WO2003105878A1 - 抗菌剤及び抗菌性組成物 - Google Patents

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WO2003105878A1
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antibacterial
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土田　裕三
小太郎 土田
憲次郎 土田
渡邉　邦友
良子 中村
篤郎 岩沢
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株式会社鳳凰堂
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an antibacterial agent containing sasa extract, and more particularly to an anti-tetanus agent, an antifungal agent, an antiviral agent and an antibacterial composition containing sasa extract.
  • Sasa extract has long been known to have antibacterial properties. For example, antibacterial effects against Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ⁇ colon Wi (scherichia co / i), bacteria causing causative agents of wound infection, and Helicobacter pylori, a causative agent of gastric ulcer Helicobacter pylori) has been reported to have antibacterial effects.
  • Lactobacillus sw. Is known as a resident bacterium in the oral cavity, digestive tract, and vagina. It is well known that the action of resident bacteria on living organisms has two sides. Lactobacillus sw 'may also be separated from clinical materials, including blood, and its pathogenic significance should never be underestimated. It is considered a highly useful bacterial species. Zacto? Aci7 us spp., Which has been evaluated as a highly useful bacterial group for humans, Although it is very interesting to know how much Sasa extract has antibacterial activity, no detailed study results have been found so far.
  • ropiifflibacieri a ⁇ es which is resident in the sebaceous glands of the skin, is an anaerobic, non-spore anaerobic bacterium. It is also known as an exacerbation factor of Ac vulgaris.
  • creams and lotions of antibacterial drugs ellis-D-mycin, tetracycline, pear, puffin
  • P. araes resistant has become a clinical problem, and its countermeasures are being discussed worldwide. No studies have been found on the acnes of Sasa extract.
  • Prevotella bivia and Pigmented Prevotella spp. are present in the vagina of healthy women only at the number of bacteria below the detection limit.
  • 'Bacterial vaginosis characterized by a decrease in lactic acid bacteria in the vagina, a decrease in vaginal pH, and a milky, malodorous odor (amin odor) along with raw gram positive cocci, Porphyro onas spp. BV) is an obligately anaerobic gram-negative bacillus that is abnormally increased in the state of bacterial vaginosis (BV) associated with BV, and is a very important bacterium as a causative bacterium for in utero and pelvic infections.
  • Sasa extract is known to have antibacterial activity, no studies have ever been conducted on its antibacterial activity against these BV-associated bacteria. Thus, it is not known whether Sasa extract has effective antibacterial activity against all bacteria, and natural extracts having antibacterial activity against bacteria have antibacterial activity against fungi such as Candida. Whether it has it is not generally known.
  • Tetanus infects the wound site and the neurotoxin produced there It is a highly lethal toxin that causes muscle spasms, stiffness, and hypertension. Tetanus is an anaerobic bacillus found in the stool of humans and animals, and it is said that automatic immunization with toxoid and passive immunization with anti-toxin serum are effective for preventive treatment of tetanus.
  • Sasa extract has antibacterial activity against tetanus bacteria.
  • Viruses are extremely small pathogens that are unable to multiply and parasitize animals, plants and microorganisms, and are divided into animal viruses, plant viruses, and microbial viruses.
  • Various antiviral agents for the prevention and treatment of viral diseases have been developed, but agents having effective antiviral activity without side effects are required.
  • tannins derived from plants other than Sasa have an antibacterial activity against MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus), but there is a problem that it cannot be used as an antibacterial agent due to its large side effects. . Disclosure of the invention
  • an object of the present invention is to provide an antibacterial agent, and more specifically, to provide an antitetanus agent, an antifungal agent and an antiviral agent.
  • Another object of the present invention is to provide an antimicrobial composition.
  • the present invention provides the following antibacterial agent and antibacterial composition containing Sasa extract:
  • Antifungal agent containing Sasa extract 1.
  • Antiviral agent containing Sasa extract 5. Antibacterial agent containing sasatannin.
  • the antibacterial agent according to 6 above which is an antibacterial agent against Propionibacterium acnes ⁇
  • a treatment for acne containing sasatannin 10.
  • An antibacterial composition containing sasa extract and an organic acid.
  • the antibacterial composition according to the above item 11 which is an ink, a paint, a food additive, a beverage, a seasoning, a food, a plastic molded product, or an adhesive.
  • spore-free anaerobic gram-positive cocci are Micromonas, Peptostreptocoecus, Atopobium, or eme77a.
  • an anti-tetanus agent an anti-fungal agent, an anti-viral agent, a remedy for acne, and the like are sometimes collectively referred to simply as “antibacterial agents”.
  • antimicrobial agent includes antimicrobial agents and preservatives used for purposes other than humans.
  • the present invention is an antibacterial agent containing Sasa extract as an active ingredient.
  • the antibacterial agent of the present invention contains Sasa extract in a solid content of 1 to 50% by mass, preferably 2 to 25% by mass, and more preferably 4 to 15% by mass.
  • the solid content of Sasa extract is less than 1% by mass, the desired antibacterial property is insufficiently developed, while when it exceeds 50% by mass, irritation becomes too strong, which is not preferable.
  • Sasa extract has usually been produced as an extract containing a solid content of 0.5 to 10% by mass, and has been used for various purposes.
  • the solid content of the Sasa extract in the final product is usually in the range of 0.05 to 0.8 because the solid content of this solid content is usually added to the final product at about 1 to 10% by mass. %, And the highest concentration was less than about 1% by mass.
  • Sasa extract is relatively expensive, that even at such a low concentration, some anti-inflammatory and antibacterial effects were exhibited, and that the amount of the active ingredient added should be 10% by mass or more. It is not common sense. However, at such low concentrations, the antibacterial effect was often not sufficient.
  • Sasa extract has a solid content of 1 to 10% by mass, preferably 2 to 8 mass%. %, More preferably from 3 to 7% by mass, significantly improves the effect of improving the anti-pruritic effect and the antipruritic effect, which were hardly observed at the conventional low concentration, and also the wound healing effect.
  • the present inventors further searched for the antibacterial effect of sasa extract on various fungi, and contained sasaex at 1 to 50% by mass, preferably 2 to 25% by mass, more preferably 4 to 15% by mass as solid content.
  • the bacteria are bacteria other than Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, etc., that is, anaerobic bacteria such as tetanus, propionibacterium including propionipacterium bacterium, and power plants such as Candida or herpes.
  • the present invention was found to have a remarkable antibacterial effect on viruses such as viruses, influenza viruses, coronaviruses, etc., and to significantly improve antibacterial properties by adding an organic acid such as malic acid to sasa extract. It has been completed.
  • Sasa extract itself has been known for a long time, it is unclear why attempts to use it at high concentrations have not been made, but it is not clear why it is higher than conventional concentrations (more than 10 times). Thus, it is surprising that it has a remarkable antibacterial effect on anaerobic bacteria such as tetanus bacteria, power plants such as Candida, and viruses.
  • the present invention is also effective for skin and soft tissue infections. If skin, bone, and soft tissue are damaged by trauma, ischemia, or surgery, an environment suitable for anaerobic infections is created. Skin and soft tissue infections occur in places easily contaminated with feces and upper respiratory secretions. For example, wounds associated with bowel surgery, pressure sores, and wounds associated with human injuries.
  • Anaerobes are isolated in cases of gas producing crepitant cellulitis, synergistic cellulitis, gangrene and necrotizing fasciitis.
  • anaerobic bacteria are isolated from skin abscesses, rectal abscesses, and axillary sweat gland infections (suppurative sweat glanditis). Anaerobic bacteria are also frequently isolated from foot ulcers in diabetic patients. Skin and soft tissue infections are usually multiple bacterial infections. On average, 4.8 species are isolated per case, and the ratio of anaerobic to aerobic bacteria is 3: 2.
  • Species with a high frequency of separation are Bacteroiaes spp., Peptostreptoccus spp., Enterococcus spp., Clostridium spp., Proteus spp. When anaerobic bacteria are involved in these infections, fever increases, foul odors appear in the affected area, gas in the tissues, and ulcers in the feet.
  • Gangrene caused by the synergistic action of anaerobic and facultative bacteria is characterized by intense pain, redness, and swelling followed by induration. Erythema spreads around the necrotic zone. Granulomatous ulcers form in the center as necrosis and erythema expand outwards. The only symptom is pain; fever is not a typical symptom. This infection is often caused by a combination of S. aureus and Peptostreptococus spp. The most common sites are surgical wounds in the abdomen and the periphery of lower limb ulcers. Treatment is surgical removal of necrotic tissue and antimicrobial chemotherapy.
  • the rapidly spreading destructive disease of the fascia necrotizing fasciitis, is often caused by group A streptococci, but can also be caused by anaerobic bacteria such as Peptostreptococcus and Bacteroides. Gas may be found in the tissue.
  • muscle necrosis has been associated with mixed infections of anaerobic and facultative bacteria.
  • Fournier's gangrene is a cellulitis that affects the scrotum, perineum, and the front of the abdominal wall, and multiple anaerobic bacteria spread along deep external facial planes, causing extensive skin defects. .
  • the present invention provides a therapeutic and / or prophylactic agent for skin and soft tissue infections containing Sasa extract.
  • the present invention also provides an antibacterial agent against propionobacterium containing propionobacterium acnes containing Sasa extract.
  • the present inventor further studied the active ingredient of Sasa extract, and found that tannin contained in a relatively large amount in Sasa extract has excellent antibacterial activity. This is the end of the Ming. Hitherto, it has been reported that tannin has an antibacterial effect, but none of these tannins has been practically used because of their large side effects. It has been known that Sasa extract itself has been taken orally for a long time and has no side effects on the human body. It is quite unlikely that such sasa extract would contain a relatively large amount of tannin and would have an excellent antibacterial effect. Sasa used as a raw material of Sasa extract which is an active ingredient of the antibacterial agent of the present invention is not particularly limited, and all Sasa belonging to the genus Sasa are exemplified.
  • Kumizasa, Kumazasa, Chishimasa, Okuyamaza, Ezomiyayamasa, Chimakizasa, Yahikozasa, Oobazasa, Miyayamasa, Sendaiizasa, Yukazasa, Aboizasa, Aonizasa and the like are mentioned.
  • specific examples of commercially available products include Kumazasa and Kumazasa (Chugosasa, Hidazasa) and the like.
  • Kumaizasa and Kumazaza water extracts collected from the Teshio Mountains in Hokkaido from July to October are preferred.
  • the Sasa extract used in the present invention is preferably obtained by extracting fresh or dried leaves of Sasa, preferably dried leaves, with water at 100 to 180 ° C under normal pressure or pressure.
  • the extraction method is not particularly limited, and for example, a method described in Japanese Patent No. 3212278 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-196188) can be used. More specifically, the extract is extracted by treating with a pressurized hot water extractor at 100 to 180 ° C. for 5 to 30 minutes, and the extract is extracted with a moisture separator by a moisture separator. 40 to 70%), and then treat the water-containing solids at 100 ° C; to 200 ° C for 5 minutes to 60 minutes with a saturated steam heating machine, and then pressurize again.
  • the extract is extracted by treatment with a hot water extractor at 100 ° C; ⁇ 180 ° C for 5 to 30 minutes, and the first and second extracts are used together.
  • dry Sasa leaves are extracted, for example, with water at 60 to 100 ° C for about 30 minutes to 12 hours.
  • An extract obtained by serving can also be used.
  • Sasa extract at a solid content of 50% by mass examples include “AHSSj” manufactured by Chloland Co., Ltd. “Moshiri” and “TWEBSj” manufactured by Fenghuangdo Co., Ltd.
  • the sasa extract thus obtained contains a sulfur component, and its content is about 4 to 10 mg / g, usually about 6 to 9 mg / g of solid content of the sasa extract in terms of sulfur.
  • the main component of the sulfur component is considered to be a sulfur-containing amino acid.
  • the antibacterial agent of the present invention contains 100 g of sulfur component derived from Sasa extract per 100 g of sulfur, preferably 4 to 500 mg, more preferably 8 to 250 mg, and most preferably 16 to 15 Omg.
  • Sasa extract contains evening ninnin and its content is about 5 to 15% by mass based on the solid content of Sasa extract. '
  • the antibacterial agent of the present invention preferably contains sasatannin in a solid content concentration of preferably 0.05 to 7.5% by mass, more preferably 0.1 to 6% by mass.
  • the antibacterial agent of the present invention may contain only Sasa extract as an active ingredient, or by using an appropriate amount of an organic acid in combination therewith, the antibacterial effect can be further improved.
  • organic acids include malic acid, citric acid, lactic acid, oxalic acid malonic acid, succinic acid, fumaric acid, acetic acid, benzoic acid, phenylacetic acid, salicylic acid, phenols, and the like.
  • the amount of the organic acid used in the antibacterial agent of the present invention is preferably 0.01 to 5% by mass, more preferably 0.02 to 3% by mass, and most preferably 0.05 to 1.5% by mass. You.
  • the antibacterial agent of the present invention may be Sasa extract itself, or may be mixed with other components and carriers.
  • the present invention provides seasonings such as salt, sugar, soy sauce, miso, sauces, mayonnaise, liquor, taste, dressings, etc., containing sasa extract or a mixture of sasa extract and organic acids. Is what you do.
  • the addition of Sasa extract or a mixture of Sasa extract and organic acid to salt has the effect of increasing the shelf life of fish, meat, etc., with salt.
  • the amount of Sasa extract added to the salt is preferably 1 to 10% by mass, more preferably 2 to 8% by mass, and most preferably 3 to 6% by mass in terms of solid content.
  • the dosage form of the antimicrobial agent of the present invention may be liquid, solid, or gas.
  • the antibacterial agent of the present invention may be administered in any of oral and parenteral administration forms.
  • Oral dosage forms include tablets, pills, powders, liquids, chewing gum, candy, chocolate, bread, cookies, buckwheat, udon, various drinks, etc.
  • parenteral dosage forms include injections , Topical preparations (creams, ointments, etc.), suppositories and the like.
  • Examples of the dosage form of the topical administration agent include those in which the antibacterial agent of the present invention is impregnated in a carrier such as natural fiber or synthetic fiber gauze, and those which are contained in cosmetics such as lipstick.
  • the antibacterial agent of the present invention is also effective as an antibacterial agent for mammals, birds, fish, reptiles and the like other than humans, as well as humans. Therefore, the antibacterial agent of the present invention can be used as an antibacterial agent for these animals (for example, a drug for pets, pet food, etc.). Further, the antibacterial agent of the present invention is useful as an antibacterial agent for various plants in addition to animals, and is also useful as a P-type preservative.
  • the antibacterial agent of various dosage forms of the present invention in addition to a predetermined amount of the above-mentioned sasa extract, base ingredients such as oily ingredients used in ordinary pharmaceutical compositions, cosmetics, skin compositions, etc., and moisturizing Agents, preservatives and the like can be used.
  • Water used for the antibacterial agent is not particularly limited, such as tap water, natural water, purified water, etc., but generally high-purity water such as ion-exchanged water is preferred.
  • Oily ingredients include squalane, beef tallow, lard, horse oil, lanolin, honey, etc., animal oils, olive oil, grape seed oil, palm oil, jojoba oil, germ oil (eg, rice germ oil), etc. Vegetable oils, liquid paraffin, higher fatty acid esters (for example, pal Synthetic oils such as octyl mitinate, isopropyl normitate, octyl dodecyl myristate), silicone oil, and semi-synthetic oils.
  • Vegetable oils liquid paraffin, higher fatty acid esters (for example, pal Synthetic oils such as octyl mitinate, isopropyl normitate, octyl dodecyl myristate), silicone oil, and semi-synthetic oils.
  • the oily component is used in an appropriate combination according to the required properties such as skin protection and emollient effect (effect of covering skin surface with a thin film to prevent drying, and imparting flexibility and elasticity) and refreshing feeling.
  • skin protection and emollient effect effect of covering skin surface with a thin film to prevent drying, and imparting flexibility and elasticity
  • refreshing feeling is the combination of squalane, olive oil and octyldodecyl myristate.
  • Solid oils such as stearic acid, stearyl alcohol, behenic acid, selenol, and petrolatum are used to adjust the hardness and fluidity of the antimicrobial agent, preferably a combination of stearic acid and selenol. Used.
  • a creaming agent for making the sasa extract, water and oily components creamy is used.
  • the creaming agent is not particularly limited, but is generally used in combination with glyceryl monostearate and self-emulsifying glyceryl monostearate (glyceryl monostearate with an emulsifier added).
  • the antimicrobial agent of the present invention may further contain a stabilizing agent, a humectant, a wound healing agent, a preservative, a surfactant and the like, if necessary.
  • the stabilizing agent examples include a combination of a carboxyvinyl polymer and a hydrating agent, polyethylene glycol distearate, and the like.
  • polyethylene glycol sesquistearate a 1: 1 mixture of polyethylene glycol distearate and polyethylene glycol monostearate
  • the molecular weight of polyethylene glycol is 100,000-20,000
  • humectant examples include sodium hyaluronate, collagen, aloe extract (particularly, aloe extract (2) derived from grove aloe), urea, 1,3-butylene Glycol, glycerin, trenolose, sorbitol, amino acids, sodium pyrrolidone carboxylate and the like.
  • wound healing agent examples include allantoin, dipotassium glycyrrhizinate, kanzo extract, and mugwort extract.
  • Preservatives are used supplementarily because Sasa extract itself has an antibacterial effect.
  • sodium benzoate, lower alkyl esters of parahydroxybenzoic acid for example, those called parapenes such as methyl, ethyl, propyl or butyl ester
  • sodium propionate mixed fatty acid esters (glyceryl caprate, polyglyceryl laurate) — 2
  • phenoxyethanol phenoxyethanol
  • photosensitizer No. 201 yellow dye
  • 1,2-pentanediol etc.
  • paraben mixed fatty acid ester, 1,2 2-Pentane diol is preferred.
  • surfactant examples include sodium N-acyl-L-glutamate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, and the like.
  • a scent component for example, orange oil, lemon oil, spruce oil, fragrance, etc. may be added.
  • Table 1 below shows preferable amounts (% by mass) of the respective components when the antibacterial agent of the present invention is produced as a cream composition.
  • the amount of each component other than water is the mass% of the water-excluding components.
  • the above-mentioned components are put into a heating and mixing vessel equipped with a stirring blade and preferably a milking device, and are stirred and mixed at 70 to 90 ° C. for 1 to 2 hours to obtain the antibacterial agent of the present invention.
  • the antimicrobial agent of the present invention can be used in the form of an ointment, a liquid, a jewel, a gel, a sol, and other forms in addition to the cream composition, but the form of the cream composition is simple and effective. Is also big. It may be in the form of a semi-solid or liquid such as shampoo, body-soap, and face-wash foam.
  • Antibacterial agent of the present invention after the clean affected area, an appropriate amount, for example, when applied as a cream composition, a skin 1 0 0 cm 2 per 0 1:.
  • the amount and frequency of application may be appropriately increased or decreased according to the symptoms and the degree of wound.
  • the antibacterial agent of the present invention When taken orally, the antibacterial agent of the present invention should be ingested as a solid extract of sasa extract in an amount of about 0.01 to 0.1 lg per 1 kg of body weight 1 to 5 times a day, usually about 1 to 3 times. Appropriate.
  • the intake and frequency of intake may be increased or decreased as appropriate according to the symptoms.
  • the solid content of sasa extract is about 0.01 to 0.1 lg per 1 kg of body weight 1 to 5 times a day, usually about 1 to 3 times. It is appropriate to take.
  • the intake and number of intakes may be increased or decreased as appropriate according to the symptoms.
  • the antibacterial agent of the present invention By applying the antibacterial agent of the present invention to a condom or the like, it is possible to prevent sexually transmitted diseases, HIV infection and the like.
  • Sasa extract which is an active ingredient of the antibacterial agent of the present invention, is an extract of the genus bamboo, and its 1.25% aqueous solution of the solution does not show toxicity to 29.3 cells derived from human fetal kidney.
  • the antibacterial agent of the present invention contains 1 to 50% by mass of Sasa extract as a solid content, and contains tetanus bacteria, gas gangrene of Clostridium sp. Genus, cryptococcus, coccidioides, human plasma, antibiotic resistant bacteria such as MRSA, propionibacterium including propionibacterium acnes, herpesvirus, ind. It shows a remarkable antibacterial effect against viruses such as Fluenza virus and Corona virus.
  • Preferred embodiments of the antibacterial agent of the present invention are as follows.
  • Antibacterial agent containing sasa extract (1 to 50% by mass in solid content), water, oily ingredients and creaming agent.
  • oily component is at least one selected from the group consisting of animal oils, vegetable oils, synthetic oils, and semi-synthetic oils.
  • the oily components are squalane, beef tallow, lard, horse oil, lanolin, honey, olive oil, grape seed oil, palm oil, jojoba oil, germ oil, liquid paraffin, octyl palmitate, Isopropyl lumitate, octyldodecyl myristate,
  • the antibacterial according to any one of the above 1 to 4 further comprising at least one component selected from the group consisting of an organic acid, a stabilizer, a humectant, a wound healing agent, a preservative, and a surfactant. Agent.
  • the stabilizer is at least one selected from the group consisting of a combination of a carboxyvinyl polymer and potassium hydroxide, and polyethylene glycol distearate.
  • the humectant is at least one selected from the group consisting of sodium hyaluronate, collagen, aloe extract, urea, 1,3-butylene glycol, glycerin, trehalose, sorbitol, amino acid, and sodium pyrrolidonecarboxylate.
  • wound healing agent is at least one selected from the group consisting of allantoin, dipotassium glycyrrhizinate, liquorice extract, and mugwort extract.
  • the P-type preservative is selected from the group consisting of sodium benzoate, lower alkyl esters of parahydroxybenzoic acid, sodium propionate, mixed fatty acid esters, phenoxyethanol, 1,2-pentendiol and yellow pigment. 6.
  • the antibacterial agent according to the above item 5 further comprising at least one component selected from the group consisting of orange oil, lemon oil, spruce oil, and fragrance.
  • Sasa extract water, oily ingredients, creaming agents, stabilizers, moisturizers, wound healing Oils, squalane, tallow, lard, horse oil, lanolin, honey, olive oil, grape seed oil, palm oil, jojoba oil, germ
  • the creaming agent is a combination of glycerin monostearate and a self-emulsifying glyceryl monostearate
  • the stabilizer is a combination of a carboxyvinyl polymer and a water-repellent rim, and a polyethylene glycol distearate.
  • At least one selected from the group consisting of a humectant Is at least one selected from the group consisting of sodium hyaluronate, collagen, aloe extract, urea, 1,3-butylene glycol, glycerin, trenodulose, sorbitol, amino acids, and sodium pyrrolidonecarboxylate
  • the wound healing agent is at least one selected from the group consisting of allantoin, dipotassium glycyrrhizinate, kanzo extract, and mugwort extract, and the preservative is sodium benzoate, lower alkyl para-hydroxybenzoate, sodium propionate,
  • the above antibacterial agent which is at least one member selected from the group consisting of a mixed fatty acid ester, phenoxy nitrate, and a yellow pigment, and wherein the surfactant is sodium N-acyl-L-gluformate.
  • the antibacterial agent according to the above item 11 further comprising at least one component selected from the group consisting of orange oil, lemon oil, spruce oil, and fragrance.
  • Sasa extract water, squalane, olive oil, octyldodecyl myristate, ceanol, glyceryl monostearate, self-emulsifying glyceryl monostearate, carboxyvinyl polymer, hydroxylated urea, 1, 3-
  • the organic acid is at least one selected from the group consisting of malic acid, cunic acid, lactic acid, oxalic acid, malonic acid, cono, citric acid, fumaric acid, acetic acid, benzoic acid, phenylacetic acid, salicylic acid, and phenols. 16.
  • the antibacterial agent according to any one of the above items 1 to 15, which is one kind.
  • the present invention also provides an antibacterial composition containing a sasa extract and an organic acid.
  • Preferred forms of the antibacterial composition of the present invention include inks, paints, food additives, beverages, pet foods, plastic molded articles, and adhesives.
  • the ingredients of these antimicrobial compositions include food additives, beverages (soft drinks, fruit juices, vegetable juices, liquors (sake, bottles, happoshu, whiskey, shochu, shochu, wine, brandy)
  • sasa extract and organic acid may be added to these materials and mixed. The addition may be made at any stage before, during, or after the production of the material.
  • the content of sasa extract in the antibacterial composition is preferably 0.1 to 20% by mass, and more preferably 0.25 to 7% by mass.
  • a sasa extract and an organic acid may be added to and mixed with the materials as described above.
  • the timing of addition may be before, during, or after the production of the material.
  • these materials are hydrophobic (lipophilic), the sasa extract and the organic acid are often difficult to mix.
  • Sasa extract or a mixture of Sasa extract and an organic acid
  • a surfactant milking agent
  • a hydrophilic organic solvent eg, alcohols such as methyl alcohol and ethyl alcohol, ketones such as acetone, esters such as ethyl acetate, Pyridine, dimethylformamide, etc.
  • alcohols such as methyl alcohol and ethyl alcohol, ketones such as acetone, esters such as ethyl acetate, Pyridine, dimethylformamide, etc.
  • a hydrophilic organic solvent eg, alcohols such as methyl alcohol and ethyl alcohol, ketones such as acetone, esters such as ethyl acetate, Pyridine, dimethylformamide, etc.
  • the antibacterial property can be further improved by adding and mixing the sasa extract and the organic acid and then stirring and mixing at 70 to 90 ° C for 1 to 2 hours.
  • the content of sasa extract in the antibacterial composition of the present invention using ink, paint, plastic molded product, adhesive or the like as a material is preferably 1 to 20% by mass, and more preferably 3 to 7%. %, And the content of the organic acid is preferably 0.1 to 10% by mass, and more preferably 3 to 7% by mass.
  • Particularly preferred organic acids are malic acid, succinic acid, citric acid and the like.
  • the antibacterial composition of the present invention shows remarkable antibacterial properties as compared with those not containing the antibacterial agent of the present invention, and inks and paints may be used as antibacterial building materials for general households and hospital infections. It is extremely useful as a building material for hospitals and public buildings.
  • the present invention will be described in more detail by showing Reference Examples, Examples and Test Examples.
  • the dried leaves of Sasa collected in September at the Teshio Mountains in Hokkaido are placed in a pressurized hot water extraction tank, treated at 125 ° C for 10 minutes, and the hot water is cooled to about 80 ° C with cooling water. Cool and extract
  • the water-containing solids were separated by a screw press to reduce the water content to about 50% by mass.
