입자 직경을 컨트롤 할 수 있고, 그 결과, 균체와의 분리가 용이하고, 또한 회수율도 높은 아미노산의 결정이 얻어진다는 것을 알 수 있었다.

본 발명에 의해, 간편하고 효율적으로 아미노산을 제조할 수 있다.

Claims

아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배지에 배양하고, 배지 중의 아미노산 농도가 포화 용해도에 이른 후 및 배지 중에 아미노산의 결정이 석출되기 전, 평균 입자 직경이 7∼50㎛ 인 아미노산의 결정을 그 아미노산의 결정의 농도가 0.5g/l 이상이 되도록 상기 배지에 첨가한 후, 그 배지 중에서 그 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 상기 미생물을 배양하고, 그 배지 중에 상기 아미노산의 결정을 평균 입자 직경이 30㎛ 이상인 아미노산의 결정으로 성장시키고, 축적시켜, 배양물 중에서 그 아미노산의 결정을 채취하는 것을 특징으로 하는 아미노산의 제조 방법으로서, 상기 배양물 중에서 아미노산을 채취하는 방법이, 아미노산을 생산하는 미생물과 축적시킨 아미노산의 결정을, 그들의 입자 직경의 차이에 기초하여 또는 그들의 비중의 차이에 기초하여 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배지에 배양하고, 배지 중의 아미노산 농도가 포화 용해도에 이른 후 및 배지 중에 아미노산의 결정이 석출되기 전, 평균 입자 직경이 7∼50㎛ 인 아미노산의 결정을 배지 중의 아미노산의 결정의 총 표면적이 0.02㎡/l 이상이 되도록 아미노산의 결정을 상기 배지에 첨가한 후, 그 배지 중에서 그 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 상기 미생물을 배양하고, 그 배지 중에 상기 아미노산의 결정을 평균 입자 직경이 30㎛ 이상인 아미노산의 결정으로 성장시키고, 축적시켜, 배양물 중에서 그 아미노산의 결정을 채취하는 것을 특징으로 하는 아미노산의 제조 방법으로서, 상기 배양물 중에서 아미노산을 채취하는 방법이, 아미노산을 생산하는 미생물과 축적시킨 아미노산의 결정을, 그들의 입자 직경의 차이에 기초하여 또는 그들의 비중의 차이에 기초하여 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

첨가하는 아미노산의 결정이 0.06㎡/㎤ 이상인 비표면적을 갖는 아미노산의 결정인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

생성, 축적시키는 아미노산의 결정의 평균 입자 직경이 15㎛ 이상인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

아미노산이 L-글루타민, L-발린, L-로이신, L-이소로이신, L-페닐알라닌, L-티로신 또는 L-트립토판인 방법.
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