WO2004024752A1 - タンパク質精製方法 - Google Patents

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WO2004024752A1
WO2004024752A1 PCT/JP2003/011642 JP0311642W WO2004024752A1 WO 2004024752 A1 WO2004024752 A1 WO 2004024752A1 JP 0311642 W JP0311642 W JP 0311642W WO 2004024752 A1 WO2004024752 A1 WO 2004024752A1
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antibody
protein
dna
aqueous solution
conductivity
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Kozo Takeda
Norimichi Ochi
Kimie Ishii
Manabu Matsuhashi
Akinori Imamura
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying a protein, and more particularly to a method for removing impurities such as DNA as a contaminant from a sample containing a physiologically active protein such as an antibody.
  • DNA is generally obtained by treating an aqueous medium containing bioactive proteins obtained from host cells with anion exchange chromatography, hydroxyapatite chromatography, or a combination thereof. Has been removed.
  • bioactive protein when the bioactive protein is an antibody obtained using a mammalian cell as a host, protein A or protein G can be used by utilizing the property that protein A or protein G binds to the Fc chain of IgG. After performing affinity column chromatography, the product is purified by various chromatography methods.
  • an antibody obtained from a mammalian cell culture is applied to absorb the antibody onto a column, and then an acidic solution (about 0.1 M concentration of citric acid, PH The antibody is eluted using 3.0-3.5), and the resulting acidic eluate is applied to ion exchange column chromatography and size exclusion column chromatography in that order for purification.
  • an acidic solution about 0.1 M concentration of citric acid, PH
  • the antibody is eluted using 3.0-3.5
  • the resulting acidic eluate is applied to ion exchange column chromatography and size exclusion column chromatography in that order for purification.
  • An object of the present invention is to provide a method for purifying a physiologically active protein, particularly an antibody, which can reliably remove impurities such as DNA contaminants and viruses by a simpler method, has a low loss of the biologically active protein, and has a low implementation cost. It is to be. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, surprisingly, a bioactive protein-containing sample was prepared using a low-conductivity aqueous solution at a pH lower than the isoelectric point of the bioactive protein.
  • the present inventors have found that the resulting particles can be efficiently filtered to remove impurities such as DNA contaminants and viruses without performing a complicated chromatographic step by filtering.
  • the present invention provides the following.
  • bioactive protein-containing sample is converted to a low conductivity aqueous solution of PH below the isoelectric point of the bioactive protein
  • a method for removing impurities in a sample containing a physiologically active protein is provided.
  • the bioactive protein-containing sample is made into a low-conductivity acidic or alkaline aqueous solution, and a buffer is added to the obtained sample to adjust the pH to a value lower than the isoelectric point of the bioactive protein.
  • the method of (1) is made into a low-conductivity acidic or alkaline aqueous solution, and a buffer is added to the obtained sample to adjust the pH to a value lower than the isoelectric point of the bioactive protein.
  • the physiologically active protein is an antibody
  • the antibody-containing sample is applied to protein A or protein G affinity chromatography, and is eluted with a low-conductivity acidic aqueous solution.
  • the bioactive protein contained in the bioactive protein-containing sample purified by the method of the present invention includes, for example, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage-dicolon stimulating factor (GM-CSF), Hematopoietic factors such as erythropoietin (EPII) and thrombopoietin, interferon, cytokins such as IL-11 and IL-16, monoclonal antibodies, tissue plasminogen activator (TPA;), perokinase, serum albumin But not limited to, blood coagulation factor VIII, lebutin, insulin, stem cell growth factor (SCF) and the like.
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte macrophage-dicolon stimulating factor
  • EPII erythropoietin
  • thrombopoietin interferon
  • cytokins such as IL-11 and IL-16
  • TPA tissue
  • antibodies such as G-CSF and monoclonal antibodies are preferred, and monoclonal antibodies are more preferred.
  • a monoclonal antibody is preferable.
  • Antibodies are classified into IgG, IgA, IgE, IgD, and IgM, with IgG antibodies being preferred.
  • the bioactive protein is a protein having substantially the same biological activity as a mammal, particularly a human bioactive protein, and includes naturally-occurring proteins and those obtained by genetic recombination, but is preferred. This was obtained by the genetic recombination method. Genetically modified bioactive proteins are produced in bacteria such as Escherichia coli; yeast; cultured cells derived from animals such as Chinese hamster ovary (CHO) cells, C127 cells, and COS cells, and extracted by various methods. Separated and refined products are used. Proteins obtained by genetic recombination include those having the same amino acid sequence as the natural protein, or those having one or more of the amino acid sequences deleted, substituted, or added, and having the biological activity. Furthermore, the biologically active protein includes those chemically modified with PEG or the like.
  • the origin of the sugar chain is not particularly limited, but a sugar chain added to mammalian cells is preferable.
  • Mammalian cells include, for example, Chinese Hams evening ovary cells (CHO cells), BHK cells, COS cells, and human-derived cells, among which CHO cells are the most preferred. No.
  • EP ⁇ may be produced by any method, extracted from human urine by various methods, separated and purified, genetic engineering techniques (for example, It is produced in bacteria such as Escherichia coli, yeast, Chinese hamster ovary cells (CH B), BHK cells, COS cells, human-derived cells, etc. and extracted and separated by various methods. The purified product is used. Furthermore, EPO chemically modified with PEG or the like is also included (see International Patent Application Publication No. WO 90/12874). Furthermore, EPO without sugar chain is also chemically modified with PEG or the like.
  • EP ⁇ analogs that have been modified to increase the number of one or more glycosylation sites at the N- or O-linked carbohydrate chain binding site in the amino acid sequence of EPO (eg, And JP-A-8-151398 and JP-T-8-506023.
  • the amount of sugar chains may be increased by increasing the content of sialic acid or the like without changing the number of sugar chain binding sites.
  • any G-CSF can be used as long as it is highly purified G-CSF.
  • the G-CSF in the present invention may be one produced by any method, such as one obtained by culturing a cell line of human tumor cells and extracting and separating and purifying it from various methods, or E. coli or the like by genetic engineering techniques. Bacteria; List bacteria; produced in animal-derived cultured cells such as Chinese hamster ovary (CHO) cells, C127 cells, and COS cells, and extracted and separated and purified by various methods are used. Preferably, it is produced by a gene recombination method using Escherichia coli, Listeria or CHO cells. Most preferably, it is produced by a CHO cell using a genetic recombination method. Furthermore, G-CSF chemically modified with PEG or the like is also included (see International Patent Application Publication No. WO 90/12874).
  • the monoclonal antibody may be produced by any method.
  • a monoclonal antibody is basically immunized with a sensitizing antigen according to a usual immunization method using a known technique, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a usual cell fusion method to give a usual screen.
  • the antibody can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells by the screening method.
  • a recombinant antibody produced by using an antibody gene cloned from a hybridoma, inserted into an appropriate vector, introduced into a host, and produced using a genetic recombination technique can be used (see, for example, Carl, AK Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • cDNA for the variable region (V region) of the antibody is synthesized from the hybridoma mRNA using reverse transcriptase.
  • DNA encoding the V region of the desired antibody is obtained, it is ligated to DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing the DNA of the human C region.
  • An expression control region for example, an enhancer, is incorporated into an expression vector so that expression is performed under the control of a promoter.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • a recombinant antibody artificially modified for the purpose of, for example, reducing the antigenicity to humans such as a chimeric antibody and a humanized antibody
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is an antibody consisting of a heavy chain and light chain variable region of a mouse antibody and a heavy chain and light chain constant region of a human antibody, and encodes the variable region of a mouse antibody.
  • the DNA can be obtained by ligating the DNA to be ligated to the DNA encoding the constant region of a human antibody, incorporating the DNA into an expression vector, introducing it into a host, and producing it.
  • the humanized antibody is also called a reshaped human antibody.
  • the complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal, such as a mouse antibody, is transplanted into the complementarity determining region of a human antibody.
  • the general method of gene recombination is also known. Specifically, a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody was constructed so as to have an overlapping portion at the end. Oligonu It is synthesized from nucleotides by the PGR method. The obtained DNA is ligated to DNA encoding the constant region of a human antibody, then inserted into an expression vector, and introduced into a host to produce it (European Patent Application Publication No.
