JP2005137357A - 抗アレルギー用組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 高抗アレルギー活性を有するL.paracasei KW3110株、及びその変異株を有効成分とする抗アレルギー機能を有する飲料又は食品からなる。本発明の抗アレルギー機能を有する飲食物は、花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などの環境アレルギーに対して特に効力を発揮する。本発明の抗アレルギー機能を有する飲食物は、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を飲料或いは食品に配合した形態で、或いは、錠剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤又はドリンク剤のような製剤形態で用いることができる。
Description
本発明の有効成分である高抗アレルギー活性を有する乳酸菌は、卵白アルブミン(以下、「OVA」という)で感作させたマウス脾臓由来リンパ球をOVA含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌としてL.paracasei KW3110株を用いた場合と同等或いは60%以上のインターロイキン12産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの50%未満のインターロイキン4生成量を示す乳酸菌である。より好ましい本発明の有効成分としては、上記乳酸菌が、OVAで感作させたマウス脾臓由来リンパ球をOVA含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、L.paracasei KW3110株を用いた場合と同等或いは75%以上のインターロイキン12産生量を示す乳酸菌である。更に好ましい本発明の有効成分としては、上記乳酸菌において、OVAで感作させたマウス脾臓由来リンパ球をOVA含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、乳酸菌無添加コントロールの40%未満のインターロイキン4生成量を示すことを特徴とする乳酸菌である。
本発明において、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌として最も好ましい態様は、卵白アルブミン(以下、「OVA」という)で感作させたマウス脾臓由来リンパ球をOVA含有培地に懸濁し被検乳酸菌を添加して培養した場合に、被検乳酸菌としてL.paracasei KW3110株を用いた場合と同等或いは80%以上のインターロイキン12産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの30%未満のインターロイキン4生成量を示す乳酸菌である。
また、本発明で抗アレルギー機能を有する飲食品の有効成分として使用されL.plantarum KW4110株はL.plantarum JCM1149株として、L.paracasei KW3926株はL.paracasei JCM8132株として、JCM(理化学研究所微生物系統保存施設)から入手することができ、及び、L.paracasei KW3925株はL.paracasei NRIC1917株として、NRIC(東京農業大学)から入手することができる。
本発明では、本発明で取得した乳酸菌株から生じた形質の異なる菌株を派生株として選抜し、用いることができる。該菌株の選抜方法は、KW3110を例として説明すると次のようになる:KW3110株をMRS培地のような培地を用いて、所定温度で、所定菌数に達するまで静置培養し、培養液を新鮮なMRS培地で、希釈した後、本菌体懸濁液を塩酸でpHを3.0にしたPBS(大日本製薬社タブレットを指定の濃度で溶解)に10%分懸濁し、37℃3時間インキュベートする。酸処理した菌体懸濁液をPBSで希釈し、MRSプレート培地にまき、コロニーを形成させた。形成させたコロニーを色調等を指標に選抜し、この色調に基いて選抜したコロニーから更に1株を選抜し、MRS培地で48時間培養する。該培養物の抗アレルギー活性を本発明の抗アレルギー活性の測定法(実施例2の方法)で測定し、各コロニーの抗アレルギー活性を判定する。該方法により、試験菌株の中から高抗アレルギー活性の菌株を選抜取得する。本発明の実施例で、KW3110株の派生株として分離された株はNo.90株と命名され、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基く、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、FERM BP−08635として寄託されている。
本発明においては、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を含有する製品の品質管理や製造工程における管理を行うために、該本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の分離、検出を行って、その乳酸菌の同定や含有量の検査を行う必要がある。該乳酸菌の分離、検出を目的として抗体を作製し、用いることができる。本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記乳酸菌を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の産生方法は、それ自体既に公知の方法により産生することができる。例えば、該産生方法は、Koehler,G.