JP5150722B2

JP5150722B2 - 抗アレルギー作用を有する新規乳酸菌と、該乳酸菌を含む抗アレルギー剤、食品及び医薬品組成物と、前記抗アレルギー剤の製造方法

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Publication number: JP5150722B2
Application number: JP2010509239A
Authority: JP
Inventors: 崇原; 斗志夫城; 武久熊谷; 真理子斎藤; 公子内山
Original assignee: Kameda Seika Co Ltd
Current assignee: Kameda Seika Co Ltd
Priority date: 2008-04-25
Filing date: 2009-04-24
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2029-04-24
Also published as: US8361481B2; JPWO2009131208A1; US20110038891A1; CN102046777A; ES2407150T3; EP2281871B1; EP2281871A4; EP2281871A1; KR101221647B1; WO2009131208A1; KR20110000670A

Description

本発明は、新規乳酸菌と、該乳酸菌を含む抗アレルギー剤と、該抗アレルギー剤を含む食品及び医薬品組成物とに関し、具体的には、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１０９８として国際寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）Ｋ７１株の乳酸菌と、該乳酸菌を含む抗アレルギー剤と、該抗アレルギー剤を含む食品組成物及び医薬品組成物とに関する。

アレルギー患者数は増加の一途を辿り、例えば日本では国民の３人に１人が何らかのアレルギー疾患に羅患しているとの調査結果が報告されている。食品を用いてアレルギー疾患の患者数を減少させることができれば、国民のＱＯＬ向上のみならず、医療費の大幅な削減につながり、その社会的、経済的意義は大きい。

アトピー性皮膚炎や花粉症等でみられる即時型アレルギー（Ｉ型アレルギー）反応では、ＩｇＥが重要な因子である。ＩｇＥの産生は、インターロイキン４（ＩＬ−４）によりＢ細胞がＩｇＥクラススイッチを受け、誘導される。ＩＬ−４の主な産生源は、Ｔ_Ｈ２細胞である。Ｔ_Ｈ１細胞やＴ_Ｈ２細胞等のヘルパーＴ細胞は、樹状細胞やマクロファージ等の細胞からの抗原提示による刺激を受けつつ、ＩＬ−４やＩＬ−１２などのサイトカインの影響下においてそれぞれへと分化する。Ｔ_Ｈ１細胞の分化はＩＬ−１２により、Ｔ_Ｈ２細胞の分化はＩＬ−４により誘導される。Ｔ_Ｈ１細胞とＴ_Ｈ２細胞のバランスが崩れるなどの要因により、Ｔ_Ｈ２細胞が著しく優位となる状況ではＩＬ−４の影響が強くなり、ＩｇＥの産生が亢進する。産生されたＩｇＥは、マスト細胞及び好塩基球の細胞表面上の高親和性ＩｇＥレセプターに結合する。この状態で、ＩｇＥに抗原（アレルゲン等）が結合すると高親和性ＩｇＥレセプターが架橋され、脱顆粒によるヒスタミン等の化学伝達物質の放出、さらに、ロイコトリエン等の脂質メディエーターの産生へと繋がり、炎症を始めとしたアレルギー症状を惹起される。ＩｇＥの産生が亢進した状態では、アレルギー症状の重篤化がみられる。

アレルギー疾患の治療薬としては、抗ヒスタミン剤に代表される化学伝達物質の拮抗剤や、抗炎症剤として用いられるステロイド剤が主流である。これらはいずれも対症療法的に用いられる薬剤であり、発症の主因子であるＩｇＥの量を直接的に減少させる機能はない。また、前者では眠気や口渇など、後者では免疫系全般を抑制するなどの副作用の恐れがある。Ｔ_Ｈ２細胞が著しく優位になる状況を緩和できる薬剤は、アレルギーの根本的治療を可能にすると目されているが、未だ開発されていない。ＩｇＥの量を減少させることによる治療法として減感作療法がある。減感作療法は、アレルギー疾患の原因物質であるアレルゲンを少量から次第に増量して摂取させる（または注射する）ことによりその症状を緩和する治療法である。この治療法は、アレルゲン投与によるアナフィラキシーの危険性を内包していることから、医師による厳密な管理の下で実施する必要がある。現段階では、減感作療法は完全に確立された治療法とは言い難く、治療に長期間を要することや、個人差がみられること等を含め、信頼性に改善の余地が残されている。

