JP5276615B2 - 抗菌剤及び抗菌性組成物 - Google Patents
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Description
1.ササエキスを含有する抗破傷風菌剤。
2.ササエキスを含有する抗カビ剤。
3.さらに有機酸を含有する上記2記載の抗カビ剤。
4.カビがカンジダである上記3記載の抗カビ剤。
5.ササエキスを含有する抗ウイルス剤。
6.ササタンニンを含有する抗菌剤。
7.黄色ブドウ球菌、プロピオニバクテリウム、大腸菌に対する抗菌剤である上記6記載の抗菌剤。
8.MRSAに対する抗菌剤である上記6記載の抗菌剤。
9.プロピオニバクテリウムアクネスに対する抗菌剤である上記6記載の抗菌剤。
10.ササタンニンを含有するニキビ治療剤。
11.ササエキス及び有機酸を含有する抗菌性組成物。
12.インキ、塗料、食品添加物、飲料、調味料、ペットフード、プラスチック成形品、又は接着剤である上記11記載の抗菌性組成物。
13.ササエキスを含有するガス壊疽菌に対する抗菌剤。
14.ガス壊疽菌がクロストリジウム属菌である上記13記載の抗菌剤。
15.ササエキスを含有する無芽胞嫌気性グラム陽性球菌に対する抗菌剤。
16.無芽胞嫌気性グラム陽性球菌がFinegoldia, Micromonas, Peptostreptococcus, Atopobium, 又はGemellaである上記15記載の抗菌剤。
17.ササエキスを含有する無芽胞嫌気性グラム陰性桿菌に対する抗菌剤。
18.無芽胞嫌気性グラム陰性桿菌がPrevotella, Porphyromonas, Bilophila, Desulfovivrio、又はFusobacteriumである上記17記載の抗菌剤。
19.ササエキスを含有する膣炎および細菌性膣症関連微生物に対する抗菌剤。20.さらに有機酸を含有する上記13〜19のいずれか1項記載の抗菌剤。
21.ササエキスを含有する調味料。
22.ササエキスを含有する食塩である上記21記載の調味料。
23.さらに有機酸を含有する上記21又は22記載の調味料。
24.ササエキスを含有する農薬。
25.さらに有機酸を含有する上記24記載の農薬。
26.ササエキスを含有する農業用殺菌剤。
27.さらに有機酸を含有する上記26記載の農業用殺菌剤。
28.ササエキスを含有する防腐剤。
29.さらに有機酸を含有する上記28記載の防腐剤。
本発明者は、さらにササエキスの各種菌類に対する抗菌効果を探索し、ササエキスを固形分で1〜50質量%、好ましくは2〜25質量%、さらに好ましくは4〜15質量%含有するものが、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌等以外の菌、すなわち破傷風菌等の嫌気性菌、プロピオニバクテリウムアクネスを含むプロピオニバクテリウム、カンジダ等のカビ類、あるいはヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス等のウイルス等にも顕著な抗菌効果を有すること、ササエキスにリンゴ酸等の有機酸を含有させることにより、抗菌性が顕著に向上することを見出し、本発明を完成するに至ったものである。ササエキス自体は古くから知られているにも関わらず、これを高濃度で使用するという試みがこれまでになされなかった理由は定かではないが、従来の濃度より高濃度(10倍以上)にすることにより、破傷風菌等の嫌気性菌、カンジダ等のカビ類、あるいはウイルス等にも顕著な抗菌効果を有することは全く驚くべきことである。
1.ササエキス(固形分で1〜50質量%)、水、油性成分及びクリーム化剤を含む抗菌剤。
2.油性成分が、動物性油、植物性油、合成油、及び半合成油からなる群から選ばれた少なくとも1種である上記1記載の抗菌剤。
3.油性成分が、スクワラン、牛脂、豚脂、馬油、ラノリン、蜜蝋、オリーブ油、グレープシード油、パーム油、ホホバ油、胚芽油、流動パラフィン、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、シリコーン油、ステアリン酸、ステアリルアルコール、ベヘニン酸、セタノール、及びワセリンからなる群から選ばれた少なくとも1種である上記1記載の抗菌剤。
4.クリーム化剤が、モノステアリン酸グリセリンと自己乳化型モノステアリン酸グリセリンとの組み合わせである上記1〜3のいずれか1項記載の抗菌剤。
5.さらに有機酸、安定化剤、保湿剤、創傷治癒剤、防腐剤及び界面活性剤からなる群から選ばれた少なくとも1種の成分を含有する上記1〜4のいずれか1項記載の抗菌剤。
6.安定化剤が、カルボキシビニルポリマーと水酸化カリウムの組合せ、及びジステアリン酸ポリエチレングリコールからなる群から選ばれた少なくとも1種である上記5記載の抗菌剤。
7.保湿剤が、ヒアルロン酸ナトリウム、コラーゲン、アロエエキス、尿素、1,3−ブチレングリコール、グリセリン、トレハロース、ソルビトール、アミノ酸、及びピロリドンカルボン酸ナトリウムからなる群から選ばれた少なくとも1種である上記5記載の抗菌剤。
8.創傷治癒剤が、アラントイン、グリチルリチン酸ジカリウム、カンゾウエキス、及びヨモギエキスからなる群から選ばれた少なくとも1種である上記5記載の抗菌剤。
9.防腐剤が、安息香酸ナトリウム、パラヒドロキシ安息香酸低級アルキルエステル、プロピオン酸ナトリウム、混合脂肪酸エステル、フェノキシエタノール、1,2−ペンタンジオール及び黄色色素からなる群から選ばれた少なくとも1種である上記5記載の抗菌剤。
10.さらに、オレンジオイル、レモンオイル、トウヒ油、及び香料からなる群から選ばれた少なくとも1種の成分を含有する上記5記載の抗菌剤。
11.ササエキス、水、油性成分、クリーム化剤、安定化剤、保湿剤、創傷治癒剤、防腐剤及び界面活性剤を含有する抗菌剤において、油性成分が、スクワラン、牛脂、豚脂、馬油、ラノリン、蜜蝋、オリーブ油、グレープシード油、パーム油、ホホバ油、胚芽油、流動パラフィン、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、シリコーン油、ステアリン酸、ステアリルアルコール、ベヘニン酸、セタノール、及びワセリンからなる群から選ばれた少なくとも1種であり、クリーム化剤が、モノステアリン酸グリセリンと自己乳化型モノステアリン酸グリセリンとの組み合わせであり、安定化剤が、カルボキシビニルポリマーと水酸化カリウムの組合せ、及びジステアリン酸ポリエチレングリコールからなる群から選ばれた少なくとも1種であり、保湿剤が、ヒアルロン酸ナトリウム、コラーゲン、アロエエキス、尿素、1,3−ブチレングリコール、グリセリン、トレハロース、ソルビトール、アミノ酸、及びピロリドンカルボン酸ナトリウムからなる群から選ばれた少なくとも1種であり、創傷治癒剤が、アラントイン、グリチルリチン酸ジカリウム、カンゾウエキス、及びヨモギエキスからなる群から選ばれた少なくとも1種であり、防腐剤が、安息香酸ナトリウム、パラヒドロキシ安息香酸低級アルキルエステル、プロピオン酸ナトリウム、混合脂肪酸エステル、フェノキシタール、及び黄色色素からなる群から選ばれた少なくとも1種であり、界面活性剤がN−アシル−L−グルタミン酸ナトリウムである上記抗菌剤。
12.さらに、オレンジオイル、レモンオイル、トウヒ油、及び香料からなる群から選ばれた少なくとも1種の成分を含有する上記11記載の抗菌剤。
13.ササエキス、水、スクワラン、オリーブ油、モノステアリン酸グリセリン、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、カルボキシビニルポリマー、水酸化カリウム、尿素、1,3−ブチレングリコール、アラントイン、パラヒドロキシ安息香酸低級アルキルエステル、ステアリン酸、N−アシル−L−グルタミン酸ナトリウム、レモンオイルを含有する上記1記載の抗菌剤。
14.ササエキス、水、スクワラン、オリーブ油、ミリスチン酸オクチルドデシル、セタノール、モノステアリン酸グリセリン、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、カルボキシビニルポリマー、水酸化カリウム、尿素、1,3−ブチレングリコール、アラントイン、混合脂肪酸エステル、ステアリン酸、N−アシル−L−グルタミン酸ナトリウム、オレンジオイルを含有する上記1記載の抗菌剤。
15.セスキステアリン酸ポリエチレングリコールを含有する上記1〜14のいずれか1項記載の抗菌剤。
16.有機酸が、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酢酸、安息香酸、フェニル酢酸、サリチル酸、及びフェノール類からなる群から選ばれたる少なくとも1種である上記1〜15のいずれか1項記載の抗菌剤。
参考例1 ササエキスの製造
北海道天塩山系で9月に採集されたササの乾燥葉を、加圧熱水抽出タンクに入れ、125℃で10分処理し、冷却水で熱水を80℃程度まで冷却し、エキスと含水固形分をスクリュープレスで分離して、含水率を約50質量%とした。次に、約50質量%含水固形分をオートクレーブに入れ、180℃で10分、飽和水蒸気による加圧熱処理を行った。処理した含水固形分を、再度加圧熱水抽出タンクに入れて110℃で5分処理してエキスを抽出させた。第1回目と第2回目のエキスを合わせ、珪藻土濾過し、固形分50質量%となるまで減圧濃縮し、110〜130℃の流動殺菌処理をしてササエキスを得た。
