TWI324068B - Antiallergic composition - Google Patents

Description

1324068 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於對過敏之預p方.治療有用之抗過敏用組合 物，特；t而言，係關於具有高抗過敏活性乳酸g做為有: 成分之抗過敏用組合物及該乳酸菌之取得方法，再者 關 於該抗過敏用組合物在食品及飲料等方面之利用。 【先前技術】

在先進國家，過敏為出現頻率最高之疾病之一。過敏之 發病機構通常可從Ϊ型至IV型分為4類。！型過敏與 關’以花粉症、氣喘、蓴麻疹及過敏性休克（anaphylacuc shock)為代表。Π型過敏與IgG或IgM抗體有關，為將補體系 統活化之細胞傷害性反應，胎兒赤芽球症及自體免疫性溶 血性貧血症是此類。ΠΙ型過敏為抗原抗體複合體引起之組 織傷。如阿色斯反應（Arthus reaction)、血清病及絲球體 腎炎等為代表之反應型過敏為與τ細胞有關之遲延性過 敏症（delayed type hypersensitivity)，如結核菌素液 (Tuberkulin)及接觸性皮膚炎為代表之反應。過敏症中，食 物過敏之發病與1型、Π型及IV型有關。另一方面，已知環 i兄過敏，亦即花粉症、異位性皮膚炎、支氣管性氣喘、過 敏性鼻炎及過敏性結膜炎等過敏症，主要具有〖型之發病機 構。 上述之1型過敏症以過敏原（allergen)特異性igE之誘導及 、’且織胺及白二稀等化學調節因子之釋放為特徵。免疫回應 雖由於各種細胞之相互作用而產生，然而與其有關之細胞 91125-990127.doc 1324068 之一為輔助T細胞（helper T cell，Th)。辅助T細胞被分類為 τ細胞亞群’能辨認抗原而產生各種細胞激素（cyt〇kine)(輔 助細胞因子）’具有調節免疫回應誘導之作用。T輔助細胞 可從其產生細胞激素之能力分類為Thl細胞及Th2細胞。為 了引起B細胞中抗體之類別轉換（class switch)及產生IgE抗 體，需要IL-4、IL-5及IL-13等Th2細胞激素。事實上，已知 過敏症患者之淋巴球中Th2細胞增加。最後，從外界侵入之 過敏原藉由樹狀細胞.巨噬細胞等抗原提示細胞，以其之 一部伤與第II類MHC分子結合之狀態對T細胞提示，使Th2 細胞活化及分化。Th2細胞釋放之Th2細胞激素誘導B細胞 之類別轉換，產生IgE抗體，IgE抗體與組織内肥大細胞及 血中嗜鹼球表面之Fc. R結合。過敏原於下次侵入時，被與

肥大細胞及血中嗜鹼球表面結合之IgE抗體所辨認，與igE 抗體間形成交聯。以此種刺激做為引發點，經由肥大細胞 及B驗球爆發性地釋放化學調節因子，而出現過敏等各種 症狀。 經由IgE與化學調節因子所採取之過敏症之預防·治療， 例如有藉由在組織胺受體與組織胺拮抗性地結合以抑制來 自末梢神經之信號傳達之抗組織胺劑，嘗試減弱產生化學 調節因子之細胞之活性以減輕症狀之抗過敏劑，藉由減弱 免疫反應性而減輕f炎之類_劑藉由定期注射過敏 原誘導寬隸之降低反歸法# H以上任何一種療 法均可發現副作用問題，且其亦未有決定性之效果。μ 近年為抑制IgE，注意力集中於調節Th2細胞激素之產生 91125-990l27.doc 1324068 之方法。曾報導藉由結核菌、溶連菌或乳酸菌等某種細菌 增強Thl免疫，並抑制Th2免疫，結果使IgE降低（臨床免疫， 1999年’第 32卷，454 頁；International Archives of Allergy andImmunol〇gy ’ 1998年，第 115卷，278頁；特開平9 2959 號公報）。 其中，從安全性方面而言，乳酸菌對食品等之應用容易， 為有用之材料。然而，一般稱為乳酸菌之所有乳酸菌，未 必有增強Thl免疫之強力效果，因此選擇有用菌株為必要之 手段。抗過敏之乳酸菌中，鼠李糖乳桿菌（L rhamn〇su勾 LGG為公知，藉由孕婦攝取，顯示可抑制孩兒異位性皮膚 炎之發病（Lancet ’ 2001年，第357卷，1〇76頁）。亦有數個 專利公報揭示使用乳酸菌做為抗過敏劑。例如，分別於特 開平9-2959號公報中，揭示關於使用添加嗜酸乳桿菌（l. acidophilus)、短乳桿菌（L. brevis)、布氏乳桿菌（l. bufneri) 及乾酪乳桿菌（L. casei)等乳酸菌培養小鼠淋巴球時之IgE 產生量為30 ng/ml以下者做為抗過敏劑，於特開平1〇_3〇9178 號公報中，揭示關於使用嬰兒雙岐桿菌（Biphid〇bacte]rium infantis)、短雙岐桿菌（Biphidobacterium breve)、長雙岐桿 菌（Biphidobacterium longam)及雙岐式雙岐桿菌 (Biphidobacterium biphidam)等雙岐桿菌做為治療過敏（尤 其食物過敏）之抗過敏劑，以及於特開2〇〇〇_95697號公報 中’揭示關於使用糞腸球菌（Enterococcus faecalis)及囉伊 氏乳桿菌（Lactobaci丨lus reuteri)等乳酸菌做為支氣管性氣 喘、過敏性鼻炎及異位性皮膚炎等I型過敏症之抑制劑。 91125-990127.doc •10· 1324068 另一方面，已知乳酸菌等之所謂「增強Thl免疫」意指經 由IL12及IFN-γ等之產生將巨噇細胞、殺手T細胞（killer T cell)及NK細胞之細胞性免疫活化，其關連對病毒或細菌感 染、或癌之發生之抵抗力。具體而言，經由巨噬細胞產生 之IL- 1 2將未分化輔助T細胞分化為Th 1細胞，及單核球、巨 噬細胞及NK細胞之活化，可獲得對外敵及癌之抵抗性。此 暗示可使用強力誘導IL-12產生之乳酸菌株做為免疫賦活 劑（Cancer Immunology Immunotherapy’ 2000年，第 49 卷， 157頁；特開平7-228536號公報；特開2002-80364號公報）。_ 又’乳酸菌為了可到達腸管中生存以發揮各種效果，必 須對月酸及膽汁酸等各種消化液具有耐性（學會出版中 心，腸内生態研討3,腸内生態與益生菌（pr〇bi〇tics)，41_55 頁，光岡知足編，1998年）。又，已知對腸管附著性高之乳 酸菌，到達腸管可充分地發揮其效果。因此，經口攝取乳 酸菌％，除期望該乳酸菌之機能性高，亦期望其能到達並 於腸管中生存。 近年，罹患異位性皮膚炎及花粉症等被認定為過敏引起 體質變化之人們處處可見，已有社會問題化之趨勢。對於 其:症狀特別嚴重之患者使用各㈣物進行治療。然而， 事實上大部分患者未進行正式治療，當發生於日常生活上 時，只以包括民俗療法之症狀療法加以處置。 錐於此種狀況，最近藉由食物抑制過敏之研究正如雨後 春筒般地進行。結果，在例如紫蘇油、魚油及特定之茶多 紛等各種飲食品成分中，發現抗過敏之效果，其等可被用 91125-990127.doc 1324068 於進行對症治療。 關於具有抗過敏效果之飲食品之成分，使用與上述之特 定乳酸菌具有同樣效果之乳酸ϋ之優酪乳及乳酸菌飲料， 已有一部份已被實用化做為具有抗過敏效果之飲食物。藉 由此種飲食品進行之預防或治療，代替原先安全且溫和條 件下攝取之方式’而必須每日持續地攝取’並且該每曰持 續攝取量必須為可發揮效能之量。然而，先前技術中，由 於選取高抗過敏活性之菌株之方法並不明確，無法取得有 力之菌株，實用上並不令人滿意。再者，先前乳酸菌之使 用中，如優酪乳及乳酸菌飲料主要目的為藉以發酵，抗過 敏作用僅為附屬之效果，再者，為優酪乳及乳酸菌飲料之 情況，多必須冷藏販售，無法久放，具有處理自由度少之 問題，同時在做為輕便，可每日持續地攝取且具有效能之 過敏預防或治療用飲食品方面，尚無法令人滿意。因此， 最近滿足此等要件之有效抗過敏用組合物及使用其等之飲 食品之開發受到迫切之期待。 [專利文獻1]特開平7-228536號公報。 [專利文獻2]特開平9_2959號公報。 [專利文獻3]特開平10-309178號公報。 [專利文獻4]特開2000-95697號公報。 [專利文獻5]特開2002-80364號公報。 [非專利文獻1]臨床免疫，1999年，第32卷，454頁。 [非專利文獻2]International Archives of Allergy and Immunology， 1998 年，第 115 卷，278 頁。 91125-990127.doc -12- 1324068 [非專利文獻3]Lancet，2001年，第357卷，1076頁。 [非專利文獻4]癌症免疫學及免疫療法（Cancer Immun〇1〇gy

Immunotherapy)，2000年，第 49卷，157 頁》 [非專利文獻5]學會出版中心，腸内生態研討3，腸内生態 與益生菌（probiotics)，41-55頁，光岡知足編，1998年》 【發明内容】 [發明欲解決之課題] 本發明之課題係提供對過敏之預防·治療有用之抗過敏 用組合物，尤其，具有高抗過敏活性之乳酸菌做為有效成 分之抗過敏用組合物，及該乳酸菌之取得方法，再者提供 具有該抗過敏機能之食品及飲料等。其中「具有抗過敏機 能」意指「對過敏之預防·治療發揮效果及/或改善.緩和 過敏症狀」。 [解決此課題之手段] 本發明人以花粉症、異位性皮膚炎、支氣管性氣喘、過 敏性鼻炎等環境過敏症之預防，治療為㈣，探索對於其 ，有效成分時，首先，基於安全性方面考量而著眼於乳酸 菌之探索’結果發現藉由選擇Th2活化之抑制及之活化 二者平衡之乳酸菌，可得到具有高抗過敏活性之乳酸菌， 本發明於焉完成。 亦即，本發明之具有高抗過敏活性之乳酸菌之取得方 法，具有著眼於Thl/Th2平衡方法之特點。先前之方法雖測 定邮以進行抗過敏活性之評價’然而邮與過敏之關係雖 為無可置疑之事實，但另一方 91I25-990127.doc 13 1324068 患者分為咼IgE病人及低IgE病人，因此事實上無法夢由 之程度說明整個狀況。已知過敏之發病中，除igE&\ ,§尚 與嗜酸球之增加，及對淋巴球局部浸潤引起之趨化激素 (chemokine)釋放等各種現象有综合性之關連。因此，本發 明係著眼於可综合地說明IgE增加、嗜酸球增加及趨化激素 之Thl/Th2平衡，而開發以該平衡做為指標，來評價及分離 抗過敏性菌狀方法，、结果成功地得到具有高抗過敏活性 之乳酸菌。 _ 本發明之抗過敏用組合物，係以介白素4(IL_4)與介白素 12(IL-12)之生成量具有特定平衡之乳酸菌做為有效成分之 抗過敏用組合物，其中以介白素4(IL_4)做為Th2之活化指標 及以介白素12(IL-12)做為Thl之免疫活化指標；更詳細言 之，其係以乳酸菌做為有效成分之抗過敏用組合物，該乳 酸菌呈現下述特性：當將來自用卵白白蛋白敏化之小鼠之 脾臟之淋巴球懸浮於含有印白白蛋白之培養基中並添加受 • 檢乳酸菌進行培養時，該乳酸菌之介白素12(interleukin 12) 產生1與使用田1j乾路乳桿菌（L. paracasej)KW3 11 0株做為受 檢乳酸菌之情況同等，或者為使用副乾酪乳桿菌KW3丨】〇 株之情況之60%以上，又介白素4(interleukin4)產生量為未 添加乳酸菌之對照組之未達5〇%。在本發明中，上述本發 明之具有抗過敏活性之乳酸菌，包含以介白素12產生量為 S亥KW3 110株之70%以上之乳酸菌，或以介白素12產生量為 该KW3 110株之70%以上且介白素4產生量為未達4〇%之乳 酸菌做為活性成分者；再者，本發明中取得之具有抗過敏 91125-990127.doc 14 1324068 活性之乳酸菌，包含以與KW4110、KW3925及kw3926之抗 過敏活性相較，呈現與KW4110相同或以上之抗過敏活性之 乳酸菌，呈現與KW3925相同或以上之抗過敏活性之乳酸 菌，或者呈現與KW3926相同或以上之抗過敏活性之乳酸菌 做為活性成分者。 本發明包含為該本發明之抗過敏用組合物有效成分之具 有高抗過敏活性之乳酸菌之取得方法。更且，包含本發明 之抗過敏用組合物在飲食品方面之利用，以及在藉由製劑 化做為經口投與抗過敏劑方面之利用。做為本發明之抗過 敏用组合物有效成分之一之副乾酪乳桿菌(l㈣咖叫 KW3U0株’為對消化液有耐性，料㈣著性高之乳酸 菌，做為抗過敏劑進行經口投與時達到特別優良之效果。 做為本發明之抗過敏用組合物之有效成分使用之副乾酪 礼才干菌KW3 110株’根據為專利微生物之寄存而訂定之布達 佩斯條、約，寄存於為㈣寄存當局之獨立行政法人產業技 術综合研究所專利微生物寄存中心、，寄存編號Bp_〇8634 號，又，寄存於中華民國（台灣）食品工業發展研究所，寄存 編號 BCRC 910252號。 關於本發明之抗過敏用組合在對飲食品方面之利用，包 括為本發明之抗過敏用組合物有效成分之具有高抗過敏活 性之乳酸菌適用於如茶飲料之飲料，提供具有抗過敏機能 之飲料。本發明之具有抗秘機能之飲料可成為嗜好性及 保存性高之飲料，並可調製成可每日持續地攝取，並且該 持續攝取量為可發揮效能之量之具有抗過敏機能之飲料了 91125-990l27.doc •15-