こうした背景の中、食品としての摂取経験が豊富で、かつＩｇＥの産生を抑制する機能を有する乳酸菌が注目されつつある。乳酸菌の抗アレルギー作用は菌株に特異的であり、このような抗アレルギー作用を有する乳酸菌がスクリーニングされ、ヨーグルトや乳酸菌飲料として市場に出回りつつある。

抗アレルギー作用が発現するためには、これら乳酸菌を毎日欠かさずに摂取し続けることが重要であるが、ヨーグルトや乳酸菌飲料では個人の嗜好により受け入れられない場合がある。また、日本人にとっては、飽きが来やすく、毎日欠かさず摂取するための優れた食品の形態であるとは言い難い。これに対し、米は日本人の主食であり、近年の米離れが進んでいるとはいえ、３食のうちの少なくとも１食は必ず摂取されている食品である。

抗アレルギー作用を有する乳酸菌を米に付与するには、別途タンク等で培養生産した乳酸菌体と精白米とを混合すればよいが、米粒と乳酸菌体粉体の比重や粒子径が異なることから、保存中にこれらが分離して、乳酸菌のみが米袋等の保存容器の底に沈んでしまうおそれがある。このため、一定量の米を計量したとしても、その米中に所望量の乳酸菌体が含まれているとは限らない。したがって、抗アレルギー作用を発揮させるために必要な量の乳酸菌を常に摂取することが困難である。また、精白米の表面に乳酸菌体をコーティングすることも技術としては可能であるが、煩雑な操作を必要とし、コスト高になることは否めない。

そこで、米、特に精白米を用いて生育させることができ、米表面に付着した状態で米とともに回収し、調理・摂食することができる、抗アレルギー作用を有する乳酸菌を開発し、該乳酸菌を含む米を材料とする食品組成物及び医薬品組成物を開発する必要がある。

本発明は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１０９８として国際寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ、以下では属名のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを「Ｌ．」と省略する場合がある。）Ｋ７１株の乳酸菌を提供する。