及びC. Milstein,Nature:256,495-497(1975)、及び、Davis, B. ,R. Dulbecco, H. Eisen,H. Ginsberg及びW. Wood, Principles of Microbiology and Immunology 第2巻、Harper & Row, New York,1973を参照することができる。すなわち、該モノクローナル抗体の産生には、例えば、本発明の乳酸菌を用いてマウスを免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマ細胞によって産生することができる。本発明の乳酸菌に特異的に結合する抗体を用いて、本発明の乳酸菌を検出するには、公知の抗体を用いた免疫学的検出法を用いて実施することができる。該免疫学的測定法としては、例えばRIA法、ELISA法、蛍光抗体法等の公知の免疫学的測定法を挙げることができる。
アレルギーは、抗原刺激によりIgE抗体が産生され、IgE抗体の組織内のマスト細胞や血中の好塩基球表面のFcレセプターに結合し、次の抗原刺激(アレルゲンの再侵入)でマスト細胞や好塩基球表面に結合しているIgE抗体に認識され、IgE抗体間に架橋が形成され、この刺激を引き金としてマスト細胞や好塩基球がケミカルメディエーターを爆発的に遊離することによって諸症状が現れる。従って、アレルギーの治療・予防の為にIgEを抑制すること、そしてその為にはTh1免疫を増強しTh2免疫を抑制することが必要となる。
抗アレルギー用組成物は、本発明による有効成分を生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合することにより製剤化して、抗アレルギー剤として用いることができる。抗アレルギー剤は、経口的或いは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤(糖衣錠を含む)、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤(例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤)、点滴剤、外用剤(例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤)、坐剤(例えば、直腸坐剤、膣坐剤)が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学的に許容される賦形剤、添加剤とともに製剤化することができる。なお、製剤化にあたっては、抗アレルギー組成物がその機能を生体内において適時的且つ効果的に発揮できるよう、即ち溶出開始時間を制御したり、苦味マスキング剤としての機能を付加したり、酸素や湿度に対する安定性を高めたりする形、例えば特許3349677記載の酵母細胞壁を主成分としたコーティング剤でコーティングされたコーティング処理物や定法に従って軟カプセルや硬カプセルによりカプセル化することで得られるかプセル剤として共に医薬製剤や健康食品等の分野で好ましく使用することができる。薬学的に許容される賦形剤や添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられる。
本発明の抗アレルギー用組成物は、飲食品に配合し、抗アレルギー機能を有する飲食品として用いることができる。本発明の抗アレルギー用組成物を飲食品に配合して用いるには、その有効成分の有効量を飲食品の製造原料段階或いは製造した製品の段階等で添加、配合する。ここで「有効成分の有効量」とは、個々の飲食品において通常喫食される量を摂取した場合に、下記のような範囲で有効成分が摂取されるような含有量をいう。
本発明において、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を配合する健康食品および機能性食品としては、各種のものをあげることができるが、それらの健康食品および機能性食品の製造に関しては、通常用いられる、食品素材、食品添加物に加え、賦形剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、分散剤、保存剤、湿潤化剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化材、カプセル基剤等の補助剤を用いた飲食品製剤形態で利用することができる。該補助剤の具体的な例示をすれば、乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはその塩、アラビアガム、ポリエチレングルコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム、プルラン、カラギーナン、デキストリン、還元パラチノース、ソルビトール、キシリトール、ステビア、合成甘味料、クエン酸、アスコルビン酸、酸味料、重曹、ショ糖エステル、植物硬化油脂、塩化カリウム、サフラワー油、ミツロウ、大豆レシチン、香料等が配合できる。このような健康食品、機能性食品の製造に関しては、医薬品製剤の参考書、例えば「日本薬局方解説書(製剤総則)」(廣川書店)等を参考にすることができる。
