KR20110000670A - 항알레르기 작용을 가지는 신규 유산균과, 이 유산균을 포함하는 항알레르기제, 식품 및 의약품 조성물과, 상기 항알레르기제의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 과제는 쌀, 특히 정백미를 이용하여 생육시킬 수 있고, 쌀 표면에 부착된 상태로 쌀과 함께 회수하며, 조리·섭식이 가능한 항알레르기 작용을 가지는 유산균을 개발하고, 상기 유산균을 포함하는 쌀을 재료로 하는 식품 조성물 및 의약품 조성물을 개발하는 것이다. 본 발명은 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터에 수탁번호 FERM BP-11098로 국제기탁된 락토바실러스 파라카세이 K71주의 유산균과, 상기 유산균을 포함하는 항알레르기제와, 상기 항알레르기제를 포함하는 식품 조성물과, 상기 유산균을 이용하여 발효시킨 쌀, 상기 쌀의 분쇄물, 상기 쌀 또는 쌀의 분쇄물로 지은 밥 중 어느 하나를 포함하는 식품 조성물과, 본 발명의 항알레르기제를 포함하는 의약품 조성물을 제공한다.

Description

항알레르기 작용을 가지는 신규 유산균과, 이 유산균을 포함하는 항알레르기제, 식품 및 의약품 조성물과, 상기 항알레르기제의 제조 방법{NOVEL LACTIC ACID BACTERIUM HAVING ANTI-ALLERGIC ACTIVITY, ANTI-ALLERGIC AGENT, FOOD AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION EACH COMPRISING THE LACTIC ACID BACTERIUM, AND PROCESS FOR PRODUCTION OF THE ANTI-ALLERGIC AGENT}

본 발명은 신규 유산균과, 상기 유산균을 포함하는 항알레르기제와, 상기 항알레르기제를 포함하는 식품 및 의약품 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터에 수탁 번호 FERM BP-11098로 국제 기탁된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) K71주(株) 유산균과, 상기 유산균을 포함하는 항알레르기제와, 상기 항알레르기제를 포함하는 식품 조성물 및 의약품 조성물에 관한 것이다．

알레르기 환자수는 증가의 일로를 걷고 있으며, 예컨대 일본에서는 국민의 3명중 1명은 어떤 알레르기질환에는 걸려 있다는 조사 결과가 보고되고 있다. 식품을 이용하여 알레르기질환의 환자수를 감소시킬 수 있다면, 국민의 QOL 향상뿐만 아니라 의료비의 대폭적인 삭감으로 연결되어 그 사회적, 경제적 의의는 크다.

아토피성 피부염이나 화분증(꽃가루 알레르기) 등에서 보여지는 즉시형 알레르기(I형 알레르기)반응에서는 IgE가 중요한 인자다. IgE의 생성은 인터류킨4(IL-4)에 의해 B세포가 IgE 클라스 스위치를 받아 유도된다. IL-4의 주요 생성원은 T_H2세포이다. T_H1세포나 T_H2세포 등의 헬퍼 T세포는 수상(樹狀)세포나 대식세포(macrophage) 등의 세포로부터의 항원제시에 의한 자극을 받으면서, IL-4나 IL-12 등의 사이트카인의 영향하에서 각각으로 분화된다. T_H1세포의 분화는 IL-12에 의해, T_H2세포의 분화는 IL-4에 의해 유도된다. T_H1세포와 T_H2세포의 밸런스가 무너지는 등의 요인에 의해 T_H2세포가 현저하게 우위가 되는 상황에서는 IL-4의 영향이 강해지고 IgE의 생성이 항진된다. 생성된 IgE는 비만세포 및 호염기구의 세포 표면상의 고친화성 IgE 리셉터에 결합된다. 이 상태에서 IgE에 항원(알레르겐 등)이 결합하면 고친화성 IgE 리셉터가 가교되고, 탈(脫)과립에 의한 히스타민 등의 화학전달 물질의 방출, 더욱이 류코트리엔 등의 지질 매개체의 생성으로 연결되어 염증을 비롯한 알레르기 증상을 야기시킨다. IgE의 생성이 항진된 상태에서는 알레르기 증상의 중독화가 보여진다.