本発明は、本発明の乳酸菌を含む抗アレルギー剤を提供する。

本発明の抗アレルギー剤において、前記乳酸菌は生菌の場合がある。

本発明の抗アレルギー剤において、前記乳酸菌は死菌の場合がある。

本発明の抗アレルギー剤は、本発明の乳酸菌の菌体成分を含む場合がある。

本発明は、本発明の抗アレルギー剤を含む食品組成物を提供する。

本発明は、本発明の抗アレルギー剤を含む医薬品組成物を提供する。

本発明は、本発明の乳酸菌を用いて発酵させた米か、該米の粉砕物か、前記米又は米の粉砕物を炊飯調理して得られる飯かを含む食品組成物を提供する。

本発明は、本発明の乳酸菌を培地に接種して培養するステップを含む抗アレルギー剤の製造方法を提供する。

本発明の抗アレルギー剤の製造方法において、前記培地は米又は米の粉砕物の場合がある。

本発明において、抗アレルギー剤とは、アレルギー反応を抑制又は阻害する作用のある物質を成分として含む薬剤の場合がある。抗アレルギー剤の作用点は、Ｔ_Ｈ２細胞の分化過程と、前記Ｔ_Ｈ２細胞が抗原提示を受ける過程と、前記Ｔ_Ｈ２細胞が活性化及び増殖する過程と、前記Ｔ_Ｈ２細胞との相互作用によってＢ細胞がＩｇＥクラススイッチを受けてＩｇＥ産生細胞に成熟する過程と、すべてのヘルパーＴ細胞サブセット（Ｔ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２、Ｔ_Ｈ３（抑制性Ｔ細胞）、Ｔ_Ｈ１７、Ｔ_ｒｅｇ（制御性Ｔ細胞）等）並びに細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ナチュラル・キラー細胞が分化・増殖及び活性化する過程と、前記ヘルパーＴ細胞サブセット（Ｔ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２、Ｔ_Ｈ３（抑制性Ｔ細胞）、Ｔ_Ｈ１７、Ｔ_ｒｅｇ（制御性Ｔ細胞）等）並びに細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ナチュラル・キラー細胞の働きを介したＩｇＥ産生を含む免疫機能制御の過程と、アレルゲンの存在によりＩｇＥ産生が亢進する過程と、マスト細胞や好塩基球、好酸球などのエフェクター細胞が分化・成熟・活性化する過程と、前記エフェクター細胞中でヒスタミン等の化学伝達物質が合成されて顆粒に蓄積される過程並びにロイコトリエン等のメディエーターが新たに合成される過程と、前記エフェクター細胞の高親和性ＩｇＥレセプターとＩｇＥとアレルゲンとが結合した複合体が形成される過程と、前記複合体の形成によるシグナルが脱顆粒を起こす過程と、脱顆粒によって放出されたヒスタミンやロイコトリエン等の化学伝達物質が、皮膚、呼吸器、消化器、眼、鼻その他の全身のさまざまな臓器において局所的アナフィラキシーを引き起こす過程とを含むが、これらに限定されない。

本発明の抗アレルギー剤は、前記の過程の少なくとも１つを抑制及び／又は阻害する作用を有する。前記抗アレルギー剤の作用点のうち、Ｔ_Ｈ２細胞の分化・成熟過程はＩＬ−４により促進されるが、ＩＬ−１２はＴ_Ｈ１細胞の分化・成熟を促すことにより、Ｔ_Ｈ２細胞の分化・成熟を抑制する。したがって、ＩＬ−４の産生を抑制し、ＩＬ−１２の産生を促進することによって、Ｔ_Ｈ２細胞が分化・成熟する過程を抑制することができる。かかる機序による抗アレルギー剤は、アレルギー疾患に対して原因療法的に用いることのできる治療剤となる。また、抗ヒスタミン剤やステロイド剤のような副作用の危険がないので、好ましい。

本発明の乳酸菌は、抗アレルギー作用を有し、かつ精白米表面での生育が良好な乳酸菌として以下の実施例に示す試験によってスクリーニングされた。本発明の乳酸菌の液体培養は、この細菌が生育可能な条件であればどのような条件でもよく、乳酸菌の培養に用いられる通常の培地（例えばＭＲＳ培地や野菜果汁等）を用いて通常の培養条件で培養することができる。培地のｐＨは４．０ないし７．０、好ましくは６．０ないし６．５で培養を開始し、培養温度は３５℃ないし４２℃、好ましくは３７℃ないし４０℃で行うとよい。また静置培養で充分生育が可能であるが、培地成分と菌体とを均一に分散させるために緩やかに撹拌することが好ましい。乳酸菌の生育に伴い乳酸が培地中に蓄積し、培地のｐＨが徐々に低下する。培養中のｐＨをコントロールしなくとも乳酸菌はある程度回収することが可能であるが、炭酸カルシウムを培地中に添加することにより、またはｐＨ自動コントロールにより培地のｐＨを制御することが好ましい。培地のｐＨは４．０ないし７．０に、好ましくは６．０ないし６．５に制御することで高密度の乳酸菌を得ることができる。

以下の実施例に示すとおり、本発明の乳酸菌を加熱殺菌した菌体に抗アレルギー作用が認められる。したがって、本発明の抗アレルギー剤に含まれる乳酸菌は、生菌、すなわち、増殖及び／又は代謝を行っている状態の菌であっても、死菌、すなわち、増殖も代謝も行っていない状態の菌であってもかまわない。また、本発明の抗アレルギー剤は、本発明の乳酸菌の菌体成分であって、抗アレルギー作用を有する成分を含む場合がある。