  • about 50% by mass of the solid content containing water was placed in the autoclave, and subjected to pressure heat treatment with saturated water vapor at 180 ° C. for 10 minutes.
  • the treated hydrous solids were again put into a pressurized hot water extraction tank and treated at 110 ° C for 5 minutes to extract the extract.
  • the first and second extracts were combined, filtered with diatomaceous earth, concentrated under reduced pressure to a solid content of 50% by mass, and subjected to a fluid sterilization treatment at 110 to 130 ° C to obtain a sasa extract.
  • the sulfur content in this sasa extract was 3850 / g / ml (7.7 mg / solid content 1 g).
  • Example 1 the amount of added Sasa extract with a solid content of 8% by mass (the Sasa extract with a solid content of 50% by mass diluted in water prepared in Reference Example 1) was changed to 6.2% by mass (according to Thus, the antibacterial agent of Comparative Example 1 was obtained in the same manner except that the content of the Sasa extract solid content was 0.5% by mass and the sulfur content was 3.8 mg in 100 g of the antibacterial agent.
  • Example 5 the amount of added Sasa extract with a solid content of 8% by mass (the Sasa extract with a solid content of 50% by mass diluted in water prepared in Reference Example 1) was changed to 6.2% by mass (according to Thus, the antibacterial agent of Comparative Example 1 was obtained in the same manner except that the content of the Sasa extract solid content was 0.5% by mass and the sulfur content was 3.8 mg in 100 g of the antibacterial agent.
  • Example 5 the amount of added Sasa extract with a solid content of 8% by mass (the Sasa extract with a solid content of 50% by mass
  • 1,3-butylene glycol 1.0 Ethanol 3.0 Trimethylglycine 0.5 Sodium hyaluronate 1.0 Sasa extract (solid content 50% by mass) 12.0 Purified water 51.5 The pH of this cream was 6.00.
  • Example 7 'dl-malic acid was not added, the amount of Sasa extract (solid content: 50% by mass) was set to 16%, 20% and 30% by mass, and the amount of purified water was Except for the adjustment, the antibacterial agent cream of the present invention having a solid content of sasa extract of 8% by mass, 10% by mass and 15% by mass was obtained in the same manner.
  • Example 11 L 3
  • Clostridium tetani Twenty-six strains of Clostridium tetani were used. These strains were isolated from Japanese soil. As controls, Escherichia coli ATCC25922 and Staphylococcus aureus ATCC25923 were also used.
  • the sasa extract (sasa extract solid content: 50% by mass) produced in Reference Example 1 was diluted with sterile distilled water to obtain an sasa extract aqueous solution.
  • the minimum growth inhibitory concentrations of various concentrations of the Sasa extract aqueous solution were measured by the agar plate dilution method. Modified to give final concentrations of 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 0.39, 0.19, 0.10% by mass.
  • GAM agar plate (Mitsui Pharmaceutical) was prepared. The Sasa extract aqueous solution and the 2x agar medium were mixed at 1: 1 to prepare an agar medium containing the Sasa extract at a predetermined concentration. Agar to prevent tetanus from escaping The concentration was corrected to 3%.
  • the minimum growth inhibitory concentrations of Sasa extract against Escherichia coli ATCC25922 and Pseudomonas aeruginosa ATCC25923 measured by this method were both 3.13% by mass.
  • the minimum growth inhibitory concentration of 26 strains of Tetanus was distributed from 0.78% by mass to 0.19% by mass. Table 6 shows the results. Sasa extract concentrations (MIC80% and MIC50%) that inhibited the growth of 80% or 50% of the strains using tetanus were 0.78% and 0.39%, respectively.
  • Tetanus is a disease that occurs when spores of tetanus bacteria present in soil enter the wound site together with soil. It is essential that the spores germinate and multiply locally to produce the toxin (tenospasmin). Since the contaminated wound site tends to be an anaerobic environment for germination of spores, the basics for preventing the onset of tetanus are appropriate surgical procedures such as removal of invading foreign substances and necrotic tissue called debridement. To prevent anaerobic environment and prevent the growth of tetanus.
  • Sasa extract completely inhibited the growth of all 26 strains of tetanus at a low concentration of 0.78%. It was revealed that the antibacterial activity of Sasa extract is more than four times that of Escherichia coli P. aureus.
  • Antimicrobial activity is expected against budless sibling anaerobic bacteria causing purulent infections o Test Example 2 (antibacterial activity against Candida)
  • the antibacterial activity against Candida albicans was examined for the Sasa extract prepared in Examples 8 to 13 and the cream composition containing the Sasa extract and malic acid.
  • the test carried out one day before fresh culture was pure culture 1 Roh 50NB medium Mc Farland (Ma Uz Farland) 0.5, suspended in about 10 eight Zml. Furthermore, diluted to 100-fold the bacterial solution at 1 / 50NB medium (about 10 6 cells / ml).
  • Example 7 The cream composition (Sasa extract solid content: 6% by mass) produced in Example 7 was applied to the affected part (mouth corner) of a herpes virus-infected patient (60 years old, female) twice by applying an appropriate amount twice. The symptoms were remarkably relieved in 2 days, and healed completely in 3 days.
  • Test Example 4 Analysis of lesion-derived strains of acne patients
  • the antibiotic susceptibility of the 44 strains of Staphylococcus aureus was as follows ( ⁇ g / ml)
  • Test Example 5 Antibacterial activity of Sasa extract of Reference Example 2
  • the value in parentheses is the MIC value of sassa tannin Test Example 6 (Antibacterial activity of Sasa extract of Reference Example 2)
  • Staphylococcus spp . MH agar (Mueller Hinton Agar (BBL)) medium, pH 7.0, in air, 37 ° C, 24 hours, Propionibacterium bacillus GAM medium, pH 7.0, anaerobic, 35 The cells were cultured at 48 ° C for 48 hours.
  • the MIC80 of the commercially available tannin was 0.04 mg / ml for the group belonging to the genus Pseudococcus and 0.08 mg / ml for the bacterium propionibacteria. Table 1 2
  • Example 15 6 parts by mass of the Sasa extract prepared in Reference Example 1 and 10 parts by mass of d1_malic acid were added to 100 parts by mass of the aqueous ink, and mixed and heat-treated at 80 for 2 hours to obtain an antibacterial ink.
  • Example 15 6 parts by mass of the Sasa extract prepared in Reference Example 1 and 10 parts by mass of d1_malic acid were added to 100 parts by mass of the aqueous ink, and mixed and heat-treated at 80 for 2 hours to obtain an antibacterial ink.
  • Example 16 100 parts by mass of the water-based paint was added with 6 parts by mass of the Sasa extract prepared in Reference Example 1 and 10 parts by mass of d1-lignoic acid, and mixed and heated at 80 ° C. for 2 hours to obtain an antibacterial paint. .
  • Example 16 100 parts by mass of the water-based paint was added with 6 parts by mass of the Sasa extract prepared in Reference Example 1 and 10 parts by mass of d1-lignoic acid, and mixed and heated at 80 ° C. for 2 hours to obtain an antibacterial paint. .
  • Example 16 100 parts by mass of the water-based paint was added with 6 parts by mass of the Sasa extract prepared in Reference Example 1 and 10 parts by mass of d1-lignoic acid, and mixed and heated at 80 ° C. for 2 hours to obtain an antibacterial paint. .
  • Example 1 To 100 parts by mass of sake, 3 parts by mass of the sasa extract produced in Reference Example 1 and 0.25 parts by mass of d1_linoleic acid were added and mixed and heat-treated at 80 ° C for 3 hours to obtain an antibacterial sake.
  • Example 1 To 100 parts by mass of sake, 3 parts by mass of the sasa extract produced in Reference Example 1 and 0.25 parts by mass of d1_linoleic acid were added and mixed and heat-treated at 80 ° C for 3 hours to obtain an antibacterial sake.
  • Example 1 To 100 parts by mass of sake, 3 parts by mass of the sasa extract produced in Reference Example 1 and 0.25 parts by mass of d1_linoleic acid were added and mixed and heat-treated at 80 ° C for 3 hours to obtain an antibacterial sake.
  • Test Example 7 Antibacterial activity against 10 gas gangrene bacteria perfringens 1 strain of C. perfringens ATCC13124 and 9 clinically isolated perfringens (GAI-92099, GAI-92100, GAI-92101, GAI-92102, GAI -92103, GAI-92104, GAI-92105, GAI-92106, GAI-92107).
  • the solid content of Sasa extract solution is 50%, and water soluble protein amino acids, minerals, tannins, carbohydrates, water soluble polysaccharides, carboxylic acids, total chlorophyll, caic acid, bimin, lipids, essential oils, water Consists of
  • the pH of the stock solution is about 5.0. Sterile distilled water was used to dilute the solution.
  • Antibacterial test The minimum growth inhibitory concentration was measured in% according to the agar plate dilution method used for measuring the antibacterial activity of antibacterial drugs. A two-fold dilution series of Sasa extract was prepared so that the final concentration was 25% to 0.2%. The Sasa extract diluent and the modified GAM agar medium (2x) were mixed 1: 1 to finally produce a modified GAM agar medium containing 12.5 to 0.1% Sasa extract. Modified method The colony of the test strain obtained by culturing on a GAM agar medium for 24 hours was scraped off with a sterile cotton swab and suspended in Anaerobe broth (Difco) to prepare a bacterium solution having Mc Turland No.
  • a mouth + 10 gas gangrene is a group of Clostridium sp. O. S. perfringens, Clostridium septicum, Clostridium bifermentans, etc. are known as causative agents, but are caused by the invasion of P. spores into the wound with soil.80% of gas gangrene cases C. perfringens.
  • Gas gangrene is a disease that can be adequately prevented by appropriate treatment in emergency surgery. However, if the surgical procedure is delayed or if the surgical procedure is not adequately performed, it may occur after injury. It is known that it develops after time, has a rapid course, and is fatal. In addition, the affected part, such as a limb, may have to be amputated for lifesaving, which is one of the diseases that cannot be underestimated medically.
  • Test Example 8 ⁇ Clostridium pe / r //? Antibacterial activity against gas gangrene bacteria other than ZJS) Strain used: A reference strain isolated from clinical material derived from an infectious disease patient or stored at our institution was used. In addition, E. coli ATC25922 and S.ATCC25923 were also used as strains for quality control of antibacterial activity evaluation. The test liquid is the same as in Test Example 7.
  • Antibacterial test The minimum growth inhibitory concentration was measured in% according to the agar plate dilution method used for measuring the antibacterial activity of antibacterial drugs.
  • a modified GAM agar medium containing Sasa extract was prepared so that the final concentration was 8% to 0.125%.
  • the medium pH was adjusted to 7.0.
  • Modified method A colony of the test strain obtained by culturing on a GAM agar medium for 24 hours is scraped off with a sterile cotton swab, and the strain is analyzed using Anaerobe broth (Diet). f Co) to prepare a bacterial solution having a turbidity of Mc Farland No. 1.
  • a mouth opening + 3 3 4 7 12 29 Sasa extract can grow C. novyi and C. S / WO /? At a concentration of 3%, sept i cum at a concentration of 3-5%, and C. bifermentans, C. sorflfe7 j7 at a concentration of 5%. It was found to be suppressed at a concentration of ⁇ 7%. In other words, although the antibacterial effect of Sasa extract on Wos tridium spp. Related to gas gangrene varied depending on the bacterial species, it was found that the concentration of% could suppress the growth of all the strains used. If this extract is used to prevent gas gangrene at the wound site, it is desirable to set the concentration to 7% under the condition of pH 7. Test Example 9 (Antibacterial activity against 16 Propionibacteriim araes strains)
  • Antibacterial test The minimum inhibitory concentration was measured by the agar plate dilution method used for measuring the antibacterial activity of antibacterial drugs. According to the standard method of the Japanese Society of Chemotherapy. A modified GAM agar plate (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing Sasa extract was prepared so that the final concentration was 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78%. The Sasa extract solution and the 2x agar medium were mixed at a ratio of 1: 1 to prepare an agar medium containing the Sasa extract at a predetermined concentration. Adjustment of pH was not performed.
  • the 1 platinum loop including the number of bacteria 10 8 / ml.
  • Anaerobic workstation After culturing at 35 ° C for 2 days in (Gunze Sangyo), the presence or absence of growth was visually observed. When growth was observed, it was judged as (+).
  • Test Example 10 Antibacterial activity against 26 strains of Pwpionibacteiiim acnes derived from fungi Bacteria used: A total of 26 strains of P./1 ⁇ 25 ⁇ bed isolate were used. These clinical isolates were isolated from acne patients and were kept at our institution. The test solution was the same as in Test Example 7, and was a 50% acidic solution (roughly ⁇ 5.0). Sterile distilled water was used for dilution.
  • Antibacterial test The minimum inhibitory concentration was measured by the agar plate dilution method used for measuring the antibacterial activity of antibacterial drugs. It was based on the standard method of the Japan Society for Danikyo Therapy. A modified GAM agar plate (Nissui Pharmaceutical) containing Sasa extract was prepared so that the final concentration was 8, 7, 6, 5, 4, 4, 2, 1, 0.5%. The pH was adjusted to around 7.0. A colony of the test strain obtained by culturing on a GAM agar medium for 48 hours was suspended in Anaerobe Broth, and a bacterial solution containing a predetermined number of bacteria was prepared. After culturing at 35 ° C for 2 days in an anaerobic workstation (Gunze Sangyo), the presence or absence of growth was visually observed.
  • Test Example 1 Antibacterial activity of Sasa extract against acto1 ⁇ 2 'J i7s spp.
  • strains used in the facility shown in Table 17 were used. These strains were purchased from ATCC and JCM and were stored at our facility. As controls, reraie77a bivia ATCC29303, Porphyromonas asaccharolytica AT CC25260, Bacteroides fragilis Nl, were selected from representative bacterial strains relatively frequently isolated from vaginal and gynecological infections of women with bacterial vaginosis. I chose N-2. In addition, Escherichia coli A TC2592 and Staphylococcus aureus ATCC25923 were used for the same purpose and as strains for quality control of sensitivity measurement. The test liquid is the same as in Test Example 7.
  • the undiluted Sasa extract was diluted with sterile distilled water and left for a while, a brownish precipitate might be formed. However, when it was mixed with the medium, it was mixed well and used.
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) was measured by the agar plate dilution method used for measuring the antibacterial activity of antibacterial drugs. According to the standard method of the Japanese Society of Chemotherapy. Modified GAM agar plates (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing Sasa extract were prepared to have final concentrations of 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, and 0.5%. For high concentration areas from 10% to 6% The mixture is prepared by mixing Sasa extract solution (20% to 12% each) and 2x agar medium 1: 1 (final pH 5.3 to 5.5), and 50% for low concentration range from 5% to 0.5%. An agar medium containing Sasa extract was prepared by mixing ⁇ 5% Sasa extract solution and 1 ⁇ agar medium at a ratio of 1: 9 (final: 115.5 to 6.0).
  • the antibacterial activity was examined under acidic ( ⁇ 5.3-6.0) conditions as well as under mildly acidic conditions. After adding Sasa extract, ⁇ was adjusted to pH 6.5-7.0 with 2 2 NaOH water to prepare a medium.
  • Lactobacillus casei ss.case Lactobacillus .hrevis ss.brevis Lactobacillus acidophilus Lactobacillus salivarius 7% to 8% for 4 strains, 10% or more for 5 strains excluding 4 strains of 5 strains Met.
  • the minimum growth inhibitory concentrations for bivia ATCC29303 and P. asaccharolytica ATCC25260 measured at the same time were all 0.
  • Sasa extract solution exhibits a pH close to the pH of the vaginal environment, and exerts a stronger antibacterial action under neutral to alkaline and neutral to acidic conditions.
  • the antimicrobial activity against E. coli and S. ai / rms strains decreased by about 2 tubes.
  • the MIC of Lactobacillus spp. did not change significantly even under slightly acidic experimental conditions in which the pH was slightly shifted to near neutral. .
  • asser L. fermentw, L. paracasei, L. plantarum, L. sahvanus, L. c spais, etc. are isolated at a relatively high rate from the intestinal tract of pregnant women and newborns.
  • the MIC shows a high value of 7% or more even for crispatus and ctobaci i / s spp.
  • gasseri which have a high separation rate from the vagina. I was
  • Sasa extract suggests that its antibacterial activity against vaginal useful bacteria and Zactoba «'77us spp., Which is useful in the gastrointestinal tract, is inherently weaker than that against bacterial species that are evaluated to be more pathogenic. are doing. This suggests that the use of Sasa extract in gynecological vagina and gastrointestinal tract could be a very good feature for this substance.
  • Sasa extract is a very important Escherichia coli as a causative bacterium of various types of infectious diseases, Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), which exhibits multidrug resistance to various antibacterial drugs, It has been found that it exhibits antibacterial activity against ⁇ eudomonas aeruginosa, which has a strong tendency to resist antibiotics.
  • MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus
  • the present inventors have so far measured the antibacterial activity of Sasa extract against anaerobic bacteria by the agar plate dilution method using a modified GAM II medium recommended for anaerobic bacteria.
  • Bacterial strains used 14 strains of Escherichia coli, 14 strains of Methicillin resistant S. aureus and 13 strains of aeruginosa, which are clinical isolates preserved in facilities.
  • E. coli ATC25922 and aureus ATCC25923 were used as quality control strains for sensitivity measurement.
  • the test solution is the same as in Test Example 7. Sterile distilled water was used to dilute the solution.
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by the agar plate dilution method used to measure the antibacterial activity of antibiotics against facultative bacteria. As far as possible, the method was based on the standard method of the Japan Danikyo Therapy Society. Muellar Hinton agar plates (Difco) containing Sasa extract were prepared so that the final concentration was 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.063, 0.032%. For the high concentration region of 7% to 6%, it is 14% to 12 respectively.
  • Sasa extract solution and Mueller Hinton agar medium of 2 times concentration are mixed 1: 1 to make 5% to 0.032%
  • a Sasa extract-containing agar medium was prepared by mixing 50% to 0.32% Sasa extract solution and 1-fold concentration Mueller Hinton agar medium at 1: 9. The medium was adjusted to pH 6.5-7.3 with 2 N NaOH water.
  • a modified GAM agar medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) was used to prepare a Sasa extract-containing agar medium, and the same inoculum was used to inoculate E. coli HI MRSA overnight. Anaerobic culture was performed to determine MIC. In this case, the pH was adjusted to 6.7 to 7.3 using 2 NNaOH.
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) of Sasa extract against ⁇ coli measured under experimental conditions of pH adjustment was distributed in 2-3%, and MIC50% was 2%.
  • the MIC for MRSA ranged from 0.25 to 0.5%, and the MIC 50% was 0.5%.
  • the MIC against P. aeru za inosa was 1% for all strains.
  • the MIC against the quality control strain ⁇ ATCC25922 under Mueller Hinton medium in a neutral environment and aerobic culture under aerobic culture was 2%, and the MIC against S. aureus A TCC25923 was 0.5%. .
  • the MIC50% of Sasa extract ⁇ 14 clinical isolates was 8% and the MIC50% of 14 S. aureus ⁇ floor isolates was 3% under anaerobic conditions using a modified GAM agar medium under anaerobic conditions.
  • %Met Modified method for strain for quality control
  • the MIC in neutral or anaerobic environment on GAM agar medium was 8% for E.co j 'ATCC25922 and 3% for S. aurei / s ATCC25923.
  • Sasa extract was less than 1% in MRSA and P. aeruginosa in a nearly neutral environment. MIC, and confirmed that it has an extremely strong antibacterial effect.
  • the MIC of a drug against bacteria varies under various experimental conditions such as the components of the culture medium used for measurement, the presence or absence of additives such as pH and blood, the amount of inoculated bacteria, and the culture environment. .
  • the present inventors have proposed Clostridium teta ni, Clostridium perfnngens, Propionibacterium acnes, Bacteroides fragil, which are anaerobic bacteria that require nutritionally complex components and grow only in an anaerobic environment in the absence of free oxygen.
  • aureus ATCC 25923 also showed a 3% MIC of Sasa extract measured in an anaerobic environment, indicating a large shift from 0.5 in the aerobic culture in Mueller Hinton medium to the resistant side.
  • the MIC90% of Sasa extract against MRSA143 ⁇ 4 in the same measurement environment as for anaerobic bacteria was 3%.
  • Propagation of S. aussens ⁇ in anaerobic culture results in dewdrop-shaped colonies with suppressed growth For this reason, it was sometimes difficult to determine the endpoint. Once the plate was determined, it was left overnight in an aerobic environment, and an operation was performed to confirm whether the dewdrop-shaped colonies would re-grow. In three cases in which S.
  • aureus ATCC 25923 was used for the measurement of antibacterial activity in anaerobic cultivation of Sasa extract, a drop-like colony was observed. In such a case, it is necessary to reconsider the method of determining the MIC, such as confirming the presence or absence of the ability to reproduce. From the above, it was clarified that the MIC of the facultative bacteria measured under the same conditions as the anaerobic bacteria shifted to the 6- to 8-fold resistant side. It is interesting to see if this is due to differences in media components between Mulle r Hinton agar and modified GAM agar, or differences between anaerobic and aerobic cultures, such as those found in aminoglycosides, which are antibiotics.
  • Bacteria used A total of 14 strains of Jia and 9 strains of Pigmented TOFOea spp. (Prevotella intelmedia Prevotella Melaninogenica) were used.
  • P. bivia was isolated from the female vagina in the early 1990s, and Pigmented Prevotella spp. was isolated from various clinical materials in 2002 and stored at this facility.
  • Escherichia co ' aureus ATCC25 923 was also used.
  • the test liquid is the same as in Test Example 7. The concentration is 50 (w / v)% acidic (pH 5 .0). Sterile distilled water was used for dilution.
  • Antibacterial test The minimum inhibitory concentration was measured by the agar plate dilution method used for measuring the antibacterial activity of antibacterial drugs.
  • a modified agar plate (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing Sasa extract was prepared so that the final concentration was 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125%.
  • the Sasa extract solution and the agar medium were mixed at 1: 9 to prepare an agar medium containing the Sasa extract at a predetermined concentration.
  • the pH of the medium was adjusted (pH 7.0 to 7.3) using a 2N Na0H aqueous solution.
  • the MIC of Sasa extract measured under the conditions of this experiment was> 5% for both ". «? 7 ATCC25922 and & aureus ATCC25923.
  • Sasa extract was 0.5% pigmented P. bivia and 1% pigmented.
  • the growth of Prevotella spp was completely inhibited, and the MIC50% of Sasa extract against bivia 14 strain and the MIC50% against Pigmented Prevotella spp.
  • vagina of healthy women is a treasure trove of anaerobic and aerobic bacteria.
  • Zacto0ac / 7 i / s spp. which plays an important role in maintaining vaginal cleanliness, is predominant in the normal flora of female birth canal.
  • anaerobic gram-positive cocci such as epi ostreptococus aflaeroWus known as opportunistic pathogens and anaerobic gram-negative bacilli such as Preyoie spp. (P revotella melaninogenica ⁇ Prevotella intermedia) and Bacteroides spp.
  • Bacterial Vaginosis is a milky, odor-causing disease that is associated with susceptibility to STD, premature birth, premature rupture and other perinatal abnormalities, pelvic inflammatory disease PID It is discussed in relation to the progress to.
  • P. bivia and pigmented Prevotella spp. are among the bacteria associated with bacterial vaginosis. It is also known that Severe is a very important bacterial species associated with intractability. From this study, it was clarified that Sasa extract showed extremely good antibacterial activity against these i-via and pigmented Prevote 11a spp.
  • Bacterial vaginosis (: BV BV-related microorganisms Bacteria
  • HSV Soil Toga Toxin Treponema pallidum Syphilis Treponema Bacteria ⁇ Stemophile Test Example 1 4 (Antibacterial activity against bacterial vaginosis-related microorganisms)
  • Gardnerella a7 / s is also found in the vagina of healthy women, but its bacterial count is low.
  • strain used ⁇ ?. rag 'fla7is (11 strains in total were used. These consisted of 2 strains purchased from NCTC or ATCC and 9 clinical isolates. The clinical isolates were introduced in the early 1990s. The strain was isolated from the female vagina and stored in our institution, and Escherichia coli ATCC25922 was used as a strain for controlling MIC accuracy. aureus ATCC25923 was also used. The test solution is the same as in Test Example 7.
  • Antibacterial test The minimum growth inhibitory concentration was measured by the agar plate dilution method used for measuring the antibacterial activity of antibacterial je. It was based on the standard method of the Japan Society for Danikyo Therapy. Brucella HK blood agar medium (Kyokuto Pharmaceutical) containing Sasa extract was prepared so that the final concentration was 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125%. Sasa extract solution and Brucella HK blood agar medium were mixed at a ratio of 1: 1 or 1: 9 to prepare an agar medium containing a predetermined concentration of Sasa extract. The pH of the medium was adjusted (pH 7.0 to 7.3) using a 2 N NaO vein solution.
  • the growth in the control medium was set so as to be uniformly observed throughout the smear site.
  • the MICs of Sasa extract against ⁇ co ATCC25922 and S. aureus ATC C25923 measured under the conditions of this experiment were> 8% and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , respectively.
  • the range of MIC for Sasa extract against ⁇ vaginalis 11 strains ranged from 6% to 4%, and MIC50% was 6%.
  • Bacterial vaginosis-associated microbes that are abnormally increased in bacterial vaginosis (BV) conditions characterized by decreased vaginosis, reduced vaginal pH, and a milky and malodorous band It is.
  • BV bacterial vaginosis
  • Antibacterial test The minimum growth inhibitory concentration was measured by the agar plate dilution method used for measuring the antibacterial activity of antibacterial drugs.
  • a modified GAM agar plate (Nissui Pharmaceutical) containing Sasa extract was prepared so that the final concentration was 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125%.
  • the Sasa extract liquid and the agar medium were mixed at 1: 9 to prepare an agar medium containing the Sasa extract at a predetermined concentration.
  • the pH of the medium was adjusted (pH 7.0 to 7.3) using a 2 N NaO vein solution.
  • the 1 platinum loop (10 ⁇ 1) was inoculated to the Sasa extract-containing plate series by the streaking method.
  • one loop contains about 10 6 bacteria.
  • the Sasa extract measured under the conditions of this experiment was «? 7 / ATCC25922 and. Aureus ATC.
