WO2004096246A1

WO2004096246A1 - 抗アレルギー用組成物

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Publication number: WO2004096246A1
Application number: PCT/JP2004/002456
Authority: WO
Inventors: Sayo Inoue; Toshio Fujii; Daisuke Fujiwara; Akira Saiki; Minoru Takahashi; Koichiro Yamauchi; Masami Gotou; Satoshi Nishida; Keiji Deuchi; Hideyuki Wakabayashi; Toshihiro Komeda
Original assignee: Kirin Beer Kabushiki Kaisha
Priority date: 2003-03-13
Filing date: 2004-02-27
Publication date: 2004-11-11
Also published as: EP1759597B1; JP2005137357A; JPWO2004096246A1; EP1759597A2; JP2005139160A; CN1767839B; TW200500074A; ES2320920T3; EP1634600A4; CA2518947A1; AU2004233658A1; JP3585487B1; ATE421256T1; CN1767839A; TWI324068B; DE602004019255D1; KR20050109985A; AU2004233658B2; HK1090289A1; US20060088513A1

Abstract

　本発明の課題は、アレルギーの予防・治療に有用な抗アレギー用組成物、その調製法及びその食品及び飲料等としての利用を提供することにある。　解決手段は、卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌としてＬ．paracasei　ＫＷ３１１０株を用いた場合と同等、或いはＬ．paracasei　ＫＷ３１１０株を用いた場合に比較して、６０％以上のインターロイキン１２産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの５０％未満のインターロイキン４生成量を示す乳酸菌を有効成分とする抗アレルギー用組成物からなる。本発明は、本発明の抗アレルギー用組成物の有効成分である高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の取得方法及び本発明の抗アレルギー用組成物の食品及び飲料等への利用、更には製剤化により、経口的に投与する抗アレルギー剤としての利用を包含する。

Description

明細書抗アレルギー用組成物技術分野

本発明^は、アレルギーの予防 ·治療に有用な抗アレルギ一用組成物、特に、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を有効成分とする抗ァレルギ一用組成物、及び該乳酸菌の取得方法、更には、該抗アレルギー用組成物の食品及び飲料等としての利用に関するものである。背景技術

先進国においてアレルギーは最も頻度が高い疾患のひとつである。ァレルギ一の発症機構は通常 I型から I V型の 4つに分類される。 I型ァレルギ一は、 I g E抗体が関与し、花粉症、喘息、じん麻疹、ァナフイラキシーショックなどに代表される。 I I型アレルギーは I g G抗体、 I g M抗体が関与し、補体系を活性化する細胞傷害性反応であり、胎児赤芽球症や自己免疫性溶血性貧血がこれにあたる。 I I I 型アレルギーは、抗原抗体複合体によって起こる組織傷害であり、ァルックス反応や血清病、糸球体腎炎に代表される反応である。 I V型アレルギ一は、 T細胞が関与する遅延型アレルギー（遅延型過敏症）であり、ッベルクリン反応や接触性皮膚炎に代表される反応である。アレルギーのうち、食物アレルギ一の発症には、 I型、 I I型及び I V型が関与するとされている。一方、環境アレルギー、すなわち花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、ァレルギ一性鼻炎、アレルギー性結膜炎などのアレルギーは、主として I 型の発症機構を持つことが知られている。

前記の I型アレルギーはアレルゲン特異的 I g Eの誘導とヒスタミンやロイコトリェン等のケミカルメディエーターの放出をその特徴とする, 免疫応答は、種々の細胞による相互作用により生ずるが、これに関わる細胞の一種としてヘルパー T細胞（Th) がある。ヘルパー T細胞は、 T細胞亜群に分類され、抗原を認識して各種サイト力イン（ヘルパー因子）を産生し、免疫応答誘導を調節する働きを持つ。ヘルパー T細胞は、そのサイトカイン産生能から Th 1細胞と Th 2細胞に分類される。 B 細胞において抗体のクラススィッチが起こり、 I g E抗体が産生されるようになるには、 I L一 4、 I L一 5、 I L一 1 3等の T h 2サイト力インを必要とする。実際、アレルギー患者のリンパ球には T h 2細胞が増加していることが分かっている。つまり、外界から侵入したアレルゲンは樹状細胞 · マクロファージ等の抗原提示細胞によってその一部を M HC class II 分子に結合した状態で T細胞に対して提示され、 Th 2 細胞が活性化 ·分化する。 T h 2細胞が放出した T h 2サイト力インは B細胞のクラススィツチを誘導し、 I _g E抗体が産生され、 I g E抗体は組織内のマスト細胞や血中の好塩基球表面の F c · Rに結合する。ァレルゲンは次回の侵入時にマスト細胞や好塩基球表面に結合している I g E抗体に認識され、 I g E扰体間に架橋が形成される。この刺激を引き金としてマスト細胞や好塩基球がのケミカルメディエー夕一を爆発的に遊離することによって、ァレルギ一の諸症状が現れる。

I g Eやケミカルメディエーターを介するアレルギーの予防 ·治療においては、例えばヒスタミンレセプターにヒスタミンと拮抗的に結合することによって末梢神経からの信号伝達を阻害する抗ヒスタミン剤、ケミカルメディエー夕一の産生細胞の活性を弱めて症状の軽減を試みる抗ァレルギ一剤、免疫応答性を弱めることによって炎症を軽減するステロイド剤、アレルゲンそのものを定期的に注射することにより寛容を誘導する減感作療法などがある。しかし、そのいずれもが副作用が問題視されており、効果についても決定的なものがない。

近年 I g Eを抑制するために、 T h 2サイトカインの産生を調節する方法に注目が集まっている。結核菌や溶連菌、乳酸菌などのある種の細菌は T h 1免疫を増強することにより、 T h 2免疫を抑制し、その結果 I g Eを低下させることが報告されている（臨床免疫、 1 9 9 9年、第 3 2巻、 4 54頁；インターナショナル · アーカイブス ·ォブ . アレルギ一 ' アンド ' ィムノロジー、 1 9 9 8年、第 1 1 5巻、 2 7 8頁；特開平 9一 2 9 5 9号公報）。

中でも乳酸菌は安全性の面から食品などへの応用が容易であり、有用な素材である。しかし一概に乳酸菌といっても全ての乳酸菌に Th 1免疫を増強させる強い効果があるわけではなく、有用な株の選択をすることが必須となってくる。抗ァレルギ一乳酸菌としては、 L . rhamnosus L G G株が公知であり妊婦に摂取させることにより、子供のアトピー性皮膚炎発症が抑制されることが示されている（ランセット、 2 0 0 1年、第 3 5 7巻、 1 0 7 6頁）。乳酸菌を抗アレルギー剤として用いることについては、いくつかの特許公報でも開示されている。例えば、特開平 9 一 2 9 5 9号公報には、 L. ァシドフィルス、 L. ブレビス、 L. ブフネリ、及び L. カゼィ等の乳酸菌を添加してマウスリンパ球を培養した際の I g E産生量が 3 O n g/m 1以下のものを抗アレルギー剤として用いることについて、特開平 1 0— 3 0 9 1 7 8号公報には、ビフィドバクテリゥム ' インファンテイス、ビフィドバクテリゥム · ブレーべ、ビフィドバクテリゥム · ロンガム及びビフィドバクテリゥム · ビフイダム等のビフィズス菌を特に食物アレルギーを治療するための抗ァレルギ —剤として用いることについて、及び、特開 2 0 0 0— 9 5 6 9 7号公報には、ェンテロコッカス ' フエカリス、ラクトバシルス ' ロイテリ一などの乳酸菌をアレルギ性気管支喘息、ァレルギ性鼻炎及びァトピー性皮膚炎等の I型アレルギーの抑制剤として用いることについて、それぞれ開示されている。

一方で、乳酸菌等が、 T h 1免疫を増強することは I L 1 2や I F N - ガンマ一などの産生を介してマクロファージゃキラー T細胞、 NK細胞の細胞性免疫の活性化を意味し、ウィルスや細菌感染、ガンの発生に対して抵抗することにつながることが分かっている。具体的にはマクロファージが産生する I L一 1 2は未分化のヘルパー T細胞の T h 1細胞への分化、単球 · マクロファージ · NK細胞の活性化を通して、外敵 - ガンに対する抵抗性を獲得させる。従って強い I L一 1 2産生を誘導することのできる乳酸菌株は免疫賦活剤として使用することができることが示唆されている（キャンサー 'ィムノロジー · ィムノセラピー、 2 0 0 0年、第 4 9巻、 1 5 7頁；特開平 7 _ 2 2 8 5 3 6号公報；特開 2 0 0 2 - 8 0 3 6 4号公報）。

また、乳酸菌が腸管へ生きて到達し、様々な効果を発揮するためには、胃酸、胆汁酸という消化液に対して耐性であることが必要であるといわれている（学会出版センター、腸内フローラシンポジウム 3、腸内フローラとプロバイオテイクス、 p 4 1 - 5 5、光岡知足編、 1 9 9 8年）。また、腸管への付着性の高い乳酸菌は腸管にとどまってその効果を十分に発揮することが知られている。従って、経口で乳酸菌を摂取する場合、当該乳酸菌の機能性の高さもさることながら、生きて腸管に届いてとどまることが望ましいとされている。

近年、アトピー性皮膚炎や花粉症など、アレルギーに起因すると考えられる体質変化をおこした人が多く見受けられ、社会問題化している。その中でも特に症状が重い患者に対しては、各種薬剤を使用しての治療行為が行われている。しかし、大部分の対象者は本格治療を行うにまでは至っておらず、日常生活をおこなっていく上で、民間療法を含め、対処療法を行って対処しているのが実情である。

そのような状況に鑑みて、最近になって食餌によってアレルギーを抑えようとする研究が活発に行われている。その結果、例えば、シソ油や魚油、特定の茶ポリフエノール等、種々の飲食品の成分に抗アレルギー効果を見い出して、それらを用いた対処が行われている。

抗ァレルギ一効果を有する飲食品の成分として、上述のように特定の乳酸菌にも同様な効果が知られてきており、この乳酸菌を用いたョーグル卜ゃ乳酸菌飲料が、抗アレルギー効果を有する飲食物として一部実用化されている。この種の抗ァレルギ一用飲食品による予防或いは治療では、安全で、かつマイルドな条件で摂取することが可能である代わり、毎日継続摂取することが必要であり、尚かつ該継続摂取することが可能な量で効能が発揮されることが必要である。しかしながら、従来のものでは、その高抗ァレルギ一活性の菌株を選択取得する方法が明確にされていなかったため、有力な菌株が取得されておらず、実用上満足できるものではなかった。更に、従来の乳酸菌の使用においては、ヨーグルトや乳酸菌飲料におけるように乳酸菌による発酵に主な目的が置かれ、抗アレルギー作用は副次的な位置付けとされ、更に、ヨーグルトや乳酸菌飲料の場合は、チルド流通が必須で日持ちしないものが多く、取扱いの自由度が少ないという問題もあったりして、手軽に、毎日継続摂取することが可能な、効能のある本格的なアレルギーの予防或いは治療用の飲食品としては満足のいくものではなかった。したがって、昨今、これらの要件を満足する効能のある抗ァレルギ一用組成物やそれを用いた飲食品等の開発が要望されている。

本発明の課題は、アレルギーの予防 ·治療に有用な抗アレルギー用組成物、特に、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を有効成分とする抗ァレルギ一用組成物、及び該乳酸菌の取得方法、更には、該抗アレルギー W 機能を有する食品及び飲料等を提供することにある。ここで「抗アレルギー機能を有する」とは、「アレルギーの予防 ' 治療に効果を発揮する、及びノ又は、アレルギ一症状を改善 '緩和する」との意味である。

本発明者は、花粉症 · アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎などの環境アレルギーの予防 · 治療を目的として、その有効成分について探索する中で、まず、その安全性の面から乳酸菌に着目し、鋭意探索した結果、 T h 2の活性化阻害と T h 1活性化をバランスよく行うことができる乳酸菌を選択することにより、高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌を得ることが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌の取得方法は、

T h 1 / T 2バランスに着目した方法である点で特徴を有する。従来の方法は、 I g Eを測定して抗アレルギー活性の評価を行なっているが、 I g Eがアレルギーに関係していることは疑いのない事実であるが、一方で例えばァトピー患者には高 I g Eのヒトと低 I g Eのヒトがいることが分かっているように、 I g Eの程度で全てを説明できないのも事実である。アレルギーの発症には I g E以外にも好酸球の増加やリンパ球の局所への浸潤を起こさせるケモカインの放出など様々な事象が総合的に関与することが分かっている。したがって、本発明では、 I g Eの増加、好酸球の増加ゃケモカインまで総合的に説明できる T h 1 Z T h 2 バランスに着目し、該バランスを指標として、抗アレルギー性の菌株を評価、分離する方法を開発することにより、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を得ることに成功した。

本発明の抗アレルギー用組成物は、 T h 2の活性化の指標としてのィン夕ーロイキン 4 ( I L一 4 ) 及び T h 1の免疫の活性化の指標となるインターロイキン 1 2 ( I L - 1 2 ) の生成量の特定のバランスを持つ乳酸菌を有効成分とする抗ァレルギ一用組成物からなり、卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌として L . paracaseiKW 3 1 1 0株を用いた場合と同等、或いは L . paracasei K W3 1 1 0株を用いた場合に比較して、 6 0 %以上のインターロイキン 1 2産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの 5 0 %未満のィンターロイキン 4生成量を示す乳酸菌を有効成分とする抗アレルギー用組成物からなる。本発明においては、上記本発明の抗アレルギー活性を有する乳酸菌について、該 KW 3 1 1 0株に対して、 7 0 %以上のィンターロイキン 1 2産生量の乳酸菌； 7 0 %以上のインターロイキン 1 2 産生量、かつ 40 %未満のィンターロイキン 4産生量の乳酸菌を活性成分とすることを包含し得るものであり、更に、本発明で取得された抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌、 KW4 1 1 0、 KW 3 9 2 5、 KW 3 9 2 6の抗アレルギー活性と対比して、 KW4 1 1 0と同等か、それ以上の抗アレルギー活性を示す乳酸菌； KW 3 9 2 5と同等か、それ以上の抗アレルギー活性を示す乳酸菌； KW 3 9 2 6と同等か、それ以上の抗ァレルギ一活性を示す乳酸菌を活性成分とすること包含し得るものである。

本発明は、該本発明の抗ァレルギ一用組成物の有効成分である高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌の取得方法を包含するものである。更に、本発明は、本発明の抗アレルギー用組成物の飲食品への利用、及び製剤化により、経口的に投与する抗ァレルギ一用剤としての利用を包含するものである。本発明の抗ァレルギ一用組成物の有効成分の一つである L. paracasei KW 3 1 1 0株は、消化液に対して耐性であり、腸管への付着性の高い乳酸菌であり、抗アレルギ一剤として経口的に投与した場合に特に優れた効果を奏する。本発明で抗アレルギー用組成物の有効成分として使用される L . paracasei K W 3 1 1 0は、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基く、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に、 F E R M B P— 0 8 6 3 4として寄託されている。

本発明の抗ァレルギ一用組成物の飲食品への利用については、特に、本発明の抗アレルギー用組成物の有効成分である高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌を茶飲料のような飲料に適用し、抗アレルギー機能を有する飲料を提供することを包含する。本発明の抗ァレルギ一機能を有する飲料は、嗜好性、保存性が高い飲料とすることができ、毎日継続摂取することが可能であり、尚かつ該継続摂取することが可能な量で効能が発揮される抗アレルギー機能を有する飲料として調製できる。本発明において、高抗アレルギ一活性を有する乳酸菌は、これを加熱殺菌のような処理により殺菌した形で用いることができ、例えば、本発明における乳酸菌を加熱殺菌した後に添加して、殺菌済みの密封容器入り飲料として製造することにより、飲料自体の香味を保持し、飲料製品として安定し、しかも抗ァレルギ一機能が保てる密封容器入り飲料として製品化することが可能である。更に、密封容器入り飲料として製造する場合には、用いる乳酸菌の濃度を調整することにより、抗アレルギー機能を保持しつつ、しかも、飲料自体の香味の保持機能を増加して嗜好性、保存性の高い飲料を製造することが可能である。本発明においては、抗アレルギー作用及び製品の保存、安定化の観点から、乳成分を含まない、すなわち、例えば、果汁入り清涼飲料或いは茶飲料のような乳成分非配合の形の、各種タイプの飲料とすることが特に好ましい。

本発明の抗アレルギー用組成物の飲食品への利用においては、本発明により採取された高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を、 2種以上

訂正された用紙（規則 91) 併存させて用いることができる。その際に、それぞれの飲食品や乳酸菌

8.