DM 中具有高抗過敏活性之乳酸菌，可將其藉由加熱殺 λ处理以已殺菌形態使用，例如藉由將本發明之乳 酸菌加熱殺菌後進行添加’充填於已殺菌之 =料，可保持飲料本身之香味，成為安定之飲料製；； 且4品化而成為保持抗過敏機能之密封容器充填飲料。 :者，製造密封容器充填飲料時，藉由調整所使用之乳酸 之濃度，可保持抗過敏機能，同時可增加飲料本身香味 ，保持機能’製造嗜好性及保存性高之飲料。本發明中， 從4几過敏作帛及製^之保存與安定化之觀點而言，以不含 乳成分（亦即例如添加果汁之清涼飲料或如茶飲料之未添 加礼成分之形態）之各種類型飲料為特佳。 本發明之抗過敏用組合物在飲食品方面之利用，可將依 黑本發明採取之具有高抗過敏活性之乳酸菌2種以上併存 使用。此時’可將各個飲食品與乳酸菌合併，依其组合及 添加量進行調製。再者’亦可進行其他抗過㈣組合物之 添加或併用。 亦即，具體而言，本發明包含一種抗過敏用組合物，盆 特徵為含有乳酸菌做為有效成分，該乳酸菌呈現下述特 性：當將來自用印白白蛋白敏化之小鼠之脾臟之淋巴球縣 浮於含有卵白白蛋白之培養基中並添加受檢乳酸菌進行培 養時，該乳酸菌之介白素i 2(interleukin ! 2)產生量與使用副 乾酪乳桿菌（L. paracasei)K W3 !丨〇株做為受檢乳酸菌之情況 同等，或者為使用副乾酪乳桿菌KW3n〇株之情況之6〇%以 上’又介白素4(interieukin4)產生量為未添加乳酸菌之對照 91125-990127.doc 16 Οδ 組之未達50〇/〇(申請專利範主 項之抗過敏用组合物，1 、、 。月利軏圍第1 /、特徵為含有乳酸菌做為有效成 分’該乳酸菌呈現下述特性：當將來自用卵白白蛋白敏化 之小鼠之脾臟之淋巴球懸浮於含有印白白蛋白之拉養基中 f添加受檢乳酸菌進行培養時，該乳酸菌之介白素12线 二與，用Μ乾^桿g(L pafaeasei) kw3ug株做為受檢 礼酸菌之凊况同等’或者為使用副乾酪乳桿菌^丄〇株之 It況之75 /〇以上（申請專利範圍第2項广如申請專利範圍第1 或2項之抗過敏用組合物，其特徵為含有乳酸菌做為有效成 分，該乳酸菌呈現下述特性：當將來自用卵白白蛋白敏化 之小鼠之脾臟之淋巴球懸浮於含有印白白蛋白之培養美中 並添加受檢乳酸菌進行培養時’該乳酸菌之介白素4產2量 為未添加乳酸菌之對照組之未達4〇%(申請專利範圍第里3 項）；如申請專利範圍第！至3項中任—項之抗過敏用組合 物’其特徵為含有乳酸菌做為有效成分，該乳酸菌呈現下 述特性：當將來自用印白白蛋白敏化之小鼠之脾臟之淋巴 球懸浮於含有印白白蛋白之培養基中並添加受檢乳酸菌進 行培養時，該乳酸菌之介白素12產生量與使用副乾路乳桿 菌（L.paracasei)KW3110株做為受檢乳酸菌之情況同等，或 者為使用副乾酪乳桿菌KW3 11 〇株之情況之75%以上，又^ 白素4(interleukin 4)產生量為未添加乳酸菌之對照組之^ 達娜（申請專利範圍第4項）；如申請專利範圍第iji4項中 任一項之抗過敏用組合物，其特徵為含有乳酸菌做為有效 成分，該乳酸菌呈現下述特性：當將來自用卵白白蛋白敏 91125-990127.doc -17- 1324068 化之小鼠之脾臟之淋巴球懸浮於含有卵白白蛋白之培養 基中並添加文檢乳酸菌進行培養時，該乳酸菌之介白素 12產生量與使用副乾酪乳桿菌（L paracasei)KW3 i i 〇株做 為文檢礼酸菌之情況同等，或者為使用副乾酪乳桿菌 KW3 110株之情況之80%以上，又介白素4產生量為未添加 礼酸菌之對照組之未達30%(申請專利範圍第5項广一種 抗過敏用組合物，其特徵為呈現如申請專利範圍第丨至5 項中任一項記載之來自小鼠脾臟之淋巴球之介白素12及 介白素4生成量之乳酸菌，係副乾酪乳桿菌 Pa顧sei) KW3110 株、植物乳桿菌（Lact〇badiius pi_咖） 4110株田！乾路乳才干菌（[邮〇1；^肠柯狀批^)^1^3925 株、副乾赂乳桿菌（Lactobacillusparacasei)KW3926株、或唾液 鏈球菌（Streptococcus salivarius) KW32】〇株（申請專利範圍第6 項）’ -種抗過敏用組合物，其係以副乾赂乳桿菌請川〇 株做為有效成分’該副乾路乳桿菌KW3u〇株呈現如申請 專利範圍第⑴項中任一項之來自小鼠脾臟之淋巴球之 介白素12及介白素4產生量，且對消化液有耐性及對腸管 附耆性高（申請專利範圍第7項）；如申請專利範圍第⑷ 項it —項之抗過敏用組合物，其中該過敏係'花粉症、 支氣管性氣喘、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎或異位性皮 膚炎（申請專利範圍第8項）；如申請專利範圍第㈣之抗過 敏用組σ物’其特徵為該抗過敏用組合物係—種醫藥 請專利範圍第9項）；如申請專利範圍第8 : ㈣抗過㈣Μ物係—種飲食^申請專 91125-990127.doc -18- 1324068 利範圍第ίο項）。 再者本發明包含一種具有高抗過敏活性之乳酸菌之取 传方法，其特徵為將來自以卵白白蛋白敏化之小鼠脾臟之 淋巴球懸浮在含有卵白白蛋白之培養基中並添加受檢乳酸 菌進行培養，然後分離出介白素12產生量與使用副乾路乳 桿菌（L. paracasei)KW3丨丨〇株做為受檢乳酸菌之情況同等或 者為使用副乾酪乳桿菌KW3丨丨〇株之情況之6〇%以上，且介 白素4產生量為未添加乳酸菌之對照組之未達5〇%之乳酸 菌（申睛專利範圍第11項）；一種具有高抗過敏活性之乳酸菌 之製造方法，其特徵為將藉由申請專利範圍第丨丨項之方法 为離之乳酸菌，使用培養基進行培養及增殖（申請專利範圍 第12項）；如中請專㈣圍第12項之具有高抗過敏活性之乳 酸菌之製造方法’纟中確認該使用培養基進行培養及增殖 之乳酸菌之抗過敏活性（申請專利範圍第13項）；如申請專利 範圍第13項之具有高抗過敏活性之乳酸菌之製造方法，其 中該增殖之乳酸菌之抗過敏活性之確認，係藉由將來自以 卵白白蛋白敏化之小鼠脾臟之淋巴球懸浮於含有卵白白蛋 白之培養基中並添加該乳酸菌進行培養，然後測定介白素 12及介白素4之產生量而進行（申請專利範圍第“項”一種 裝入密封容ϋ之醫藥品或飲食品之製造方法，其特徵為將 藉由申請專利範圍第項中任—項之具有高抗過㈣ 性之乳酸菌之製造方法製造之乳酸菌添加於醫藥或飲食品 中，然後充填於容器内並密封（申請專利範圍第15項”一種 具有抗過敏機能之飲食品’其特徵為添加申請專利範圍第1 91125-990127.doc •19· 1324068 之具有抗過敏活性之乳酸菌做為有效成分 (申知專利範圍第16項);如申請專利範圍 ㈣能之飲食品’其中在每-曰攝取之飲食品之量= 3有具有抗過敏活性之乳酸菌$ χ 9 y =項）利範圍第16或17項之具有抗過敏機能之 奴艮品，其特徵為該飲料或食品不含成為過敏原因之成分 (申請專利範圍第18項）；如中請專利範圍㈣項之具有抗過 敏機月t*之飲食品，Φ -=Λ· *4·' A. « ^

具中該飲枓或食品係不含成為過敏原因 Μ分之錠劑' 顆粒劑 '粉劑 '膠囊劑或飲用劑（申請專利 範圍第19項）；如巾請專㈣圍第⑽I9射任—項之具有 抗過敏機能之飲食品’其中將乳酸菌殺菌後使用（申請專利 範圍第20項）。

再者，本發明包含一種具有抗過敏機能之飲料，其特徵 為添加申請專利範圍第1至7項中任一項之具有抗過敏活性 之乳酸菌做為有效成分（申請專利範圍第21項）；如申請專利 範圍第21項之具有抗過敏機能之飲料，其特徵為該飲料係 未添加乳成分之裝入密封容器之飲料（申請專利範圍第22 項）；如申請專利範圍第21或22項之具有抗過敏機能之飲 料’其特徵為該飲料係裝入密封容器之含有果汁之清涼飲 料或茶飲料（申請專利範圍第23項）；如申請專利範圍第21 至23項中任一項之具有抗過敏機能之飲料，其中該裝入密 封容器之飲料中所添加之乳酸菌在每1 〇〇 g飲料中為1 〇9至 1〇11個（申請專利範圍第24項）；如申請專利範圍第16至24項 中任一項之具有抗過敏機能之飲料，其中該添加之乳酸菌 91125-990127.doc -20- 1324068 為副乾酪乳桿菌（L. paracasei)KW3110或其突變株（申靖專 利範圍第25項）；如申請專利範圍第16至24項中任_項之具 有抗過敏機能之食品或飲料，其特徵為該食品或飲料係被 調製成健康食品、機能性食品、特定保健食品或病患用食 品（申請專利範圍第26項一種具有抗過敏機能之裝入密封 容器之飲食品之製造方法，其特徵為在已滅菌之食品或飲 料中，於實質無菌狀態下，添加申請專利範圍第丨至7項中 任一項之具有抗過敏活性之乳酸菌或該乳酸菌經過殺菌處 理者，再充填於容器中並密封（申請專利範圍第2?項”一種 乳酸菌之抗過敏活性之測定方法’其特徵為將來自以印白 白蛋白敏化之小鼠之脾臟之淋巴球懸浮於含有卵白白蛋白 之培養基中並添加受檢㈣菌進行培養，然後収所產生 之介白素12及/或介白素4之量（申請專利範圍第綱）；如申 請專利範圍第28項之乳酸菌之抗過敏活性之敎方法，其 中將藉由添加及培養受檢乳酸菌所產生之介白素^及/或 介白素4之量與使利乾路乳桿菌（Lact〇bacillus paracasei)