  • Sasa extract completely inhibited the growth of 21 strains of M. micros, F. magna, P. anaerobius, and P. asacch aro i / cus ⁇ anaerobic cocci at a concentration of 3%.
  • the MIC50% of Sasa extract against anaerobic bacteria was 0.5%.
  • Bacterial vaginosis is a milky, odor-causing disease that is associated with susceptibility to sexually transmitted disease (STD), premature birth, and premature rupture, and various abnormalities seen in the perinatal period, pelvis It has been discussed in relation to progression to endoinflammatory disease (PID).
  • STD sexually transmitted disease
  • PID endoinflammatory disease
  • Zac s spp. which plays an important role in maintaining the cleanliness of the vagina during health, is significantly reduced, and Prevotella sw '(such as ⁇ ⁇ melamnogenica ⁇ P. intermedia), Vetera j Anaerobic gram-negative bacilli such as' fltes spp., anaerobic gram-positive cocci such as P. anaerobius, and ⁇ if abnormal growth such as vagimlis ⁇ Mycoplasm are known to grow.
  • These bacterial groups are called bacterial vaginosis-associated microorganisms.
  • Sasa extract reduced the growth of spp. (P. bivia, P. Melaninogenica, P. swelling o3 ⁇ 4, etc.), a bacterial vaginosis-related microorganism, at a concentration as low as 2%. He stated that Bacteroides fragilis g could block the occurrence of owp and G. vaginal is at a concentration of 6%. From this study, it was revealed that Sasa extract inhibits the growth of all strains even at the anaerobic group at a concentration of 2%. Test Example 16 (Antibacterial activity against bacterial vaginosis-related microorganisms)
  • Anaerobic gram-positive bacilli spp. are anaerobic, non-spore gram-positive anaerobic bacilli, and also include Prevotella bivia, Pigmented Prevotella spp. Abnormally increased bacterial vaginosis associated with bacterial vaginosis characterized by reduced lactobacilli in the vagina, reduced vaginal pH, and a milky, malodorous odor. A companion of living things. In this test example, the antibacterial action of Sasa extract against Mobiluncus sw 'was examined.
  • Test Example 7 Twelve strains of ⁇ W ifflras spp. Were used. Curtisii subsp. Curtisii ATCC35242, M. curtisii subsp. Holmessii ATCC25241, M. mulliel is ATCC35240. ATCC35243. Staphylo coccus aureus ATCC25923 was also used as a strain for MIC accuracy control.
  • the test liquid is the same as in Test Example 7.
  • Antibacterial test The minimum inhibitory concentration was measured by the agar plate dilution method used for measuring the antibacterial activity of antibacterial drugs.
  • Brucella HK blood agar plates containing Sasa extract were prepared at final concentrations of 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, and 0.125%.
  • sheep delipidated blood (Nissan) lysed by freeze-thawing was used and added to the medium at a rate of 5%.
  • the sasa extract solution and the agar medium were mixed at a ratio of 1: 1 to prepare an agar medium containing sasaex at a predetermined concentration.
  • the pH of the medium was adjusted (pH 7.0 ⁇ 0.3) using a 2 N NaOH aqueous solution.
  • aci i / s spp. which plays an important role in maintaining the cleanliness of the vagina during health, is significantly reduced, and Prevotella spp. (P. meianinogenica ⁇ P. intermedia chicks, Anaerobic gram-negative or anaerobic gram-positive bacilli such as Bactero ides spp.
  • Anaerobic gram-positive cocci such as spp., P. a / 2ae O? / i / s, and microorganisms such as .vaginalis and Mycoplasma are known to grow abnormally. These bacterial groups are called bacterial vaginosis-associated microorganisms.
  • Mobi 7 c «s spp. Has been identified in a study by the inventors of the present invention as having a high detection rate with a high BV score.
  • Test Example 17 Antibacterial action of Sasa extract on fec e / O / i es / ra i7 / s3 ⁇ 4.
  • Bacteroides fra i 's is a spore-free anaerobic gram-negative bacillus isolated from human feces, and is used in various skin and subcutaneous soft tissue infections including pressure sores and perianal abscesses. It is a clinically important bacterial species along with drug-resistant Pseudomonas aeruginosa. In this test example, the antibacterial effect of Sasa extract on ⁇ // lz's was examined.
  • Antibacterial test The minimum inhibitory concentration was measured by the agar plate dilution method used for measuring the antibacterial activity of antibacterial drugs. According to the standard method of the Japanese Society of Chemotherapy. A modified GAM agar plate (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing Sasa extract was prepared so that the final concentration was 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1. Up to 10 to 6%, mix Sasa extract and 2x agar medium 1: 1. Up to 5 to 1%, mix Sasa extract and agar medium 1: 9. An agar medium was prepared. The pH of the medium was adjusted (pH 6.6 to 7.1) using a 2 N NaOH aqueous solution.
  • the Bacteroides fragilis group (especially ⁇ ⁇ fragilis) is an anaerobic spore-free, gram-negative anaerobic bacillus that is resident in the lower gastrointestinal mucosa of humans. When the mucosa ruptures, the bacteria usually invade sterile tissues and organs and cause infection. It is an anaerobic bacterium that is most frequently isolated from various purulent infections, especially from the lower part of the diaphragm.
  • This bacterium is transmitted at the site of infection along with facultative bacilli such as Escherichia coli, faculties such as staphylococci, enterococci, and Streptococcus milleri groups, as well as non-spore anaerobic anaerobic bacteria other than microaerobic cocci and ⁇ cieroictes Existing.
  • facultative bacilli such as Escherichia coli
  • faculties such as staphylococci, enterococci, and Streptococcus milleri groups
  • non-spore anaerobic anaerobic bacteria other than microaerobic cocci and ⁇ cieroictes Existing.
  • it is important as a component of multiple bacterial infections.
  • B. fragilis and some other facultative bacteria it is naturally resistant to many antibacterial drugs, , Cefamycin, karbanem, etc. are relatively limited. However, even those few antibacterial drugs tend to become more resistant to acquisition and pose a problem. Therefore
  • Sasa extract is a representative group of anaerobic bacteria without spore anaerobic bacteria, which are important along with aur eus, P. aeruginosa, and E. co 'as the causative bacteria of purulent multiple bacterial infections.
  • the bacteria of the fragilis group had at least the same antibacterial activity under the anaerobic condition as the S. aureus ⁇ E.co 'reference strain.
  • Test Example 18 pelletvic infection
  • the vagina of a healthy woman is one of the treasure trove of anaerobic and aerobic bacteria.
  • Anaerobic bacteria are more than 10 times more aerobic than normal aerial flora in the female birth canal.
  • Anaerobic Gram-positive cocci and Bacteroides spp. (Prevotella spp. And Bacteroides spp. In the current classification).
  • Anaerobic bacteria are isolated from most patients with STD pathogen-free birth canal infections.
  • the major anaerobic pathogens are Bacteroides fragilis, Prevotella bivia, Prevotella disiens, Prevotella melaninogenica, anaerobic cocci, and Clostri dium spp.
  • Anaerobic bacteria have been implicated in tubal ovarian abscess, septic abortion, pelvic abscess, uterine endometritis, postoperative wound infections, especially post cesarean section wound infections. These infections are often multiple infections of anaerobic bacteria with Enterobacteriaceae bacteria, but infections caused only by anaerobic bacteria from which Enterobacteriaceae bacteria and other facultative bacteria cannot be isolated. Are more common than in intraperitoneal infections.
  • the uterus emits foul-smelling pus and blood, local pressure in the entire lower abdomen with the uterus or in the pelvis. It is characterized by pain, persistent fever and chills. Purulent thrombophlebitis of the pelvic vein may be complicated, causing episodes of recurrent septic pulmonary embolism.
  • Anaerobic bacteria are thought to be factors involved in the pathogenesis of bacterial vaginosis.
  • the syndrome for which the cause is not yet evident, is characterized by an overwhelming odorous secretion and an abnormal increase in bacteria such as vaginal Gardnerella vaginal is s Prevotella spp., Mobiluncus s PP., Peptostreptococcus spp. And mycoplasmas. I do.
  • Anaerobic bacteria are thought to play an important role in the pathogenesis of pelvic inflammatory disease (PID), and some experts have suggested that the relationship between bacterial vaginosis and progression to PID is Has shown.
  • PID pelvic inflammatory disease
  • Bifidobacterium sw.l and Lactobacillus spp. It is known as a resident bacterium in the digestive tract and vagina, and is known to have respiratory pathogenicity. It is a bacterium known as a useful bacterium without a specific bacterial species. Therefore, we examined the degree of antibacterial activity of Sasa extract against Bifidobacterium spp. Using a reference strain of Bifidobacterium SP.
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) was measured by the agar plate dilution method used for the measurement of antibacterial activity of antibiotics. According to the standard method of the Japanese Society of Chemotherapy. Modified GAM agar plates (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing Sasa extract were prepared so that the final concentrations were 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, and 0.5%. For the high-concentration region of 10% to 6%, the Sasa extract solution of 20% to 12% and the 2x agar medium are mixed 1: 1 (final pH 5.3 to 5.5), and 5% to 5%. For the low concentration area up to 0.5%, agar medium containing Sasa extract was prepared by mixing 50% to 5% of Sasa extract solution and 1x agar medium 1: 9 (final 5.5 to 6.0).
  • Sasa extract showed only weak antibacterial activity against 5 strains of 5 strains of Bifi'dobacteriu spp. Resident in the digestive tract, as well as against Lactobacillus spp.
  • Sasa extract strongly suggests that the antibacterial activity against vaginal useful bacteria and useful bacteria in the digestive tract is relatively weaker than that of opportunistic pathogenic bacteria.
  • Table 28 Antibacterial activity of Sasacekis against Bifidobacterium sm>.
  • Bacterial strains used A total of 13 strains of Candida albi cans and ⁇ Candida za were used. These strains were isolated from various clinical materials in 2002 and stored at this facility. Escherichia coli ATCC25922 Staphylococcus aureus ATCC25923 and Pseuifo Mas aeruginosa ATCC27853 were used as MIC accuracy control strains.
  • the test liquid is the same as in Test Example 7. Sterile distilled water was used for dilution.
  • Antibacterial test The minimum inhibitory concentration was measured by the agar plate dilution method used for measuring the antibacterial activity of antibacterial drugs.
  • MH agar plates (Difco) containing Sasa extract were used so that the final concentration was 8,7,6,5,4,3,2,1%.
  • the Sasa extract solution and the agar medium were mixed at 1: 9 to prepare an agar medium containing the Sasa extract at a predetermined concentration.
  • the pH of the medium was adjusted using a 2N NaOH aqueous solution or a 10% hydrogen chloride aqueous solution (two types: pH around 7.0 and pH 5.0).
  • a bacterium solution of McFarlan l was prepared in MH broth (Difco), and one platinum loop (10 ju 1 ) was inoculated to the plate series containing Sasa extract by the streaking method.
  • the 1 platinum loop containing about 10 6 bacteria.
  • the table shows the distribution of MIC for 63 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ '3 ⁇ 4 spp. Of Sasa extract determined after 1 day and after 3 days in the environment of pH5 and pH7. At a pH of 5 and 24 hours, the growth of all eight strains of C. a Wca / js and four strains of C. raia was inhibited at a concentration of 5% in sasacekis. 3 According to the later evaluation, 8% was required to prevent the growth of all strains.
  • Sasa extract has a growth inhibitory effect against yeast fungi.
  • the MIC measured after one day under acidity ranged from 5% to 3%.
  • the MIC measured under neutrality after adjusting for ⁇ ⁇ ranged from 5% to 4%.
  • the MIC at pH 5.0 against Candida spp. was 12% for 5 strains, except for 8% for 1 strain.
  • the MIC at pH 7.0 shifted from the range of 5 to 4% to more than 8%. This indicated that the action on Sasa extract fungi at the MIC or higher concentration determined one day later was bacteriostatic, suggesting that higher concentrations are required for killing.
  • glabrata did not grow sufficiently after 1 day culture at 37 ° C in a neutral environment, but when left at room temperature for 3 days thereafter, it showed sufficient growth, and MIC determination was possible. It became. In the Mueller Hinton medium adjusted to acidic, sufficient growth was observed even at 37 ° C for 1 day, and MIC determination was possible.
  • Sasa extract which has an antifungal effect in addition to an antibacterial effect, can be sufficiently used as a therapeutic drug for vaginitis, vulvitis and other conditions involving spp.
  • this extract has strong or moderate antibacterial activity against bacteria associated with bacterial vaginosis such as rew ea spp., E7 ap3 ⁇ 4g7 'za7 / s, and has other bacteriological properties. Since the present inventors have confirmed that it is considered to be highly useful as a therapeutic agent for bacterial vaginosis, in this case, the ex, which also has an antifungal effect, is, of course, It has been reported that Candida spp. Causes bacterial alternation or alternation, which has been reported to occur as a secondary phenomenon after the use of antibacterial agents that have no antifungal activity, such as chloramphenicol used for bacterial vaginosis. It is easily expected that it has characteristics that can be prevented.
  • Sasa extract is one of the causes of acne (Acne vulgaris). Important AOp o / jjT) acteriim 3 «1 ⁇ 25 at a concentration of 6.25% completely suppresses growth. Sasa extract also reduces Staphylococcus aureus (MRSA), which is important as S. pyogenes, by 1% or less. It was found that the growth was completely inhibited at the lower concentration.
  • MRSA Staphylococcus aureus
  • the present inventors have identified 13 Staphylococcus e pidermidis strains, which are important as acne exacerbating factors, and were isolated from the lesions of acne patients.
  • the antibacterial activity of Sasa extract was examined by agar plate dilution method using 14 strains of cohnii 13 ⁇ 4 (Staphylococcus spp.
  • Bacterial strains used Staphylococcus epidermidis ⁇ 3 strains A total of 14 Staphylococcus cohnii strains were used.
  • Escherichia coli ATCC25922 and S. aureus ATCC25923 were used as strains for quality control of sensitivity measurement.
  • Table 30 shows the strains used and the antimicrobial susceptibility patterns.
  • Table 30 Antibacterial resistance of Staphylococus sp. Derived from acne lesions
  • N-68 S. epidermidis PT / JP03 / 07557 Test solution is the same as in Test Example 7.
  • Sterile distilled water was used to dilute the solution.
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by the agar plate dilution method used to measure the antibacterial activity of antibiotics against facultative bacteria. As far as possible, we followed the standard method of the Japanese Society of Chemotherapy. Muellar Hinton agar plates (Difco) containing sasekis were prepared so that the final concentrations were 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, and 0.125%. 50% ⁇ : L.25% Sasa extract solution and 1-fold concentration Mueller Hinton agar medium were mixed at 1: 9 to prepare an agar medium containing Sasa extract. The medium was adjusted to pH 6.1 to 7.1 with 2N NaOH water. The MIC for S. aureus ATCC 25922 and ATCC 25922 was 2%. Preparation and determination of the inoculum:
  • a colony of the test strain obtained by culturing for 24 to 48 hours in a TSA * sky medium was scraped off with a sterile cotton swab and suspended in Mueller Hinton broth (Difco) to prepare a bacterium having a turbidity of Mc Farland No. 1. 10/1 was suspended in 1 ml of Mueller Hinton broth, and 10 ⁇ 1 of the suspension was inoculated into a plate series containing Sasa extract by the streaking method. After culturing in an aerobic environment at 35 ° C for 20 hours, the presence or absence of growth was visually observed.
  • a total of 14 strains were used to examine the antibacterial activity of Sasa extract by the agar plate dilution method. As a result, Sasa extract completely suppressed the growth at a concentration of 1%.
  • Fourteen strains have been tested for susceptibility to three antibacterial agents (tetracycline, clindamacincin, and ofloxacin), with two strains resistant to one tetracycline and one strain resistant to one clindamycin, Two strains resistant to tetracycline and clindamycin were included in two strains, and one strain resistant to ofloxacin was included in one strain. Sasa extract uniformly inhibited the growth of these resistant bacteria by 1% or less.
  • the present inventors have identified an important acne exacerbation factor isolated from acne patients.
  • Bacterial strain used HI cocczz ⁇ 44 3 ⁇ 4 in total was used.
  • Escherichia coli ATCC25922, S. ai / ra / s ATCC25923 was used as a strain for quality control of sensitivity measurement.
  • the test solution is the same as in Test Example 7. Sterile distilled water was used to dilute the solution.
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by the agar plate dilution method used to measure the antibacterial activity of antibiotics against facultative bacteria. As far as possible, we followed the standard method of the Japanese Society of Chemotherapy. Muellar Hinton agar plates (Difco) containing sasakekis were prepared at a final concentration of 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125%. The medium was adjusted to ⁇ 6. ⁇ 7.1 with 2N NaOH water. The MIC for S. aureus ATCC 25922 and ⁇ coli ATCC25922 was 2%.
  • Table 32 Susceptibility of Staphylococcus spp. (44 strains) to Sasa extract and various antibacterial agents
  • Staphylococcus epidermidis 34 S. capitis 2, S. aureus 2, S. cohnu 1, S. hominis 1, S. haemolyticus 1, Staphylococcus sp. 3
  • Test example 2 3 for vaginitis and bacterial vaginosis-associated microorganisms) Antibacterial action
  • test liquid is the same as in Test Example 7. It is a slightly viscous, acidic liquid with an aroma of 50 (w / v)% brown.
  • Test method for antibacterial activity Following the method for measuring the antibacterial activity of an anaerobic bacterium, the minimum inhibitory concentration (MIC) was calculated as a percentage using a modified GAM agar medium or Brucella HK agar medium as a basal medium for measurement.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • Candida spp. B Prevotella bivia (14 strains), Pigmened Prevotella spp. (9 strains), Finegoldia, Micromonas,;) anaerobic cocci of tos repiococc (21 strains), Mobiluncus s. (123 ⁇ 4) s Gardnerella vaginalis (113 ⁇ 4) was used.
  • Bacterial strain used A reference strain stored at this facility was used [Tables 33 to 36]. Escherichia co? / ATCC25922 and SiapA ⁇ ococras aureus ATCC25923 were also used as MIC accuracy control strains.
  • the test liquid is the same as in Test Example 7. Sterile distilled water was used for dilution.
  • Antibacterial test The minimum inhibitory concentration was measured by the agar plate dilution method used for measuring the antibacterial activity of antibacterial drugs. Modified GAM agar plates (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing final concentrations of 6.4, 3.2, 1.6. 0.8, 0.4, 0.2, 0.1% sasax were prepared. The pH of the medium was adjusted using a 2N aqueous sodium hydroxide solution and a 10% aqueous hydrochloric acid solution, and the targets were set to PH6.0 and PH7.0.
  • Peptostreptococcus anaerobius ATCC27337 Peptostreptococcus asacchroly ticus WAL3218, PeOtostreptococccus indolicus GAI0915, Peptostreptococc us prevotii ATCC9321um, Micromonas micros V I-5464-1, Finegoima magna ATCClocus bacillum ATCC 293b No growth.
  • Porphyromonas gingival is ATCC33277 0.4 ND
  • Clostridium sept icm, Clostridium sordellii, and Clostridium perfringens belong to the group of gas gangrene bacteria.
  • Sasa extract is resistant to spore-free anaerobic gram-positive cocci (inego a, Micro thighs, Pept ostreptococcus, Atopob marauder, Gemella). However, the microaerobic anginosus group showed only weak antibacterial activity.
  • Propionibacterium exhibited moderate antibacterial activity, while Actinomyces, Biiidobacterum, and Zaci ⁇ aci ⁇ s exhibited weak antibacterial activity. It showed strong antibacterial activity against Prewtella, Porphyromonas, Bilophila, Desulfovivrio and FusotecieriiM against spore-free anaerobic gram-negative bacilli, and moderate antibacterial activity against Bacteroides and Sutterella. Anaerobic Gram-negative cocci (Eillonella showed strong antibacterial activity. Clostridium showed moderate antibacterial activity. Except for sorofe 7i, it showed strong antibacterial activity.
  • the antibacterial agent of the present invention includes tetanus bacteria, Candida bacteria (for example, Candida albicans, Candida glabrata), propionipacterium muvacnes, gas gangrene, various resistant bacteria (for example, Methicillin resistant Staphylococcus aureus), vaginitis And microbes associated with bacterial vaginosis (eg, Finegoldia, Micro thigh as, Peptostreptococus), etc.
  • Candida bacteria for example, Candida albicans, Candida glabrata
  • propionipacterium muvacnes for example, gas gangrene
  • various resistant bacteria for example, Methicillin resistant Staphylococcus aureus
  • vaginitis And microbes associated with bacterial vaginosis eg, Finegoldia, Micro thigh as, Peptostreptococus
  • Antibacterial effect against viruses such as herpes virus, antibacterial ink, antibacterial paint, antibacterial sake, antibacterial adhesive, antibacterial beverage, antibacterial food, antibacterial It is useful as a seasoning, an antibacterial agent for animals and plants, an antiseptic, a fungicide for agriculture, a pesticide, etc.