  • a preferred example of such a reshaped humanized antibody is a humanized anti-IL-16 receptor antibody (hPM-1) (see International Patent Application Publication No. W ⁇ 92-19795). ). Also, a humanized anti-HM1.24 antigen monoclonal antibody (see International Patent Application Publication No. WO98-145580), a humanized anti-parathyroid hormone-related peptide antibody (anti-PTH rP antibody) (see International Patent Application Publication No. WO98-133388), humanized anti-tissue factor antibody (see International Patent Application Publication No. WO99-51734), etc. Are also preferred antibodies for use in the present invention.
  • a method for obtaining a human antibody is known.
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with a desired antigen or cells expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, for example, U266, to obtain a desired human antibody having antigen-binding activity.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes with an antigen (International Patent Application Publication Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94 / 02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).
  • a technique for obtaining human antibodies by panning using a human antibody library is also known.
  • a phage that binds to an antigen can be selected by expressing the variable region of a human antibody as a single-chain antibody (scFv) on the surface of a phage by the phage display method.
  • scFv single-chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • a suitable expression vector can be prepared based on the sequence to obtain a human antibody.
  • antibodies produced by transgenic animals or the like are also preferred.
  • antibodies include antibody fragments such as Fab, (Fab ') 2 , Fc, Fc', and Fd, and reconstituted antibodies such as monovalent or bivalent or more single-chain antibodies (scFV).
  • the bioactive protein-containing sample or the antibody-containing sample is preferably a culture medium for mammalian cells such as CH ⁇ cells containing a bioactive protein or antibody obtained by culturing, or a partial culture medium thereof. It is one that has undergone a certain process such as purification.
  • bioactive protein-containing sample is converted into a low-conductivity aqueous solution of PH below the isoelectric point of the bioactive protein
  • the impurity removed by the method of the present invention may be any substance other than the target protein.
  • impurities include DNA contaminants, viruses, protein A (eluted from ram), endotoxin, HCP (cell-derived protein), medium components Hy-Fish (FL), and IGF.
  • it is a DNA contaminant or virus.
  • the DNA contaminants are DNAs in a sample containing a physiologically active protein, and include DNAs from a host and DNAs from a contaminated virus.
  • the virus removed by the method of the present invention is not particularly limited, and any virus may be removed, and includes a DNA virus and an RNA virus.
  • the RNA virus include a retrovirus such as X-MuLV, a reovirus such as Reo3, and a parabovirus such as MVM.
  • viruses removed by the method of the present invention include, for example, X-MuLV, PRV, Reo3, MVM, VSV, Herpes Simplex, CHV, Sindbis, Mumps, Wax Chair, Measle, Rubella, Flu, Hells Zos Yuichi, Cytomegalo, Para Influenza, EB, HIV, HA, HB, NANB, ATL, ECHO, Valpo, etc.
  • the low-conductivity aqueous solution is generally an aqueous solution having a molar concentration of 0 to 100 mM, preferably 0 to 50 mM, more preferably 0 to 3 OmM, or an ionic strength of 0 to 0.2, preferably 0 to 0 mM. 0.12 or an aqueous solution having a conductivity of 0 to 300 mS / m, preferably 0 to 200 mS / m, and more preferably 0 to 150 mS / m.
  • the isoelectric point of a bioactive protein is a value of pH at which the charge of the bioactive protein disappears in an aqueous solution.
  • the isoelectric point can be measured by a method known to those skilled in the art.For example, the isoelectric point is obtained by performing electrophoresis in a solution having various pH values and determining the pH at which the physiologically active protein does not move. It can be measured by such means.
  • the pH below the isoelectric point of the bioactive protein is preferably a pH below the isoelectric point of the bioactive protein.
  • the impurity is DNA
  • the bioactive protein is positively charged by setting the pH to be equal to or lower than the isoelectric point of the bioactive protein, and that the DNA is further negatively charged.
  • the pH for negatively charging is not particularly limited, and a preferable pH below the isoelectric point of the bioactive protein can be used. Since the preferable pH below the isoelectric point of the bioactive protein is considered to be different for each bioactive protein, those skilled in the art will be familiar with known methods (for example, as described in the Examples, a plurality of samples having different pHs). , And measuring the DNA removal rate, protein recovery rate, etc.), it is possible to select a preferable pH below the isoelectric point of the bioactive protein. Such pH is usually pH 2.0 or higher, preferably pH 3.0 or higher, and particularly preferably pH 4.0 or higher.
  • ETC electrophoresis titration curve
  • a sample containing a physiologically active protein is acidified with low conductivity.
  • a buffer is added to the obtained sample to adjust the pH to a value below the isoelectric point of the bioactive protein
  • the impurities removed by the method of the present invention are as described above.
  • the acidic aqueous solution having a low conductivity refers to an aqueous solution having a molar concentration of 0 to 100 mM, preferably 0 to 50 mM, more preferably 0 to 3 O mM, or an ionic strength of 0 to 0 mM. 2, preferably an aqueous solution of 0 to 0.12 or an aqueous solution having a conductivity of 0 to 300 mS / m, preferably 0 to 200 mS / m, more preferably 0 to 150 mS / m, pH 2.0 to 3.9, Preferably, it refers to an aqueous solution having a pH of 2.0 to 3.0.
  • the acidic aqueous solution may be selected from aqueous solutions of hydrochloric acid, citric acid, acetic acid and the like.
  • the type, conductivity, and H of the low-conductivity acidic aqueous solution to be used vary depending on the type of the biologically active protein and the antibody to be purified, and those skilled in the art may carry out preliminary tests according to the method described in this specification. By doing so, these optimum conditions can be easily set.
  • the low-conductivity alkaline aqueous solution used in the method of the present invention may be a water solution having a molar concentration of 0 to 100 mM, preferably 0 to 50 mM, more preferably 0 to 30 mM, or an ion solution.
  • a bioactive protein-containing sample is converted into a low-conductivity acidic or alkaline aqueous solution, and a buffer is added to the obtained sample to adjust the pH to the isoelectricity of the bioactive protein. Adjust the pH below the point.
  • the buffer include Tris-HCl, phosphate, Tris, Na 2 HPO 4 , and NaOH.
  • an antibody-containing sample is applied to an affinity mouth chromatography of protein A or protein G and eluted with a low-conductivity acidic aqueous solution. Then, it is possible to adjust the pH to a preferable value below the isoelectric point of the physiologically active protein by adding a buffer to the obtained eluate.
  • a buffer is added to the obtained eluate to adjust the pH to a value below the isoelectric point of the physiologically active protein
  • the impurities removed by the method of the present invention are as described above.
  • Acidic aqueous solution of low conductivity for use in this process Ki is permitted to use those mentioned above, also as a buffer, for example Tris-HCl, phosphate, Tris, and the like Na 2 HP0 4, NaOH it can.
  • a solution having a pH below the isoelectric point of the physiologically active protein in the above-described step produces particles (cloudy).
  • impurities such as DNA contaminants can be efficiently removed.
  • the filter used for the filtration for example, a 1.0-0.2 m Cellulose Acetate Filter System (manufactured by Coming) or TFF can be used, but the filter is not limited thereto.
  • a centrifugal separation operation or the like can be considered, and any method capable of efficiently removing the particles may be used, and the method is not limited to filter filtration.
  • the present inventors presume that when the impurity is DNA, the particle is a complex formed by a bioactive protein and DNA.
  • a protein is positively charged when it has a pH lower than its isoelectric point, while a negatively charged DNA forms a complex of DNA and protein. It is estimated that it will be formed.
  • the use of a low-conductivity aqueous solution makes it easier to form complexes. The removal of the particles by filtration removes a small amount of the bioactive protein contained in the DNA-bioactive protein complex, but it is a few percent of the total bioactive protein, and is described in Examples described later. Thus, about 90% of the bioactive protein could be recovered.
  • the bioactive protein purified by the method of the present invention can be further purified by cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, hydroxyapatite chromatography, or a combination thereof, and used in a pharmaceutical preparation.
  • a DNA quantification method measurement is performed by a threshold total DNA quantification method, and a DNA extraction operation is performed prior to the measurement, but is not limited thereto.
  • TCID 50 tissue culture infective dose (50%); 50% cultivated cell infection amount) using the virus infectivity to detected cells as an index, and RT / Q that can quantify the amount of virus in fractions -Measured by PCR and Q-PCR, but not limited to these.
  • Example 1 Investigation of buffer composition of protein A affinity chromatography in purification of hPM-1 (humanized anti-IL-16 receptor antibody)
  • h PM-1 antibody humanized anti-IL-6 receptor antibody production CHO cell culture supernatant (hereinafter abbreviated as CM) (Cell centrifugation removed: stored at -80 ° C) It was filtered using Cellulose Acetate (abbreviated as CA) Filter System (CORNING) and used for purification studies.