訂正された用紙（規則 91) に合わせて、その組み合わせや、配合量を調製することができる。更に、他の抗ァレルギ一用組成物との配合若しくは併用も行うことができる。発明の開示

すなわち本発明は、卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌として L actobacillus paracasei KW3 1 1 0株を用いた場合と同等、或いは L actobacillus paracasei" KW 3 1 1 0 株を用いた場合に比較して、 6 0 %以上のィンタ一ロイキン 1 2産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの 5 0 %未満のインタ一ロイキン 4生成量を示す乳酸菌を有効成分として含んでなることを特徴とする抗アレルギー用組成物（請求項 1 ) や、卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌として L ac t obac i 11 us paracasei K W 3 1 1 0株を用いた場合と同等、或いは L ac tobac i 1 lus paracasei KW 3 1 1 0株を用いた場合に比較して、 7 5 %以上のインターロイキン 1 2産生量を示す乳酸菌を有効成分とすることを特徴とする請求項 1記載の抗アレルギー用組成物（請求項 2 ) や、卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、乳酸菌無添加コントロールの 4 0 %未満のィンタ一ロイキン 4生成量を示す乳酸菌を有効成分とすることを特徴とする請求項 1又は 2記載の抗ァレルギ一用組成物（請求項 3) や、卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌として L actobaci 1 lus paracasei KW 3 1 1 0株を用いた場合と同等、或いは Lactobacillus paracasei KW3 1 1 0株を用いた場合に比較して、 7 5 %以上のインタ一ロイキン 1 2産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの 40 %未満のィンタ一ロイキン 4生成量を示す乳酸菌を有効成分として含んでなることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載の抗アレルギー用組成物（請求項 4) や、卵白ァルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌として L actobacillus paracasei K W 3 1 1 0株を用いた場合と同等、或いは Lactobacillus paracasei K W 3 1 1 0株を用いた場合に比較して、 8 0 %以上のインターロイキン 1 2産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの 3 0 %未満のィン夕一ロイキン 4生成量を示す乳酸菌を有効成分として含んでなることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載の抗アレルギー用組成物（請求項 5) や、請求項 1〜 5のいずれか記載のマウス脾臓由来リンパ球のインターロイキン 1 2及びィンターロイキン 4生成量を示す乳酸菌が、 Lactobacillus, paracasei KW 3 1 1 0株、 Lactobacillus plantarum K W 4 1 1 0株、 Lactobacillus paracasei KW 3 9 2 5株、 Lactobacillus paracasei K W 3 9 2 6株、又は Streptococcus salivarius K W 3 2 1 0であることを特徴とする抗アレルギー用組成物（請求項 6) や、請求項 1〜 5のいずれか記載のマウス脾臓由来リンパ球のィンターロイキン 1 2及びインターロイキン 4生成量を示し、且つ、消化液に対して耐性であり、腸管への付着性の高い乳酸菌である L actobacillus paracasei KW 3 1 1 0 株を有効成分とする抗アレルギー用組成物（請求項 7 ) や、アレルギーが、花粉症、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、又はァトピー性皮膚炎であることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の抗アレルギ一用組成物（請求項 8) や、抗アレルギー用組成物が、医薬であることを特徴とする請求項 8記載の抗ァレルギ一用組成物（請

0 求項 9) や、抗アレルギー用組成物が、飲食品であることを特徴とする請求項 8記載の抗アレルギ一用組成物（請求項 1 0) からなる。

また本発明は、卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養し、被検乳酸菌として L actobacillus paracasei KW 3 1 1 0株を用いた場合と同等、或いは L. paracasei KW 3 1 1 0株を用いた場合に比較して、 6 0 %以上のインタ一ロイキン 1 2産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの 5 0 %未満のィンターロイキン 4生成量を示す乳酸菌を分離することを特徴とする高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の取得方法（請求項 1 1 ) や、請求項 1 1の方法により分離した乳酸菌を、培地を用いて培養し、増殖することを特徴とする高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌の製造方法（請求項 1 2) や、培地を用いて培養し、増殖した乳酸菌の坊アレルギー活性を確認することを特徴とする請求項 1 2 記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の製造方法（請求項 1 3 )や、増殖した乳酸菌の抗アレルギー活性の確認が、卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁した培地に、該乳酸菌を添加して培養し、インターロイキン 1 2及びインター口ィキン 4の産生量を測定することにより行われることを特徴とする請求項 1 3記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の製造方法（請求項 1 4) や、請求項 1 2〜 1 4のいずれか記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の製造方法により製造された乳酸菌を、医薬又は飲食品に配合し、容器に充填し、密封することを特徴とする密封容器入り医薬品又は飲食品の製造方法（請求項 1 5) や、請求項 1〜 1 0のいずれか記載の抗アレルギー用組成物をアレルギー疾患の予防及び Z又は治療のための処置に用いることを特徴とするァレルギ一疾患の予防及び Z又は治療方法（請求項 1 6 ) や、アレルギー疾患が、花粉症、気管支喘息、アレルギ一性鼻炎、アレルギー性結膜炎、又はアトピー性皮膚炎であることを特徴とする請求項 1 6記載のアレルギー疾患の予防及び/又は治療方法 (請求項 1 7 ) や、アレルギー疾患の予防及び Z又は治療のための請求項 1〜 1 0のいずれか記載の抗アレルギー用組成物の使用（請求項 1 8 ) や、アレルギー疾患の予防及びノ又は治療が、花粉症、気管支喘息、ァレルギ一性鼻炎、アレルギー性結膜炎、又はアトピー性皮膚炎の予防及び/又は治療であることを特徴とする請求項 1 8記載の抗ァレルギ一用組成物の使用（請求項 1 9 ) からなる。

さらに本発明は、請求項 1〜 7のいずれか記載の抗アレルギー活性を有する乳酸菌を活性成分として添加したことを特徴とする抗アレルギー機能を有する飲食品（請求項 2 0 ) や、抗アレルギー活性を有する乳酸菌を、 1 日に摂取する飲食品の量当たり、 5 X 1 0 ⁹個以上となるように含有させたことを特徴とする請求項 2 0記載の抗アレルギー機能を有する飲食品（請求項 2 1 ) や、飲料又は食品が、アレルギーの原因となる成分を含有していないことを特徴とする請求項 2 0又は 2 1記載の抗ァレルギ一機能を有する飲食品（請求項 2 2 ) や、飲料又は食品が、ァレルギ一の原因となる成分を含有しない錠剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、又はドリンク剤であることを特徴とする請求項 2 2記載の抗アレルギー機能を有する飲食品（請求項 2 3 ) や、乳酸菌を、殺菌して用いることを特徴とする請求項 2 0〜 2 1のいずれか記載の抗ァレルギ一機能を有する飲食品（請求項 2 4 ) や、請求項 1〜 7のいずれか記載の抗アレルギー活性を有する乳酸菌を活性成分として添加したことを特徴とする抗アレルギー機能を有する飲料（請求項 2 5 ) や、飲料が、乳成分非配合密封容器入り飲料であることを特徴とする請求項 2 2記載の抗ァレルギ —機能を有する飲料（請求項 2 6 ) や、飲料が密封容器入り果汁含有清涼飲料又は茶飲料であることを特徴とする請求項 2 5又は 2 6記載の抗

1 2 アレルギー機能を有する飲料（請求項 2 7 ) や、密封容器入り飲料において、添加する乳酸菌が、飲料 1 0 0 gあたり l O S l O ^{1 1}個の範囲であることを特徴とする請求項 2 5〜 2 7のいずれか記載の抗アレルギ一機能を有する飲料（請求項 2 8 )や、添加する乳酸菌が L actobacillus paracasei KW 3 1 1 0又はその変異株であることを特徴とする請求項 2 0〜 2 8のいずれか記載の抗ァレルギ一機能を有する食品又は飲料 (請求項 2 9) や、食品又は飲料が、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、又は病者用食品として調製されていることを特徴とする請求項 2 0〜 2 9のいずれか記載の抗アレルギー機能を有する食品又は飲料 (請求項 3 0 ) や、滅菌した食品又は飲料に、実質的に無菌状態において、請求項 1〜 7のいずれか記載の高抗アレルギ一活性を有する乳酸菌、又は該乳酸菌を殺菌したものを配合し、容器に充填して密封することを特徴とする抗アレルギー機能を有する密封容器入り飲食品の製造方法 (請求項 3 1 ) や、卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し、被検乳酸菌を添加して培養することにより産生されるィン夕一ロイキン 1 2及び/又はィンターロイキン 4の量を測定することを特徴とする乳酸菌の抗ァレルギ一活性の測定方法（請求項 3 2 ) や、被検乳酸菌を添加して培養することにより産生されるインターロイキン 1 2及び Z又はインターロイキン 4の量を、 L actobacillus paracasei K W 3 1 1 0株を用いた場合と比較して評価することを特徵とする請求項 3 2記載の乳酸菌の抗アレルギー活性の測定方法（請求項 3 3) や、請求項 1〜 7のいずれか記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌に、担体、賦形剤及びノ又はその他の補助剤を添加して製剤化したことを特徴とする抗ァレルギ一剤（請求項 3 4)や、請求項 1〜 7のいずれか記載の高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌からなる医薬品（請求項 3 5 ) や、乳酸菌を用いて製造される或いは乳酸菌

13 を含有する飲料又は食品の一部、又は全部を請求項 1〜 7のいずれか記載の高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌で代替することを特徴とする抗アレルギー機能を有する飲食品（請求項 3 6 ) 'や、乳酸菌を用いて製造される或いは乳酸菌を含有する飲料又は食品の乳酸菌の一部、又は全部を請求項 1〜 7のいずれか記載の高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌で代替することを特徴とする抗ァレルギ一機能を有する飲料又は食品の製造方法（請求項 3 7 ) からなる。

本発明は、 T h 2の活性化の指標としてのインタ一ロイキン 4 ( I L 一 4)及び T h 1の免疫の活性化の指標となるィンターロイキン 1 2 ( 1 L - 1 2 ) の生成量の特定のバランスを持つ高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を有効成分とする抗ァレルギ一用組成物からなる。

(本発明の有効成分である乳酸菌）

本発明の有効成分である高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌は、卵白アルブミン（以下、「〇VA」という）で感作させたマウス脾臓由来リンパ球を OVA含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌として L.paracasei KW3 1 1 0株を用いた場合と同等或いは 6 0 %以上のイン夕一ロイキン 1 2産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの 5 0 %未満のィン夕一ロイキン 4生成量を示す乳酸菌である。より好ましい本発明の有効成分としては、上記乳酸菌が、〇 V Aで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を OVA含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、 L. paracasei KW 3 1 1 0株を用いた場合と同等或いは 7 5 %以上のインタ一ロイキン 1 2産生量を示す乳酸菌である。更に好ま bい本発明の有効成分としては、上記乳酸菌において、 OVAで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を OVA含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、乳酸菌無添加コントロールの 4 0 %未満のィン夕ーロイキン 4生成量を示すことを特徴とす

4 る乳酸菌である。

本発明において、高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌として最も好ましい態様は、卵白アルブミン（以下、「OVA」という）で感作させたマゥス脾臓由来リンパ球を O V A含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌として L . paracasei KW3 1 1 0株を用いた場合と同等或いは 8 0 %以上のィンターロイキン 1 2産生量を示し，且つ、乳酸菌無添加コントロールの 3 0 %未満のィン夕ーロイキン 4生成量を示す乳酸菌である。

本発明において有効成分として用いる高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌を取得するには、アレルゲンで感作させた動物脾臓由来リンパ球を当該アレルゲン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養し、被検乳酸菌として Lactobacillus paracasei KW 3 1 1 0株を用いた場合と同等、或いは paracasei KW 3 1 1 0株を用いた場合に比較して、 6 0 %以上の Th 1誘導サイト力イン産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの 5 0 %未満のィンターロイキン 4生成量を示す乳酸菌を分離する高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌の取得方法による。すなわち、公知の乳酸菌の菌株或いは新しく分離した乳酸菌の菌株を用いて、卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁したものに該乳酸菌を添加して培養し、基本的には、被検乳酸菌として L . paracasei K W 3 1 1 0株を用いた場合と同等、或いは L . paracasei KW 3 1 1 0株を用いた場合に比較して、 6 0 %以上のイン夕一ロイキン 1 2産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コント口 —ルの 5 0 %未満のィンタ一ロイキン 4生成量を示す乳酸菌を分離することにより取得することができる。前記のとおり、本発明において有効成分として用いる乳酸菌は、種々の公知の或いは新たに分離した乳酸菌の中から、 in vitroにおける抗ァレルギ一活性を評価する実験方法を行

15 うことにより、本発明の指標を基準に当業者が容易に選択し取得することができるものであるが、その詳細は実施例 1に具体的に開示する。本発明において有効成分として用いる、高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌は、例えば L. paracasei KW3 1 1 0株は、 L.casei L 1 4 株として、日本乳業技術協会から入手することができる。なお、日本乳業技術協会の記載によれば、乙 1 4株はし. casei との記載があるが、本発明者らが QUALIC0N 社製リポプリンターを用いた R F L P (Restriction Flagment Length Polymorphism)及び A F L P (Am l i f i ed Flagment Lengt Polymorphism) を用いて解析したところ、当該株は L . Paracasei と判断されたため、本発明においては L. p aracasei と記載した。本発明で抗アレルギー用組成物の有効成分として使用される L. paracasei KW3 1 1 0は、上記のとおり日本乳業技術協会から入手することができるが、更に、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基く、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一に、 F ERM B P— 0 8 6 34として寄託されている。

