KR20180123259A - 락토바실러스 플란타럼으로부터 유래된 당단백질 l67을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P로부터 유래된 당단백질 L67을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 락토바실러스 플란타럼으로부터 유래된 당단백질 L67을 포함하는 알레르기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
알레르기는 면역 시스템의 오작동으로 보통 사람에게는 별 영향이 없는 물질이 어떤 사람에게만 과민 반응을 일으키는 것을 말한다. 알레르기를 일으키는 물질을 알레르겐 또는 항원이라고 한다. 항원이 우리 몸에 들어오면 항체가 만들어지고 항원항체반응이 일어나게 되는데, 이로 인해 알레르기의 증상이 생긴다. Gell & Cooms의 분류법을 이용하면 알레르기를 총 4형으로 분류할 수 있다.
우리가 흔히 말하는 알레르기의 대다수이자 아나필락시스(anaphylaxis)를 유발하며 즉시과민반응으로 불리고 있는 1형 알레르기, 항체 매개 과민반응의 2형, 면역복합체에 의한 3형 그리고 후천 면역에 의한 4형이 있다.
제 1형 알레르기는 가장 잘 알려져 있는 과민반응으로, IgE 매개 즉시반응(IgE mediated acute reaction) 기전에 의한 것이다. 비만세포 표면에 IgE가 붙어있고 이곳에 알레르겐이 접촉하면, 세포 내 신호전달과정을 통해 비만세포(mast cell) 또는 호염기구에서 여러 물질을 분비, 생산해내어 나오는 반응에 의해 혈관 확장으로 인한 투과성 증가, 평활근 수축으로 인한 호흡장애, 국소적 염증(아토피) 등의 증상이 나타난다. 제 1형 알레르기 질환으로는 기관지 천식, 두드러기, 알레르기 비염, 아토피 피부염과 아나필락시스 등이 있다.
제 2형 알레르기는 세포 표면에 드러나 있는 항원기와 항체(IgG 또는 IgM)가 결합하여 보체계를 활성화하여 세포 용해, 사멸 과정을 밟게 되는 항체 의존형 반응(antibody dependent reaction) 기전에 의한 것이다. 해당 질환으로는 수혈반응, 용혈성 빈혈, 혈소판 감소증, 페니실린 독성 등이 있다.
제 3형 알레르기는 면역 복합체 반응(immune complex reaction) 기전에 의한 것으로, 세포외액에 항원과 항체가 결합하여 조직에 침착하여 독성을 나타내는 면역반응에 의해 일어난다. 혈관벽, 관절의 윤활막, 신장의 기저막 등에서 주로 나타난다. 제 3형 알레르기 질환으로는 혈청병, 혈관염, 사구체 신염, 전신성홍반성낭찬, 류마티스성 관절염 등이 있다.
제 4형 알레르기는 세포매개 지연반응(cell mediated delayed type reaction) 기전에 의한 것으로, T세포와 항원이 협동으로 여러 작용을 나타내는 면역 반응에 의해 일어난다. 제 4형 알레르기 질환으로는 접촉성 피부염, 결핵, 이식거부, 갑상선염, 악성빈혈, 제1형 당뇨 등이 있다.
대부분의 알레르기 반응은 제 1형으로 천식, 비염, 결막염, 식품 및 약물 알레르기, 아토피성 피부염 등이 대표적인 질환으로 나타나고 심한 경우 아나필락시스(anaphylaxis)가 일어나 생명을 위협하기도 한다. 현재 알레르기 치료제로써 주로 사용되고 있는 것은 항히스타민제, 코르티코스테로이드(corticosteroid) 등이 있다. 항히스타민제는 히스타민 수용체 수용을 억제시켜 히스타민의 작용을 억제시키거나, 히스티딘에서 히스타민으로의 변환을 촉진시키는 효소의 활성을 억제한다. 1세대 항히스타민제는 효과가 큰 편이지만 부작용 또한 크다. 부작용으로는 졸음이나 어지럼증 등과 같은 진정작용이 있고, 전반적으로 인지능력 및 운동신경이 둔해지게 된다. 이후 개발된 2, 3세대 항히스타민제는 1세대 항히스타민제의 부작용인 진정작용은 줄였으나, 성분의 반감기가 짧고 근본적인 치료보다는 단지 증상을 완화하기 위한 것이다. 코르티코스테로이드 치료법도 알레르기 질환의 치료약물로 사용되나 장기적으로 사용하였을 때 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome)과 같은 외인성 고코르티솔증을 일으키며, 골다공증, 부신기능부전 등의 부작용을 일으킨다는 보고가 있다. 따라서, 이러한 문제점들을 보완할 수 있는 알레르기 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 물질 개발이 필요하다.