  • CM Cell culture supernatant
  • CA Cellulose Acetate
  • CORNING Cellulose Acetate
  • HPLC L-6200 Intelligent Pump (HITACHI)
  • hPM-1 quantification method Quantification is performed by reverse-phase HPLC using a PLRP-S column (Polymer Laboratories) by a linear concentration gradient method.
  • DNA content measurement method Threshold total DNA measurement method. Perform a DNA extraction procedure (such as a DNA extractor kit ⁇ Wako Pure Chemicals>) prior to measurement. For the measurement, use a threshold total DNA quantification kit (Molecular Devices). Turbidity measurement method: A spectrophotometer is used to measure the sample to monitor the state of particle formation.
  • the sample is subjected to U-2000 (HITACHI), and the absorption at 660 nm is measured.
  • NaCl was added to the eluate hydrochloric acid in Elution Method 2, and the correlation between the added NaCl concentration (0 mM, 50 mM, 100 mM) and various factors was determined.
  • the Protein A eluted fraction with each NaCl addition was adjusted to pH 7.0 with a 300 mM Tris solution before filtering, and after adjusting the pH, the sample was added to a 0.22 m CA Filter. The filtered sample was taken after filtration. The hPM-1 recovery rate (after filtration only) of the sample before and after filtration was measured using the above measurement method, and the remaining The amount of DNA was measured.
  • Table 2 shows the results of examining the correlation between the added NaCl concentration in the eluate hydrochloric acid and various factors.
  • the hPM-1 recovery after filtration was 88% for the lOOmM NaCl-added sample, and was 86% for the 50mM NaCl addition and 81% for the OmM NaCl addition in that order.
  • the sample before and after filtration showed a low value in the sample with OmM NaCl, and the sample with OmM NaCl after filtration showed a very low value of llpg DNA / mg h PM-1.
  • a 0.45 + 0.2 m CA SARTOBRAN P filter (sartorius) was purified by a method using protein A affinity single column chromatography under the following conditions.
  • the PTHrP antibody was obtained from International Patent Application Publication No.
  • CA filter to remove DNA by filtration (conditions are examined in (1) below).
  • a sample containing a humanized anti-HM1.24 antigen monoclonal antibody (culture supernatant cultured in CHO cells) was purified by a method using protein A affinity single column chromatography under the conditions shown in Table 4 below.
  • the HM1.24 antigen monoclonal antibody was prepared by the method described in International Patent Application Publication No. WO 98/14580 (isoelectric point: pH 9.0).
  • hPM-1 antibody humanized IL-16 receptor antibody
  • CH ⁇ cell culture supernatant (CM) Cell centrifuged: stored at 80 ° C
  • X-MuLV Reo 3 MVM was added to each sample. After the addition, each CM was filtered using a 0.45 m filter (pottle top filter: CORNING) and used for purification studies.
  • the hPM-1 antibody was prepared in the same manner as in Example 1. Each virus used was obtained from ATCC (American Type Culture Collection).
  • the virus-added sample prepared in 5.1 was purified by rProtein Column Chromatography.
  • the specific conditions are as follows.
  • the eluted fraction obtained in 5.2 was adjusted to pH 3.2 ⁇ 0.1 with lmol / L hydrochloric acid and kept at room temperature 15 ⁇ 5 for 30 minutes or more. Thereafter, each eluted fraction was adjusted to pH 7.2 ⁇ 0.1 with a 300 mmol / LTris solution. 40.0 mL of this was placed in a glass fiber filter (Millipore) (0.2 m PALL) on the primary side, and Bio-inert (0.2 m, PALL) in a PALL filter holder with a diameter of 15 mm. (Attached to an Asystar)) and filtered under a pressure of 0.03 ⁇ 0.01 MPa using a filter unit connected to the secondary side. 5.4 Virus Detection
  • TCID 5 o All the collected samples were measured at TCID 5 o.
  • RT / Q-PCR and Q-PCR which can quantify the amount of virus in fractions, can be used in addition to TCID 50 , which measures virus infectivity to detected cells. r seven.
  • Table 8 virus titer (TCID 5 o method: Logio / mL)
  • impurities such as DNA contaminants and viruses can be efficiently removed by an extremely simple method, and the purification of bioactive proteins, particularly antibodies, has become much more effective.
  • impurities are D NA is the very low concentrations of D NA concentration (eg 22.5 pg / ml)
  • the Huy Ruska value very low values (e.g. TCID 5 o Method 1.0 3 (by the notation of Logio / mL)).
  • the cost can be reduced by the method of the present invention, which has a special technical significance.

Abstract