また、本発明においては、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を食品に配合して、抗アレルギー機能を持たせた食品として調製することができる。かかる飲食品として具体的には、プリン、クッキー、クラッカー、ポテトチップス、ビスケット、パン、ケーキ、チョコレート、ドーナツ、ゼリーなどの洋菓子、煎餅、羊羹、大福、おはぎ、その他の饅頭、カステラなどの和菓子、冷菓(飴等)、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば、きしめん等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ハム、ソーセージ、ハンバーグ、コーンビーフ等の畜肉製品や、塩、胡椒、みそ、しょう油、ソース、ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、甘味料、辛味料等の調味類や、明石焼き、たこ焼き、もんじゃ焼き、お好み焼き、焼きそば、焼きうどん等の鉄板焼き食品や、チーズ、ハードタイプのヨーグルト等の乳製品や、納豆、厚揚げ、豆腐、こんにゃく、団子、漬物、佃煮、餃子、シューマイ、コロッケ、サンドイッチ、ピザ、ハンバーガー、サラダ等の各種総菜や、各種粉末(ビーフ、ポーク、チキン等畜産物、海老、帆立、蜆、昆布等水産物、野菜・果実類、植物、酵母、藻類等)や、油脂類・香料類(バニラ、柑橘類、かつお等)を粉末固形化したものや、粉末飲食品(インスタントコーヒー、インスタント紅茶、インスタントミルク、インスタントスープ、味噌汁等)等の各種食品が挙げることができるが、これらに特に制限されない。
本発明の高抗アレルギー活性の組成物は、特に飲料の形で用いて、毎日継続摂取することが可能であり、尚かつ該継続摂取することが可能な量で効能を発揮する抗アレルギー機能を有する飲料として提供することができる。本発明における高抗アレルギー活性活性を有する乳酸菌を飲料へ配合する場合に、飲料自体の香味を保持し、しかも安定した物性の飲料を調製するためには、乳酸菌を加熱殺菌した形で用いるのが好ましい。
本発明の実施例で用いた乳酸菌及びその入手先を、図1(No.1)及び図2(No.2)に示す。本発明においては、全ての菌株をKWで始まる番号にて識別しているが、これら試験株は独自で単離したもの、市販乳製品で使用されているもの、公的機関等から入手したもの等があるために便宜上統一した識別名を付したものであり、それぞれのKW株と入手由来との関係は図1(No.1)及び図2(No.2)の通りである。なお、該図1の「入手先」において、「JCM」は理化学研究所微生物系統保存施設を、「IFO」は前財団法人発酵研究所(現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 生物資源センター(NBRC))を表す。
1.試料
乳酸菌の各菌株をM.R.S.(de Man, Rogosa, Sharpe)培地(OXOID)で48時間培養したものを、滅菌水で3回洗浄し、滅菌水に懸濁後100℃、30分処理し、殺菌した。これを凍結乾燥し、PBSに懸濁した。使用した乳酸菌は図1(No.1)及び図2(No.2)を参照のこと。
7−10週齢BALB/cマウス(チャールズリバー)にday0とday6に卵白アルブミン(OVA)1mgをアジュバントであるAlum2mgと共に腹腔内注射した。Day13に解剖し、脾臓を単離・リンパ球を調製した。実験は、n=6で行った。
IL−4、IL−12の測定は、OptEIA ELISA Set(ベクトン・ディッキンソン)を用いて測定した。
「2.実験動物、飼育」の方法で調製した脾臓リンパ球をRPMI1640(SIGMA)+10%FCS(ロシュ)+1mg OVA培地で2.5×106cells/mlになるように懸濁した。さらに試験する乳酸菌を0.1あるいは1μg/mlで添加した。1週間後に培養上清を回収し、Th1サイトカインとしてIL−12をTh2サイトカインとしてIL−4をそれぞれ測定した。
Th1サイトカイン、IL−12の各乳酸菌による生成量を図3及び表2に示す。乳酸菌の添加量は1μg/mlである。菌株の違いにより、様々な産生量の違いが見られた。約100株の中で最も強いTh1誘導能を示したのはL.paracasei KW3110株であった。データは全てKW3110株によるIL−12産生量を100%としたときの比率で示されている。便宜的にKW3110株に対して75%以上の産生量を示した株をA評価、50%以上〜75%未満の産生量を示した株をB評価、25%以上〜50%未満の産生量を示した株をC評価、10%以上〜25%未満の産生量を示した株をD評価、10%未満の産生量を示した株をE評価とした。
本実施例では、本発明で取得した乳酸菌株KW3110株から派生した抗アレルギー活性を有する菌株を選抜した例である。KW3110株をMRS培地にて37℃でOD600が0.8から1.0に達するまで静置培養した。
培養液を新鮮なMRS培地で、OD600=0.5になるように希釈した後、本菌体懸濁液を塩酸でpHを3.0にしたPBS(大日本製薬社タブレットを指定の濃度で溶解)に10%分懸濁し、37℃3時間インキュベートした。酸処理した菌体懸濁液をPBSで希釈し、MRSプレート培地にまき、37℃でコロニーを形成させた。形成させたコロニーの中に色調の薄いコロニーが認められた。これを選抜し、MRS培地で48時間培養した。この株をNo.90と命名した。No.90株を実施例2の方法で抗アレルギー活性を測定した。No.90株は野生株と比較して同程度のIL−12産生能を示した(図6)。なお、図中、「比活性(%)」は、KW3110株のIL−12産生能を100とした時の派生株(No.90)のIL−12産生能で示した。このNo.90株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、FERM BP−08635として寄託された。
1.投与試料
L.paracasei KW3110株をMRS培地で48時間培養したものを、滅菌水で3回洗浄し、滅菌水に懸濁後100℃、30分処理し、殺菌した。これを凍結乾燥し、標準粉末飼料AIN93(アメリカ国立栄養研究所による標準組成)にマウス一匹が1日1mg摂取するように練りこんだ混餌を作製した。