본 발명은 알레르기 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 알레르기 질환을 예방 또는 개선할 수 있는 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P로부터 유래된 당단백질 L67을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 당단백질 L67은 분자량이 13 내지 50 kDa인, 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 알레르기 질환은 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 천식, 두드러기, 아나팔락시스, 수혈반응, 용혈성 빈혈, 혈소판 감소증, 페니실린 독성, 혈청병, 혈관염, 사구체신염, 전신성홍반성낭찬, 류마티스성 관절염, 접촉성 피부염, 결핵, 이식거부, 갑상선염, 악성빈혈 및 제1형 당뇨로 이루어진 군으로부터 선택된 질환인, 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 위 1에 있어서, 상기 당단백질 L67은 Th1 세포 활성을 촉진 또는 Th2 세포 활성을 억제하는 것인, 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 위 1에 있어서, 상기 당단백질 L67은 전사인자 T-bet의 발현을 촉진 또는 GATA-3의 발현을 억제하는 것인, 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
6. 위 1에 있어서, 상기 당단백질 L67은 IL-1β, IL-6 또는 IL-10의 발현을 억제하는 것인, 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
7. 위 1에 있어서, 상기 당단백질 L67은 ERK, p38 또는 AP-1의 인산화를 억제하는 것인, 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
8. 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P로부터 유래된 당단백질 L67을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
9. 위 8에 있어서, 상기 알레르기 질환은 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 천식 또는 두드러기인, 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
10. 위 8에 있어서, 상기 식품은 우유, 치즈, 요거트, 버터, 마가린, 크림, 아이스크림, 유산균 음료, 캐피어, 쿠미스, 발효된 소시지, 곡물, 빵의 산성 반죽(dough), 피클 및 김치로 이루어진 군에서 선택된 것인, 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P로부터 유래된 당단백질 L67은 Th1 세포와 Th2 세포의 불균형을 경감시킬 수 있고, Th2 관련 사이토킨인 IL-1β, IL-6 및 IL-10의 발현을 억제할 수 있다. 또한 본 발명의 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P로부터 유래된 당단백질 L67은 전사인자 T-bet의 발현을 촉진 또는 GATA-3의 발현을 억제할 수 있다. 또한 ERK, p38 또는 AP-1의 인산화를 억제할 수 있다. 따라서, 상기 당단백질 L67은 알레르기 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
상기 당단백질 L67은 유산균인 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P로부터 유래된 것이므로 인체에 대한 부작용을 최소화할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P을 포함한 스타터 배양액을 이용하여 제조된 발효물은 시제품과 비교하여 산성화, 발효시간, 살아있는 전체 세포 수, 맛 및 질감 면에서 큰 차이가 없으므로, 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P로부터 유래된 당단백질 L67은 알레르기 질환을 예방 또는 개선할 수 있는 건강기능식품으로 사용될 수 있다.
도 1은 BPA 처리된 RBL-2H3 세포에서 p38 MAPK의 인산화를 억제하는 당단백질 L67의 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 BPA 처리된 RBL-2H3 세포에서 ERK MAPK의 인산화를 억제하는 당단백질 L67의 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 BPA 처리된 RBL-2H3 세포에서 AP-1(c-Fos, c-Jun) MAPK의 인산화를 억제하는 당단백질 L67의 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 BPA 처리된 RBL-2H3 세포에서 GATA-3의 발현을 억제하고, T-bet의 발현을 촉진하는 당단백질 L67의 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 BPA 처리된 RBL-2H3 세포에서 IL-1β, IL-6 및 IL-10 유전자의 발현을 억제하는 당단백질 L67의 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 BPA 처리된 RBL-2H3 세포에서 ERK MAPK의 인산화를 억제하는 당단백질 L67의 효과를 나타낸 것이다.
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도 5는 BPA 처리된 RBL-2H3 세포에서 IL-1β, IL-6 및 IL-10 유전자의 발현을 억제하는 당단백질 L67의 효과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구체적인 실시형태를 설명하기로 한다. 그러나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P로부터 유래된 당단백질 L67을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서의 알레르기 질환은 면역 시스템의 오작동으로 보통 사람에게는 별 영향이 없는 물질이 어떤 사람에게만 과민 반응을 일으키는 것을 말한다. 알레르기를 일으키는 물질을 알레르겐 또는 항원이라고 한다. 항원이 우리 몸에 들어오면 항체가 만들어지고 항원항체반응이 일어나게 되는데, 이로 인해 알레르기의 증상이 생긴다. Gell & Cooms의 분류법을 이용하면 알레르기를 총 4형으로 분류할 수 있다. 즉시과민반응으로 불리고 있는 1형 알레르기, 항체 매개 과민반응의 2형, 면역복합체에 의한 3형 그리고 후천 면역에 의한 4형이 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 알레르기 질환은 제1형 알레르기, 제2형 알레르기, 제3형 알레르기 또는 제4형 알레르기일 수 있다. 구체적으로, 상기 알레르기 질환은 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 천식, 두드러기, 아나팔락시스, 수혈반응, 용혈성 빈혈, 혈소판 감소증, 페니실린 독성, 혈청병, 혈관염, 사구체신염, 전신성홍반성낭찬, 류마티스성 관절염, 접촉성 피부염, 결핵, 이식거부, 갑상선염, 악성빈혈, 제1형 당뇨 등일 수 있다. 바람직하게는 알레르겐에 대한 IgE 매개 비정상적인 면역 반응인 제1형 알레르기일 수 있다. 또는 상기 알레르기 질환의 알레르겐은 비스페놀 A(bisphenol A, BPA)일 수 있다. BPA는 내분비 교란 물질로, 일상 생활에서 널리 쓰이고 있다. 최근 연구에서 BPA는 대식세포에서 사이토킨(cytokine) 및 항체를 생산함으로써 면역계를 방해할 수 있다고 보고된 바 있다. BPA에 대한 노출은 IL-4 및 항원 특이적 IgE의 생산뿐 아니라 사이토킨 IL-6 및 IL-10을 포함한 Th2와 관련된 사이토킨의 발현을 조절할 수 있다.
락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum)은 락토바실러스(Lactobacillus)속 젖산균으로 막대기 모양의 간균이며 그람양성이다. 크기는 0.7~1.0 x 3.0~8.0 μm으로 생육 적정 온도는 29-33℃이며 약간의 호기성을 띤다. 락토바실러스 플랜타룸은 아라비노오스(arabinose), 글루코오스(glucose), 과당(fructose), 갈락토오스(galactose), 엿당(maltose), 수크로오스(sucrose), 덱스트란(dextran), 라피노오스(raffinose) 및 트레할로스(trehalose) 등을 발효하여 젖산을 생성한다. 주로 우유, 치즈, 버터, 케피어(kefir), 발효된 소시지, 발효된 감자, 곡물, 빵의 산성 반죽(dough), 피클이나 김치와 같은 침채류 및 토마토 등에서 분리되며, 자연계에서 가장 분포가 넓은 젖산균 중의 하나이다. 특히 우리 나라 김치의 발효에 중요한 역할을 하는 젖산균으로 식염 내성은 약 5.5%이다.
본 발명에 있어서, 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43)은 본 발명자들이 2014년 3월 11일자로 한국미생물보존센터에 기탁된 것으로, 기탁번호는 KCCM11522P이다.