参考例2
ササエキス(Bambuseae Sasa)(株式会社鳳凰堂より入手)の成分を分析したところ下記の結果が得られた。
水 59.5質量%
蛋白質 8.6
脂質 0.6
ミネラル 9.0
炭水化物 19.8
タンニン 2.5
実施例1〜4
下記の表2に示す成分を表2に示す質量比で混合し、攪拌翼と乳化器を備えた加熱混合釜に投入し、80℃で2時間攪拌混合し、本発明の抗菌剤を得た。固形分濃度8質量%のササエキス(参考例1で製造した固形分50質量%のササエキスを水で希釈したもの)の添加量は実施例1〜4においてそれぞれ、12.5、25、37.5、及び75質量%(従って、ササエキス固形分の含有量は、1、2、3、及び6質量%、硫黄含有量は、抗菌剤100g中、7.7mg、15.4mg、23.1mg及び46.2mgである)。
実施例1において、固形分濃度8質量%のササエキス(参考例1で製造した固形分50質量%のササエキスを水で希釈したもの)の添加量を6.2質量%(従って、ササエキス固形分の含有量は0.5質量%、硫黄含有量は、抗菌剤100g中、3.8mgである)とした他は同様にして、比較例1の抗菌剤を得た。
実施例5
下記の表3に示す成分を表3に示す質量比で混合し、実施例1〜4と同様にして、本発明の抗菌剤を得た。
下記の表4に示す成分を表4に示す質量比で混合し、攪拌翼と乳化器を備えた加熱混合釜に投入し、80℃で2時間攪拌混合し、本発明の抗菌剤を得た。
下記の表5に示す成分を表5に示す質量比で混合し、攪拌翼と乳化器を備えた加熱混合釜に投入し、80℃で2時間攪拌混合し、本発明の抗菌剤クリームを得た。
実施例7において、dl−リンゴ酸を添加せず、ササエキス(固形分含有量50質量%)の量を16質量%、20質量%及び30質量%とし、精製水の量を調整した他は同様にしてササエキス固形分含有量が8質量%、10質量%及び15質量%の本発明の抗菌剤クリームを得た。
実施例11〜13
実施例7においてササエキス(固形分含有量50質量%)の量を16質量%、20質量%及び30質量%とし、精製水の量を調整した他は同様にしてササエキス固形分含有量が8質量%、10質量%及び15質量%の本発明の抗菌剤クリームを得た。
試験例1(破傷風菌に対する抗菌活性)
破傷風菌(Clostridium tetani)の26株を使用した。これらの菌株は日本の
土壌から分離されたものである。対照として大腸菌(Escherichia coli)ATCC25922とブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923も使用した。
:105 cfu)をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。対照菌株は、血液寒天培地上の集落を用い、Anaerobe broth (Difco)中に,Mc Farland No. 0.5の濁度に調整し、その1μl(接種量:105 cfu)を画線塗抹法によ
り接種した。なお、嫌気ワークステーション(グンゼ産業)中で、35℃18時間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合(+)と判定した。
試験例2(カンジダ菌に対する抗菌活性)
実施例8〜13で調製したササエキス及びササエキス並びにリンゴ酸を含むクリーム組成物について、カンジダ菌(Candida albicans 臨床分離株)に対する抗菌活性を調べた。
使用培地
・NB培地:肉エキス0.2%を添加した普通ブイヨン(栄研化学)
・1/50NB培地:NB培地をリン酸緩衝液で50倍に希釈し、pH7.2±0.2に調整したもの。
・SCDLPブイヨン(栄研化学)
・SA培地:標準寒天培地(日水製薬)
菌液の調整
試験実施1日前純培養した新鮮培養菌を1/50NB培地にMc Farland(マッファーランド)0.5、約108個/mlに懸濁する。更に、1/50NB培地
で菌液を100倍(約106個/ml)に希釈する。
とり、SA培地上に滴下し、均一に塗り拡げ、48時間培養後、菌数を測定し、アクリル板1枚当たりの菌数に換算する。結果を表7に示す。
試験例3(ヘルペスウイルスに対する治癒効果)
実施例7で製造したクリーム組成物(ササエキス固形分含有量6質量%)をヘルペスウイルス感染患者(60歳、女)の患部(口角)に1日2回適量を塗布したところ、2日間で症状が著しく緩和し、3日間で完治した。
試験例4(ニキビ患者の病巣由来株の分析)
ニキビ患者の病巣から下記の黄色ブドウ球菌44株とプロピオニバクテリウムアクネス属菌26株を分離した。
参考例2のササエキス(ササタンニン)と市販タンニン(Lot.02060618, Extrasynthese, Geney, France) の抗菌性(MIC(mg/ml):最小生育阻止濃度)を寒天培地上、2倍希釈法により調べた。結果を以下に示す。
試験例4のニキビ患者の病巣由来株のブドウ球菌属細菌44株(混合物)とプロピオニバクテリウムアクネス菌26株(混合物)を用いて、参考例2のササエキス(ササタンニン)と市販タンニン(Lot.02060618, Extrasynthese, Geney, France)の抗菌性 (MIC(mg/ml):最小生育阻止濃度)を寒天培地上、2倍希釈法により調べた。結果を以下に示す。ブドウ球菌属の菌はMH寒天(Mueller Hinton Agar (BBL))培地、pH7.0、空気中、37℃24時間、プロピオニバクテリウムアクネス菌はGAM培地、pH7.0、嫌気中、35℃48時間、培養した。なお、市販タンニンのMIC80はブドウ球菌属群に対して0.04mg/mlであり、プロピオニバクテリウムアクネス菌に対して0.08mg/mlであった。
水性インキ100質量部に参考例1で製造したササエキス6質量部及びdl−リンゴ酸10質量部を加え、80℃で2時間混合加熱処理し、抗菌性インキを得た。
実施例15
水性塗料100質量部に参考例1で製造したササエキス6質量部及びdl−リンゴ酸10質量部を加え、80℃で2時間混合加熱処理し、抗菌性塗料を得た。
実施例16
日本酒100質量部に参考例1で製造したササエキス3質量部及びdl−リンゴ酸0.25質量部を加え、80℃で3時間混合加熱処理し、抗菌性日本酒を得た。
実施例17
水性接着剤100質量部に参考例1で製造したササエキス6質量部及びdl−リンゴ酸10質量部を加え、80℃で2時間混合加熱処理し、抗菌性接着剤を得た。
試験例7(ガス壊疽菌群Clostridium perfringens 10株に対する抗菌作用)
使用菌株:C. perfringens ATCC13124の1株と臨床分離のC. perfringens 9株 (GAI-92099, GAI-92100, GAI-92101, GAI-92102, GAI-92103, GAI-92104, GAI-92105, GAI-92106, GAI-92107) の合計10株を使用した。これらの臨床分離株は感染症患者由来の臨床材料から分離され、岐阜大学医学部附属嫌気性菌実験施設(以下「当施設」という)に保存されていた株である。なお、抗菌力評価の精度管理用菌株として、E. coli ATC25922を使用した。
抗菌試験:抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法に準じて最小発育阻止濃度を%で測定した。最終濃度が25%から0.2%になるようにササエキスの2倍希釈水溶液の系列を作製した。ササエキス希釈液と変法GAM寒天培地(2倍)を1:1で混合して、最終的に12.5〜0.1%の濃度のササエキス含有変法GAM寒天培地を作製した。変法GAM 寒天培地で24時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、Anaerobe broth (Difco)中に浮遊させ、Mc Farland No 1の濁度の菌液を調整した。 その10μl(接種量:106 cfu)をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。対照菌株E. coli については、TSA寒天培地(Difco)上の集落を用い、Anaerobe broth中にMc Farland No. 0.5の濁度に調整し、その10μl(接種量:105 cfu)を画線塗抹法により接種した。なお、嫌気ワークステーション(グンゼ産業)中で、35℃18時間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合(+)と判定した。本方法により測定したササエキスのE. coli ATC25922に対する最小発育阻止濃度は3.13%であった。
結果
C. perfringens 10株の発育を阻止するに必要なササエキスの最小濃度(MIC)は、3.13〜6.25%に分布した。C. perfringens使用菌株の80%、あるいは50%の株の発育を阻止するササエキスの濃度は6.25%であった。
ガス壊疽は、土壌中に存在するガス壊疽菌群と称される1群のClostridium spp.の芽胞が土壌とともに創部に侵入することが契機となって発症する疾患である。C. perfringens, Clostridium septicum, Clostridium bifermentansなどが原因菌として知られるが、ガス壊疽の症例の80%は、C. perfringensによるものである。ガス壊疽は、救急外科における適切な治療により十分予防できる疾患であるが、外科的処置が遅れるような状況になった場合、また、外科的処置が十分適切でなかった場合には、受傷後6時間以降に発症、急激な経過をとり、致死的となることが知られている。また、救命のために四肢など患部の切断を余儀なくされることがあり、医療上軽視できない疾患のひとつである。