8週齢BALB/cを用いた。1群6匹のBALB/cマウスをCE−2(日本クレア)及び水を自由摂取させて1週間馴化飼育を行った。day0の抗原感作後は、コントロール群は精製原料を使用して作製したAIN93粉末飼料での飼育に、KW3110群はAIN93にKW3110菌が練りこまれた混餌に切り替えた。
IgE、IL−4、IL−12の測定は、OptEIA ELISA Set(ベクトン・ディッキンソン)を用いて測定した。
実験群としてはコントロール群(AIN93)、KW3110株をAIN93に1mg/mouse/dayになるように添加した群(KW3110群)を設定した。コントロール群、KW3110群共に粉末飼料4gを水で練ったものを実験終了時(day98)まで毎日与えた。飲水は自由摂取とした。卵白アルブミン(OVA)でのアレルギー感作は100μgOVAをアジュバントであるAlum2mgと共に、day0、14、42、70、94の合計5回腹腔に注射することで行った。この間、1週間ごとに眼底静脈より採血を行った。実験終了時には全血採取及び脾臓の摘出を行い、リンパ球を調製した(図7)。脾臓リンパ球はRPMI1640(SIGMA)+10%FCS(ロシュ)+100μgOVA培地で37℃、5%CO2の条件で1週間培養し、培養上清を回収した。血液サンプルに対してはIgE量を脾臓リンパ球培養上清サンプルに対してはIL−4、IL−12を測定した。
98日間の実験期間中における血中IgEの変動を図8に示す。day48時での血中IgEでKW3110群はコントロール群に対してp<0.05で有意に低い血中IgE値を示した。day48及び解剖時day98での血中IgE量をドットブロットで図9に示す。day98においてもKW3110群はコントロール群に対して有意に低い血中IgEを示した。コントロール群、KW3110群の98日解剖時の脾細胞培養におけるIL−12産生量を図10に、IL−4産生量を図11に示す。KW3110群はコントロール群に対して有意に高いIL−12産生を示した。IL−4について有意差はつかなかったが、コントロール群に対して低い傾向を示した。以上の結果は、KW3110株摂取により体内の免疫バランスがTh1にシフトし、アレルギー状態が改善されたことを示唆する。また、図12に示すようday30時でコントロール群では例外なく鼻周辺の脱毛が見られたが、KW3110群では例外なく脱毛が起こらなかった。このときコントロール群では頻繁に鼻の引っかき行動が観察された。KW3110群でコントロール群と同様な鼻周辺の脱毛及び鼻の引っかき行動が観察されたのはday60前後であった。鼻の引っかき行動の観察結果は、KW3110群がアレルギー症状を実際に抑制していることを示唆している。
1.投与試料
KW3110株、KW4610株をMRS培地で48時間培養したものを、滅菌水で3回洗浄し、滅菌水に懸濁後100℃、30分処理し、殺菌した。これを凍結乾燥し、標準粉末飼料AIN93(アメリカ国立栄養研究所による標準組成)にマウス一匹が1日1乃至10mg摂取するように練りこんだ混餌を作製した。
8週齢BALB/cを用いた。1群6匹のBALB/cマウスをCE−2(日本クレア)及び水を自由摂取させて1週間馴化飼育を行った。抗原感作21日前からKW3110株、KW4610株の混餌あるいはAIN93粉末飼料を摂取させた。
IgEの測定は、OptEIA ELISA Set(ベクトン・ディッキンソン)を用いて測定した。
実験群としてはコントロール群(AIN93)、KW3110株又はKW4610株をAIN93に1あるいは10mg/mouse/dayになるように添加した群(KW3110群、KW4610群)を設定した。コントロール群、KW3110群、KW4610群共に粉末飼料4gを水で練ったものを実験終了時(day133)まで毎日与えた。飲水は自由摂取とした。卵白アルブミン(OVA)でのアレルギー感作は100μgOVAをアジュバントであるAlum2mgと共に、day0、14、42、70、98、126の合計6回腹腔に注射することで行った。この間、1週間ごとに眼底静脈より採血を行った(図13)。血液サンプルに対してはIgE量を測定した。
試験期間中の血中IgE量の変動を図14に、OVA5次、6次投与後の個体ごとの血中IgE量をドットで図15に示す。OVAの抗原感作と共に血中IgEレベルは全ての群で上昇することが確認されたが、KW3110群においてOVA5次投与後からコントロールに対して有意な血中IgE量の低下が観察された。一方、KW4610群ではコントロールに対して有意な血中IgE量の低下は観察されず、KW3110株の抗アレルギー活性がより強いことを示唆した。また1mg摂取群より10mg摂取群でより強いIgE低減効果があることが示唆された。
乳酸菌が腸管へ生きて到達し、プロバイオティクスな効果を発揮するためには、胃酸、胆汁酸という消化液に対して耐性であることが必要であるといわれている。KW3110株がこの条件を満たす株であるかを検証するために、in vitroにおける酸耐性及び胆汁酸耐性を測定した。
酸耐性は、乳酸菌を対数増殖後期まで培養したのち、PBS(pH6.5)でOD600=0.5になるように調整した菌体を、塩酸でpH3.0になるように調整したMRS培地に1/10量添加し、これを37℃でインキュベーションした。インキュベーション開始後1時間、2時間、3時間にサンプリングを行い、MRS寒天培地で生菌率を測定した。
胆汁酸耐性はMRS液体培地に胆汁酸(OXOID社 Bile Salts)を最終濃度2%になるように添加したものに、KW3110株前培養液を1%植菌し、オリエンタルインスツルメンツ社のBIOPLOTTERを用いてOD630を測定することにより、生育速度を測定した。