본 발명의 당단백질 L67은 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P로부터 유래된 것이다. 상기 당단백질 L67을 제조하는 방법의 일 예시는 다음과 같으나, 특정의 것으로 한정되는 것은 아니다. 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P을 배양한 배양액을 얻은 후, 배양액 내 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P 세포로부터 단백질을 분리한다.
구체적으로는 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P을 20 내지 50℃에서 12 내지 24시간 동안 배양한 배양액을 원심분리하여 펠렛을 얻는다. 세포 용해액으로 펠렛을 현탁시킨 후 20 내지 50℃에서 가열한다. 구체적으로 세포 용해액은 SDS 용액 등일 수 있고, 세포 용해액을 사용하는 방법 외에도 비드 또는 파쇄기 등을 이용하여 물리적으로 추출하거나 동결-해빙 방법 등을 이용할 수 있다. 가열 후 원심분리하여 상등액을 회수하고, 상등액으로부터 당단백질을 얻는다. 구체적으로 상등액을 증류수로 투석하여 본 발명의 당단백질 L67을 얻을 수 있다.
본 발명의 당단백질 L67은 분자량이 13 내지 50 kDa 이고, 당이 전체 중량의 20 내지 40%, 단백질이 전체 중량의 60 내지 80 %를 차지한다. 보다 구체적으로, 분자량이 18 kDa일 수 있고, 당이 전체 중량의 37%, 단백질이 전체 중량의 63%일 수 있다. 상기 당단백질 분자량은 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)으로 측정된 것이다.
본 발명의 당단백질 L67의 최적활성 pH는 pH 6 내지 8 이다.
당은 육탄당에서 다 같기 때문에 서열분석을 할 수 없고 아미노산은 결합된 당이 방해를 해서, 서열 분석이나 그 3차원적 구조를 밝히는 것이 불가하다(대전의 기초과학연구소 의견).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 당단백질 L67은 Th1 세포 활성을 촉진할 수 있다. 또는 Th2 세포 활성을 억제할 수 있다. 상기 당단백질 L67은 Th1 세포 활성을 촉진 또는 Th2 세포 활성을 억제하여 Th1 세포와 Th2 세포의 활성의 불균형을 감소시킬 수 있다. 상기 당단백질 L67은 Th1 세포 활성을 촉진 또는 Th2 세포 활성을 억제하여, 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 수 있다.
T 세포는 Th0 전구체에서 항원제시세포와 결합을 통한 활성화 과정에서 항원제시세포가 자극하는 자극의 종류에 따라 Th1 세포와 Th2 세포로의 분화가 가능하며, 이렇게 분화된 Th1 세포와 Th2 세포는 각기 특징적인 사이토킨의 발현을 통해 서로 상반되는 면역기능을 담당한다. Th1 세포의 경우 IFN-γ, TNF, IL-12와 같은 사이토킨을 발현하며, 전염증성(pro-inflammatory) 혹은 세포 매개 면역 반응(cell mediated immune response)를 담당한다. 즉, IFN-γ나 TNF와 같은 사이토킨의 증가가 수반되는 면역반응의 경우 Th1 면역반응 (Th1 type immune response)이라 한다.
이에 반해 Th2 세포는 IL-4, IL-6, IL-10, IL-1β와 같은 사이토킨을 선택적으로 발현하며, 비만세포(mast cell)과 호염기구(basophil)로 하여금 세포 내에 수용성 물질의 방출을 유도하며, B 세포의 IgE나 IgG1과 같은 항체의 생산을 촉진한다. IL-4, IL-6, IL-10, IL-1β와 같은 사이토킨의 발현 증가가 수반되는 면역반응의 경우 Th2 면역반응(Th2 type immune response)이라 한다.
이렇게 정의되는 Th1 면역반응과 Th2 면역반응은 균형을 이루어 면역학적 항상성을 유지하게 된다. 하지만 특정 질병의 발생과정은 이러한 Th1/Th2 균형을 무너뜨려 면역 불균형을 초래하여 특정 면역반응을 과도하게 일으키게 된다. 일반적으로 항원으로 작용하는 알레르겐은 면역세포에 작용하여 특이적으로 Th2 면역반응을 촉진하게 된다. Th2 면역반응과 관련된 질환에는 아토피 피부염, 천식, 알레르기 비염, 두드러기, 류마티스 관절염 등과 같은 질병이 분류될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 당단백질 L67은 전사인사 T-bet의 발현을 촉진할 수 있다. 또는 전사인자 GATA-3(GATA-결합 단백질 3)의 발현을 억제할 수 있다. 상기 당단백질 L67은 전사인자 T-bet의 발현을 촉진 또는 GATA-3 발현을 억제하여 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 수 있다.
Th1 및 Th2 세포는 T 세포에서 발현되는 T-box(T-bet) 및 GATA-결합 단백질3(GATA-3)와 같은 특이적인 전사 인사에 의해 T helper 세포 Th0로부터 분화된다. T-bet은 Th1 세포의 분화와 IFN-γ 분비와 관련이 있고, GATA-3는 Th2 세포 분화에 중심적인 역할을 한다.
GATA-3은 Th2 세포 분화에서 주요한 전사 요소로 잘 알려져 있다. GATA-3의 활성은 IL-4 및 IL-10과 같은 Th2 사이토킨의 생산을 유도하고, Th1 관련 사이토킨의 생산을 억제한다.
본 발명의 당단백질 L67은 알레르겐으로 인해 증가한 GATA-3의 발현을 억제할 수 있다. 반대로, 본 발명의 당단백질 L67은 T-bet의 발현을 촉진시킬 수 있다. 상기 당단백질 L67은 T-bet과 GATA-3의 발현을 조절함으로써 Th1 과 Th2 세포 사이의 균형을 유지하는 데 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 당단백질 L67은 IL-1β, IL-6 또는 IL-10의 발현을 억제할 수 있다. 상기 당단백질은 IL-1β, IL-6 또는 IL-10의 발현을 억제하여 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 수 있다.