また、本発明で抗アレルギー用組成物の有効成分として使用される L. plantarum K W 4 1 1 0株は L · pi ant arum J CM 1 1 4 9株として、 L . paracasei ¹\¥ 3 9 2 6株は1^. paracasei J CM 8 1 3 2株として、 J CM (理化学研究所微生物系統保存施設）から入手することができ、及び、 L. paracasei 1：¹\¥ 3 9 2 5株は1^. paracasei NR I C 1 9 1 7株として、 NR I C (東京農業大学）から入手することができる。

本発明において有効成分として用いる乳酸菌の選択に際しては、抗ァレルギ一作用の他に、多くの乳酸菌で言われている整腸作用 · コレステロール低下作用 ·血圧低下作用など従来知られているプロバイオティックスの機能をも併せて発揮する乳酸菌を選択することもできる。また、

16 本発明の有効成分である乳酸菌を、経口的に投与する場合に、乳酸菌が腸管にとどまりその効果を十分発揮することがより効果的となるため、上記の基準で選択取得した乳酸菌を、更に in vitroにおけるヒト腸管由来株化細胞 C a c o - 2への接着性試験に供し、より高い細胞接着能を有する株を選択することで、更に有効性の高い乳酸菌を取得することができる。本発明の有効成分の一つである L . paracasei KW3 1 1 0 株は、消化液に対して耐性であり、腸管への付着性の高い乳酸菌であり、抗アレルギー剤として経口的に投与した場合に特に優れた前記効果を兼ね備えている。

本発明による有効成分たる乳酸菌は、 M. R . S . (de Man, Rogosa, Sharpe) 培地等の当業者に知られた乳酸菌培養用培地にて適宜培養増殖させた後、生菌で或いは殺菌処理し、必要によっては凍結乾燥或いはスプレードライして粉末化し、本発明組成物の有効成分として使用することができる。また、工程管理のため、必要に応じて得られた乳酸菌菌体の抗アレルギー活性を測定することができる。すなわち、該抗アレルギ一活性の測定方法としては、アレルゲンで感作させた動物脾臓由来リンパ球を当該ァレルゲン含有培地に懸濁し、被検乳酸菌を添加して培養することにより産生される T h l誘導サイトカイン及び Z又は T h 2誘導サイトカインの量を測定する乳酸菌の抗ァレルギ一活性の測定方法を用いることができる。

本発明においては、本発明の方法で取得した高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌を変異させて、抗アレルギー活性等の高い変異株を作製し、用いることができる。菌株の変異手段としては、 UV等の公知の変異手段を用いて行うことができる、例えば、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌である KW3 1 1 0株を変異手段で変異させて、本明細書に記載された乳酸菌の抗ァレルギ一活性の評価方法を用い、抗ァレルギ一活性の

17 増加した或いは他の特性を変異させた好ましい特性の変異株を取得して，用いることができる。また、 KW4 1 1 0株、 KW3 2 1 0株、 KW 3 9 2 5株、及び KW 3 9 2 6株等を変異させて用いることもできる。

(派生株の選抜）

本発明では、本発明で取得した乳酸菌株から生じた形質の異なる菌株を派生株として選抜し、用いることができる。該菌株の選抜方法は、 K W 3 1 1 0を例として説明すると次のようになる： KW3 1 1 0株を M R S培地のような培地を用いて、所定温度で、所定菌数に達するまで静置培養し、培養液を新鮮な MR S培地で、希釈した後、本菌体懸濁液を塩酸で p Hを 3. 0にした P B S (大日本製薬社夕ブレットを指定の濃度で溶解）' に 1 0 %分懸濁し、 3 7 °C 3時間ィンキュベートする。酸処理した菌体懸濁液を P B Sで希釈し、 MR Sプレート培地にまき、コロ二一を形成させた。形成させたコロニー.を色調等を指標に選抜し、この色調に基いて選抜したコロニーから更に 1株を選抜し、 MR S培地で 4 8時間培養する。該培養物の抗アレルギー活性を本発明の钪アレルギー活性の測定法（実施例 2の方法）で測定し、各コロニーの抗アレルギー活性を判定する。該方法により、試験菌株の中から高抗アレルギー活性の菌株を選抜取得する。本発明の実施例で、 KW3 1 1 0株の派生株として分離された株は N o. 9 0株と命名され、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基く、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に、 F E RM B P— 0 8 6 3 5として寄託されている。

(抗体の作製）

本発明においては、本発明の高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌を含有する製品の品質管理や製造工程における管理を行うために、該本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の分離、検出を行って、その乳酸

18

訂正された用紙（規則 91) 菌の同定や含有量の検査を行う必要がある。該乳酸菌の分離、検出を目的として抗体を作製し、用いることができる。本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記乳酸菌を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の産生方法は、それ自体既に公知の方法により産生することができる。例えば、該産生方法は、 KoeMer, G.及び C. Mi 1 s tein, Nature： 256, 495-497 (1975), 及び、 Davis, B. , R. Dulbecco, H. Eisen, H. Ginsberg 及び W. Wood, Principles of Microbiology and Immunology第 2巻、 Harper & Row, New York, 1973 を参照することができる。すなわち、該モノクローナル抗体の産生には、例えば、本発明の乳酸菌を用いてマウスを免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエ口一マ細胞と融合させ、得られたハイプリドーマ細胞によって産生することができる。本発明の乳酸菌に特異的に結合する抗体を用いて、本発明の乳酸菌を検出するには、公知の抗体を用いた免疫学的検出法を用いて実施することができる。該免疫学的測定法としては、例えば R I A法、 E L I S A法、蛍光抗体法等の公知の免疫学的測定法を挙げることができる。

(本発明の有効成分である乳酸菌の抗ァレルギ一作用）

アレルギーは、抗原刺激により I g E抗体が産生され、 I g E抗体の組織内のマスト細胞や血中の好塩基球表面の F c レセプターに結合し、次の抗原刺激（アレルゲンの再侵入）でマスト細胞や好塩基球表面に結合している I g E抗体に認識され、 I g E抗体間に架橋が形成され、この刺激を引き金としてマスト細胞や好塩基球がケミカルメディエーターを爆発的に遊離することによって諸症状が現れる。従って、アレルギー

19 の治療 ·予防の為に I g Eを抑制すること、そしてその為には T h l免疫を増強し T h 2免疫を抑制することが必要となる。

本発明による乳酸菌は、マウスリンパ球を用いた in vitro の系において、 T h l免疫の指標であるィン夕ーロイキン 1 2 ( I L— 1 2) 産生を強く誘導するとともに、 T h 2免疫の指標であるインターロイキン 4 ( I L - 4) 産生を強く抑制する。従って、本発明による乳酸菌は、 Th 1免疫を増強し T h 2免疫を抑制することにより、 I g E抗体産生を抑制するという作用機序に基づくァレルギ一の治療 ·予防効果がある。そこで、本発明の抗アレルギー用組成物は、花粉症 · アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎 ·気管支喘息などの環境アレルギーに対して特に効力を発揮する。また、本発明における乳酸菌は、上記抗アレルギー作用の他に、多くの乳酸菌で言われている整腸作用 · コレステロール低下作用 ·血圧低下作用など従来知られているプロバイオティックスの機能をも併せて具備することができ、本発明における有効成分の乳酸菌の一つである KW3 1 1 0株は、強い抗アレルギー · 免疫賦活活性に加えて、腸管細胞への接着性、胃酸 ·胆汁酸に対する耐性についても優れていることが確認され、更に前述のプロバイォテイツクスの機能の面からもその効果が期待できる。

(本発明の抗アレルギー用組成物の投与）

本発明の抗アレルギ一用組成物は、本発明による有効成分を生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合することにより製剤化して、抗アレルギー剤として用いることができる。本発明の抗ァレルギ一剤は、経口的或いは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴

20 剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学的に許容される賦形剤、添加剤とともに製剤化することができる。なお、製剤化にあたっては、本発明の抗アレルギ一組成物がその機能を生体内において適時的且つ効果的に発揮できるよう、即ち溶出開始時間を制御したり、苦味マスキング剤としての機能を付加したり、酸素や湿度に対する安定性を高めたりする形、例えば特許 3 3 4 9 6 7 7記載の酵母細胞壁を主成分としたコ一ティング剤でコーティングされたコーティング処理物や定法に従って軟カプセルや硬カプセルによりカプセル化することで得られるかプセル剤として共に医薬製剤や健康食品等の分野で好ましく使用することができる。薬学的に許容される賦形剤や添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクト一ス、ぺクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウム力ルポキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられる。

製剤は例えば次のようにして製造できる。すなわち、経口剤は、有効成分として、例えば賦形剤（例えば、乳糖、白糖、デンプン、マンニト一ル）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、カルポキシメチルセルロースカルシウム）、結合剤（例えば、 α化デンプン、アラビアゴム、カルポキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース）または滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール 6 0 0 0 ) を添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知

2 1 の方法でコーティングすることにより製造することができる。コ一ティング剤としては、例えばェチルセル口一ス、ヒドロキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびオイドラギット (ローム社製、ドイツ、メタアクリル酸 · アクリル酸共重合物）などを用いることができる。

注射剤は、有効成分を分散剤（例えば、ツイーン（Twe en) 8 0 (アトラスパウダー社製、米国）、 H C O 6 0 (日光ケミカルズ製）、ポリェチレンダリコール、カルポキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、'保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノ一ル、フエノ一ル）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、転化糖）などと共に水性溶剤（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例えば、ォリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコール）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造することができる。この際、所望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、安定剤（例えば、ヒト血清ァルブミン）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニゥム、塩酸プロカイン）等の添加物を添加してもよい。

外用剤は、有効成分を固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造することができる。例えば、上記固状の組成物は、有効成分をそのまま、あるいは賦形剤（例えば、ラクト一ス、マンニ卜一ル、デンプン、微結晶セルロース、白糖）、増粘剤（例えば、天然ガム類、セル口 —ス誘導体、アクリル酸重合体）などを添加、混合して粉状とすることにより製造できる。上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様にして製造できる。半固状の組成物は、水性または油性のゲル剤、ある

2 2 いは軟骨状のものがよい。また、これらの組成物は、いずれも p H調節剤（例えば、炭酸、リン酸、クェン酸、塩酸、水酸化ナトリウム）、防腐剤（例えば、パラォキシ安息香酸エステル類、クロロブタノ一ル、塩化ベンザルコニゥム）などを含んでいてもよい。坐剤は、有効成分を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の組成物とすることにより製造できる。該組成物に用いる油性基剤としては、高級脂肪酸のグリセリド

〔例えば、カカオ脂、ウイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社製）〕、中級脂肪酸〔例えば、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社製）〕、あるいは植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油）が挙げられる。水性基剤としては、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールが挙げられる。また、水性ゲル基剤としては、天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体が挙げられる。

(飲食品配合による利用）

本発明の抗アレルギー用組成物は、飲食品に配合し、抗アレルギー機能を有する飲食品として用いることができる。本発明の抗アレルギー用組成物を飲食品に配合して用いるには、その有効成分の有効量を飲食品の製造原料段階或いは製造した製品の段階等で添加、配合する。ここで「有効成分の有効量」とは、個々の飲食品において通常喫食される量を摂取した場合に、下記のような範囲で有効成分が摂取されるような含有量をいう。

すなわち、本発明における有効成分の飲食品への有効量の投与量または摂取量は、受容者、受容者の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して決定できる。例えば、本発明による有効成分を医薬として経口投与する場合、成人 1人当たり 0 . 1 〜； L O O m g Z k g体重（好ましくは 1〜 1 O m g / k g体重）、非経口的に投与する場合は 0 . 0 1〜 1 0 m g Z k g体重（好ましくは 0 . 1

2 3 〜 1 m g Z k g体重）の範囲で一日 1〜3回に分けて投与することができる。本発明による有効成分と組み合わせて用いる他の作用機序を有する薬剤も、それぞれ臨床上用いられる用量を基準として適宜決定できる。本発明における有効成分の飲食品への有効量の投与量または摂取量を、乳酸菌の菌数で表示すると、 1 日当たりの摂取量が 5 X 1 0 ⁹個以上が好ましく、より好ましくは 1 日あたり 1 X 1 0 ^{1 (5}個以上、更に好ましくは 5 X 1 0 ^{1 C}個以上を摂取することが好ましい。したがって、通常 1 日あたり摂取される飲食品の量に合わせて、各々の食品あたりの含有させる乳酸菌の菌数が決定される。例えば、食品（ヨーグルト）として摂取する場合に、成人 1人 1 日当たり 5 0〜5 0 0 gの範囲、好ましくは 6 0〜2 0 0 gの範囲の摂取量となるよう本発明による有効成分を食品に配合することができる。

本発明においては、本発明の抗ァレルギ一用組成物の有効成分をそのまま、或いは前記のような製剤の形態で、飲食品に配合することができる。より具体的には、本発明の飲食品は、本発明の有効成分を適宜基材と配合して、そのまま飲食品として調製したもの、或いは、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等を更に配合したもの、液状、半液体状若しくは固体状にしたもの、更には、一般の飲食品へ添加、配合したもの等、種々の利用形態を採ることができる。

従来より、乳酸菌を利用した飲食品の分野としては、その活用の態様分類としては、乳製品類、肉類、パン類、飲料、及び野菜類に大別される。これらの乳酸菌を利用した飲食品の製造における乳酸菌又はその一部として、或いは、製造した該飲食品の添加物として、本発明の高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌を用いて、該飲食品に抗アレルギー機能を付与することができる。

本発明の他の実施の態様として、有効成分である乳酸菌を飲食品に添

2 4 加する場合に、乳酸菌自体の発酵を必要とせず、かつ、飲食品自体の香味の保持を図る場合には、乳酸菌を例えば加熱殺菌のような処理により殺菌して用いるのが特に好ましい。また、本発明の高抗アレルギー機能を有する飲食品は、他の微生物や異物の混入を防ぎ、内容物の品質を保持するために、密封容器詰飲食品の形態で製造されることが好ましい。本発明における食品としては、抗アレルギー機能を持たせた、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、或いは病者用食品として調製することができる。また、特に、食品の形態に限定されるものではなく、抗ァレルギ一機能を持たせた飲料の形態であってもよい。本発明による有効成分は、抗アレルギ一作用を有するため、日常摂取する食品やサブリメントとして摂取する健康食品や機能性食品等に本発明の有効成分を配合することにより、継続的に摂取可能な、アレルギーの発症の予防および治療といった機能を併せ持つ食品として提供することができる。本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を、例えば、茶類やドリンク剤或いは夕ブレットのような、その飲食品中にアレルギーを引き起こす成分を含まない飲食品中に配合して用いることにより、アレルギー問題から完全に遮断された抗ァレルギ一機能を有する飲食品を提供することができる。また、本発明においては、乳酸菌を用いて製造される或いは乳酸菌を含有する飲料又は食品の乳酸菌の一部、又は全部を本発明の高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌で代替することにより、高抗アレルギー機能を有する飲料又は食品とすることができる。