腸管へ生きて到達した乳酸菌が、プロバイオティクスな効果を発揮するためには、菌が腸管にとどまることが必要である。乳酸菌が腸管にとどまり、その効果を十分発揮するための指標として、in vitroにおけるヒト腸管由来株化細胞Caco−2への接着性試験が頻繁に用いられる。そこで、KW3110株のCaco−2細胞接着能を測定した。
Caco−2細胞の培養は、Coconnierらの方法(アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー、1992年、第58巻、2034頁)に準じて行った。1.2×104個/cm2のCaco−2細胞をスライドグラス上で約1〜2週間、ポストコンフルエントとなるまで培養した。KW3110株はMRS培地で37℃、2晩培養したものを集菌し、PBSで1回洗浄後、PBSでOD600=1.0に調製したものを用いた。調製したKW3110液2mlに、Caco−2細胞を培養したスライドグラスを浸し、37℃、10%炭酸ガス存在下で1時間接触させ、その後スライドグラスをDMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培地で3回洗浄した。次にスライドグラスをメタノールで固定した後、グラム染色法(メディカルテクノロジー、1995、第23巻、205頁)でKW3110株を染色した。これを検鏡して、Caco−2細胞に付着した乳酸菌数を数え、4視野あたりの平均値を接着数として求めた。また基準株であるKW3913株(JCM8130株)およびKW3115株(JCM1134株)をはじめとする、L.paracasei、L.casei15株についても同様の検討を行った。
各乳酸菌のCaco−2細胞への接着能の試験の結果を表3に示す。OuwehandらはL.paracasei、L.casei菌がCaco−2細胞への接着能力が低いことを報告しているが(フードマイクロバイオロジー・アンド・セイフティー、2001年、第66巻、856頁)、今回の実験でも、KW3110株以外の株は、接着能力が低かった。しかし、KW3110株はL.paracasei、L.casei菌の中では、著しく高いCaco−2細胞接着能力を示しており、優れたプロバイオティクス効果が期待できる株であることが示唆された。
1.実験方法
(動物種)
BDF1♀マウス4週令(チャールズリバー)を購入
(実験群)
実験A:点鼻による抗原感作(花粉症モデル)
Control群:標準飼料(AIN−76ベース)を投与した群
KW群:KW1mg/mouse(1mg KW3110/3gAIN−76ベース)投与した群
実験B:ネブライザによる抗原感作(気道炎症モデル)
Control群:標準飼料(AIN−76ベース)を投与した群
KW群:KW1mg/mouse(1mg KW3110/3gAIN−76ベース)投与した群
(試薬・機器)
スギ花粉抽出物CP(LSL社)
ALUM(Sigma社)
超音波式ネブライザXE−U12(オムロン社)
集細胞遠心機:サイトスピン4(ThermoBioAnalysis社)
実験A
BDF−1マウスを購入後1週間馴化し、眼窩採血で得られた血漿をもとに血中総IgE濃度で群分けを行った(n=7)。群分け後、実験食を投与開始した。さらに群分け後3週目からCP+ALUM溶液(CP 10μg+ALUM 2mg/mouse)を週1回/3週間腹腔内投与した。3回目のCP+ALUM溶液投与後2週目からマウス両鼻にCP溶液(1mg/ml)を10μlずつ点鼻した。また未刺激モデル(Basal)として点鼻に生理食塩水を投与するマウスも設定した。点鼻は5日間実施し、点鼻後5分間のくしゃみの回数(1、3、5日目)と、鼻部引っ掻き回数(3、5日目)をカウントした。
BDF−1マウスを購入後1週間馴化し、眼窩採血で得られた血漿をもとに血中総IgE濃度で群分けを行った(n=7)。群分け後、実験食を投与開始した。さらに群分け後3週目から週1回/3週間CP+ALUM溶液(CP 10μg+ALUM 2mg/mouse)を腹腔内投与した。3回目のCP+ALUM溶液投与後2週目から、密閉容器内でマウスにCP溶液(40μg/ml)を15分間ネブライザで噴霧した。また未刺激モデル(Basal)として生理食塩水を噴霧するマウスを設定した。この噴霧は5日間実施した。またCP腹腔内投与時(0日目)、ネブライザ開始時(35日目)、解剖時(40日目)に眼窩採血を行い、血中総IgE濃度を測定した。5日目に麻酔下で気管支肺胞洗浄液(BALF)を回収し、BALF中の細胞数カウント、BALF中細胞同定、BALF中のサイトカインの測定を行った。BALFは麻酔下のマウス頚部を切開及び気道のカニュレーションし、0.1%BSA入りSaline0.7ml×3回(計2.1ml)によって洗浄した。遠心後上清及び細胞を回収し、細胞は細胞数を計測した。さらに塗抹標本を作製し、ライト・ギムザ染色により細胞を同定した。
(実験A)
点鼻後5分間のくしゃみの回数に関して、物理的刺激の影響を考慮するため、点鼻後0〜1分、1〜5分、総回数に分けて評価した。結果、生理食塩水点鼻ではほとんどくしゃみ症状を示さないのに対し、Control群は抗原点鼻を繰り返すにつれてくしゃみ頻度を増していった。一方、KW群ではくしゃみ症状を抑制する傾向が見られた(図18a、b、c)。また鼻部引っ掻き行動に関しては点鼻後5分間の連続した引っ掻き行動を1pointとした(総point数)。また軽度の引っ掻き(連続1〜4回の引っ掻き行動)と重度の引っ掻き(連続5回以上の引っ掻き行動)に分けた場合もpoint評価した。Control群に比べKW群は引っ掻き行動は抑えられ、5日目の軽度のpoint数に関して有意な抑制がみられた(図19a、b)