  • an organic acid for example, malic acid

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Abstract

　　ササエキスを含有する抗破傷風菌剤、ササエキス及び有機酸を含有する抗カビ剤、ササエキスを含有する抗ウイルス剤、ササタンニンを含有する抗菌剤、ササエキス及び有機酸を含有する抗菌性組成物。

Description

明細書
抗菌剤及び抗菌性組成物 技術分野
本発明は、 ササエキスを含有する抗菌剤に関し、 さらに詳細には、 ササエキス を含有する抗破傷風菌剤、 抗カビ剤、 抗ウィルス剤及び抗菌性組成物に関する。 背景技術
ササエキスは古くから抗菌性を有することが知られている。例えば、 創傷感染 症の原因菌となる細菌である黄色ブドゥ球菌（ Staphylococcus aureus), 緑膿菌（ Pseudomonas aeruginosa^ 大腸 Wi( scherichia co/iに対する抗菌効果や、 胃 潰瘍の原因菌とされるピロリ菌 Helicobacter pylori)に対する抗菌効果が報 告されている。
しかし、 創傷感染症の原因菌として、 破傷風、 ガス壊疽、 各種化膿性感染症の 原因となる有芽胞および無芽胞嫌気性菌も重要な存在であるが、 これら嫌気性菌 に対する抗菌作用についての検討はいまだみられない。
抗菌力を有する物質を評価する際には、 その物質の人の病原菌に対する作用と ともに皮膚、 粘膜に常在する有用あるいは日和見細菌に対する作用を知っておく ことは、 極めて重要である。
ところで、 Lactobacillus sw. は、 口腔内、 消化管内、 膣内の常在細菌とし て知られている。 常在細菌の生体に対する作用には二面性があることは周知のと ころである。 Lactobacillus sw' も、 血液を含む臨床材料から分離されること があり、 病原的意義も決して過少評価すべきではないが、 その分離頻度は極めて 低率であることから、 それぞれの解剖学的部位で有用性が高い細菌種と考えられ ている。 人に対して有用性の高い菌群と評価されている Zacto ?aci7 us spp.に対 して、 ササエキスがどの程度の抗菌作用を有するかはきわめて興味ある点である が、 これまでその詳細な検討成績はみられない。
ところで、 皮膚の皮脂腺内に常在する ropiifflibacieri a∞esは、 嫌気性無 芽胞嫌気性菌で、 中等症から重症の Acne vulgaris (ざそう） において、 Staphylo coccus aureus^? Staphylococus epiden di sなどヒヒもに Ac vulgarisの増悪 因子として知られている。 現在、 Acne vulgar isの治療には、 これまで抗菌薬（ ェ リス Dマイシン、 テトラサイクリン、 ナシ、、フ Πキンン）のクリーム、 ローションが使用されているが、 それらの長期の使用による Staphylococus sp . や P. araesの耐性化が臨床上問 題になっており、 世界的にその対策について議論されているところである。 ササ エキスの acnesについての検討成績は見あたらない。
Prevotella biviaや Pigmented Prevotella spp.は、 健常な女性の膣では検出 限界以下の菌数でしか存在しないが、 Mycoplasma genital im (hommis)、 Gard nerella vaginalis^ Pep tos trep tococcus aaaara&j ' を中心とする嫌気' |'生グラム 陽性球菌、 Porphyro onas spp.などとともに、 膣内乳酸菌の減少、 膣内 p Hの . 低下、 およびミルク様で悪臭（ァミン臭）のある帯下を特徴とする細菌性膣症 ( B V ) の状態で異常に増加する細菌性膣症 ( B V) 関連微生物の範疇に入る偏性 嫌気性グラム陰性桿菌で、 子宮内、 骨盤内感染症の原因菌としても極めて重要な 細菌である。
ササエキスには抗菌作用があることが知られているが、 これまでこれらの B V 関連細菌群菌種に対する抗菌作用の検討は全くみられない。 このように、 ササエキスが全ての細菌に対して有効な抗菌活性を有するかどう かは知られていないし、 細菌に対して抗菌活性を有する天然抽出物がカンジダ等 のカビに対しても抗菌活性を有するかどうかは一般に知られていない。
一方、 破傷風は、 破傷風菌が創傷部位に感染し、 そこで産生された神経毒素が おもに筋のけいれん、 硬直、 腱反射亢進を起す致命率の高い毒素性疾患である。 破傷風菌は土、 ヒト、 動物の便に検出される嫌気性桿菌であり、 破傷風の予防治 療にはトキソィ ドによる自動免疫、 抗毒素血清による受動免疫が有効であるとさ れている。 しかし、 ササエキスが破傷風菌に対して抗菌活性を有することは知ら れていない。
また、 ウイルスは自己増殖不能で動植物や微生物に寄生増殖する極微小な病原 体であり、 動物ウィルス、 植物ウィルス、 微生物ウィルスに分けられる。 ウィル ス性疾患の予防治療用の種々の抗ウィルス剤が開発されているが、 なお、 副作用 のない有効な抗ウィルス活性を有する薬剤が求められている。
また、 各種の植物に含まれる夕ンニンが抗菌作用を有することも知られている
。例えば、 ササ以外の植物由来のタンニンが MR S A (メチシリン耐性黄色ブド ゥ球菌） に対する抗菌作用を有することも知られているが、 副作用が大きいため に抗菌剤として使用することができないという問題がある。 発明の開示
従って本発明の目的は、 抗菌剤を提供することであり、 さらに具体的には、 抗 破傷風菌剤、 抗ガビ剤及び抗ウィルス剤を提供することである。' ' 本発明の他の目的は、 抗菌性組成物を提供することである。
本発明はササエキスを含有する以下の抗菌剤、 抗菌性組成物を提供するもので あ ο
1 . ササエキスを含有する抗破傷風菌剤。
2 . ササエキスを含有する抗カビ剤。
3 . さらに有機酸を含有する上記 2記載の抗カビ剤。
4. カビがカンジダである上記 3記載の抗カビ剤。
5 . ササエキスを含有する抗ウィルス剤。 6. ササタンニンを含有する抗菌剤。
7. 黄色ブドウ球菌、 プロピオニバクテリゥム、 大腸菌に対する抗菌剤である上 記 6記載の抗菌剤。
8. MR S Aに対する抗菌剤である上記 6記載の抗菌剤。
9. プロピオ二バクテリウムァクネスに対する抗菌剤である上記 6記載の抗菌剤 ο
10. ササタンニンを含有する二キビ治療剤。
1 1. ササエキス及び有機酸を含有する抗菌性組成物。
12. インキ、 塗料、 食品添加物、 飲料、 調味料、 ぺヅトフ一ド、 プラスチック 成形品、 又は接着剤である上記 11記載の抗菌性組成物。
13. ササエキスを含有するガス壊疽菌に対する抗菌剤。
14. ガス壊疽菌がクロストリジゥム属菌である上記 13記載の抗菌剤。
15. ササエキスを含有する無芽胞嫌気性グラム陽性球菌に対する抗菌剤。
16. 無芽胞嫌気性グラム陽性球菌が Micromonas, Peptostreptoco ecus, Atopobium, 又は eme77aである上記 1 5記載の抗菌剤。
17. ササエキスを含有する無芽胞嫌気性グラム陰性桿菌に対する抗菌剤。
18. 無芽胞嫌気性グラム陰性桿菌が /wo e7 a, Porphyromonas, Bilophila, Desulfovivrio, 又は¾sc½ci である上記 17記載の抗菌剤。
19. ササエキスを含有する膣炎および細菌性膣症関連微生物に対する抗菌剤。 20. さらに有機酸を含有する上記 13〜19のいずれか 1項記載の抗菌剤。
2 1. ササエキスを含有する調味料。
22. ササエキスを含有する食塩である上記 21記載の調味料。
23. さらに有機酸を含有する上記 21又は 22記載の調味料。
24. ササエキスを含有する農薬。
25. さらに有機酸を含有する上記 24記載の農薬。 2 6 . ササエキスを含有する農業用殺菌剤。
2 7 . さらに有機酸を含有する上記 2 6記載の農業用殺菌剤。
2 8 . ササエキスを含有する防腐剤。
2 9 . さらに有機酸を含有する上記 2 8記載の防腐剤。
以下、 この明細書において抗破傷風菌剤、 抗カビ剤、 抗ウィルス剤、 二キビ治 療剤等を総称して単に 「抗菌剤」 と称することもある。
また、 この明細書において 「抗菌剤」 とは、 ヒト以外に使用される抗菌剤、 防 腐剤も包含するものとする。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 有効成分としてササエキスを含有する抗菌剤である。 本発明の抗菌 剤は、 ササエキスを固形分で 1〜5 0質量％、 好ましくは 2〜2 5質量％、 さら に好ましくは 4 ~ 1 5質量％含有する。 ササエキスの固形分濃度が 1質量％未満 では目的とする抗菌性の発現が不充分であり、 一方、 5 0質量％を超えると、 刺 激が強くなり過ぎて好ましくない。
従来、 ササエキスは、 通常 0 . 5〜1 0質量％の固形分を含有するエキスとし て製造され、 種々の用途に利用されてきた。 この固形分濃度のものを通常は最終 製品に対して 1〜1 0質量％程度添加して使用しているため、 最終製品中のササ エキスの固形分濃度は通常 0 . 0 5〜0 . 8質量％程度であり、 最も高濃度のも のでも 1質量％未満程度であった。 その理由としては、 ササエキスが比較的高価 であること、 このような低濃度でも、 ある程度の消炎効果や抗菌効果が発現して いたこと、 有効成分の添加量を 1 0質量％以上とすることは常識的ではないこと 等が挙げられる。 しかし、 このような低濃度では、 抗菌効果が充分なものではな い場合が多かった。
本発明者は、 ササエキスを固形分濃度で 1〜1 0質量％、 好ましくは 2〜 8質 量％、 さらに好ましくは 3〜7質量％含有させることにより、 従来の低濃度の場 合にはほとんど認められなかったァトピ一等に対する改善効果、 止痒効果が顕著 に発現し、 また創傷治癒効果も著しく向上することを見出した （W0 02/07745)。 本発明者は、 さらにササエキスの各種菌類に対する抗菌効果を探索し、 ササェキ スを固形分で 1〜5 0質量％、 好ましくは 2〜2 5質量％、 さらに好ましくは 4 〜1 5質量％含有するものが、 綠膿菌、 黄色ブドウ球菌、 大腸菌等以外の菌、 す なわち破傷風菌等の嫌気性菌、 プロピオ二パクテリゥムァクネスを含むプロピオ ニバクテリゥム、 カンジダ等の力ビ類、 あるいはヘルぺスウィルス、 インフルェ ンザウィルス、 コロナウィルス等のウィルス等にも顕著な抗菌効果を有すること 、 ササエキスにリンゴ酸等の有機酸を含有させることにより、 抗菌性が顕著に向 上することを見出し、 本発明を完成するに至ったものである。 ササエキス自体は 古くから知られているにも関わらず、 これを高濃度で使用するという試みがこれ までになされなかった理由は定かではないが、 従来の濃度より高濃度 （1 0倍以 上） にすることにより、 破傷風菌等の嫌気性菌、 カンジダ等の力ビ類、 あるいは ウィルス等にも顕著な抗菌効果を有することは全く驚くべきことである。 本発明は皮膚軟部組織感染症にも有効である。 皮膚、 骨、 軟部組織が外傷、 虚 血、 手術により損傷を受けると、 嫌気性菌感染症に適した環境ができる。皮膚軟 部組織感染症は糞便や上気道分泌物で汚染されやすい場所におこる。 例えば、 腸 管手術と関係する創部、 褥創、 人による嚙傷と関連する創傷がある。 嫌気性菌は 、 ガス産生の見られる蜂窩織炎 (crepitant cellulitis) ，相乗的蜂窩織炎 （syn ergistic cellulitis) ，壊疽 (gangrene) および壊死性筋膜炎の症例で分離され る。 さらに、 嫌気性菌は皮膚の膿瘍、 直腸膿瘍、 そして、 腋下汗腺感染症 （化膿 性汗腺炎） から分離される。 嫌気性菌は糖尿病患者の足潰瘍からも頻繁に分離さ れる。 皮膚軟部組織感染症は通常複数菌感染症である。 平均すると症例あたり 4.8菌 種が分離されており、 嫌気性菌と好気性菌の比率は 3 ： 2となる。 分離頻度の 高い細囷種は、 Bacteroiaes spp. , Peptostreptoccus spp. , Enterococcus spp. , Clostridium spp. , Proteus spp. である。 嫌気性菌がこれらの感染症に関係 すると、 発熱の頻度が高まり、 患部に悪臭がみられるようになり、 組織内にガ スが、 また、 足には潰瘍がみられるようになる。
嫌気性菌と通性菌の相乗作用によっておこる壊疽 （Meleneyの壊疽） は、 強烈 な痛み、 発赤、 腫脹とそれに続いておこる induration (硬結）を特徴とする。紅斑 が壊死帯を中心にして拡がる。 肉芽性の潰瘍が、 壊死と紅斑が外側に拡大するに つれて、 中心部に形成されていく。 症状は疼痛のみで、 発熱は典型的な症状では ない。 この感染症は、 よく、 S. aureusと Peptostreptococus spp.の組み合わせ によっておこる。 好発部位は腹部の手術創、 下肢の潰瘍の周辺部である。 治療は 壊死組織の外科的除去と抗菌化学療法である。
壊死性筋膜炎という急速に広がる筋膜の破壊的な疾病は A群連鎖球菌によるこ とが多いが、 Peptostreptococcusや Bacteroidesのような嫌気性菌によっておこ . ることもある。 組織内にガスをみることもある。 これと同様に、 筋壊死も嫌気性 菌と通性菌の混合感染症と関係している。 Fournier壊疽は、 陰嚢、 会陰部、 .腹壁 前部をおかす、 複数の嫌気性菌が深部の筋膜面 deep external facial planesに そって拡がっていき、 広範な皮膚欠損をきたす蜂窩織炎である。
本発明は、 ササエキスを含有する皮膚軟部組織感染症に対する治療及び/又は 予防剤を提供するものである。
本発明はまた、 ササエキスを含有するプロピオ二バクテリウムァクネスを含む プロピオ二パクテリゥムに対する抗菌剤を提供するものである。
本発明者はササエキスの有効成分について、 さらに検討した結果、 ササエキス 中に比較的多量に含まれるタンニンが優れた抗菌作用を有することを見出し本発 明を完成するに至ったものである。従来、 タンニンが抗菌作用を有することは報 告されているが、 これらのタンニンはいずれも副作用が大きいため実用化された ものは知られていない。 ササエキス自体は古くから経口摂取され、 人体に対する 副作用を有していないことは知られている。 このようなササエキス中にタンニン が比較的多量に含まれ、 それが優れた抗菌作用を有することは全く予想されなか つたことである。 本発明の抗菌剤の有効成分であるササエキスの原料として使用するササは、 特 に限定されず、 ササ属 （Sasa) に属するすべてのササが例示される。例えば、 ク マイザサ、 クマザサ、 チシマザサ、 ォクャマザサ、 ェゾミヤマザサ、 チマキザサ 、 ャヒコザサ、 ォォバザサ、 ミヤマザサ、 センダイザサ、 ユカヮザサ、 ァボイザ サ、 ォヌカザサ等が挙げられる。 これらのうち、 市販品の具体例としてはクマイ ザサ、 クマザサ (チュウゴクザサ、 ヒダザサ)等が挙げられる。例えば、 北海道 天塩山系で 7〜1 0月に採取されたクマイザサ、 クマザザの水抽出物等が好まし い。
本発明に使用するササエキスは、 ササの生葉又は乾燥葉、 好ましくは乾燥葉を 、 1 0 0〜1 8 0 °Cの水で、 常圧又は加圧抽出して得られるものが好ましい。 抽出方法は特に限定されないが、 例えば、 特許第 3 2 1 2 2 7 8号 （特開平 1 1 - 1 9 6 8 1 8号公報） に記載された方法を使用することができる。 さらに具 体的には、 加圧熱水抽出機により 1 0 0〜1 8 0 °C、 5〜3 0分処理してエキス を抽出し、 該エキスを水分分離器により含水固形分 （含水率 4 0〜7 0 %) と分 離し、 次に飽和水蒸気加熱処理機により該含水固形分を 1 0 0 °C；〜 2 0 0 °Cで 5 分〜 6 0分処理した後、 再度加圧熱水抽出機により 1 0 0 °C；〜 1 8 0 °Cで 5〜 3 0分処理してエキスを抽出させ、 第 1回目と第 2回目のエキスを合わせて使用す る。 また、 ササ乾燥葉を例えば、 6 0〜1 0 0 °Cの水で 3 0分〜 1 2時間程度抽 出して得られるエキスも使用できる。
ササエキスを固形分で 50質量％含有する市販品としては、 株式会社クロロラ ンド 'モシリ製「AHSSj、 株式会社鳳凰堂の 「TWEBSjがある。
こうして得られるササエキスは硫黄成分を含有しており、 その含有量は硫黄に 換算して、 ササエキスの固形分 1 gあたり約 4〜10mg、 通常は約 6〜9mg である。硫黄成分のうち主たる成分は含硫アミノ酸と考えられる。
本発明の抗菌剤は、 ササエキス由来の硫黄成分を、 硫黄に換算して 100 g当 り、 好ましくは 4〜500mg、 さらに好ましくは 8〜250mg、 最も好まし くは 16〜： 15 Omg含有する。
また、 ササエキスは夕ンニンを含んでおりその含有量はササエキスの固形分に 対して 5〜15質量％程度である。 '
本発明の抗菌剤は、 ササタンニンを固形分濃度で好ましくは 0. 05〜7. 5 質量％、 さらに好ましくは 0. 1〜 6質量％含有することが望ましい。
本発明の抗菌剤は、 ササエキスのみを有効成分とするものであっても良いし、 これに適量の有機酸を併用することにより、 その抗菌効果をさらに向上させるこ とがで'きる。 このような有機酸としては、 リンゴ酸、 クェン酸、 乳酸、 シユウ酸 マロン酸、 コハク酸、 フマル酸、 酢酸、 安息香酸、 フエニル酢酸、.サリチル酸 、 フエノール類等が挙げられる。
有機酸の使用量は、 本発明の抗菌剤中、 好ましくは 0. 01〜5質量％、 さら に好ましくは 0. 02〜3質量％、 最も好ましくは 0. 05〜1. 5質量％であ る。
本発明の抗菌剤は、 ササエキスそのものでも良いし、 これを他の成分、 担体と 混合しても良い。
本発明はササエキス又はササエキスと有機酸の混合物を含有する食塩、 砂糖、 醤油、 味噌、 ソース、 マヨネーズ、 酒、 味醐、 ドレッシング等の調味料等を提供 するものである。例えば、 ササエキス又はササエキスと有機酸の混合物を食塩に 添加すると、 食塩による魚類、 肉類等の保存期間が各段に長くなるという効果が ある。食塩に対するササエキスの添加量は、 固形分で好ましくは 1〜1 0質量％ 、 さらに好ましくは 2〜8質量％、 最も好ましくは 3〜6質量％である。
本発明の抗菌剤の剤型は、 液体状、 固体状、 気体状いずれでも良い。 本発明の 抗菌剤は、 経口、 非経口投与いずれの投与形態で投与してもよい。経口投与形態 としては錠剤、 丸剤、 粉剤、 液剤、 チュ一インガム、 飴、 チョコレート、 パン、 クッキ一、 そば、 うどん、 各種ドリンク剤等の食品形態が、 非経口投与形態とし ては、 注射剤、 局所投与剤 （クリーム、 軟膏等） 、 座薬等が挙げられる。局所投 与剤の剤型の例としては、 本発明の抗菌剤を、 天然繊維又は合成繊維製のガーゼ 等の担体に含浸させたもの、 口紅等の化粧品に含有させたもの等が挙げられる。 本発明の抗菌剤は、 ヒトはもとより、 ヒト以外の哺乳類、 鳥類、 魚類、 爬虫類 等用の抗菌剤としても有効である。従って本発明の抗菌剤は、 これらの動物の用 の抗菌剤 （例えば、 ペット用医薬、 ペットフード等） として使用することができ る。 さらに本発明の抗菌剤は、 動物以外に、 各種植物に対する抗菌剤としても有 用であり、 また、 P方腐剤としても有用である。 本発明の種々の剤型の抗菌剤の製造には、 所定量の上記ササエキスのほか、 通 常の医薬組成物、 化粧品、 皮膚用組成物等に使用される油性成分等の基材成分、 保湿剤、 防腐剤等を使用することができる。
抗菌剤に使用する水は、 水道水、 天然水、 精製水等、 特に限定されないが、 一 般にイオン交換水等の高純度の水が好ましい。
油性成分としては、 スクヮラン、 牛脂、 豚脂、 馬油、 ラノリン、 蜜蠟等の動物 性油、 オリープ油、 グレープシード油、 パ一ム油、 ホホバ油、 胚芽油 （例えば、 米胚芽油） 等の植物性油、 流動パラフィン、 高級脂肪酸エステル （例えば、 パル ミチン酸ォクチル、 ノ ルミチン酸イソプロピル、 ミリスチン酸ォクチルドデシル ) 、 シリコ一ン油等の合成油、 半合成油が挙げられる。
油性成分は、 皮膚の保護、 ェモリエント性付与効果 （皮膚表面を薄膜で覆い、 乾燥を防ぐと共に、 柔軟性、 弾力性を与える効果） 、 さっぱり感等の要求性能に 合わせて適宜組み合わせて用いられる。 スクヮラン、 オリ一プ油及びミリスチン 酸ォクチルドデシルの組合せは好ましい例の一つである。
抗菌剤の硬さ、 流動性を調節するために、 ステアリン酸、 ステアリルアルコー ル、 ベへニン酸、 セ夕ノール、 ワセリン等の固体油が用いられ、 好ましくはステ ァリン酸とセ夕ノールが組み合わせて用いられる。
本発明の抗菌剤をクリーム組成物として製造するためには、 ササエキス、 水、 油性成分をクリーム状にするためのクリーム化剤が用いられる。 クリーム化剤は 、 特に限定されないが、 モノステアリン酸グリセリンと自己乳化型モノステアリ ン酸グリセリン (モノステアリン酸グリセリンに乳化剤を添加したもの) とを組 み合わせて使用するのが一般的である。
本発明の抗菌剤には、 さらに必要に応じて安定ィ匕剤、 保湿剤、 創傷治癒剤、 防 腐剤、 界面活性剤等を含有させることができる。 ·
安定化剤としては、 カルボキシビニルポリマ一と水酸化力リゥムの組合せ、 ジ ステアリン酸ポリエチレングリコール等が挙げられる。 特に、 セスキステアリン 酸ポリエチレングリコ一ル （ジステアリン酸ポリエチレングリコ一ルとモノステ アリン酸ポリエチレングリコールの 1 ： 1混合物） （ポリエチレングリコ一ルの 分子量は 1 0 0 0〜2万） は、 安定性が高く、 水と油に分離することがなく、 ま た、 クリーム組成物として皮膚に塗布する際の硬さを効果的に調節することがで きるので好ましい。
保湿剤としては、 ヒアルロン酸ナトリウム、 コラーゲン、 アロエエキス （特に 、 木立アロエ由来のアロエエキス （2 ) が好ましい） 、 尿素、 1 , 3—プチレン グリコール、 グリセリン、 トレノヽロース、 ソルビトール、 アミノ酸、 ピロリドン カルボン酸ナトリゥム等が挙げられる。
創傷治癒剤としては、 アラントイン、 グリチルリチン酸ジカリウム、 カンゾゥ エキス、 ョモギエキス等が挙げられる。
防腐剤は、 ササエキス自体に抗菌作用があるため補助的に用いられるものであ る。 例えば、 安息香酸ナトリウム、 パラヒドロキシ安息香酸低級アルキルエステ ル （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル又はプチルエステル等のパラペンと称さ れるもの） 、 プロピオン酸ナトリウム、 混合脂肪酸エステル （カプリン酸グリセ リル、 ラウリン酸ポリグリセリル— 2、 ラウリン酸ポリグリセリル一 1 0の混合 物） 、 フエノキシエタノール、 感光素 2 0 1号 （黄色色素） 、 1 , 2—ペンタン ジオール等が挙げられるが、 パラベン、 混合脂肪酸エステル、 1 , 2—ペンタン ジオールが好ましい。
界面活性剤としては、 例えば、 N—ァシル—L—グルタミン酸ナトリウム、 ポ リオキシエチレンソルビ夕ンモノステアレート等が挙げられる。
さらに必要により、 香り成分、 例えば、 オレンジオイル、 レモンオイル、 トウ ヒ油、 香料等を含有させてもよい。
以上の各成分に、 水、 及び必要により有機酸を加えて全体で 1 0 0質量％とす る。
本発明の抗菌剤をクリーム組成物として製造する場合の各成分の好ましい配合 量 （質量％) を、 以下の表 1に示す。 水分以外の各成分の配合量は水分を除いた ものの質量％である。
2 表 1
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以上の各成分を、 攪拌翼と好ましくは乳ィ匕器を備えた加熱混合釜に投入し、 7 0〜 9 0 °Cで 1〜 2時間攪拌混合し、 本発明の抗菌剤を得る。
本発明の抗菌剤は、 クリーム組成物の他、 軟膏、 液状、 ジエル状、 ゲル状、 ェ ァゾ一ル、 その他の形態で使用することができるが、 クリーム組成物の形態が簡 便で効果も大きい。 また、 シャンプー、 ボディ一ソープ、 洗顔フォーム等の半固 体又は液体の形態としてもよい。
本発明の抗菌剤は、 患部を清潔にした後、 適量、 例えば、 クリーム組成物とし て適用する場合、 皮膚 1 0 0 c m2当たり 0 . 1〜： L g程度を、 1日 1〜5回、 通常は 1〜3回程度塗布すればよい。 塗布量、 塗布回数は症状や創傷の程度に合 わせ適宜増減すればよい。
本発明の抗菌剤は、 経口摂取する場合、 ササエキス固形分として体重 l k g当 たり 0 . 0 1〜0 . l g程度を 1日 1〜5回、 通常は 1〜3回程度摂取するのが 適当である。摂取量、 摂取回数は症状に合わせ適宜増減すればよい。
本発明の抗菌剤は、 注射剤等として非経口摂取する場合、 ササエキス固形分と して体重 l k g当たり 0 . 0 1〜0 . l g程度を 1日 1〜5回、 通常は 1〜3回 程度摂取するのが適当である。摂取量、 摂取回数は症状に合わせ適宜増減すれば よい。
本発明の抗菌剤は、 コンドーム等に塗布しておくことにより、 性病や HIV感染 等を予防し得る。
本発明の抗菌剤の有効成分であるササエキスは笹属の抽出物であり、 その 1 . 2 5貲量％水溶液はヒトの胎児腎臓由来の 2 9 3細胞に対して毒性を示さない。 本発明の抗菌剤は、 ササエキスを固形分で 1〜5 0質量％含有しており、 破傷 風菌、 ガス壊疽を起すクロストリジゥム属ガス壊疽菌群、 カンジダ菌、 白癬菌、 ケカビ、 クモノスカビ、 ァスペルギルス属菌、 クリプトコヅカス属菌、 コクシジ オイデス属菌、 ヒトプラズマ属菌、 MR S A等の抗生物質耐性菌、 プロピオニバ クテリウムァクネスを含むプロピオニバクテリゥム属菌、 ヘルぺスウィルス、 ィ ンフルェンザウィルス、 コロナウィルス等のウィルス等に対する顕著な抗菌効果 を示す。 本発明の抗菌剤の好ましい実施態様は以下のとおりである。
1 . ササエキス （固形分で 1〜5 0質量％) 、 水、 油性成分及びクリーム化剤を 含む抗菌剤。
2 . 油性成分が、 動物性油、 植物性油、 合成油、 及び半合成油からなる群から選 ばれた少なくとも 1種である上記 1記載の抗菌剤。
3 . 油性成分が、 スクヮラン、 牛脂、 豚脂、 馬油、 ラノリン、 蜜蠟、 オリ一ブ油 、 グレープシード油、 パ一ム油、 ホホバ油、 胚芽油、 流動パラフィン、 パルミチ ン酸ォクチル、 ノ ルミチン酸イソプロピル、 ミリスチン酸ォクチルドデシル、 シ リコ一ン油、 ステアリン酸、 ステアリルアルコール、 ベへニン酸、 セ夕ノール、 及びワセリンからなる群から選ばれた少なくとも 1種である上記 1記載の抗菌剤 o
4 . クリ一ム化剤が、 モノステアリン酸グリセリンと自己乳化型モノステアリン 酸グリセリンとの組み合わせである上記 1〜 3のいずれか 1項記載の抗菌剤。
5 . さらに有機酸、 安定化剤、 保湿剤、 創傷治癒剤、 防腐剤及び界面活性剤から なる群から選ばれた少なくとも 1種の成分を含有する上記 1〜4のいずれか 1項 記載の抗菌剤。
6 . 安定化剤が、 カルボキシビ二ルポリマ一と水酸ィ匕カリウムの組合せ、 及びジ ステアリン酸ポリエチレングリコールからなる群から選ばれた少なくとも 1種で ある上記 5記載の抗菌剤。
7 . 保湿剤が、 ヒアルロン酸ナトリウム、 コラーゲン、 アロエエキス、 尿素、 1 , 3—ブチレングリコール、 グリセリン、 トレハロース、 ソルビトール、 ァミノ 酸、 及びピロリ ドンカルボン酸ナトリウムからなる群から選ばれた少なくとも 1 種である上記 5記載の抗菌剤。
8 . 創傷治癒剤が、 アラントイン、 グリチルリチン酸ジカリウム、 カンゾウエキ ス、 及びョモギエキスからなる群から選ばれた少なくとも 1種である上記 5記載 の抗菌剤。
9 . P方腐剤が、 安息香酸ナトリウム、 パラヒドロキシ安息香酸低級アルキルエス テル、 プロピオン酸ナトリウム、 混合脂肪酸エステル、 フエノキシエタノール、 1 , 2—ペン夕ンジオール及び黄色色素からなる群から選ばれた少なくとも 1種 である上記 5記載の抗菌剤。
1 0 . さらに、 オレンジオイル、 レモンオイル、 トウヒ油、 及び香料からなる群 から選ばれた少なくとも 1種の成分を含有する上記 5記載の抗菌剤。