本発明の食品組成物は、本発明のアレルギー剤に加えて、調味料、着色料、保存料その他の食品として許容される成分を含む場合がある。本発明の食品組成物は、本発明の抗アレルギー剤の効果を損なわないことを条件として、本発明の乳酸菌を用いて発酵により製造される場合がある。また、本発明の乳酸菌及び／又は本発明の乳酸菌による発酵品を炊飯その他の加熱、加圧等を施して製造される場合がある。液体培養により生育した本発明の乳酸菌はそのままでも、乾燥させても、抗アレルギー作用を有する食品素材として利用することが可能であるが、精白米を発酵させる際のスターターとしても利用することが可能である。

本発明の乳酸菌を用いて精白米を発酵させる場合には、洗米の終了した精白米を水に浸漬し、そこに本発明の乳酸菌を含むスターターを添加して発酵させるだけでよい。本発明の乳酸菌は米の表面の栄養を利用して旺盛に生育し、かつ米の表面に付着するため、発酵が終了した米を笊等に受け、その後水洗処理を行っても殆どの乳酸菌体は米表面に付着したままで存在する。適正な条件で発酵が終了した精白米の表面には、原料米１ｇ当たり１０^８個ないし１０^９個の乳酸菌が付着している。この米を乾燥させることにより原料米として加工することも可能であり、また乾燥させることなく、そのまま水を加えて炊飯することで抗アレルギー乳酸菌を含む炊飯米を得ることができる。

本発明の医薬品組成物は、本発明のアレルギー剤に加えて、製剤学的に必要な物質及び／又は医薬品として許容される物質を含む場合がある。

本発明によれば、抗アレルギー作用を有する本発明の乳酸菌を、精白米を原料として発酵させることにより、表面に抗アレルギー乳酸菌が均一に分布した精白米が容易にかつ安価に得られ、これを炊飯して毎日継続して摂取することが可能な抗アレルギー作用を示す主食が提供される。

乳酸菌の反復経口投与がＯＶＡ感作マウスの血清総ＩｇＥ量に及ぼす効果を示すグラフ。乳酸菌の反復経口投与がＯＶＡ感作マウスのオバルブミン特異的ＩｇＥレベルに及ぼす効果を示すグラフ。乳酸菌の反復経口投与がＯＶＡ感作マウス脾細胞におけるＩＬ−４産生量に及ぼす効果を示すグラフ。乳酸菌の反復経口投与がＯＶＡ感作マウス脾細胞における総ＩｇＥ産生量に及ぼす効果を示すグラフ。乳酸菌の反復経口投与がアトピー性皮膚炎モデル動物の血清総ＩｇＥ量に及ぼす効果を示すグラフ。乳酸菌の反復経口投与がアトピー性皮膚炎モデル動物の耳介アレルギー症状に及ぼす効果を示すグラフ。

以下に本発明の実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。

１．抗アレルギー作用を有し、かつ精白米表面での生育が良好な乳酸菌のスクリーニング
（１）スクリーニングに用いた乳酸菌の出所
スクリーニングに用いた乳酸菌は、米を原料とした発酵食品（米糠床、米麹味噌、酒粕、醪等）から新たに分離された。予備試験においてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に帰属する種であることを確認できた３９種類の乳酸菌の菌株名を表１に列挙した。