Kw·株時比較並進行評價（_請專利範圍第29項）；一種 抗過敏劑’其特徵為在如中請專利範圍第！至7項中任一項 之具有抗過敏活性之乳㈣中添加載體、賦形劑及/或其他 輔助劑’進行製劑化（中請專利範圍第3()項）；—種醫藥品， 其包含中請專利範圍第項中任_項之具有抗過敏活性 之乳酸菌（中請專㈣圍第31項）；_種具有抗過敏機能之飲 食品’其特徵為將使用乳酸菌製造或者含有乳酸菌之飲料 或食品之—部份或全部料請專利範圍第⑴項中任-項 91125-990127.doc 1324068 之具有抗過敏活性之乳酸菌代替（申請專利範圍第32項）；_ 種具有抗過敏機能之飲料或食品之製造方法，其特徵為將 使用乳酸菌製造或者含有乳酸菌之飲料或食品之一部份或 全部用申請專利範圍第1至7項中任一項之具有抗過敏活性 之乳酸菌代替（申請專利範圍第3 3項）。 又，本發明係關於一種過敏疾病之預防及/或治療方法， 其特徵為將使用本案之乳酸菌之抗過敏用組合物用於進行 過敏疾病之預防及/或治療之處置；在該過敏疾病之預防及 /或治療方法中，為花粉症、支氣管性氣喘、過敏性鼻炎、 過敏性結膜炎或異位性皮膚炎之預防及/或治療方法；使用 本發明乳酸菌之抗過敏用組合物在過敏疾病之預防及/或 ⑺療上之使用，及該抗過敏用組合物於過敏疾病之預防及/ 或冶療上之使用，係為進行花粉症、支氣管性氣喘、過敏 性鼻炎、過敏性結膜炎或異位性皮膚炎之預防及/或治療之 使用。 [發明效果] 依照本發明，可取得具有高抗過敏活性之乳酸菌，並可 仔到以該乳酸菌做為有效成分之呈現高抗過敏效果之組合 物。本發明之抗過敏用組合物特別對花粉症、異位性皮膚 炎、支氣管性氣瑞、過敏性鼻炎或過敏性結膜炎等環境過 敏發揮效力。尤其’如花粉症數據及使用花粉做為抗原之 氣喘治療實驗數據顯示’對如花粉症、支氣管性氣喘、過 敏性鼻炎或過敏性結獏炎等黏膜過敏症疾病之預防治療 有顯著效果。為本發明之抗過敏用組合物之有效成分之一 91125-990l27.doc -22- 1324068 之副乾路乳桿菌（L.paracasei)KW3n〇除強抗過敏免疫賦 活活生之外，對於腸管細胞之接著性及對胃酸及膽汁酸之 ^ f亦優良藉由將該乳酸菌甚至使用該乳酸菌之製品經 口投與’除可期待抗過敏機能外，並能發揮整腸作用、膽 固醇降低作用及血壓降低作用等先前已知之益生菌 (probiotics)機能在藥劑或飲食品上之用途。本發明之具有 高抗過敏機能之組合物，尤其做為飲料形態使用時，可提 供能母日持續地攝取，並且能以該持續攝取之量發揮效能 以保持高抗過敏機能，並且為喜好性及保存性高之飲料。 【實施方式】 [實施本發明之最佳形態] 本發明包含抗過敏用組合物，係以介白素4(il_句與介白 素12(IL-12)之生成量具有特定平衡之乳酸菌做為有效成 分，其中以介白素4(IL_4)做為Th2之活化指標及以介白素 12(IL-12)做為Thl之免疫活化指標。 (為本發明之有效成分之乳酸菌） 為本發明有效成分之具有高抗過敏活性之乳酸菌，為將 來自用㈣白蛋白（以下稱為「〇VA」）敏化之小鼠之脾臟之 淋巴球懸浮在含有〇VA之培養基中並添加受檢乳酸菌進行 坨養時，介白素12產生量與使用副乾酪乳桿菌KW3丨丨〇株做 為丈檢乳酸菌之情況同等或其6〇%以上，且介白素*產生量 為未添加乳酸菌之對照組之未達5〇%之乳酸菌。做為本發 明之有效成分，以將來自以〇VA敏化之小鼠之脾臟之淋巴 球懸浮在含有OVA之培養基中並添加受檢乳酸菌進行培養 91125-990127.doc •23- 時白素12產生里與使用副乾酪乳桿菌KW3 110株做為受 檢乳酸菌之情關等或其75%以上之乳酸菌為較佳。做為 本么月之有效成分者，以將來自用〇VA敏化之小鼠之脾臟 =淋巴球懸浮在含有OVA之培養基中並添加受檢乳酸菌進 行養時，介白素4產生量為未添加乳酸菌之對照組之未達 40%之礼酸菌為更佳。本發明中具有高抗過敏活性之乳 酉文菌之最佳形態，將來自用卵白白蛋白（以下稱為「〇VA」） 敏化之小鼠之脾臟之淋巴球懸浮在含有〇VA之培養基中並 添加受檢乳酸菌進行培養時，介白素12產生量與使用副乾 酪乳桿菌K W 3 11 0株做為受檢乳酸菌之情況同等或其8 〇 % 以上，且介白素4產生量為未添加乳酸菌之對照組之未達 30%之乳酸菌。 在取得做為本發明之有效成分之具有高抗過敏活性之乳 酸菌上，係藉由將來自用過敏原敏化之動物脾臟之淋巴球 懸沣在含有該過敏原之培養基中並添加受檢乳酸菌進行培 養，然後分離Thl誘導之細胞激素產生量與使用副乾酪乳桿 菌KW3110株做為受檢乳酸菌之情況同等，或為使用副乾酪 乳桿菌KW3110株之情況之6〇%以上，且介白素4產生量為 未添加乳酸菌之對照組之未達5〇%之乳酸菌，以取得具有 高抗過敏活性之乳酸菌之取得方法。亦即，藉由使用公知 之乳酸菌菌株或新分離之乳酸菌菌株，並將該乳酸菌添加 在懸浮有來自以過敏原敏化之小鼠脾臟之淋巴球之含過敏 原培養基中及進行培養，然後分離基本上介白素產生量與 使用副乾赂乳桿菌KW3110株做為受檢乳酸菌之情況同 91125-990127.doc • 24· 1324068 等’或者為使用副乾酪乳桿菌KW3丨〗0株之情況之6〇〇/〇以 且）丨白素4產生罝為未添加乳酸函之對照組之未達 之乳酸菌而取得。如上所述，藉由使用評價試管中抗過敏 活性之實驗方法以及依據本發明之指標，本技藝人士可從 各種公知或新分離之乳酸菌中容易地選取在本發明中做為 有效成分之乳酸菌，其之細節被具體地揭示於實施例丨申。 做為本發明有效成分用之具有高抗過敏活性之乳酸菌， 例如副乾酪乳桿菌（L.paracasei)KW3110株，係從日本乳業 技術協會取得之乾酪乳桿菌（L casei)L14株。再者，雖然依 據曰本乳業技術協會之記載，L14株係被記載為乾酪乳桿菌 仏咖小'然而本發明人等使用Qualic〇W司製之Rib〇pHnt〇r 微生物鑑定系統進行RFLp(Restricti〇n Ρ〇1，ΓρΜ3ΐη，限制片段長度之多樣性）及AFLP(Amplified F士lagmem Length p〇lym〇rphism，擴增片段之多樣性）解析 時’該株被判斷為副乾路乳桿菌（L叫咖叫，因此在本 發明中記載為副乾路乳桿菌（L㈣⑽叫。本發明中做為 抗過敏用組合物有效成分用之副乾路乳桿菌（l pa⑽叫 KW3110株，可如上述般從日本乳業技術協會取得，再者， 根據為專利微生物之寄存而訂定之布達佩斯條約，將該乳 酸菌寄存於職際寄錢構之獨立行政法人產業技術综合 研九所專利微生物寄存中心，寄存編號為Bp嶋Μ號又， 寄存於中華民國（台灣）食品工業發展研究所，寄存編號為 BCRC 910252號。 在本發月中做為抗過敏用組合物之有效成分用之 91125-990127.doc -25· 1324068 植物乳桿菌（1^卩13加31'11111)尺1^4110株係從>1〇]\4(理化學研究 所微生物系統保存設施）取得之植物乳桿菌（L. plantarum) JCM1149株，副乾路乳桿菌（L. paracasei)KW3926株係從 JCM取得之副乾酪乳桿菌（L. paracasei)JCM8132株，副乾酪 乳桿菌（L. paracasei)KW3925株則係從NRIC(東京農業大學） 取得之副乾酪乳桿菌（L. paracasei)NRIC1917株。 選擇做為本發明之有效成分用之乳酸菌時，除抗過敏作 用外，亦可選擇能一併發揮多數乳酸菌具有之整腸作用、 膽固醇降低作用及血壓降低作用等先前已知之益生菌 (probiotics)機能之乳酸菌。又，將為本發明有效成分之乳 酸菌經口投與時，由於乳酸菌到達腸管時效果才能更充分 發揮，可將依上述基準取得之乳酸菌，再於試管中進行對 來自人類腸管之分化細胞Caco-2之接著性之試驗，並選擇 具有更高接著能力之菌株，以取得有效性更高之乳酸菌。 做為本發明之抗過敏用組合物有效成分之一之副乾酪乳桿 菌（L. paracasei)KW3110株，為對消化液有耐性且對腸管附 著性高之乳酸菌，經口投與做為抗過敏劑時兼具特別優良 之上述效果。 將為本發明有效成分之乳酸菌在M. R. S.(de Man, Rogosa, Sharpe)培養基等本技藝人士熟知之乳酸菌培養用培養基中 適當地培養增殖後，以生菌或進行殺菌處理，依照需要冷 凍乾燥或喷霧乾燥而粉末化，可做為本發明組合物之有效 成分使用。又，為了步驟管理，需要時可測定得到之乳酸 菌體之抗過敏活性。亦即，該抗過敏活性之測定方法，可 91125-990127.doc -26- 使用一種「將來自以過敏原敏化之小鼠脾臟之淋巴球懸浮 在含有過敏原之培養基中並添加受檢乳酸菌進行培養時， 測定產生之Thl誘導細胞激素及/或Th2誘導細胞激素之量」 之乳酸菌之抗過敏活性之測定方法。 在本發明中’亦可藉由使本發明之方法取得之具有高抗 過敏活性之乳酸菌發生突變，而製作及使用抗過敏活性高 之突變株。菌株之突變手段，可使用uv等公知之突變手段 來進行’例如具有高抗過敏活性之乳酸菌KW3 11 〇株藉由突 變手段突變，再使用本說明書中記載之乳酸菌抗過敏活性 之#價方法，取得抗過敏活性增加或其他特性被突變成較 佳特性之突變株來使用。又，亦可將KW4n〇株、KW32i〇 株、KW3925株及KW3926株等突變並使用。 (衍生株之篩選） 在本發明中，可從用本發明取得之乳酸菌株中篩選產生 之形質不同之菌株做為衍生株使用。該菌株之篩選方法， 以KW3100為例說明如下：將KW3u〇株使用培養基（如mrs 培養基），在設定溫度進行靜置培養至達到設定菌數，將培 養液用新鮮MRS培養基稀釋後，將本菌體懸浮液在用鹽酸 調為pH 3.0之PBS(將大日本製藥公司之錠劑以指定之濃度 溶解）中懸浮成10%，於3rc培養3小時。將酸處理之菌體懸 浮液用PBS稀釋，在MRS平板培養基上散佈，使菌落形成。 將形成之菌落以色調等做為指標進行筛選，從根據該色調 筛選之菌落再篩選1株，用MRS培養基培養48小時。將該培 養物之杬過敏活性用本發明之抗過敏活性之測定法（實施 91125-990127.doc •27· JO0 γ之方法）進行測定，判定各菌落 方法’從試驗菌株㈣、SS7 — > W1·生。根據5玄 0B ^ ^ . k取仔阿抗過敏活性之菌株。本發 月之4例t分離之KW3U啡之衍生株命名為⑽爾， 為二:::生物之寄存而訂定之布達佩斯條约，寄存於 微生二==::法人產 ^ 寄存編號為BP-08635號，又，寄存於中 華民國（台灣）食品工筆 办 、

91。253號。 …展研-所，寄存編號為BCRC (抗體之製作） f本發明中’為進行含有本發明之具有高抗過敏活性乳 酸菌之製品之品質管理及製造步驟之管理，必須進行本發 明之具有高抗過敏活性乳酸菌之分離及檢測，以及進行該 乳酸菌之鑑定及含量之檢查。可使用以該乳酸菌之分離及 檢測為目的而製作之抗體。與本發明之具有高抗過敏活性 乳酸菌特異性結合之抗體’具體而言如單株抗體或多株抗 體等免疫特異性之抗體’其等可使用上述乳酸菌做為抗 原，藉由常法而製作，然而其中從特異性之觀點而言以單 株k體為較佳。該單株抗體及多株抗體之產生方法可藉 由其本身公知之方法而產生《例如，該產生方法可參照

Koehler，G.及 C. Milstein，Nature: 256，495-497(1975);及 Davis，B.R.，Dulbecco，Η· Eisen，Η· Ginsberg及 W. Wood， Principles of Microbiology and Immunology，第 2卷，Harper & Row, New York，1973。亦即’在該單株抗體之產生中， 例如使用本發明之乳酸菌將小鼠免疫後，將該小鼠之脾臟 91l25-990l27.doc -28- 1324068 細胞與小鼠骨髓瘤（myeloma)細胞融合後，可藉由得到之雜 種細胞瘤（hybridoma)細胞而產生。使用本發明之乳酸菌特 異地結合之抗體，在檢測本發明之乳酸菌時，可使用公知 抗體採用之免疫學檢測法而實施。該免疫學測定法，可為 例如RIA法、ELIS Α法或螢光抗體法等公知之免疫學測定 法。 (為本發明有效成分之乳酸菌之抗過敏作用） 過敏症係藉由抗原刺激產生IgE抗體’ IgE抗體與組織内 肥大細胞及血中嗜鹼球表面之Fc受體結合，下次抗原刺激 (過敏原之再侵入）時，被與肥大細胞及血中嗜鹼球表面結合 之IgE抗體所辨認，與]：gE抗體間形成交聯，以此種刺激做 為引發點，藉由肥大細胞及嗜鹼球之化學調節因子爆發般 地游離，出現各種症狀。因此，為達到過敏症之預防治 療’抑制IgE，繼而增強Thl免疫並抑制Th2免疫為必要之手 I又。本發明之乳酸菌在使用小鼠淋巴球之試管系統中，強 烈地誘導為Thl免疫指標之介白素12 (IL_12)產生，同時強 烈地抑制為Th2免疫指標之介白素4 (IL_4)產生。因此，本 發明之乳酸菌基於所謂「藉由增強ΤΜ免疫並抑制Th2免 疫，以抑制IgE抗體產生」之作用機制而具有過敏之治療. 預防效果。 因此，本發明之抗過敏用組合物特別對花粉症、異位性 皮膚火支氣官性氣喘、過敏性鼻炎或過敏性結膜炎等環 境過敏發揮效力。X，為本發明之乳酸菌除上述抗過敏活 之外，並兼具多數乳菌被稱道之整腸作用、膽固醇降 9H25-990127.doc •29- 1324068 低作用及血壓降低作用等先前已知之益生菌（probi〇tics)機 能；為本發明有效成分之一之KW3 110除強抗過敏.免疫賦 活活性之外’可確認有關對腸管細胞之接著性，對胃酸及 膽汁酸之耐性亦優良，從上述益生菌機能方面而言，其效 果更可期待。 (本發明之抗過敏用組合物之投與） 本發明之抗過敏用組合物，可藉由將得自本發明之有效 成分與生理學上容許之載體、賦形劑、結合劑或稀釋劑等 混合進仃製劑化，做為抗過敏劑使用。本發明之抗過敏劑 可經口投與或非經口投與。經口劑如顆粒劑 '散劑、鍵劑（包 括糖衣錠）、丸劑、膠囊劑、糖漿劑、乳劑或懸浮劑。非經 口劑如注射劑(例如皮下注射劑、靜脈内注射劑、肌肉内注 射J或腹腔内注射劑）、點滴劑、外用劑(例如經鼻投與製 劑、經皮製劑或軟膏劑）、或栓劑（例如 劑）。此等製劑可藉由該領域中通常採行之手法， 谷_形劑或添加劑一起進行製劑化。再者，當製劑化 時，本發明之抗過敏肋合物為在身體中適時 =能(:即控制開始溶出時間…加做為苦味遮蔽:丨 33= 高對氧及濕氣之安定性，形成例如專利 之被覆處 之酵母細胞壁為主成分之被覆劑進行被覆 理物，或依照固定方法以軟膠囊 進行膠囊化所得到之膨壹麻f ^襄之方式 康食品之領域二=，可同時適用於醫藥製劑及健 結合劑'夫料谷许之職形劑或添加劑，如載體、 ϋ衝劑 '料劑、著色劑、安定劑、乳化 91125-990127.doc 劑、分散劑、縣、、拿 ^ U/予化劑或防腐劑等。藥學上容許之載體， 例如碳酸鈣、砀押私 取體 3次鎂、滑石粉、砂糖、乳糖、果膠、糊 積、版粉、明勝、 夕 西黃蓍膠（tragacanth)、曱基纖維去、始 曱基纖維素鈉、倍 ’、殘 , ^低搶點蠟或可可奶油等。 製劑可依照例如以下之方式製造。亦即，經口劑 效成分中添加你丨、_， ' ^ 賦•形劑（例如乳糖、白糖、殺粉或甘露 醇）朋散軸如錢㉟或纖維賴）、結合劑（例如 ^㈣伯膠、緩甲基纖維素、聚乙稀H各咬酮或 經丙基’戴、’#素）或潤滑劑（例如滑石粉、硬脂酸鎮或聚乙二醇 6000)並壓縮成形，繼而依照需要，針對味道遮蔽、腸溶性 或持續性之目的，藉由本身已知之方法進行被覆而製造。 被覆劑可使用例如乙基纖維素、，£甲基纖維素、聚氧乙二 醇、纖維素乙酸酯鄰苯二甲酸酯 '羥丙曱基纖維素鄰苯二 曱酸酯及Eudragit(德國Rohms公司製’曱基丙烯酸.丙烯酸 共聚合物）等。 注射劑可藉由將有效成分與分散劑（例如吐溫8〇(τ^α 80)(AtlaS製粉公司製，美國）、HC〇6〇(曰光化學公司製）、 聚乙二醇、叛甲基纖維素或褐藻酸鈉等）、保存劑（例如對經 基苯甲酸甲醋 '對經基苯甲酸丙醋、节醇、氣丁醇或齡）或 等張化劑（例如氣化納、甘油、山梨醇、葡萄糖或轉化糖） 等共同溶解、懸浮或乳化於水性溶劑（例如蒸館水、生理食 鹽水或林格氏液等）或油性溶劑（例如撖欖油、麻油、棉籽 油、玉米油或聚丙二醇)等而製造。此時’亦可依照需要添 加溶解輔助劑（例如水楊酸鈉或醋酸鈉）、安定劑（例如人類 91125-990127.doc 1324068 血清白蛋白）或無痛化劑（例如氯化苄烷銨（benzaik〇nium chloride)或“魯卡因（pr〇caine)鹽酸鹽）等添加劑。 外用劑可藉由將有效成分做成固狀、+ m狀或液狀之組 合物而製造。例如，可藉由將有效成分原樣或者添加賦形 劑（例如乳糖、甘露醇、澱粉、微結晶纖維素或白糖）或增黏 劑（例如天然橡膠、纖維素衍生物或丙烯酸聚合體）等並混 合，形成粉狀而製造。上述液狀之組合物可依照與注射劑 t情況幾乎相同之方式製造。半固狀之組合物可為水性或 油性之凝膠劑，或者軟骨狀者。又，此等組合物任一種亦 可含有pH調節劑（例如碳酸、磷酸、檸檬酸、鹽酸或氫氧化 鈉）或防腐劑（例如對氧安息香酸酯類、氣丁醇或氯化苄烷銨） 專。权劑可藉由將有效成分做成油性或水性之固狀、半固 狀或液狀之組合物而製造。該組合物中使用之油性基劑， 如高級脂肪酸之甘油化物[例如可可脂或Wheps〇i類 (Dynamh-Nobel公司製）]、中級脂肪酸[例如Migly〇i類 φ (Dynamit-Nobel公司製）]或植物油（例如麻油、大豆油或棉 軒/由）水性.基劑如聚乙二醇類或丙二醇。又，水性凝膠基 劑如天然橡膠、纖維素衍生物、乙烯基聚合體或丙烯酸聚 合體。 (添加於飲食品之利用） 本發明之抗過敏組合物可添加於飲食品中，做為具有抗 過敏機能之飲食品。本發明之抗過敏組合物添加於飲食品 使用時，可將其有效成分之有效量在飲食品之製造原料階 段或製造後之成品階段添加並混合。其中「有效成分之有 91125-990127.doc •32- 1324068 效量」意指攝取各種飲食品通常食用之量時，在以下之範 圍内攝取有效成分之含量。 亦即，本發明之有效成分於飲食品中有效量之投與量戋 攝取量，可依照接受者、接受者之年齡與體重、症狀、投 與時間、劑型、投與方法、或藥劑之組合等而決定。例如， 將本發明之有效成分做為醫藥經口投與時，成人每1人平均 為0.1-100 mg/kg體重（而以卜1〇 mg/kg體重為較佳）之範 圍，非經口投與時，為〇〇1_1〇 mg/kg體重（而以〇mg/kg 體重為較佳）之範圍，可分為—日⑴次投與。與本發明之