알레르기 질환의 치료약으로서는 항히스타민제로 대표되는 화학전달 물질의 길항제나, 항염증제로 이용되는 스테로이드제가 주류를 이룬다. 이들은 모두 대증요법적으로 이용되는 약제로, 발증의 주요 인자인 IgE의 양을 직접적으로 감소시키는 기능은 없다. 또한, 전자는 졸음이나 구갈 등, 후자는 면역계 전반을 억제하는 등의 부작용의 우려가 있다. T_H2세포가 현저하게 우위가 되는 상황을 완화시킬 수 있는 약제는 알레르기의 근본적 치료를 가능하게 한다고 보여지나 아직 개발되지 않았다. IgE의 양을 감소시키는 치료법으로서 감감작요법(減感作療法)이 있다. 감감작요법은 알레르기 질환의 원인 물질인 알레르겐을 소량에서부터 점차 증량하여 섭취시킴(또는 주사함)으로써 그 증상을 완화시키는 치료법이다. 이 치료법은, 알레르겐 투여에 의한 아나필락시스의 위험성을 내포하고 있기 때문에 의사에 의한 엄밀한 관리 하에서 실시할 필요가 있다. 현 단계에서 감감작요법은 완전하게 확립된 치료법이라고는 말하기 어렵고, 치료에 장기간이 소요된다는 점이나, 개인차가 있다는 점 등을 포함해 신뢰성에 개선의 여지가 남아 있다.

이러한 배경에서 식품으로써의 섭취 경험이 풍부하고 또한 IgE의 생성을 억제하는 기능을 가지는 유산균이 주목되고 있다. 유산균의 항알레르기 작용은 균주에 특이적이며, 이러한 항알레르기 작용을 가지는 유산균이 스크리닝 되어 요구르트나 유산균음료로서 시장에 나돌고 있다.

항알레르기 작용이 발현되기 위해서는 이들 유산균을 매일 빠짐없이 계속 섭취하는 것이 중요한데, 요구르트나 유산균음료는 개인의 기호에 따라 받아들여지지 않을 수 있다. 또한, 일본인에게는 싫증이 나기 쉽고, 매일 빠짐없이 섭취하기에 우수한 식품의 형태라고는 말하기 어렵다. 이에 대하여 쌀은 일본인의 주식이며, 최근 쌀을 안 먹는 경향이 많아진다고 해도 3끼 중 적어도 1끼는 반드시 섭취되고 있는 식품이다.

항알레르기 작용을 가지는 유산균을 쌀에 부여하기 위해서는, 별도 탱크 등에서 배양 생산한 유산균체와 정백쌀을 혼합하면 되나, 쌀알과 유산균체 분체의 비중이나 입자지름이 다르기 때문에 보존 중에 이들이 분리되어 유산균만이 쌀자루 등의 보존 용기의 밑바닥에 가라앉아버릴 우려가 있다. 이 때문에 일정량의 쌀을 계량했더라도, 그 쌀 중에 원하는 양의 유산균체가 포함되어 있다고는 할 수 없다. 따라서, 항알레르기 작용을 발휘시키기 위해서 필요한 양의 유산균을 항상 섭취하기는 어렵다. 또한, 정백미의 표면에 유산균체를 코팅하는 것도 가능한 기술이기는 하나, 번잡한 조작을 필요로 하고 비용이 높아진다는 것은 부정할 수 없다.

그러므로 쌀, 특히 정백미를 이용하여 생육시킬 수 있고, 쌀 표면에 부착된 상태로 쌀과 함께 회수하며, 조리·섭식이 가능한 항알레르기 작용을 가지는 유산균을 개발하고, 상기 유산균을 포함하는 쌀을 재료로 하는 식품 조성물 및 의약품 조성물을 개발할 필요가 있다.

본 발명은, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 수탁 번호 FERM BP-11098로 국제기탁된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei, 이하 속명의 Lactobacillus를 「L.」이라고 생략하기도 한다.) K71주의 유산균을 제공한다.

본 발명은, 본 발명의 유산균을 포함하는 항알레르기제를 제공한다.

본 발명의 항알레르기제에서 상기 유산균은 살아있는 균일 수 있다.

본 발명의 항알레르기제에서 상기 유산균은 죽은 균일 수 있다.

본 발명의 항알레르기제는 본 발명의 유산균의 균체 성분을 포함할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 항알레르기제를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 항알레르기제를 포함하는 의약품 조성물을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 유산균을 이용하여 발효시킨 쌀, 상기 쌀의 분쇄물, 상기 쌀 또는 쌀의 분쇄물로 지은 밥의 어느 하나를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 유산균을 배지(培地)에 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 항알레르기제의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 항알레르기제의 제조 방법에서 상기 배지는 쌀 또는 쌀의 분쇄물일 수 있다.