試験例8(Clostridium perfringens以外のガス壊疽菌群に対する抗菌作用)
使用菌株:感染症患者由来の臨床材料から分離された、または当施設保存の参考菌株を使用した。なお、抗菌力評価の精度管理用菌株として、E. coli ATC25922、S. aureus ATCC25923も使用した。試験液は試験例7と同じである。
抗菌試験:抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法に準じて最小発育阻止濃度を%で測定した。最終濃度が8%から0.125%になるようにササエキスを含む変法GAM寒天培地を作製した。培地pHを7.0に調整した。変法GAM 寒天培地で24時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、Anaerobe broth (Difco)中に浮遊させ、Mc Farland No 1の濁度の菌液を調整した。 その10μl(接種量:106 cfu)をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。対照菌株E. coli S.aureusについては、TSA寒天培地(Difco)上の集落を用い、Anaerobe broth中にMc Farland No. 0.5の濁度に調整し、その10μl(接種量:105cfu)を画線塗抹法により接種した。なお、嫌気ワークステーション(グンゼ産業)中で、35℃18時間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合(+)と判定した。結果を表14に示す。
ササエキスはC. novyi と C. sporogenesの発育を3%の濃度で、C. septicumの発育を3〜5%の濃度で、また、C. bifermentans, C. sordelliiの発育を5〜7%の濃度で抑制することが明らかとなった。すなわち、ガス壊疽に関係するClostridium spp.に対するササエキスの抗菌作用は、菌種により差が認められたが、7%の濃度であれば使用した全株の増殖を抑制できることが明らかとなった。創傷部位に本エキスをガス壊疽の予防を意図して使用する場合には、pH7の条件下で、7%の濃度に設定することが望ましい。
試験例9(Propionibacterium acnes 16株に対する抗菌作用)
使用菌株:P. acnes ATCC11827とP. acnes臨床分離株の15株( GAI-10341, GAI-10342, GAI-10343, GAI-10344, GAI-10345, GAI-10346, GAI-10347, GAI-10348, GAI-10349, GAI-10350, GAI-10351, GAI-10352, GAI-10353, GAI-10354, GAI-10355)の合計16株を使用した。これらの臨床分離株は皮膚科感染症患者から分離され、当施設に保存されていた株である。試験液は、試験例7と同じである。希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験:抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78%になるようにササエキスを含有させた変法GAM寒天平板(日水製薬)を作製した。ササエキス液と2倍寒天培地を1:1で混合して、所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。なお、pHの調整は、実施しなかった。
結果
P. acnes 16株の発育を完全に阻止するに必要なササエキスの最小濃度(MIC)は6.25%であった(表15)。ササエキスはP. acnesの16株中12株に対して、3.13%でササエキス不含の対照培地と比し顕著な発育の抑制を呈したが、完全な阻止には6.25%が必要であった。
Acne vulgaris に関与するS. aureusの阻止に必要なササエキスの濃度は3.13%であるが、この試験例の検討で、P. acnesの全株を完全に阻止するのに必要なササエキス濃度は、3.13%以上から6.25%以下の範囲の濃度であった。P. acnesはS.aureusとともに重要なAcne vulgarisの増悪因子であることから、Acne vulgaris治療を目的とする場合には、P. acnesの発育を完全に阻止できる6.25%程度が適当と考えられる。
試験例10(にきび由来のPropionibacterium acnes 26株に対する抗菌作用)
使用菌株: P. acnes臨床分離株の合計26株を使用した。これらの臨床分離株は、にきび患者から分離され、当施設に保存されていた株である。試験液は試験例7と同じであり、濃度は50%の酸性 (pH5.0前後) の溶液である。希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験:抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が8,7,6,5,4,3,2,1,0.5%になるようにササエキスを含有させた変法GAM寒天平板(日水製薬)を作製した。pHは7.0付近に調整した。GAM寒天培地で48時間培養して得た被験菌株の集落をAnaerobe Brothに懸濁し、所定の菌数を含む菌液を調整した。嫌気ワークステーション(グンゼ産業)中で、35℃2日間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。
結果と考察
同時に行った成績ではないが、各種抗菌薬に対する感受性の分布を参考に示した。今回は、pH無調整で実施した前回の実験の場合と異なり、終末点の判定が困難であった。
使用菌株:表17に示した施設保存の参考菌株を使用した。これらの菌株はATCC, JCMから購入し、当施設に保存されていた株である。なお、対照として、細菌性膣症の婦人の膣内や婦人科領域感染症から比較的高頻度に分離される代表的な菌種の中からPrevotella bivia ATCC29303, Porphyromonas asaccharolytica ATCC25260, Bacteroides fragilis N-1, N-2を選んだ。また、Escherichia coli ATC25922とStaphylococcus aureus ATCC25923も、同様の目的と感受性測定の精度管理用菌株として使用した。試験液は試験例7と同じである。
抗菌試験:抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度(MIC) を測定した。日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5%になるようにササエキスを含有させた変法GAM寒天平板(日水製薬)を作製した。10%〜6%までの高濃度領域については、それぞれ20%〜12%のササエキス液と2倍寒天培地を1:1で混合して作製し(最終pH5.3〜5.5)、5%〜0.5%までの低濃度の領域については, 50%〜5%のササエキス液と1倍寒天培地を1:9で混合して(最終pH5.5〜6.0)、ササエキス含有寒天培地を作製した。
また、今回の抗菌力の検討は、酸性(pH5.3〜6.0)条件下に加え、より弱酸性〜環境下でも実施した。ササエキス添加後のpHを2NのNaOH水で、pH6.5〜7.0に、調整した培地を作製した。
接種菌液の調整:
Brucella HK 血液寒天培地で48時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、Anaerobe broth MIC (Difco)中に浮遊させ、Mc Farland No 1の濁度に調整した。その10μl(接種量:106 cfu)をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。対照菌株についても、TSA寒天培地上の集落を用い、Anaerobe broth MIC中にMc Farland #1の濁度に調整し、その10μl(接種量:106cfu)を画線塗抹法により接種した。今回、E. coli ATC25922とS. aureus ATCC25923については、Mc Farland #1/2, 1/2の10倍希釈液、1/2の100倍希釈液についても同時にMICを測定し、接種菌量のMICに与える影響を検討した。
結果
pH無調整の酸性(pH5.3〜6.0)の実験条件下で測定したササエキスの最小発育阻止濃度は、表17に示した。Lactobacillus casei ss. casei, Lactobacillus. brevis ss. brevis, Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus salivariusの4菌種4株に対して7〜8%, その4菌種4株を除く5菌種5株に対して、10%以上であった。なお、同時に測定したP. bivia ATCC29303, P. asaccharolytica ATCC25260に対する最小発育阻止濃度は、いずれも0.5%で、本方法により測定したササエキスの精度管理用菌株2株、E. coli ATC25922とS. aureus ATCC25923に対する最小発育阻止濃度はともに4%であった。