ネブライザ前ならびに解剖時にControl群に対してKW群は有意に血中総IgE濃度上昇を抑制した(図20)。BALF中の細胞の種類は通常状態であれば、マクロファージを中心とした単球が殆んどを占めている。しかし抗原刺激によりControl群のBALF中には好酸球が65%程度を占め、単球比率が減少する。一方、KW群はControl群に比べ、好酸球%の上昇を抑えている傾向がみられた(図21a)。また好酸球数においても同様にKW群がControl群に比べ好酸球の局所への浸潤を抑制している傾向がみられた(図21b)。
アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するKW3110株の改善効果の検証に、ピクリルクロライド塗布によるアトピー性皮膚炎モデルを用いた。(引用文献・応用薬理 59(6) 123-134,2000 )
(動物種)
NC/NgaTndCyjマウス♂5週令(チャールズリバー)を購入
(実験群)
対照群:標準飼料(AIN−76ベース)を11週間投与した群
KW1mg−11wk群:1mg KW3110/3g AIN−76ベースを11週間投与した群
KW 10mg−11wk群:10mg KW3110/3g AIN−76ベースを11週間投与した群
KW1mg−8wk群:標準飼料を3週間投与した後、1mg KW3110/3g AIN−76ベースを8週間投与した群
(試薬)
ピクリルクロライド:PCI(東京化成工業)
感作用溶液:5%溶液(エタノール:アセトン=4:1)
腹部・・・100μl、後肢部・・・25μl両足
チャレンジ用溶液:0.8%溶液(オリーブオイル)
耳介部・・・両面・両耳に10μlずつ(計40μl)、背皮部・・・50μl
NC/Ngaマウスを購入後1週間馴化し、眼窩採血で得られた血清をもとに血中総IgE濃度で群分けを行った(n=10)。群分けし実験食を投与開始した3週間後、PC1感作用溶液を毛剃した腹部と後肢部両側に塗布し、次にチャレンジとして1週間後に両耳介部・両面及び毛剃した背皮部にチャレンジ用溶液を塗布した。このチャレンジを1週間おきに計77回実施した。またチャレンジ用溶液溶媒による耳介肥厚がないことを確認するため、オリーブオイル塗布後、0、1、4、24、72、96、120、144、168hにダイヤルシックネスゲージにより耳介肥厚を測定した。さらにチャレンジ1,3回目の後、同様に0、1、4、24、72、96、120、144、168hにダイヤルシックネスゲージにより耳介肥厚を測定し浮腫を評価した。また感作後毎週眼窩採血を実施し、感作後週2回臨床スコアを評価した。最終チャレンジ7回目から1週間後に屠殺し、血清及び耳介部組織を回収した。血清に関しては総IgE濃度を、耳介部組織はヘマトキシリン・エオジン染色、トロイジンブルー染色を実施した。
耳介部の掻痒症、発赤・出血・糜爛、浮腫、擦傷・組織欠損、痂皮形成・乾燥の5項目、頭皮部の脱毛、発赤・出血・糜爛、痂皮形成・乾燥の3項目の8項目について症状無(0点)、軽度(1点)、中度(2点)、重度(3点)と点数化し、加算したものをスコアとして評価した。
(統計)
統計は分散分析並びに対照群に対するDunnettの多重比較検定を行い、各々の項目で危険率が5%以下のものを有意差ありとした。
血中総IgE濃度は、対照群はPClチャレンジ4週目あたりから大幅に上昇していくのに対し、KW3110摂取全群でその上昇は抑えられ、KW 10mg−11wk群とKW1mg−8wk群ではチャレンジ4回目から、KW1mg−11wk群はチャレンジ6回目から有意に上昇を抑制した(図23)。
臨床スコアは、対照群では早期から耳介及び頭皮の病態悪化、すなわちスコアの上昇が確認された。一方KW3110摂取全群でその上昇が抑制され、KW1mg−11wk群、KW 10mg−11wk群はチャレンジ2回目から、KW1mg−8wk群はチャレンジ3回目直後から有意に上昇を抑制した。耳介部のみの臨床スコア、頭皮のみの臨床スコアに関しても同様にKW3110摂取全群で有意差が見られた(図24、25、26)。また頭部の写真からも耳介部の糜爛・組織欠損が、KW摂取群で抑えられているのが確認できる(図27)。
以上の結果から、KW摂取により血中総IgE濃度の上昇抑制、ハプテン刺激による耳介肥厚の抑制、臨床レベルでの症状悪化の抑制が確認された。よってKW3110摂取によりNC/Ngaマウスにおけるハプテン誘発アトピー性皮膚炎に対して症状改善効果をもつことが示された。
KW3110株のヒトでの効果を検証するために、花粉症ボランティアに対して下記の試験を行った。
(試験試料)
実施例2でTh1、Th2両パラメーターの評価が共にE評価であったLactobacillus delbrueckii B株あるいはL. paracasei KW3110株で作製したヨーグルト試作品。菌数として2×108 cfu/mlを含む。
(試験対象)
企業に勤務するボランティア花粉症患者28名。本試験は、ヘルシンキ宣言にのっとり,全ての被験者に対して事前に試験内容、方法に関する十分な説明を行い、文書によるインフォームドコンセントを得て行った。
(試験群)
被験者28名を無作為に2群に分けた。1群は対照ヨーグルトであるL.delbrueckii B株ヨーグルト、もう1群はL.paracaseiKW3110株ヨーグルトを一日200ml(KW3110株乾燥菌体40mgに相当する)摂取した。群分けの結果については試験終了まで第3者が情報を管理する2重盲検試験で行われた。
(試験期間)
2003年1月20日から4月14日。
被験者に対して、0週(試験開始時)、4、8、12週目(試験終了時)に採血を行った。血液はファルコバイオシステムズ(株)において次の項目について測定を行った:NK細胞活性、Th1及びTh2細胞数の比(Th1/Th2比)、好酸球数、ECP値、血中総IgE量、血中スギ花粉特異的IgE量。
これらのデータは試験終了後、統計処理を行ってデータ化した。
また、被験者は表に示すアンケートフォームに5段階(3+:高度、2+:中等度、+:軽度、±:軽微、−:なし)で採血時に答えた。3+を4点、2+を3点、+を2点、±を1点、−を0点として、スコア化して統計処理を行った。