有效成分組合使用之具有其他作用機能之藥劑可分別e 其臨床上制之用量為基準而適宜地決定。本發明之有贺 成分於飲食品中有效量之投與量或攝取量，若用乳酸菌之 菌數表示，每一日平均之攝取量以5χΐ〇9個以上為較佳，而 乂1 10個以上為更佳，以攝取以5χΐ〇10個以上為特佳。因 此’配合通常每一曰平均攝取之飲食品之量可決定各種

食品平均含有之乳酸菌菌數。例如，做為食品(優路乳)攝取 時，可依照成人每1A1日平均為5G5GG g之範圍（而以

Wg之範圍為較佳）之攝取量，將本發明之有效成分添 加於食品。 在本發明中，可將本發明抗過敏用組合物之有效成分以 原樣或上述製劑形態添加於飲食品令。更具體而言，本發 =飲食品’可將本發明之有效成分添加於 ::製：為飲食品:或者再添加各種蛋白質、糖類、脂肪、 H、或维生素等’做成液狀、半液體狀或固體狀，再 9lI25-990127.doc -33- 1324068 ^，亦可添加及混合於一般飲食品等，及採用各種利用形 先前’在利用乳酸菌之飲食品之領域中，其活用之形態 可分為乳製品類、肉類、麵包類'飲料及蔬菜類。使用: 發明之具有抗過敏活性之乳酸菌，在此等利用乳酸菌之飲 食品之製造巾做為該乳_或成為其之—部份，或者做^ 製造該飲食品之添加物，可賦予該飲食品抗過敏機能。 本發明之其他實施形態，當於飲食品中添加為有效成分 之乳酸菌時，若乳酸菌本身之發酵並非必要，i意圖保: 飲食品本身之香味時，以將乳酸菌進行例如加熱殺菌之殺 菌處理後再使用為特佳…本發明之具有高抗過敏機能 之飲食品’為防止其他微生物或異物混入’保持内容物之 品質’以充填於密封容器内之飲食品形態進行製造為較佳。 本發明之食品，使其具有抗過敏機能，可調製做為健康 食品、機能性食品、特定保鍵用食品或病患用食品。又， 食品之形態並無特別限定’只要使其具有抗過敏機能之飲 料形L即可。由於本發明之有效成分具有抗過敏作用，在 曰常攝取之食品、或做為補品攝取之健康食品或機能性食 品等中添加本發明之有效成分，可提供能持續性地攝取， 並兼具過敏症之預防及治療機能之食品。使用本發明之具 有高抗過㈣性之乳酸菌添加於例如茶葉、飲 之飲食品中，由於其中不含引起過敏之成分，可提= 敏問題完全遮斷而具有抗過敏機能之飲食品。X，本發明 中藉由將使用酸菌製造或含有乳酸菌之飲料或食品之乳 91125-990127.doc •34· 1324068 酸菌一部份或全部以本發明之具有高抗過敏活性之乳酸菌 代替’可做為具有高抗過敏機能之飲料或食品。 (飲食品製劑形態之利用） 在本發明中，添加本發明之具有高抗過敏活性之乳酸菌 之健康食品及機能性食品，雖有各式各樣，然而關於此等 健康食品及機能性食品之製造，除通常之食品原料及食品 添加物之外，亦可使用賦形劑、增量劑、結合劑、崩解劑、 潤滑劑、分散劑、保存劑、濕潤劑、溶解輔助劑、防腐劑、 安定劑及膠囊基劑等輔助劑，並利用各種飲食品製劑形籲 悲。忒輔助劑之具體實例，例如可添加乳糖、果糖、葡萄 糖、澱粉、明膠、碳酸鎂、合成矽酸鎂、滑石粉、硬脂酸 鎂、碳酸鈣、甲基纖維素、羧甲基纖維素或其鹽、阿拉伯 膠、聚乙二醇、糖漿、凡士林、甘油、乙醇、丙二醇、檸 檬酸、氣化鈉、亞硫酸鈉、磷酸鈉、出芽短梗孢糖（pullulan)、 角叉菜膠（carrageenan)、糊精、還原帕拉金糖（palatin〇se)、 山梨糖醇，木糖醇、甜菊（stevia)、合成甜味料、檸檬酸、抗 壞血酸、酸味料、碳酸氫鈉、蔗糖酯、植物硬化油脂、氣化 # 鈣、葵花籽油、蜜蠟、大豆卵磷酯或香料等。關於此種健康 食品及機能性食品之製造，可參考醫藥品製劑之參考書，例 如「日本藥局方解說書（製劑總則）」（廣川書店出版）等。 本發明中適合之健康食品及機能性食品之形狀，可為例 如錠片狀、膠囊狀、顆粒狀、粉末狀、懸浮液狀或乳化液 狀’尤其’添加本發明之具有高抗過敏活性之乳酸菌之健 康食品及機能性食品，從本發明為解決之課題之觀點而 91125-990127.doc -35· g ’以與不含㈣性之特定原㈣之原材㈣合為較佳。 若具體地舉例說明錠片狀健康食品及機能性食品之製造 法’可將添加本發明之具有高抗過敏活性之乳酸菌之組合 物®縮而製造，或者將用水或如醇之溶媒濕潤之混合物， 做成-定形狀或流入一定形狀之模型中而製造。若具體地 舉例說明膠囊狀健康食品及機能性食品之製造法，可將添 加本發明之具有高抗過敏活性之乳酸菌之組合物以液狀、 懸浮狀、糊狀、粉末狀或顆粒狀等形狀充填於膠囊，或者 用膠囊基劑破覆成形而製造，可有硬膠囊劑及㈣囊劑等。 (添加於食品） +又，在本發明中，將本發明之具有高抗過敏活性之乳酸 菌添加在食品中，可調製成具有高抗過敏機能之食品。該 飲食品具體而言，如布丁、小甜餅'薄脆餅乾、薯條、餅 軋蛋叙、巧克力、油炸圈餅、果减等西式糖果、煎餅、 ，羹、豆銘年糕、豆沙糯求飯糊、其他饅頭、蛋糕（castella) 等曰本糖果、冷藏冰果（餘等）、或口香糖等麵包糖果類；烏 龍麵、蕎麵或寬麵條等麵類；魚糕、看、肉火腿、或魚肉香 腸等魚肉煉H火腿、香腸、漢堡、或鹹牛肉（⑽n beaf) 等畜肉製品；鹽、胡椒、味增、醬油、調味醬、沙拉醬、 蛋兴醬、蕃莊醬、甜味料或辣味料；明石燒、章魚燒、紋 紗燒（食品名）、御好燒（日式什錦煎餅）、燒烤薔麵或燒烤烏 ㈣等鐵板燒食品；乳路、或硬f優胳乳等乳製品；納豆、 炸丑腐且腐、碎翁、丸子、醉漬物、怕煮（一種熬煮味濃 之小菜）、飲子、燒賣、油炸丸、三明治、披薩、漢堡或沙 91125-990127.doc -36 · 。等各種綜合菜類；或各種粉末（牛肉、緒肉或雞肉等畜產 品’蝦、帆立貝、蚌、或昆布等水產類；蔬菜或果實類， 植物酵母或澡類等）、或將油脂類或香料類（香草、柑桔類 或經2、等）進行粉末@形化者；或粉城食品（速食★啡^ 食紅茶、速食乳、速食湯或味噌湯等）等各種食品然而並 不以此為限。 尤其，乳製品中含有本發明之有效成分時，亦可於乳原 料中添加本發明之有效成分做為生菌並進行菌增殖/發 酵’製成優酪乳等發酵乳酸菌食品。 (添加於飲料） 本發明之高抗過敏活性之組合物，尤其以飲料形態使用 時，提供可每曰持續地攝取，並且該可持續攝取之量能發 揮效能之具有抗過敏機能之飲料。將本發明之具有高抗過 敏活性之乳酸菌添加於飲料時，為調製保持飲料本身香味 並且有安定物性之飲料，以將乳酸菌進行加熱殺菌之形式 使用為較佳β 將本發明之具有高抗過敏活性之乳酸菌添加於飲料時， 乳酸菌之添加量可適宜地決定，然而通常採用可做為每日 持續攝取之飲料，並且該乳酸菌具有之抗過敏活性可充分 發揮之添加量。本發明之有效成分於飲食品中有效量之投 與i或攝取量’若用乳酸菌之菌數表示，每曰平均之攝取 量以5xl09個以上為較佳，而以1χ1〇ιο個以上為更佳，以攝 取以5χ1010個以上為特佳。因此，配合通常每日平均攝取 之飲食品之量’從上述指標可決定各種食品含有之平均乳 91125-990127.doc -37- 1324068 酸菌菌數。例如，若每日平均攝取1〇〇 g之飲料，則以每_ 淡料中平均添加W個以上菌數為較佳。另一方面乳酸 囷之添加若考慮無損於香味及外觀範圍，則以1〇11個以下為 較佳。因此，具有抗過敏機能，且有安定性，又嗜好性及 保存性高之飲料中乳酸菌之濃度，對平均每飲料而言 以ι〇Κ個之範圍為特佳。再者’關於乳酸菌菌體數： 乾燥菌體重量之關係、，例如副乾路乳桿菌⑺，…㈣ KW3110株，菌體數1〇〗2個相當於乾燥菌體重量丨卜 本發月巾添加本發明之具有高抗過敏活性之乳酸菌 之飲料’可為各種種類，製造此等飲料時，，亦可使用通常 飲料配方設計中使用之吞斗沐、I& 使用之杳枓果汁或食品添加物等。關於 飲料之製造’可參考現有之參考書，例如「改訂新版軟飲 料」（光琳股份有限公司）等。 在本發明中尤其適合添加之飲料，從抗過敏作用以及製 品之保存及安定化之觀點而言，以不含乳成分，亦即例如 加入果汁之清涼飲料或茶飲料等未添加乳成分方式之飲料 為特佳。 添加之飲料之具體實例，如酒精飲料（威士忌、波旁威士 心（bourbon)、洛館酒（spirit)、甜露酒、葡萄、酒、果實酒、 本酒中國/酉、燒酒、啤酒、酒精度1%以下之無酒精啤 酒、發泡酒或酒胚等）、非酒精飲料（飲料類型之優赂乳、蘋 果▲柑桔％萄、香煮、梨子'梅子或西瓜等果汁，蕃祐、 胡蘿菜、頁瓜等蔬菜汁、清涼飲料、牛乳、豆乳、 咖：、可可、紅茶、綠茶、麥茶 '黑米茶、煎茶、玉露茶、 文口才、烏龍命、普；4命、南非紅茶⑽…）、玫瑰茶、 91125-990J27.doc •38· 1324068 菊花茶、薄荷茶、茉莉菲欠望 — !化木#各種香卓余，運動飲料、礦 泉水或營養飲料等）各種飲料。 〃 /由飲料分類舉例說明，可有綠茶、烏龍茶、紅茶、麥 余、或混合茶等茶系飲料，以及咖啡、加果汁飲料、蔬菜 飲料、運動飲料及營養飲料。.瓜 具有抗過敏機能之飲料製品化時，可根據食 口口衛生法規疋，適宜地進行飲料之殺菌。該殺菌方法，可 2據飲狀PH，分別使用巴斯德殺菌 '熱包裹殺菌、而 叙fe或殺函爸（ret；ort)殺菌等。 再者’關於製品形態，以通常飲料之製品形態所用之裝 入密封容器之飲料形態為特佳，該密封容器可為罐'瓶： PET或、.氏u何—種形態。又，有關容量亦無特別限定， =而言可考慮消費者曰常攝取飲料之量、添加之乳酸菌 菌數及一日必要之菌數而適宜地決定。 以下:藉由實施例更詳細地說明本發明，然而本發明並 不因其等而受到何限制。 [實施例1] (本發明之實施例中使用之乳酸菌） 本發明之實施例中使用之乳酸菌，其取得如圖1(N01) 及圖2(Ν〇·2)所示。本發明中所有菌株雖可藉由KW起頭之 編號而識別’然而此等試驗株由於有獨自單離者，市售乳 製品使用者，或公家機關等取得者等，為方便起見均附上 統-識別名稱，各種KW株與取得來源之關係如圖（版！） 及圖2(N〇.2)。該圖1之「取得前」中「心」表示理化學 91J25-990127.doc -39· 研究所微生物系統保存設施，Γ IF0」表示前財團法人發酵 研究所（現在為獨立行政法人製品評價技術基盤機構生物 資源中心（NBRC))。 [實施例2] (乳酸菌群之試管中抗過敏活性之評價） 1. 試料 將乳西夂囷各函株用M· R. S.(de Man，Rogosa，Sharpe)培養 基（OXOID)培養48小時，用滅菌水洗淨3次，懸浮於滅菌水 後在10 0 C處理3 0分鐘’殺菌。將其冷；東乾燥，並懸浮於 PBS。使用之乳酸菌參照圖（Ν〇· 〇及圖2(N〇. 2)。 2. 實驗動物及飼養 對7-10週齡之BALB/c小鼠（Charles River公司）於第〇日及 第6日用卵白白蛋白（〇VA)1 mg與為佐劑（adjuvant)之Alum 2 mg共同地進行腹腔内注射。於第13日解剖，將脾臟單離 並調製淋巴球。實驗進行n=6次。 3. 脾細胞IL-4及IL-12之測定 IL-4 及 IL-12之測定係使用 〇ptEiA ELISA Set (Becton