분화된 Th1 세포는 세포 내의 병원균에 대한 면역 저항성에 필요한 IFN-γ 및 림프독소를 생산한다. 그에 반해, Th2 세포는 IL-1β, IL-6 및 IL-10을 방출한다. 그리고 IL-10은 IL-12 및 IFN-γ(Th1 사이토킨)를 억제하는 역할을 한다. 이는 알레르기 질환과 관련이 있다. 증가된 IL-1β, IL-6 또는 IL-10의 유전자 발현은 Th0 세포에서 Th2 세포로의 분화를 촉진시킨다. 본 발명의 당단백질 L67은 IL-1β, IL-6 또는 IL-10의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 당단백질 L67은 ERK, p38 또는 AP-1의 인산화를 억제할 수 있다. 상기 당단백질 L67은 ERK, p38 또는 AP-1의 인산화를 억제하여 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 수 있다.
Th2 세포로의 분화와 관련된 요소 중 하나인 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK, Mitogen-activated protein kinase)는 IL-4 및 IL-10과 같은 Th2 관련 사이토킨 발현의 주요 매개자이다. 따라서, Th2 면역 반응에 의해 유도된 알레르기 질환에서 MAPK 신호 경로는 중요한 치료 타겟이다. ERK MAPK와 p38 MAPK는 MAPK 신호 경로 중 하나이다.
본 발명의 당단백질 L67은 MAPK 신호를 억제할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 당단백질 L67은 ERK 또는 p38의 인산화를 억제하여 결과적으로 IL-1β, IL-6 및 IL-10의 발현을 억제할 수 있다.
ERK MAPK 또는 JNK MAPK의 활성화는 활성화단백질-1(AP-1, activator protein-1)의 핵 전좌(nuclear translocation)로 이어지고, 전염증(pro-inflammatory) 사이토킨 유전자의 발현을 증가시킨다. AP-1은 전사인자로서 c-Fos, c-Jun, ATF 및 JDP 군에 속해 있는 단백질들로 구성되어 있는 헤테로 이합체(heterodimer) 형태이다. AP-1은 사이토킨, 성장인자 및 박테리아나 바이러스 감염 같은 다양한 자극에 반응하여 유전자 발현을 조절하며, 세포의 분화, 증식 그리고 세포사멸과 같은 세포 성장 과정도 조절한다. 본 발명의 당단백질 L67은 AP-1의 인산화를 억제할 수 있다. 보다 구체적으로 c-Fos 또는 c-Jun의 인산화를 억제할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 알레르기 질환에 관여하는 여러 인자를 조절하는 효과가 우수하여, 다양한 알레르기 질환에 대한 우수한 약효를 나타낼 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 알레르기 질환에 관여하는 MAPK 신호를 억제할 수 있다. 구체적으로 ERK, p38 또는 AP-1의 인산화를 억제할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 전사인자 GATA-3 또는 T-bet의 활성을 조절할 수 있다. 구체적으로 GATA-3의 발현을 억제할 수 있거나 T-bet의 발현을 촉진시킬 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 전사인사 GATA-3 또는 T-bet의 활성 조절함으로써 Th1 세포와 Th2 세포 사이의 균형을 유지할 수 있다. 구체적으로 Th1 세포 활성을 촉진시킬 수 있거나 Th2 세포 활성을 억제할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 Th2-관련 사이토킨을 억제할 수 있다. 구체적으로 IL-1β, IL-6 또는 IL-10의 발현을 억제할 수 있다.
상기 약학 조성물은 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 대한 활성을 갖는 공지의 유효 성분을 더 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형제 및 희석제는 예를 들어, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유를 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 개체에 투여된 후 유효 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
상기 약학 조성물에 있어서, 경구 투여를 위한 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 담체, 부형제, 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형제, 또는 희석제는 예를 들어, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유를 포함할 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 마그네슘 스테아레이트, 또는 탈크와 같은 윤활제를 더 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물에 있어서, 경구를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 또는 시럽제일 수 있다. 상기 액상 제제는 물, 또는 리퀴드 파라핀을 포함할 수 있다. 상기 액상 제제는 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 또는 보존제를 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물에 있어서, 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 또는 좌제일 수 있다. 비수성용제 또는 현탁제는 식물성 기름 또는 에스테르를 포함할 수 있다. 식물성 기름은 예를 들어, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 올리브 오일일 수 있다. 에스테르는 예를 들어 에틸올레이트일 수 있다. 좌제의 기제는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 또는 글리세로젤라틴일 수 있다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 본 발명이 속하는 기술분야에 일반적으로 적용되는 방법에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 및 인간 등을 비롯한 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하 또는 자궁 내 경막 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P로부터 유래된 당단백질 L67을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품은 식품학적으로 허용되는 첨가제, 부형제 또는 향미제를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 과립, 분말, 티백, 파우치, 환제, 조미료, 곡물제품, 스프, 소스, 오일, 액상제제, 음료수, 껌, 아이스크림, 초콜렛, 차, 드링크제, 알코올 음료, 유제품, 우유, 치즈, 요거트, 버터, 마가린, 크림, 아이스크림, 유산균 음료, 캐피어, 쿠미스, 발효된 소시지, 육류제품, 유동식, 죽, 빵, 빵의 산성 반죽(dough), 피클, 김치, 케이크, 캔디, 스낵류, 과자류, 영양바, 면류 또는 비타민 복합제 등의 형태일 수 있다.
본 발명의 식품은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P로부터 유래된 당단백질 L67를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지,마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P로부터 유래된 당단백질 L67를 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 식품은 우유, 치즈, 요거트, 버터, 마가린, 크림, 아이스크림, 유산균 음료, 캐피어, 쿠미스, 발효된 소시지, 곡물, 빵의 산성 반죽(dough), 피클 및 김치로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P은 스타터 배양액(starter culture)으로 사용될 수 있다. 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P을 포함한 스타터 배양액을 이용하여 발효물을 제조할 수 있다. 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P은 발효 과정에서 산성화에 영향을 주지 않고, 스타터 배양액의 발효 시간 또는 살아있는 세포 전체 수에도 영향을 주지 않는다. 또한 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P을 포함한 스타터 배양액을 이용하여 제조된 발효물의 맛 또는 질감에 대한 성질을 변화시키지 않는다.