考察
ササエキスが6.25 %〜3.13%以下の濃度で、いくつかの病原性細菌の発育を阻止することが明らかとなってきた。ササエキスのこれら病原性細菌に対する抗菌力の他に、非病原性細菌に対する抗菌力についての情報を集積することも極めて重要と考え、この試験例を実施した。
本発明者らは、ササエキスが、各種化膿性感染症の原因菌として極めて重要なEscherichia coli、各種抗菌薬に多剤耐性を示すMethicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA)、MRSAと同様に多くの抗菌薬に対して耐性傾向の強いPseudomonas aeruginosa などに対して抗菌作用を示すことを見出している。本発明者らは、これまでササエキスの嫌気性菌に対する抗菌作用を嫌気性菌に対して推奨されている変法GAM寒天培地を感受性測定培地とする寒天平板希釈法により測定してきた。
材料と方法
使用菌株:施設保存の臨床分離株であるE. coli 14株, Methicillin resistant S. aureus 14 株およびP. aeruginosa 13 株を用いた。また、E. coli ATC25922とS. aureus ATCC25923を感受性測定の精度管理用菌株として使用した。試験液は試験例7と同じである。溶液の希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験:
抗菌薬の通性菌に対する抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度(MIC) を測定した。可能な限り、日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.063, 0.032%になるようにササエキスを含有させたMuellar Hinton 寒天平板 (Difco) を作製した。7%〜6%の高濃度領域については、それぞれ14%〜12%のササエキス液と2倍濃度のMueller Hinton寒天培地を1:1で混合して作製し、5%〜0.032%までの低濃度の領域については, 50%〜0.32%のササエキス液と1倍濃度のMueller Hinton寒天培地を1:9で混合して、ササエキス含有寒天培地を作製した。2NのNaOH水で、培地pH6.5〜7.3に調整した。
なお、Mueller Hinton 寒天培地の代わりに、変法GAM寒天培地〔日水製薬〕を用いてササエキス含有寒天培地を作成し、同一の接種菌液を用いて、E.coliとMRSAを接種し、一夜嫌気性培養を実施し、MICを求めた。なお、この場合もpHは2NNaOHを用いて、6.7〜7.3に調整した。
接種菌液の調整と判定:
TSA寒天培地で24〜48時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、Mueller Hinton broth (Difco)中に浮遊させ、Mc Farland No 1の濁度の菌液を調整した。 その10μlをMueller Hinton broth 1 mlに浮遊させ、その5μl をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。
35℃20時間好気環境下で培養後、発育の有無を肉眼で観察した。嫌気培養した平板については、一夜培養後の判定後、さらに大気環境下で一夜放置して、再増殖の有無の判定を行った。
結果
pH調整 (pH6.5〜7.3) の実験条件下で測定したササエキスのE. coli に対する最小発育阻止濃度(MIC)は、2〜3%に分布し、MIC50%は2%であった。また、MRSAに対するMICは、0.25〜0.5%に分布し、MIC50%は、0.5%であった。また、P. aeruginosaに対するMICは、全株1%であった。
変法GAM寒天培地を用いて、嫌気性環境下で測定したササエキスのE. coli臨床分離株14株に対するMIC50%は8%で、S. aureus臨床分離株14株に対するMIC50%は3 %であった。精度管理用菌株に対する変法GAM寒天培地での中性環境、嫌気性環境でのMICは、E. coli ATCC25922に対して8%、S. aureus ATCC25923に対して3%であった。
考察
この試験例において、日本化学療法学会MIC測定標準法に可能な限り近づけたササエキスのMIC測定結果から、ササエキスはMRSAやP. aeruginosaに対して、ほぼ中性の環境で、いずれも1%以下のMICを示し、極めて強い抗菌作用があることを確認した。
* 好気性:Mueller Hinton Agar、好気性培養
嫌気性:変法GAM寒天培地、嫌気性培養
P. aeruginosa の嫌気性培養は未実施
参考:
High: Mc Farland No.1の10μl,
Low: Mc Farland No1の100倍希釈液の10μl ,
(1): 嫌気培養では測定不能であったが、さらに好気性培養を継続して判定すると1%になる,
NT: 試験未実施
1.Prevotella bivia およびpigmented Prevotella spp. 株について
BV関連細菌に分類される細菌の中で、まずP. biviaおよびPigmented Prevotella spp.に対するササエキスの抗菌作用を検討した。
使用菌株:P. biviaの合計14株とPigmented Prevotella spp.(Prevotella intermedia、 Prevotella melaninogenica)9株を使用した。P. biviaは、1990年代前半に女性膣内から分離され、また、Pigmented Prevotella spp.は、2002年に各種臨床材料から分離され、当施設に保存されていた株である。MIC精度管理用菌株として、Escherichia coli ATCC25922とStaphylococcus aureus ATCC25923も使用した。試験液は試験例7と同じである。濃度は50(w/v) %の酸性 (pH5.0前後) の溶液である。希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験:抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。最終濃度が4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 %になるようにササエキスを含有させた変法GAM寒天平板(日水製薬)を作製した。ササエキス液と寒天培地を1:9で混合して、所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。なお2NNaOH水溶液を使用して、培地pHの調整 (pH 7.0〜7.3) を実施した。
結果
ササエキスは、0.5%で P. biviaの発育を、1%でpigmented Prevotella sppの発育を完全に阻止した。ササエキスのP. bivia 14株に対するMIC50%およびPigmented Prevotella spp.に対するMIC50%は、いずれも0.5%であった。
健常な女性の膣は嫌気性菌と好気性菌の宝庫である。女性産道の正常細菌叢には、膣内の清浄度を保つのに重要な役割を演じているLactobacillus spp. が最優勢に存在している。しかしながら、一方では日和見病原体として知られるPeptostreptococus anaerobius などの嫌気性グラム陽性球菌やPrevotella spp. (Prevotella melaninogenica、 Prevotella intermediaなど)、Bacteroides spp.などの嫌気性グラム陰性桿菌も低菌量で存在し、細菌性膣症とよばれる状況で異常に増殖することがわかっていて、Bacterial Vaginosis(細菌性膣症)関連微生物と称されている。細菌性膣症は、ミルク様で悪臭のある帯下を生じる疾患であり、STDに対する易感染性、早産、前期破水など周産期に見られる各種異常との関係、骨盤内炎症性疾患PIDへの進展との関係で論じられている。
2.Gardnerella vaginalis 株について
Gardnerella vaginalisは健常な女性の膣からも検出されるが、その菌数は少ない。 G. vaginalis は Mycoplasma homminis、Peptostreptococcus anaerobius、Pigmented Prevotella spp.、Non-pigmented Prevotella spp.、Porphyromonas spp.などとともに、細菌性膣症の状態で異常に増殖するいわゆるBV関連微生物の範疇に入る細菌の一つである。しかも、産道感染症の原因菌としても極めて重要である。この試験では、G. vaginalisについて検討した。
材料と方法