　課題：より簡単な方法で、ＤＮＡ夾雑物やウイルスといった不純物を確実に除去でき、しかも生理活性タンパク質の損失が少なく、かつ実施コストの低い生理活性タンパク質、特に抗体の精製方法を提供する。解決手段：以下の段階：１）生理活性タンパク質含有試料を、該生理活性タンパク質の等電点よりも低いｐＨの低伝導度水溶液状態とし、２）生じる粒子を除去する、を含む、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する方法。

Description

明細書
タンパク質精製方法
技術分野
本発明はタンパク質の精製方法に関し、 さらに詳しくは抗体などの生理活性夕 ンパク質を含有する試料中から夾雑物としての D N Aといった不純物を除去する 方法に関する。 背景技術
遺伝子組換え技術の発達によって、 種々のタンパク質製剤が安定した供給量で 提供されるようになった。 特に、 近年通常の医薬品に比べて選択性の高い様々な 抗体医薬品が遺伝子組換え技術によって開発されており、臨床試験に入っている。 このような遺伝子組換え技術によって産生された生理活性夕ンパク質を含有す る製剤においては、 宿主 D N Aやウィルスの汚染による不純物、 例えば D NA夾 雑物を除去する必要がある。 現在、 バイオ医薬品における D N Aの許容量は 1 0 O p g D NAZ—投与量以下であることが世界保健機構 （WH O) により示され ている。 この基準を満たすために、 一般には、 宿主細胞から得られる生理活性タ ンパク質を含有する水性培地を陰イオン交換クロマトグラフィー、 ハイドロキシ ァパタイトク口マトグラフィー、 もしくはこれらの組合せで処理することにより D NAを除去している。
特に、 生理活性タンパク質が哺乳動物細胞を宿主として得られた抗体であると きには、 プロテイン Aもしくはプロテイン Gが I g Gの F c鎖に結合する性質を 利用して、 プロテイン Aもしくはプロテイン Gのァフィ二ティカラムクロマトグ ラフィー処理を行った後に種々のクロマトグラフィ一で精製している。
例えば、 特表平 5— 5 0 4 5 7 9号では、 哺乳動物細胞培養から得られた抗体 適用して抗体をカラムに吸収させ、次いで酸性溶液（濃度約 0 . 1 Mのクェン酸、 P H 3 . 0— 3 . 5 ) を用いて抗体を溶出させ、 得られる酸性溶出液をイオン交 換カラムクロマトグラフィー、 サイズ排除カラムクロマトグラフィーに順次適用 して精製している。 しかし、 これらの各種クロマトグラフィー工程やその組合せは時間、 労力、 コ ストがかかり、 煩雑であり、 また効果も安定していない。
本発明の目的は、 より簡単な方法で、 確実に DNA夾雑物やウィルスといった 不純物を除去でき、 しかも生理活性タンパク質の損失が少なく、 かつ実施コスト の低い生理活性タンパク質、 特に抗体の精製方法を提供することである。 発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、驚くべきことに、 生理活性夕ンパク質含有試料を、 生理活性夕ンパク質の等電点より低い p Hで低 伝導度水溶液にし、 生じた粒子をフィルター濾過することにより、 煩雑なクロマ 卜グラフィ一工程を行わずに D N A夾雑物やウイルスといつた不純物を効率よく 除去できることを見出してして本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 以下のものを提供する。
(1) 以下の段階：
1) 生理活性タンパク質含有試料を、 該生理活性タンパク質の等電点以下の PH の低伝導度の水溶液状態とし、
2) 生じる粒子を除去する、
を含む、 生理活性夕ンパク質含有試料中の不純物を除去する方法。
(2) 低伝導度の水溶液の伝導度が、 0〜： LOOmMのモル濃度である前記 （1) 記 載の方法。
(3) 低伝導度の水溶液のイオン強度が、 0〜0.2である前記 （1) 又は （2) 記 載の方法。
(4) 低伝導度の水溶液の導電率が、 0〜300mS/mである前記 （1) 〜 （3) の いずれかに記載の方法。
(5) 溶液が塩酸、 クェン酸、 酢酸の水溶液から選択される前記 （1) 〜 （4) のいずれかに記載の方法。
(6) 水溶液の pHが生理活性タンパク質の等電点以下、 かつ pH2. 0以上で ある前記 （1) 〜 （5) のいずれかに記載の方法。
(7) 不純物が DN A夾雑物である （1) 〜 （6) のいずれかに記載の方法。 (8) 不純物がウィルスである （1) 〜 （6) のいずれかに記載の方法。
( 9 ) DNA夾雑物除去処理後の生理活性夕ンパク質含有試料中の DNA夾雑物が DNA濃度 22.5pg/ml以下である （7) に記載の方法。
(10) 生理活性タンパク質が抗体である前記 （1) 〜 （9) のいずれかに記載 の方法。
(1 1) 抗体が I gG抗体である前記 （10) に記載の方法。
(12) 抗体がヒト型化モノクローナル抗体である前記 （10) 又は （11) に 記載の方法。
(13) 抗体がヒト型化抗 I L— 6レセプター抗体である前記 （12) 記載の方 法。
(14) 抗体がヒ卜型化抗 HM1. 24抗原モノクローナル抗体である前記 （1 2) 記載の方法。
(15) 抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体 （抗 PTHr P抗 体） である前記 （12) 記載の方法。
(16)生理活性タンパク質が顆粒球コロニー刺激因子である前記（1) 〜 （9) のいずれかに記載の方法
(17) 粒子をフィルター濾過によって除去する前記 （1) 〜 （16) のいずれ かに記載の方法。
(18) 生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液 状態とし、 得られる試料に緩衝液を添加して PHを該生理活性タンパク質の等電 点以下の PHに調整することによって 1) の工程を行う、 （1) の方法。
(19) 生理活性タンパク質が抗体であって、 該抗体含有試料をプロテイン Aも しくはプロテイン Gのァフィ二ティクロマトグラフィーに適用して、 低伝導度の 酸性水溶液で溶出し、 得られる溶出液に緩衝液を添加して pHを該抗体の等電点 以下の PHに調整することによって 1) の工程を行う、 （1) の方法。
(20) 緩衝液が Tr i s水溶液である前記 （18) 又は （19) 記載の方法。 (21) 前記 （1) 〜 （20) のいずれかに記載の方法によって得られる精製生 理活性タンパク質。
(22)前記（1)〜（20)のいずれかに記載の方法を用いた精製工程を含む、 医療用タンパク質製剤の製造方法。 発明を実施するための最良の形態
本発明の方法で精製する生理活性タンパク質含有試料に含まれる生理活性夕ン パク質は、 例えば、 顆粒球コロニー刺激因子 （G— CSF) 、 顆粒球マクロファ —ジコロニー剌激因子 (GM—CSF)、エリスロポエチン (EP〇)、 トロンボポェ チン等の造血因子、 インタ一フエロン、 I L一 1や I L一 6等のサイト力イン、 モノクローナル抗体、組織プラスミノーゲン活性化因子 (TP A；)、ゥロキナーゼ、 血清アルブミン、 血液凝固第 VI I I因子、 レブチン、 インシュリン、 幹細胞成 長因子（S CF)などを含むが、 これらに限定されない。 タンパク質の中でも、 G 一 CSF、 モノクロナ一ル抗体等の抗体が好ましく、 さらに好ましくはモノクロ —ナル抗体である。 プロテイン Aもしくはプロティン Gァフィ二ティクロマトグ ラフィーを用いて実施する本発明の態様では、 モノクローナル抗体が好ましい。 抗体は I gG, I gA， I gE、 I gD、 I gMに分類されるが、 I g G抗体が 好ましい。
生理活性タンパク質とは、 哺乳動物、 特にヒトの生理活性タンパク質と実質的 に同じ生物学的活性を有するものであり、 天然由来のもの、 および遺伝子組換え 法により得られたものを含むが、 好ましいのは遺伝子組換え法により得られたも のである。 遺伝子組換え法による生理活性タンパク質は、 大腸菌などの細菌類； イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣 （CHO) 細胞、 C 127細胞、 CO S細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、 種々の方法で抽出し分離精 製したものが用いられる。 遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然 タンパク質とアミノ酸配列が同じであるもの、 あるいは該アミノ酸配列の 1又は 複数を欠失、 置換、 付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。 さら には、 生理活性タンパク質は PEG等により化学修飾されたものも含む。
生理活性タンパク質が糖鎖を有するタンパク質である場合、 糖鎖の由来として は、 特に制限はないが、 哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。 哺乳動物細 胞には、 例えば、 チャイニーズハムス夕一卵巣細胞 (CHO細胞)、 BHK細胞、 COS細胞、 ヒト由来の細胞等があるが、 この中でも、 CHO細胞が最も好まし い。
生理活性夕ンパク質が E P Oである場合には、 E P〇はいかなる方法で製造さ れたものでもよく、 ヒト尿より種々の方法で抽出し、 分離精製したもの、 遺伝子 工学的手法 （例えば特開昭 61— 12288号） により大腸菌などの細菌類、 ィ —スト菌、 チャイニーズハムスター卵巣細胞 （CH〇） 、 BHK細胞、 COS細 胞、 ヒト由来の細胞などに産生せしめ、 種々の方法で抽出し分離精製したものが 用いられる。 さらには、 PEG等により化学修飾された EPOも含む （国際特許 出願公開番号 WO 90/12874参照） 。 さらに、 糖鎖のついていない EPO を PEG等により化学修飾したものも含む。 また、 EPOのアミノ酸配列中の N —結合炭水化物鎖結合部位もしくは O—結合炭水化物鎖結合部位において、 1以 上のグリコシル化部位の数を増加させるように改変した EP〇類似体も含む （例 えば、特開平 8— 151398号、特表平 8— 506023号参照）。さらには、 糖鎖結合部位の数は変化させずに、 シアル酸等の含量を増加させることにより糖 鎖の量を増加させたものであってもよい。