(飲食品製剤形態での利用）

本発明において、本発明の高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌を配合する健康食品および機能性食品としては、各種のものをあげることができるが、それらの健康食品および機能性食品の製造に関しては、通常用いられる、食品素材、食品添加物に加え、賦形剤、増量剤、結合剤、崩

2 5 壊剤、潤滑剤、分散剤、保存剤、湿潤化剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化材、カプセル基剤等の補助剤を用いた飲食品製剤形態で利用することができる。該補助剤の具体的な例示をすれば、乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケィ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはその塩、アラビアガム、ポリェチレンダルコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレンダリコール、クェン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソ一ダ、リン酸ナトリウム、プルラン、カラギ一ナン、デキストリン、還元パラチノース、ソルビトール、キシリトール、ステビア、合成甘味料、クェン酸、ァスコルビン酸、酸味料、重曹、ショ糖エステル、植物硬化油脂、塩化カリウム、サフラワー油、ミツロウ、大豆レシチン、香料等が配合できる。このような健康食品、機能性食品の製造に関しては、医薬品製剤の参考書、例えば「日本薬局方解説書（製剤総則）」（廣川書店）等を参考にすることができる。

本発明において、特に、健康食品および機能性食品に適した形状として、夕ブレット状、カプセル状、顆粒状、粉末状、懸濁液状、乳化液状のものが例示でき、特に本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を配合する健康食品および機能性食品は、本発明が解決しょうとする課題から見て、アレルギー特定原材料を含まない原材料を組み合わせたものが好ましい。

タブレツト状健康食品及び機能性食品の製造法を具体的に例示すれば本発明の高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌を配合した処方物を一定の形状に圧縮して製造するか、または水またはアルコールのような溶媒で湿潤させた練合物を、一定の形状にするか若しくは一定の型に流し込んで成型して製造したものがあげられる。カプセル状健康食品および機能

2 6 性食品の製造法を具体的に例示すれば、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を配合した処方物を液状、懸濁状、のり状、粉末状または顆粒上などの形でカプセルに充填するか、またはカプセル基剤で被包成型して製造したもので、硬力プセル剤および軟カプセル剤等があげられる。

(食品への配合）

また、本発明においては、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を食品に配合して、抗アレルギー機能を持たせた食品として調製することができる。かかる飲食品として具体的には、プリン、クッキ一、クラッカー、ポテトチップス、ビスケット、パン、ケーキ、チョコレート、ドーナツ、ゼリーなどの洋菓子、煎餅、羊羹、大福、おはぎ、その他の饅頭、カステラなどの和菓子、冷菓（飴等）、チューインガム等のパン - 菓子類や、うどん、そば、きしめん等の麵類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ハム、ソーセージ、ハンバーグ、コ— ンビーフ等の畜肉製品や、塩、胡椒、みそ、しょう油、ソース、ドレツシング、マヨネーズ、ケチャップ、甘味料、辛味料等の調味類や、明石焼き、たこ焼き、もんじや焼き、お好み焼き、焼きそば、焼きうどん等の鉄板焼き食品や、チーズ、ハードタイプのヨーグルト等の乳製品や、納豆、厚揚げ、豆腐、こんにゃく、団子、漬物、佃煮、餃子、シユーマィ、コロッケ、サンドイッチ、ピザ、ハンバーガ一、サラダの各種総菜や、各種粉末（ビーフ、ポーク、チキン等畜産物、海老、帆立、蜆、昆布等水産物、野菜 ·果実類、植物、酵母、藻類等）や、油脂類 ·香料類（バニラ、柑橘類、かつお等）を粉末固形化したものや、粉末飲食品 (インスタントコ一ヒー、インスタント紅茶、インスタントミルク、ィンスタントスープ、味噌汁等）等の各種食品が挙げることができるが、これらに特に制限されない。

2 7 特に本発明による有効成分を乳製品に含有させる場合には、本発明による有効成分を生菌として乳原料に加えて菌増殖/発酵を行い、ョーグルト等の発酵乳酸菌飲食品とすることもできる。

(飲料への配合）

本発明の高抗アレルギ一活性の組成物は、特に飲料の形で用いて、毎日継続摂取することが可能であり、尚かつ該継続摂取することが可能な量で効能を発揮する抗アレルギー機能を有する飲料として提供することができる。本発明における高抗アレルギー活性活性を有する乳酸菌を飲料へ配合する場合に、飲料自体の香味を保持し、しかも安定した物性の飲料を調製するためには、乳酸菌を加熱殺菌した形で用いるのが好ましい。

本発明における高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌を飲料へ配合する場合に、乳酸菌の配合量は適宜決定することができるが、通常、飲料として継続的に摂取することができる量で、乳酸菌のもつ抗ァレルギー活性を充分に発揮するための配合量が採用される。本発明における有効成分の飲食品への有効量の投与量または摂取量を、乳酸菌の菌数で表示すると、 1 日当たりの摂取量が 5 X 1 0 ⁹個以上が好ましく、より好ましくは 1 日あたり 1 X I 0 ¹。個以上、更に好ましくは 5 X 1 0 ^{1 Q}個以上を摂取することが好ましい。したがって、通常 1 日あたり摂取される飲料の量に合わせて、上記指標により、各々の飲料あたりに含有させる乳酸菌の菌数が決定される。例えば、 1 日あたり 1 0 0 gの飲料が摂取されるとすれば、飲料 1 0 0 gあたり 1 0 ⁹個以上の菌数を添加することが好ましい。一方、乳酸菌の添加で、飲料の香味や外観を損なわない範囲を考えると、 1 0 ^{1 1}個以下が好ましい。更に、 5 X 1 0 ^{1 Q}個以下がより好ましい。したがって、抗アレルギー機能を有し、かつ、安定性があり、嗜好性、保存性が高い飲料の乳酸菌の濃度としては、飲料 1 0 0 g当た

2 8 り、 1 0 ⁹〜 1 0 ^{1 1}個の範囲のものが特に好ましい。なお、乳酸菌の菌体数と乾燥菌体重量の関係については、例えば、 L . par ac as e i K W 3 1 1 0株では、菌体数 1 0 ^{1 2}個が乾燥菌体重量 1 gに相当する。

本発明において、本発明の高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌を配合する飲料としては、各種のものを挙げることができるが、それらの飲料の製造に際しては、通常の飲料の処方設計に用いられる糖類、香料、果汁、食品添加物などいずれも使用することが出来る。飲料の製造に関しては、既存の参考書、例えば「改訂新版ソフトドリンクス」（株式会社光琳）等を参考にすることができる。

本発明において、特に、配合に適した飲料としては、抗アレルギー作用及び製品の保存、安定化の観点から、乳成分を含まない、すなわち、例えば、果汁入り清涼飲料或いは茶飲料のような乳成分非配合の形の飲料が特に好ましい。

配合する飲料を具体的に例示すれば、アルコール飲料（ウィスキー、バ一ボン、スピリッッ、リキュール、ワイン、果実酒、日本酒、中国酒、焼酎、ビール、アルコール度数 1 %以下のノンアルコールビール、発泡酒、酎ハイ等）や非アルコール飲料（ドリンクタイプのヨーグルト、リンゴ、ミカン、ブドウ、バナナ、ナシ、ウメ、スイカ等の果汁、トマト、ニンジン、セロリ、キユウリ等の野菜汁、清涼飲料、牛乳、豆乳、コーヒ一、ココア、紅茶、緑茶、麦茶、玄米茶、煎茶、玉露茶、ほうじ茶、ウーロン茶、ゥコン茶、プーアル茶、ルイボスティー茶、ローズ茶、キク茶、ミント茶、ジャスミン茶等の各種ハーブ茶、スポーツ飲料、ミネラルウオーター、栄養ドリンク等）の各種飲料が挙げられる。

飲料のカテゴリーによって例示すれば、緑茶、ウーロン茶、紅茶、麦茶、プレンド茶などの茶系飲料と、コーヒー、果汁入り飲料、野菜飲料、スポーツ飲料、栄養ドリンクとが例示できる。

2 9 本発明において、抗ァレルギ一機能を有する飲料を製品化するに際しては、食品衛生法に定められた方法に従って、適宜、飲料の殺菌を行うことができる。該殺菌方法としては、飲料の pHによって、パストル殺菌、ホットパック殺菌、 UHT殺菌、レトルト殺菌等を使い分けることができる。

更に、製品形態としては、通常飲料の製品形態に使用されている密封容器入り飲料の形態が特に好ましく、該密封容器としては、缶、ビン、 P E T、紙容器のいずれの形態でもよい。また、容量についても特に制限はないが、一般的に、消費者が日常的に飲料として摂取している量と、配合する乳酸菌の菌数と 1 日の必要菌数を考慮して、適宜、決定することができる。

以下に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。

実施例 1

(本発明の実施例で用いた乳酸菌）

本発明の実施例で用いた乳酸菌及びその入手先を、図 1 (N o . 1 ) 及び図 2 ( o. 2) に示す。本発明においては、全ての菌株を KWで始まる番号にて識別しているが、これら試験株は独自で単離したもの、市販乳製品で使用されているもの、公的機関等から入手したもの等があるために便宜上統一した識別名を付したものであり、それぞれの KW株と入手由来との関係は図 1 (N o . 1 ) 及び図 2 (N o. 2) の通りである。なお、該図 1の「入手先」において、「 J CM」は理化学研究所微生物系統保存施設を、「 I F O」は前財団法人発酵研究所（現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物資源センター（NB R C))を表す。実施例 2

(乳酸菌群の in vitroにおける抗アレルギー活性の評価）

30 1. 試料

乳酸菌の各菌株を M. R . S . (de Man, Rogosa, Sharpe) 培地（O XO I D) で 48時間培養したものを、滅菌水で 3回洗浄し、滅菌水に懸濁後 1 0 0°C、 3 0分処理し、.殺菌した。これを凍結乾燥し、 P B S に懸濁した。使用した乳酸菌は図 1 (N o . 1 ) 及び図 2 (N o . 2) を参照のこと。

2. 実験動物、飼育

7— 1 0週齢 B AL BZ cマウス（チャールズリバ一）に d a y 0と d a y 6に卵白アルブミン（OVA) l mgをアジュバントである Alum 2mgと共に腹腔内注射した。 D a y 1 3に解剖し、脾臓を単離 · リンパ球を調製した。実験は、 n = 6で行った。

3. 脾細胞 I L _ 4、 I L - 1 2の測定

I L— 4、 I L— 1 2の測定は、 OptEIA ELISA Set (べクトン ' ディッキンソン）を用いて測定した。

4. 実験条件

「 2. 実験動物、飼育」の方法で調製した脾臓リンパ球を R PM I 1 6 4 0 (S I GMA) + 1 0 % F C S (ロシュ） + l mg OVA培地で 2. 5 X 1 06 c e 1 l s Zm l になるように懸濁した。さらに試験する乳酸菌を 0. 1あるいは 1 g/m 1で添加した。 1週間後に培養上清を回収し、 T h 1サイト力インとして I L一 1 2を T h 2サイトカインとして I L— 4をそれぞれ測定した。

5. 実験結果

T h lサイト力イン、 I L— 1 2の各乳酸菌による生成量を図 3及び表 2に示す。乳酸菌の添加量は 1 a g /m 1である。菌株の違いにより、様々な産生量の違いが見られた。約 1 0 0株の中で最も強い T h 1誘導能を示したのは L. paracasei KW 3 1 1 0株であった。デ一夕は全て

31 KW 3 1 1 0株による I L— 1 2産生量を 1 0 0 %としたときの比率で示されている。便宜的に KW 3 1 1 0株に対して 7 5 %以上の産生量を示した株を A評価、 5 0 %以上〜 7 5 %未満の産生量を示した株を B評価、 2 5 %以上〜 5 0 %未満の産生量を示した株を C評価、 1 0 %以上〜 2 5 %未満の産生量を示した株を D評価、 1 0 %未満の産生量を示した株を E評価とした。

アレルギーの原因である T h 2サイト力イン、 I L一 4の各乳酸菌による生成量を図 4及び表 2に示す。乳酸菌の添加量は 0. l ^ gZm l である。菌株の違いにより、その抑制効果は様々な値を示した。約 1 0 0株の中で最も強い T h 2抑制能を示したのは L . paracasei KW 3 1 1 0株であった。データは全てコントロール（乳酸菌無添加）の I L _ 4産生量を 1 0 0 %としたときの比率で示されている。便宜的にコントロールに対して 3 0 %未満の産生量を示した株を A評価、 3 0 %以上〜 5 0 %産生量を示した株を B評価、 5 0 %以上〜 7 0 %未満の産生量を示した株を C評価、 7 0 %以上〜 1 0 0 %未満の産生量を示した株 D評価、 1 0 0 %以上の産生量を示した株を E評価とした。 T h l、 T h 2 それぞれのパラメ一夕一について A〜E評価をまとめた「抗アレルギ一乳酸菌評価結果」を表 1及び表 2に示す。

32

O o rH CM

(表 2 )

34 差替え用紙（規則 26) T h 1パラメ一夕が KW3 1 1 0株の 6 0 %以上、 T h 2パラメ一夕一がコントロールの 5 0 %以下の株を抗ァレルギ一乳酸菌であるとすると該当する株は、 KW 3 1 1 0株、 T株、 NR I C 1 9 1 7株、 J CM 8 1 3.2、 J CM 1 1 4 9株の 5株である。また、強い KW 3 1 1 0株の 7 5 %以上の T h 1誘導能を示した株を免疫賦活乳酸菌であるとすると該当する株は KW3 1 1 0株、 KW4 5 1 0株、 J CM 1 1 4 9株、

T株、 NR I C 1 9 1 7株、 J CM 1 0 5 9株の 6株である。そして、当該乳酸菌、 KW 3 1 1 0株と同等の免疫賦活活性'を有する乳酸菌、若

3 / 1

差替え用紙（規則 26) CM 1 0 5 9株と同等かそれ以上の免疫賦活活性を有する乳酸菌を配合した免疫賦活用組成物（医薬品、飲食品）を、本明細書記載の方法で製造することができる。また、抗アレルギ一乳酸菌として知られる L . acidophilusL— 9 2株は I L— 1 2の産生量で KW 3 1 1 0株の 1 1. 7 %程度、 I L一 4の抑制活性については KW 3 1 1 0株がコント口一ル（無添加）の 2 6. 4 %であるのに対し、 L— 9 2株は 7 4. 6 %と、どちらのパラメ一夕一に関しても KW3 1 1 0株のような強い抗アレルギ一乳酸菌に比べて圧倒的に劣ることが示唆された（図 5)。本発明のし酸菌株及び対照となる乳酸菌株の抗アレルギー活性について測定した結果を表 3に示す。

(表 3 )