본 발명에서 항알레르기제란, 알레르기 반응을 억제 또는 저해하는 작용이 있는 물질을 성분으로 포함하는 약제일 수 있다. 항알레르기제의 작용점은, T_H2세포의 분화 과정과, 상기 T_H2세포가 항원제시를 받는 과정과, 상기 T_H2세포가 활성화 및 증식하는 과정과, 상기 T_H2세포와의 상호작용에 의해 B세포가 IgE 클라스 스위치를 받아서 IgE 생성 세포로 성숙하는 과정과, 모든 헬퍼 T세포 서브셋(T_H1, T_H2, T_H3(억제성 T세포), T_H17, T_reg(제어성 T세포) 등) 및 세포 상해성 T세포, NKT세포, 내츄럴 킬러 세포가 분화·증식 및 활성화되는 과정과, 상기 헬퍼 T세포 서브셋(T_H1, T_H2, T_H3(억제성 T세포), T_H17, T_reg(제어성 T세포) 등) 및 세포 상해성 T세포 , NKT세포, 내츄럴 킬러 세포의 활동을 통한 IgE 생성을 포함하는 면역기능 제어 과정과, 알레르겐의 존재로 IgE 생성이 항진되는 과정과, 비만세포나 호염기구, 호산구 등의 이펙터 세포가 분화·성숙·활성화되는 과정과, 상기 이펙터 세포 중에서 히스타민 등의 화학전달 물질이 합성되어서 과립에 축적되는 과정 및 류코트리엔 등의 매개체가 새롭게 합성되는 과정과, 상기 이펙터 세포의 고친화성 IgE 리셉터와 IgE와 알레르겐이 결합된 복합체가 형성되는 과정과, 상기 복합체 형성에 의한 시그널이 탈(脫)과립을 일으키는 과정과, 탈(脫)과립에 의해 방출된 히스타민이나 류코트리엔 등의 화학전달물질이 피부, 호흡기, 소화기, 눈, 코 기타의 전신의 여러 장기에서 국소적 아나필락시스를 야기하는 과정을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 항알레르기제는 상기 과정의 적어도 1개를 억제 및/또는 저해하는 작용을 가진다. 상기 항알레르기제의 작용점 중 T_H2세포의 분화·성숙 과정은 IL-4에 의해 촉진되는데, IL-12는 T_H1세포의 분화·성숙을 촉진함으로써, T_H2세포의 분화·성숙을 억제한다. 따라서, IL-4의 생성을 억제하고 IL-12의 생성을 촉진 함으로써 T_H2세포가 분화·성숙하는 과정을 억제할 수 있다. 이러한 메카니즘에 의한 항알레르기제는 알레르기 질환에 대하여 원인 요법적으로 이용할 수 있는 치료제가 된다. 또한 항히스타민제나 스테로이드제와 같은 부작용의 위험이 없으므로 바람직하다.

본 발명의 유산균은 항알레르기 작용을 가지고, 또한 정백미 표면에서의 생육이 양호한 유산균으로서 이하의 실시예에 나타낸 시험에 의해 스크리닝 되었다. 본 발명의 유산균의 액체배양은 상기 세균이 생육 가능한 조건이면 어떠한 조건에서도 가능하며, 유산균 배양에 이용되는 통상의 배지(예를 들면 MRS 배지나 야채과즙 등) 를 이용하여 통상의 배양조건으로 배양할 수 있다. 배지의 pH는 4.0 내지 7.0, 바람직하게는 6.0 내지 6.5에서 배양을 시작하고, 배양 온도는 35℃ 내지 42℃, 바람직하게는 37℃ 내지 40℃에서 실시할 수 있다. 또한, 정치배양(靜置培養)으로 충분히 생육이 가능하지만 배지성분과 균체를 균일하게 분산시키기 위해서 천천히 교반하는 것이 바람직하다. 유산균의 생육에 따라 유산이 배지 중에 축적되어 배지의 pH가 서서히 저하된다. 배양중의 pH를 조절하지 않아도 유산균을 어느 정도는 회수할 수 있으나, 탄산칼슘을 배지 중에 첨가함으로써 또는 pH 자동 조절에 의해 배지의 pH를 제어하는 것이 바람직하다. 배지의 pH는 4.0 내지 7.0으로, 바람직하게는 6.0 내지 6.5로 제어함으로써 고밀도의 유산균을 얻을 수 있다.

이하의 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유산균을 가열 살균한 균체에 항알레르기 작용이 인정된다.

따라서 본 발명의 항알레르기제에 포함되는 유산균은 살아있는 균 즉 증식 및/또는 대사를 하고 있는 상태의 균일 수도 있고, 죽은 균 즉 증식도 대사도 하고 있지 않은 상태의 균일 수도 있다. 또한 본 발명의 항알레르기제는 본 발명의 유산균의 균체 성분으로 항알레르기 작용을 가지는 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은, 본 발명의 알레르기제에 가하여 조미료, 착색료, 보존료, 기타 식품으로서 허용되는 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 본 발명의 항알레르기제의 효과를 손상시키지 않는 조건으로, 본 발명의 유산균을 이용하여 발효에 의해 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 유산균 및/또는 본 발명의 유산균에 의한 발효품을 밥을 짓는 외의 가열, 가압 등을 실시하여 제조될 수 있다. 액체배양으로 생육한 본 발명의 유산균은 그 자체로도, 또는 건조시켜도, 항알레르기 작용을 가지는 식품소재로서 이용할 수 있으나, 정백미를 발효시킬 때에 스타터로도 이용할 수 있다.