生理活性タンパク質が G—CSFである場合には、 G—CSFは高純度に精製 された G— CSFであれば全て使用できる。 本発明における G— CSFは、 いか なる方法で製造されたものでもよく、 ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、 これから 種々の方法で抽出し分離精製したもの、 あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌 などの細菌類；ィ一スト菌；チャイニーズハムスター卵巣 （CHO) 細胞、 C 1 27細胞、 COS細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、 種々の方法 で抽出し分離精製したものが用いられる。 好ましくは大腸菌、 ィ一スト菌又は C HO細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。 最も好ましく は CHO細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。さらには、 P E G等により化学修飾された G— C S Fも含む （国際特許出願公開番号 W〇 9 0/12874参照） 。
生理活性夕ンパク質がモノクローナル抗体である場合には、 モノク口一ナル抗 体はいかなる方法で製造されたものでもよい。 モノクローナル抗体は、 基本的に は公知技術を使用し、 感作抗原を通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる 免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常のスクリー ニング法により、 モノク口一ナルな抗体産生細胞をスクリ一ニングすることによ つて作成できる。
また、 抗体遺伝子をハイプリドーマからクロ一ニングし、 適当なベクターに組 み込んで、 これを宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組 換え型抗体を用いることができる （例えば、 Carl， A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照） 。 具体的 には、 ハイプリドーマの mRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域 （V領 域） の cDNAを合成する。 目的とする抗体の V領域をコ一ドする DNAが得ら れれば、 これを所望の抗体定常領域 （C領域） をコードする DNA と連結し、 こ れを発現べクタ一へ組み込む。 または、 抗体の V領域をコードする DNA を、 钪体 C領域の DNA を含む発現ベクターへ組み込んでもよい。 発現制御領域、 例えば、 ェンハンサ一、 プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクター に組み込む。 次に、 この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現 させることができる。
本発明では、 ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的 に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメラ （Chimeric) 抗体、 ヒト型化 (Humanized ) 抗体などを使用できる。 これらの改変抗体は、 既知の方法を用 いて製造することができる。 キメラ抗体は、 ヒト以外の哺乳動物、 例えば、 マウ ス抗体の重鎖、 軽鎖の可変領域とヒ卜抗体の重鎖、 軽鎖の定常領域からなる抗体 であり、 マウス抗体の可変領域をコードする DNAをヒト抗体の定常領域をコ一 ドする DNA と連結し、 これを発現べクタ一に組み込んで宿主に導入し産生させ ることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体とも称され、 ヒト以外の哺乳動 物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region) をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一般的な遺伝 子組換え手法も知られている。 具体的には、 マウス抗体の CDR とヒト抗体のフ レ一ムワーク領域（framework region； FR) を連結するように設計した DNA配 列を、 末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌ クレオチドから PGR法により合成する。 得られた DNA をヒト抗体定常領域を コードする DNA と連結し、 次いで発現ベクターに組み込んで、 これを宿主に導 入し産生させることにより得られる （欧州特許出願公開番号 EP 239400 、 国際 特許出願公開番号 WO 96/02576参照） 。 CDR を介して連結されるヒト抗体の FR は、 相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必 要に応じ、 再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するよ うに抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい （Sato， et al.， Cancer Res. (1993) 53, 851-856) 。
このような再構成ヒト型化抗体としてヒト型化抗 I L一 6レセプタ一抗体 ( h P M- 1 ) が好ましく例示される （国際特許出願公開番号 W〇 9 2— 1 9 7 5 9 を参照） 。 また、 ヒト型化抗 HM 1 . 2 4抗原モノクローナル抗体 (国際特許出 願公開番号 W〇 9 8 - 1 4 5 8 0を参照） 、 ヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連べ プチド抗体 （抗 P TH r P抗体） （国際特許出願公開番号 WO 9 8 - 1 3 3 8 8 を参照） 、 ヒト型化抗組織因子抗体 （国際特許出願公開番号 W〇 9 9 - 5 1 7 4 3を参照） なども本発明で使用する好ましい抗体である。
また、 ヒト抗体の取得方法も知られている。 例えば、 ヒトリンパ球を in vitro で所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、 感作リンパ球をヒトミ エローマ細胞、 例えば U266と融合させ、 抗原への結合活性を有する所望のヒト 抗体を得ることもできる （特公平 1-59878参照） 。 また、 ヒト抗体遺伝子の全て のレパートリーを有するトランスジエニック動物を抗原で免疫することで所望の ヒト抗体を取得することができる （国際特許出願公開番号 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735参照） 。 さらに、 ヒト抗体ライブラリ一を用いて、 パンニングによりヒト抗体を取得する 技術も知られている。 例えば、 ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体 (scFv) として ファ一ジディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、 抗原に結合するファ —ジを選択することができる。 選択されたファージの遺伝子を解析すれば、 抗原 に結合するヒ卜抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定することができる。 抗原に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列に基づいて適当な 発現べクタ一を作製し、 ヒト抗体を取得することができる。 これらの方法は既に 衆知であり、 WO 92/01047， WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
さらに、 トランスジエニック動物等によって作製されたヒト抗体も好ましい。 さらに、 抗体には Fab, (Fab')2, Fc, Fc'， Fdなどの抗体断片や、 1価又は 2価以 上の一本鎖抗体 (scFV) などの再構成したものも含む。
本発明では、 生理活性タンパク質含有試料もしくは抗体含有試料とは、 好まし くは、 培養により得られた生理活性タンパク質もしくは抗体を含む C H〇細胞な どの哺乳動物細胞の培養培地、 あるいはこれに部分的精製などの一定の処理を施 したものをいう。
本発明の好ましい態様では、 以下の段階：
1 ) 生理活性タンパク質含有試料を、 該生理活性タンパク質の等電点以下の P H の低伝導度水溶液状態とし、
2 ) 生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、 生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。 本発明の方法によって除去される不純物は、 目的のタンパク質以外の物質であ れば、 いかなる物質でもよい。 不純物の例としては、 D NA夾雑物、 ウィルス、 プロティン A (力ラムからの溶出物）、エンドトキシン、 HCP (細胞由来蛋白質）、 培地成分である Hy-Fish(FL)、 IGFなどを挙げることができるが、 好ましくは D NA夾雑物又はウィルスである。 ここで D NA夾雑物とは、 生理活性タンパク質 含有試料中の D NAであり、 宿主由来の D NAや汚染したウィルス由来の D NA が含まれる。