Strain Π) Genera Culture collection Thl Th2

W3110 Lactooacillus paracasei L14 乳業技術協会 100 26.4

KW4110 Lactobacillus plantarum JCM1149 JCM 93.9 36.7

KW3210 Streptococcus salivarius subsp. Thermophilus T 小岩井 77.7 49.9

KW3925 Lactobacillus paracasei NRIC1917 東京農大 77.1 45.2 W3926 Lactobacillus paracasei JCM8132 JCM 70.1 30.2 W4310 Lactobacillus mesenteroides JCM6124 J M 67.4 43.4

KW3119 Lactobacillus casei Y/iJ 雪印 56 27.5

KW3927 Lactobacillus paracasei JCM10D3 JCM 53.7 45.3

KW4010 Lactobacillus gasseri JCM1131 JCM 53.2 36.7

実施例 3

(派生株の選抜）

本実施例では、本発明で取得した乳酸菌株 KW3 1 1 0株から派生した抗アレルギー活性を有する菌株を選抜した例である。 KW3 1 1 0株を MR Si^llにて 3 7°Cで OD 6 0 0が 0. 8から 1. 0に達するまで静置培養した。

培養液を新鮮な MR S培地で、〇D 6 0 0 = 0. 5になるように希釈

35 した後、本菌体懸濁液を塩酸で p Hを 3. 0にした P B S (大日本製薬社タブレットを指定の濃度で溶解）に 1 0 %分懸濁し、 3 7 3時間ィンキュベー卜した。酸処理した菌体懸濁液を P B Sで希釈し、 MR Sプレート培地にまき、 3 7 t:でコロニーを形成させた。形成させたコロニ一の中に色調の薄いコロニ一が認められた。これを選抜し、 MR S培地で 4 8時間培養した。この株を N o . 9 0と命名した。 N o . 9 0株を実施例 2の方法で抗アレルギー活性を測定した。 N o . 9 0株は野生株と比較して同程度の I L一 1 2産生能を示した（図 6) 。なお、図中、「比活性（％) 」は、 KW 3 1 1 0株の I L— 1 2産生能を 1 0 0とした時の派生株（N o. 9 0 ) の I L— 1 2産生能で示した。この N o . 9 0株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、 F E RM B P— 0 8 6 3 5として寄託された。

実施例 4

(in vitro高抗アレルギー活性株 KW 3 1 1 0株の in vivoでの評価） 1. 投与試料

L . paracasei KW 3 1 1 0株を MR S培地で 4 8時間培養したものを、滅菌水で 3回洗浄し、滅菌水に懸濁後 1 0 0 、 3 0分処理し、殺菌した。これを凍結乾燥し、標準粉末飼料 A I Ν 9 3 (アメリカ国立栄養研究所による標準組成）にマウス一匹が 1 日 l mg摂取するように練りこんだ混餌を作製した。

2. 実験動物、飼育

8週齢 B A L B/ cを用いた。 1群 6匹の BAL BZ cマウスを C E 一 2 (日本クレア）及び水を自由摂取させて 1週間馴化飼育を行った。 d a y 0の抗原感作後は、コントロール群は精製原料を使用して作製した A I N 9 3粉末飼料での飼育に、 KW 3 1 1 0群は A I N 9 3に KW 3 1 1 0菌が練りこまれた混餌に切り替えた。

36 3. 血中 I g E、脾細胞 I L一 4、 I L - 1 2の測定

I g E、 I L _ 4、 I L一 1 2の測定は、 OptEIA ELISA Set (ベクトン ' ディッキンソン）を用いて測定した。

4. 実験条件

実験群としてはコントロール群（A I N 9 3)、 KW 3 1 1 0株を A I N 9 3に 1 m g/mouseZ d a yになるように添加した群（KW3 1 1 0 群）を設定した。コントロール群、 KW3 1 1 0群共に粉末飼料 4 gを水で練ったものを実験終了時（d a y 9 8 ) まで毎日与えた。飲水は自由摂取とした。卵白アルブミン（OVA) でのアレルギー感作は 1 0 0 g 0 V Aをアジュバントである Alum2 m gと共に、 d a y 0、 1 4、

4 2、 7 0、 9 4の合計 5回腹腔に注射することで行った。この間、 1 週間ごとに眼底静脈より採血を行った。実験終了時には全血採取及び脾臓の摘出を行い、リンパ球を調製した（図 7 )。脾臓リンパ球は R PM I

1 6 4 0 (S I GMA) + 1 0 % F C S (ロシュ） + 1 0 0 g〇VA 培地で 3 7 °C、 5 % C 02の条件で 1週間培養し、培養上清を回収した。血液サンプルに対しては I g E量を脾臓リンパ球培養上清サンプルに対しては I L— 4、 I L— 1 2を測定した。

5. 実験結果

9 8 日間の実験期間中における血中 I g Eの変動を図 8に示す。 d a y 48時での血中 I g Eで KW3 1 1 0群はコントロール群に対して p < 0. 0 5で有意に低い血中 I g E値を示した。 d a y 4 8及び解剖時 d a y 9 8での血中 I g E量をドットブロットで図 9に示す。 d a y 9 8においても KW3 1 1 0群はコントロール群に対して有意に低い血中 I g Eを示した。コント口一ル群、 KW3 1 1 0群の 9 8 日解剖時の脾細胞培養における I L一 1 2産生量を図 1 0に、 1 ー 4産生量を図 1 1に示す。 KW3 1 1 0群はコントロール群に対して有意に高い I L一

37 1 2産生を示した。 I L一 4について有意差はっかなかったが、コントロール群に対して低い傾向を示した。以上の結果は、 KW3 1 1 0株摂取により体内の免疫バランスが T h 1にシフ卜し、ァレルギ一状態が改善されたことを示唆する。また、図 1 2に示すよう d a y 3 0時でコントロ一ル群では例外なく鼻周辺の脱毛が見られたが、 KW3 1 1 0群では例外なく脱毛が起こらなかった。このときコントロール群では頻繁に鼻の引つかき行動が観察された。 KW3 1 1 0群でコントロール群と同様な鼻周辺の脱毛及び鼻の引つかき行動が観察されたのは d a y 6 0前後であった。鼻の引つかき行動の観察結果は、 KW3 1 1 0群がアレルギ一症状を実際に抑制していることを示唆している。

実施例 5

(公知の抗ァレルギ一乳酸菌、 KW4 6 1 0株（L. rhamnosus L G G株）との比較）

1. 投与試料

KW3 1 1 0株、 KW4 6 1 0株を MR S培地で 4 8時間培養したものを、滅菌水で 3回洗浄し、滅菌水に懸濁後 1 0 0 °C、 3 0分処理し、殺菌した。これを凍結乾燥し、標準粉末飼料 A I N 9 3 (アメリカ国立栄養研究所による標準組成）にマウス一匹が 1 日 1乃至 1 Omg摂取するように練りこんだ混餌を作製した。

2. 実験動物、飼育

8週齢 B AL BZcを用いた。 1群 6匹の BAL B/cマウスを C E 一 2 (日本クレア）及び水を自由摂取させて 1週間馴化飼育を行った。抗原感作 2 1 日前から KW3 1 1 0株、 KW4 6 1 0株の混餌あるいは A I N 9 3粉末飼料を摂取させた。

3. 血中 I g Eの測定

I g Eの測定は、 OptEIA ELISA Set (べクトン ' ディッキンソン）を

38 用いて測定した。

4. 実験条件

実験群としてはコントロール群（A I N 9 3 )、 KW 3 1 1 0株又は KW 4 6 1 0株を A I N 9 3に 1あるいは 1 Omg /mouse/ d a yになるように添加した群（KW 3 1 1 0群、 KW4 6 1 0群）を設定した。コントロール群、 KW3 1 1 0群、 KW4 6 1 0群共に粉末飼料 4 gを水で練ったものを実験終了時（d a y 1 3 3) まで毎日与えた。飲水は自由摂取とした。卵白アルブミン（〇VA) でのアレルギー感作は 1 0 O ^ g OVAをアジュバントである Alum 2 m gと共に、 d a y 0、 1 4、 42、 7 0、 9 8、 1 2 6の合計 6回腹腔に注射することで行った。この間、 1週間ごとに眼底静脈より採血を行った（図 1 3 )。血液サンプルに対しては I g E量を測定した。

5. 実験結果

試験期間中の血中 I g E量の変動を図 1 4に、 OVA 5次、 6次投与後の個体ごとの血中 I g E量をドットで図 1 5に示す。 OVAの抗原感作と共に血中 I g Eレベルは全ての群で上昇することが確認されたが、 KW 3 1 1 0群において OVA 5次投与後からコントロールに対して有意な血中 I g E量の低下が観察された。一方、 KW4 6 1 0群ではコントロールに対して有意な血中 I g E量の低下は観察されず、 KW 3 1 1 0株の抗アレルギー活性がより強いことを示唆した。また l mg摂取群より 1 0 mg摂取群でより強い I g E低減効果があることが示唆された < 実施例 6

(乳酸菌の酸耐性及び胆汁酸耐性）

乳酸菌が腸管へ生きて到達し、プロバイオティクスな効果を発揮するためには、胃酸、胆汁酸という消化液に対して耐性であることが必要であるといわれている。 KW3 1 1 0株がこの条件を満たす株であるかを

39 検証するために、 in vi oにおける酸耐性及び胆汁酸耐性を測定した。 1. 方法

酸耐性は、乳酸菌を対数増殖後期まで培養したのち、 P B S (p H 6. 5)で OD 6 0 0 = 0. 5になるように調整した菌体を、塩酸で p H 3. 0になるように調整した MR S培地に 1 / 1 0量添加し、これを 3 7 °C でインキュベーションした。インキュベーション開始後 1時間、 2時間、 3時間にサンプリングを行い、 MR S寒天培地で生菌率を測定した。

2. 実験結果

胆汁酸耐性は MR S液体培地に胆汁酸（0X0ID社 Bile Salts) を最終濃度 2 %になるように添加したものに、 KW 3 1 1 0株前培養液を 1 % 植菌し、オリエンタルインスツルメンッ社の B I O P L OTTE Rを用いて OD 6 3 0を測定することにより、生育速度を測定した。

いずれの実験にも対象として L. delbrueckii の基準株である KW3 3 1 7株（ J CM 1 0 1 2株）を用いた。その結果、酸耐性試験（図 1 6 ) では 3時間も約 5 0 %の KW 3 1 1 0株が生存していることが示唆された。また胆汁酸耐性試験（図 1 7 ) では 2 %の胆汁酸を含む培地においても、 KW3 1 1 0株は十分な生育を示し、胆汁酸に耐性であることが示された。一方、 KW3 3 1 7株は酸、胆汁酸のいずれに対する耐性も低いことが示唆された。

実施例 7

(乳酸菌の腸管接着性）

腸管へ生きて到達した乳酸菌が、プロバイオティクスな効果を発揮するためには、菌が腸管にとどまることが必要である。乳酸菌が腸管にとどまり、その効果を十分発揮するための指標として、 invitroにおけるヒ卜腸管由来株化細胞 C a c o - 2への接着性試験が頻繁に用いられる < そこで、 KW 3 1 1 0株の C a c o— 2細胞接着能を測定した。

40 1. 方法

C a c o - 2細胞の培養は、 Coconnier らの方法（アプライド · アンド . エンバイ口メンタル · マイク口バイオロジー、 1 9 9 2年、第 5 8 巻、 2 0 34頁）に準じて行った。 1. 2ズ 1 04個/ (： 1112 の〇 & (： 0 — 2細胞をスライドグラス上で約 1〜 2週間、ポストコンフルェントとなるまで培養した。 KW3 1 1 0株は MR S培地で 3 7 °C、 2晚培養したものを集菌し、？ 83で 1回洗浄後、 P B Sで OD 6 0 0 - 1. 0に調製したものを用いた。調製した KW3 1 1 0液 2m l に、 C a c o— 2細胞を培養したスライドグラスを浸し、 3 7 °C、 1 0 %炭酸ガス存在下で 1時間接触させ、その後スライドグラスを D M E M (Dulbecco' s Modified Eagle Medium) 培地で 3回洗浄した。次にスライドグラスをメ夕ノールで固定した後、グラム染色法（メディカルテクノロジ一、 1 9 9 5、第 2 3巻、 2 0 5頁）で KW3 1 1 0株を染色した。これを検鏡して、 C a c o _ 2細胞に付着した乳酸菌数を数え、 4視野あたりの平均値を接着数として求めた。また基準株である KW 3 9 1 3株（ J CM 8 1 3 0株）および KW 3 1 1 5株（ J CM 1 1 3 4株）をはじめとする、 L. paracasein L . casei 1 5株についても同様の検討を行った。

2. 実験結果

各乳酸菌の C a c o - 2細胞への接着能の試験の結果を表 3に示す。 Ouwehand らは L . paracasein L . casei菌が C a c o - 2細胞への接着能力が低いことを報告しているが'（フードマイク口バイオロジー · アンド，セィフティー、 2 0 0 1年、第 6 6巻、 8 5 6頁）、今回の実験でも、 KW3 1 1 0株以外の株は、接着能力が低かった。しかし、 KW3 1 1 0株は L. paracasein L . casei菌の中では、著しく高い C a c o— 2 細胞接着能力を示しており、優れたプロバイオテイクス効果が期待できる株であることが示唆された。

41 (表 4)

実施例 8

(花粉抗原を用いた花粉症'気道炎症の KW 3 1 1 0株による改善効果） 1. 実験方法

(動物種）

BDF 1 マウス 4週令（チャールズリパー）を購入

(実験群）

実験 A：点鼻による抗原感作（花粉症モデル）

Control群：標準飼料（A I N— 76ベース）を投与した群

KW群： KWlm gZmouse ( 1 m g KW3 1 1 0Z3 gA I N— 7 6ベ

—ス）投与した群

実験 B ：ネブライザによる抗原感作（気道炎症モデル）

Control群：標準飼料（A I N— 76ベース）を投与した群

KW群： KW 1 m g /mouse ( 1 m g KW 3 1 1 0/3 gA I N- 76 ベース）投与した群

(試薬 ·機器）

42

差替え用紙（規則 26) スギ花粉抽出物 C P (LSL社）

ALUM (Sigma社）

超音波式ネブライザ XE _U 1 2 (オムロン社）

集細胞遠心機：サイトスピン 4 (ThermoBioAnalysis社）

(評価方法）

実験 A

BD F— 1マウスを購入後 1週間馴化し、眼窩採血で得られた血漿をもとに血中総 I g E濃度で群分けを行った（n= 7)。群分け後、実験食を投与開始した。さらに群分け後 3週目から C P +AL UM溶液（C P 1 0 g + AL UM 2 mgZmouse)を週 1回 Z 3週間腹腔内投与した。

3回目の C P + A L UM溶液投与後 2週目からマウス両鼻に C P溶液 (lmgZm l ) を 1 0 i lずつ点鼻した。また未刺激モデル（Basal) として点鼻に生理食塩水を投与するマウスも設定した。点鼻は 5日間実施し、点鼻後 5分間のくしゃみの回数（ 1、 3、 5 日目）と、鼻部引つ搔き回数（ 3、 5日目）をカウントした。