본 발명의 유산균을 이용하여 정백미를 발효시킬 경우에는 깨끗이 씻은 정백미를 물에 침지하고, 여기에 본 발명의 유산균을 포함하는 스타터를 첨가하여 발효시키기만 하면 된다. 본 발명의 유산균은 쌀 표면의 영양을 이용하여 왕성하게 생육하며 또한 쌀 표면에 부착되기 때문에 발효가 종료된 쌀을 소쿠리 등으로 받고, 그 후 물로 씻어도 대부분의 유산균체는 쌀 표면에 부착된 채로 존재한다. 적정한 조건에서 발효가 종료된 정백미의 표면에는 원료 쌀 1g당 10⁸개 내지 10⁹개의 유산균이 부착되어 있다. 이 쌀을 건조시킴으로써 원료 쌀로서 가공할 수도 있고, 또한 건조시키지 않고 그대로 물을 가해서 밥을 지음으로써 항알레르기 유산균을 포함하는 밥 짓는 쌀을 얻을 수 있다.

본 발명의 의약품 조성물은, 본 발명의 알레르기제에 가하여 제제학(製劑學)적으로 필요한 물질 및/또는 의약품으로서 허용되는 물질을 포함할 수 있다.

본 발명에 의하면 항알레르기 작용을 가지는 본 발명의 유산균을 정백미를 원료로 하여 발효 시킴으로써, 표면에 항알레르기 유산균이 균일하게 분포된 정백미를 용이하고 저렴하게 얻을 수 있으며, 이것을 밥을 지어 매일 계속해서 섭취할 수 있는 항알레르기 작용을 나타내는 주식이 제공된다.

도 1은 유산균의 반복 경구투여가 OVA 감작마우스의 혈청 총 IgE 양에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 유산균의 반복 경구투여가 OVA 감작마우스의 오부알부민 특이적 IgE 레벨에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 유산균의 반복 경구투여가 OVA 감작마우스 지라세포에서의 IL-4 생성량에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 유산균의 반복 경구투여가 OVA 감작마우스 지라세포에서의 총 IgE 생성량에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 유산균의 반복 경구투여가 아토피성피부염 모델 동물의 혈청 총 IgE 양에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 유산균의 반복 경구투여가 아토피성피부염 모델 동물의 귓바퀴 알레르기 증상에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.

이하에 본 발명의 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 이들의 실시예에 의해 제한되지 않는다.

1. 항알레르기 작용을 가지고 정백미 표면에서의 생육이 양호한 유산균의 스크리닝

(1) 스크리닝에 이용한 유산균의 출처

스크리닝에 이용한 유산균은 쌀을 원료로 한 발효식품(겨된장(米糠床)), 쌀 누룩된장, 술지게미, 술덧(

) 등)으로부터 새롭게 분리되었다. 예비시험에서 락토바실러스속(屬)에 귀속되는 종인 것을 확인할 수 있는 39종의 유산균의 균주명을 표 １에 열거하였다.

(2) 유산균의 항알레르기 작용의 인 비트로(in vitro) 평가

오부알부민(OVA) 감작마우스로부터 적출한 지라세포를 이용하여 인 비트로에서의 항알레르기 시험을 실시하였다. 6주령(週齡)의 암컷 마우스(Balb/c, 찰스리버)를 3마리 구입하여 SPF 환경하에서 사육하고, 1주일에 1회 빈도로 1mg/mL의 Al(OH)₃와 2mg/mL의 OVA를 포함하는 현탁액을 1마리당 0.5mL씩 복강내 주사하였다. 적절히 꼬리 정맥에서 채혈하여 혈청 총 IgE량 및 OVA 특이적 IgE 레벨을 확인하였다. 그리고 혈청 총 IgE 및 OVA 특이적 IgE의 측정은 각각 "벡톤 디킨슨 앤 컴파니" 제조의 Murine Opt EIA ELISA 세트를 이용하여 샌드위치 ELISA법으로 실시하였다. 즉 총 IgE를 측정하는 경우에는 랫트(rat) 모노크로날 항마우스 IgE를 일차 항체로서 코팅한 플레이트를 이용하고, 여기에 적절히 희석한 혈청을 첨가한 후, 2차 항체로서 비오틴화 랫트 모노크로날 항마우스 IgE 중쇄 항체를 이용하였다. OVA 특이적 IgE를 측정하는 경우에는 일차 항체 대신에 OVA를 코팅한 플레이트를 이용하여 동일한 조작으로 ELISA를 실시하였다. 혈청 총 IgE량 및 OVA 특이적 IgE 레벨이 가장 높은 개체 1마리를 선출하고 사육 개시 28일 후에 비장을 적출하였다. 적출한 비장을 메스로 잘게 깨뜨려 적혈구 용해 버퍼 (154mM의 염화암모늄, 14mM의 탄산수소나트륨, 0.11mM의 EDTA-2Na, pH 7.3)를 첨가하여 적혈구를 제거하고, 10% 소 태아혈청(Difco사 제조), 페니실린G (100U/mL), 스트렙토마이신(100mg/mL) 및 10mM의 HEPES를 포함하는 RPM 1640 배지(Sigma사 제조)로 2x10⁶세포/mL가 되도록 희석한 후, 96구멍 마이크로타이터 플레이트에 100㎕씩 나누어 주입하였다. 다음에 80㎕의 OVA 용액(1mg/mL)과 20㎕의 가열 살균한 유산균 현탁액(1mg/mL)을 가하였다. 이산화탄소 5%, 37℃의 환경하에서 7일간 배양한 후, 배양액을 원심분리함으로써 지라세포 및 유산균을 제거하였다. 배양 상청에 포함되는 IL-4 및 IL-12의 농도를 "벡톤 디킨슨 앤 컴파니" 제조의 Mouse Opt EIA ELISA 세트 마우스 IL-4(카탈로그 번호 555232) 및 마우스 IL-12(p70, 카탈로그번호 555256)를 각각 이용하여 측정하였다.