1 1 . ササエキス、 水、 油性成分、 クリーム化剤、 安定化剤、 保湿剤、 創傷治癒 剤、 防腐剤及び界面活性剤を含有する抗菌剤において、 油性成分が、 スクヮラン 、 牛脂、 豚脂、 馬油、 ラノリン、 蜜蠟、 オリ一ブ油、 グレープシード油、 パーム 油、 ホホバ油、 胚芽油、 流動パラフィン、 パルミチン酸ォクチル、 ノ ルミチン酸 ィソプロピル、 ミリスチン酸ォクチルドデシル、 シリコーン油、 ステアリン酸、 ステアリルアルコール、 ぺへニン酸、 セタノ一ル、 及びワセリンからなる群から 選ばれた少なくとも 1種であり、 クリーム化剤が、 モノステアリン酸グリセリン と自己乳化型モノステアリン酸グリセリンとの組み合わせであり、 安定化剤が、 カルボキシビニルポリマ一と水酸化力リゥムの組合せ、 及びジステアリン酸ポリ エチレングリコールからなる群から選ばれた少なくとも 1種であり、 保湿剤が、 ヒアルロン酸ナトリウム、 コラーゲン、 アロエエキス、 尿素、 1， 3—ブチレン グリコ一ル、 グリセリン、 トレノヽロース、 ソルビトール、 アミノ酸、 及びピロリ ドンカルボン酸ナトリウムからなる群から選ばれた少なくとも 1種であり、 創傷 治癒剤が、 アラントイン、 グリチルリチン酸ジカリウム、 カンゾゥエキス、 及び ョモギエキスからなる群から選ばれた少なくとも 1種であり、 防腐剤が、 安息香 酸ナトリウム、 パラヒドロキシ安息香酸低級アルキルエステル、 プロピオン酸ナ トリウム、 混合脂肪酸エステル、 フエノキシ夕一ル、 及び黄色色素からなる群か ら選ばれた少なくとも 1種であり、 界面活性剤が N—ァシル—L—グル夕ミン酸 ナトリウムである上記抗菌剤。
1 2 . さらに、 オレンジオイル、 レモンオイル、 トウヒ油、 及び香料からなる群 から選ばれた少なくとも 1種の成分を含有する上記 1 1記載の抗菌剤。
1 3 . ササエキス、 水、 スクヮラン、 オリ一ブ油、 モノステアリン酸グリセリン 、 自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、 カルボキシビニルポリマ一、 水酸化 カリウム、 尿素、 1 , 3—ブチレングリコ一ル、 アラントイン、 パラヒドロキシ 安息香酸低級アルキルエステル、 ステアリン酸、 N—ァシル—L—グルタミン酸 ナトリウム、 レモンオイルを含有する上記 1記載の抗菌剤。 1 4 . ササエキス、 水、 スクヮラン、 ォリーブ油、 ミリスチン酸ォクチルドデシ ル、 セ夕ノール、 モノステアリン酸グリセリン、 自己乳化型モノステアリン酸グ リセリン、 カルボキシビニルポリマ一、 水酸化力リゥム 尿素、 1 , 3—ブチレ ングリコ一ル、 アラントイン、 混合脂肪酸ェステル、 ステアリン酸、 N—ァシル — L一グル夕ミン酸ナトリウム、 オレンジオイルを含有する上記 1記載の抗菌剤
1 5 . セスキステアリン酸ポリエチレングリコールを含有する上記 1〜1 4のい ずれか 1項記載の抗菌剤。
1 6 . 有機酸が、 リンゴ酸、 クェン酸、 乳酸、 シユウ酸、 マロン酸、 コノ、ク酸、 フマル酸、 酢酸、 安息香酸、 フエニル酢酸、 サリチル酸、 及びフエノール類から なる群から選ばれたる少なくとも 1種である上記 1〜1 5のいずれか 1項記載の 抗菌剤。
本発明はまた、 ササエキス及び有機酸を含有する抗菌性組成物を提供するもの である。 本発明の抗菌性組成物として好ましい形態は、 インキ、 塗料、 食品添加 物、 飲料、 ペットフード、 プラスチック成形品、 及び接着剤が挙げられる。 これらの抗菌性組成物の素材として、 食品添加物、 飲料 （清涼飲料水、 果物ジ ユース、 野菜ジュース、 酒類 （日本酒、 ビ一ル、 発泡酒、 ウイスキー、 焼酎、 ゥ ォヅ力、 ワイン、 ブランデー等） ） 等の水性素材を使用する場合は、 これらの素 材に、 ササエキス及び有機酸を添加、 混合すれば良い。 添加時期は、 素材の製造 前、 製造中、 製造後のいずれの段階であっても良い。 ササエキス及び有機酸を添 加した後、 7 0 - 9 0 °C 1 ~ 2時間攪拌混合処理することにより、 抗菌性をさ らに向上することができる。 食品添加物、 飲料等の抗菌性組成物中のササエキス の含有量は、 好ましくは 0 . 1〜2 0質量％、 さらに好ましくは 0 . 2 5〜7質 量％である。
また、 これらの抗菌性組成物の素材として、 インキ、 塗料、 プラスチック成形 品、 接着剤等を使用する場合、 これらの素材が親水性である場合には上述のとお り、 素材にササエキス及び有機酸を添加、 混合すれば良い。 添加時期は、 素材の 製造前、 製造中、 製造後のいずれの段階であっても良い。 一方、 これらの素材が 疎水性 （親油性） である場合には、 ササエキス及び有機酸が混和しにくいことが 多い。 そこで、 ササエキス、 又はササエキスと有機酸の混合物を、 界面活性剤 （ 乳ィ匕剤）又は親水性有機溶剤 （例えば、 メチルアルコール、 エチルアルコール等 のアルコール、 アセトン等のケトン、 酢酸ェチル等のエステル、 ピリジン、 ジメ チルホルムアミド等） を併用して素材との混和性を改善する、 あるいは、 ササェ キス、 又はササエキスと有機酸の混合物を、 予め親油性材料を用いてマイクロ力 プセル化しておく等の手段を講じて、 素材との混和性を改善することが望ましい
。 いずれの場合にもササエキス及び有機酸を添加した後、 7 0〜9 0 °Cで 1〜2 時間攪拌混合処理することにより、 抗菌性をさらに向上することができる。
素材として、 インキ、 塗料、 プラスチック成形品、 接着剤等を使用した、 本発 明の抗菌性組成物中のササエキスの含有量は、 好ましくは 1〜 2 0質量％、 さら に好ましくは 3〜 7質量％であり、 有機酸の含有量は、 好ましくは 0 . 1〜 1 0 質量％.、 さらに好ましくは 3〜 7質量％である。
特に好ましい有機酸はリンゴ酸、 コハク酸、 クェン酸等である。
本発明の抗菌性組成物は、 本発明の抗菌剤を含有しないものと比較して顕著な 抗菌性を示し、 インキや塗料は抗菌性建材として、 一般家庭はもとより、 院内感 染のおそれのある病院や公共建築物用の建材として極めて有用である。 次に、 参考例、 実施例及び試験例を示し本発明をさらに詳細に説明する。
参考例 1 ササエキスの製造
北海道天塩山系で 9月に採集されたササの乾燥葉を、 加圧熱水抽出タンクに入 れ、 1 2 5 °Cで 1 0分処理し、 冷却水で熱水を 8 0 °C程度まで冷却し、 エキスと 含水固形分をスクリユープレスで分離して、 含水率を約 50質量％とした。 次に 、 約 50質量％含水固形分をォ一トクレーブに入れ、 180 °Cで 10分、 飽和水 蒸気による加圧熱処理を行った。処理した含水固形分を、 再度加圧熱水抽出タン クに入れて 110°Cで 5分処理してエキスを抽出させた。 第 1回目と第 2回目の エキスを合わせ、 珪藻土濾過し、 固形分 50質量％となるまで減圧濃縮し、 11 0〜130°Cの流動殺菌処理をしてササエキスを得た。
このササエキス中の硫黄含有量は 3850 /g/ml (7. 7mg/固形分 1 g) であった。
参考例 2
ササエキス (Bambuseae Sasa) (株式会社鳳凰堂より入手） の成分を分析したと ころ下記の結果が得られた。
水 59. 5質量％
蛋白質 8. 6
脂質 . 0. 6
ミネラゾレ 9. 0
炭水化物 19. 8
タンニン 2. 5 実施例 1〜4
下記の表 2に示す成分を表 2に示す質量比で混合し、 攪拌翼と乳化器を備えた 加熱混合釜に投入し、 80°Cで 2時間攪拌混合し、 本発明の抗菌剤を得た。 固形 分濃度 8質量％のササエキス （参考例 1で製造した固形分 50質量％のササェキ スを水で希釈したもの） の添加量は実施例 1〜4においてそれぞれ、 12. 5、 25、 37. 5、 及び 75質量％ (従って、 ササエキス固形分の含有量は、 1、 2、 3、 及び 6質量％、 硫黄含有量は、 抗菌剤 100g中、 7. 7mg、 15. 4mg、 23. 1111 及び46. 2mgである） 表 2
Figure imgf000021_0001
比較例 1
実施例 1において、 固形分濃度 8質量％のササエキス （参考例 1で製造した固 形分 50質量％のササエキスを水で希釈したもの） の添加量を 6. 2質量％ (従 つて、 ササエキス固形分の含有量は 0. 5質量％、 硫黄含有量は、 抗菌剤 100 g中、 3. 8mgである） とした他は同様にして、 比較例 1の抗菌剤を得た。 実施例 5
下記の表 3に示す成分を表 3に示す質量比で混合し、 実施例 1 ~ 4と同様にし て、 本発明の抗菌剤を得た。 表 3
Figure imgf000022_0001
2 この抗菌剤 100 g中の硫黄含有量は、 46. 2mgである。
実施例 6
下記の表 4に示す成分を表 4に示す質量比で混合し、 攪拌翼と乳化器を備えた 加熱混合釜に投入し、 80°Cで 2時間攪袢混合し、 本発明の抗菌剤を得た。
表 4
成 分 質量％ 流動パラフィン 10. 0 スクヮラン 1. 0 ォリーブ油 1. 0 オレンジオイル 1. 0 ミリスチン酸ォクチルドデシル 6. 0
1、 2—ペン夕ンジオール 0. 5 フエノキシエタノール 0. 5 セ夕ノ—ル 1. 5 ステアリン酸 4. 0 モノステアリン酸グリセリン 2. 0 モノステアリン酸グリセリン （自己乳化型） 2. 5 ジステアリン酸ポリエチレングリコール 0. 5 カルボキシビニルポリマー 0. 3
N—ァシルー L—グルタミン酸ナトリウム 0. 2
1, 3—プチレングリコール 1. 0 エタノール 3. 0 トリメチルグリシン 0. 5 ヒアルロン酸ナトリウム 1. 0 ササエキス （固形分 50質量％) 1 2. 0 精製水 51. 5 このクリームの pHは 6. 00であった。
実施例 7
下記の表 5に示す成分を表 5に示す質量比で混合し、 攪拌翼と乳化器を備えた 加熱混合釜に投入し、 80°Cで 2時間攪拌混合し、 本発明の抗菌剤クリームを得 7
表 5
成 分 質量％ オリ一ブ油 3. 0 スクヮラン 1. 0 流動パラフィン 3. 0 セ夕ノール 1. 3 モノステアリン酸グリセリン 2. 0 モノステアリン酸グリセリン （自己乳化型） 5. 0 ポリオキシエチレン （20) ステアリルェ一テル 1. 0 ポリオキシエチレン （20) セチルェ一テル 1. 0 モノステアリン酸ポリオキシエチレン （140) 1. 0 ベントナイト 0. 5 キサンタンガム 0. 2 ヴルコノ一 δ—ラク卜ン 4. 0 d 1—リンゴ酸 1. 0 トリエ夕ノールァミン 3. 3
1 2—ペン夕ンジオール 0. 5 フエノキシエタノール 0. 5
1, 3—プチレングリコ一ル 2. 0 ササエキス （固形分 50質量％) 12. 0 精製水 57. 7 このクリームの p Hは 4 . 6 8であった。 実施例 8〜1 0
実施例 7において、' d l—リンゴ酸を添加せず、 ササエキス （固形分含有量 5 0質量％) の量を 1 6質量％、 2 0質量％及び 3 0質量％とし、 精製水の量を調 整した他は同様にしてササエキス固形分含有量が 8質量％、 1 0質量％及び 1 5 質量％の本発明の抗菌剤クリームを得た。 実施例 1 1〜： L 3
実施例 7においてササエキス （固形分含有量 5 0質量％) の量を 1 6質量％、 2 0質量％及び 3 0質量％とし、 精製水の量を調整した他は同様にしてササェキ ス固形分含有量が 8質量％、 1 0質量％及び 1 5質量％の本発明の抗菌剤クリ― ムを得た。 試験例 1 (破傷風菌に対する抗菌活性）
破傷風菌 （Clostridium tetani)の 2 6株を使用した。 これらの菌株は日本の 土壌から分離されたものである。 対照として大腸菌 （Escherichia coli)ATCC259 22とブドゥ球菌（Staphylococcus aureus)ATCC25923も使用した。
参考例 1で製造したササエキス （ササエキス固形分含有量 5 0質量％) を滅菌 蒸留水で希釈してササエキス水溶液とした。
種々の濃度のササエキス水溶液について、 寒天平板希釈法により最少発育阻止 濃度を測定した。 最終濃度が 1 2 . 5、 6 . 2 5、 3 . 1 3、 1 . 5 6、 0 . 7 8、 0 . 3 9、 0 . 1 9、 0 . 1 0質量％となるように変法 GAM寒天平板（曰 水製薬） を作製した。 ササエキス水溶液と 2倍寒天培地を 1 ： 1で混合して、 所 定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。破傷風菌の迷走防止のため寒天 濃度は 3%に補正した。寒天を 3%に調整した変法 GAM寒天培地で 24時間培 養して得た被験菌株の集落を白金耳でかきとり、 Anaerobe broth (Difco)中に浮 遊させ、 Mc Farland No. 1の濁度に調整した。 その 1〃1 (接種量
： 105 cfu)をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。 対照菌株 は、 血液寒天培地上の集落を用い、 Anaerobe broth (Difco)中に， Mc Farland N o. 0.5の濁度に調整し、 その 1〃1 (接種量： 105 cfu)を画線塗抹法によ り接種した。 なお、 嫌気ヮ一クステーション （グンゼ産業） 中で、 35°C18時 間培養後、 発育の有無を肉眼で観察した。 発育が認められた場合（+ ) と判定し た。
この方法により測定したササエキスの大腸菌 ATCC25922とブドゥ球菌 ATCC25923 に対する最少発育阻止濃度はいずれも 3. 13質量％であった。
破傷風菌 26株の最少発育阻止濃度は 0. 78質量％から 0. 19質量％に分 布した。 結果を表 6に示す。破傷風菌使用菌株の 80%又は 50%の株の発育を 阻止するササエキス濃度 (MIC80%及び MIC50%)はそれぞれ 0. 78%及び0. 39 %であった。
表 6
最少発育阻止濃度 （％) 株数
12. 5 0
6. 25 0
3. 15 0
1. 56 0
0. 78 11
0. 39 14
0. 19 1
0. 10 0
合計 26 破傷風は、 土壌中に存在する破傷風菌の芽胞が土壌とともに創傷部位に侵入す ることが契機となって発症する疾患である。 発症には、 芽胞が局所で発芽し、 増 殖して、 毒素 （テ夕ノスパスミン） を産生することが必要不可欠である。汚染さ れた創傷部位は芽胞の発芽に嫌気的環境となり易いため、 破傷風の発症予防の基 本は、 デブリドマンと呼ばれる侵入した異物や壊死組織の除去などの適切な外科 的処置を行い、 創傷部位が嫌気性環境となることを阻止し、 破傷風菌の増殖を防 ぐことである。
表 6に記載したように、 ササエキスは破傷風菌 2 6株のすべての増殖を 0 . 7 8 %の低濃度で完全に抑制した。 ササエキスの抗菌活性は、 大腸菌ゃプドウ球菌 に対する抗菌活性の 4倍以上であることが明らかとなった。
菌の発育がササエキスを含まない培地での発育と差のない濃度 ( 0 . 1 9 %) で得た破傷風菌の単染色の顕微鏡観察で、 菌体のフィラメント化と菌体が膨れて 溶菌している像が観察された。 また、 菌の発育がササエキスを含まない培地での 発育より顕著に抑制された濃度 ( 0 . 3 8 %) では、 発色性の悪い菌体が認めら れ、 また芽胞を有する菌体を容易に認めることができた。 ぶどう球菌で隔壁形成 が阻害されていることを示唆する所見が電子顕微鏡レベルですでに観察されてい る。 最少発育阻止濃度以下の濃度で見られたフィラメント化は、 分裂時の毛句へ 気形成が阻害される場合に見られる所見であることが抗生物質の研究から知られ ている。
破傷風と類似の発症機序を有する外傷と関連する疾患であるガス壊疽を起す幾 つかの嫌気性菌、 すなわち、 Clostridium perfringens, Clostridium septicum, Clostridium bifermentans等のガス壊疽菌群に対するササエキスの抗菌活性や
、 化膿性感染症を起す無芽同胞嫌気性菌に対する抗菌活性も期待される o 試験例 2 (カンジダ菌に対する抗菌活性）
実施例 8〜 13で調製したササエキス及びササエキス並びにリンゴ酸を含むク リーム組成物について、 カンジダ菌 (Candida albicans臨床分離株）に対する抗 菌活性を調べた。
使用培地
•NB培地：肉エキス 0. 2%を添加した普通プイヨン （栄研化学）
• 1/50NB培地： NB培地をリン酸緩衝液で 50倍に希釈し、 pH7. 2 ±0. 2に調整したもの。
- SCDLPブイヨン （栄研化学）
• S A培地：標準寒天培地 (曰水製薬）
菌液の調整
試験実施 1日前純培養した新鮮培養菌を 1ノ50NB培地に Mc Farland (マヅ ファーランド） 0. 5、 約 108個 Zmlに懸濁する。 更に、 1/50NB培地 で菌液を 100倍（約 106個/ ml) に希釈する。
クリーム組成物を 60°Cで 10分間加熱してクリーム組成物を融解する。 融解 したクリーム組成物 lmlをァクリル板（50纖 X 50顧） 上に滴下し、 10 分間室温で放置して固める。 菌液 0. 5mlをクリーム組成物塗布面に滴下し、 この上にアクリル板 （45mmx45mm) を密着させる。 これを高湿度下で、 3 6 °C 24時間培養する。
滅菌シャーレに 10 mlの S CD LPブイヨンを入れ、 この中に 24時間培養 後のァクリル板を移動し、 ァクリル板をブイヨンで洗い流す。 この 100 zlを とり、 S A培地上に滴下し、 均一に塗り拡げ、 48時間培養後、 菌数を測定し、 ァクリル板 1枚当たりの菌数に換算する。結果を表 7に示す。 表 7
Figure imgf000029_0001
対照：実施例 7において d 1—リンゴ酸とササエキスを添加しないもの。 ササエキスを含有するがリンゴ酸を含有しないクリーム組成物 （試験 No. 3〜 5 ) は、 カンジダ菌に対して抗菌活性を殆ど示さないのに対して、 ササエキス及 びリンゴ酸を含有するクリーム組成物 （試験 No. 6〜8 ) は、 特にササエキス濃 度 1 0質量％以上において高い抗菌活性を示す。 試験例 3 (ヘルぺスウィルスに対する治癒効果）
実施例 7で製造したクリーム組成物 （ササエキス固形分含有量 6質量％) をへ ルぺスウィルス感染患者 （6 0歳、 女） の患部 （口角） に 1曰 2回適量を塗布し たところ、 2日間で症状が著しく緩和し、 3日間で完治した。 試験例 4 (二キビ患者の病巣由来株の分析）
二キビ患者の病巣から下記の黄色ブドウ球菌 4 4株とプロピオ二バクテリウム ァクネス属菌 2 6株を分離した 表 8
Figure imgf000030_0001
上記 4 4株の黄色ブドゥ球菌の抗生物質感受性は以下のとおりであった (^g/ml)
表 9
Figure imgf000030_0002
上記 2 6株のプロピオ二バクテリウムァクネス属菌の抗生物質感受性は以下の とおりであった。 （〃g/ml) 表 1 0
Figure imgf000031_0001
試験例 5 (参考例 2のササエキスの抗菌性）
参考例 2のササエキス （ササタンニン） と巿販タンニン （Lot.02060618, Extr asynthese, Geney, France) の抗菌性 (MIC (mg/ml) :最小生育阻止濃度） を寒天 培地上、 2倍希釈法により調べた。 結果を以下に示す。 表 1
Figure imgf000031_0002
( ) 内の数値はササタンニンとしての MIC値 試験例 6 (参考例 2のササエキスの抗菌性）
試験例 4の二キビ患者の病巣由来株のブドウ球菌属細菌 4 4株 （混合物） とプ 口ピオ二バクテリウムァクネス菌 2 6株（混合物） を用いて、 参考例 2のササェ キス （ササタンニン） と巿販タンニン （Lot.02060618, Extrasynthese, Geney, France)の抗菌性 (MIC (mg/ml) :最小生育阻止濃度） を寒天培地上、 2倍希釈法 により調べた。 結果を以下に示す。 ブドウ球菌属の菌は MH寒天 (Mueller Hinton Agar (BBL)) 培地、 p H7.0、 空気中、 37°C24時間、 プロピオニバクテリゥムァ クネス菌は GAM培地、 p H7.0 嫌気中、 35°C48時間、 培養した。 なお、 市販タン ニンの MIC80はプドウ球菌属群に対して 0.04mg/mlであり、 プロピオ二バクテリゥ ムァクネス菌に対して 0.08mg/mlであった。 表 1 2
Figure imgf000032_0001
実施例 1 4
水性ィンキ 1 0 0質量部に参考例 1で製造したササエキス 6質量部及び d 1 _ リンゴ酸 1 0質量部を加え、 8 0 で 2時間混合加熱処理し、 抗菌性ィンキを得 た。 実施例 1 5
水性塗料 1 0 0質量部に参考例 1で製造したササエキス 6質量部及び d 1 —リ ンゴ酸 1 0質量部を加え、 8 0 °Cで 2時間混合加熱処理し、 抗菌性塗料を得た。 実施例 1 6
日本酒 1 0 0質量部に参考例 1で製造したササエキス 3質量部及び d 1 _リン ゴ酸 0 . 2 5質量部を加え、 8 0 °Cで 3時間混合加熱処理し、 抗菌性日本酒を得 た 実施例 1
水性接着剤 1 0 0質量部に参考例 1で製造したササエキス 6質量部及び d 1― リンゴ酸 1 0質量部を加え、 8 0 で 2時間混合加熱処理し、 抗菌性接着剤を得 た。 試験例 7 (ガス壊疽菌群 perfringens 10株に対する抗菌作用） 使用菌株： C. perfringens ATCC13124の 1株と臨床分離の perfringens 9株 ( GAI-92099, GAI-92100, GAI-92101, GAI-92102, GAI-92103, GAI-92104, GAI-92 105, GAI-92106, GAI-92107) の合計 10株を使用した。 これらの臨床分離株は感 染症患者由来の臨床材料から分離され、 岐阜大学医学部附属嫌気性菌実験施設 ( 以下 「当施設」 という） に保存されていた株である。 なお、 抗菌力評価の精度管 理用菌株として、 E. co7i ATC25922を使用した。
ササエキス溶液の固形分濃度は 5 0 %で、 水溶性夕ンパク 'アミノ酸、 ミネラ ル、 タンニン、 糖質、 水溶性多糖体、 カルボン酸、 総クロロフィル、 ケィ酸、 ビ 夕ミン、 脂質、 精油、 水分からなる。 原液の p Hは約 5.0である。 溶液の希釈に は滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法に準じて最小発育 阻止濃度を％で測定した。 最終濃度が 25%から 0.2%になるようにササエキスの 2 倍希釈水溶液の系列を作製した。 ササエキス希釈液と変法 GAM寒天培地 (2倍）を 1 ： 1で混合して、 最終的に 12.5〜0.1%の濃度のササエキス含有変法 GAM寒天培地 を作製した。 変法 GAM寒天培地で 24時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒 でかきとり、 Anaerobe broth (Difco)中に浮遊させ、 Mc Farland No 1の濁度の 菌液を調整した。 その 10 / 1(接種量： 106 cfu)をササエキス含有平板系列に画 線塗抹法により接種した。 対照菌株^1, coliについては、 TSA寒天培地 (D co)上 の集落を用い、 Anaerobe broth中に Mc Farland No. 0.5の濁度に調整し、 その 10 H 1 (接種量： 105 cfu)を画線塗抹法により接種した。 なお、 嫌気ワークステ一 シヨン （グンゼ産業） 中で、 35°C18時間培養後、 発育の有無を肉眼で観察した。 発育が認められた場合 （+ ) と判定した。 本方法により測定したササエキスの . coli ATC25922に対する最小発育阻止濃度は 3.13%であつた。
C. perfringens 10株の発育を阻止するに必要なササエキスの最小濃度 (MIC) は、 3. 13〜6.25%に分布した。 C. ^用菌株の 80%、 あるいは 50%の 株の発育を阻止するササエキスの濃度は 6.25%であった。 表 1 3 ササエキスの Clostridium perfringens 1 0株に対する抗菌作用
最小発育阳 1卜ササエキス濃度 株 数
(%)
12.5 0
6.25 8
3. 13 2
1.56 0
0.78 0
0.39 0
0. 19 0
0.10 0
A口き + 10 ガス壊疽は、 土壌中に存在するガス壊疽菌群と称される 1群の Clostridium sp P .の芽胞が土壌とともに創部に侵入することが契機となつて発症する疾患である o C. perfringens, Clostridium septicum, Clostridium bifermentansなど 原 因菌として知られるが、 ガス壊疽の症例の 80%は、 C. perfringens るもの である。 ガス壊疽は、 救急外科における適切な治療により十分予防できる疾患で あるが、 外科的処置が遅れるような状況になった場合、 また、 外科的処置が十分 適切でなかった場合には、 受傷後 6時間以降に発症、 急激な経過をとり、 致死的 となることが知られている。 また、 救命のために四肢など患部の切断を余儀なく されることがあり、 医療上軽視できない疾患のひとつである。
今回の試験管内で検討した成績によると、 ササエキスの C. perfringensに す る抗菌作用は、 試験例 1で検討した teia/jiに対する作用には及ばなかったも のの、 C. 尸/ 7? /25 10株の増殖を3.13%以上〜6.25%以下の濃度で完全に抑 制することが明らかとなった。従って、 この程度の濃度のササエキスを含浸させ た患部保護布等は per/ri/? /2Sの最小発育阻止濃度を上回っており、 受傷後 の外科医の適切な治療を受けるまでの応急処置として人体へ使用した場合、 受傷 部位での C. e/?s©発芽あるいは発芽後の増殖を抑制する効果があ.るとい える。 試験例 8 { Clostridium pe/ r//? ZJS以外のガス壊疽菌群に対する抗菌作用） 使用菌株：感染症患者由来の臨床材料から分離された、 または当施設保存の参考 菌株を使用した。 なお、 抗菌力評価の精度管理用菌株として、 E. coli ATC25922 、 S. ATCC25923も使用した。 試験液は試験例 7と同じである。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法に準じて最小発育 阻止濃度を％で測定した。 最終濃度が 8 %から 0.125%になるようにササエキスを 含む変法 GAM寒天培地を作製した。 培地 pHを 7.0に調整した。 変法 GAM寒天培地で 24時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、 Anaerobe broth (Di f co)中に浮遊させ、 Mc Farland No 1の濁度の菌液を調整した。 その 10〃 1(接種 量： 106 cfu)をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。 対照菌株 E. coli S. aureusについては、 TSA¾天培地 (Difco)上の集落を用い、 Anaerobe b roth中に Mc Farland No. 0.5の濁度に調整し、 その 10 / 1 (接種量： 105 cfu)を 画線塗抹法により接種した。 なお、 嫌気ワークステーション （グンゼ産業） 中で 、 35°C18時間培養後、 発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合 ( + ) と判定した。 結果を表 1 4に示す。 表 1 4 ササエキスのガス壊疽菌群 C os /i iM spp. に対する抗菌作用
C. bi -ferm C. sorde C. novyi C. sporog C. septicu 合計
/0 en tans llii Type A enes M
8
7 1 2 3
6 1 1
5 2 1 3
4 4 4
3 2 6 8
2 1 1
1 3 4 1 8
0.5 1 1
0.25
0. 125
A口き口 + 3 3 4 7 12 29 ササエキスは C. novyi と C. S/WO /? の発育を 3%の濃度で、 sept i cum の発育を 3〜5%の濃度で、 また、 C. bifermentans, C. sorflfe7 j7の発育を 5〜7 %の濃度で抑制することが明らかとなった。 すなわち、 ガス壊疽に関係する Wos tridium spp.に対するササエキスの抗菌作用は、 菌種により差が認められたが、 %の濃度であれば使用した全株の増殖を抑制できることが明らかとなった。創 傷部位に本エキスをガス壊疽の予防を意図して使用する場合には、 p H 7の条件 下で、 7 %の濃度に設定することが望ましい。 試験例 9 (Propionibacteriim araes 16株に対する抗菌作用）
使用菌株： ac/jes ATCC11827と ac/?es^床分離株の 15株（ GAI- 10341， GAI-1 0342, GAI-10343, GAI-10344, GAI-10345, GAI-10346, GAI-10347, GAI-10348, GAI-10349, GAI-10350, GAI-10351, GAI-10352, GAI-10353, GAI -10354, GAI-10 355)の合計 16株を使用した。 これらの臨床分離株は皮膚科感染症患者から分離さ れ、 当施設に保存されていた株である。 試験液は、 試験例 7と同じである。 希釈 には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻 止濃度を測定した。 日本化学療法学会標準法に準じた。 最終濃度が 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78%になるようにササエキスを含有させた変法 GAM寒天平板（日水 製薬)を作製した。 ササエキス液と 2倍寒天培地を 1 ： 1で混合して、 所定の濃 度のササエキス含有寒天培地を作製した。 なお、 pHの調整は、 実施しなかった。 ； Tルセラ HK半流動培地 （極東製薬） で 48時間培養して得た被験菌株の濃厚発育部 位からの 1白金耳をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。 本実 験条件下では、 1白金耳には、 108/mlの細菌数を含む。 嫌気ワークステーション (グンゼ産業） 中で、 35°C2日間培養後、 発育の有無を肉眼で観察した。 発育が 認められた場合 ( +) と判定した。