（２）乳酸菌の抗アレルギー作用のｉｎｖｉｔｒｏ評価
オバルブミン（ＯＶＡ）感作マウスより摘出した脾細胞を用いてｉｎｖｉｔｒｏでの抗アレルギー試験を行った。６週齢で購入した雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、チャールス・リバー）３匹をＳＰＦ環境下で飼育し、１週間に一度の頻度で１ｍｇ／ｍＬのＡｌ（ＯＨ）_３と２ｍｇ／ｍＬのＯＶＡとを含む懸濁液を１匹当たり０．５ｍＬずつ腹腔内注射した。適宜尾静脈より採血し、血清総ＩｇＥ量及びＯＶＡ特異的ＩｇＥレベルを確認した。なお、血清総ＩｇＥ及びＯＶＡ特異的ＩｇＥの測定はそれぞれベクトン・ディッキンソン社製のＭｕｒｉｎｅＯｐｔＥＩＡＥＬＩＳＡセットを用い、サンドイッチＥＬＩＳＡ法にて行った。即ち、総ＩｇＥを測定する場合にはラットモノクローナル抗マウスＩｇＥを１次抗体としてコートしたプレートを用い、これに適宜希釈した血清を添加した後、２次抗体としてビオチン化ラットモノクローナル抗マウスＩｇＥ重鎖抗体を用いた。ＯＶＡ特異的ＩｇＥを測定する場合には、１次抗体の代わりにＯＶＡをコートしたプレートを用いて同様の操作によりＥＬＩＳＡを行った。血清総ＩｇＥ量及びＯＶＡ特異的ＩｇＥレベルが最も高い個体１匹を選出し、飼育開始２８日後に脾臓を摘出した。摘出した脾臓をメスで細かく砕き、赤血球溶解バッファー（１５４ｍＭの塩化アンモニウム、１４ｍＭの炭酸水素ナトリウム、０．１１ｍＭのＥＤＴＡ−２Ｎａ、ｐＨ７．３）を添加して赤血球を取り除き、１０％ウシ胎児血清（Ｄｉｆｃｏ社製）、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＲＰＭ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）により２×１０^６細胞／ｍＬとなるように希釈後、９６穴マイクロタイタープレートに１００μＬずつ分注した。次に８０μＬのＯＶＡ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）と２０μＬの加熱殺菌した乳酸菌懸濁液（１ｍｇ／ｍＬ）を加えた。二酸化炭素５％、３７℃の環境下で７日間培養した後、培養液を遠心分離することにより脾細胞及び乳酸菌を除去した。培養上清に含まれるＩＬ−４及びＩＬ−１２の濃度を、ベクトン・ディッキンソン社製のＭｏｕｓｅＯｐｔＥＩＡＥＬＩＳＡセットマウスＩＬ−４（カタログ番号５５５２３２）及びマウスＩＬ−１２（ｐ７０、カタログ番号５５５２５６）をそれぞれ用いて測定した。

（３）精白米表面における乳酸菌の生育試験
精白米５０ｇを洗米し、これに１００ｍＬの蒸留水を添加して浸漬した。この浸漬液に、ＭＲＳ培地を用いて３７℃で１夜培養した乳酸菌培養液（約１０^９個／ｍＬ）を１ｍＬ添加して混合した後、３８℃で１日保温した。浸漬水を捨て、約１００ｍＬの蒸留水による洗浄を３回行った後、発酵米を粉砕して、米表面に付着した乳酸菌を遊離・懸濁させた。発酵米の粉砕は、発酵米１０ｇと９０ｍＬの滅菌生理食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）を専用フィルター付き無菌バッグに入れてストマッカー（オレガノ、ストマッカー４００Ｔ）に装着し、２３０ｒｐｍで１２０秒間運転して、粉砕した。粉砕された発酵米は、適宜希釈してＬＢＳ寒天培地（ＢＢＬ社製）に塗布して培養し、生じたコロニー数から精白米表面に付着した乳酸菌数を求めた。

（４）結果
抗アレルギー活性及び精白米を用いた生育・付着試験の結果を表１に示す。

表１に示すとおり、米を原料とした発酵食品から分離した乳酸菌３９株のうち、１５株において、ＩＬ−４濃度が顕著に低下し、かつＩＬ−１２濃度が顕著に上昇していた。ＩＬ−４はＴ_Ｈ２細胞の分化・成熟を促進する。一方、ＩＬ−１２はＴ_Ｈ１細胞の分化・成熟を促進することにより、Ｔ_Ｈ２細胞の分化・成熟を抑制する。Ｔ_Ｈ１細胞とＴ_Ｈ２細胞のバランスが崩れ、Ｔ_Ｈ２細胞が著しく優位となる状況では、高濃度のＩＬ−４存在環境となり、ＩｇＥの産生が亢進し、アレルギー状態へと導くことになる。したがって、ＩＬ−４の産生を抑制し、ＩＬ−１２の産生を促進する乳酸菌はＴ_Ｈ２細胞が優位な状況を緩和する、つまり、抗アレルギー作用を有するといえる。抗アレルギー作用が高い乳酸菌１５株のうち、ラクトバチルス・パラカゼイＫ７１株は、精白米による生育が良好で、かつ、精白米に強く付着し回収が容易である。そこで、ラクトバチルス・パラカゼイＫ７１株を本発明の目的に最も適する株として選別した。以下ではラクトバチルス・パラカゼイＫ７１株を本発明の乳酸菌という。本発明の乳酸菌は酒粕から分離され、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１０９８として国際寄託されている。