使用菌株:G. vaginalisの合計11株を使用した。これらはNCTCまたはATCCから購入した菌株2株と臨床分離株9株からなる。臨床分離株は、1990年代前半に、本発明者らが女性膣内から分離し、当施設に保存していた株である。また、MIC精度管理用菌株として、Escherichia coli ATCC25922とStaphylococcus aureus ATCC25923も使用した。試験液は、試験例7と同じである。
抗菌試験:抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が8,7,6,5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 %になるようにササエキスを含有させたBrucella HK 血液寒天培地(極東製薬)を作製した。ササエキス液とBrucella HK 血液寒天培地を1:1または、1:9の割合で混合して、所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。なお、2N NaOH水溶液を使用して、培地pHの調整 (pH 7.0〜7.3) を実施した。
Brucella HK血液寒天培地(極東製薬)で48時間培養して得た被験菌株の集落を使用して、Anaerobe Broth MIC (Difco)中にMcFarland#1の濁度の菌液を調整し、その1白金耳(10μl)をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。対照培地での発育が塗抹部位全体に一様に見られるように設定した。
嫌気ワークステーション(グンゼ産業)中で、35℃で、2日間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合(+)と判定した。
なお、本実験条件下で測定したササエキスのE. coli ATCC25922とS. aureus ATCC25923に対するMICは、それぞれ、>8%、8%であった。
結果
ササエキスのG. vaginalis 11株に対するMICの範囲は6%から4%に分布し、MIC50%は6%であった。
今回の検討から、ササエキスは、細菌性膣症関連微生物のひとつとして重要な通性嫌気性菌のG. vaginalisに対しては、6%の濃度で完全に発育を阻止することが明らかになった。BV関連微生物の嫌気性菌であるNon-pigmented Prevotella であるP. bivia やpigmented PrevotellaであるPrevotella melaninogenicaより抗菌力は弱いことが明らかとなった。本エキスは、8%の濃度でもLactobacillus spp.の多くの菌株の発育を阻止しないことが知られており、生体での使用に際しての濃度の設定に重要な成績が得られたと考えられる。
なお、一連の検討において、参考菌株であるE. coli やS. aureus のMICに実験条件により変動があることが明らかになっている。MICは、使用する感受性測定用培地の種類、接種菌量、培養条件などの因子により影響を受けるが、今回は初めて感受性測定培地としてBrucella HK 血液寒天培地を使用した。本培地でのMICは、変法GAM培地でのMICより酸性側にシフトする印象であった。
試験例15(細菌性膣症関連微生物に対する抗菌作用)
3.Finegoldia, Micromonas, Peptostreptococusについて
嫌気性球菌であるFinegoldia magna、Micromonas micros、Peptostreptococcus spp.は、Prevotella bivia、Pigmented Prevotella spp.、Porphyromonas spp.、Mycoplasma genitalium (hommnis)、Gardnerella vaginalisなどとともに、膣内乳酸菌の減少、膣内pHの低下、およびミルク様かつ悪臭(アミン臭)のある帯下を特徴とする細菌性膣症(BV)の状態で異常に増加する細菌性膣症関連微生物の仲間である。この試験例では、細菌性膣症関連細菌に分類される細菌のひとつである嫌気性球菌に対するササエキスの抗菌作用を検討した。
材料と方法
使用菌株:Peptostreptococcus anaerobius(5株)、 Peptostreptococcus asacccharolyticus(3株)、Finegoldia magna(7株)、 Micromonas micros(6株)の合計21株を使用した。MIC精度管理用菌株として、Escherichia coli ATCC25922とStaphylococcus aureus ATCC25923も使用した。試験液は試験例7と同じである。
抗菌試験:抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。最終濃度が5,4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 %になるようにササエキスを含有させた変法GAM寒天平板(日水製薬)を作製した。ササエキス液と寒天培地を1:9で混合して、所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。なお、2N NaOH水溶液を使用して、培地pHの調整 (pH 7.0〜7.3) を実施した。
Brucella HK血液寒天培地(極東製薬)で48時間培養して得た被験菌株の集落を使用して、Anaerobe Broth MIC (Difco)中にMcFarland#1の濁度の菌液を調整し、その1白金耳(10μl)をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。本実験条件下では、1白金耳には、約106の細菌を含む。
嫌気ワークステーション(グンゼ産業)中で、35℃で、24時間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合(+)と判定した。
なお、本実験条件下で測定したササエキスのE. coli ATCC25922とS. aureus ATCC25923に対するMICは、ともに>=5%であった。
結果
ササエキスは、3%の濃度で M. micros, F. magna, P. anaerobius, P. asaccharolyticusの嫌気性球菌群21株の発育を完全に阻止した。ササエキスの嫌気性球菌に対するMIC50%は0.5%であった。
細菌性膣症は、ミルク様で悪臭のある帯下を生じる疾患であり、性感染症(STD)に対する易感染性、早産、前期破水など周産期に見られる各種異常との関係、骨盤内炎症性疾患(PID)への進展との関係で論じられている。細菌性膣症では、健康時には膣内の清浄度を保つのに重要な役割を演じているLactobacillus spp. が著しく減少し、Prevotella spp. (P. melaninogenica、P. intermediaなど)、Bacteroides spp.などの嫌気性グラム陰性桿菌やP. anaerobius などの嫌気性グラム陽性球菌、さらにはG. vaginalisやMycoplasmaなどの微生物が異常に増殖することがわかっている。これらの細菌群は細菌性膣症関連微生物と称されている。
試験例16(細菌性膣症関連微生物に対する抗菌作用)
Mobiluncus spp. について
嫌気性グラム陽性桿菌であるMobiluncus spp.は、嫌気性無芽胞グラム陽性嫌気性桿菌で、Prevotella bivia 、Pigmented Prevotella spp.、Porphyromonas spp.、Mycoplasma genitalium (hommnis)、 Gardnerella vaginalisなどとともに、膣内乳酸菌の減少、膣内pHの低下、およびミルク様で悪臭(アミン臭)のある帯下を特徴とする細菌性膣症の状態で異常に増加する細菌性膣症関連微生物の仲間である。この試験例では、Mobiluncus spp. 対するササエキスの抗菌作用を検討した。
材料と方法
使用菌株:Mobiluncus spp.の12株を使用した。この中には、M. curtisii subsp. curtisii ATCC35242、M. curtisii subsp. holmessii ATCC25241、M.mullielis ATCC35240、ATCC35243 を含む。また、MIC精度管理用菌株として、Staphylococcus aureus ATCC25923も使用した。試験液は試験例7と同じである。
抗菌試験:抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。最終濃度が8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 %になるようにササエキスを含有させたBrucella HK 血液寒天平板を作製した。血液は、凍結融解により溶血させた羊脱繊血(日生材)を使用し、培地に5%の割合で添加した。ササエキス液と寒天培地を1:1で混合し、所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。なお、2N NaOH水溶液を使用して、培地pHの調整 (pH 7.0±0.3) を実施した。