Dickinson)進行湏ij 定 〇 4. 實驗條件 將以「2.實驗動物及飼養」之方法調製之脾臟淋巴球在

RPMI1640(SIGMA公司）+10% FCS(R〇che公司）+1 mg OVA 培養基中以2.5χΙΟ6細胞/ml之方式懸浮。再將試驗之乳酸菌 以0.1或1 gg/ml添加。1週後回收培養上清液，分別測定為 Thl細胞激素之il-12及為Th2細胞激素之IL-4。 91125-990127.doc -40- 1324068 5.實驗結果

Thl細胞激素及il-12之各乳酸菌生成量如圖3及表2所 示。乳酸菌之添加量為1 pg/ml。由於菌株不同，可發現各 種產生里之差異。在約100株中’呈現最強之Thl誘導能力 者為副乾酷乳桿菌（L_ paracasei)KW3 110株。數據全部以 KW3110株之IL-12產生量當做100%時之比率表示。為方便 起見，與KW3110株相較，呈現75〇/。以上產生量之株被評價 為A ’呈現50。/。以上而不到75%產生量之株被評價為b，呈 現25°/。以上而不到50%產生量之株被評價為c，呈現1 〇%以 上而不到25%產生量之株被評價為d，呈現1 〇%不到產生量 之株被評價為E。 各乳酸菌之Th2細胞激素及lL-4(為過敏原因）之生成量如 圖4及表2所示。乳酸菌之添加量為〇 ! gg/ml。由於菌株不 同’其抑制效果呈現各種不同之值。在約1 〇〇株中，呈現最 強之Th2抑制能力者為副乾路乳桿菌（L paracasei)KW3 i 10 株。數據全部以對照組（未添加乳酸菌）之IL_4產生量當做 100%時之比率表示。為方便起見，與對照組相較，呈現3〇% 不到產生量之株被評價為A，呈現3〇%以上而不到5〇%產生 量之株被評價為B，呈現50。/。以上而不到7〇。/。產生量之株被 評價為C，呈現70%以上而不到i 〇〇%產生量之株被評價為 D，呈現1 〇〇%以上產生量之株被評價為E。關於Thl及Th2 各個參數，將A至E之評價彙整為「抗過敏乳酸菌評價結 果」’如表1及表2所示。 91125-990127.doc 1324068 [表i]

Thl Th2 Thl Th2 Thl Th2 Thl Th2 KW3118 C B KW4510 A C KW3910 D E KW3817 D B KW3110 A A KW4511 D E KW3914 C B KW3811 A D KW4210 E E KW3812 D E KW3916 E D KW3211 E D KW3510 E E KW3813 C E KW3917 C B KW4010 B B KW3310 E E KW3814 D E KW3918 E D KW3413 C C KW3411 C C KW3815 E E KW3919 D C KW4110 A B KW3211 D C KW3816 C E KW3920 C C KW3513 E D KW2820 C E KW3817 D E KW3921 E C KW3514 E E KW4211 C D KW3818 E E KW3922 E C KW4310 A B KW4610 B C KW3819 E E KW3923 C B KW3210 A C KW3515 E D KW3821 C E KW3924 C C KW3810 D D KW3822 C D KW3311 C B KW3612 E E KW3823 c D KW3114 C B KW3210 E E KW3824 c D KW3115 E D KW3511 E E KW3825 c D KW3116 E C KW3316 D E KW3826 c D KW3117 E D KW3613 D E KW3827 E E KW3313 C B KW3412 D D KW3828 C D KW3118 B A

[表2]

菌株NO. Thl (%oE KW3110) 評價 Th2 (% oE control) 評價 KW 3111 42.1 C 36.3 B KW 3112 43.6 C 48.8 B KW 3113 38.3 c 54.8 C KW 3120 38.8 c 43.9 B KW 3311 19.4 D 55.9 C KW 3315 2.4 B 50.4 D KW 3410 36.7 C 49.2 B KW 3414 11.7 D 74.6 D KW 3212 18 D 70.7 D KW 3927 53.7 B 45.9 B KW 3931 19.3 D 49 B KW 3932 17.9 D 51 C KW 3933 17.1 D 58.1 C KW 3934 8.1 E 48.7 B KW 3929 30.7 C 41 B KW 3938 1.2 B 49.6 C KW 3930 19.5 D 59.7 C KW 3935 5.5 E 63.1 C KW 3936 5.1 B 64 C KW 3926 70.1 B 30.2 B KW 3928 39.2 C 69.8 C KW 3925 77.1 A 45.2 B KW 3939 3.3 E 59.1 C KW 3941 38.3 C 60.3 C KW 4511 21.4 D 134.4 B 9J125-990127.doc -42 - KW 4611 1.3 B 58.4 c ' K.W 4700 3.6 E 109 KAV 4701 2.6 E 138.2 B KW 4702 2.1 E 96.6 D- KW 4703 0 E 103.5 E KW 4704 2.3 E 84.3 D KW 3610 1 E 104 B KW 3212 19 D 67.1 'c KW 3213 65.3 B 54.6 ~c KW 3214 37.2 C 49.6 B KW 3510 0.5 r e 165.5 F KW 3516 Γ 0 E 79.3 KW 3511 0 E 80 _ 若將Thl參數為KW3110株之60%以上，Th2參數為對照組 1324068 之未達50%之菌株視為抗過敏乳酸菌，則該菌株有KW3 11 〇. 株、T株、NRIC1917 株、JCM8132 株及 JCM1149 株共 5株。 又，若將呈現強力Thl誘導能力（KW3 110株之75%以上）之菌 株視為免疫賦活乳酸菌，則該菌株有KW3110株、KW4510 株、JCM1149 株、T株、NRIC1917 株及 JCM1059 株共 6株。 再者’添加該乳酸菌、與KW3 110株具有相等免疫賦活活性 之乳酸菌、或者與KW4510株、JCM1149株' NRIC1917株及 JCM1059株具有相等或其以上免疫賦活活性之乳酸菌之免 疫賦活用組合物（醫藥品或飲食品），可根據本說明書記載之 方法製造。又，已知為抗過敏乳酸菌之嗜酸乳桿菌（L. acidophilus) L-92株之IL-1 2產生量為KW3 11 0株之約 11 _7%，關於IL-4之抑制活性，相對於KW3 110株為對照組（無 添加）之26.4%，L-92株為為對照組之74.6%，此暗示無論哪 一參數，與KW3 110株之強力抗過敏乳酸菌相比，L-92株均 呈現極大落差（圖5)。關於本發明之乳酸菌株及做為對照之 乳酸菌株之抗過敏活性，測定結果如表3所示。 91l25-990127.doc -43- 1324068 [表3] 菌株編號 分類 培養保藏處 Thl Th2 KW3110 副乾酪乳桿菌L14 乳業技術協會 100 26.4 KW4110 植物乳桿菌JCM1149 JCM 93.9 36.7 KW3210 唾液鏈球菌亞種嗜熱T 小岩井 77.7 49.9 KW3925 副乾酪乳桿菌NRIC1917 東京農大 77.1 45.2 KW3926 副乾酪乳桿菌JCM8132 JCM 70.1 30.2 KW4310 腸膜乳桿菌 JCM 57.4 43.4 (Lactobacillus mesenteroides)JCM6124 KW3119 乾酪乳桿菌YA1 雪印 56 27.5 KW3927 副乾酪乳桿菌JCM1053 JCM 53.7 45.3 KW4010 加氏乳桿菌 JCM 53.2 36.7 (Lactobacillus gasseri) JCM1131 [實施例3] (衍生株之篩選） 本實施例為篩選從本發明取得之乳酸菌KW3 11 0株衍生 之具有抗過敏活性之菌株之實例。將KW3 110株在MRS培養 基中，於37°C下，以OD600從0.8達到1.〇為止進行靜置培養。 將培養液用新鮮MRS培養基稀釋，成為〇D600 = 0.5後，將 本菌體懸浮液在用鹽酸調為pH 3.0之PBS(將大日本製藥公 司之錠劑以指定之濃度溶解）中以懸浮成丨〇%，並於37。〇培 養3小時。將酸處理之菌體懸浮液用pB s稀釋，在MRS平板 培養基上散佈，於37°C使菌落形成。將形成之菌落辨認色 調淡者。將其篩選，用MRS培養基培養48小時。將其命名 為No. 90株’將No· 90株用實施例2之方法測定抗過敏活 性。No. 90株與野生株比較，呈現相同程度之IL_丨2產生能 力（圖6)。再者，圖中「比活性（％)」表示將KW3u〇株之IL_12 產生能力當作100時，衍生株（N〇 9〇株）tIL_12產生能力。 該No. 90株寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利 91125-990127.doc -44- 1324068 微生物寄存中心，寄存編號為BP-08635號，又，寄存於中 華民國（台灣）食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910253號。 [實施例4] (試管中高抗過敏活性株KW3 11 0株之身體内評價） 1. 投與試料 將副乾酪乳桿菌（L. paracasei) KW3110株用MRS培養基 培養48小時，用滅菌水洗淨3次，懸浮於滅菌水後在100°C處 理30分鐘，殺菌。將其冷凍乾燥，於標準粉末飼料AIN93(根 據美國國立營養研究所標準組成）中，以可使小鼠每隻每曰 攝取1 mg之方式混合，製作食姆。 2. 實驗動物及飼養 使用8週齡之B ALB/c。使1群6隻B ALB/c小鼠自由攝取 CE-2(曰本Clea公司）及水，進行1週之馴化飼養。於第0曰抗 原敏化後，對照組使用精製原料製作之AIN93粉末飼料飼 養，KW3110株組則於AIN93中摻入KW3110菌代替，製成食餌。 3. 血中IgE、脾細胞IL-4及IL-12之測定

IgE、IL-4及 IL-12之測定係使用 OptEIA ELISA Set (Becton Dickinson公司）進行測定。 4. 實驗條件 將實驗組設定為對照組（AIN93)，以及將KW3110株以可 使小鼠每隻每日攝取1 mg之方式添加於AIN93中之組 (KW3110組）。對照組與KW3110組同樣係將粉末飼料4 g摻 水攪合，每日供應，至實驗終了（第98日）為止。飲水係自由 91125-990127.doc -45- 1324068 攝取。用卵白白蛋白（OVA)進行過敏敏化係於第〇、14、42、 70及94日將100 pg OVA與為佐劑之Alum 2 mg—起予以腹 腔注射，總計進行注射5次。這期間，每1週從眼底靜脈進 行採血。實驗終了時採取全血及摘出脾臟，以調製淋巴球 (圖7)。脾臟淋巴球在rpmI1640(SIGMA公司）+10% FCS (Roche公司）+ 100 〇VA培養基中，以 37。(：，5% C02之條 件培養1週。1週後回收培養上清液。測定血液樣本之IgE 量’以及測定脾臟淋巴球培養上清液之測定IL_4& IL_ i 2。 5.實驗結果 在98日實驗期間血中IgE之變動如圖8所示。第48曰時之 血中IgE值，KW3110組，與對照組相較，呈現血中IgE值有 意義地降低（ρ<0·〇5)。第48曰及解剖時之第98曰之血中IgE 量如圖9之點圖所示。第98日時之KW3 110組，與對照組相 較，亦呈現血中IgE值有意義地降低。對照組及KW3丨丨〇組 於第98日解剖時’脾細胞培養中之IL_丨2產生量如圖丨〇所 示，IL-4產生量如圖11所示。關於IL_4，雖未連有意義差異， 然而與對照組相較，呈現降低之傾向。以上結果暗示藉由 攝取KW3110,體内平衡向Thl移動，過敏狀態得以改善。 又，如圖12所示，第30日時對照組無例外地出現鼻週邊之 脫毛，而KW3110組則無例外地未發生脫毛。此時，可在對 知、組中觀察到小既頻繁地用鼻搔癢之動作。kw3丨1 〇組則係 在第60曰左右才觀察到與對照組同樣之鼻週邊脫毛及用鼻 搔癢動作。該用鼻搔癢動作之觀察結果暗示KW3u〇組確可 抑制過敏之症狀。 91125-990127.doc -46- 1324068 [實施例5] (與公知之抗過敏乳酸菌KW46 10株[鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus) LGG株]之比較） 1. 投與試料 將KW3110株及KW4610株用MRS培養基培養48小時，用 滅菌水洗淨3次，懸浮於滅菌水後在100°C處理30分鐘，殺 菌。將其冷凍乾燥，於標準粉末飼料AIN93(根據美國國立 營養研究所標準組成）中，以可使小鼠每隻每日攝取1至1 〇 mg之方式混合，製作食僻。 2. 實驗動物及飼養 使用8週齡之B ALB/c。讓1組6隻B ALB/c小鼠自由攝取 CE-2(日本Clea公司）及水，進行1週之馬ι|化飼養。從抗原敏 化第21日前，分別讓其攝取KW3110株、KW4610株之混合 食餌或者AIN93粉末飼料。 3 .血中IgE之測定

IgE之測定係使用 OptEIA ELISA Set (Becton Dickinson公 司）進行測定。 4.實驗條件 實驗組設定為對照組（AIN93)，及將KW3 11 0株或KW46 1 0 株以可使小鼠每隻每日攝取1或10 mg之方式添加於AIN93 之組（KW3110組及KW4610組）。對照組、KW3110組及 KW46 10組同樣地將粉末飼料4g摻水攪合，每日供應，至實 驗終了（第133日）為止。飲水係自由攝取。用卵白白蛋白 (OVA)進行過敏敏化係於第0、14、42、70、98及126日將100 91125-990127.doc • 47-