実験 B

B D F— 1マウスを購入後 1週間馴化し、眼窩採血で得られた血漿をもとに血中総 I g E濃度で群分けを行った（n= 7)。群分け後、実験食を投与開始した。さらに群分け後 3週目から週 1回 / 3週間 C P + AL UM溶液（C P 1 0 g + ALUM 2 m g Zmouse)を腹腔内投与した。

3回目の C P + ALUM溶液投与後 2週目から、密閉容器内でマウスに C P溶液（4 0 g/m 1 ) を 1 5分間ネブライザで噴霧した。また未刺激モデル（Basal) として生理食塩水を噴霧するマウスを設定した。この噴霧は 5 日間実施した。また C P腹腔内投与時（ 0 日目）、ネブライザ開始時（ 3 5 日目）、解剖時（4 0 日目）に眼窩採血を行い、血中総 I g E濃度を測定した。 5 日目に麻酔下で気管支肺胞洗浄液（BAL F) を

43 回収し、 B AL F中の細胞数カウント、 BAL F中細胞同定、 BAL F 中のサイトカインの測定を行った。 BAL Fは麻酔下のマウス顇部を切開及び気道の力二ユレ一シヨンし、 0. 1 % B S A入り Saline 0. 7 m I X 3回（計 2. l m l ) によって洗浄した。遠心後上清及び細胞を回収し、細胞は細胞数を計測した。さらに塗抹標本を作製し、ライト * ギムザ染色により細胞を同定した。

2. 実験結果

(実験 A)

点鼻後 5分間のくしゃみの回数に関して、物理的刺激の影響を考慮するため、点鼻後 0〜 1分、 1〜 5分、総回数に分けて評価した。結果、生理食塩水点鼻ではほとんどくしゃみ症状を示さないのに対し、 Cont rol 群は抗原点鼻を繰り返すにつれてくしゃみ頻度を増していった。一方、 KW群ではくしゃみ症状を抑制する傾向が見られた（図 1 8 a、 b、 c)。また鼻部引つ搔き行動に関しては点鼻後 5分間の連続した引つ搔き行動を 1 point とした（総 point数）。また軽度の引つ搔き（連続 1〜 4 回の引つ搔き行動）と重度の引つ搔き（連続 5回以上の引つ搔き行動）に分けた場合も point評価した。 Control 群に比べ KW群は引つ搔き行動は抑えられ、 5 日目の軽度の point数に関して有意な抑制がみられた (図 1 9 a、 b )。

(実験 B)

ネブライザ前ならびに解剖時に Control群に対して KW群は有意に血中総 I g E濃度上昇を抑制した（図 2 0)。 B AL F中の細胞の種類は通常状態であれば、マクロファージを中心とした単球が殆んどを占めている。しかし抗原刺激により Control群の B AL F中には好酸球が 6 5 % 程度を占め、単球比率が減少する。一方、 KW群は Control群に比べ、好酸球％の上昇を抑えている傾向がみられた（図 2 1 a)。また好酸球数

44 においても同様に K W群が C o n t r o 1群に比べ好酸球の局所への浸潤を抑制している傾向がみられた（図 2 1 b)。

また B A L F上清中のサイト力インを測定したところ、好酸球の増殖 '分化を担う T h 2サイト力インである I L— 5が Control群に比べ、 KW群は低値を示した（図 2 2 )。

以上の結果から、 KW3 1 1 0を摂取することにより、即時型アレルギ一のなかでも花粉症の臨床症状に近いスギ花粉抗原によるくしゃみ行動、引つ搔き行動を抑制する可能性が示唆された。また KW3 1 1 0は

I g E上昇を抑制することにより、抗原暴露による気道炎症に対しても肺局所での I L _·5産生を抑制し、さらには好酸球の浸潤を抑制することが分かった。 IL- 5 と気道炎症 ' 好酸球の関係は J. Allergy Clin.

Immunol 88 (6) 935-942, 1991 に述べられており、このことは KW3 1 1

0投与が気道炎症を主な症状とするアレルギー性喘息に有効であることを示している。

実施例 9

(ァトピー性皮膚炎モデルマウスに対する KW3 1 1 0株の改善効果）ァトピー性皮膚炎モデルマウスに対する KW 3 1 1 0株の改善効果の検証に、ピクリルクロライド塗布によるァトピー性皮膚炎モデルを用いた。（引用文献 ·応用薬理 59 ( 6) 123-134, 2000)

1. 実験方法

(動物種）

N C/N g a T n d C y j マウス^ 5週令（チャールズリバ一）を購入 (実験群）

対照群：標準飼料（A I N— 7 6ベース）を 1 1週間投与した群

KW l mg— l l wk群： l mg KW 3 1 1 0 / 3 g A I N— 7 6ベースを 1 1週間投与した群

45 KW l Omg - l l wk群： l O mg KW 3 1 1 0 / 3 g A I N - 7 6ベースを 1 1週間投与した群

KW l mg— 8 wk群：標準飼料を 3週間投与した後、 1 mg KW 3 1 1 0 / 3 g A I N— 7 6ベースを 8週間投与した群

(試薬）

ピクリルクロライド： P C I (東京化成工業）

感作用溶液： 5 %溶液 (エタノール：アセトン = 4 ： 1 )

腹部 · · · 1 0 0 1、後肢部 · · · 2 5 1両足

チャレンジ用溶液： 0. 8 %溶液（オリ一ブオイル）

耳介部 · · ·両面 ·両耳に 1 0 1ずつ（計 4 0 1 )、背皮部 · · · 5

0 PL 1

(評価方法）

NC/N g aマウスを購入後 1週間馴化し、眼窩採血で得られた血清をもとに血中総 IgE濃度で群分けを行った（n = 1 0)。群分けし実験食を投与開始した 3週間後、 P C 1感作用溶液を毛剃した腹部と後肢部両側に塗布し、次にチャレンジとして 1週間後に両耳介部 ·両面及び毛剃した背皮部にチヤレンジ用溶液を塗布した。このチャレンジを 1週間おきに計 77 回実施した。またチャレンジ用溶液溶媒による耳介肥厚がないことを確認するため、オリ一ブオイル塗布後、 0、 1、 4、 2 4、 7 2、 9 6、 1 2 0、 1 44、 1 6 8 hにダイヤルシックネスゲージにより耳介肥厚を測定した。さらにチャレンジ 1 , 3回目の後、同様に 0、 1、 4、 2 4、 7 2、 9 6、 1 2 0、 1 44、 1 6 8 hにダイヤルシックネスゲージにより耳介肥厚を測定し浮腫を評価した。また感作後毎週眼窩採血を実施し、感作後週 2回臨床スコアを評価した。最終チヤレンジ 7回目から 1週間後に屠殺し、血清及び耳介部組織を回収した。血清に関しては総 I g E濃度を、耳介部組織はへマトキシリン · ェォ

46 色、トロイジンブルー染色を実施した。

(臨床スコア）

耳介部の搔痒症、発赤 · 出血 · 糜爛、浮腫、擦傷 ·組織欠損、痂皮形成 ·乾燥の 5項目、頭皮部の脱毛、発赤 · 出血 ' 糜爛、痂皮形成 '乾燥の 3項目の 8項目について症状無（ 0点）、軽度（ 1点）、中度（ 2点）、重度（ 3点）と点数化し、加算したものをスコアとして評価した。

(統計）

統計は分散分析並びに対照群に対する Dunnettの多重比較検定を行い、各々の項目で危険率が 5 %以下のものを有意差ありとした。

2. 実験結果

血中総 I g E濃度は、対照群は PC1チャレンジ 4週目あたりから大幅に上昇していくのに対し、 KW 3 1 1 0摂取全群でその上昇は抑えられ、 KW 1 O mg— 1 l wk群と KW l mg— 8 wk群ではチャレンジ 4 回目から、 KW l mg— 1 l wk群はチヤレンジ 6回目から有意に上昇を抑制した（図 2 3 )。

臨床スコアは，大将軍では想起から耳輔及び逃避の病態悪化，即ちスコアの上昇が確認された。一方 KW3 1 1 0摂取全群でその上昇が抑制され、 KWl mg— 1 l wk群、 KW 1 Omg— 1 l wk群はチヤレンジ 2回目から、 KW 1 m g— 8 w k群はチヤレンジ 3回目直後から有意に上昇を抑制した。耳介部のみの臨床スコア、頭皮のみの臨床スコアに関しても同様に KW3 1 1 0摂取全群で有意差が見られた（図 2 4、 2 5、 2 6 )。また頭部の写真からも耳介部の糜爛 '組織欠損が、 KW摂取群で抑えられているのが確認できる（図 2 7 )。

P C Iチャレンジによる耳介肥厚に関して、感作段階で実施した溶媒塗布では耳介の肥厚はみられなかったが、 P C I をチャレンジすることにより耳介の肥厚 ·発赤 ·浮腫が確認できた。チヤレンジ 1回目では対

47 照群は 1、 4時間目に即時型反応が関与する 1相目の肥厚、 4 8時間目に遅延型反応による 2相目の肥厚、さらに 1 2 0〜 1 44時間目に即時型反応が関与すると言われいている 3相目の耳介部の肥厚が確認できた' 一方、 KW3 1 1 0摂取群は 3群とも即時型反応が関与する 1、 4時間目に有意な肥厚抑制が見られ、 KW 1 0 m g _ 1 1 w k群はさらに 1 44時間目に、 K w 1 m g— 8 w k群に関しては 24、 1 44時間目に有意な肥厚の抑制がみられた。チャレンジ 3回目には対照群は塗布後継続して肥厚していたが、 KW3 1 1 0摂取群は全体的に肥厚抑制傾向がみられ、 KWl mg— l l wk群、 KW 1 0mg— 1 1 wk群では有意な抑制が確認できた（図 2 8、 2 9 )。

耳介部の病理学的評価の結果、対照群は真皮並びに表皮が肥厚し浮腫などの炎症も見られるのに対し、 KW摂取全群では対照群よりも肥厚が全体的に抑えられているのが確認できた（図 3 0 )。またトロイジンブル一染色による病理組織評価において肥満細胞数が KW 摂取群は対照群に比べ少ないことが確認できた（図 3 1 )。

以上の結果から、 KW摂取により血中総 I g E濃度の上昇抑制、ハプテン刺激による耳介肥厚の抑制、臨床レベルでの症状悪化の抑制が確認された。よって KW3 1 1 0摂取により NCZN g aマウスにおけるハプテン誘発ァトピ一性皮膚炎に対して症状改善効果をもつことが示された, 実施例 1 0

(花粉症についての KW 3 1 1 0株のヒトでの効果）

KW 3 1 1 0株のヒトでの効果を検証するために、花粉症ポランティァに対して下記の試験を行った。

1. 試験方法

(試験試料）

実施例 2で T h 1、 Th 2両パラメータ一の評価が共に E評価であつ

48 た Lactobaci 1 lus delbruecki i B株あるいは L. paracasei K W 3 1 1 0株で作製したヨーグルト試作品。菌数として 2 X 1 0⁸ c f u/m 1 を含む。

(試験対象）

企業に勤務するポランティア花粉症患者 2 8名。本試験は、ヘルシンキ宣言にのっとり，全ての被験者に対して事前に試験内容、方法に関する十分な説明を行い、文書によるインフォームドコンセントを得て行つた。

(試験群）

被験者 2 8名を無作為に 2群に分けた。 1群は対照ヨーグルトである L. delbruecki i B株ョ一ダルト、もう 1 群は L. paracaseiKW 3 1 1 0 株ヨーグルトを一日 2 0 0 m l (KW 3 1 1 0株乾燥菌体 4 Omgに相当する）摂取した。群分けの結果については試験終了まで第 3者が情報を管理する 2重盲検試験で行われた。

(試験期間）

2 0 0 3年 1月 2 0日から 4月 1 4日。

(測定項目）

被験者に対して、 0週（試験開始時）、 4、 8、 1 2週目（試験終了時）に採血を行った。血液はフアルコバイオシステムズ（株）において次の項目について測定を行った： NK細胞活性、 T h 1及び T h 2細胞数の比（T h 1 ZT h 2比）、好酸球数、 E C P値、血中総 I g E量、血中スギ花粉特異的 I g E量。

これらのデータは試験終了後、統計処理を行ってデータ化した。

また、被験者は表に示すアンケートフオームに 5段階（ 3 + ：高度、 2 + ：中等度、 + ：軽度、土：軽微、一：なし）で採血時に答えた。 3 +を 4点、 2 +を 3点、 +を 2点、土を 1点、 —を 0点として、スコア

49 化して統計処理を行った,

(表 5 )

50 (表 6 )

2. 実験結果

図 3 2に示すように、試験開始時と終了時を比較した時、対照である L. delbrueckii B株ョーグル卜群（対照群）では T h 1 /T h 2比が有意な低下を示し、図 3 3に示すように、 E C F値では有意な上昇を示した。一方、 L. paracasei KW 3 1 1 0株ヨーグルト群（KW群）ではどちらの値についても試験前後での有意な変化は認められなかった。また、図 3 4に示すように、自覚症状をスコア化したものについてものどのかゆみ、目の痛み、まぶたの重みの項目で KW群の方が対照群より低い傾向が認められた。以上の結果、ヒト花粉症においても KW 3 1 1 0株の有効性が示された。

以下に、本発明の抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌を飲料の製造に適用した場合の実施例について記載する。

実施例 1 1

(飲料添加原料となる乳酸菌菌体の調製方法）

51 調製例 1. 乳酸菌 KW3 1 1 0株菌体の調製

乳酸菌の培養には、培養用培地（グルコース 1 %、酵母エキス S (武田キリン社） 1 %、 M g S 04 · 7 H20 5 0 p pm、 M n S 04 · 5 H2 〇 5 0 p pm) を使用した。前培養は乳酸菌 KW 3 1 1 0株を培養用培地 1 0 m l に接種し、 3 7 °Cで 2 0〜 2 4 h r静置し、行った。本培養は、前培養液 0. 6 m 1 を 1 2 0 m 1 の培養用培地に接種し、 2 0 0 m l容フアーメンター（モデル BM J — 2 5、エイブル社）を用いて、 2 8 °Cにて培養した。通気量は 0. 1 2 LZm i n、攪拌速度は 5 0 0 r pmとした。 p Hは 2 5 % N a OH溶液を用いて p H 4. 5以下にならないように制御した。培養は 4 8時間行った。

培養終了後、 8 5 0 0 X g、 1 0分間の遠心分離により、菌体を集菌した。 3 0 m 1 の滅菌蒸留水に懸濁し、 8 5 0 0 X g、 1 0分間の遠心分離により、菌体を集菌した。この洗浄操作を 3回繰り返し、培地由来成分を除去した。洗浄菌体を、 1 0 m 1 の滅菌水に懸濁し、ォ一トクレーブにて 1 0 0T：、 3 0分間処理した後、凍結乾燥した。最終的に乳酸菌乾燥菌体 5 0〜 7 0 mgが得られた。得られた乳酸菌菌体の抗ァレルギー活性を確認した。