Brucella HK血液寒天培地(極東製薬)で72時間培養して得た被験菌株の集落を使用して、Anaerobe Broth MIC (Difco)中にMcFarland#1の濁度の菌液を調整し、その1白金耳(10μl)をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。本実験条件下では、1白金耳には、約106の細菌を含む。
嫌気ワークステーション(グンゼ産業)中で、35℃で、2日間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合(+)と判定した。
結果
表26に成績を示した。ササエキスは、4%で Mobiluncus spp. の発育を完全に阻止した。ササエキスのMobiluncus spp.に対するMIC50%は4%であった。
考察
細菌性膣症は、ミルク様で悪臭のある帯下を生じる疾患であり、STDに対する易感染性、早産、前期破水など周産期に見られる各種異常との関係、骨盤内炎症性疾患PIDへの進展との関係で論じられている。細菌性膣症では、健康時には膣内の清浄度を保つのに重要な役割を演じているLactobacillus spp. が著しく減少し、Prevotella spp. (P. melaninogenica、 P. intermediaなど)、Bacteroides spp.などの嫌気性グラム陰性桿菌や嫌気性グラム陽性桿菌であるMobiluncus spp. 、P. anaerobius などの嫌気性グラム陽性球菌、さらにはG. vaginalisやMycoplasmaなどの微生物が異常に増殖することがわかっている。これらの細菌群は細菌性膣症関連微生物と称されている。細菌性膣症関連微生物の中で、Mobiluncus spp.は、BV scoreが高い値をとる状態で検出率が高くなる菌種が、本発明者らの研究でも確認されている。
Bacteroides fragilisは人糞便中から分離される無芽胞嫌気性グラム陰性桿菌で、褥創や肛門周囲膿瘍などを含む各種皮膚や皮下軟部組織感染症において、黄色ブドウ球菌(MRSA)、多薬剤耐性緑膿菌ととともに臨床上極めて重要な菌種である。この試験例では、ササエキスのB. fragilisについての抗菌作用を検討した。
使用菌株:B. fragilisの合計12株を使用した。これらの臨床分離は、2002年1月から7月までに各種化膿性感染症患者から分離され、当施設に保存されていた株である。MIC精度管理用菌株として、Escherichia coli ATCC25922とStaphylococcus aureus ATCC25923も使用した。試験液は試験例7と同じである。
抗菌試験:抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 %になるようにササエキスを含有させた変法GAM寒天平板(日水製薬)を作製した。10〜6 %までは、ササエキス液と2倍寒天培地を1:1で混合して、5〜1 %までは、ササエキス液と寒天培地を1:9で混合して、所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。なお、2N NaOH水溶液を使用して、培地pHの調整 (pH6.6〜7.1) を実施した。
Brucella HK血液寒天培地(極東製薬)で48時間培養して得た被験菌株の集落を使用して、Anaerobe Broth MIC (Difco)中にMcFarland#1の濁度の菌液を調整し、その1白金耳(10μl)をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。本実験条件下では、1白金耳には、106cfu/mlの細菌数を含む。
結果:ササエキスのB. fragilis 12株に対するMICは4〜6%に分布した。MIC90%は、5%であった。
Bacteroides fragilis group (特に、B. fragilis) は、嫌気性無芽胞グラム陰性嫌気性桿菌で、人の下部消化管粘膜に常在している。本菌群は、粘膜の破綻の際に、通常無菌の組織や臓器に侵入し、感染症を惹起する。各種化膿性感染症、特に横隔膜から下部の化膿性感染症から、最も高頻度に分離される嫌気性菌である。本菌は、 感染部位で、大腸菌などの通性桿菌、ぶどう球菌、腸球菌、Streptococcus milleri groupなどの通性、微好気性球菌やBacteroides以外の無芽胞嫌気性菌嫌気性菌などとともに存在している。すなわち複数菌感染症の構成菌として重要である。また、B. fragilisは、他の一部の通性菌と同様に、多くの抗菌薬に対し自然耐性であり、本菌種に抗菌力のある抗菌薬は、クリンダマイシン、セファマイシン、カルバペネムなどと比較的限られている。しかし、それらの数少ない抗菌薬に対しても獲得耐性化傾向にあり問題となっている。従って、B. fragilisが関与する感染症の治療には、より広域の抗菌薬が、または複数種の抗菌薬が長期にわたり使用される傾向がある。ところが、その使用方法によっては、本菌種はもとより、本菌種以外の細菌種の抗菌薬耐性化を増長する可能性があり、感染症治療上、極めて厄介な菌種ともいえる菌である。
試験例18(骨盤内感染症)
健常な女性の膣は嫌気性菌と好気性菌の宝庫の一つである。女性産道の正常細菌叢には、嫌気性菌が好気性菌の10倍以上多く存在している。嫌気性グラム陽性球菌とBacteroides spp.(現在の分類ではPrevotella spp.とBacteroides spp.)である。嫌気性菌はSTD病原体が関係しない産道感染症のほとんどの患者から分離される。主要な嫌気性病原体は、Bacteroides fragilis, Prevotella bivia, Prevotella disiens, Prevotella melaninogenica, 嫌気性球菌、そしてClostridium spp.である。嫌気性菌は、卵管卵巣膿瘍、敗血症性流産、骨盤内膿瘍、子宮内膜炎、術後創部感染症、特に帝王切開術後創部感染症、などに関係している。これらの感染症は嫌気性菌と腸内細菌科の細菌との複数菌感染症であることが多いが、腸内細菌科の細菌やその他の通性菌が分離されない嫌気性菌だけによる感染症は腹腔内感染症の場合よりも多くみられる。また、子宮から悪臭ある膿汁や血液の排出があること、子宮のある下腹部全体のあるいは骨盤内の局所的な圧痛、持続する発熱や悪寒が特徴である。骨盤静脈の化膿性血栓性静脈炎が合併することがあり、反復性の敗血症性肺栓塞のエピソードを起こす原因となる。
試験例19(ササエキスのBifidobacterium spp.に対する抗菌作用)
抗菌力を有する物質の評価の際には、人の病原菌に対する作用とともに皮膚、粘膜に常在する有用あるいは日和見細菌に対する作用を知っておくことが極めて重要である。
材料と方法
使用菌株:表28に示した施設保存の参考菌株を使用した。これらの菌株はATCC, JCMから購入し、当施設に保存されていた株である。なお、対照として、婦人科領域感染症および消化器感染症からもっとも高頻度に分離される嫌気性菌菌種の中からPrevotella bivia ATCC29303, Porphyromonas asaccharolytica ATCC25260, Bacteroides fragilis N-1を選んだ。 また、Escherichia coli ATC25922とStaphylococcus aureus ATCC25923も、同様の目的と感受性測定の精度管理用菌株として使用した。試験液は試験例7と同じである。溶液の希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験:
抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度(MIC) を測定した。日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5%になるようにササエキスを含有させた変法GAM寒天平板(日水製薬)を作製した。10%〜6%までの高濃度領域については、それぞれ20%〜12%のササエキス液と2倍寒天培地を1:1で混合して作製し(最終pH5.3〜5.5)、5%〜0.5%までの低濃度の領域については, 50%〜5%のササエキス液と1倍寒天培地を1:9で混合して(最終pH5.5〜6.0)、ササエキス含有寒天培地を作製した。
接種菌液の調整:
Brucella HK 血液寒天培地で48時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、Anaerobe broth (Difco)中に浮遊させ、Mc Farland No 1の濁度に調整した。 その10μl(接種量:106 cfu)をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。対照菌株についても、TSA寒天培地上の集落を用い、Anaerobe broth中にMc Farland #1の濁度に調整し、その10μl(接種量:106 cfu)を画線塗抹法により接種した。なお、嫌気ワークステーション(グンゼ産業)中で、35℃18時間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合(+)と判定した。
結果