図32に示すように、試験開始時と終了時を比較した時、対照であるL. delbrueckii B株ヨーグルト群(対照群)ではTh1/Th2比が有意な低下を示し、図33に示すように、ECP値では有意な上昇を示した。一方、L. paracasei KW3110株ヨーグルト群(KW群)ではどちらの値についても試験前後での有意な変化は認められなかった。また、図34に示すように、自覚症状をスコア化したものについてものどのかゆみ、目の痛み、まぶたの重みの項目でKW群の方が対照群より低い傾向が認められた。以上の結果、ヒト花粉症においてもKW3110株の有効性が示された。
以下に、本発明の抗アレルギー活性を有する乳酸菌を飲料の製造に適用した場合の実施例について記載する。
調製例1.乳酸菌KW3110株菌体の調製
乳酸菌の培養には、培養用培地(グルコース 1%、酵母エキスS(武田キリン社)1%、MgSO4・7H2O 50ppm、MnSO4・5H2O 50ppm)を使用した。前培養は乳酸菌KW3110株を培養用培地10mlに接種し、37℃で20〜24hr静置し、行った。本培養は、前培養液0.6mlを120mlの培養用培地に接種し、200ml容ファーメンター(モデルBMJ−25、エイブル社)を用いて、28℃にて培養した。通気量は0.12L/min、攪拌速度は500rpmとした。pHは25% NaOH溶液を用いてpH 4.5以下にならないように制御した。培養は48時間行った。
85℃の熱水で抽出した烏龍茶、紅茶、緑茶、ほうじ茶、ジャスミン茶の抽出液に対して、茶葉使用率が0.8重量%になるように脱イオン水を追加した。その際、アスコルビン酸を0.025重量%になるように添加し、ついで重曹を用いて飲みやすいpHに調整した。さらに当該調合液100gに対して、乳酸菌KW3110株を菌数が1.5×1010個、3×1010個になるように添加した後、常法通りUHT殺菌をおこない、350ml容PETボトルに充填した。
はと麦茶250gを熱湯10kgで30分間煮出して、ろ過した後、遠心分離をおこなった。得られた抽出液に、乳酸菌KW3110株を最終製品100gあたり8×1010、1.5×1010、3×1010個になるように加えた後、さらにアスコルビン酸と重曹を加えて味を調整してから、10kgに脱イオン水で再度メスアップした。ついで常法通りUHT殺菌して、500ml容PETボトルにアセプティック充填した。官能評価に供したところ、いずれも満足できる香味であり、充分毎日継続して飲みつづけられるとの高い評価が得られた。ただし、3×1010個添加したサンプルは外観上、乳酸菌がオリとして目立ちやすく、それ以下の方がより好ましいと評価された。
混濁リンゴ果汁900gと香料1gに対して所定量の乳酸菌菌体を添加し、さらに脱イオン水を加えて合計1kgになるようにした後、常法通り180ml容ガラス瓶でホットパック充填をおこない、リンゴ果汁入り飲料を調製した。なお、乳酸菌KW3110株は、当該調合液100gに対して、菌数が2×1010個、若しくは4×1010個になるように添加した。
官能評価の結果、いずれのサンプルについても乳酸菌配合による香味の違和感は全くなく、外観上も何ら問題なかった。
グラニュー糖4.5重量%、クエン酸0.2重量%、クエン酸ナトリウム0.05重量%、香料0.1重量%を含む調合液に対し、乳酸菌KW3110株を0.0143重量%(製品100gあたり1.5×1010個)を添加した。さらにこの液を90℃まで加熱して殺菌し、ペットボトルにホットパックしてスポーツドリンクタイプの飲料を調製した。官能評価の結果、外観、香味ともに満足できるものであった。本飲料中の乳酸菌菌体を遠心分離してから、純水で2回洗浄した後、凍結乾燥を行い、乾燥菌体を得た。できあがった製品をマウスリンパ球を用いたin vitroの系で評価した結果、所定の活性を保持していた(図35)。
トマトジュースに対して所定量の乳酸菌菌体を添加た後、190g缶に充填して常法に従ってレトルト殺菌をおこなったた。なお、乳酸菌KW3110株は、当該調合液100gに対して、菌数が2.5×1010個もしくは5×1010個になるように添加した。
官能評価の結果、いずれのサンプルについても乳酸菌配合による違和感は全くなく、外観上も何ら問題なかった。
粉砕したコーヒー焙煎豆(コロンビア)を95℃の熱水で抽出してコーヒー抽出液を得た。これに脱イオン水を添加して可溶性固形分1.4%になるように希釈した。当該調合液100gに対して、乳酸菌KW3110株を菌数が2×1010個、4×1010個になるように添加した後、190g缶に充填し、常法通りレトルト殺菌をおこなった。
官能評価の結果、いずれのサンプルについても乳酸菌配合による違和感は全くなかった。ただし、コップ等に移した場合4×1010個添加したサンプルは外観上、乳酸菌がオリとして目立ちやすく、1.5×1010個の方がより好ましいと評価された。しかし、缶から直接飲用する場合には問題なかった。
乳を含む原材料(牛乳、脱脂粉乳、クリーム、砂糖液糖、安定剤、香料、水)を均一に混合し、128℃、15秒の加熱殺菌を行い、40℃以下まで冷却後、乳酸菌スターターKW3110を添加し、37℃に維持した発酵タンクで発酵を開始した。乳酸菌KW3110が混合液中の乳糖を分解し乳酸が生成して、約18時間でpH4.6となり、乳タンパク質の等電点凝集により、ゲル化が安定した時点で撹拌冷却した。撹拌によりペースト状になったヨーグルトを紙容器に充填、密封し、10℃以下の冷蔵庫で冷却保管した。冷却後、官能検査により、ヨーグルトとして適正な食味と物性を有することを確認した。このときのヨーグルト原材料の配合割合を表7に示す。また原材料中の脂肪分、SNF(無脂乳固形分)の割合及び甘味度を表8に示す。できあがった製品をマウスリンパ球を用いたin vitroの系で評価した結果、所定の活性を保持していた(図36)。