実施例 1 2

(茶系飲料の製造）

8 5 °Cの熱水で抽出した烏龍茶、紅茶、緑茶、ほうじ茶、ジャスミン茶の抽出液に対して、茶葉使用率が 0. 8重量％になるように脱イオン水を追加した。その際、ァスコルビン酸を 0. 0 2 5重量％になるように添加し、ついで重曹を用いて飲みやすい p Hに調整した。さらに当該調合液 1 0 0 gに対して、乳酸菌 KW 3 1 1 0株を菌数が 1. 5 X 1 0 ¹ D個、 3 X 1 0 ¹ °個になるように添加した後、常法通り UHT殺菌をおこない、 3 5 0 m 1容 P E Tボトルに充填した。

52 これらの 1 0個の実施例（ 5種の茶 X 2段階乳酸菌濃度）をパネラーによる官能評価に供した。その結果いずれの飲料の香味も満足できるものであり、充分毎日継続して飲みつづけられるとの高い評価が得られた。ただし、 3 X 1 0¹ °個添加したサンプルは外観上、乳酸菌がオリとして目立ちやすく、 1. 5 X 1 0^{1 Q}個の方がより好ましいと評価された。実施例 1 3

(麦茶の製造）

はと麦茶 2 5 0 gを熱湯 1 0 k gで 3 0分間煮出して、ろ過した後、遠心分離をおこなった。得られた抽出液に、乳酸菌 KW3 1 1 0株を最終製品 1 0 0 gあたり 8 X 1 0¹。、 1. 5 X 1 0¹⁰ , 3 X 1 0^{1 0}個になるように加えた後、さらにァスコルビン酸と重曹を加えて味を調整してから、 1 0 k gに脱イオン水で再度メスアップした。ついで常法通り UHT殺菌して、 5 0 0 m l容 P ETポトルにァセプティック充填した。官能評価に供したところ、いずれも満足できる香味であり、充分毎日継続して飲みつづけられるとの高い評価が得られた。ただし、 3 X 1 0 ¹ °個添加したサンプルは外観上、乳酸菌がオリとして目立ちやすく、それ以下の方がより好ましいと評価された。

実施例 1 4

(果汁入り飲料の製造）

混濁リンゴ果汁 9 0 0 gと香料 1 gに対して所定量の乳酸菌菌体を添加し、さらに脱イオン水を加えて合計 1 k gになるようにした後、常法通り 1 8 0 m 1容ガラス瓶でホットパック充填をおこない、リンゴ果汁入り飲料を調製した。なお、乳酸菌 KW3 1 1 0株は、当該調合液 1 0 0 gに対して、菌数が 2 X I 0¹ °個、若しくは 4 X 1 0¹ °個になるように添加した。

官能評価の結果、いずれのサンプルについても乳酸菌配合による香味

53 の違和感は全くなく、外観上も何ら問題なかった。

実施例 1 5

(スポーツドリンクの製造）

グラニュー糖 4. 5重量％、クェン酸 0. 2重量％、クェン酸ナトリゥム 0. 0 5重量％、香料 0. 1重量％を含む調合液に対し、乳酸菌 W3 1 1 0株を 0. 0 1 4 3重量％ (製品 1 0 0 gあたり 1. 5 X 1 0 ¹⁰個）を添加した。さらにこの液を 9 0 °Cまで加熱して殺菌し、ペットポトルにホットパックしてスポーツドリンクタイプの飲料を調製した。官能評価の結果、外観、香味ともに満足できるものであった。本飲料中の乳酸菌菌体を遠心分離してから、純水で 2回洗浄した後、凍結乾燥を行い、乾燥菌体を得た。できあがった製品をマウスリンパ球を用いた i n v i t r oの系で評価した結果、所定の活性を保持していた（図 3 5) 。

実施例 1 6

(トマトジュースの製造）

トマトジュースに対して所定量の乳酸菌菌体を添加た後、 1 9 0 g缶に充填して常法に従ってレトルト殺菌をおこなったた。なお、乳酸菌 K

W 3 1 1 0株は、当該調合液 1 0 0 gに対して、菌数が 2. 5 X 1 0¹⁰ 個もしくは 5 X 1 0^{1 (5}個になるように添加した。

官能評価の結果、いずれのサンプルについても乳酸菌配合による違和感は全くなく、外観上も何ら問題なかった。

実施例 1 7

(コーヒーの製造）

粉砕したコーヒ一焙煎豆（コロンビア）を 9 5 °Cの熱水で抽出してコ —ヒー抽出液を得た。これに脱イオン水を添加して可溶性固形分 1.4 % になるように希釈した。当該調合液 1 0 0 gに対して、乳酸菌 KW3 1

54 1 0株を菌数が 2 X 1 0^{1 Q}個、 4 X 1 0^{1 Q}個になるように添加した後、 1 9 0 g缶に充填し、常法通りレトルト殺菌をおこなった。

官能評価の結果、いずれのサンプルについても乳酸菌配合による違和感は全くなかった。ただし、コップ等に移した場合 4 X 1 0^{1 (5}個添加したサンプルは外観上、乳酸菌がオリとして目立ちやすく、 1. 5 X 1 0 ^{1 Q}個の方がより好ましいと評価された。しかし、缶から直接飲用する場合には問題なかった。

以下に、本発明の抗アレルギー活性を有する乳酸菌を食品の製造に適用した場合の実施例について記載する。

実施例 1 8

(ヨーグルトの製造）

乳を含む原材料（牛乳、脱脂粉乳、クリーム、砂糖液糖、安定剤、香料、水）を均一に混合し、 1 2 8° (：、 1 5秒の加熱殺菌を行い、 4 0°C 以下まで冷却後、乳酸菌スターター KW 3 1 1 0を添加し、 3 7 °Cに維持した発酵タンクで発酵を開始した。乳酸菌 KW3 1 1 0が混合液中の乳糖を分解し乳酸が生成して、約 1 8時間で p H4. 6となり、乳タンパク質の等電点凝集により、ゲル化が安定した時点で撹拌冷却した。撹拌によりペースト状になったョーダルトを紙容器に充填、密封し、 1 0 °C 以下の冷蔵庫で冷却保管した。冷却後、官能検査により、ヨーグルトとして適正な食味と物性を有することを確認した。このときのョーダルト原材料の配合割合を表 7に示す。また原材料中の脂肪分、 S NF (無脂乳固形分）の割合及び甘味度を表 8に示す。できあがった製品をマウスリンパ球を用いた i n V i t r oの系で評価した結果、所定の活性を保持していた（図 3 6 ) 。

55 (表 7 )

以下に、本発明の抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌を健康食品製剤の製造に適用した場合の実施例について記載する。

実施例 1 9

(タブレツト状健康食品の製造）

乳酸菌 K W 3 1 1 0株の調製乾燥末 6 7 gに、糖類である還元パラチノース、ソルピトール、キシリト一ルおよびアラビアガムを、適宜、水をバインダーとして加熱 ' 造粒しながら添加し、クェン酸、ステビア、香料等で味を調整し、打錠機により夕ブレット状に成型しやすいよう、粉末油脂とショ糖エステルを加え 1 0 0 0 gの混合物を得た。その後、

5 6 1粒あたり 1. 5 gになるよう打錠し、香味的に好ましいタブレツト状の健康食品を製造した。この際、乳酸菌 KW 3 1 1 0株は 1粒当たり 5 X 1 0 ¹ Qであった。

実施例 2 0

(硬カプセル状健康食品）

乳酸菌 KW 3 1 1 0株の調製乾燥末 1 0 0 gに、デキストリンを 5 0 g添加し、均等に混和したのち、プルラン、植物油脂、カラギーナン、塩化力リウムからなる硬カプセル基材に充填し、硬カプセルで被包された、 1カプセル 2 1 3 mgの健康食品を得た。この際、乳酸菌 KW3 1 1 0株は 1カプセル当たり 5 X 1 0 ^{1 ()}であった。

実施例 2 1

(硬カプセル状健康食品）

乳酸菌 KW 3 1 1 0株の調製乾燥末 1 0 0 gに、デキストリンを 5 0 g添加し、均等に混和したのち、ゼラチンとグリセリンからなる硬カブセル基材に充填し、硬カプセルで被包された 1カプセル 2 1 3 mgの健康食品を得た。この際、乳酸菌 KW 3 1 1 0株は 1カプセル当たり 5 X 1 0 ¹ °であった。

実施例 2 2

(軟カプセル状健康食品）

乳酸菌 KW 3 1 1 0株の調製乾燥末 1 0 0 k gを、サフラワー油 1 8 O k g, ミツロウ 2 0 k g、大豆レシチン 5 k gの混合物で均等に懸濁したのち、カラギーナン、デンプン、ダリセリンを主成分とするカプセル基材で被包し、 1カプセル 4 5 0 mgの楕円球状の軟カプセル状に成型した。この際、乳酸菌 KW 3 1 1 0株は 1カプセル当たり 5 X 1 0 ¹ ° であった。

実施例 2 3

57 (軟カプセル状健康食品）

乳酸菌 KW 3 1 1 0株の調製乾燥末 1 0 0 k gを、サフラワー油 1 8 0 k g、ミツロウ 2 0 k g、大豆レシチン 5 k gの混合物で均等に懸濁したのち、ゼラチンとグリセリンからなるカプセル基材で被包し、 1力プセル 4 5 Omgの楕円球状の軟カプセル状に成型した。この際、乳酸菌 KW3 1 1 0株は 1カプセル当たり 5 X 1 0¹。であった。

実施例 24

(顆粒状健康食品）

乳酸菌 KW3 1 1 0株の調製乾燥末 1 0 0 k gを、スティック充填機にて、 1スティック 1 gとなるように充填し、乳酸菌 KW 3 1 1 0株が 1スティック当たり 5 X 1 0^{1 1}個となる健康食品を得た。

実施例 2 5

(顆粒状健康食品）

乳酸菌 KW 3 1 1 0株の調製乾燥末 1 0 0 k gに、デキストリン 9 0 O k gを添加し、水をバインダーとして流動層造粒機を用いて、均等に混和 ·加熱 ·造粒を行い、造粒物 1 0 0 0 k gを得た。その後この造粒物を、スティック充填機にて、 1スティック 1 gとなるように充填し、乳酸菌 KW 3 1 1 0株が 1スティック当たり 5 X 1 0¹。個となる健康食品を得た。できあがった製品をマウスリンパ球を用いた invitroの系で評価した結果、所定の活性を保持していた（図 3 7 )。

実施例 2 6

(粉末状健康食品）

乳酸菌 KW 3 1 1 0株の調製乾燥末 1 0 0 k gに、デキストリン 9 0 0 k gを添加し、水をバインダーとして流動層造粒機を用いて、均等に混和 · 加熱 ·造粒を行い、造粒物 1 0 0 0 k gを得た。その後この造粒物を、 1 8号篩を全量通過するまで粉砕し、スティック充填機にて、 1

58 スティック l gとなるように充填し、乳酸菌 KW 3 1 1 0株が 1スティック当たり 5 X 1 0^{1 Q}個となる粉末状健康食品を得た。

実施例 2 7

(懸濁液状健康食品）

乳酸菌 KW3 1 1 0株の調製乾燥末 1 0 0 gを、ケ一ル葉の搾汁液 1 O k gに添加し、乳酸菌が液中で分散しやすいよう、アルギン酸ナトリゥム 1 0 gで粘度を調整し、懸濁液状健康食品を得た。

実施例 2 8

(懸濁液状健康食品）

乳酸菌 KW3 1 1 0株の調製乾燥末 1 0 0 gをぶどう糖 0. 7 k g、蒸留水 5 k gとぶどう香料 5 g混和し、加熱殺菌後、 1本 5 0 m 1 の密封容器に無菌的に充填することでシロップ状の懸濁液状健康食品を得た, このものは小児に違和感を与えず好評であった。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の実施例で用いた乳酸菌及びその入手先を示す一覧 (N o . 1 ) である。

第 2図は、本発明の実施例で用いた乳酸菌及びその入手先を示す一覧 (N o. 2 ) である。

第 3図は、本発明の実施例において、 T h 1サイトカインである I L - 1 2の各種乳酸菌による生成量を示す図である。

第 4図は、本発明の実施例において、 T h 2サイト力インである I L 一 4の各種乳酸菌による生成量を示す図である。

第 5図は、本発明の実施例において、本発明の乳酸菌株（KW3 1 1 0 ) と対照株（L— 9 2株）を用いて、 i n v i t r oにより、 I L — 1 2と I L _ 4の産生量を比較した結果を示す図である。

59 第 6図は、本発明の実施例において選抜した、 KW 3 1 1 0株から派生した菌株 N o. 9 0株の抗アレルギー活性について測定した結果を示す図である。

第 7図は、本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株である KW 3 1 1 0株の in vivoにおける抗アレルギー能を測定するための実験スケジュールを示す図である。

第 8図は、本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株である KW3 1 1 0株の in vivoにおける抗アレルギー能を測定するための実験において、 9 8 日間の実験における血中 I g Eの変動を示す図である。

第 9図は、本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株である KW3 1 1 0株の in vivoにおける抗アレルギ一能を測定するための実験において、 d a y 4 8及び解剖時 d a y 9 8での血中 I g E量をドットブロッ卜で示した図である。

第 1 0図は、本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株である KW3 1 1 0株の in vivoにおける抗アレルギー能を測定するための実験において、コントロール群及び KW 3 1 1 0群の 9 8 日解剖時の脾細胞培養における I L— 1 2産生量を示す図である, 第 1 1図は、本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株である KW 3 1 1 0株の in vivoにおける抗アレルギー能を測定するための実験において、コントロール群及び KW 3 1 1 0群の 9 8 日解剖時の脾細胞培養における I L - 4産生量を示す図である。第 1 2図は、本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株である KW 3 1 1 0株の in vivoにおける抗アレルギー能を測定するための実験において、コントロール群及び KW 3 1 1 0群の鼻周辺の脱毛を観察した結果を示す写真である。

60 第 1 3図は、本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株である KW3 1 1 0株と、抗アレルギー乳酸菌として公知の KW4 6 1 0株との比較において、該乳酸菌株の混餌飼料を用いた予防効果試験の実験スケジュールを示す図である。

第 1 4図は、本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株である KW3 1 1 0株と、抗アレルギー乳酸菌として公知の KW4 6 1 0株との比較において、該乳酸菌株の混餌飼料を用いた予防効果試験の試験期間中における血中 I g E量の変動を示す図である _c 第 1 5図は、本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株である KW3 1 1 0株と、抗アレルギー乳酸菌として公知の KW4 6 1 0株との比較において、該乳酸菌株の混餌飼料を用いた予防効果試験の OVA 5次、 6次投与後の個体ごとの血中 I g E量をドッ卜で示す図である。

第 1 6図は、本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株である KW3 1 1 0株の、酸耐性試験の結果を示す図である。