본 발명에 있어서, "스타터 배양액(starter culture)"란 발효물을 제조하는 경우에 사용하는 미생물 배양액을 말한다. 따라서 스타터 미생물의 종류는 그 제품의 특성을 결정하게 되며 제품의 품질에 중요한 영향을 미친다. 미생물 중에서 스타터로 사용되고 있는 것은 박테리아, 곰팡이, 효모 등을 들 수 있으며, 이것을 단독 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P와 Bifidobacterium longum 및/또는 Streptococcus thermophilus를 혼합하여 스타터 배양액을 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 알레르기 질환은 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 천식 또는 두드러기일 수 있다. 본 발명의 당단백질 L67은 Th1 세포 활성을 촉진하거나 Th2, 세포 활성을 억제할 수 있어, Th1 세포와 Th2 세포의 불균형을 경감시킬 수 있고, Th2 관련 사이토킨인 IL-1β, IL-6 및 IL-10의 발현을 억제할 수 있다. 또한, 전사인자 T-bet의 발현을 촉진 또는 GATA-3의 발현을 억제할 수 있다. 또한 ERK, p38 또는 AP-1의 인산화를 억제할 수 있다. 따라서 당단백질 L67을 포함한 상기 건강기능식품은 알레르기 질환을 예방 또는 개선할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예
실시예 1. 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(
Lactobacillus plantarum CNU43
) KCCM11522P 유래 당단백질의 제조
본 발명에 쓰인 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43)은 본 발명자들이 2014년 3월 11일자로 한국미생물보존센터에 기탁된 것으로, 기탁번호는 KCCM11522P이다.
Lactobacillus plantarum CNU43을 37에서 18시간 배양한 후에, 당단백질 제조를 위한 배양액 10 ml을 얻었다. 원심분리(12,000 x g, 4)하여 펠렛을 회수하였고, 멸균된 탈이온수로 3번 세척하였다. 10 g/L SDS 용액으로 세척된 세포를 현탁시켰고 10분 동안 가열하였다. 가열 후, 15분 동안 원심분리하여(12,000 x g, 4) 상등액을 회수하였고, 상등액을 4℃에서 증류수로 투석하였다. 그 다음 당단백질 L67을 포함한 상등액을 냉동건조기(freeze-dryer)를 이용하여 건조하였고, -70℃에서 보관하였다.
비교예 1. RBL-2H3 세포의 배양 및 BPA 처리
RBL-2H3 세포(rat basophilic leukemia cell line)는 한국세포주은행으로부터 제공받았다. 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 추가된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양되었다. 배지는 일주일에 2번씩 교체하였다. 세포를 6-웰 플레이트에 2.3 x 106 세포수/ml씩 나누었다. 비장세포를 항크스 평형 염류 완충액(Hanks' balanced salt solution)에서 무균 조건을 이용하여 BALB/c 쥐로부터 회수하였다. 비장은 40 μm 세포 스트레이너(Falcon, Corning Inc., Corning, NY)를 이용하여 부수었다. 균질 세포의 상등액에 염화암모늄(0.8% wt/vol)을 첨가하여 침전시키고 원심분리하였다. 원심분리 후 세포를 PBS로 세척하였고 10% 소태아혈청, 100 U/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지에, 37℃, 5% CO2 조건에서 현탁시켰다. 그런 다음, 세포를 6-웰 또는 96-웰 플레이트(flat-bottomed plates)에 1 x 106 세포수/ml 의 농도로 나누었다. 그 후에, RBL-2H3 세포에 50 μM BPA 를 30분 동안 처리하였다.
실시예 2. RBL-2H3 세포의 배양 및 BPA 및 당단백질 L67 처리
RBL-2H3 세포의 배양 과정은 비교예 1과 같다. 비교예 1에서 RBL-2H3 세포에 50 μM BPA 를 30분 동안 처리하는 과정 대신 50 μM BPA 및 당단백질 L67을 동시에 30분 동안 처리하였다. 당단백질 L67의 처리 농도는 각각 5 μg/ml, 20 μg/ml, 50 μg/ml 및 100 μg/ml이다.
실험예 1. 웨스턴 블랏(Western blot Analysis)
BPA 처리된 비교예 1의 세포와 BPA와 당단백질 L67이 동시에 처리된 실시예 2의 세포들을 배지를 제거한 후 PBS로 세척하엿다. 단백질은 Oh와 Lim (2008)의 방법에 따라 분리하였다.
분리한 단백질은 100V, 2시간, 상온에서 10% 폴리아크릴아마이드 미니-겔 전기영동에 의해 분석되었다. 이 때 미니-프로테안 II 전기영동 세포(Bio-Rad, Hercules, CA) 장치를 이용하였다. 니트로셀로오스 멤브레인(Millipore, Bedford, MA)에 단백질을 이동시킨 후, 멤브레인을 TBS-T(Tris-buffered saline Tween 20) 용액에서 토끼 다중클론항체(1:3,000)와 함께 4에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 사용된 토끼 다중클론항체는 T-bet, GATA-3, MAPK, AP-1 및 α-튜뷸린의 항체이다. 멤브레인을 TBS-T 용액으로 3번 세척한 후, 다시 TBS-T 용액에서 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG)와 같이 1시간 30분 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 단백질 밴드는 화학발광(chemiluminescence)으로 시각화하였고, 밴드 강도는 scion 이미징 소프트웨어를 이용하여 측정하였다.