Pg OVA與為佐劑之Alum 2 mg予以腹腔注射，總計注射6 次。這期間，每1週從眼底靜脈進行採血（圖13)。對血液樣 本測定IgE量。 5.實驗結果 將在實驗期間血中][gE量之變動示於圖14中。將〇VA第5 次及第6次投與後之每個體血中IgE量示於圖1 5之點圖中。 雖然確認在所有群中’以〇VA抗原敏化之同時血中IgE濃度 均上升，然而KW3 110組從OVA第5次投與後可觀察到與對 照組相較’ IgE量有意義地降低。另一方面，KW4610組無 法觀察到對對照組有意義之IgE量之降低，暗示KW3110株 之抗過敏活性更強。又，暗示丨〇 ^^攝取組比1 mg攝取組有 更強之IgE降低效果❶ [實施例6] (乳酸菌之耐酸性及耐膽汁酸性） 為使礼酸菌活著到達腸管，發揮益生菌之效果，對胃酸 及膽汁酸等消化液必須具有耐性。為驗證1丨〇株是否為 滿足此條件之菌株，測定在試管中之耐酸性及耐膽汁酸性。 1. 方法 耐馱性係將礼酸菌培養至對數增殖後期後，用pBs(pH 6·5)以OD600-0,5之方式調整之菌體，以1/1〇之量添加於以 鹽酸將ΡΗ調整為3.0之MRS培養基，將其於3邝培養。培養 開始後1小時、2小時及3小時進行取樣，測定MR㈣脂培養 基中之生菌數。 2. 實驗結果 91125-990127.doc -48- 耐膽汁酸性係將膽汁酸（〇X〇〗D公司，Bile Salts)以最終 濃度為2%之方式添加於MRS液體培養基中，然後將 KW3110株以1%接種於上述培養液中，藉由使用東方儀器 公司之BIOPLOTTER測定OD630，以測定繁殖速度。 在任一實驗中’均使用為德氏乳桿菌（L. delbrueckii)基準 株之KW3317株（JCM1012株）做為對象。結果，耐酸性試驗 (圖16)暗示縱使於培養3小時之時亦有約5 〇%之kw3 11 〇株 生存。又’耐膽汁酸試驗（圖17)顯示縱使在含有2%膽汁酸 之培養基中KW3 11 0株亦充分地繁殖，顯示對膽汁酸具有耐 性。另一方面，暗示KW33 17株對酸及膽汁酸之耐性均低。 [實施例7] (乳酸菌之腸管接著性） 為使生存到達腸管之乳酸菌，發揮益生菌之效果’讓該 菌停留於腸管為必要之手段。在試管中對於來自人類腸管 之株化細胞Caco-2之接著性之試驗係經常做為乳酸菌停留 於腸官且充分發揮效果之指標。因此，測定KW3丨丨〇株之 Caco-2細胞接著能力。 1.方法

Caco-2細胞之培養，根據c〇c〇nnier等人之方法（應用及環 境微生物學（Applied and Environmental 奶⑽bi〇i〇gy)， 1992年，第58卷，2034頁）進行。將！ 2xl〇4/cm2個心〇_2細 胞在載玻片上培養約1-2週，至達融合後（p〇st⑽加⑽狀 態。關於KW3110株，係使用在MRS培養基中於37<>c培養 2晚後進行集菌’然後用PBS洗淨丨次後，用pBs調至°成 91125-990127.doc •49- 1324068 OD600=1.0者。於調製之KW3110液2 ml中，將培養Caco-2 細胞之載玻片浸入，使其在37°C，10%二氧化碳存在下接 觸卜J、時，然後將載玻片用DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培養基洗淨3次。繼而將載玻片用曱醇固定 後，以革蘭氏染色法（藥物技術（Medical Technology)，1995 年，第23卷，205頁）將KW3 110株染色。對其進行鏡檢，計 算附著於Caco-2細胞之乳酸菌數，求取4個視野之平均值做 為接著數。又，對於以KW3913株（JCM8130株）及KW3115 株（JCM1134株）（為基準株）為首之副乾酪乳桿菌（L. paracasei)及乾酷乳桿菌（L. casei) 1 5株亦進行同樣之檢討。 2.實驗結果 各乳酸菌對Caco-2細胞之接著能力之試驗結果如表3所 示。Ouwehand氏等報導副乾赂乳桿菌（L. paracasei)及乾路 乳桿菌（L. casei)對Caco-2細胞之接著能力低（食品為生物學 及安全性（Food Microbiology and Safegy)，2001年，第 66 卷，856頁），此次之實驗，亦發現KW3 11 0株以外之菌株， 接著能力降低。然而，KW3 110株在副乾酪乳桿菌（L. paracasei)及乾酿乳桿菌（L. casei)中，明顯地呈現高Caco-2 細胞接著能力，此暗示其為可期待具有優良益生菌 (probiotics)效果之菌株。 KW3110 KW3913 KW3115 KW3914 KW3915 KW3917 KW3918 KW3919 每個視野中 之平均菌數 243 8 7 17 6 17 3 27 KW3920 KW3921 KW3923 KW3924 KW3915 KW3910 KW3911 KW3912 每個視野中 之平均菌數 23 16 15 21 39 28 14 3 91125-990127.doc -50- 1324068 [實施例8] (KW3U0株對使用花粉抗原之花粉症及呼吸道發炎之改善 效果） 1.實驗方法 (動物種類） 購入BDF1雌性小鼠，4週齡（CharlesRiver公司）。 (實驗群） 貫驗A .點鼻造成抗原敏化（花粉症模型） 對照組：投與標準飼料（AIN-76基質）之組 KW組.投與 KW 1 mg/小鼠（1 mg KW3H0/3 g ain_76* 質）之組 實驗B:藉由噴霧器（nebuUzer)進行抗原敏化（呼吸道發炎 模型） 對,¾組.投與標準飼料（AIN-76基質）之組 KW 組：投與 KW 1 mg/小鼠（1 mg KW3110/3 g AIN-76 基 質）之組 (試藥·機器） 杉花粉萃取物CP(LSL公司） ALUM (Sigma公司） 超曰波式噴務器（nebulizer)-U12(Omron公司） 集細胞離心機· Cytospin 4 (Thermo Bio Analysis公司） (評價方法）

實驗A 購入BDF-1小鼠後進行1週馴化，將藉眼窩採血得到之血 91125-990127.doc 51 1324068 漿依原本血中總IgE濃度進行分組（n=7)。分組後，開始投與 實驗食物。再從分組後第3週開始，經由腹腔内投與方式投 與 CP+ALUM 溶液（CP 10 pg+ALUM 2 mg/小鼠），每週 1次， 共計投與3週。從第3次投與CP+ALUM溶液後第2週開始， 對小鼠兩鼻以CP溶液（1 mg/ml)點鼻，每次10 μΐ。又，以生 理食鹽水點鼻之小鼠做為未刺激模型（Basal)。點鼻實施5 曰，計算點鼻後5分鐘之喷嚏次數（第1、3及5日）及鼻部搔癢 次數（第3及第5曰）。

實驗B 購入BDF-1小鼠後進行1週馴化，將藉眼窩採血得到之血 漿依原本血中總IgE濃度進行分組（n=7)。分組後，開始投與 實驗食物。再從分組後第3週開始，經由腹腔内投與方式投 與CP+ALUM溶液（CP 10 pg+ALUM 2 mg/小鼠），每週 1次， 共計投與3週。從第3次投與CP+ALUM溶液後第2週開始， 在密閉容器内用喷霧器對小鼠喷CP溶液（40 pg/ml)15分 鐘。又，以生理食鹽水進行噴霧之小鼠，做為未刺激模型 (Basal)。該喷霧實施5日。又，於經腹腔内投與CP時（第0 曰）、噴霧開始時（第35曰）及解剖時（第40曰）進行眼窩採 血，測定血中總IgE濃度。於第5曰在麻醉下回收支氣管肺 泡洗淨液（BALF)，計算BALF中之細胞數、鑑定BALF中之 細胞及測定B ALF中之細胞激素。B ALF係在麻醉下切開小 鼠頸部並在呼吸道中插管，然後用添加0.1 % BSA之生理食 鹽水0.7 ml洗淨3次（總計2.1 ml)而得。回收離心後之上清液 及細胞，計測細胞之細胞數。製作塗抹標本，藉由萊特. 91125-990127.doc -52- 金沙（Wright . Giemsa)染色法鑑定細胞。 2.實驗結果 (實驗A) 關於點鼻後5分鐘之噴嚏次數’由於考慮物理刺激之影 響，因此以點鼻後〇，丨分鐘、丨_5分鐘及總次數三種方式來評 價。結果，相較於以生理食鹽水點鼻幾乎未呈現噴嚏症狀， 對照組隨著反覆點鼻而增加噴嚏頻率。另一方面，可發現 kw組傾向於抑制噴嚏症狀（圖18a、b、c)。又，關於鼻部搔 癢動作，將點鼻後5分鐘之連續搔癢動作當做丨點（計算總點 數）。又，亦分為輕度搔癢（連續丨_4次之搔癢動作）及重度搔 癢（連續5次以上之搔癢動作）之情況進行點數評價。與對照 組比較，KW組之搔癢動作被抑制，在第5日之輕度之點數 方面，亦可發現有意義之抑制。 (實驗B) 喷霧前及解剖時，與對照組相較，KW組有意義地抑制血 中總IgE濃度之上升(圖2〇)qBALF中之細胞種類在通常狀態 幾乎為以巨噬細胞為主之單核球。然而由於抗原刺激，對 照組織BALF中嗜酸球佔約65%左右，單核球比率減少。另 一方面，KW組與對照組相比，有抑制嗜酸球％上升之傾向 (圖21a)。又，在嗜酸球數方面，同樣可發現組與對照組 相比，有抑制嗜酸球浸潤於局部部位之傾向（圖2ib)〇 又，測定BALF上清液中之細胞激素時，擔任嗜酸球之增 殖及分化之Th2細胞激素，即IL_5，與對照組相比，kw組 呈現低值（圖22)。 91125-990127.doc -53- 1324068 以上結果暗示藉由攝取KW3 11 〇，可抑制即時型過敏中與 花粉症臨床症狀相近之杉花粉抗原引起之噴嚏動作及搔癢 動作。又，對於暴露於抗原造成之呼吸道發炎，KW3 11 〇 藉由抑制IgE上升，可抑制肺部位之IL_5產生並抑制嗜酸球 之浸潤。IL-5與哞吸道發炎及嗜酸球之關係如j Allergy