(3) 정백미 표면에서의 유산균의 생육 시험

정백미 50g을 깨끗이 씻고, 100mL의 증류수를 첨가하여 침지시켰다. 상기 침지 액에 MRS배지를 이용하여 37℃로 하룻밤 배양한 유산균 배양액 (약 10⁹개/mL)을 1mL 첨가하여 혼합한 후 38℃에서 하루 보온하였다. 침지수를 버리고, 약 100mL의 증류수로 3회 세정한 후, 발효 쌀을 분쇄하여 쌀 표면에 부착된 유산균을 유리·현탁시켰다. 발효 쌀의 분쇄는 발효 쌀 10g과 90mL의 멸균 생리식염수(0.85％ Nacl)를 전용 필터가 부착된 무균 백에 넣어서 스토마커(오가노, 스토마커 400T)에 장착하고 230RPM으로 120초간 운전하여 분쇄하였다. 분쇄된 발효 쌀은, 적절히 희석하여 LBS 한천배지(BBL사 제조)에 도포하여 배양하고, 발생한 콜로니 수로부터 정백미 표면에 부착된 유산균 수를 구하였다.

(4)결과

항알레르기 활성 및 정백미를 이용한 생육·부착 시험 결과를 표 １에 나타내었다.

표 １에 나타난 바와 같이 쌀을 원료로 한 발효식품에서 분리한 유산균 39주 중 15주에서 IL-4 농도가 현저히 저하되었고 IL-12 농도가 현저히 상승하였다. IL-4는 T_H2세포의 분화·성숙을 촉진한다. 한편, IL-12는 T_H1세포의 분화·성숙을 촉진 함으로써 T_H2세포의 분화·성숙을 억제한다. T_H1세포와 T_H2세포의 밸런스가 무너지고, T_H2세포가 현저하게 우위가 되는 상황에서는 고농도의 IL-4 존재 환경이 되고, IgE의 생성이 항진되어 알레르기 상태로 인도된다. 따라서, IL-4의 생성을 억제하고 IL-12의 생성을 촉진하는 유산균은 T_H2세포의 우위 상황을 완화시키는, 요컨대 항알레르기 작용을 가진다고 말할 수 있다. 항알레르기 작용이 높은 유산균 15주 중, 락토바실러스 파라카세이 K71주는 정백미에 의한 생육이 양호하고 정백미에 강하게 부착되어 회수가 용이하다. 그래서, 락토바실러스 파라카세이 K71주를 본 발명의 목적에 가장 적합한 주(株)로서 선별하였다.

이하에서는 락토바실러스 파라카세이 K71주를 본 발명의 유산균이라 한다. 본 발명의 유산균은 술지게미로부터 분리되어 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 수탁 번호 FERM BP-11098로 국제기탁 되어 있다.