BPA-처리된 RBL-2H3 세포에서 당단백질 L67이 p38 MAPK의 인산화를 억제시킬 수 있는지 판단하기 위해, 웨스턴 블랏을 통해 p38 인산화를 분석하였다 (도 1). 도 1은 BPA 처리된 RBL-2H3 세포에서 p38 MAPK의 인산화를 억제하는 당단백질 L67의 효과를 나타낸 것이다. 도 1의 (A)는 웨스턴 블랏의 결과를 나타낸 것이고, (B)는 웨스턴 블랏의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 1을 참조하면, BPA-처리된 RBL-2H3 세포는 대조군과 비교하여 p38의 인산화가 4.5배 증가하였다. 그러나 증가된 인산화는 당단백질 L67 처리로 대조군과 비교하여 감소하였다. 당단백질 L67을 5, 20, 50 및 100 μg/ml 농도로 처리하였을 때, 대조군과 비교하여 각각 3.67, 3.62, 3. 43 및 0.87 배로 감소하였다. 도 2는 BPA 처리된 RBL-2H3 세포에서 ERK MAPK의 인산화를 억제하는 당단백질 L67의 효과를 나타낸 것이다. 도 2의 (A)는 웨스턴 블랏의 결과를 나타낸 것이고, (B)는 웨스턴 블랏의 결과를 그래프로 나타낸 것이다. ERK MAPK의 활성도 BPA 처리로 인해 증가하였고, 이러한 증가된 활성은 당단백질 L67의 처리량에 따라 감소하였다.
도 3은 BPA 처리된 RBL-2H3 세포에서 AP-1(c-Fos, c-Jun) MAPK의 인산화를 억제하는 당단백질 L67의 효과를 나타낸 것이다. 도 3의 (A)는 웨스턴 블랏의 결과를 나타낸 것이고, (B)는 c-Fos에 대한 웨스턴 블랏의 결과를 그래프로 나타낸 것이고, (C)는 c-Jun에 대한 웨스턴 블랏의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3을 참조하면 AP-1(c-Fos) 및 AP-1(c-Jun)의 인산화는 30분 간의 BPA 처리(50 μM)로 인해 각각 6.65 및 4.73배 증가하였다. AP-1(c-Fos)의 증가된 인산화는 당단백질 L67의 처리로(5, 20, 50 및 100 μg/ml) 각각 4.77, 4.02, 2.91 및 2.79 배 감소하였다. AP-1(c-Jun)의 증가된 인산화는 당단백질 L67의 처리로(5, 20, 50 및 100 μg/ml) 각각 3.83, 3.08, 2.38 및 1.17 배 감소하였다.
도 4는 BPA 처리된 RBL-2H3 세포에서 GATA-3의 발현을 억제하고, T-bet의 발현을 촉진하는 당단백질 L67의 효과를 나타낸 것이다. 도 4의 (A)는 웨스턴 블랏의 결과를 나타낸 것이고, (B)는 GATA-3에 대한 웨스턴 블랏의 결과를 그래프로 나타낸 것이고, (C)는 T-bet에 대한 웨스턴 블랏의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, BPA-처리된 비장세포에서 GATA-3의 발현은 2.6배 증가하였다. 반면에, T-bet의 발현은 대조군에 비해 0.15배 감소하였다. 증가된 GATA-3 발현은 5, 20, 50 및 100 μg/ml의 당단백질 L67 처리에 의해 각각 1.5, 1.12, 1.03 및 0.6 배로 감소하여, 투여량에 의존하는 형태로(dose-dependent manner) 억제되는 것으로 나타났다. 감소한 T-bet의 발현은 당단백질 L67 처리(5, 20, 50 및 100 μg/ml)에 대해 각각 0.2, 0.74, 0.76 및 0.8 배로 증가하였다.
실험예 2. RNA 분리 및 실시간 정량적 PCR(Real-time quantitative PCR)
BPA 처리된 비교예 1의 세포와 BPA와 당단백질 L67이 동시에 처리된 실시예 2의 세포들로부터 RNA를 분리하였다. 전체 RNA는 RNeasy 미니 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 매뉴얼에 따라 분리하였다. 맥심 RT 프리믹스 올리고 실시간 정량적 PCR(Maxime RT Premix Oligo real-time quantitative PCR, 인트론바이오테크놀로지, 성남, 한국) 키트를 이용하여 1 μl의 전체 RNA(1 μg/20 μl)로부터 cDNA를 제조하였다. 사용한 프라이머는 표 1에 나타내었다.
| 서열번호 | 유전자 | PCR 프라이머 서열 (5'-3') | |
| 1 | IL-1β | 정방향 프라이머 | TTGACGGACCCCAAAAGATG |
| 2 | 역방향 프라이머 | AGAAGGTGCTCATGTCCTCA | |
| 3 | IL-6 | 정방향 프라이머 | GTTCTCTGGGAAATCGTGGA |
| 4 | 역방향 프라이머 | TGTACTCCAGGTAGCTATGG | |
| 5 | IL-10 | 정방향 프라이머 | CTGGACAACATACTGCTAACCGAC |
| 6 | 역방향 프라이머 | ATTCATTCATGGCCTTGTAGACACC | |
| 7 | GAPDH | 정방향 프라이머 | CAAAAGGGTCATCATCTCTG |
| 8 | 역방향 프라이머 | CCTGCTTCACCACCTTCTTG | |
각 유전자의 발현 수준은 2x 프라임 Q 마스터 믹스(prime q master mix, Kapa Biosystems, Boston, MA)를 이용하여 real-time PCR로 측정하였고, CFX96TM Real-time 시스템(Bio-Rad)을 이용하여 분석하였다. 증폭은 IL-1β, IL-6, IL-10 및 GADPH에 대해 95℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 60초를 50 사이클 반복하여 증폭하였다. 샘플의 SΔCt값 (Δ cycle threshold)은 BPA 단독 처리 또는 BPA와 당단백질 L67 함께 처리된 세포에서, IL-1β, IL-6 또는 IL-10과 GADPH 값의 차이점에 따라 계산되었다. 처리 그룹과 대조군 간의 각각의 유전자 발현 수준은 식(SΔCt-CΔCt)을 이용하여 결정되었다.