P. acnes 16株の発育を完全に阻止するに必要なササエキスの最小濃度 (MIC) は 6.25%であった （表 1 5 ) 。 ササエキスは araesの 16株中 12株に対して、 3.1 3°/でササエキス不含の対照培地と比し顕著な発育の抑制を呈したが、 完全な阻止 には 6.25%が必要であった。 表 1 5 ササエキスの Propionibacteriwi acnes 16株に対する抗菌作用
Figure imgf000038_0001
Acne vulgaris に関与する aureus®阻止に必要なササエキスの濃度は 3. 13% であるが、 この試験例の検討で、 P. ac/jes®全株を完全に阻止するのに必要なサ サエキス濃度は、 3. 13%以上から 6, 25%以下の範囲の濃度であった。 P. acnesは S. aureus匕ともに重要な Acne vulgarisの増悪因子であることから、 Acne vulgaris 治療を目的とする場合には、 P. aojesの発育を完全に阻止できる 6.25%程度が適 当と考えられる。
ササエキスのこのような抗菌作用の機作については現時点では不明であるが、 その由来が植物であるササエキスは、 これまでの放線菌由来や真菌由来の各種抗 菌薬とは異なる作用機作をもっている可能性があり、 耐性発現の点からも興味深 い。 試験例 1 0 ( きび虫来の Pwpionibacteiiim acnes 2 6株に対する抗菌作用） 使用菌株： P. /½5^床分離株の合計2 6株を使用した。 これらの臨床分離株は 、 にきび患者から分離され、 当施設に保存されていた株である。 試験液は試験例 7と同じであり、 濃度は 50%の酸性 （ρΗ5· 0前後） の溶液である。 希釈には滅菌 蒸留水を使用した。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻 止濃度を測定した。 日本ィ匕学療法学会標準法に準じた。 最終濃度が 8 , 7， 6 , 5 , 4 , 3 , 2， 1， 0 . 5 %になるようにササエキスを含有させた変法 GAM寒天 平板（日水製薬)を作製した。 pHは 7.0付近に調整した。 GAM寒天培地で 48時間 培養して得た被験菌株の集落を Anaerobe Brothに懸濁し、 所定の菌数を含む菌液 を調整した。 嫌気ワークステーション （グンゼ産業） 中で、 35°C2日間培養後、 発育の有無を肉眼で観察した。
結果と考察
同時に行った成績ではないが、 各種抗菌薬に対する感受性の分布を参考に示し た。 今回は、 p H無調整で実施した前回の実験の場合と異なり、 終末点の判定が 困難であった。
表 1 6 P. acnes ( 2 6株） のササエキスおよび各種抗菌薬に対する感受性
Figure imgf000040_0001
試験例 1 1 (ササエキスの acto½ 'J i7s spp.に対する抗菌作用）
使用菌株：表 1 7に示した施設保存の参考菌株を使用した。 これらの菌株は ATCC , JCMから購入し、 当施設に保存されていた株である。 なお、 対照として、 細菌 性膣症の婦人の膣内や婦人科領域感染症から比較的高頻度に分離される代表的な 菌種の中から reraie77a bivia ATCC29303, Porphyromonas asaccharolytica AT CC25260, Bacteroides fragilis N-l, N-2を選んだ。 また、 Escherichia coli A TC2592 と Staphylococcus aureus ATCC25923も、 同様の目的と感受性測定の精度 管理用菌株として使用した。 試験液は試験例 7と同じである。
なお、 ササエキス原液を滅菌蒸留水で希釈し、 しばらく放置すると、 茶褐色の 沈殿物が生じる場合があるが、 培地との混釈時にそれをよく撹拌混合して使用し た。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻 止濃度 (MIC) を測定した。 日本化学療法学会標準法に準じた。 最終濃度が 10, 9 ， 8, 7， 6, 5， 4, 3, 2, 1， 0.5%になるようにササエキスを含有させ た変法 GAM寒天平板（日水製薬)を作製した。 10%〜6%までの高濃度領域については 、 それぞれ 20%〜12%のササエキス液と 2倍寒天培地を 1 ： 1で混合して作製し （ 最終 pH5.3〜5.5) 、 5%〜0.5%までの低濃度の領域については， 50%〜5%のササ エキス液と 1倍寒天培地を 1 ： 9で混合して（最終 115.5〜6.0)、 ササエキス含有 寒天培地を作製した。
また、 今回の抗菌力の検討は、 酸性 (ρΗ5.3〜6· 0)条件下に加え、 より弱酸性〜 環境下でも実施した。 ササエキス添加後の ρΗを 2 Νの N a O H水で、 pH6.5〜7.0に 、 調整した培地を作製した。
Brucella HK血液寒天培地で 48時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒で かきとり、 Anaerobe broth MIC (Difco)中に浮遊させ、 Mc Farland No 1の濁度 に調整した。 その 10 / 1(接種量： 106 cfu)をササエキス含有平板系列に画線塗抹 法により接種した。 対照菌株についても、 TSA寒天培地上の集落を用い、 Anaerob e broth MIC中に Mc Farland #1の濁度に調整し、 その 10〃 1 (接種量： 106cfu) を画線塗抹法により接種した。 今回、 E. ATC25922と S. aureus ATCC25923 については、 Mc Farland #1/2, 1/2の 10倍希釈液、 1/2の 100倍希釈液についても 同時に MICを測定し、 接種菌量の MICに与える影響を検討した。 ■ なお、 嫌気ワークステーション （グンゼ産業） 中で、 35°C18時間培養後、 発育 の有無を肉眼で観察した。 発育が認められた場合（+ ) と判定した。 pH無調整の酸性 （ρΗ5.3〜6· 0) の実験条件下で測定したササエキスの最小発育 阻止濃度は、 表 1 7に示した。 Lactobacillus casei ss. case Lactobacillus . hrevis ss. brevis, Lactobacillus acidophilus Lactobacillus salivarius の 4菌種 4株に対して 7〜8%, その 4菌種 4株を除く 5菌種 5株に対して、 10%以上で あった。 なお、 同時に測定した bivia ATCC29303, P. asaccharolytica ATCC2 5260に対する最小発育阻止濃度は、 いずれも 0· で、 本方法により測定したササ エキスの精度管理用菌株 2株、 E. «?7/ ATC25922と . awrei/s ATCC25923に対する 最小発育阻止濃度はともに 4%であつた。
pH調整 （pH6.8〜7. 1 ) の実験条件下で測定したササエキスの最小発育阻止濃度 も表 1に示した。 L. brevis ss. brevis, L. acidophilus の 2菌種 2株に対して 7 % その 2菌種 2株を除く 7菌種 7株に対して、 >=9%であった。 P. biviaでは 1% 、 P. asacd wi yt i caでは Q .5%であった。 また、 E. co/i ATCC25922および a e ATCC25923の MICは、 6%であった。
なお、 pH調整下 （pH6.4〜7.0) での MICを求めるにあたり、 接種菌量の MICに与 える影響を^ co ' ATC25922と^ ai/reus ATCC25923を用いて検討した。 その結 果、 S. aureusは、 Mc Farland #1〜1/2 (>108/ml )の濁度の菌液の 1白金耳量を 使用した場合、 MICは 6%, Mc Farland #1/2の 10倍 ( 107/ml)、 100倍希釈液 ( 10 Vm 1 )のそれを使用した場合には、 MICは 3%と読み取られた。 E. coIH 接種菌量 の変化により、 subMICの領域での菌の発育程度が段階的に悪ィ匕していたものの、 読み取った MIC値の変動はなく、 いづれも ¾と読み取られた。 ササエキスが 6 .25 %〜3. 13°以下の濃度で、 いくつかの病原性細菌の発育を阻 止することが明らかとなってきた。 ササエキスのこれら病原性細菌に対する抗菌 力の他に、 非病原性細菌に対する抗菌力についての情報を集積することも極めて 重要と考え、 この試験例を実施した。
;acto0ac 7 s spp.の多くは、 人の粘膜で生体防御の観点から、 極めて重要な 役割を演じていることがわかっている。 本発明者らは、 すでに 29名の健康な妊婦 の膣から Lactobacillus sw. 91株を分離し、 それらを詳細に同定した結果、 La ctobacillus crispa tusffi^S^. (52.7%)と最も多く、 Lactobacillus gasseriが 19 株 （20.85) とそれに次ぐことを、 そして、 Lactobacillus vaginalis, Lactobac illus fermentm, Lactobacillus pi ant arum, L. salivariusなどが分離される ことを見出した。 中でも、 L. c 'sj^ usはその 100%が過酸化水素を産生し、 そ の産生量も多い Lactobacil lus spp.の代表的な菌種であり、 100%ではないが過酸 化水素産生株が存在することが報告されている gasseriや L. t¾ の 2菌 種とともに、 女性の膣および子宮粘膜内の感染防御機構においてとりわけ重要な 役割を果たしていると考えられている。 今回の検討で、 ササエキスの過酸化水素 萑生 Lactobacillus spp.である crispatus}iL. gasseriに対する:!几菌作用は 、 MICが 10 %以上と、 同時に実施した coli, S. au/^sなどの代表的な病原性 通性菌に対する MIC 4 %や bivia, P. asaccharolytica, B. fraざ 'sなどの代 表的化膿性嫌気性菌に対する MIC 0.5〜4% に比し、 極めて弱いことが明らかとな つた。
また、 ササエキス溶液は、 膣内環境の p Hに近い p Hを示し、 アルカリ性より 中性、 中性より酸性の条件下でより強い抗菌作用を発揮することが知られている 。 E. coliや S . ai/rms 考菌株に対する抗菌力が 2管程度低下する pHをやや中性 付近にシフトさせた弱酸性の実験条件下でも、 Lactobacillus spp.の MICは大き く変化しなかった。
さらに、 本発明者らは、 妊婦や新生児の腸管から ざ asser L. fermentw, L.paracasei, L. plantarum, L. sahvanus, L. c spai sなどが比較的高率に 分離されることも見出しているが、 これらの Zactotecj'77i/s spp.の中で、 膣から の分離率が高い crispatusと gasseri以外の ctobaci i/s spp.に対して も、 MICは 7 %以上と高い値を示していた。
ササエキスは、 膣内有用菌ゃ消化管内有用菌である Zactoba«'77us spp. に対 して，その抗菌力が、 より病原性の強いと評価されている細菌種に対するより、 本来弱いことを示唆している。 このことは、 同時に、 婦人科膣、 消化管で、 ササ エキスを使用するような場合、 極めて本物質にとつて優れた特徴となる可能性が 示唆された。 表 17 ササエキスの Lactobacillus sw. groupに対する抗菌作用
Figure imgf000044_0001
*接種菌量： Mc Farland #1の 1白金耳』 試験例 1 2 (Escherichia coli, Methicillin resistant Staphylococcus aureu sぉ び Pseudomonas aeruginosaに対する抗菌作用)
本発明者らは、 ササエキスが、 各種ィ匕膿性感染症の原因菌として極めて重要な Escherichia coli, 各種抗菌薬に多剤耐性を示す Methicillin resistant Staphy lococcus aureus (MRSA)、 MRSAと同様に多くの抗菌薬に対して耐性傾向の強い ^ eudomonas aeruginosaなどに対して抗菌作用を示すことを見出している。 本発 明者らは、 これまでササエキスの嫌気性菌に対する抗菌作用を嫌気性菌に対して 推奨されている変法 GAM¾天培地を感受性測定培地とする寒天平板希釈法により 測定してきた。
この試験例では、 患者から分離された . coli, S. aureus, P. aeruginosaの 通性菌と好気性菌であるそれぞれ 10株以上を使用して、 ササエキスのこれらの菌 種に対する抗菌作用を通性菌で推奨されている Mueller Hinton Agarを測定培地 とする寒天平板希釈法により検討した。
材料と方法
使用菌株：施設保存の臨床分離株である coli 14株， Methicillin resistant S. aureus 14株および . aeruginosa 13株を用いた。 また、 E. coli ATC25922 と aureus ATCC25923を感受性測定の精度管理用菌株として使用した。 試験液 は試験例 7と同じである。 溶液の希釈には滅菌蒸留水を使用した。
几菌試験：
抗菌薬の通性菌に対する抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小 発育阻止濃度 (MIC) を測定した。 可能な限り、 日本ィ匕学療法学会標準法に準じた 。 最終濃度が， 7, 6, 5, 4, 3, 2， 1， 0.5, 0.25, 0. 125, 0.063, 0.032%になるようにササエキスを含有させた Muellar Hinton寒天平板 (Difco) を作製した。 7%〜6%の高濃度領域については、 それぞれ 14%〜12。のササエキス液 と 2倍濃度の Mueller Hinton寒天培地を 1 ： 1で混合して作製し、 5%〜0.032% までの低濃度の領域については， 50%〜0.32%のササエキス液と 1倍濃度の Mueller Hinton寒天培地を 1 ： 9で混合して、 ササエキス含有寒天培地を作製した。 2 N の NaOH水で、 培地 £[6.5〜7.3に調整した。
なお、 Mueller Hinton寒天培地の代わりに、 変法 GAM寒天培地〔日水製薬〕 を用いてササエキス含有寒天培地を作成し、 同一の接種菌液を用いて、 E. coliヒ MRSAを接種し、 一夜嫌気性培養を実施し、 M I Cを求めた。 なお、 この場合も p Hは 2 NNaOHを用いて、 6.7〜7.3に調整した。
接種菌液の調整と判定：
TSA寒天培地で 24〜48時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり 、 Mueller Hinton broth (Difco)中に浮遊させ、 Mc Farland No 1の濁度の菌液 を調整した。 その 10 / 1を Mueller Hinton broth 1 mlに浮遊させ、 その 5〃1 をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。
35°C20時間好気環境下で培養後、 発育の有無を肉眼で観察した。 嫌気培養した 平板については、 一夜培養後の判定後、 さらに大気環境下で一夜放置して、 再増 殖の有無の判定を行った。 pH調整 （pH6.5〜7.3 ) の実験条件下で測定したササエキスの^ coliに対する 最小発育阻止濃度 (MIC) は、 2〜3%に分布し、 MIC50%は 2%であった。 また、 MRSA に対する MICは、 0.25〜0.5%に分布し、 MIC50%は、 0.5%であった。 また、 P. aeru ざ inosaに対する MICは、 全株 1%であった。
また、 精度管理用菌株である^ ATCC25922に対する Mueller Hinton培地 での中性環境、 好気性培養という今回の実験条件下での MICは 2 %、 S. aureus A TCC25923に対する MICは、 0.5%であった。
変法 GAM寒天培地を用い 、 嫌気性環境下で測定したササエキスの^ 臨床 分離株 14株に対する MIC50%は 8%で、 S. aureus^床分離株 14株に対する MIC50%は 3 %であった。精度管理用菌株に対する変法 GAM寒天培地での中性環境、 嫌気性環 境での MICは、 E. co j' ATCC25922に対して 8%、 S. aurei/s ATCC25923に対して 3% であった。 この試験例において、 日本化学療法学会 MIC測定標準法に可能な限り近づけた ササエキスの MIC測定結果から、 ササエキスは MRSAや P. aeruginosaに対して、 ほ ぼ中性の環境で、 いずれも 1%以下の MICを示し、 極めて強い抗菌作用があること を確忍した。
ある薬物の細菌に対する M I Cは、 測定に使用する培地の成分や p H、 血液な ど添加物の有無、 接種菌量、 培養環境など種々の実験条件で変動することは、 よ く知られている。 本発明者らは、 栄養学的に複雑な成分を必要とし、 かつ遊離酸 素の存在しない嫌気性環境でしか発育しない嫌気性菌である、 Clostridium teta ni, Clostridium perfnngens, Propi onibacterium acnes, Bacteroides fragil isなどを対象として、 ササエキスの MICを検討してきた。 これらの測定の際には 、 精度管理用菌株として、 E. coli ATCC25922 と《. a eus ATCC25923を使用し . てきたが、 ササエキスのこれらの精度管理用菌株に対する嫌気性環境下での MIC と、 通性菌に対して本来使用される測定環境での M ICを同時に比較したことはな かった。今回その点を検討し、 その差を明確にした。 変法 GAM寒天培地を感受性 測定培地の基礎培地として、 嫌気性環境で測定したササエキスの MICは、 E. coli ATCC25922 に対して 7%以上となり、 Mueller Hinton培地で好気性培養した場合 の 2 %に比較し、 耐性側への大きなシフトが観察された。 また、 S. aureus ATCC 25923に対しても嫌気性環境で測定したササエキスの MICは 3%となり、 Mueller H inton培地で好気性培養した場合の 0.5 から耐性側への大きなシフトが見られた 。 MRSA14¾対するササエキスの嫌気性菌と同様の測定環境での MIC90%は 3%であ つた。 嫌気培養での S. aureizs©増殖は、 発育が抑制された露滴状の集落となる ことから、 エンドポイントの判定が困難な場合があった。 一度判定した平板をさ らに一夜好気環境で放置し、 露滴状の集落が再増殖するかどうかを確認する操作 を行ったところ、 発育陽性と判定したボイントで一夜培養しても再増殖が認めら れなかつた例を 3例経験したことから、 ササエキスの嫌気性培養での抗菌力の測 定の場合で， S. aureus ATCC 25923を精度管理用として露滴状集落が見られた場 合には、 再増殖能の有無を確認しておくなど、 MICの決定の仕方についても、 再 考が必要であると考える。 以上のことから、 嫌気性菌と同様の条件で測定した通 性菌の MICは 6〜8倍耐性側にシフ卜することが明らかとなった。 この原因が Mulle r Hinton agarと変法 GAM寒天の培地成分の相違によるものか、 抗菌薬であるアミ ノ配糖体でみられるような嫌気培養と好気培養の相違によるものかは興味ある点 であるが、 Mueller Hinton agarを用いた好気培養と嫌気培養の MICの比較検討か ら、 E. coli ATCC25922では、 Mueller Hinton agarを用いた嫌気培養での MICは 、 好気培養での MICと同一であつたが、 & at/reus ATCC25923では、 E. coli ATCC2 5922と同一実験条件であるにもかかわらず、 嫌気培養での MICが好気培養での MIC より 4倍高いなど、 菌種により異なる現象を確認した。 この現象には、 種々の要 素が複合して関係しているものと考えられる。
表 1 8 ササェキスの Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphyloco ecus ai/rewsに対する M I C分布
Figure imgf000049_0001
*好気性： Mueller Hinton Agar、 好気性培養
嫌気性：変法 GAM¾天培地、 嫌気性培養
P. aeruginosaの嫌気性培養は未実施 表 1 9 Mueller Hinton Agarを感受性測定用培地として日本化学療法学会標準 法に準拠して測定したササエキスの Escherichia coli, Pseudomonas aeruginos a, Staphylococcus aureus参考菌株 3株に対する MICの比較
Figure imgf000050_0001
High: Mc Far land 1^0. 1の10 1,
Low: Mc Farland Nolの 100倍希釈液の 10 l ，
( 1 )： 嫌気培養では測定不能であつたが、 さらに好気性培養を継続して判定する と 1 %になる，
N T : 試験未実施 '
表 2 0 培地 p Hの M I Cに及ぼす影響
菌 名 pH 5.0 PH7.0
E. coli high <=5 8
low <=5 8
S. aureus high <=5 8
low <=5 5
P. aeruginosa high <=5 <=5
low <=5 <=5 表 2 1変法 GAM寒天培地、 嫌気性培養， 24時間培養
Figure imgf000051_0002
変法 GAM*天培地、 好気性培 24時間培養 試験例 1 3 (細菌性膣症関連微生物に対する抗菌作用） ·
1 . Prevotella biviaおよび pigmented Prevotella spp. 株について
BV関連細菌に分類される細菌の中で、 まず _P . W 'aおよび Pigmented Prevote 11a spp.に対するササエキスの抗菌作用を検討した。
使用菌株： J iaの合計 14株と Pigmented TOFO e a spp. (Prevotella i ntermedia Prevotella Melaninogenica) 9株を使用した。 P. biviaは、 1990 年代前半に女性膣内から分離され、 また、 Pigmented Prevotella spp.は、 2002 年に各種臨床材料から分離され、 当施設に保存されていた株である。 MIC精度管 理用菌株として、 Escherichia co '
Figure imgf000051_0001
aureus ATCC25 923も使用した。試験液は試験例 7と同じである。 濃度は 50(w/v) %の酸性 (pH5 .0前後） の溶液である。 希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻 止濃度を測定した。 最終濃度が 4, 3, 2, 1， 0.5, 0.25, 0. 125 %になるようにサ サエキスを含有させた変法 寒天平板（日水製薬)を作製した。 ササエキス液と 寒天培地を 1 ： 9で混合して、 所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した 。 なお 2 NNa0H水溶液を使用して、 培地 pHの調整 （pH 7.0〜7.3) を実施した。
Brucella HK血液寒天培地 （極東製薬） で 48時間培養して得た被験菌株の集落 を使用して、 Anaerobe Broth MIC (Mfco)中に McFarland#lの濁度の菌液を調整 し、 10倍希釈の後、 その 1白金耳 (10〃 1 )をササエキス含有平板系列に画線塗抹 法により接種した。 本実験条件下では、 1白金耳には、 約 104の細菌を含む。 嫌 気ワークステーション （グンゼ産業） 中で、 35°Cで、 2日間培養後、 発育の有無 を肉眼で観察した。 発育が認められた場合（+ ) と判定した。
なお、 本実験条件下で測定したササエキスの ". «?7 ATCC25922と & aureus ATCC25923に対する MICは、 ともに >5%であつた。 ササエキスは、 0.5%で P. biviaの髓を、 1 %で pigmented Prevotella spp の発育を完全に阻止した。 ササエキスの bivia 14株に対する MIC50%および Pi gmented Prevotella spp.に対する MIC50%は、 いずれも 0.5%であった。
5 表 2 2 ササエキスの Prevotel bivia 14株および pigmented Prevotella spp. 9株に対する抗菌作用
Figure imgf000053_0001
健常な女性の膣は嫌気性菌と好気性菌の宝庫である。 女性産道の正常細菌叢に は、 膣内の清浄度を保つのに重要な役割を演じている Zacto0ac/7 i/s spp. が最 優勢に存在している。 しかしながら、 一方では日和見病原体として知られる epi ostreptococus aflaeroWusなどの嫌気性グラム陽性球菌や Preyoie spp. (P revotella melaninogenica^ Prevotella intermediaなど)、 Bacteroides spp. などの嫌気性グラム陰性桿菌も低菌量で存在し、 細菌性膣症とよばれる状況で異 常に増殖することがわかっていて、 Bacterial Vaginosis (細菌性膣症） 関連微 生物と称されている。 細菌性膣症は、 ミルク様で悪臭のある帯下を生じる疾患で あり、 S T Dに対する易感染性、 早産、 前期破水など周産期に見られる各種異常 との関係、 骨盤内炎症性疾患 P IDへの進展との関係で論じられている。
P. biviaおよび pigmented Prevotella spp.は、 細菌性膣症関連微生物の中で も、 重症度ある 、は難治性と関連する極めて重要な細菌種であることが知られて いる。 今回の検討から、 ササエキスは、 これらの i viaおよび pigmented Prevote 11a spp. に対して、 きわめて良好な抗菌作用を示すことが明らかになった。
表 2 3 産婦人科領域感染症の原因となる病原体一覧 （疾患名、 学名、 通俗名） 学名 通俗名 備考 淋疾 Neisseria 淋菌 細菌 淋菌性頸管炎 gonorrhoea
子 咅 βクラミ 'ィ Cnlanivdia クラミデジァ 細菌 ァ症 （子宫育管炎） tv8,choni8T s トラコマチス
カンジ夕"症 Canida albicans カンジダ
外陰 ァゾレビカンス
膣炎
腾卜 1 )コ； Fナス p i hoiiiouBS 膣ト uコモナス、 原虫 膣炎 VB^in lis
首
細菌性膣症 （： B V B V関連微生物 細菌
ΜνΡΠΏ Ifl <7 小牛器マイつプラフマ
genital ium
Gardnerella ガードネレラ
vaginalis
Prevotella プレボテラ
bivia* ビビア
Pigmented Prevotella 黒色色素産生プレボ
spp. * テラ
Porphyromonas spp. * ボルフイロモナス
Mobil uncus spp. * モビノレンカス
Peptostreptococcus ぺプトストレプトコ
spp. ネ ヅカス
外陰部へルぺス Herpes simplex virus 単純へルぺスウィル ウィル
(HSV) ス ス 栂毒 Treponema pallidum 梅毒トレポネーマ 細菌 氺 拳気性菌 試験例 1 4 (細菌性膣症関連微生物に対する抗菌作用）
2 . Gardnerella vaginalis 株について
Gardnerella a7/sは健常な女性の膣からも検出されるが、 その菌数は少 ない。 G. vaginalisは Mycoplasma no腿 ims、 Peptostreptococcus anaerobi us^ Pigmented Prevotella spp,、 Non-pigment ed Prevotella spp.ヽ Porphyrom onas spp.などとともに、 細菌性膣症の状態で異常に増殖するいわゆる BV関連微 生物の範疇に入る細菌の一つである。 しかも、 産道感染症の原因菌としても極め て重要である。 この試験では、 G. について検討した。 ' 材料と方法