第 1 7図は、本発明の実施例において、本発明の高抗アレルギー活性を示す乳酸菌株である KW3 1 1 0株の、胆汁酸耐性試験の結果を示す図である。

第 1 8図は、図 1 6 a、 b、 cは、本発明の実施例において花粉抗原を用いた花粉症 ·気道炎症の KW 3 1 1 0株による改善効果について、モデルマウスのくしゃみ行動について試験した結果を示す図である。第 1 9図は、図 1 7 a、 bは、本発明の実施例において花粉抗原を用いた花粉症 ·気道炎症の KW 3 1 1 0株による改善効果について、モデルマウスの引つ搔き行動について試験した結果を示す図である。

第 2 0図は、本発明の実施例において、花粉抗原を用いた花粉症 ·気

6 道炎症の KW3 1 1 0株による改善効果について、モデルマウスの血中総 I g E濃度の上昇の抑制について試験した結果を示す図である。

第 2 1図は、本発明の実施例において、花粉抗原を用いた花粉症 ·気道炎症の KW3 1 1 0株による改善効果について、モデルマウスの好酸球上昇の抑制（図 1 9 a) 及び好酸球の局所への浸潤の抑制（図 1 9 b) について試験した結果を示す図である。

第 2 2図は、本発明の実施例において、花粉抗原を用いた花粉症 ·気道炎症の KW3 1 1 0株による改善効果について、モデルマウスにおける I L _ 5の値について試験した結果を示す図である。

第 2 3図は、本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対する KW3 1 1 0株の改善効果について、血中総 I g E濃度の上昇について試験した結果を示す囟である。

第 2 4図は、本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対する KW3 1 1 0株の改善効果について、モデルマウスにおける総臨床スコアの測定結果について示す図である。

第 2 5図は、本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対する KW3 1 1 0株の改善効果について、モデルマウスの臨床スコア（耳介部）の測定結果について示す図である。

第 2 6図は、本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対する KW 3 1 1 0株の改善効果について、モデルマウスの臨床スコア（頭皮部）の測定結果について示す図である。

第 2'7図は、本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対する KW3 1 1 0株の改善効果について、モデルマウスの頭部の耳介部の糜爛 ·組織欠損の抑制の状況を示す写真である。

第 2 8図は、本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対する KW3 1 1 0株の改善効果について、モデルマウスの耳介肥

62 厚（図 2 6 a) 及び、モデルマウスのチャレンジ 1回目の耳介の肥厚の抑制傾向（図 2 6 b) について試験した結果を示す図である。

第 2 9図は、本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対する KW3 1 1 0株の改善効果について、モデルマウスのチヤレンジ 3回目の耳介の肥厚の抑制傾向について試験した結果を示す図である。

第 3 0図は、本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対する KW3 1 1 0株の改善効果について、モデルマウスの耳介の肥厚の抑制について、へマトキシリン ' ェォジン染色を用いた耳介部の病理学的評価の結果を示す写真である。

第 3 1図は、本発明の実施例において、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対する KW3 1 1 0株の改善効果について、モデルマウスの耳介の肥厚の抑制について、トロイジンブル一染色を用いた耳介部の病理学的評価の結果を示す写真である。

第 3 2図は、本発明の実施例において、花粉症についての KW3 1 1 0株のヒトでの効果について、ヨーグルトを用いた試験における、 T h 1 /Th 2比の変化について測定した結果を示す図である。

第 3 3図は、本発明の実施例において、花粉症についての KW3 1 1 0株のヒトでの効果について、ヨーグルトを用いた試験において、試験開始前と開始後における E C Pの変化について測定した結果を示す図でめる

第 3 4図は、本発明の実施例において、花粉症についての KW 3 1 1 0株のヒトでの効果について、ヨーグルトを用いた試験において、試験開始前と開始後における花粉症自覚症状の変化について観察した結果を示す図である。

第 3 5図は、本発明の実施例において、 KW3 1 1 0株を用いて、各

63 種処理加工を施して製品化した場合の抗ァレルギ一活性の維持について、清涼飲料水として製品化した場合の I L 一 1 2の産生量について試験した結果を示す図である。

第 3 6図は、本発明の実施例において、 K W 3 1 1 0株を用いて、各種処理加工を施して製品化した場合の抗ァレルギ一活性の維持について、ョーダルトに配合して製品化した場合の I L一 1 2の産生量について試験した結果を示す図である。

第 3 7図は、本発明の実施例において、 K W 3 1 1 0株を用いて、各種処理加工を施して製品化した場合の抗ァレルギ一活性の維持について，錠剤化した場合の I L— 1 2及び I L _ 4の産生量について試験した結果を示す図である。産業上の利用可能性

本発明により、高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌を取得することができ、該乳酸菌を有効成分とする高抗アレルギー効果を示す組成物を得ることができる。本発明の抗アレルギー用組成物は、花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などの環境アレルギーに対して特に効力を発揮する。特に、花粉症データや花粉を抗原として用いた喘息治療実験データに示されるように、花粉症、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎のような粘膜過敏症疾患の予防 ·治療に著効を有する。本発明の抗ァレルギ一用組成物の有効成分の一つである L . par ac as e i K W 3 1 1 0は、強い抗アレルギ — ，免疫賦活活性に加えて、腸管細胞への接着性、胃酸 ·胆汁酸に対する耐性についても優れており、該乳酸菌乃至は該乳酸菌を用いた製品を経口により投与することにより、抗ァレルギ一機能とともに、整腸作用 · コレステロール低下作用 ·血圧低下作用など従来知られているプロバイ

6 4 ォティックスの機能をも併せて発揮することができる薬剤或いは飲食品としての利用が期待できる。本発明の高抗アレルギー機能を有する組成物は、特に飲料の形で用いて、毎日継続摂取することが可能であり、尚かつ該継続摂取することが可能な量で効能を発揮する、抗ァレルギ一機能を保持し、しかも嗜好性、保存性が高い飲料を提供することが可能である。

6 5

Claims

請求の範囲

1. 卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌として L actobacillus paracasei K W 3 1 1 0株を用いた場合と同等、或いは L actobacillus paracasei KW 3 1 1 0株を用いた場合に比較して、 6 0 %以上のインターロイキン 1 2産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの 5 0 %未満のィンターロイキン 4生成量を示す乳酸菌を有効成分として含んでなることを特徴とする抗アレルギー用組成物。

2. 卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌として L actobacillus paracasei K W 3 1 1 0株を用いた場合と同等、或いは L actobacillus paracasei KW 3 1 1 0株を用いた場合に比較して、 7 5 %以上のインターロイキン 1 2産生量を示す乳酸菌を有効成分とすることを特徴とする請求項 1記載の抗ァレルギ一用組成物

3. '卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、乳酸菌無添加コントロールの 4 0 %未満のィン夕一ロイキン 4生成量を示す乳酸菌を有効成分とすることを特徴とする請求項 1又は 2記載の抗ァレルギ —用組成物。

4. 卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌として L actobacillus paracasei KW 3 1 1 0株を用いた場合と同等、或いは Lactobacillus paracasei K W 3 1 1 0株を用いた場合に比較して、 7 5 %以上のインターロイキン 1 2産生量を示し、且つ、

66 乳酸菌無添加コントロールの 40 %未満のィン夕ーロイキン 4生成量を示す乳酸菌を有効成分として含んでなることを特徴とする請求項 1〜 3 のいずれか記載の抗ァレルギ一用組成物。

5. 卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌として L actobacillus paracasei K W 3 1 1 0株を用いた場合と同等、或いは L actobacillus paracasei KW 3 1 1 0株を用いた場合に比較して、 8 0 %以上のインターロイキン 1 2産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの 3 0 %未満のィンターロイキン 4生成量を示す乳酸菌を有効成分として含んでなることを特徴とする請求項 1〜 4 のいずれか記載の抗ァレルギ一用組成物。

6. 請求項 1〜 5のいずれか記載のマウス脾臓由来リンパ球のインターロイキン 1 2及びインタ一ロイキン 4生成量を示す乳酸菌が、 L actobaci 1 lus. paracasei KW 3 1 1 0株、 L actobaci 1 lus pi antarum KW4 1 1 0株、 L actobacillus paracasei KW 3 9 2 5株、 L actobac i 1 lus paracasei K W 3 9 2 6 株、又は Streptococcus salivarius KW 3 2 1 0であることを特徴とする抗アレルギー用組成物。

7. 請求項 1〜 5のいずれか記載のマウス脾臓由来リンパ球のィンターロイキン 1 2及びインタ一ロイキン 4生成量を示し、且つ、消化液に対して耐性であり、腸管への付着性の高い乳酸菌である L actobaci 1 lus paracasei KW 3 1 1 0株を有効成分とする抗アレルギー用組成物。

8. アレルギーが、花粉症、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギ —性結膜炎、又はアトピー性皮膚炎であることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の抗アレルギー用組成物。

9. 抗アレルギー用組成物が、医薬であることを特徴とする請求項 8記

67 載の抗アレルギー用組成物。

1 0. 抗アレルギー用組成物が、飲食品であることを特徴とする請求項 8記載の抗ァレルギ一用組成物。

1 1. 卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養し、被検乳酸菌として Lactobacillus paracasei KW 3 1 1 0株を用いた場合と同等、或いは L . paracasei KW 3 1 1 0株を用いた場合に比較して、 6 0 %以上のインターロイキン 1 2産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コント口ールの 5 0 %未満のィンターロイキン 4生成量を示す乳酸菌を分離することを特徴とする高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌の取得方法。

1 2.請求項 1 1の方法により分離した乳酸菌を、培地を用いて培養し、増殖することを特徴とする高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の製造方法。

1 3. 培地を用いて培養し、増殖した乳酸菌の抗アレルギー活性を確認することを特徴とする請求項 1 2記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の製造方法。

1 4. 増殖した乳酸菌の抗アレルギー活性の確認が、卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁した培地に、該乳酸菌を添加して培養し、インターロイキン 1 2及びイン夕一ロイキン 4の産生量を測定することにより行われることを特徴とする請求項 1 3記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の製造方法。

1 5. 請求項 1 2〜 1 4のいずれか記載の高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌の製造方法により製造された乳酸菌を、医薬又は飲食品に配合し、容器に充填し、密封することを特徴とする密封容器入り医薬品又は飲食品の製造方法。

1 6. 請求項 1〜 1 0のいずれか記載の抗アレルギー用組成物をアレル

68 ギー疾患の予防及び/又は治療のための処置に用いることを特徴とするァレルギ一疾患の予防及び/又は治療方法。

1 7 . アレルギー疾患が、花粉症、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、ァレルギ一性結膜炎、又はァトピー性皮膚炎であることを特徴とする請求項 1 6記載のアレルギー疾患の予防及び/又は治療方法。

1 8 . ァレルギ一疾患の予防及び Z又は治療のための請求項 1〜 1 0のいずれか記載の抗ァレルギ一用組成物の使用。

1 9 . アレルギー疾患の予防及び Z又は治療が、花粉症、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、又はアトピー性皮膚炎の予防及び Z又は治療であることを特徴とする請求項 1 8記載の抗アレルギー用組成物の使用。

2 0 . 請求項 1〜 7のいずれか記載の抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌を活性成分として添加したことを特徴とする抗アレルギ一機能を有する飲食品。

2 1 . 抗アレルギー活性を有する乳酸菌を、 1 日に摂取する飲食品の量当たり、 5 X 1 0 ⁹個以上となるように含有させたことを特徴とする請求項 2 0記載の抗アレルギー機能を有する飲食品。

2 2 . 飲料又は食品が、アレルギーの原因となる成分を含有していないことを特徴とする請求項 2 0又は 2 1記載の抗アレルギー機能を有する飲食品。

2 3 .飲料又は食品が、アレルギーの原因となる成分を含有しない錠剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、又はドリンク剤であることを特徴とする請求項 2 2記載の抗アレルギー機能を有する飲食品。

2 4 . 乳酸菌を、殺菌して用いることを特徴とする請求項 2 0〜 2 1のいずれか記載の抗ァレルギ一機能を有する飲食品。

2 5 . 請求項 1〜 7のいずれか記載の抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌

6 9 を活性成分として添加したことを特徴とする抗ァレルギ一機能を有する飲料。

2 6. 飲料が、乳成分非配合密封容器入り飲料であることを特徴とする請求項 2 2記載の抗アレルギー機能を有する飲料。

2 7. 飲料が密封容器入り果汁含有清涼飲料又は茶飲料であることを特徵とする請求項 2 5又は 2 6記載の抗アレルギー機能を有する飲料。

2 8. 密封容器入り飲料において、添加する乳酸菌が、飲料 1 0 0 gあたり 1 0⁹〜 1 0^{1 1}個の範囲であることを特徴とする請求項 2 5〜 2 7 のいずれか記載の抗ァレルギ一機能を有する飲料。

2 9.添加する乳酸菌が L actobaci 1 lus paracasei KW3 1 1 0又はその変異株であることを特徴とする請求項 2 0〜 2 8のいずれか記載の抗ァレルギ一機能を有する食品又は飲料。

3 0. 食品又は飲料が、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、又は病者用食品として調製されていることを特徴とする請求項 2 0〜 2 9のいずれか記載の抗ァレルギ一機能を有する食品又は飲料。

3 1. 滅菌した食品又は飲料に、実質的に無菌状態において、請求項 1 〜 7のいずれか記載の高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌、又は該乳酸菌を殺菌したものを配合し、容器に充填して密封することを特徴とする抗アレルギー機能を有する密封容器入り飲食品の製造方法。

3 2. 卵白アルブミンで感作させたマウス脾臓由来リンパ球を卵白アルブミン含有培地に懸濁し、被検乳酸菌を添加して培養することにより産生されるインターロイキン 1 2及び Z又はィン夕ーロイキン 4の量を測定することを特徴とする乳酸菌の抗ァレルギ一活性の測定方法。

3 3. 被検乳酸菌を添加して培養することにより産生されるインター口ィキン 1 2及び/又はインターロイキン 4の量を、 L actobacillus paracasei KW 3 1 1 0株を用いた場合と比較して評価することを特

70 徴とする請求項 3 2記載の乳酸菌の抗ァレルギ一活性の測定方法。

3 4 . 請求項 1〜 7のいずれか記載の高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌に、担体、賦形剤及び/又はその他の補助剤を添加して製剤化したことを特徴とする抗ァレルギ一剤。

3 5 . 請求項 1 ~ 7のいずれか記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌からなる医薬品。

3 6 . 乳酸菌を用いて製造される或いは乳酸菌を含有する飲料又は食品の一部、又は全部を請求項 1〜 7のいずれか記載の高抗ァレルギ一活性を有する乳酸菌で代替することを特徴とする抗アレルギー機能を有する飲食品。

3 7 . 乳酸菌を用いて製造される或いは乳酸菌を含有する飲料又は食品の乳酸菌の一部、又は全部を請求項 1〜 7のいずれか記載の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌で代替することを特徴とする抗ァレルギ一機能を有する飲料又は食品の製造方法。