알레르기 관련 사이토킨에 대한 당단백질 L67 처리 효과를 확인하기 위해, BPA-처리된 RBL-2H3 세포에서 IL-1β, IL-6 및 IL-10 유전자의 발현을 측정하였다. 도 5는 BPA 처리된 RBL-2H3 세포에서 IL-1β, IL-6 및 IL-10 유전자의 발현을 억제하는 당단백질 L67의 효과를 나타낸 것이다. 도 5의 (A), (B) 및 (C)는 각각 IL-1β, IL-10 및 IL-6 유전자에 대한 실시간 정량적 PCR(Real-time quantitative PCR) 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, BPA로 처리된 세포는 대조군에 비해 IL-6, IL-10 및 IL-1β의 발현이 매우 촉진되었음을 알 수 있다. 그러나, 세포에 당단백질 L67을 처리하였을 경우, BPA 단독으로 처리하였을 때와 비교하여 처리량에 의존하는 양상으로(dose-dependent manner) IL-1β, IL-6 및 IL-10이 억제되었다. BPA-유도된 IL-6 유전자 전사는 4.5배 증가하였으나, 당단백질 L67을 처리(5, 20, 50 및 100 μg/ml)함에 따라, 각각 4.2, 3.6, 2.8, 1.9 및 1.8 배 감소하였다. BPA 처리함에 따라 IL-10 및 IL-1β의 유전자 전사는 둘 다 1.8배 증가하였으나, 당단백질 L67의 처리로 유전자 발현이 감소되었다.
비교예 2, 3 및 실시예 3. 요거트 제조
요거트는 우유(SNF 11%; 탈지분유를 포함한 원유(raw milk with skim milk powder); 서울우유, 서울, 한국)를 95℃까지 20분 동안 가열한 후, 40℃까지 냉각시켜 제조하였다. 스타터 배양액을 멸균상태로 접종하였다. Streptococcus thermophilus 와 Bifidobacterium 종은 M17 배지(Difco, Detroit, MI)와 BL 배지(Teraguchi et al., 1978)에서 각각 배양하였다. Lactobacillus acidophilus 및 L. plantarum CNU43 균주는 MRS 배지(Difco)에서 배양하였다. 모든 균주는 -80℃에서 환원 탈지유(reconstituted skim milk, 10% wt/vol), yeast extract (0.5% wt/vol) 배지에 저장하였고, 사용 전에 3번 배양하였다. 테스트한 스타터들은 표 2에 나타내었다.
| 스타터배양액 | 배양액 조성 (cfu/mL) | 출처 |
| 비교예 2 (스타터 A) |
Lactobacillus acidophilus La5 (~106), Bifidobacterium animalis ssp. lactis Bb12 (~106) 및 Streptococcus thermophilus (~107) |
Chr. Hansen A/S, Horsholm,Denmark |
| 비교예 3 (스타터 B) |
Lactobacillus acidophilus NCFM (~106), Bifidobacterium longum (~106) 및 Streptococcus thermophilus (~107) |
Danisco USA Inc., New Century, KS |
| 실시예 3 (스타터 C) |
Lactobacillus plantarum CNU43 (~106), Bifidobacterium longum (~106) 및 Streptococcus thermophilus (~107) |
Culture Systems Inc., Mishawaka, IN |
실험예 3. 제조된 요거트의 평가
비교예 2, 3 및 실시예 3을 발효하는 동안의 pH 값은 pH 미터로 측정하였다. 표 3는 pH 4.5까지(endpoint) 배양액이 발효하는 동안, pH의 감소 변화를 나타내고 있다. 모든 스타터 배양액에서, pH 4.5에 도달하기 위해 요구되는 발효 시간은 5시간이다. 프로바이오틱 균주 L. acidophilus La5, L. acidophilus NCFM, Bifidobacterium animalis Bb12 및 L. plantarum CNU43은 산성화에 있어 명확한 차이점을 나타내지 않는다.
| 시간 | 비교예 2 (스타터 A) |
비교예 3 (스타터 B) |
실시예 3 (스타터 C) |
| O시간 | 6.55 ± 0.005 | 6.52 ± 0.004 | 6.61 ± 0.007 |
| 2시간 | 6.01 ± 0.006 | 5.98 ± 0.006 | 6.08 ± 0.006 |
| 4시간 | 4.75 ± 0.004 | 4.68 ± 0.006 | 4.72 ± 0.005 |
| 종료점 (Endpoint) |
4.44 ± 0.007 (5시간 10분) |
4.46 ± 0.007 (5시간 5분) |
4.45 ± 0.005 (5시간 10분) |
L. acidophilus 및 L. plantarum CNU43은 MRS-말토오즈 아가(MRS-maltose agar)에서 37℃, 48시간 동안 배양 후 균수를 측정하였다. S. thermophilus는 M17 아가에서 43℃, 24시간 동안 배양하였고, B. longum은 테라구치(Teraguchi et al., 1978) 방법에 따라 BL-NPNL(nalidixic acid, paromomycin sulfate, neomycin sulfate 및 lithium chloride) 아가를 이용하여 혐기성 조건, 37에서 48시간 동안 배양하였다.
표 4을 참조하면, S. themophilus의 살아있는 세포의 수는 발효하는 동안 빠르게 증가한 반면, bifidobacteria와 bactobacilli는 대략 1 log 정도로 꾸준히 증가하였다. 비교예 2, 3 및 실시예 3의 스타터 배양액에서, 발효 시간 또는 스타터 배양액에 살아 있는 세포의 전체 수에는 차이점이 없음을 관찰하였다.