pH無調整の酸性(pH5.3〜6.0)の実験条件下で測定したササエキスの最小発育阻止濃度は、表28に示した。Bifidobacterium spp. の5菌種5株に対しても、MICが4%であったB. bifidumの1株を除き、すべて7%以上の最小発育阻止濃度であった。なお、同時に測定したP. bivia ATCC29303、P. asaccharolytica ATCC25260に対する最小発育阻止濃度は、いずれも0.5%で、本方法により測定したAHSSの精度管理用菌株2株、E. coli ATC25922とS. aureus ATCC25923に対する最小発育阻止濃度ともに4%であった。
考察
ササエキスが6.25 %以下(多くは4 %程度) の濃度で、いくつかの病原性細菌の発育を阻止することが明らかとなってきた。ササエキスのこれら病原性細菌に対する抗菌力の他に、非病原性細菌に対する抗菌力についての情報を集積することも極めて重要と考え、今回の検討を実施した。
この試験例では、“鵞口瘡”や女性の膣炎・外陰炎の原因となるCandida albicansおよびCandida glabrataに対する抗真菌作用を検討した。
使用菌株:Candida albicansおよびCandida glabrataの合計13株を使用した。これらは、2002年に各種臨床材料から分離され、当施設に保存されていた株である。MIC精度管理用菌株として、Escherichia coli ATCC25922、Staphylococcus aureus ATCC25923およびPseudomonas aeruginosa ATCC27853を使用した。
試験液は試験例7と同じである。希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験:抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。最終濃度が8,7,6,5,4, 3,2,1%となるようにササエキスを含有させたMH寒天平板(Difco)を使用した。ササエキス液と寒天培地を1:9で混合して、所定の濃度のササエキス含有寒天培地を作製した。なお、2N NaOH水溶液または10%塩化水素水溶液を使用して、培地pHの調整 (pH 7.0前後とpH5.0前後の2種類)を実施した。
マイコセル寒天培地(BD)で48時間培養して得た被験菌株の集落を使用して、MH broth (Difco) 中にMcFarland#1の濁度の菌液を調整し、その1白金耳(10μl)をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。本実験条件下では、1白金耳には、約106の細菌を含む。
35℃で、24時間培養後、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合(+)と判定した。
なお、本実験条件下で測定したササエキスのE. coli ATCC25922とS. aureus ATCC25923およびP. aeruginosa ATCC27853 に対する1日後でのMICは、pH7で、それぞれ2、<=1、 2 であり、pH5では、すべて<=1であった。また、さらに3日室温後でのMICは、pH7で、それぞれ3、<=1、3 であり、pH5では、2、<=1、<=1であった。
結果
表にpH5とpH7の環境で、1日後、および3日後に判定したササエキスのCandida spp.に対するMICの分布を示した。pH5で、24時間判定で、ササエキス5%の濃度で、C. albicans 8株とC. glabrata4株のすべての発育を阻止した。3日後の判定では、全株の発育阻止には8%が必要であった。
pH7で、24時間判定で、ササエキス5%の濃度で、C. albicans全株の発育阻止を示した。C. glabrataに対するMICは判定不能であった。3日後の判定では、C. glabrataを含め全株の発育阻止には8%以上が必要であった。
考察
女性の膣炎には、原虫によるトリコモナス膣炎、真菌によるCandida性膣炎もの、および細菌による細菌性膣症(=非特異性膣炎)が知られている。膣炎をおこすCandida spp.は、外陰炎の原因ともなる。Candida性膣炎は、他の膣炎と異なり、チーズ状の帯下が特徴で、きわめて掻痒感の強い疾患である。治療には抗真菌薬が投与される。
今回の検討から、ササエキスは酵母状真菌に対して発育阻止効果があることが確認された。酸性下で1日後に測定したMICは、5%から3%に分布した。また、pH調整後中性下で測定したMICは、5%から4%に分布した。しかしながら、さらに3日間の室温放置後に再度MICを判定したところ、ササエキスのCandida spp.に対するpH5.0でのMICは、8%の1株を除き12株が5〜3%の範囲から7〜4%の範囲と耐性側にシフトし、pH7.0でのMICは、13株の全株が5〜4%の範囲から8%以上にシフトした。このことから、1日後に決定したMICあるいはそれ以上の濃度でのササエキス真菌に対する作用が静菌的であることを示しており、殺菌にはより高濃度が必要であることを示唆した。また、C.glabrataは、中性環境で37℃で1日培養後には充分な発育が認められなかったが、その後3日室温に放置した時、充分な発育が認められ、MICの判定が可能となった。酸性に調整したMueller Hinton培地では、37℃1日でも充分な発育が見られ、MICの判定が可能であった。
Mueller Hinton培地を感受性測定用培地として用いた本実験では、ササエキスのCandida spp.に対するMICは7〜4%の濃度にあり、抗真菌作用を示すことが明らかとなった。そのMICは、中性環境で、酸性環境より1管程度低い値を示した。さらに、中性条件で1日後で発育を阻止していたかなり高い濃度でも、その後の室温放置によりCandida spp.の発育が観察され、その作用は静菌的であることが知られた。酸性条件下でも、1日後で発育を阻止していた濃度で、その後Candida spp.の発育が観察されたが、その程度は中性環境で観察されたより軽度であった。すなわち、本エキスは、酸性条件下で、Candida spp.に対して、中性環境下より、強い殺菌作用を示すことが明らかとなった。ササエキスを臨床応用する場合の濃度の設定には、本エキスの毒性に関する情報に加え、この点も充分考慮して、使用濃度と使用回数を設定する必要があると考えられた。
以上のことから、抗菌作用に加え、抗真菌作用を有するササエキスはCandida膣炎および外陰炎およびその他のCandida sppが関与する病態の治療薬として、充分使用できることが強く示唆された。
感受性測定用培地のpH(5.0、7.0) および判定日数(1日、3日)の影響
* 培地pH
** 判定日数
*エキス不含培地(pH7.0)での発育が悪いため判定を保留
ササエキスは、にきび(Acne vulgaris)の病因の一つとして重要なPropionibacterium acnesを6.25%の濃度で、完全に発育を抑制する。また、ササエキスは、化膿性球菌として重要なStaphylococcus aureus(MRSA) に対しても、1%以下の濃度で完全に発育を抑制をすることが明らかとなった。本発明者らは、にきびの患者の病巣から分離されたにきびの増悪因子として重要なStaphylococcus epidermidis 13株とStaphylococcus cohnii 1株のStaphylococcus spp. 合計14株を使用して、ササエキスの抗菌作用を寒天平板希釈法により検討した。
材料と方法
使用菌株:Staphylococcus epidermidis 13株とStaphylococcus cohnii 1株の合計14株を用いた。また、Escherichia coli ATCC25922, S. aureus ATCC25923を感受性測定の精度管理用菌株として使用した。表30に使用した菌株の菌種と抗菌薬感受性パターンを示した。
抗菌試験:
抗菌薬の通性菌に対する抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度(MIC) を測定した。可能な限り、日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125%になるようにササエキスを含有させたMuellar Hinton 寒天平板 (Difco) を作製した。50%〜1.25%のササエキス液と1倍濃度のMueller Hinton寒天培地を1:9で混合して、ササエキス含有寒天培地を作製した。2NのNaOH水で培地pH6.1〜7.1に調整した。S. aureus ATCC 25922 およびE. coli ATCC25922に対するMICは2%であった。
接種菌液の調整と判定:
TSA寒天培地で24〜48時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、Mueller Hinton broth (Difco)中に浮遊させ、Mc Farland No 1の濁度の菌液を調整した。その10μlをMueller Hinton broth 1 mlに浮遊させ、その10μl をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。35℃20時間好気環境下で培養後、発育の有無を肉眼で観察した。
結果