2. 본 발명의 유산균의 특징

(1) 16S rRNA 배열의 해석

당업자에게 주지의 방법을 따라 본 발명의 유산균인 락토바실러스 파라카세이 K71주의 균체 DNA를 주형으로서 유전자 증폭한 미생물 16S 리보솜 RNA (이하, 「rRNA 」라고 한다.) 유전자 영역의 폴리뉴클레오티드 단편(斷片)의 배열을 배열 번호 1로 나타낸다. 미생물 16S rRNA는 489,840종류 이상에 이르고, 정렬된 후에 그 전체배열 또는 부분배열이 데이터 베이스화되어 있고 (릴리스(release) 9.59, 2008년 3월5일 현재), Ribosomal Database Project II(RDP II, http://rdp.cme.msu.edu/)를 통해서 이용 가능하다(Maidak, B. L. 등 2001년, Nucleic Acids Res., 29권, 173-174 페이지). 그래서 배열 번호 1의 배열에 대해서 상기 데이터 베이스를 검색한 결과, L．파라카세이의 아종인 L．파라카세이 아종 파라카세이 JCM 8130주의 16S rRNA 유전자의 뉴클레오티드 배열에 대한 상동성은 100%로, L．파라카세이 아종 톨러런스(tolerans) NBRC 15906주에 대한 상동성은 99.9%였다. 그리고 상동성 검색에서는 배열번호 1의 뉴클레오티드 배열은 L．카세이 ATCC 334주의 16S rRNA 유전자의 뉴클레오티드 배열에도 높은 상동성을 나타내는데, L．파라카세이의 각 균주와 동종이라고 하는 Dellaglio, F．등에 의한 논문(Int. J．Syst．Evol． Microbiol.,52:285-287(2002))이 있다. 그래서, L. 카세이 ATCC 334주도 L. 파라카세이에 귀속될 가능성이 높다고 추측되므로, L. 카세이 ATCC 334주가 상동성 검색에서 검색된다고 해서 본 발명의 유산균이 L. 카세이에 귀속된다고는 말할 수 없다. L. 카세이 ATCC 334주 이외에 상동성 검색에서 상위에 검색된 미생물의 16S rRNA 유전자의 뉴클레오티드 배열과 클러스터 해석을 실시한 바, 배열번호 1의 뉴클레오티드 배열은 L. 파라카세이의 2개의 아종이 형성하는 클러스터에 속하고, L. 파라카세이 아종 파라카세이의 16S rRNA 유전자의 뉴클레오티드 배열과 동일 배열이었다. 따라서, 16S rRNA 유전자의 뉴클레오티드 배열의 해석 결과에 의하면 본 발명의 유산균은 종 레벨로는 L. 파라카세이에 귀속될 가능성이 높다.

(2) 생리·생화학 성상시험

본 발명의 유산균인 락토바실러스 파라카세이 K71주의 생리·생화학 성상에 대한 각종시험의 결과는 이하의 표 ２, 3 및 4에 나타낸 바와 같다.

표 ２에 나타낸 세균 제 1단계 시험 결과, 본 발명의 유산균은 운동성을 가지지 않는 그람 양성 간균으로 글루코스를 발효하고, 카탈라아제 반응 및 옥시다아제 반응은 모두 음성을 나타내었다. 이들의 성상은 16S rRNA 유전자 뉴클레오티드 배열 해석에서 귀속이 시사된 L. 파라카세이와 같은 유산간균의 일반 성상과 일치한다. 표 ３에 나타낸 세균 제 2단계 시험 결과, 본 발명의 유산균은 리보오스(ribose), 아도니톨(adonitol), 갈락토오스(galactose), 프록토오스(fructose), 및 덜시톨(dulcitol) 등을 발효하고, 글리세롤, D-아라비노오스(D-arabinose), 람노스(rhamnose) 및 이노시톨(inositol)등을 발효하지 않았다. 또한, 표 ４에 나타낸 생육 시험의 결과, 본 발명의 유산균은 10℃에서 생육하였다. 이들의 성상은, 16S rRNA 유전자 뉴클레오티드 배열 해석에서 귀속이 시사된 L. 파라카세이의 전형적인 성상(Collins, M.D.등, Int. J. Syst. Bacteriol.,39:105-108(1989))과 일치한다고 생각된다. 그래서, 생리·생화학 성상시험의 결과에 의하면, 본 발명의 유산균은 아종 레벨에서는 L. 파라카세이 아종 파라카세이에 귀속될 가능성이 높다.

3. 본 발명의 유산균의 항알레르기 작용의 인 비보(in vivo) 평가

(1) 알레르겐 감작마우스에의 효과

본 발명의 유산균인 락토바실러스 파라카세이 K71주를 알레르겐 감작마우스에 반복 경구투여한 경우의 IgE 및 알레르기에 영향을 미치는 사이트카인(IL-4등)의 생성량의 변화를 이하의 방법으로 조사하였다.

6주령의 암컷 마우스(Balb/c) 18마리를 찰스리버사로부터 구입하고 기존 환경하에서 사육하였다. 4일간의 예비사육 후, 6마리씩 3군으로 나누고 그 중 1군에는 본 발명의 유산균인 락토바실러스 파라카세이 K71주의 균체 현탁액(20mg/mL)을 매일 50㎕씩 경구로 반복 투여하였다(유산균 투여군). 투여 개시 1주일 후부터 주에 1회 빈도로 꼬리 정맥으로부터 채혈한 후, 실시예 1과 동일한 방법으로 AL(OH)₃와 OVA의 현탁액을 복강내 주사하였다. 시험 개시 42일째에 채혈 종료 후에 실시예 1과 동일한 방법으로 지라를 적출하여 지라세포를 채취하였다. 유산균 현탁액 대신에 증류수를 반복 경구투여 하고, AL(OH)₃와 OVA의 현탁액을 매주 복강내 주사한 동물군을 감작군, 증류수를 경구투여 하고, AL(OH)₃와 OVA의 현탁액의 복강내 주사를 실시하지 않은 동물군을 비감작군으로 하여 유산균 투여군과 마찬가지로 채혈과 비장적출을 실시하였다.