本発明の方法によって除去されるウィルスには特に制限はなく、 どのようなゥ ィルスを除去してもよく、 D NAウィルス及び R NAウィルスが含まれる。 R N Aウィルスとしては、 X-MuLVといったレトロウイルス、 Reo 3といったレオゥ ィルス、 MVMといったパラボウイルスが挙げられる。 本発明の方法によって除 去されるウィルスの具体的な例としては、例えば、 X-MuLV、 PRV、 Reo 3、 MVM, VSV、 ヘルぺスシンプレックス、 CHV、 シンドビス、 ムンプス、 ワクチェア、 Measle、 Rubella, インフルエンザ、 ヘルぺスゾス夕一、 サイトメガロ、 パラー インフルエンザ、 EB、 HIV、 HA、 HB、 NANB、 ATL、 ECHO、 バルポなどを 挙げることができるが、 好ましくは、 X-MuLV、 Reo3、 MVM、 PRVである。 本発明において、 低伝導度水溶液とは、 通常、 モル濃度が 0〜100mM、 好 ましくは 0〜50mM、 さらに好ましくは 0〜 3 OmMの水溶液または、 イオン 強度が 0〜0.2、好ましくは0〜0.12の水溶液または、導電率が 0〜300mS/m、 好ましくは 0〜200mS/m、 さらに好ましくは 0〜150mS/mの水溶液をいう。 生理活性タンパク質の等電点とは、 水溶液中において生理活性タンパク質の電 荷が見かけ上なくなる p Hの値である。 等電点は当業者に公知に方法により測定 することが可能であり、 例えば、 種々の pHの溶液中で電気泳動を行い生理活性 夕ンパク質が移動しなくなる p Hを求める等電点電気 動などにより測定するこ とが可能である。 生理活性タンパク質の等電点以下の pHは、 好ましくは生理活 性タンパク質の等電点未満の p Hである。
本発明の方法において、 不純物が DNAである場合、 生理活性タンパク質の 等電点以下の P Hにすることにより生理活性夕ンパク質を正に帯電させ、 さらに DN Aを負に帯電させることが好ましい。
通常、 DNAはバックボーン中のリン酸基により非常に強い負イオンの電荷を 有している （核酸の強酸性リン酸ジエステル結合内のリン酸基の PK値は約 1で ある） ので、 DNAを負に帯電させる pHは特に限定されず、 生理活性タンパク 質の等電点以下の好ましい pHを用いることが可能である。 生理活性タンパク質 の等電点以下の好ましい p Hは、 生理活性タンパク質ごとに異なると考えられる ので、 当業者は公知の方法 （例えば、 実施例に記載されているように複数の異な る pHの試料を調製し、 DNA除去率やタンパク質回収率などを測定する、 など の方法） により生理活性夕ンパク質の等電点以下の好ましい p Hを選択すること が可能である。 そのような pHとしては、 通常 pH2. 0以上、 好ましくは pH 3. 0以上、 特に好ましくは pH4. 0以上である。
DN Aが負に帯電していることを確認するには公知の方法、 例えば電気泳動に よるタイ トレ一シヨンカーブ （E T C) を用いた方法 （Ion Exchange Chromatography Principles and Methods, Pharmacia( Amersham Biosciences),p52〜 p 56) により調べることができる。
さらに、 本発明の方法では、 生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性ま たはアル力リ性水溶液状態とし、 得られる試料に緩衝液を添加して p Hを該生理 活性夕ンパク質の等電点以下の p Hに調整することも可能である。
従って、 本発明の別の好ましい態様では、 以下の段階：
1 ) 生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアル力リ性水溶液状態 とし、
2 ) 得られる試料に緩衝液を添加して p Hを該生理活性夕ンパク質の等電点以下 の p Hに調整し、
3 ) 生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、 生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。 本発 明の方法によって除去される不純物は、 前述の通りである。
本発明における低伝導度の酸性水溶液とは、 モル濃度が 0〜1 0 0 mM、 好ま しくは 0〜5 0 mM、 さらに好ましくは 0〜 3 O mMの水溶液または、 イオン強 度が 0〜0 . 2、 好ましくは 0〜0.12の水溶液または、 導電率が 0〜300mS/m、 好ましくは 0〜200mS/m、 さらに好ましくは 0〜150mS/mの水溶液であつて、 p H2.0〜3.9、 好ましくは p H2.0〜3.0の水溶液をいう。 酸性水溶液は、 塩酸、 クェン酸、 酢酸などの水溶液から選択してよい。 精製しょうとする生理活性タン パク質、 抗体の種類により、 使用する低伝導度の酸性水溶液の種類、 伝導度、 Hはそれぞれ異なっており、 当業者は本明細書に記載の方法に従って予備試験を 行うことにより、 これらの最適条件を容易に設定できる。
また、 本発明の方法で使用する低伝導度のアルカリ性水溶液とは、 モル濃度が 0 - 1 0 0 mM、 好ましくは 0〜 5 0 mM、 さらに好ましくは 0〜 3 0 mMの水 溶液または、 イオン強度が 0〜 0 . 2、 好ましくは 0〜0.12の水溶液または、 導電 率が 0〜300mS/m、好ましくは 0〜200mS/m、 さらに好ましくは 0〜150mS/m の水溶液であって、 一般には p H 7 . 5〜1 3である （p Hは精製しょうとする 生理活性タンパク質、 抗体の種類により、 それぞれ異なっている） 。
本発明の方法では、 生理活性夕ンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアル 力リ性水溶液状態とした後、 得られる試料に緩衝液を添加して p Hを該生理活性 タンパク質の等電点以下の p Hに調整する。 緩衝液としては、 例えば Tris-HCl、 リン酸、 Tris、 Na2HPO4、 NaOHなどを挙げることができる。 さらに本発明では、 例えば、 生理活性タンパク質が抗体の場合、 一般的に、 抗 体含有試料をプロテイン Aもしくはプロテイン Gのァフィ二テイク口マトグラフ ィ一に適用して、 低伝導度の酸性水溶液で溶出し、 得られる溶出液に緩衝液を添 加して p Hを生理活性タンパク質の等電点以下で好ましいものに調整することが 可能である。
従って、 本発明のさらに別の好ましい態様では、 以下の段階：
1 ) 抗体含有試料をプロテイン Aもしくはプロテイン Gのァフィ二テイク口マト グラフィ一に適用して、 低伝導度の酸性水溶液で溶出し、
2 ) 得られる溶出液に緩衝液を添加して p Hを該生理活性タンパク質の等電点以 下の P Hに調整し、
3 ) 生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、 生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。 本発 明の方法によって除去される不純物は、 前述の通りである。
この方法で使用する低伝導度の酸性水溶液は上記したものを使用することがで き、 また緩衝液としては、 例えば Tris-HCl、 リン酸、 Tris、 Na2HP04、 NaOH などを挙げることができる。
本発明の方法では、 上記段階で生理活性タンパク質の等電点以下の p Hになつ た溶液は粒子 （白濁） を生じる。 この粒子をフィルタ一濾過によって除去するこ とによって、 D N A夾雑物といった不純物を効率よく除去することができる。 濾 過に用いるフィルタ一は、 例えば、 1.0〜0.2 mの Cellulose Acetate Filter System (Coming製） もしくは TFFなどを用いることができるが、 これらに限 定されるものではない。
また、 上記粒子を除去するための方法としては遠心分離操作等も考えられ、 粒 子を効率的に除去できる手法であればよく、 フィルター濾過に限定されるもので はない。
本発明者らは特別の理論に拘束されるものではないが、 不純物が D N Aである 場合、 上記粒子は生理活性タンパク質と D NAとによって形成される複合体であ ると推定している。 タンパク質が等電点より低い P Hになることにより正に帯電 し、 一方、 D N Aが負に帯電することにより、 D N Aとタンパク質の複合体が形 成されると推定している。 さらに、 低伝導度の水溶液にすることにより、 より複 合体が形成されやすくなると考えている。 粒子をフィルター除去することによつ て DNA-生理活性タンパク質複合体中に含まれる生理活性タンパク質が少量ロス となるが、 生理活性タンパク質の全体からすると数％であり、 後述する実施例に 記載するように、 生理活性タンパク質の約 9 0 %を回収することができた。
また、 この DNA-生理活性タンパク質複合体が樹脂上で生じるためにプロティ ン Aもしくはプロティン Gカラムクロマトグラフィ—単独では DNA夾雑物と夕 ンパク質の分離が効果的に行えないのではないか、 と推測している。 本発明の 方法により精製された生理活性タンパク質は、 さらに陽イオン交換クロマトダラ フィ一、 陰イオン交換クロマトグラフィー、 ハイドロキシアパタイトクロマトグ ラフィ一、 もしくはこれらの組合せなどにより精製して医薬製剤に用いることが できる。
DNA定量法としてはスレッシュホールド総 DNA定量法により測定し、測定に 先だつて DNA抽出操作を実施するが、 これらに限定されるものではない。
ウィルス定量法としては、 検出細胞へのウィルス感染力を指標とした TCID50 (tissue culture infective dose (50%)； 50%培養細胞感染量） 、 並びに画分中の ウィルス量を定量できる RT/Q-PCRおよび Q-PCRにより測定するが、 これらに 限定されるものではない。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、 本発明の範囲はこれ に限定されない。 本発明の記載に基づき種々の変更、 修飾が当業者には可能であ り、 これらの変更、 修飾も本発明に含まれる。 実施例
実施例 1 ： h P M— 1 (ヒト型化抗 I L一 6レセプ夕一抗体） 精製におけるプ 口ティン Aァフィ二ティクロマトグラフィーの緩衝液組成の検討
1 . 1 . 試験方法
(1)検討材料 （抗体含有試料）
h P M- 1抗体 （ヒト型化抗 I L— 6レセプター抗体) 産生 CHO細胞培養上 清液 (以下 CMと略す) (細胞遠心除去済み: -80°C保存)含有試料は、上記 CMを 0.22 Cellulose Acetate(CAと略す) Filter System (CORNING)を用いて濾過し、 精製検討に使用した。 なお、 h P M— 1抗体は、 国際特許出願公開番号 WO 9 2 / 1 9 7 5 9号公報の実施例 1 0に記載されたヒトェロンゲ一シヨンファクター I αプロモーターを利用し、 特開平 8— 9 9 9 0 2号公報の参考例 2に記載され た方法に準じて作成した （等電点： Ρ Η 9 . 0 ) 。