２．本発明の乳酸菌の特徴付け
（１）１６ＳｒＲＮＡ配列の解析
当業者に周知な方法に従い、本発明の乳酸菌ラクトバチルス・パラカゼイＫ７１株の菌体ＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅した微生物１６ＳリボソームＲＮＡ（以下、「ｒＲＮＡ」という。）遺伝子領域のポリヌクレオチド断片の配列を配列番号１に示す。微生物１６ＳｒＲＮＡは、４８９，８４０種類以上にわたり、アライメントを取ったうえでその全長配列または部分配列がデータベース化されており（リリース９．５９、２００８年３月５日現在）、ＲｉｂｏｓｏｍａｌＤａｔａｂａｓｅＰｒｏｊｅｃｔＩＩ（ＲＤＰＩＩ、ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／）を通じて利用可能となっている（Ｍａｉｄａｋ、Ｂ．Ｌ．ら、２００１年、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２９巻、１７３−１７４ページ）。そこで、配列番号１の配列について前記データベースを検索した結果、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉの亜種である、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉのＪＣＭ８１３０株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列に対する相同性は１００％で、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉｓｕｂｓｐ．ｔｏｌｅｒａｎｓのＮＢＲＣ１５９０６株に対する相同性は９９．９％であった。なお、相同性検索では、配列番号１のヌクレオチド配列はＬ．ｃａｓｅｉのＡＴＣＣ３３４株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列にも高い相同性を示すが、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉの各菌株と同種であるとのＤｅｌｌａｇｌｉｏ、Ｆ．らによる論文（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５２：２８５−２８７（２００２））がある。そこで、Ｌ．ｃａｓｅｉのＡＴＣＣ３３４株もＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉに帰属する可能性が高いと推察されるので、Ｌ．ｃａｓｅｉのＡＴＣＣ３３４株が相同性検索でヒットするからといって本発明の乳酸菌がＬ．ｃａｓｅｉに帰属するとはいえない。Ｌ．ｃａｓｅｉのＡＴＣＣ３３４株以外で相同性検索において上位にヒットした微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列とクラスター解析を行ったところ、配列番号１のヌクレオチド配列はＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉの２つの亜種が形成するクラスターに属し、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列と同一配列であった。したがって、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列の解析結果によると本発明の乳酸菌は種レベルではＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉに帰属する可能性が高い。

（２）生理・生化学性状試験
本発明の乳酸菌ラクトバチルス・パラカゼイＫ７１株の生理・生化学性状についての各種試験の結果は以下の表２、３及び４に示すとおりである。

表２に示す細菌第１段階試験の結果、本発明の乳酸菌は運動性を有さないグラム陽性桿菌で、グルコースを発酵し、カタラーゼ反応及びオキシダーゼ反応はともに陰性を示した。これらの性状は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列解析において帰属が示唆されたＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉのような乳酸桿菌の一般性状と一致する。表３に示す細菌第２段階試験の結果、本発明の乳酸菌は、リボース、アドニトール、ガラクトース、フラクトース及びズルシトール等を発酵し、グリセロール、Ｄ−アラビノース、ラムノース及びイノシトール等を発酵しなかった。また、表４に示す生育試験の結果、本発明の乳酸菌は１０℃で生育した。これらの性状は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列解析において帰属が示唆されたＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉの典型性状（Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｍ．Ｄ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３９：１０５−１０８（１９８９））と一致すると考えられる。そこで、生理・生化学性状試験の結果によると、本発明の乳酸菌は亜種レベルではＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉに帰属する可能性が高い。