使用菌株： ί?. rag 'fla7is( 合計 11株を使用した。 これらは NCTCまたは ATCCから購 入した菌株 2株と臨床分離株 9株からなる。 臨床分離株は、 1990年代前半に、 本発 明者らが女性膣内から分離し、 当施設に保存していた株である。 また、 MIC精度 管理用菌株として、 Escherichia coli ATCC25922と
Figure imgf000055_0001
aureus ATCC25923も使用した。試験液は、 試験例 7と同じである。
抗菌試験：抗菌桀の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻 止濃度を測定した。 日本ィ匕学療法学会標準法に準じた。 最終濃度が 8, 7，6，5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25， 0. 125 %になるようにササエキスを含有させた Brucella HK 血液寒天培地 (極東製薬)を作製した。 ササエキス液と Brucella HK血液寒天培 地を 1 ： 1または、 1 ： 9の割合で混合して、 所定の濃度のササエキス含有寒天 培地を作製した。 なお、 2 N NaO脉溶液を使用して、 培地 pHの調整 （pH 7.0〜 7.3) を実施した。
Brucella HK血液寒天培地（極東製薬） で 48時間培養して得た被験菌株の集落を 使用して、 Anaerobe Broth MIC (Difco)中に McFarland#lの濁度の菌液を調整し 、 その 1白金耳（10〃 1 )をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した
。 対照培地での発育が塗抹部位全体に一様に見られるように設定した。
嫌気ワークステーション (グンゼ産業) 中で、 35°Cで、 2日間培養後、 発育の有 無を肉眼で観察した。 発育が認められた場合 （+) と判定した。
なお、 本実験条件下で測定したササエキスの^ co ATCC25922と S. aureus ATC C25923に対する MICは、 それぞれ、 >8%、 ¾であった。 ササエキスの^ vaginalis 11株に対する MICの範囲は 6 %から 4 %に分布し、 MIC50%は 6 %であった。 表 2 4 ササエキスの Gardnerel la vaginalis 1 1株に対する抗菌作用
最小発育阻止
ササエキス濃度 (%) 株 数
8 0
7 0
6 7
5 3
4 1
3 0
2 0
1 0
0.5 0
0.25 0
0. 125 0
合計 11 今回の検討から、 ササエキスは、 細菌性膣症関連微生物のひとつとして重要な 通性嫌気性菌の^ vaginalisに対しては、 6 %の濃度で完全に発育を阻止する ことが明らかになった。 B V関連微生物の嫌気性菌である Non-pigmented Prevot ellaである尸. biviaや pigmented Prevote 11 aである Prevote 11 a melaninogenic aより抗菌力は弱いことが明らかとなった。 本エキスは、 8 %の濃度でも actote cillus spp.の多くの菌株の発育を阻止しないことが知られており、 生体での使 用に際しての濃度の設定に重要な成績が得られたと考えられる。
なお、 一連の検討において、 参考菌株である . coli や . aw ewsの MICに実 験条件により変動があることが明らかになつている。 M I Cは、 使用する感受性 測定用培地の種類、 接種菌量、 培養条件などの因子により影響を受けるが、 今回 は初めて感受性測定培地として Brucella HK血液寒天培地を使用した。 本培地で の MICは、 変法 GAM培地での M I Cより酸性側にシフトする印象であった。 試験例 1 5 (細菌性膣症関連微生物に対する抗菌作用）
3 . Finegoldia, Micromonas, Peptostreptococusにつ 、て
嫌気'性球菌である i ie σ '3 magna Micromonas micros Peptostreptococcu s spp.は、 Prevotella bivia^ Pigmented Prevotella spp.、 Porphyromoms spp .、 Mycoplasma genital im (hommis)、 Gardnerella vaginal i sなヒ もに、 膣内乳酸菌の減少、 膣内 p Hの低下、 およびミルク様かつ悪臭 （ァミン臭） のあ る帯下を特徴とする細菌性膣症 ( B V) の状態で異常に増加する細菌性膣症関連 微生物の仲間である。 この試験例では、 細菌性膣症関連細菌に分類される細菌の ひとつである嫌気性球菌に対するササエキスの抗菌作用を検討した。
材料と方法 使用菌株： Peptostreptococcus anaerobius ( 5株) 、 Pep tostrep tococcus asa cccharolyticus ( 3株) 、 Finegoldia magna (7株) 、 Micromonas micros (6株 ) の合計 21株を使用した。 MIC精度管理用菌株として、 Escherichia coli ATCC25 922ヒ Staphylococcus a eus ATCC25923も使用した。試験液は試験例 7と同じで ある。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育.阻 止濃度を測定した。 最終濃度が 5, 4, 3， 2, 1, 0.5, 0.25, 0. 125 %になるように ササエキスを含有させた変法 GAM寒天平板（日水製薬）を作製した。 ササエキス液 と寒天培地を 1 ： 9で混合して、 所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製し た。 なお、 2 N . NaO脉溶液を使用して、 培地 pHの調整 （pH 7.0〜7.3) を実施 した。
Brucella HK血液寒天培地 （極東製薬） で 48時間培養して得た被験菌株の集落を 使用して、 Anaerobe Broth MIC (Difco)中に McFarland#lの濁度の菌液を調整し
、 その 1白金耳（10〃 1 )をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した
。 本実験条件下では、 1白金耳には、 約 106の細菌を含む。
嫌気ワークステーション （グンゼ産業） 中で、 35°Cで、 24時間培養後、 発育の有 無を肉眼で観察した。 発育が認められた場合 ( + ) と判定した。
なお、 本実験条件下で測定したササエキスの «?7/ ATCC25922と . aureus ATC
C25923に対する MICは、 ともに >=5%であった。 ササエキスは、 3%の濃度で M. micros, F. magna, P. anaerobius, P. asacch aro i/cus©嫌気性球菌群 21株の発育を完全に阻止した。 ササエキスの嫌気性球 菌に対する MIC50%は 0.5%であった。 表 2 5 ササエキスの嫌気性球菌群に対する抗菌作用
Figure imgf000059_0001
細菌性膣症は、 ミルク様で悪臭のある帯下を生じる疾患であり、 性感染症 ( S T D ) に対する易感染性、 早産、 前期破水など周産期に見られる各種異常との関 係、 骨盤内炎症性疾患 （PID) への進展との関係で論じられている。細菌性膣症 では、 健康時には膣内の清浄度を保つのに重要な役割を演じている Zacひ s spp. が著しく減少し、 Prevotella sw' (Ρ· melamnogenica^ P. intermedia など）、 Vetera j'fltes spp.などの嫌気性グラム陰性桿菌や P. anaerobiusな の 嫌気性グラム陽性球菌、 さらには vagimlis^Mycoplasmなどの^ if異常 に増殖することがわかっている。 これらの細菌群は細菌性膣症関連微生物と称さ れている。
先に、 ササエキスが細菌性膣症関連微生物である spp. (P. bivia 、 P. Melaninogenica, P. 膨 o¾など）の発育を 2 %という低い濃度で、 Bacteroides fragilis gで owpや G. vaginal isの発有を、 6 %の濃度で阻止するこ とを述べた。 今回の検討から、 ササエキスは嫌気性球菌群 に対しても、 2 %の 濃度で全株の発育を阻止することが明らかとなった。 試験例 1 6 (細菌性膣症関連微生物に対する抗菌作用）
Mobil uncus spp. について
嫌気性グラム陽性桿菌である spp.は、 嫌気性無芽胞グラム陽性嫌 気性桿菌で、 Prevotella bivia、 Pigmented Prevotella spp.ヽ Porphy醒賺 s spp.、 Mycoplasma genital iw (homnis)、 Gardnerella vaginalisナょ ヒヒ もに、 膣内乳酸菌の減少、 膣内 p Hの低下、 およびミルク様で悪臭 （ァミン臭） · のある帯下を特徴とする細菌性膣症の状態で異常に増加する細菌性膣症関連微生 物の仲間である。 この試験例では、 Mobiluncus sw' 対するササエキスの抗菌作 用を検討した。
材料と方法
使用菌株： ^W ifflras spp.の 12株を使用した。 この中には、 curt i si i subsp . curtisii ATCC35242、 M. curtisii subsp. holmessii ATCC25241, M.mulliel is ATCC35240. ATCC35243 を含む。 また、 MIC精度管理用菌株として、 Staphylo coccus aureus ATCC25923も使用した。 試験液は試験例 7と同じである。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻 止濃度を測定した。 最終濃度が 8， 7, 6, 5, 4, 3, 2， 1, 0.5， 0.25, 0.125 %に なるようにササエキスを含有させた Brucella HK血液寒天平板を作製した。 血液 は、 凍結融解により溶血させた羊脱繊血 （日生材） を使用し、 培地に 5 %の割合 で添加した。 ササエキス液と寒天培地を 1 ： 1で混合し、 所定の濃度のササェキ ス含有寒天培地を作製した。 なお、 2 N NaOH水溶液を使用して、 培地 pHの調整 (pH 7.0±0.3) を実施した。 Brucella HK血液寒天培地（極東製薬） で 7 2時間培養して得た被験菌株の集落 を使用して、 Anaerobe Broth MIC (Difco)中に McFarland#lの濁度の菌液を調整 し、 その 1白金耳（10〃 1 )をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種し た。 本実験条件下では、 1白金耳には、 約 10δの細菌を含む。
嫌気ワークステーション （グンゼ産業） 中で、 35°Cで、 2日間培養後、 発育の有 無を肉眼で観察した。 発育が認められた場合 （+) と判定した。
なお、 pH7.0での本実験条件下で測定したササエキスの^ aureus ATCC25923 に対する MICは 8%であった。 （対照培地での発育と比較し、 著しく発育が阻止さ れる濃度を観察すると 4 %であった。 ） 表 2 6に成績を示した。 ササエキスは、 4%で Mobil騰 us spp. の発育を完全 に阻止した。 ササエキスの MobUuncus spp.に対する MIC50%は 4%であった。 細菌性膣症は、 ミルク様で悪臭のある帯下を生じる疾患であり、 S T Dに対す る易感染性、 早産、 前期破水など周産期に見られる各種異常との関係、 骨盤内炎 症性疾患 PIDへの進展との関係で論じられている。細菌性膣症では、 健康時には 膣内の清浄度を保つのに重要な役割を演じている aci i/s spp. が著しく 減少し、 Prevotella spp. (P. meianinogenica^ P. intermediaなヒ、、 Bactero ides spp.などの嫌気性グラム陰性桿菌や嫌気性グラム陽性桿菌である
Figure imgf000061_0001
spp.、 P. a/2ae O ?/i/sなどの嫌気性グラム陽性球菌、 さらには . vaginalis や Mycoplasmaなどの微生物が異常に増殖することがわかっている。 これらの細菌 群は細菌性膣症関連微生物と称されている。 細菌性膣症関連微生物の中で、 Mobi 7 c«s spp.は、 BV scoreが高い値をとる状態で検出率が高くなる菌種が、 本発 明者らの研究でも確認されている。
先に、 ササエキスが細菌性膣症関連微生物である P/ otei spp. (P. bivia, P. aelaninogenic^ P. _z'/?ie/¾efl¾など）の発育を 2 %という低い濃度で、 B acteroides fragilis gr卿や G. vaginal isの免 をヽ 6 %の濃度で、 さらには 嫌気性球菌群 に対しても、 全株を 2 %で発育を阻止することを述べた。 この試 験例では、 Mobiluncus spp. について検討した。 その結果、 ササエキスは、 4% の濃度で、 これらの発育を阻止することが明らかとなった。 表 2 6 ササエキスの Mobiluncus spp.に対する抗菌作用
Figure imgf000062_0001
試験例 1 7 (ササエキスの fec e/O/i es /ra i7/s¾に対する抗菌作用） Bacteroides fra i 'sは人糞便中から分離される無芽胞嫌気性グラム陰性桿菌 で、 褥創ゃ肛門周囲膿瘍などを含む各種皮膚や皮下軟部組織感染症において、 黄 色ブドウ球菌 (MRSA) 、 多薬剤耐性綠膿菌ととともに臨床上極めて重要な菌種で ある。 この試験例では、 ササエキスの^ // lz'sについての抗菌作用を検討し た。
使用菌株： fraざ J' 's®合計 12株を使用した。 これらの臨床分離は、 2002年 1 月から 7月までに各種化膿性感染症患者から分離され、 当施設に保存されていた 株である。 MIC精度管理用菌株として、 Escherichia CO/J' ATCC25922と <«apA^oc occus a ei/s ATCC25923も使用した。 試験液は試験例 7と同じである。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻 止濃度を測定した。 日本化学療法学会標準法に準じた。 最終濃度が 10， 9, 8, 7， 6, 5, 4， 3, 2, 1 こなるようにササエキスを含有させた変法 GAM寒天平板（日 水製薬)を作製した。 10〜6 %までは、 ササエキス液と 2倍寒天培地を 1 ： 1で混 合して、 5〜1 %までは、 ササエキス液と寒天培地を 1 ： 9で混合して、 所定の 濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。 なお、 2 N NaOH水溶液を使用して 、 培地 pHの調整 （pH6.6〜7.1) を実施した。
Brucella HK血液寒天培地 （極東製薬） で 48時間培養して得た被験菌株の集落を 使用して、 Anaerobe Broth MIC (Difco)中に McFarland#lの濁度の菌液を調整し 、 その 1白金耳 (10〃 1 )をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した 。 本実験条件下では、 1白金耳には、 106cfu/mlの細菌数を含む。
嫌気ワークステーション （グンゼ産業） 中で、 35°Cで、 1、 2日間培養後、 発 育の有無を肉眼で観察した。 発育が認められた場合 ( +) と判定した。
なお、 本実験条件下で測定したササエキスの co ATCC25922と aureus A TCC25923に対する MICは、 ともに 6 %であった。
結果：ササエキスの fragilis 12株に対する MICは 4〜 6 %に分布した。 M l C 90%は、 5 %であった c 表 2 7 ササエキスの Bacteroides fragilis group 1 2株に対する抗菌作用
Figure imgf000064_0001
Bacteroides fragilis group (特に、 Β· fragilis) は、 嫌気性無芽胞グラム 陰性嫌気性桿菌で、 人の下部消化管粘膜に常在している。 本菌群は、 粘膜の破綻 の際に、 通常無菌の組織や臓器に侵入し、 感染症を惹起する。 各種化膿性感染症 、 特に横隔膜から下部の化膿性感染症から、 最も高頻度に分離される嫌気性菌で ある。 本菌は、 感染部位で、 大腸菌などの通性桿菌、 ぶどう球菌、 腸球菌、 Str eptococcus milleri groupなどの通性、 微好気性球菌や ^cieroictes以外の無芽 胞嫌気性菌嫌気性菌などとともに存在している。 すなわち複数菌感染症の構成菌 として重要である。 また、 B. fragilis 、 他の一部の通性菌と同様に、 多くの 抗菌薬に対し自然耐性であり、 本菌種に抗菌力のある抗菌薬は、 ク ン、 セファマイシン、 力ルバぺネムなどと比較的限られている。 しかし、 それら の数少ない抗菌薬に対しても獲得耐性化傾向にあり問題となっている。従って、
B. fra 関与する感染症の治療には、 より広域の抗菌薬が、 または複数種 の抗菌薬が長期にわたり使用される傾向がある。 ところが、 その使用方法によつ ては、 本菌種はもとより、 本菌種以外の細菌種の抗菌薬耐性化を増長する可能性 があり、 感染症治療上、 極めて厄介な菌種ともいえる菌である。
今回の検討から、 ササエキスには、 化膿性複数菌感染症の原因菌として . aur eus, P. aeruginosa, E. co 'とともに重要な無芽胞嫌気性菌嫌気性菌の代表的 な菌群である^ fragilis groupの細菌種に対しても、 嫌気性条件下での S. aur eus^E. co '参考菌株に対する作用と少なくとも同程度の抗菌作用があることが 明らかになった。 試験例 1 8 (骨盤内感染症）
健常な女性の膣は嫌気性菌と好気性菌の宝庫の一つである。 女性産道の正常細 菌叢には、 嫌気性菌が好気性菌の 10倍以上多く存在している。 嫌気性グラム陽性 球菌と Bacteroides spp. (現在の分類では Prevotella spp.と Bacteroides spp. ) である。 嫌気性菌は STD病原体が関係しない産道感染症のほとんどの患者から分 離される。 主要な嫌気性病原体は、 Bacteroides fragilis, Prevotella bivia, Prevotella disiens, Prevotella melaninogenica, 嫌気性球菌、 そして Clostri dium spp.である。 嫌気性菌は、 卵管卵巣膿瘍、 敗血症性流産、 骨盤内膿瘍、 子 宮内膜炎、 術後創部感染症、 特に帝王切開術後創部感染症、 などに関係している 。 これらの感染症は嫌気性菌と腸内細菌科の細菌との複数菌感染症であることが 多いが、 腸内細菌科の細菌やその他の通性菌が分離されない嫌気性菌だけによる 感染症は腹腔内感染症の場合よりも多くみられる。 また、 子宮から悪臭ある膿汁 や血液の排出があること、 子宮のある下腹部全体のあるいは骨盤内の局所的な圧 痛、 持続する発熱や悪寒が特徴である。 骨盤静脈の化膿性血栓性静脈炎が合併す ることがあり、 反復性の敗血症性肺栓塞のェピソ一ドを起こす原因となる。
嫌気性菌は細菌性膣症（Bacterial Vaginosis) の病因に関係する因子である と考えられている。原因がいまだ明らかではない症候群は、 あふれるような悪臭 のある分泌物と膣内の Gardnerella vaginal iss Prevotella spp.、 Mobiluncus s PP.、 Peptostreptococcus spp.そして mycoplasmasなどの細菌の異常な増加を特 徴とする。 嫌気性菌は骨盤内炎症性疾患 （PID) の病因において重要な役割を演 じていると考えられており、 何人かの専門家は細菌性膣症と PIDへの進展との間 の関係を示してきた。
Actinomyces spp.が原因となる骨盤内感染症は、 子宮内避妊道具の使用と関係 がある感染症である。 試験例; I 9 (ササエキスの f/fi^acie /™ spp.に対する抗菌作用）
抗菌力を有する物質の評価の際には、 人の病原菌に対する作用とともに皮膚、 粘膜に常在する有用あるいは日和見細菌に対する作用を知っておくことが極めて 重要である。
Bifidobacterium sw. l 、 Lactobacillus spp. と同様に、 消化管内、 膣内の 常在細菌として知ちれ、 呼吸器病原性があることが知られている Bifidobacteria m dentium機き、 病原的意義が指摘されている菌種がない有用菌として知られ ている細菌である。 そこで、 Bifidobacterium spp. に対して、 ササエキスがど の程度の抗菌作用を有するか、 Bifidobacterium S P. の参考菌株を用いて検討 ¾ί了った。
材料と方法
使用菌株：表 2 8に示した施設保存の参考菌株を使用した。 これらの菌株は ATCC , JCMから購入し、 当施設に保存されていた株である。 なお、 対照として、 婦人 科領域感染症および消化器感染症からもつとも高頻度に分離される嫌気性菌菌種 の中から Prevotella bivia ATCC29303, Porphyromonas asaccharolytica ATCC25 260, Bacteroides fmgilis -iを遺ん f£。 また、 sc eric zia co ATC25922 と Staphylococcus aureus ATCC25923も、 同様の目的と感受性測定の精度管理用 菌株として使用した。 試験液は試験例 7と同じである。 溶液の希釈には滅菌蒸留 水を使用した。 抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度 (MIC ) を測定した。 日本化学療法学会標準法に準じた。 最終濃度が 9， 8， 7， 6, 5, 4， 3， 2, 1， 0.5%になるようにササエキスを含有させた変法 GAM寒天 平板（日水製薬)を作製した。 10%〜6%までの高濃度領域については、 それぞれ 20% 〜12 のササエキス液と 2倍寒天培地を 1： 1で混合して作製し （最終 pH5.3〜5. 5)、 5%〜0.5%までの低濃度の領域については， 50%〜5%のササエキス液と 1倍 寒天培地を 1 ： 9で混合して(最終 5.5〜6. 0)、 ササエキス含有寒天培地を作製 した。
Brucella HK血液寒天培地で 48時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒で かきとり、 Anaerobe broth (Difco)中に浮遊させ、 Mc Farland No 1の濁度に調 整した。 その 10 l (接種量： 106 cfu)をササエキス含有平板系列に画線塗抹法 により接種した。 対照菌株についても、 TSA寒天培地上の集落を用い、 Anaerobe broth中に Mc Farland #1の濁度に調整し、 その 10 z 1 (接種量： 106 cfu)を画 線塗抹法により接種した。 なお、 嫌気ワークステーション （グンゼ産業） 中で、 35°C18時間培養後、 発育の有無を肉眼で観察した。 発育が認められた場合 (+ ) と半 [J定した。 pH無調整の酸性 （pH5.3〜6.0) の実験条件下で測定したササエキスの最小発育 阻止濃度は、 表 2 8に示した。 Bifidobacterium spp. の 5菌種 5株に対しても 、 MICが 4 %であった W/jWi Dl株を除き、 すべて 7 %以上の最小発育阻止濃 度であった。 なお、 同時に測定した P. bivia ATCC29303, P. asaccharolytica A TCC25260に対する最小発育阻止濃度は、 いずれも 0.5%で、 本方法により測定した AHSSの精度管理用菌株 2株、 E. CO?J' ATC25922と . a etfs ATCC25923に対する最 小発育阻止濃度ともに 4%であつた。 ササエキスが 6 .25 %以下 （多くは 4 %程度） の濃度で、 いくつかの病原性細菌 の発育を阻止することが明らかとなってきた。 ササエキスのこれら病原性細菌に 対する抗菌力の他に、 非病原性細菌に対する抗菌力についての情報を集積するこ とも極めて重要と考え、 今回の検討を実施した。
Lactobacillus sw.や Bifidobacterium swの多く I 、 人の粘膜で生体防御の 観点から、 極めて重要な役割を演じている。 本発明者らはすでに、 ササエキスの 過酸化水素産生 ^ciobac 7 us spp.である crispatusヒ L. ざ asser に対する 抗菌作用は、 MICが 10 %以上と、 同時に実施した^ coli S. aurei/sなどの代表 的な病原性通性菌に対する MIC 4 %や P. bivia, P. asaccharolytica, B. fragil などの代表的化膿性嫌気性菌に対する MIC 0.5〜4%に比し、 極めて弱いことを 報告した。
今回、 ササエキスは、 消化管常在の Bifi'dobacteriu spp. の 5菌種 5株に対し ても、 Lactobacillus spp.に対すると同様に弱い抗菌力しか示さないことが明ら かとなつた。
ササエキスは、 膣内有用菌ゃ消化管内有用菌に対して抗菌力が、 日和見病原細 菌より相対的に弱いことを強く示唆している。 表 2 8 ササェキスの Bifidobacterium sm>. groupに対する抗菌作用
Figure imgf000069_0001
Mc Farland #1の濁度の菌液の 1白金耳量を 1 cm画線塗抹 試験例 2 0 { Candida albicansお び Candida ra aに対する抗真菌作用） この試験例では、 "鵞ロ瘡"や女性の膣炎■外陰炎の原因となる ώ/ζ 'ώ albi cans^よび Candida glabra iaに対する抗真菌作用を検討した。
使用菌株： Candida albi cansお Χβ Candidaざ の合計 13株を使用した。 こ れらは、 2002年に各種臨床材料から分離され、 当施設に保存されていた株である 。 MIC精度管理用菌株として、 Escherichia coli ATCC25922 Staphylococcus au reus ATCC25923および Pseuifo Mas aeruginosa ATCC27853を使用した。
試験液は試験例 7と同じである。 希釈には滅菌蒸留水を使用した。 抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻 止濃度を測定した。最終濃度が 8,7，6,5,4, 3, 2，1%となるようにササエキスを含 有させた MH寒天平板 (Difco)を使用した。 ササエキス液と寒天培地を 1 ： 9で 混合して、 所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。 なお、 2N NaOH 水溶液または 10%塩化水素水溶液を使用して、 培地 pHの調整 （pH 7.0前後と pH5.0 前後の 2種類)を実施した。
マイコセル寒天培地 (BD) で 48時間培養して得た被験菌株の集落を使用して、 MH broth (Difco) 中に McFarlan lの濁度の菌液を調整し、 その 1白金耳（10 ju 1 )をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。 本実験条件下で は、 1白金耳には、 約 106の細菌を含む。
35°Cで、 24時間培養後、 発育の有無を肉眼で観察した。 発育が認められた場合 ( +) と半 U定した。
なお、 本実験条件下で測定したササエキスの^ co7i ATCC25922と S. aureus ATC C25923および aeruginosa ATCC27853 に対する 1日後での MICは、 pH7で、 そ れぞれ 2、 <= 2 であり、 pH5では、 すべてく =1であった。 また、 さらに 3日 室温後での MICは、 pH7で、 それぞれ 3、 く =1、 3 であり、 pH5では、 2、 く =1、 く =1であった。 表に pH5と pH7の環境で、 1日後、 および 3曰後に判定したササエキスの 6¾ Λ 'ώ spp.に対する MI Cの分布を示した。 pH5で、 24時間判定で、 ササェキ ス 5%の濃度で、 C. a Wca/js 8株と C. raia 4株のすべての発育を阻止した 。 3曰後の判定では、 全株の発育阻止には 8%が必要であった。
pH7で、 24時間判定で、 ササエキス 5%の濃度で、 C.