(2)使用機器
塩酸溶出検討時
HPLC： L-6200 Intelligent Pump (HITACHI)
L-4200 UV-VIS Detector(HITACHI)
D-2500 Chromato-Integrator(HITACHI)
カラム： HR5/2(Pharmacia ¾),5mmI.D. X 20mmH
Media： POROS 50A(PerSeptive社), 0.4ml
Lot;A250-039,Code;SPECIAL
粒子検討時
HPLC： Waters PrepLC4000 System(Waters)
Waters2000 System Controller(Waters)
Waters486 Tunable Absorbance Detector(Waters)
Waters741 Data Module(Waters)
分光光度計： 1>2000(HITACHI)
カラム： XK26(Pharmacia社)， 26mmI.D. X lOOmmH
Media： POROS 50A(PerSeptive社), 53ml
Lot;A250-039,Code;SPECIAL
(3)分析、 定量法
h P M— 1定量法：直線濃度勾配法による PLRP-S カラム (ポリマーラボラトリ ーズ社)を用いる逆相 HPLCにより定量する。
DNA量測定法：スレツシュホールド総 DNA定量法により測定する。測定に先だ つて DNA抽出操作 （D NAエキストラクターキット <和光純薬〉等） を実施す る。 また、 測定にはスレッシュホールド総 D NA定量キット （モレキュラーデバ イス社製） を用いる。 濁度測定法：粒子形成の状況をモニタ一するために測定サンプルを分光光度計
U-2000(HITACHI)に供し、 660nmにおける吸収を測定する。
1 . 2 . 溶出条件の検討
プロテイン Aァフィ二ティークロマトグラフィーにおいて溶出液として用いる 緩衝液組成を変更した検討を行い、 h P M— 1回収率及び溶出液による DNA除 去状況を確認した。上記抗体含有試料を以下の表 1に示す条件でカラムにかけた。 表 1に示す平衡化緩衝液にてプロテイン A樹脂を平衡化し、 続いて上記抗体含有 試料負荷、その後、洗浄 1、洗浄 2、溶出と実施する。溶出プロファイルを A280nm で監視し、 タンパク質のピークを単離した。なお、表中 C-P Bufferはクェン酸一 リン酸緩衝液を示す。 表 1
Figure imgf000015_0001
溶出法 1、 2 , 3において、 クロマトグラム上で差異は確認されなかった。 また、各溶出画分を 300mM Tris溶液で pH7.0に調整したところ、塩酸溶出画 分 (溶出法 2、溶出法 3)では粒子が生じた。更に、粒子形成と h P M— 1回収率及 び残存 DNA量との相関を求める検討をも行った。
粒子相関検討として、 溶出法 2における溶出液塩酸中に NaClを添加し、 添加 NaCl濃度 (0mM,50mM,100mM)と各種要因との相関を求めた。 添加 NaCl濃度 と各種要因との相関検討として、 それぞれの NaCl添加による Protein A溶出画 分を 300mM Tris溶液で pH7.0に調整したサンプルを濾過前、その pH調整後サ ンプルを 0.22 m CA Filterにて濾過したサンプルを濾過後とした。 濾過前及び 濾過後サンプルを上記測定法で h P M— 1回収率 (濾過後のみ）を測定し、 残存 DNA量を測定した。
1. 3. 回収率
各溶出条件における hPM— 1回収率を測定した。 その結果、 溶出法 1におけ る回収率は 98.6%と良好であった。 また溶出法 2における回収率では 83.8%〜 97.1%、 溶出法 2における回収率では 83.5%〜93.7%とばらつきが生じたが、 検 討スケールが小さい要因 (樹脂量: 0.4ml)から生じるばらつきであると推測された。 そこで、 精製スケールをアップした検討 （溶出法 2) では安定して hPM— 1回 収率 90%以上を示す事を確認した。 従って、 塩酸溶出の場合であっても、 hPM - 1の回収率は良好であることが判明した。
1. 4. 溶出液塩酸中の添加 NaCl濃度と各種要因相関
溶出液塩酸中の添加 NaCl濃度と各種要因相関を調べた結果を表 2に示す。 表 2
Figure imgf000016_0001
濾過後の h P M— 1回収率は lOOmM NaCl添加サンプルで 88%を示し、 順に 50mM NaCl添加の 86%、 OmM NaCl添加の 81%であつた。残存 DNA量に関し ては、 濾過前後のサンプルでともに、 OmM NaCl添加サンプルが低値を示し、 特 に濾過後の OmM NaCl添加サンプルでは llpg DNA/mg h PM— 1と極めて低 値であった。
また、 pH調整後サンプルにおいて濁度の高値なサンプル程、 濾過後の hPM 一 1回収率及び残存 DNA量が低値を示している。 この結果は、 粒子形成に hP M— 1及び DNAが関与している可能性が高い事を示すものである。おそらく pH を 7.0に調整する事により h PM_ 1と DNAが相互作用し粒子を生じると推測 される。 hPM— 1回収率を高くするという点からは、 添加 NaCl濃度を増加さ せることが好ましく、 逆に残存 DNA量減少を重視するという点からは、 溶出液 塩酸中に NaClを無添加とすることが望ましい。 実施例 2 ： ヒ卜型化抗 P TH r P抗体の精製
ヒト型化坊 P T H r P抗体含有試料 （C H O細胞で培養した培養上清を
0.45+0.2 m CA SARTOBRAN Pフィルター （sartorius) で濾過したもの） を プロテイン Aァフィ二ティ一カラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の条 件により精製した。 なお、 P TH r P抗体は、 国際特許出願公開番号 W0 9 8 Z
1 3 3 8 8号公報に記載の方法によって作成した （等電点： p H 8 . 3 ) 。
2 . 1 . 実験条件
精製装置： AKTA explorer (Amers am Pnarmacia Biotecn
カラム： HR5/5， CIO, XK-26 (Amersham Pharmacia Biotech)
樹脂： rProtein A Sepharose Fast Flow
負荷：培養上清直接負荷 (pH6.6〜7.5)
溶出画分調整： 1M Tris 水溶液により各種 pH に調整し、 0.2 m Cellulose
Acetate (以下 CAと略す)フィルタ一濾過により DNAを除去 （以下の （1 ) にお いて条件を検討） 。
プロテイン Aカラムを 150mM NaCl入りクェン酸-リン酸緩衝液 pH7.5で十 分に平衡化した後、 上記抗体含有 CMを負荷した。 続いて結合していない不純物 を 150mM NaCl入りクェン酸-リン酸緩衝液 pH7.5で洗浄、更に導電率を下げる 目的でクェン酸-リン酸緩衝液 pH7.5で洗浄を行い、 その後 20mMクェン酸水溶 液にて溶出を実施した。溶出プロファイルを A280nmで監視し、 タンパク質ピー クを分取した。 このプロテイン A溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。 2 . 2 . 溶出後の残存 DNA除去条件検討
残存 DNAを効率的に除去するために、 フィルター濾過時の最適 pH条件を設 定する検討を行った。 プロテイン A溶出画分を、 1.0M Tris水溶液により以下の 各検討 pH (未調整 (2.7), 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 ) に調整した。 その 後、一定時間放置し、 0.22um CAフィルター濾過処理を行つた。その後 1.0M Tris 水溶液により pH7に調整し、 DNA定量を行った。 表 3に各検討 pH及び放置時 間と残存 DNAの結果示す。 表 3
残存 DNA除去検討結果 （単位 g I mL)
Figure imgf000018_0001
(培養上清中の DNA: 6,637,200 pg mL、 フィルタ一未処理中の DNA: 25, 110 pg I mL) 表から明らかなように、 pH5.5、 6.0における 0，6，24時間放置すべてにおいて DNAが検出限界以下となつた。 また DNA除去状況に関しては pH5.5、 6.0を中 心として pHが高く、 又は低くなるにつれて DNA除去の効率が悪くなることが 観察された。 実施例 3 ：ヒト型化抗 HM1. 24抗原モノクローナル抗体の精製
ヒト型化抗 HM1. 24抗原モノクローナル抗体含有試料 （CHO細胞で培養 した培養上清） をプロテイン Aァフィ二ティ一カラムクロマトグラフィーを用い る方法で以下の表 4に記載の条件により精製した。 なお、 HM1. 24抗原モノ クローナル抗体は、 国際特許出願公開番号 WO 98/14580号公報に記載の 方法によって作成した （等電点： pH9. 0) 。
3. 1. 実験条件
カラム： rProtein A FF, 5 mL (16 mmID x 25 mmH)
流速 ： 5 mL / min (ibO cm I h)
サンプル：培養上清直接負荷 表 4
平衡化 （20CV) 10 mM C-P Buffer, 1 M NaCl, pH 7.5
負荷 CM直接負荷 洗浄 1 (20CV) 10 mM C-P Buffer, 1 M NaCl, H 7.5
洗浄 EE 2 (20CV) 10 mM C-P Buffer, pH 7.5
クェン酸， pH 2.5
洗浄 3 (4 CDCV) 0.1 M NaOH プロテイン Aカラムを 150mM NaCl入りクェン酸-リン酸緩衝液 pH7.5で十 分に平衡化した後、 上記抗体含有 CMを負荷した。 続いて結合していない不純物 を 150mMNaCl入りクェン酸-リン酸緩衝液 pH7.5で洗浄、更に導電率を下げる 目的でクェン酸-リン酸緩衝液 pH7.5で洗浄を行い、 その後 20mMクェン酸水溶 液にて溶出を実施した。溶出プロファイルを A280nmで監視し、 タンパク質ピー クを分取した。 このプロテイン A溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。 3. 2. 溶出後の残存 DNA除去条件検討