Chn，Immunol.，88(6)，935-942, 1991 所述，此種情況顯示投 與KW3 11 0對呼吸道發炎為主要症狀之過敏性氣喘有效。 [實施例9] (KW3 11 0株對異位性皮膚炎模型小鼠之改善效果） KW3 11 0株對異位性皮膚炎模型小鼠之改善效果之驗 證，係使用藉由塗布三硝基氯苯（picryl chl〇ride)引起異位 性皮膚炎模型（引用文獻.應用藥理，59(6)，123-134， 2000) ° 1.實驗方法 (動物種類） 購入NC/NgaTndCyj雄性小鼠，5週齡（Charles River公司）。 (實驗群） 對照組：投與標準飼料（AIN-76基質）11週之組 KW 1 mg-11 wk組：投與 1 mg KW3110/3 g AIN-76基質 11 週之組 KW 10 mg-11 wk組：投與 10 mg KW3110/3 g AIN-76基質 11週之組 KW 1 mg-8 wk組：投與標準飼料3週後，投與1 mg KW3110/3 g AIN-76基質 8週之組 91125-990127.doc -54- 1324068 (試藥） 三硝基氯苯（picryl chloride) : PCI(東京化成工業公司） 敏化用溶液：5 %溶液（乙醇：丙酮=4 : 1) 腹部…100 μΐ、後肢部...25 μΐ兩足 激發（challenge)用溶液：ο』％溶液（橄欖油） 耳殼部…兩面兩耳各1〇 μ1(合計4〇 μΐ)、背皮部5〇 μ1 (評價方法） 購入NC/Nga小鼠後進行1週馴化，將藉由眼窩採血得到 之血清依原本血中總IgE濃度進行分組（n=1 〇)。分組並開始 投與實驗食物3週後，將？(：1敏化用溶液塗布於剃毛後之腹 部及後肢部兩側，繼而於i週後將激發用溶液塗布於兩耳殼 部·兩面及背皮部，進行激發。此種激發在丨週中合計實施 77次。又，為確認激發用溶液之溶媒未造成耳殼肥厚在 塗布撖欖油0、1、4、24、72、96、120、144及168小時後 用指針式厚度計（dail thickness gauge)測定耳殼肥厚。再 者’激發第1次及第3次後’同樣地於〇、1、4、24、72、96、 120、144及168小時後用指針式厚度計測定耳殼肥厚，評價 浮腫。又，敏化後每週實施眼窩採血，評價每週2次之臨床 計分。最後從第7次激發丨週後將其宰殺，回收血清及耳殼 部組織。關於血清，測定IgE濃度，關於耳殼部組織，實施 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin)染色及曱苯胺藍（t〇iuidine blue)染色》 (臨床計分） 針對耳殼部之搔癢症、發紅/出血/糜爛、浮腫、擦傷/組 91125-990l27.doc -55- 丄汹068 織缺損、及形成痴皮/乾燥5項，及頭皮部之脫毛、發紅/出 血/靡爛及形成痴皮/乾無3項共8項’以無症狀（〇點）、輕度（1 點）、中度（2點）及重度（3點）進行點數化，合計後評價其計 分。 (統計） 關於統計’係進行分散分析及相對於對照組之Dunnett多 重比較檢定’各個項目以顯著率在5 %以下者當做有意義差 異。 2.實驗結果 血中總IgE濃度，對照組平均從第4週開始大幅地上升， 而所有攝取KW3110之組均抑制其上升，KW 1〇 mg_u wk 組及KW 1 mg-8 wk組從激發第4次開始，KW 1 mg-11 wk組 從激發第6次開始，有意義地抑制上升（圖23)。臨床計分可 確認對照組從早期開始即呈現耳殼及頭皮之病態惡化，亦 即計分之上升。另一方面，所有攝取KW3 11 0之組均抑制其 上升，KW lmg-11 Wk組及KW 10 mg- 11 wk組於激發第2次 後，KWlmg-8wk組於激發第3次後，立即有意義地抑制上 升。只針對耳殼部之臨床計分，及只針對頭皮之臨床計分， 同樣地在所有攝取KW3 110之組中均可見到有意義之差異 (圖24、25及26)。又’從頭部之照片亦可確認耳殼部之糜爛 /組織缺損在攝取KW之組受到抑制（圖27)。 關於PCI激發引起之耳殼肥厚，雖敏化階段實施溶媒塗布 時未發現耳殼之肥厚，然而藉由pci激發可確認耳殼之肥 厚.發紅.浮腫。第1次激發，在對照組中於第1及第4小時 91125-990127.doc -56- 1324068 可見到即時型反應參與之第i相肥厚，於第48小時可見到延 遲反應造成之第2相肥厚，以及於第i2〇至j44小時可見到即 時型反應參與之第3相耳殼部肥厚。另一方面，在3組之 KW3110攝取組中，可見到對於即時型反應參與之第丨及第4 小時之有意義肥厚皆有抑制作用，KW 1〇 mg_u wk組對於 第M4小時之有意義肥厚亦有抑制作用，KW 1 mg-8 wk組對 於第24及144小時之有意義肥厚亦有抑制作用。第3次激 發，對照組於塗布後繼續肥厚，而全部KW3丨丨〇攝取組均有 抑制肥厚之傾向，以及可確認Kw〗mg_u wk組及Kw 1〇 mg-11 wk呈現有意義之抑制（圖28及29)。 耳殼部之病理學評價結果確認：相對於對照組在真皮及 表皮亦出現浮腫等發炎，全部Kw攝取組可抑制該肥厚（圖 3〇)又，藉由甲笨胺藍（toluidine blue)染色評價病理組織， 可確認肥大細胞數在K W攝取組比在對照組少（圖3丨）。 從以上結果可確認KW攝取抑制血中總IgE濃度之上升， 抑制半抗原（haptene)刺激造成之耳殼肥厚，及抑制臨床症 狀之惡化。由此顯示在NC/Nga小鼠中，藉由KW3u〇攝取’ 可得到改善半抗原誘發之異位性皮膚發炎狀之效果。 [實施例10] (在人類中KW3 11 0株對於花粉症之效果） 為驗證KW3110株對於人類之效果，對於花粉症自願者進 行下列之試驗。 1·試驗方法 (試驗試料） 91125-990127.doc -57- 使用實施例2中Thl及Th2兩參數之評價同為E評價之德 氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii) B株或副乾路乳桿菌（l. paracaSei)KW3110株製作優酪乳試製品。其含有菌數2xl〇8 cfu/ml 〇 (試驗對象） 在企業任職之自願花粉症患者28名。本試驗遵照赫爾辛 基宣言事前對全部被驗者進行關於試驗内容及方法之充分 說明，取得其書面之知情同意書（inf〇rmed c〇nsent)後進行。 (試驗組） 將被驗者任意地分為2組。一組係做為對照優酪乳之德氏 乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii) B株優酪乳，另一組為副 乾酷·乳桿菌（L. paracasei)KW3110株優酪乳，一日攝取2〇〇 ml(相當於KW3 110株乾燥菌體4〇 mg)。對於分組之結果， 直至試驗終了為止，進行由第3者管理資料之雙盲試驗。 (試驗期間） 2003年1月20日至4月14日 (測定項目） 於第0週（試驗開始時）以及第4、8、12週（試驗終了時）對 被驗者進行採血。血液係由Falc〇 Bi〇systems(股）公司針對 以下項目進行測定：NK細胞活性、Thl&Th2細胞數之比 (Thl/Th2比）、嗜酸球數、ECp值、血中總IgE量及血中杉花 粉特異性IgE量，將此等數據在試驗終了後進行統計處理而 數據化。 又，被驗者在表中所示之問卷調查表，分為5階段（3+: 91125-990127.doc -58- 1324068 高度，2+:中度，+ :輕度，士：輕微，_:無）而於採血時 答覆。以3 +為4點’ 2 +為3點，+為2點，土為1點，-為〇點， 予以計分化’進行統計處理。 [表5] 項目 開始時之過敏性鼻炎 (花粉症)症狀 開始後之過敏性鼻更~ (花粉症)症狀 流鼻水之症狀 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4-(±) 5.(-) 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4.(土）5.(-) 鼻塞之症狀 U3+)2.(2+) 3.(+) ~~ 4.㈤ 5.(-) 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4.㈤ 5.(-) 喉龍痛之症狀 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4-(±) 5.(-) 1.(3+) 2.(2+) 3·㈩ 4.(±) 5.(-) 喉嚨刺癢之症狀 1.(3+) 2.(2+)3.(+) 4.㈤ 5.(-) 1.(3+)2.(2+)3.(+) ~~ 4.(±) 5.(-) 打喷嚏之症狀 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4.(±) 5.(-) 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4.㈤5.㈠ 眼睛發癢之症狀 1.(3+) 2.(2+)3.(+) 4-(±) 5.(-) 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4.(±) 5.(-) 眼睛充血之症狀 1.(3+)2.(2+)3.(+) ~~ 4·(土）5.(-) 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4.(±) 5.(-) 流淚之症狀 1.(3+) 2.(2+)3.(+) 4.㈤ 5.(-) 1.(3+)2.(2+)3.(+) ~~~ 4-(±) 5.(-) 眼睛痛之症狀 1.(3+) 2.(2+)3.(+) 4.(士）5.㈠ 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4-(±) 5.(-) 眼油流出之症狀 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4.(±) 5.(-) 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4_(±) 5.(-) 眼皮沉重之症狀 1.(3+) 2.(2+) 3.(+) 4.(士）5.(·) 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4.(±) 5.(-) 頭重之症狀 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4.(士）5.(-) 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4.㈤ 5.(-) 身體倦怠之症狀 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4.(士) 5.(-) 1.(3+)2.(2+)3.(+) 4·(±) 5心） 91125-990127.doc 59· 1324068 [表6] 項目 自覺症狀之判定基準 3+ : 症狀被認定為尚度。 南度症狀 例如，鼻水流出次數及量均多，無法專心做事及讀書。 2+ : 症狀被認定為中等程度。 中等程度之症狀 例如，為次數多所苦。 + : 症狀被認定為輕度。 輕度之症狀 例如，次數少，不太需要擔心。 士： 症狀被認定為輕微。 輕微之症狀 例如，偶而發生但尚可忍受。 • • · 幾乎或完全無症狀。 無症狀 無須擔心。 2.實驗結果 如圖32所示，比較試驗開始時與終了時，為對照之德氏 乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii)B株優酷乳組（對照組） 中，Thl/Th2比呈現有意義之降低，如圖33所示，ECP值呈 現有意義之上升。另一方面，副乾酷乳桿菌（L. paracasei) KW3 110株優酪乳組（KW組）中，對於任一項數值，均未見 到實驗前後出現有意義之變化。又，如圖34所示，關於將 自覺症狀計分化者之任一項，如眼油流出、眼睛痛及眼臉 沉重等項目，可認定KW組與對照組相較呈現降低之傾向。 以上之結果顯示縱使對於人類花粉症，KW3 11 0株亦呈現有 效性。 以下，記載關於本發明之具有抗過敏活性之乳酸菌適用 於飲料製造時之實施例。 [實施例11] (做為飲料添加原料之乳酸菌菌體之調製方法） 調製例1.乳酸菌KW3 110株菌株之調製 91125-990127.doc -60- 1324068 乳酸囷之培養，係使用培養用培養基（荀萄糖1。/。、酵母萃 取物 S(武田麟麟公司）1%、MgS〇4 . 7H2〇 50 ppm 及]VinS〇4 . 5出0 50 ppm”前培養係將乳酸菌3110株接種於培養用培 養基10 ml ’在37°C靜置20至24小時而進行。本培養係將前 培養液〇·6 ml接種於120 ml培養用培養基，使用2〇〇 mi容積 發酵槽（BMJ-25型，EIBLE公司），在28T：培養。通氣量為0.12 L/min’攪拌速度為50〇rpm。PH係用25%Na〇H溶液控制成 為pH 4·5以下。培養進行48小時。 培養終了後’藉由8500 Xg離心1〇分鐘，將菌體集菌處 理。懸浮於30 ml蒸餾水，藉由8500 Xg離心1〇分鐘，將菌 體集菌處理。重覆該洗淨操作3次，除去來自培養基之成 分。將洗淨菌體懸浮於10 ml滅菌水，於l〇〇t熱壓爸 (autoc丨ave)處理3 〇分鐘後，冷凍乾燥。最後得到乳酸菌乾燥 菌體50-70mg。確認得到之乳酸菌菌體之抗過敏活性。 [實施例12] (茶系飲料之製造） 一：於藉由85。。熱水萃取之烏龍茶、紅茶、綠茶、焙茶及茉 利花茶萃取液’追加脫離子水使得茶葉使㈣成為〇 8重量 %。此時添加抗壞血酸並使其濃度成為〇〇25重量％，繼而使 用小蘇打將pH調整至容易飲用 之程度。再者，對該調和液100 g添加乳酸菌KW3110株至菌砮忐泛,c 1M0/ 10 1个土困默成為1.5χΐ〇ι〇個及3χ1〇ι〇個 後’如常法進行UHT殺菌，充埴於 兄異於350 ml容積之pet瓶中。 將此1 0個實施案例（5種茶 員進行官能評價。結果任一 x2等級乳酸菌濃度）提供評審 種飲料之香味均令人滿意，得 9H25-990l27.doc 1324068 到可每日持續地充分飲用之高度評價。然而，添加3 x丨〇10 個樣本之外觀上，乳酸菌沉澱物甚為顯眼，故評價以 1 ·5X 1 〇1Q個為較佳。 [實施例13 ] (麥茶之製造）

將麥茶250 g以熱水10kg熬煮3〇分鐘，過濾後進行離心。 ，得到之萃取液中添加乳酸菌KW3u〇株，使最終製品平均 母lOOg為8X10丨G個、154()10個及3χ1(^個後，再添加抗壞 血酸及小蘇打調整味道，同時用1〇0脫離子水再度將其分 散（mess up)。繼而，如同常法進行UHT殺菌，以無菌方式 充填於500 ml容積之pET瓶中。進行官能評價。結果任一種 飲料之香味均令人滿意，得到可每日持續地充分飲用之高 度評價。然:而，添加3χΗ)、樣本之外觀上，乳酸菌沉殿 物甚為顯眼，故評價以其以下為較佳。 [實施例I4]

(加入果汁之飲料之製造） 對混濁蘋果汁9〇〇g及香料lg添加設定之乳酸菌菌體， 添加脫離子水使合計成為…後，如同常法以高溫充填^ Pack)方式充填於18〇⑹容積之瓶中調製加入果汁之 Γ再=將礼酸菌3110株以對該調和液1〇〇§而言成為 數2x10個或4xl〇1G個之方式添加。 官能評價之結果， 完全沒有令人不舒服 [實施例15] 任何一項樣本添加乳酸菌造成 之味道，外觀上亦無任何問題 之香味 〇 91125-990127.doc -62· (運動飲料之製造） 對於含有砂糖4.5重量％'檸檬酸〇2重量％、擰檬酸鈉〇〇5 重量％及香料〇.丨重量％之調和液添加乳酸菌KW3110株 .0143重畺/〇(母1〇〇 g製品平均為1 ^1〇丨〇個）。再者，將該

液加熱至90C殺菌，以高溫充填（h〇t pack)方式充填於pET 瓶中’調製運動飲料型式之飲才斗。官能評價結*，外觀及 香味均可令人滿意。將本飲料中之乳酸菌菌體離心，用純 水洗淨後，進行凍結乾燥，得到乾燥菌體。將完成之製品 藉由使用小鼠淋巴球之試管内系統評價之結果，確認保持 設定之活性（圖35)。 [實施例16] (蕃茄汁之製造） 對蕃茄汁添加設定量之乳酸菌菌體後，充填於19〇 g罐 中，依妝常法進行殺菌釜（Γεί〇η)殺菌。再者，將乳酸菌 KW3110株以對該調和液1〇〇 g而言成為菌數2 5χΐ〇1〇個或 5xl〇1G個之方式添加。 官能評價之結果，任何一項樣本完全沒有添加乳酸菌造 成之令人不舒服感，外觀上亦無任何問題。 [實施例17] (咖啡之製造） 將粉碎之咖啡焙煎豆以95°c熱水萃取，得到咖啡萃取 液。於其中添加脫離子水稀釋使可溶性固形份成為丨4%。 將乳酸菌KW3110株以對該調和液10〇 g而言成為菌數 2xl〇1G個或4xl01G個之方式添加後，充填於19() g罐中如 9 " 25-990l27.doc -63- 丄&4U68 同常法進行殺菌爸（retort)殺菌。 g能評價之結果，任何一項樣本 不70王，又有添加乳酸菌造 成之々人不舒服感。然而，移動杯 外亇吋添加4χ1〇丨G個之 樣本外觀上，乳酸菌沉澱物甚為顯眼，故評價以1.5Μ〇ι〇 個為較佳。然而，從罐中直接飲用則無問題。 以下，記載關於本發明之具有抗過敏活性之乳酸菌適用 於食品製造時之實施例。