３．本発明の乳酸菌の抗アレルギー作用のｉｎｖｉｖｏ評価
（１）アレルゲン感作マウスへの効果
本発明の乳酸菌ラクトバチルス・パラカゼイＫ７１株を、アレルゲン感作マウスに反復経口投与した場合のＩｇＥ及びアレルギーに影響するサイトカイン（ＩＬ−４等）の産生量の変化を以下の手法により調べた。

６週齢の雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）１８匹をチャールス・リバー社より購入し、コンベンショナル環境下で飼育した。４日間の予備飼育後、６匹ずつの３群に分け、その内の１群には本発明の乳酸菌ラクトバチルス・パラカゼイＫ７１株の菌体懸濁液（２０ｍｇ／ｍＬ）を毎日５０μＬずつ経口で反復投与した（乳酸菌投与群）。投与開始１週間後より週に１度の頻度で尾静脈からの採血を行い、その後、実施例１と同様の手法でＡｌ（ＯＨ）_３とＯＶＡの懸濁液を腹腔内注射した。試験開始４２日目に、採血終了後に実施例１と同様の手法で脾臓を摘出し、脾細胞を採取した。乳酸菌懸濁液の代わりに蒸留水を反復経口投与し、Ａｌ（ＯＨ）_３とＯＶＡの懸濁液を毎週腹腔内注射した動物群を感作群、蒸留水を経口投与し、Ａｌ（ＯＨ）_３とＯＶＡの懸濁液の腹腔内注射を行わなかった動物群を非感作群として、乳酸菌投与群と同様に採血と脾臓摘出を実施した。

採血した血液サンプルは、実施例１と同様の操作により、血清総ＩｇＥ量及びＯＶＡ特異的ＩｇＥレベルの分析に供した。また、１００μｇ／ｍＬのＯＶＡを添加して脾細胞を培養し、７日後に培養上清中のＩＬ−４及びＩＬ−１２の産生量を、１４日後に総ＩｇＥ産生量を分析した。乳酸菌の反復経口投与がＯＶＡ感作マウスの血清総ＩｇＥ量の上昇に及ぼす効果を図１に、オバルブミン特異的ＩｇＥレベルに及ぼす効果を図２にそれぞれ示した。また、乳酸菌の反復経口投与がＯＶＡ感作マウス脾細胞の培養上清におけるＩＬ−４産生量に及ぼす効果を図３に、乳酸菌の反復経口投与がＯＶＡ感作マウス脾細胞の培養上清における総ＩｇＥ産生量に及ぼす効果を図４に示した。図１ないし４において、記号「ａ」及び「ｂ」は、２つの実験条件の群の間で統計的有意差（Ｐ＜０．０５）があることを表し、記号「ｃ」は、「ａ」及び「ｂ」の実験条件の群のいずれに対しても「ｃ」の実験条件の群は統計的有意差（Ｐ＜０．０５）があることを表す。図１ないし４に示されるとおり、アレルゲン感作により血清ＩｇＥ量（図１）、オバルブミン特異的ＩｇＥレベル（図２）とも有意に上昇したが、乳酸菌の反復投与はこれらの上昇を有意に抑制した。同様に、乳酸菌の反復経口投与は、脾細胞におけるＩＬ−４産生量（図３）、総ＩｇＥ産生量（図４）ともに有意に低下した。なお、各実験条件の群の間の統計的有意差はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ社製表計算ソフトＥＸＣＥＬのアドインソフトウェアであるＳｔａｔｃｅｌを利用し、一元配置の分散分析で有意差があった場合にＦｉｓｈｅｒ’ｓＰＬＳＤで検定した。

（２）アトピー性皮膚炎モデル動物への効果
アトピー性皮膚炎モデル動物であるＮＣマウスを用いて、本発明の乳酸菌ラクトバチルス・パラカゼイＫ７１株の反復経口投与がアトピー性皮膚炎の進行に及ぼす影響を調べた。５週齢で購入したＮＣ雄マウス（ＮＣ／Ｎｇａ、チャールス・リバー）１２匹を、ＣＥ−２飼料（日本クレア）にて３日間予備飼育し、その後６匹ずつの２群に分けした。一方の群にはラクトバチルス・パラカゼイＫ７１の乾燥菌体０．０５％を含むＣＥ−２飼料（乳酸菌投与群）を、他方の群には通常のＣＥ−２飼料（対照群）を与え、引き続き３週間飼育した。