채혈한 혈액 샘플은 실시예 1과 동일한 조작에 의해 혈청 총 IgE량 및 OVA특이적 IgE 레벨의 분석에 이용하였다. 또한, 100㎍/mL의 OVA를 첨가하여 지라세포를 배양하고, 7일 후에 배양 상청 중의 IL-4 및 IL-12의 생성량을, 14일후에 총 IgE 생성량을 분석하였다. 유산균의 반복 경구투여가 OVA 감작마우스의 혈청 총 IgE량의 상승에 미치는 효과를 도 1에, 오부알부민 특이적 IgE 레벨에 미치는 효과를 도 2에 각각 나타내었다. 또한, 유산균의 반복 경구투여가 OVA 감작마우스 지라세포의 배양 상청에서의 IL-4 생성량에 미치는 효과를 도 3에, 유산균의 반복 경구투여가 OVA 감작마우스 지라세포의 배양 상청에서의 총 IgE 생성량에 미치는 효과를 도 4에 나타내었다. 도 1 내지 도 4에서 기호 「a」 및 「ｂ」는 2개의 실험조건군 간의 통계적 유의차(P <0.05)가 있음을 나타내고, 기호 「c」는 「a」 및 「ｂ」의 실험조건군 모두에 대해서도 「c」의 실험조건군은 통계적 유의차(P <0.05)가 있음을 나타낸다. 도 1 내지 도 4에 나타난 바와 같이, 알레르겐 감작에 의해 혈청 IgE량 (도 1), 오부알부민 특이적 IgE 레벨(도 2) 모두 유의적으로 상승했으나, 유산균의 반복투여는 이들의 상승을 유의적으로 억제하였다. 마찬가지로, 유산균의 반복 경구투여는 지라세포에서의 IL-4생성량 (도 3), 총 IgE 생성량 (도 4) 모두 유의적으로 저하시켰다. 그리고 각 실험조건군간의 통계적 유의차는 마이크로소프트사제의 표 계산 소프트 엑셀의 애드 인 소프트웨어인 Statcel을 이용하고, 일원 배치의 분산분석에서 유의차가 있는 경우에 Fisher's PLSD로 검정하였다.

(2) 아토피성 피부염 모델 동물에의 효과

아토피성 피부염 모델 동물인 NC마우스를 이용하여 본 발명의 유산균인 락토바실러스 파라카세이 K71주의 반복 경구투여가 아토피성 피부염의 진행에 미치는 영향을 조사하였다. 5주령의 NC수컷 마우스(NC/Nga, 찰스리버) 12마리를 구입하여 CE-2 사료(일본 크레아)로 3일간 예비사육하고, 그 후 6마리씩 2군으로 나누었다. 한쪽 군에는 락토바실러스 파라카세이 K71의 건조 균체 0.05%를 포함하는 CE-2 사료(유산균 투여군)를, 다른 쪽 군에는 통상의 CE-2사료(대조군)를 주어 계속해서 3주일 사육하였다.

알레르기 감작에는 염화피크릴(2,4,6-트리니트로 클로로벤젠, 재결정화 후에 사용)을 이용하였다. 첫 회의 감작은 5% 염화피크릴 용액(에탄올:아세톤=4:1로 용해)을 복부와 사지 발바닥의 도톰한 부분에 도포하고, 그 4일 후부터 주 1회의 빈도로 합계 8회, 1% 염화피크릴 용액(식용 올리브유에 용해)을 귀에 반복해 도포하였다. 적절히 채혈하여 혈청 총 IgE량의 분석을 실시예 1에 기재한 방법으로 실시하였다. 또한, 사육 기간을 통해 양쪽귀의 임상 스코어 평가(표 ５의 평가기준을 따라서 6명의 평가자가 실시하고, 좌우 귀의 스코어 합계로 표시)를 실시하였다.

유산균 투여군에서의 유산균의 평균 투여량은 섭취 사료량으로부터 환산하여 23mg/마리/일로 계산되었다. 유산균의 반복 경구투여가 아토피성 피부염 모델 동물의 혈청 총 IgE량에 미치는 효과를 도 5에, 유산균의 반복 경구투여가 아토피성 피부염 모델 동물의 귓바퀴 알레르기 증상에 미치는 효과를 도 6에 각각 나타내었다. 도 5 및 도 6에서 ＊표시는 P<0.05를 나타내고, ＊＊표시는 P<0.01을 나타낸다. 유산균 투여군에서는 혈청 총 IgE량 (도 5), 임상 스코어(도 6) 모두 대조군에 비해 유의적으로 저하되었으며, 유산균의 투여에 의해 아토피성 피부염이 분명하게 경감됨이 확인되었다. Student t-검정을 실시한 결과, 유산균 투여군에서는 혈청 총 IgE량 및 임상 스코어 양쪽 모두 대조군에 비해 유의적으로 저하되었으며, 본 발명의 유산균 투여에 의해 아토피성 피부염이 분명하게 경감됨이 확인되었다.