[實施例18] (優酪乳之製造）

將含乳原料（牛乳、脫脂粉乳、乳膏、砂糖液糖、安定劑、 香料及水）均勻混合’於128t進行加熱殺菌_，冷卻至 4〇°C以下後，添加乳酸菌種菌KW3u〇，在維持於37它之發 酵槽開始發酵。乳酸菌KW3110株分解混合液中之乳糖，生 成乳酸，約18小時pH成為4.6,在乳蛋白質藉由等電點凝集 而凝膠化安定之時點進行㈣冷卻。藉由㈣將成為糊狀 之優酪乳充填於紙容器，密封，於1(rc以下之冰箱中冷藏 保存。冷卻後，藉由官能檢查，確認具有做為優酪乳之適 當食味及物性。此種優酪乳之原料添加比例如表7所示。 又，原料中之脂肪份、SNF(無脂乳固形份）之比例及甜味度 如表8所示。將完成之製品藉由使用小鼠淋巴球之試管内系 統評價之結果’確認保持設定之活性（圖36)。 91125-990127.doc • 64 - [表7] 原料名稱 (重量％) 牛乳 50.00 脫脂粉乳 4.63 乳膏 2.42 砂糖液糖 9.50 安定劑 0.80 香料 0.08 乳酸菌種菌 5.00 水 27.57 合計 100.00 [表8] 原料中特定成分之比例(％)及甜Θ k度 脂肪份 3.1% SCF 9.3% 甜味度 6.4 1324068 以下，記載關於本發明之具有抗過敏活性之乳酸菌適用 於健康食品製劑製造時之實施例。 [實施例19] (錠狀健康食品之製造） 於乳酸菌KW3 110株之調製乾燥粉末67g中，添加為糖類 之還原帕拉金糖（palatinose)、山梨糖醇，木糖醇及阿拉伯 膠，以水為黏合劑進行加熱及造粒，並用檸檬酸、甜菊 (stevia)或香料等調整味道，為容易藉由打錠機成型為键 狀，添加粉末油脂及蔗糖酯，得到1000 g之混合物。然後， 以每1粒為1.5 g之方式打錠，製造香味良好之錠狀健康食 品。此時，乳酸菌KW3110株在每1粒中平均為5xl01G個。 [實施例20] (硬膠囊狀鍵康食品） 91125-990127.doc -65- 於乳酸菌KW3110株之調製乾燥粉末1〇〇 §中，添加糊精 5〇 g並均勻混合後，充填於包含出芽短梗孢糖（puUuian)、 植物油脂、角叉膠（carrageenan)及氯化鈣之硬膠囊基材得 到以硬膠囊包覆，1個膠囊213 mg之健康食品。此時，乳酸 菌KWHIO株在每1個膠嚢平均為5χ1〇10個。 [實施例21] (硬膠囊狀鍵康食品） • 於乳酸菌KW3110株之調製乾燥粉末100 g中，添加糊精 50 g並均勻混合後，充填於包含明膠及甘油之硬膠囊基 材，得到以硬膠囊包覆，丨個膠囊213 mg之健康食品。此時， 乳酸菌KW3 110株在每1個膠囊平均為5X 1 〇ι〇個。 [實施例22] (軟膠囊狀鍵康食品） 將乳酸菌KW3110株之調製乾燥粉末1〇〇 kg均勻地懸浮 於葵花籽油180 kg、蜜蠟20 kg及大豆卵磷酯5 kg之混合物 • 後，藉由以角叉膠、澱粉及甘油為主成分之膠囊基材包覆， 成形成1個膠囊450 mg之橢圓球型軟膠囊狀。此時，乳酸菌 KW3110株在每i個膠囊平均為5><1〇1()個。 [實施例23] (軟膠囊狀鍵康食品） 將乳酸菌KW3 110株之調製乾燥粉末1〇〇 kg均勻地懸浮 於葵花籽油180 kg、蜜蠟20 kg及大豆卵磷酯5 kg之混合物 後，藉由包含明膠及甘油之膠囊基材包覆，成形成丨個膠囊 450 mg之橢圓球型軟膠囊狀。此時，乳酸菌KW3ii〇株在每 91125-990127.doc • 66 - 1個膠囊平均為5xl〇1Q個。 [實施例24] (顆粒狀鍵康食品） 將乳酸菌KW3110株之調製乾燥粉末100 kg藉由條狀充 填機充填，成為1條1 此時，乳酸菌KW3110株在每1條 中平均為5 X 1 〇11個。 [實施例25J (顆粒狀健康食品） 於乳酸菌KW3110株之調製乾燥粉末100kg中，添加糊精 900 kg，以水為黏合劑，使用流動層造粒機進行均勻之混 &、加熱及造粒，得到造粒物1 〇〇〇 kg。然後將該造粒物藉 由條狀充填機，以丨條丨g之方式充填，得到乳酸菌KW3u〇 株在每1條中平均為5xl〇1〇個之健康食品。將完成之製品藉 由使用小鼠淋巴球之試管内系統評價之結果，確認保持設 定之活性（圖37)。 [實施例26] (粉末狀健康食品） 於乳酸菌KW3110株之調製乾燥粉末1〇〇kgf，添加糊精 900 kg，以水為黏合劑，使用流動層造粒機進行均勻之曰 合、加熱及造粒，得到造粒物1000 kg。然後將該造粒物2 碎至全量通過18號篩為止，藉由條狀充填機，以丨條工 方式充填，得到乳酸菌KW311〇株在每丨條中平均為…〇 個之健康食品。 [實施例27] 91125-990127.doc •67· ^24068 (懸浮液狀健康食品） 將乳酸菌KW311〇株之調製乾燥粉末1〇〇§添 藍葉之榨汁液1叫中，藉由褐藻酸鈉H)g調整^ 使得乳酸g在液中容易分散，得到懸浮液狀之健康食^ [實施例28] < (懸浮液狀健康食品）

將乳酸菌KW3110株之調製乾燥粉末1〇〇 g，與葡萄糖〇 7 kg、蒸館水5 kg及葡萄香料5 g混合，加熱殺菌後，以無菌 方式充填於1瓶5〇 ml之密封容器中，得到糖漿狀之懸&液 狀健康食品。此產物未造成小孩之不舒服感，頗獲好評。 【圖式簡單說明】 [圖1]為表示本發明實施例中使用之乳酸菌及其取得來 源之一覽表（No. 1)。 [圖2]為表示本發明實施例中使用之乳酸菌及其取得來 源之一覽表（No. 2)。

[圖3]為表示本發明實施例中各種乳酸菌產生之為Thl細 胞激素之IL-12之產生量之圖。 [圖4]為表示本發明實施例中各種乳酸菌產生之為Th2細 胞激素之IL-4之產生量之圖。 [圖5]為表示本發明實施例中使用之本發明乳酸菌株 (KW3110)與對照株（L_92株），藉由試管試驗比較IL-i2與 IL-4產生量之結果之圖。 [圖6]為表示本發明實施例中篩選之從KW3 11 0株衍生之 菌株No.90株之抗過敏活性之測定結果之圖。 91125-990127.doc •68· 1324068 [圖7]為表不本發明之實施例中，供測定本發明之呈現高 抗過敏活性乳酸菌之KW3110株在身體中抗過敏能力之實 驗進度之圖。 [圖8]為表不本發明之實施例中，在供測定本發明之呈現 咼抗過敏活性乳酸菌之KW3 110株為在身體中之抗過敏能 力之貫驗中，於98曰之實驗期間血中lgE之變動。 [圖9]為藉由點圖法表示本發明之實施例中，在供測定本 發明之呈現高抗過敏活性乳酸菌之KW3丨1〇株在身體中之 抗過敏能力之實驗中，於第48日及於解剖時（第98日）血中 IgE之量之圖。 [圖10]為表示本發明之實施例中，在供測定本發明之呈 現高抗過敏活性乳酸菌之KW3 110株在身體中之抗過敏能 力之實驗中，對照組及KW3110組於第98日解剖時脾細胞培 養中之IL-12產生量之圖。 [圖11 ]為表示本發明之實施例中，在供測定本發明之呈現 高抗過敏活性乳酸菌之KW3110株在身體中之抗過敏能力 之實驗中’對照組及KW3 110組於第98日解剖時脾細胞培養 中之IL-4產生量之圖。 [圖12]為表示本發明之實施例中，在供測定本發明之呈 現高抗過敏活性乳酸菌之KW3110株在身體中之抗過敏能 力之實驗中’觀察對照組及KW3 110組之鼻周邊脫毛結果之 照片。 [圖13 ]為表示本發明之實施例中，為了比較本發明之呈 現高抗過敏活性乳酸菌之KW3 110株與公知為抗過敏乳酸 91125-990127.doc -69· 丄324068 菌之KW46 1 0 ’使用該等乳酸菌株之混餌飼料所進行之預防 效果試驗之實驗進度之圖。 [圖14]為表示本發明之實施例中’為了比較本發明之呈 現高抗過敏活性乳酸菌之KW3 110株與公知為抗過敏乳酸 菌之KW4610,使用該等乳酸菌株之混餌飼料所進行之預防 效果試驗於實驗期間血中IgE量之變動之圖。 [圖1 5]為藉由描點表示本發明之實施例中，本發明之呈 現高抗過敏活性乳酸菌之KW311〇株，為了比較本發明之呈 現高抗過敏活性乳酸菌之KW3U〇株與公知為抗過敏乳酸 菌之KW4610，使用該等乳酸菌株之混餌飼料所進行之預防 效果試驗於第5次及第6次投與〇VA後，每個體血中igE量之 圖0 圖16]為表示本發明之實施例中，本發 τ π "〜土 ％ 敏活性乳酸菌之KW311G株之㈣性試驗結果之圖。 [圖17]為表示本發明之實施例中，本發明之呈現高抗 敏活性乳酸菌之削11()株之耐膽汁酸性試驗結果之圖。 [圖18]圖l8a、bAe為表示本發明之實施例中，關於藉 KW3H0株對使用花粉抗原造成之花粉症呼吸道發炎二 善效果，對於標本小鼠噴料作試驗結果之圖。 [圖為表示本發明之實施例中， =311G株對使用花粉抗原造成之花粉症.呼吸道發炎 善效果，對㈣本小鼠歸_試㈣果之圖。* [圖20]為表示本發明之實施例中 粉抗原料^粉症.彳 於使用] 十及運發炎之改善效果，以及對力 91125-990127.doc .70· 1324068 模型小鼠血中總igE濃度上升之抑制試驗結果之圖。 [圖21]為表示本發明之實施例中，kw3ii〇株對於使用花 粉抗原造成之花粉症.呼吸道發炎之改善效果，以及對於 模型小执之嗜g請上升之抑制（圖丨9a)及對局部浸潤之抑制 (圖19b)試驗結果之圖。 [圖22]為表示本發明之實施例中，kw3u〇株對於花粉抗 原造成之花粉症·呼吸道發炎之改善效果，以及對於模型 小鼠之IL-5之值之試驗結果之圖。 [圖23]為表示本發明之實施例中，Kw3u〇株對於異位性 皮膚炎核型小鼠之改善效果，以及對於血中總邮濃度之上 升試驗結果之圖。 [圖24]為表示本發明之實施例中，請31職對於異位性 皮膚炎模型小鼠之改善效果’以及對於模型小鼠之總臨床 計分測定結果之圖。 [圖25]為表示本發明之實施例中，Kw3n〇株對於異位性 皮膚炎模型小鼠之改善效果，以及對於模型小鼠之臨床計 分（耳殼部）測定結果之圖。 [圖6]為表示本發明之實施例中’ 〇株對於異位性 皮膚炎模型小鼠之改善效果，以及對於模型小鼠之臨床計 分（頭皮部）測定結果之圖。 [圖27]為本發明之實施例中，KW3110株對於異位性皮膚 人模5L J乳之改善效果，以及顯示模型小鼠頭部之耳殼部 糜爛·組織缺損之抑制狀況之照片。 [圖28]為表示本發明之實施例中，KWMH)株對於異位性 91125-990127.doc -71 - :膚炎模型小鼠之改善效果，以及對於模型小鼠第!次激發 k成之耳殼肥厚之抑制傾向試驗結果之圖。 [圖29]為表示本發明之實施例中，KW3110株對於異位性 皮膚人模型小鼠之改善效果，對於模型小鼠第3次激發造成 之耳设肥厚之抑制傾向試驗結果之圖。 [圖30]為表示本發明之實施例中，KW3u〇株對於異位性 皮膚X杈型小鼠之改善效果，以及對於模型小鼠之耳殼肥 旱之抑制，使用蘇木精（hematoxylin)-伊紅（eosin)染色進行 耳殼部之病理學評價結果之照片。 [圆31]為表示本發明之實施例中，KW3u〇株對於異位性 皮膚炎模型小鼠之改善效果，對於模型小鼠之耳殼肥厚之 抑制使用甲苯胺藍（t〇luidine blue)染色進行耳殼部之病理 學評價結果之照片。 [圖32]為表示本發明之實施例中，KW3u〇株對於人類之 花粉症之效果，對於使用優酪乳之試驗中，Thi/Th2比之變 化測定之結果之圖。 [圖33]為表示本發明之實施例中，關於kw3u〇株對於人 類之花粉症之效果，對於使用優酪乳之試驗中，測定試驗 開始前與開始後ECP之變化之結果之圖。 [圖34]為表示本發明之實施例令，kw3u〇株對人類之花 籾症之效果，使用優酪乳之試驗中觀察試驗開始前與開 始後花粉症自覺症狀之變化之結果之圖。 [圖35]為表示本發明之實施例中，使用株施行各 種加工處理進行製品化時抗過敏活性之維持，以及製品化 9ll25-990127.doc -72- 1324068 成為清涼飲料時IL-12之產生量之試驗結果之圖。 [圖36]為表示本發明之實施例中，使用KW3110株施行各 種加工處理進行製品化時抗過敏活性之維持，以及添加於 優酪乳進行製品化時IL- 12之產生量之試驗結果之圖。 [圖37]為表示本發明之實施例中，使用KW3110株施行各 種加工處理進行製品化時抗過敏活性之維持，以及進行錠 劑化時IL.-12及IL-4之產生量之試驗結果之圖。 91125-990127.doc 73-

Claims (1)

1. 彳?年（月+修(炙)正本 十、申請專利範圍：1-丄——:_ 1. 一種具有抗過敏機能之飲料或食品之製造方法，其特徵 為將使用培養基培養及增殖之副乾酪乳桿菌 (Lactobacillus par acasei)KW3 110株（BCRC 910252)、或具 有抗過敏機能之突變株No. 90株（BCRC 9 10253)之菌體’ 於製造步驟之任一步驟中進行加熱殺菌處理。 2. 如申請專利範圍第1項之具有抗過敏機能之飲料或食品 之製造方法，其中於副乾酪乳桿菌KW3 11 0株（BCRC 910252)、或具有抗過敏機能之突變株No. 90株（BCRC 9 10253)之培養結束後，進行加熱殺菌處理。 3. 如申請專利範圍第1或2項之具有抗過敏機能之飲料或食 品之製造方法，其中將培養後之副乾酪乳桿菌KW3 110株 (BCRC 910252)、或具有抗過敏機能之突變株No. 90株 (BCRC 910253)洗淨後，將洗淨之菌體懸浮於滅菌水中， 在該菌體懸浮於該滅菌水中之狀態下進行加熱殺菌處 理。 4. 如申請專利範圍第1項之具有抗過敏機能之飲料或食品 之製造方法，其中加熱殺菌係使用巴斯德殺菌、熱包裹 殺菌、UHT殺菌或殺菌爸（retort)殺菌進行處理。 5. 如申請專利範圍第1或4項之具有抗過敏機能之飲料或食 品之製造方法，其中加熱殺菌係將添加經培養之副乾酪 乳桿菌KW3110株（BCRC 910252)、或具有抗過敏機能之 突變株No. 90株（BCRC 910253)之飲食品以加熱步驟進行 處理。 91125-990127.doc B24068 6. 如申請專利範圍第1項之具有抗過敏機能之飲料或食品 之製造方法，其中飲食品係製造成密封容器裝飲料或食 品者。 7. 如申請專利範圍第6項之具有抗過敏機能之飲料或食品 之製造方法，其中密封容器裝飲料或食品為健康食品、 含果汁之清涼飲料或茶飲料。 8. 如申請專利範圍第6項之具有抗過敏機能之飲料或食品 之製造方法，其中密封容器裝飲料為不含乳成分者。 9. 如申請專利範圍第6項之具有抗過敏機能之飲料或食品 之製造方法，其中以飲食品每日攝取量計，飲料或食品 中之副乾酪乳桿菌KW3110株（BCRC 910252)、或具有抗 過敏機能之突變株No. 90株（BCRC 9 10253)之菌體量係調 整至每100 g中為109至1011個之比例。 1 0.如申請專利範圍第1項之具有抗過敏機能之飲料或食品 之製造方法，其中藉由將飲料或食品中之副乾酪乳桿菌 KW3110株（BCRC 910252)、或具有抗過敏機能之突變株 No· 90株（BCRC 910253)用於製造飲料或食品，以保持飲 料或食品之香味，並賦予飲料或食品抗過敏機能。 91125-990127.doc