| 스타터 배양액 | 초기 살아있는 세포수(cfu/mL) | 최종 살아있는 세포수 (cfu/mL) | |
| 비교예 2 (스타터 A) |
Lactobacillus acidophilus La5 | 1.43 × 106 ± 0.83 | 1.21 × 107 ± 1.12 |
| Bifidobacterium animalis ssp. lactis Bb12 | 1.35 × 106 ± 0.71 | 9.10 × 107 ± 2.15 | |
| Streptococcus thermophilus | 2.37 × 107 ± 0.79 | 1.63 × 109 ± 0.62 | |
| 비교예 3 (스타터 B) |
Lactobacillus acidophilus NCFM | 2.54 × 106 ± 1.56 | 1.01 × 107 ± 0.61 |
| Bifidobacterium longum | 1.83 × 106 ± 0.81 | 1.31 × 107 ± 0.78 | |
| Streptococcus thermophilus | 1.66 × 107 ± 0.44 | 1.93 × 109 ± 1.14 | |
| 실시예 3 (스타터 C) |
Lactobacillus plantarum CNU43 | 1.02 × 106 ± 1.27 | 2.17 × 107 ± 0.99 |
| Bifidobacterium longum | 1.12 × 106 ± 0.44 | 2.01 × 107 ± 1.04 | |
| Streptococcus thermophilus | 1.53 × 106 ± 0.62 | 1.88 × 109 ± 0.95 | |
관능평가는 6명의 검사원에 의해 평가하였다. 요거트는 맛(1~9점), 질감 및 선호도(1~5점)에 대한 감각평가척도(sensory rating scale)를 이용하여 평가되었다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 관능 평가에서 L. plantarum CNU43이 포함된 요거트는 다른 상업용 스타터들과 비슷한 결과를 나타냈다.
| 스타터배양액 | 맛(flavor) | 질감(testure) | 선호도(preference) |
| 비교예 2 (스타터 A) |
7.12 ± 0.051 | 3.21 ± 0.048 | 3.43 ± 0.053 |
| 비교예 3 (스타터 B) |
7.45 ± 0.053 | 3.19 ± 0.042 | 3.51 ± 0.056 |
| 실시예 3 (스타터 C) |
7.36 ± 0.049 | 3.25 ± 0.051 | 3.57 ± 0.061 |
L. plantarum CNU43은 산성화(acidification)에 영향을 주지 않는 것으로 나타났고, 스타터 배양액에서 발효 시간 또는 살아있는 세포의 전체 수에는 차이가 없다는 것 또한 관찰하였다. 관능평가에서 L. plantarum CNU43이 포함된 요거트는 다른 상업용 스타터와 유사한 결과를 나타냈다. 우유 발효(milk fermentation)하는 동안, 유산균(lactic acid bacteria)은 젖당(lactose)을 젖산(lactic acid)으로 전환할 수 있다. 이는 요거트의 맛과 텍스쳐에 기여한다. Hekmat and Reid는 프로바이오틱스의 첨가는 요거트의 성질을 크게 바꾸지 않는다고 보고하였다. 대부분 프로바이오틱스 균주는 주요한 우유-발효 미생물이 아니다. 반면에, S. thermophilus와 L. delbrueckii spp.는 아세트알데하이드(acetaldehyde), 디아세틸(diacetyl) 및 아세토닌(acetonin)과 같은 풍미 화합물을 생산하는 역할을 독점적으로 한다고 보고된 바 있다 (Cheng, 2010).
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY
<120> Composition for preventing or treating allergic disease
comprising glycoprotein L67 from Lactobacillus plantarum
<130> 17P01015
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-1beta forward primer
<400> 1
tgtactccag gtagctatgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-1beta reverse primer
<400> 2
agaaggtgct catgtcctca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-6 forward primer
<400> 3
gttctctggg aaatcgtgga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-6 reverse primer
<400> 4
tgtactccag gtagctatgg 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-10 forward primer
<400> 5
ctggacaaca tactgctaac cgac 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-10 reverse primer
<400> 6
attcattcat ggccttgtag acacc 25
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH forward primer
<400> 7
caaaagggtc atcatctctg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH reverse primer
<400> 8
cctgcttcac caccttcttg 20
Claims (10)
- 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P로부터 유래된 당단백질 L67을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 당단백질 L67은 분자량이 13 내지 50 kDa 인, 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 알레르기 질환은 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 천식, 두드러기, 아나팔락시스, 수혈반응, 용혈성 빈혈, 혈소판 감소증, 페니실린 독성, 혈청병, 혈관염, 사구체신염, 전신성홍반성낭찬, 류마티스성 관절염, 접촉성 피부염, 결핵, 이식거부, 갑상선염, 악성빈혈 및 제1형 당뇨로 이루어진 군으로부터 선택된 질환인, 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 당단백질 L67은 Th1 세포 활성을 촉진 또는 Th2 세포 활성을 억제하는 것인, 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 당단백질 L67은 전사인자 T-bet의 발현을 촉진 또는 GATA-3의 발현을 억제하는 것인, 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 당단백질 L67은 IL-1β, IL-6 또는 IL-10의 발현을 억제하는 것인, 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 당단백질 L67은 ERK, p38 또는 AP-1의 인산화를 억제하는 것인, 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P로부터 유래된 당단백질 L67을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 청구항 8에 있어서, 상기 알레르기 질환은 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 천식 또는 두드러기인, 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 청구항 8에 있어서, 상기 식품은 우유, 치즈, 요거트, 버터, 마가린, 크림, 아이스크림, 유산균 음료, 캐피어, 쿠미스, 발효된 소시지, 곡물, 빵의 산성 반죽(dough), 피클 및 김치로 이루어진 군에서 선택된 것인, 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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|---|---|---|---|---|
| WO2021071292A3 (ko) * | 2019-10-08 | 2021-06-10 | 한국식품연구원 | 락토바실러스 플란타럼 균주 등을 이용한 호흡기 질환 개선용 조성물 |
| WO2024107012A1 (ko) * | 2022-11-17 | 2024-05-23 | 주식회사 지아이바이옴 | 락티플란티바실러스 플란타룸 균주, 그의 유래의 배양액 및 그의 항알러지 용도 |
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| KR20040023755A (ko) * | 2002-09-11 | 2004-03-18 | 젠몬트 바이오테크 인크. | 알레르기 치료에 있어서 일부 락토바실러스 균주들의새로운 용도 |
| US20170005615A1 (en) | 2015-06-30 | 2017-01-05 | Glasspoint Solar, Inc. | Phase change materials for cooling enclosed electronic components, including for solar energy collection, and associated systems and methods |
-
2017
- 2017-05-08 KR KR1020170057233A patent/KR102038380B1/ko active IP Right Grant
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102038380B1 (ko) | 2019-10-30 |
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