3. 밥 짓는 쌀의 관능평가

정백미 (니이가타현 생산의 코시히카리) 3홉을 깨끗이 씻고, 900mL의 증류수에 침지하였다. 여기에 MRS 배지 중에서 37℃로 하룻밤 배양한 배양액 9mL을 가해서 천천히 혼합하여 38℃에서 1일 보온하였다. 그 후 침지 수를 버리고, 약 500mL의 증류수로 3회 세정한 후에 적당량의 증류수를 가해서 전기밥솥에 넣었다. 밥 짓기 전의 쌀을 소량 채취하여 실시예 1과 동일한 조작으로 유산균 수를 측정한 결과, 쌀 (건조 중량환산) 1g당 4.3x10⁸개의 유산균이 검출되었다. 통상의 조건으로 밥을 해서 밥짓는 쌀의 관능평가를 실시한 바, 통상의 밥 짓는 쌀로서 손색이 없는 맛있는 밥이었다.

<110> KAMEDA SEIKA CO., LTD. NIIGATA UNIVERSITY <120> Novel Lactobacillus Microbe, Antiallergic Agent, Food and Pharmaceutical Composition Containing Thereof, and Method for Manufacturing the Antiallergic Agent <130> KMSF-001PCT <150> JP2008-115091 <151> 2008-04-25 <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1530 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei <400> 1 gagtttgatc ctggctcagg atgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgaacg 60 agttctcgtt gatgatcggt gcttgcaccg agattcaaca tggaacgagt ggcggacggg 120 tgagtaacac gtgggtaacc tgcccttaag tgggggataa catttggaaa cagatgctaa 180 taccgcatag atccaagaac cgcatggttc ttggctgaaa gatggcgtaa gctatcgctt 240 ttggatggac ccgcggcgta ttagctagtt ggtgaggtaa tggctcacca aggcgatgat 300 acgtagccga actgagaggt tgatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct 360 acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgcaa gtctgatgga gcaacgccgc 420 gtgagtgaag aaggctttcg ggtcgtaaaa ctctgttgtt ggagaagaat ggtcggcaga 480 gtaactgttg tcggcgtgac ggtatccaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 540 gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca 600 ggcggttttt taagtctgat gtgaaagccc tcggcttaac cgaggaagcg catcggaaac 660 tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag 720 atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct 780 cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgaa 840 tgctaggtgt tggagggttt ccgcccttca gtgccgcagc taacgcatta agcattccgc 900 ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg 960 tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatctttt 1020 gatcacctga gagatcaggt ttccccttcg ggggcaaaat gacaggtggt gcatggttgt 1080 cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatgact 1140 agttgccagc atttagttgg gcactctagt aagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1200 ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga 1260 tggtacaacg agttgcgaga ccgcgaggtc aagctaatct cttaaagcca ttctcagttc 1320 ggactgtagg ctgcaactcg cctacacgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca 1380 cgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg 1440 taacacccga agccggtggc gtaacccttt tagggagcga gccgtctaag gtgggacaaa 1500 tgattagggt gaagtcgtaa caaggtagcc 1530

Claims (10)

1. 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 수탁 번호 FERM BP-11098로서 국제 기탁된 락토바실러스 파라카세이 K71주의 유산균.
2. 제 1항에 기재된 유산균을 포함하는 것을 특징으로 하는 항알레르기제.
3. 제 2항에 있어서,
   상기 유산균은 살아있는 균인 것을 특징으로 하는 항알레르기제.
4. 제 2항에 있어서,
   상기 유산균은 죽은 균인 것을 특징으로 하는 항알레르기제.
5. 제 1항에 기재된 유산균의 균체 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 항알레르기제.
6. 제 2항 내지 제 5항의 어느 한 항에 기재된 항알레르기제를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
7. 제 2항 내지 제 5항의 어느 한 항에 기재된 항알레르기제를 포함하는 것을 특징으로 하는 의약품 조성물.
8. 제 1항에 기재된 유산균을 이용하여 발효시킨 쌀, 상기 쌀의 분쇄물, 상기 쌀 또는 쌀의 분쇄물로 밥을 지은 밥 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
9. 제 1항에 기재된 유산균을 배지에 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항알레르기제의 제조 방법.
10. 제 9항에 있어서,
    상기 배지는 쌀 또는 쌀의 분쇄물인 것을 특징으로 하는 항알레르기제의 제조 방법.

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