Staphylococcus epidermidis 13株とStaphylococcus cohnii 1株のStaphylococcus spp. 合計14株を使用して、ササエキスの抗菌作用を寒天平板希釈法により検討した。その結果、ササエキスは、1%の濃度で、これらの発育を完全に抑制した。14株については、抗菌薬3薬剤(テトラサイクリン、クリンダマシシン、オフロキサシン)についての感受性が試験されており、テトラサイクリン1剤耐性の菌株が2株、クリンダマイシン1剤耐性株が1株、テトラサイクリンとクリンダマイシンの2剤耐性の菌株が2株、オフロキサシン1剤耐性株が1株含まれていたが、これらの耐性菌をササエキスは、一様に1%以下で発育を阻止した。
本発明者らは、にきびの患者から分離された、にきびの増悪因子として重要なStaphylococcus epidermidis 13株とStaphylococcus cohnii 1株のStaphylococcus spp. 合計14株のササエキスに対する感受性を寒天平板希釈法により検討した。その結果、ササエキスは、2%の濃度で、これらの発育を完全に抑制した。抗菌薬3薬剤(テトラサイクリン、クリンダマシシン、オフロキサシン)についての感受性が試験されたこれら14株には、テトラサイクリン1剤耐性の菌株が2株、クリンダマイシン1剤耐性株が1株、テトラサイクリンとクリンダマイシンの2剤耐性の菌株が2株、オフロキサシン1剤耐性株が1株含まれていたが、ササエキスは、これらの耐性菌を一様に、2%以下の濃度で発育阻止した。
試験例22(Acne vulgaris患者病巣由来のStaphylococcus spp.に対する抗菌作用)
この試験例では、にきびの患者の病巣から分離されたStaphylococcus epidermidis spp. 合計44株を使用して、ササエキスの抗菌作用を寒天平板希釈法により検討した。
使用菌株:Staphylococcus合計44株を用いた。また、Escherichia coli ATCC25922, S. aureus ATCC25923を感受性測定の精度管理用菌株として使用した。試験液は試験例7と同じである。溶液の希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験:
抗菌薬の通性菌に対する抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度(MIC) を測定した。可能な限り、日本化学療法学会標準法に準じた。最終濃度が 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125%になるようにササエキスを含有させたMuellar Hinton 寒天平板 (Difco) を作製した。2NのNaOH水で、培地pH6.1~7.1に調整した。S. aureus ATCC 25922 およびE. coli ATCC25922に対するMICは2%であった。
接種菌液の調整と判定:
TSA寒天培地で24~48時間培養して得た被験菌株の集落を滅菌綿棒でかきとり、Mueller Hinton broth (Difco)中に浮遊させ、Mc Farland No 1の濁度の菌液を調整した。 その10μlをMueller Hinton broth 1 mlに浮遊させ、その10μl をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。35℃20時間好気環境下で培養後、発育の有無を肉眼で観察した。
結果を表32にまとめた。
1) Staphylococcus epidermidis 34, S.capitis 2, S.aureus 2, S.cohnii 1, S.hominis 1, S.haemolyticus 1, Staphylococcus sp. 3
試験液は試験例7と同じである。50(w/v)%の茶褐色で、芳香を有するやや粘性のある酸性の液体である。
抗菌力の試験法:嫌気性菌の抗菌薬の抗菌力測定法にならい、変法GAM寒天培地またはBrucella HK寒天培地を測定用基礎培地として、最小発育阻止濃度(MIC)を%で求めた。
供試菌株:Candida spp.とPrevotella bivia (14株)、Pigmened Prevotella spp.(9株)、Finegoldia, Micromonas, Peptostreptococcusの嫌気性球菌群(21株)、Mobiluncus spp.(12株)、Gardnerella vaginalis(11株) を用いた。
成績とまとめ
BV関連微生物の通性嫌気性菌と嫌気性菌およびCandida spp.に対するササエキスの抗菌力の程度、が明らかとなった。Candida spp.を3〜5%で、G. vaginalisの発育を6%の濃度で、Mobiluncus spp.を4%の濃度で、嫌気性球菌群を3%の濃度で、Prevotella spp.を1%の濃度で抑制した。
試験例24(ササエキスの偏性嫌気性菌に対する抗菌スペクトル)
嫌気性菌参考菌株を用いたpH6.0とpH7.0での検討
この試験例では、ササエキスの抗菌スペクトルを明らかにする目的で、一部の気難しい微好気性菌、通性菌(Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces, Sutterella)を含む教室保存の偏性嫌気性菌の多数株を使用して、ササエキスの抗菌作用を中性(pH7.0)と弱酸性(pH6.0)付近で検討した。
使用菌株:当施設に保存されていた参考菌株を用いた〔表33〜36〕。MIC精度管理用菌株として、Escherichia coli ATCC25922とStaphylococcus aureus ATCC25923も使用した。試験液は試験例7と同じである。希釈には滅菌蒸留水を使用した。
抗菌試験:抗菌薬の抗菌力測定法に用いられる寒天平板希釈法により最小発育阻止濃度を測定した。最終濃度が6.4, 3.2, 1.6. 0.8, 0.4, 0.2, 0.1%ササエキスを含有させた変法GAM寒天平板(日水製薬)を作製した。なお、2N水酸化ナトリウム水溶液と10%塩酸水を使用して、培地pHの調整を実施し、その目標をpH6.0とpH7.0とした。
Brucella HK血液寒天培地(極東製薬)で48時間培養して得た被験菌株の集落を使用して、Anaerobe Broth MIC (Difco)中にMcFarland#1の濁度の菌液を調整し、10倍希釈の後、その1白金耳をササエキス含有平板系列に画線塗抹法により接種した。本実験条件下では、1白金耳には、約104の細菌を含む。
嫌気ワークステーション(グンゼ産業)中で、35℃で、2日間培養後(Clostridiumでは、1日培養後)、発育の有無を肉眼で観察した。発育が認められた場合(+)と判定した。結果を表33〜36に示す。
接種菌量:108/ml 培養時間:48時間判定
備考:
Peptostreptococcus anaerobius ATCC27337, Peptostreptococcus asacchrolyticus WAL3218, Peptostreptococccus indolicus GAI0915, Peptostreptococcus prevotii ATCC9321, Micromonas micros VPI-5464-1, Finegoldia magna ATCC29328, Staphylococcus saccharolyticus ATCC14953, Atopobium parvulum VPI0546, Bifidobacterium bifidum JCM1255 は、pH6.0に発育せず。
接種菌量:107/ml 培養時間:35℃48時間
備考:
Prevotella heparinolytica ATCC35895, Porphyromonas asaccharolytica ATCC25260, Porphyromonas gingivalis ATCC33277, Bilophila wadsworthia WAL7959, Desulfovibrio piger DSM749は、pH6.0のエキス不含の対照培地で発育しなかった。
* Clostridium septicum, Clostridium sordellii, Clostridium perfringensは、ガス壊疽菌群の仲間に属する。
接種菌量:107/ml 培養:35℃24時間判定
まとめ
ササエキスの嫌気性菌群に対する抗菌スペクトルの概要が明らかになった。ササエキスに対するMICが3%以下の場合に強い抗菌力、4%〜6%の場合に、中等度の抗菌力、そして7%以上の場合に弱い抗菌力を示すと仮定した場合には、以下のように記述できる。
Claims (3)
- ササの水抽出物と有機酸とを含有する抗ウイルス剤であって、
前記抗ウイルス剤中のササの水抽出物の量が、固形分で2〜25質量%であり、
前記抗ウイルス剤中の有機酸の量が、0.01〜5質量%であり、且つ
ウイルスがヘルペスウイルスである、前記抗ウイルス剤。 - 有機酸が、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酢酸、安息香酸、フェニル酢酸、サリチル酸、及びフェノール類からなる群から選ばれる少なくとも1種である請求項1記載の抗ウイルス剤。
- 有機酸が、リンゴ酸である請求項2記載の抗ウイルス剤。
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