Figure imgf000070_0001
止を示した。 7a rateに対する MI Cは判定不能であった。 3日後の判定で は、 C. ^a/y¾ ^を含め全株の発育阻止には 8%以上が必要であった。 女性の膣炎には、 原虫によるトリコモナス膣炎、 真菌による ί¾/ζώ' 性膣炎も の、 および細菌による細菌性膣症 （-非特異性膣炎） が知られている。膣炎をお こす Candida spp.は、 外陰炎の原因ともなる。 性膣炎は、 他の膣炎と異 なり、 チーズ状の帯下が特徴で、 きわめて搔痒感の強い疾患である。 治療には抗 真菌薬が投与される。
今回の検討から、 ササエキスは酵母状真菌に対して発育阻止効果があることが 確認された。 酸性下で 1日後に測定した MICは、 5%から 3%に分布した。 また、 ρ Η調整後中性下で測定した MICは、 5%から 4%に分布した。 しかしながら、 さら に 3日間の室温放置後に再度 MICを判定したところ、 ササエキスの Candida spp. に対する P H5.0での M I Cは、 8%の 1株を除き 12株が 5〜3 %の範囲から 7〜4% の範囲と耐性側にシフトし、 p H7.0での MICは、 13株の全株が 5〜4%の範囲から 8%以上にシフトした。 このことから、 1日後に決定した M I Cあるいはそれ以 上の濃度でのササエキス真菌に対する作用が静菌的であることを示しており、 殺 菌にはより高濃度が必要であることを示唆した。 また、 glabrataは、 中性環境 で 3 7 °Cで 1日培養後には充分な発育が認められなかったが、 その後 3日室温に 放置した時、 充分な発育が認められ、 MICの判定が可能となった。 酸性に調整し た Mueller Hinton培地では、 3 7 °C 1日でも充分な発育が見られ、 MICの判定が 可能であった。
Mueller Hinton培地を感受性測定用培地として用いた本実験では、 ササエキス の Candida spp.に対する MICは？〜 4 %の濃度にあり、 抗真菌作用を示すことが明 らかとなつた。 その MICは、 中性環境で、 酸性環境より 1管程度低い値を示した。 さらに、 中性条件で 1日後で発育を阻止していたかなり高い濃度でも、 その後の 室温放置により Candida spp.の発育が観察され、 その作用は静菌的であることが 知られた。 酸性条件下でも、 1日後で発育を阻止していた濃度で、 その後 CandM a spp.の発育が観察されたが、 その程度は中性環境で観察されたより軽度であつ た。 すなわち、 本エキスは、 酸性条件下で、 Candida spp.に対して、 中性環境 下より、 強い殺菌作用を示すことが明らかとなった。 ササエキスを臨床応用する 場合の濃度の設定には、 本エキスの毒性に関する情報に加え、 この点も充分考慮 して、 使用濃度と使用回数を設定する必要があると考えられた。
以上のことから、 抗菌作用に加え、 抗真菌作用を有するササエキスは 膣炎および外陰炎およびその他の sppが関与する病態の治療薬として、 充分使用できることが強く示唆された。
また、 本エキスが rew e a spp.、 e7 a p¾g7' za7/sなど細菌性膣症に 関係する細菌に強いあるいは中等度の抗菌作用を示すことや、 その他の細菌学的 な特性があることを本発明者らが確認していることから、 細菌性膣症の治療薬と しての有用性が高いと考えられるが、 その場合、 抗真菌作用を合わせもつ本ェキ スは、 当然ながら、 現在細菌性膣症に使用されるクロラムフエ二コールのように 抗真菌作用を全く示さない抗菌薬の使用後に副現象として生じることが報告され ている Candida spp.による菌交代現象あるいは交代症の発生を防止できる特性を 有していることが容易に予想される。
7 ¾ 2 9 ササエキスの Candida albicansお^ X Candidaざatoraiaに対する抗真 菌作用
感受性測定用培地の p H (5.0、 7.0) および判定日数 （1日、 3日） の影響
Figure imgf000073_0001
* 培地 p H
** 判定日数
*エキス不含培地 (PH7.0)での発育が悪いため判定を保留 試験例 2 1 (Acne vulgaris患者病巣由来の SteMWococ£¾s に対する抗菌作 ササエキスは、 にきび （Acne vulgaris) の病因の一つとして重要な AOp o/jjT) acteriim 3«½5を6.25%の濃度で、 完全に発育を抑制する。 また、 ササエキスは 、 化膿性球菌と て重要な Staphylococcus aureus (MRSA) に対しても、 1%以 下の濃度で完全に発育を抑制をすることが明らかとなった。 本発明者らは、 にき びの患者の病巣から分離されたにきびの増悪因子として重要な Staphylococcus e pidermidis 13株と
Figure imgf000074_0001
cohnii 1¾( Staphylococcus spp. 合言十 14 株を使用して、 ササエキスの抗菌作用を寒天平板希釈法により検討した。
材料と方法
使用菌株： Staphylococcus epidermidis ί3株ヒ Staphylococcus cohnii 1株の 合計 14株を用いた。 また、 Escherichia coli ATCC25922, S. aureus ATCC25923 を感受性測定の精度管理用菌株として使用した。表 3 0に使用した菌株の菌種と 抗菌薬感受†生ノ ターンを示した。 表 3 0 にきび病巣由来の Staphylococus sp .の抗菌薬耐性ノ 夕一ン
菌株番号 菌 種 感受性パターン（TC, CLDM, OFLX)
N-4 S. epiaermidis TCR,
N-5 S. epidermidis
N-6 S. epidermidis CLDME
N-7 S. epidermidis
N - 8 S. epidermidis
N-15 S. epidermidis TCR
N - 26 S. epidermidis
N-39 S. epidermidis
N-34 S. epidermidis OFLX1
N-37 S. epidermidis TCE 5 CLDMB
N-38 S. epidermidis
N-46 S. epidermidis
N - 48 S. cohnii TCK,
N - 68 S. epidermidis P T/JP03/07557 試験液は試験例 7と同じである。 溶液の希釈には滅菌蒸留水を使用した。 抗菌薬の通性菌に対する抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小 発育阻止濃度 (MIC) を測定した。 可能な限り、 日本化学療法学会標準法に準じた 。 最終濃度が 5， 4, 3， 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125%になるようにササェ キスを含有させた Muellar Hinton寒天平板 (Difco) を作製した。 50%〜： L .25% のササエキス液と 1倍濃度の Mueller Hinton寒天培地を 1 ： 9で混合して、 ササ エキス含有寒天培地を作製した。 2 Nの NaOH水で培地 p H6. 1〜7.1に調整した。 S . aureus ATCC 25922および ATCC25922に対する MICは 2 %であった。 接種菌液の調整と判定：
TSA*天培地で 24〜48時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり 、 Mueller Hinton broth (Difco)中に浮遊させ、 Mc Far land No 1の濁度の菌液 を調整した。 その 10/ 1を Mueller Hinton broth 1 mlに浮遊させ、 その 10〃1 を ササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。 35°C20時間好気環境下で 培養後、 発育の有無を肉眼で観察した。
Staphylococcus epidermidis 13¾ ^ Staphylococcus cohnn Hの Staphylococ cus spp. 合計 14株を使用して、 ササエキスの抗菌作用を寒天平板希釈法により 検討した。 その結果、 ササエキスは、 1%の濃度で、 これらの発育を完全に抑制 した。 14株については、 抗菌薬 3薬剤 （テトラサイクリン、 クリンダマシシン、 オフロキサシン） についての感受 ½iが試験されており、 テトラサイクリン 1剤耐 性の菌株が 2株、 クリンダマイシン 1剤耐性株が 1株、 テトラサイクリンとクリン ダマイシンの 2剤耐性の菌株が 2株、 オフロキサシン 1剤耐性株が 1株含まれてい たが、 これらの耐性菌をササエキスは、 一様に 1 %以下で発育を阻止した。 表 3 1 ササエキスの Staphylococcus spp. 14株に対する抗菌作用
Figure imgf000076_0001
本発明者らは、 にきびの患者から分離された、 にきびの増悪因子として重要な
Staphylococcus epidermidis Staphylococcus cohnii の Staphylococ cus spp. 合計 14株のササエキスに対する感受性を寒天平板希釈法により検討し た。 その結果、 ササエキスは、 2%の濃度で、 これらの発育を完全に抑制した。 抗菌薬 3薬剤 （テトラサイクリン、 クリンダマシシン、 オフロキサシン） につい ての感受性が試験されたこれら 1 4株には、 テトラサイクリン 1剤耐性の菌株が 2株、 クリンダマイシン 1剤耐性株が 1株、 テトラサイクリンとクリンダマイシン の 2剤耐性の菌株が 2株、 オフロキサシン 1剤耐性株が 1株含まれていたが、 ササ エキスは、 これらの耐性菌を一様に、 ¾以下の濃度で発育阻止した。
以上の事実は、 ササエキス P . acnesの発育を抑制できる 6.25%の濃度であれば、 増悪因子の Sta≠ylococcus spp.に対しても充分な効果があり、 にきびの治療薬 として、 極めて有用であることを示唆する。 試験例 2 2 (Acne vulgaris患者病巣由来の S coccus spp.に対する抗菌作 用）
この試験例では、 にきびの患者の病巣から分離された Staphylococcus epiderm idis spp. 合計 44株を使用して、 ササエキスの抗菌作用を寒天平板希釈法により 検討した。
使用菌株： ひ cocczz ^計 44¾を用いた。 また、 Escherichia coli ATCC259 22, S. ai/ra/s ATCC25923を感受性測定の精度管理用菌株として使用した。 試験 液は試験例 7と同じである。 溶液の希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗¾式¾：
抗菌薬の通性菌に対する抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小 発育阻止濃度 (MIC) を測定した。 可能な限り、 日本化学療法学会標準法に準じた 。 最終濃度が 5, 4, 3， 2, 1, 0.5, 0.25, 0. 125%になるようにササェ キスを含有させた Muellar Hinton寒天平板 （Difco) を作製した。 2 Nの NaOH水 で、 培地 ρ Η6. Γ7. 1に調整した。 S. aureus ATCC 25922 および^ coli ATCC2 5922に対する MICは 2 %であった。
接種菌液の調整と判定：
TSA寒天培地で 24— 48時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、 Mueller Hinton broth (Difco)中に浮遊させ、 Mc Farland No 1の濁度の菌液を 調整した。 その 10〃1を Mueller Hinton broth 1 mlに浮遊させ、 その 10/ 1 を ササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。 35 C20時間好気環境下で 培養後、 発育の有無を肉眼で観察した。
結果を表 3 2にまとめた。 表 3 2 Staphylococcus spp. ( 4 4株） のササエキスおよび各種抗菌薬に対す る感受性
Figure imgf000078_0001
1 ) Staphylococcus epidermidis 34, S. capitis 2， S. aureus 2， S. cohnu 1， S .hominis 1, S.haemolyticus 1, Staphylococcus sp. 3 試験例 2 3 (膣炎および細菌性膣症関連微生物に対する抗菌作用）
試験液は試験例 7と同じである。 50 (w/v) %の茶褐色で、 芳香を有するやや粘 性のある酸性の液体である。
抗菌力の試験法：嫌気性菌の抗菌薬の抗菌力測定法にならい、 変法 GAM寒天培地 または Brucella HK寒天培地を測定用基礎培地として、 最小発育阻止濃度 (MIC) を％で求めた。
供試菌株： Candida spp. b Prevotella bivia (14株)、 Pigmened Prevotella spp . (9株）、 Finegoldia, Micromonas, ;) tos repiococc の嫌気性球菌群 (21株）、 Mobiluncus s . ( 12¾)s Gardnerella vaginalis ( 11¾) を用いた。
成績とまとめ
BV関連微生物の通性嫌気性菌と嫌気性菌および ί¾α 'ώ spp.に対するササエキス の抗菌力の程度、 が明らかとなった。 spp.を 3〜5%で、 G. vaginal isの 発育を 6%の濃度で、 ?W zras spp.を 4%の濃度で、 嫌気性球菌群を 3%の濃度で 、 Prevotella spp.を 1%の濃度で抑制した。 試験例 2 4 (ササエキスの偏性嫌気性菌に対する抗菌スぺクトル）
嫌気性菌参考菌株を用 ヽた PH6.0と pH7.0での検討
この試験例では、 ササエキスの抗菌スペクトルを明らかにする目的で、 一部の 気難しい微好気性菌、 通性菌 Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces, S utterella) を含む教室保存の偏性嫌気性菌の多数株を使用して、 ササエキスの 抗菌作用を中性 （PH7.0) と弱酸性 (pH6.0) 付近で検討した。
使用菌株：当施設に保存されていた参考菌株を用いた 〔表 3 3〜3 6〕。 MIC精 度管理用菌株として、 Escherichia co?/ ATCC25922と SiapA^ococras aureus AT CC25923も使用した。 試験液は試験例 7と同じである。 希釈には滅菌蒸留水を使 用した。
抗菌試験：抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻 止濃度を測定した。 最終濃度が 6.4， 3.2, 1.6. 0.8, 0.4, 0.2, 0. 1%ササェキ スを含有させた変法 GAM寒天平板（日水製薬）を作製した。 なお、 2 N水酸化ナト リウム水溶液と 10%塩酸水を使用して、 培地 pHの調整を実施し、 その目標を PH6.0 と P H7.0とした。
Brucella HK血液寒天培地 （極東製薬） で 48時間培養して得た被験菌株の集落を 使用して、 Anaerobe Broth MIC (Difco)中に McFarland#lの濁度の菌液を調整し 、 10倍希釈の後、 その 1白金耳をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接 種した。 本実験条件下では、 1白金耳には、 約 104の細菌を含む。
嫌気ワークステーション （グンゼ産業） 中で、 35。Cで、 2日間培養後 (Clostridi umでは、 1日培養後）、 発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合（ + ) と判定した。結果を表 33〜36に示す。 T JP03/07557
表 3 3 l)W ^\^. (Peptostreptococcus, Staphylococcus, Finegoldia, Micro monas, Atopobium, <7e/neZ¾)と微好気性菌（/S¾ret?tococcus)および嫌気性グラム ^ i. iAetinomyces, Eubactenum, Propionibactenum, Bifidobacteriujii) 対する抗菌力
pH7.2 pH5.8 細 菌 名
+/ /-0八.2 +/-0.2
Pep tostrep tococcus anaerobius A丄しし 27337 0.4 ND
Peptostreptococcus asaccharolyticus WAL3218 0.4 ND
Pep tostrep tococcus mdohcus A10915 1.6 ND
Pep tostrep tococcus prevotu ATCC9321 3.2 ND
Micromonas micros VP上- 5464-1 1.6 ND
Finegoldia magna ATCC29328 1.6 ND
Staphylococcus saccharolyticus AIしし 14953 0.8 ND
Streptococcus intermedius ATGC27823 >6.5 3.2
11 m ~
Streptococus constellatus ATCC27735 >6.5 3.2
1
VOJJODIUW. pa VUlulJi V MUO^it) 丄. o 丄 "\_L ί θϊΏΘΙΙα. lOrDlllOruni 丄しし ^ , Ο ^ 丄 .o u iUJ IO αΐ IU ciCIJcfo 丄しし丄丄 ΟώΟ Ό. Ό.
a
jrrupiUJ lOix j CcIJ UI ^IHIl LLlUb UJI1 しし iitJ ひ Ό. K a o.
Eggerthella lenta ATCC25559 >6.5 6.5
Actinomyces odontolyticus GAI-91002 >6.5 6.5
Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 >6.5 1.6
Bifidobacterium bifidum JCM1255 6.5 ND
Bifidobactenum breve ATCC 15700 6.5 6.5
Bifidobactenum longum ATCC 15707 >6.5 6.5
Bifidobacterium pseudolongum ATCC25526 >6.5 6.5
Bacteroides fragilis ATCC25285 6.5 3.2
Bacteroides thetaiotaomicron ATCC29741 6.5 6.5
Eschenchia coli ATCC25922 >6.5 6.5
Staphylococcus aureus ATCC25923 6.5 1.6 接種菌量： 10 ml 培養時間： 48時間判定 備考：
Peptostreptococcus anaerobius ATCC27337, Peptostreptococcus asacchroly ticus WAL3218, PeOtostreptococccus indolicus GAI0915, Peptostreptococc us prevotii ATCC9321, Micromonas micros V I-5464-1, Finegoima magn a ATCC29328, Staphylococcus saccharolyticus ATCC14953, Atopobium p arvulum VPI0546, Bifidobacterium bifidum JCM1255 は、 H6. 0に発育せ ず。
表 3 4 乳酸桿菌 CLactobaciZ/us)および縑気性グラム陰性桿菌 に対す る抗菌作用
pH5.8 細 菌 名
a + +/-0.3
Lactobacillus acidophilus «J CM 1132 >6.5 >6.5
Lactobacillus brevis ss. brevis JCM1059 >6.5 >6.5
Lactobacillus casei ss. casei JCM1134 >6.5 >6.5
Lactobacillus plant arum JCM1173 >6.5 >6.5
Lactobacillus reuteri JCM1149 >6.5 >6.5
Lactobacillus salivarius ss. salivarius JCM1112 >6.5 >6.5
Bacteroides fragilis GAI5562 6.5 6.5
Bacteroides fragilis ATCC25285 6.5 6.5
Bacteroides fragilis NCTC10581 6.5 3.2
Bacteroides fragilis GAI-0558 ペニシリン耐性 6.5 6.5
Bacteroides fragilis GAI-7955 ペニシリン耐性 6.5 3.2
Bacteroides fragilis GAI-10150 ペニシリン耐性 6.5 6.5
Bacteroides fragilis GAI30079 力ルバぺネム耐性 6.5 6.5
Bacteroides fragilis GAI3014 カノレバぺネム耐性 6.5 6.5
Bacteroides vulgatus ATCC8482 6.5 3.2
Bacteroides distasonis ATCC8503 6.5 3.2
Bacteroides ovatus ATCC8483 6.5 6.5
Bacteroides thetaiotaomicron ATCC29741 3.2 6.5
Bacteroides uniformis ATCC8482 3.2 3.2 07557 接種菌量： 107/ml 培養時間： 35°C48時間判定
表 35 嫌気性グラム陰性掉菌（·fecierocfes, Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium, Bilophila, Desulfovibrio) 微好 ¼性菌 ( Campylooacter, Sutterella, Capnocytophaga)、および 嫌気性グラム陰性球菌（ Veillonella)に 対する抗菌作用
pil / · U pno. u 細 菌 名
T/ U . ϋαυ υυΐ Οί Club uggul bill i Λ1しし ώ〖 ί 丄 1 * R 0 0 Q 9
, L ΰαθ i l Uluub ill Ui bl Luo し 1し丄 u ^:丄 Π u . R o U · o tUUpy Ιϋϋα ί βΐ a l Ho U Ί ( ]MrlRO^OO ¾RO 0 t O ,
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ΓΙ VUb l la LUl Ul l 17 丄 丄 UUリ n A u · o ri vULul la pa UUlt / Λ1しし OJOi? riV
uVU a SHuUl Λ丄し ciU丄丄 \J o 丄 * u
Prevotella melaninogenica GAI5490 3.2 3.2
Prevotella oralis ATCC33269 1.6 3.2
Prevotella oris ATCC33573 0.4 0.8
Porphyromonas asaccharolytica ATCC25260 0.2 ND.
Porphyromonas gingival is ATCC33277 0.4 ND
Fusobacterium nucleatum ATCC25586 1.6 1.6
Fusobacterium varium ATCC8501 1.6 3.2
Fusobacterium necrophorum ATCC25286 0.8 0.8
Bilophila wadsworthia WAL7959 0.2 ND
Desulfovibrio piger DSM749 0.4 ND
Veillonella parvula ATCC10790 0.8 1.6
Veillonella dispar ATCC17748 0.8 1.6
Capnocytophaga ochracea GAI-5586 1.6 0.4
Bacteroides fragilis ATCC25285 6.5 6.5
Bacteroides the taiotaomicron ATCC29741 3.2 6.5 7557 lOVml 培養時間： 3 5 °C48時間
Prevotella heparinolytica ATCC35895, Porphyromonas asaccharolytica ATC C25260, Porphyromonas gingival is ATCC33277, Bilophila wadsworthia ML 7959, Desulfovibrio piger DSM749は、 p H6.0のエキス不含の対照培地で発 育しなかった。 表 3 6 有芽胞嫌気性菌 ( os r i/iM〉に対する抗菌力
Figure imgf000083_0001
ネ Clostridium sept i cm, Clostridium sordellii, Clostridium perfringens は、 ガス壊疽菌群の仲間に属する。
接種菌量： lOVml 培養： 3 5 °C 24時間判定
まとめ
ササエキスの嫌気性菌群に対する抗菌スぺクトルの概要が明らかになつナこ。 サ サエキスに対する M I Cが 3 %以下の場合に強い抗菌力、 4 %〜 6 %の場合に、 中等度の抗菌力、 そして 7 %以上の場合に弱い抗菌力を示すと仮定した場合には 、 以下のように記述できる。
ササエキスは、 無芽胞嫌気性グラム陽性球菌 ( inego a, Micro腿 s， Pept ostreptococcus, Atopob匪, Gemella) に強い ίτι菌カ 示し 。 しかしながら、 微好気性菌の anginosus groupには弱い抗菌力しか示さなかった。
無芽胞グラム陽性嫌気性菌には、 Propionibacteriumには中等度の、 Actinomy ces, Biiidobacterum, Zaci^aci 《sには弱い抗菌力を示した。無芽胞嫌気性グ ラム陰'性桿菌には、 Prewtella, Porphyromonas, Bilophila, Desulfovivrio、 F usotecieriiMには強い抗菌作用を、 Bacteroides, Sutterellaには、 中等度の抗 菌作用を示した。 嫌気性グラム陰性球菌 ( eillonella には強い抗菌作用を示 した。 Clostridiumには、 中等度の抗菌作用を示した。 sorofe 7iを除くすべて に強い抗菌作用を示した。 産業上の利用可能性
本発明の抗菌剤は、 破傷風菌、 カンジダ菌 （例えば、 Candida albicans, Cand ida glabrata) 、 プロピオ二パクテリゥムァクネス属菌、 ガス壊疽菌、 各種耐性 菌 （例えば、 Methicillin resistant Staphylococcus aureus)、 膣炎および細 菌性膣症関連微生物 （例えば、 Finegoldia, Micro腿 as, Peptostreptococus) 等には強い抗菌作用を、 Actinomyces, Bifidobacterm,
Figure imgf000084_0001
い抗菌作用を示し、 また、 ヘルぺスウィルス等のウイルスに対する抗ゥィルス作 用を示し、 抗菌性インキ、 抗菌性塗料、 抗菌性日本酒、 抗菌性接着剤、 抗菌性飲 料、 抗菌性食品、 抗菌性調味料、 動植物用抗菌剤、 防腐剤、 農業用殺菌剤、 農薬 等として有用である。特にササエキスに加え、 有機酸 （例えば、 リンゴ酸） を含 有する本発明の抗菌剤の抗菌作用は特に顕著である。

Claims

請求の範囲
1. ササエキスを含有する抗破傷風菌剤。
2. ササエキスを含有する抗カビ剤。
3. さらに有機酸を含有する請求項 2記載の抗カビ剤。
4. カビがカンジダである請求項 3記載の抗カビ剤。
5. ササエキスを含有する抗ウィルス剤。
6. ササタンニンを含有する抗菌剤。
7. 黄色ブドウ球菌、 プロピオ二パクテリゥム、 大腸菌に対する抗菌剤である請 求項 6記載の抗菌剤。
8. MR S Aに対する抗菌剤である請求項 6記載の抗菌剤。
9. プロピオニバクテリゥムァクネスに対する抗菌剤である 求項 6記載の抗菌 剤。
10. ササタンニンを含有する二キビ治療剤。
1 1. ササエキス及び有機酸を含有する抗菌性組成物。
12. インキ、 塗料、 食品添加物、 飲料、 調味料、 ペットフード、 プラスチック 成形品、 又は接着剤である請求項 1 1記載の抗菌性組成物。
13. ササエキスを含有するガス壊疽菌に対する抗菌剤。
14. ガス壊疽菌がクロストリジゥム属菌である請求項 13記載の抗菌剤。
15. ササエキスを含有する無芽胞嫌気性グラム陽性球菌に対する抗菌剤。
16. 無芽胞嫌気性グラム陽性球菌が¾je Micro蘭 as, Peptostreptoco ecus, Atopobium, 又は ifez/e である請求項 15記載の抗菌剤。
17. ササエキスを含有する無芽胞嫌気性グラム陰性桿菌に対する抗菌剤。
18. 無芽胞嫌気性グラム陰性桿菌が尸 zwote 7a, Porphyromonas, Bilophila, Desulfovivrio, 又は Fusobacteriunr^ある議求項 17記載の抗菌剤。
1 9 . ササエキスを含有する膣炎および細菌性膣症関連微生物に対する抗菌剤。
2 0 . さらに有機酸を含有する請求項 1 3〜 1 9のいずれか 1項記載の抗菌剤。
2 1 . ササエキスを含有する調味料。
2 2 . ササエキスを含有する食塩である請求項 2 1記載の調味料。
2 3 . さらに有機酸を含有する請求項 2 1又は 2 2記載の調味料。
2 4 . ササエキスを含有する農薬。
2 5 . さらに有機酸を含有する請求項 2 4記載の農薬。
2 6 . ササエキスを含有する農業用殺菌剤。
2 7 . さらに有機酸を含有する請求項 2 6記載の農業用殺菌剤。
2 8 . ササエキスを含有する防腐剤。
2 9 . さらに有機酸を含有する請求項 2 8記載の防腐剤。
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