アレルギー感作には塩化ピクリル（２，４，６−トリニトロクロロベンゼン、再結晶化後に使用）を用いた。初回の感作は５％塩化ピクリル溶液（エタノール：アセトン＝４：１に溶解）を腹部と四肢の肉球に塗布し、その４日後より週１回の頻度で計８回、１％塩化ピクリル溶液（食用オリーブ油に溶解）の耳への塗布を繰り返した。適宜採血し、血清総ＩｇＥ量の分析を実施例１に記載した方法で行った。また、飼育期間を通じ、両耳の臨床スコア評価（表５の評価基準に従って６人の評価者が実施し、左右の耳のスコアの合計値で表示）を実施した。

乳酸菌投与群における乳酸菌の平均投与量は摂餌量から換算して２３ｍｇ／匹／日と計算された。乳酸菌の反復経口投与がアトピー性皮膚炎モデル動物の血清総ＩｇＥ量に及ぼす効果を図５に、乳酸菌の反復経口投与がアトピー性皮膚炎モデル動物の耳介アレルギー症状に及ぼす効果を図６にそれぞれ示す。図５及び６において、＊印はＰ＜０．０５を示し、＊＊印はＰ＜０．０１を示す。乳酸菌投与群では血清総ＩｇＥ量（図５）、臨床スコア（図６）とも対照群に比べて有意に低下しており、乳酸菌の投与によりアトピー性皮膚炎が明らかに軽減することが確認された。Ｓｔｕｄｅｎｔｔ−検定を行った結果、乳酸菌投与群では血清総ＩｇＥ量及び臨床スコアの両方とも対照群に比べて有意に低下しており、本発明の乳酸菌の投与によってアトピー性皮膚炎が明らかに軽減することが確認された。

３．炊飯米の官能評価
精白米（新潟県産コシヒカリ）３合を洗米し、９００ｍＬの蒸留水に浸漬した。これにＭＲＳ培地中３７℃で一夜培養した培養液９ｍＬを加えて緩やかに混合し、３８℃で１日保温した。その後浸漬水を捨て、約５００ｍＬの蒸留水で３回洗浄した後に適量の蒸留水を加えて電気炊飯器に仕込んだ。炊飯前の米を少量採取し、実施例１と同様の操作で乳酸菌数を測定した結果、米（乾燥重量換算）１ｇ当たり４．３×１０^８個の乳酸菌が検出された。通常の条件で炊飯を行い、炊飯米の官能評価を行ったところ、通常の炊飯米と遜色の無いおいしいごはんであった。

Claims

独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１０９８として国際寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）Ｋ７１株の乳酸菌。
請求項１に記載の乳酸菌を含むことを特徴とする抗アレルギー剤。
前記乳酸菌は生菌であることを特徴とする、請求項２に記載の抗アレルギー剤。
前記乳酸菌は死菌であることを特徴とする、請求項２に記載の抗アレルギー剤。
請求項１に記載の乳酸菌の菌体成分を含むことを特徴とする抗アレルギー剤。
請求項２ないし５のいずれかに記載の抗アレルギー剤を含むことを特徴とする食品組成物。
請求項２ないし５のいずれかに記載の抗アレルギー剤を含むことを特徴とする医薬品組成物。
請求項１に記載の乳酸菌を用いて発酵させた米か、該米の粉砕物か、前記米又は米の粉砕物を炊飯調理して得られる飯かを含むことを特徴とする食品組成物。
請求項１に記載の乳酸菌を培地に接種して培養するステップを含むことを特徴とする、抗アレルギー剤の製造方法。
前記培地は米又は米の粉砕物であることを特徴とする、請求項９に記載の抗アレルギー剤の製造方法。