乳酸菌KW3110株の調整乾燥末67gに、糖類である還元パラチノース、ソルビトール、キシリトールおよびアラビアガムを、適宜、水をバインダーとして加熱・造粒しながら添加し、クエン酸、ステビア、香料等で味を調整し、打錠機によりタブレット状に成型しやすいよう、粉末油脂とショ糖エステルを加え1000gの混合物を得た。その後、1粒あたり1.5gになるよう打錠し、香味的に好ましいタブレット状の健康食品を製造した。この際、乳酸菌KW3110株は1粒当たり5×1010であった。
乳酸菌KW3110株の調整乾燥末100gに、デキストリンを50g添加し、均等に混和したのち、プルラン、植物油脂、カラギーナン、塩化カリウムからなる硬カプセル基材に充填し、硬カプセルで被包された、1カプセル213mgの健康食品を得た。この際、乳酸菌KW3110株は1カプセル当たり5×1010であった。
乳酸菌KW3110株の調整乾燥末100gに、デキストリンを50g添加し、均等に混和したのち、ゼラチンとグリセリンからなる硬カプセル基材に充填し、硬カプセルで被包された1カプセル213mgの健康食品を得た。この際、乳酸菌KW3110株は1カプセル当たり5×1010であった。
乳酸菌KW3110株の調整乾燥末100kgを、サフラワー油180kg、ミツロウ20kg、大豆レシチン5kgの混合物で均等に懸濁したのち、カラギーナン、デンプン、グリセリンを主成分とするカプセル基材で被包し、1カプセル450mgの楕円球状の軟カプセル状に成型した。この際、乳酸菌KW3110株は1カプセル当たり5×1010であった。
乳酸菌KW3110株の調整乾燥末100kgを、サフラワー油180kg、ミツロウ20kg、大豆レシチン5kgの混合物で均等に懸濁したのち、ゼラチンとグリセリンからなるカプセル基材で被包し、1カプセル450mgの楕円球状の軟カプセル状に成型した。この際、乳酸菌KW3110株は1カプセル当たり5×1010であった。
乳酸菌KW3110株の調整乾燥末100kgを、スティック充填機にて、1スティック1gとなるように充填し、乳酸菌KW3110株が1スティック当たり5×1011個となる健康食品を得た。
乳酸菌KW3110株の調整乾燥末100kgに、デキストリン900kgを添加し、水をバインダーとして流動層造粒機を用いて、均等に混和・加熱・造粒を行い、造粒物1000kgを得た。その後この造粒物を、スティック充填機にて、1スティック1gとなるように充填し、乳酸菌KW3110株が1スティック当たり5×1010個となる健康食品を得た。できあがった製品をマウスリンパ球を用いたin vitroの系で評価した結果、所定の活性を保持していた(図37)。
乳酸菌KW3110株の調整乾燥末100kgに、デキストリン900kgを添加し、水をバインダーとして流動層造粒機を用いて、均等に混和・加熱・造粒を行い、造粒物1000kgを得た。その後この造粒物を、18号篩を全量通過するまで粉砕し、スティック充填機にて、1スティック1gとなるように充填し、乳酸菌KW3110株が1スティック当たり5×1010個となる粉末状健康食品を得た。
乳酸菌KW3110株の調整乾燥末100gを、ケール葉の搾汁液10kgに添加し、乳酸菌が液中で分散しやすいよう、アルギン酸ナトリウム10gで粘度を調整し、懸濁液状健康食品を得た。
乳酸菌KW3110株の調整乾燥末100gをぶどう糖0.7kg、蒸留水5kgとぶどう香料5g混和し、加熱殺菌後、1本50mlの密封容器に無菌的に充填することでシロップ状の懸濁液状健康食品を得た。このものは小児に違和感を与えず好評であった。
Claims (10)
- Lactobacillus paracasei KW3110株又は抗アレルギー活性を有するLactobacillus paracasei KW3110株の変異株を活性成分として添加したことを特徴とする抗アレルギー機能を有する飲食品。
- 抗アレルギー活性を有する乳酸菌を、1日に摂取する飲食品の量当たり、5×109個以上となるように含有させたことを特徴とする請求項1記載の抗アレルギー機能を有する飲食品。
- 飲料及び食品が、アレルギーの原因となる成分を含有していないことを特徴とする請求項1又は2記載の抗アレルギー機能を有する飲食品。
- 飲料及び食品が、アレルギーの原因となる成分を含有しない錠剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、又はドリンク剤であることを特徴とする請求項3記載の抗アレルギー機能を有する飲食品。
- 乳酸菌を、殺菌して用いることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の抗アレルギー機能を有する飲食品。
- 請求項1記載の抗アレルギー活性を有する乳酸菌を活性成分として添加したことを特徴とする抗アレルギー機能を有する飲料。
- 飲料が、乳成分非配合密封容器入り飲料であることを特徴とする請求項6記載の抗アレルギー機能を有する飲料。
- 飲料が密封容器入り果汁含有清涼飲料又は茶飲料であることを特徴とする請求項7記載の抗アレルギー機能を有する飲料。
- 密封容器入り飲料において、添加する乳酸菌が、飲料100gあたり109〜1011個の範囲であることを特徴とする請求項7又は8記載の抗アレルギー機能を有する飲料。
- 食品又は飲料が、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、又は病者用食品として調製されていることを特徴とする請求項1〜9のいずれか記載の抗アレルギー機能を有する食品又は飲料。
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