残存 DNAを効率的に除去するために、 フィルター濾過時の最適 pH条件を設 定する検討を行った。 プロテイン A溶出画分を、 l.OMTris水溶液により以下の 各検討 pH(pH = 4.5 - 7.5)に調整した。 その後、 一定時間放置し、 0.22um CAフ ィルター濾過処理を行つた。その後 1.0M Tris水溶液により pH7に調整し、 DNA 定量及び逆相カラムによるヒト型化抗 HM1. 24抗原モノクローナル抗体の定 量を行った。 表 5に DNA量の測定結果を、 また表 6にヒト型化抗 HM1. 24 抗原モノクローナル抗体の収量測定の結果を示す。 表 5
残存 DNA除去の検討 （単位： pg/ml)
実験 1
Figure imgf000019_0001
(培養上清中の DNA： 235200 pg/ml)
実験 2
pH 5.5 pH 5.0 pH 4.5
Oh 137 67 86
6h 94 34 164 (培養上清中の DNA: 5448000 pg/ml,
フィルタ一濾過処理を行う前の試料中の DNA： 4330 pg/ml) 表 6
フィルター処理によるヒト型化抗 HM1. 24抗原モノクローナル抗体回収率
Figure imgf000020_0001
Protein Aァフィ二ティ一クロマトグラフィー精製した後のサンプルにおいて は大量の DNAが存在していたが、実験 1では pH 7.5, 6.5, 5.5と pHの低下に従 つて DNA量が減少しており、 また時間は 0時間の方が DNA除去率が高い傾向 があった。 実験 2では pH = 4.5, 5.0, 5.5の条件で同様の実験を行ったが、 この 間においては pHおよび時間に関係なく十分に DNAが同程度に除去されていた。 更に回収量の計算からヒト型化抗 HM 1. 24抗原モノクローナル抗体はほとん ど消失していないことが判明した。 実施例 4 ：顆粒球コロニー刺激因子 （G— CSF) の精製
G— CSF含有試料 （CHO細胞で培養：中外製薬製） を用いて以下の条件検 討を実施した （等電点： PH5. 5〜5. 7) 。
4. 1. 溶出後の残存 DNA除去条件検討
残存 DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適 pH条件を設定する 検討を行った。 G— CSF含有試料に低伝導度の酸性溶液（2.5mMHCl水溶液） を 添加し、 更に 20%塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、 更に試料 DNAを添 加した。 1.(¾ 13水溶液にょり以下の各検討011 11 = 4.3又は6.6)に調整し、 続 いて 0.22um CAフィルター濾過処理を行った。 その後、 ろ過前後の画分の DNA定量 を行った。 表 8に DNA量の測定結果を示す。 表 7
残存 DNA除去の検討 （単位： pg/ml) 濾過時 PH H 6.6 pH 4.3
濾過前 4.3X105 4.3X105
濾過後 2.8X104 < 90 上記検討結果より濾過時 PH4.3の場合において DNAを多量に含んだ G— C S F 含有試料から DNA量が効率的に減少し定量限界以下であった。 実施例 5 hPM- 1 (ヒト型化抗 I L一 6レセプ夕一抗体） 精製におけるウイ ルス除去効果
5. 1 検討材料 （抗体含有試料）
hPM— 1抗体 （ヒト型化 I L一 6レセプ夕一抗体） 産生 CH〇細胞培養上清液 (CM) (細胞遠心済み：一 80°C保存） 含有試料に、 それぞれ X-MuLV Reo 3 MVMを添加後、 各 CMを 0.45 mフィルタ一 （ポトルトップフィルター： CORNING社製） を用いてろ過し、 精製検討用に使用した。 なお、 hPM— 1抗 体は、実施例 1と同様に作成した。なお、使用した各ウィルスは ATCC (American Type Culture Collection) から入手した。
5. 2 rProtem Column Chromatograph での 製
5. 1で作製したウィルス添加試料を rProtein Column Chromatographyで精 製した。 具体的な条件は以下の通りである。
棚旨： rProteinA Sepharose Fast Flow
機器： AKTAexplorerl00 AKTApurifier
カラム： XK16/20 XK16/40
樹脂高： 11.5 cm
溶出条件
平衡化 1 mol/LNaCl, 20 mmol/LC-P Buffer,
ρΗ7.5±0·2 Conductivity 8.5±0.5 S/m
洗浄 1 1 mol/L NaCl, 20 ol/L C-P Buffer,
pH7.5±0.2, Conductivity 8.5±0.5 S/m
洗浄 2 10 mmol/L C-P Buffer,
pH7.7±0.2, Conductivity 165±20 mS/m 溶出： 2.5mmol/LHCl，
pH2.7±0.2, Conductivity 107±10 mS/m
5. 3 低 pH処理
5. 2で得られた溶出画分を lmol/L塩酸で pH3.2±0.1に調整し、 室温 15±5 で 30分以上保持した。 その後、 各溶出画分を 300mmol/LTris溶液で pH7.2±0.1に 調整した。 そのうちの 40.0 mLを、 グラスファイバーフィルタ一 （Millipore社製） (0.2 m PALL社製） を一次側、 バイオイナ一ト （0.2 m、 PALL社製） (PALL社製のフィルタ一ホルダーに直径 15 mmのアジヤスターを装着） を二次 側になるよう連結したろ過ュニットを用いて 0.03 ± 0.01 MPaで加圧ろ過した。 5. 4 ウィルスの検出
採取したサンプルは全て TCID5oで測定を行った。また、 X-MuLVおよび MVM のクリアランス能試験では、 検出細胞へのウィルス感染力を指標とした TCID50 に加え、 画分中のウィルス量を定量できる RT/Q-PCRおよび Q-PCRによる測定 ¾r rつ 7こ。
5. 5 結果
5. 4の測定の結果を以下の表に示す。 表 8 ウィルス力価 （TCID5o法： Logio/mL)
Figure imgf000022_0001
以上のように、 本発明の精製工程により、 いずれのウィルスについても非常に高 い LRV (Logarithmic Reduction Value) が得られ、 低 r»H処理 ·ろ過後では定 量限界以下にまで除去されていることが確認された。 産業上の利用可能性'
本発明の方法により、 D N A夾雑物やウィルスといった不純物を極めて簡単な 方法で、 効率よく除去することが可能となり、 生理活性タンパク質、 特に抗体の 精製がはるかに効果的となった。 不純物が D NAである場合には、 D NA濃度を 極めて低濃度に （例えば 22.5pg/ml) 、 不純物がウィルスである場合には、 ウイ ルスカ価を極めて低い値に （例えば TCID5o法で 1 . 0 3 (Logio/mLの表記によ る） ） することができた。 また、 本発明の方法によりコストを低減することがで き、 格別の技術的意義を有するものである。

Claims

請求の範囲
I . 以下の段階：
1 ) 生理活性タンパク質含有試料を、 該生理活性タンパク質の等電点以下の p H の低伝導度の水溶液状態とし、
2 ) 生じる粒子を除去する、
を含む、 生理活性夕ンパク質含有試料中の不純物を除去する方法。
2 . 低伝導度の水溶液の伝導度が、 0〜： LOOmMのモル濃度である請求項 1に記 載の方法。
3 . 低伝導度の水溶液のイオン強度が、 0〜0.2である請求項 1又は 2に記載の 方法。
4. 低伝導度の水溶液の導電率が、 0〜300 mS/mである請求項 1〜 3のいずれ かに記載の方法。
5 . 水溶液が塩酸、 クェン酸、 酢酸の水溶液から選択される請求項 1〜4のい ずれかに記載の方法。
6 . 水溶液の p Hが生理活性タンパク質の等電点以下、 かつ p H 2 . 0以上で ある請求項 1〜 5のいずれかに記載の方法。
7 . 不純物が D N A夾雑物である請求項 1〜 6のいずれかに記載の方法。
8 . 不純物がウィルスである請求項 1〜 6のいずれかに記載の方法。
9 . DNA夾雑物除去処理後の生理活性夕ンパク質含有試料中の DNA夾雑物が DNA濃度 22.5pg/ml以下である請求項 Ίに記載の方法。
1 0 . 生理活性夕ンパク質が抗体である請求項 1〜 9のいずれかに記載の方法。
I I . 抗体が I g G抗体である請求項 1 0に記載の方法。
1 2 . 抗体がヒト型化モノク口一ナル抗体である請求項 1 0または 1 1に記載 の方法。
1 3 . 抗体がヒト型化抗 I L一 6レセプター抗体である請求項 1 2記載の方法。 1 4 . 抗体がヒト型化抗 HM 1 . 2 4抗原モノクローナル抗体である請求項 1 2記載の方法。
1 5 . 抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連べプチド抗体 （抗 P T H r P抗 体） である請求項 1 2記載の方法。
1 6 . 生理活性夕ンパク質が顆粒球コロニー刺激因子である請求項 1〜 9のい ずれかに記載の方法
1 7 . 粒子をフィルタ一濾過によって除去する請求項 1〜1 6のいずれかに記 載の方法。
1 8 . 生理活性夕ンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアル力リ性水溶液 状態とし、 得られる試料に緩衝液を添加して p Hを該生理活性タンパク質の等電 点以下の P Hに調整することによって 1 )の工程を行う、請求項 1に記載の方法。 1 9 . 生理活性タンパク質が抗体であって、 該抗体含有試料をプロテイン Aも しくはプロテイン Gのァフィ二ティクロマトグラフィーに適用して、 低伝導度の 酸性水溶液で溶出し、 得られる溶出液に緩衝液を添加して P Hを該抗体の等電点 以下の p Hに調整することによって 1 ) の工程を行う、 請求項 1に記載の方法。 2 0 . 緩衝液が T r i s水溶液である請求項 1 8又は 1 9記載の方法。
2 1 . 請求項 1〜2 0のいずれかに記載の方法によって得られる精製生理活性 タンパク質。
2 2 . 請求項 1〜 2 0のいずれかに記載の方法を用いた精製工程を含む、 医療 用夕ンパク質製剤の製造方法。
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