WO2003104453A1 - 抗体作製方法 - Google Patents

Abstract

標的抗原と背景抗原を含む免疫原を、背景抗原をコードする遺伝子を導入したトランスジェニック動物に投与する工程を含む、抗体の製造方法が提供された。トランスジェニック動物は背景抗原に対して免疫寛容の状態にあるので、標的抗原に対する抗体を効率的に産生する。

Description

抗体作製方法

技術分野

本発明は、 抗体の作製方法に関する。 また本発明は、 本発明の抗体作製方法に より得られた抗体に関する。 さらに本発明は、 本発明の抗体作製に有用な、 トラ ンスジエニック非ヒト動物に関する。 背景技術

抗体は様々な疾患の治療薬、 診断薬、 あるいは試薬などとして有用である。 現 在までに多くの抗体が取得されてきた。 抗体を作製するための一般的な方法とし ては、 抗原をマウスなどの哺乳動物に投与して、 該動物の血清から抗体を取得す る方法が用いられている。 抗体の作製において、 たとえば次のような場合には、 目的とする抗体を効率的に得られないことがある。

•哺乳動物に免疫する抗原の量が少ぃ

•抗原が十分に精製されていない

したがって、 免疫に当たっては、 十分に精製された多量の抗原を用意すること が望ましい。 しかし現実には、 抗原の中には精製が困難なものや、 十分な量を用 意することが困難なものも多い。 つまり抗原の調製工程が、 しばしば抗体作製に おける障害となっていた。

免疫原の調製が困難な抗原の一つとして、 膜蛋白質を示すことができる。 一般 に、 膜蛋白質を大量に発現させることや十分に精製することは困難な場合が多い このことが膜蛋白質に対する抗体の取得における障害となっていた。

膜蛋白質を大量に発現させる方法として、 バキュロウィルスを利用する方法が 注目されている。 目的の膜蛋白質をコードする遺伝子をバキュロウィルスゲノム に導入することによって、 出芽バキュロウィルスの膜上に目的の膜蛋白質が発現 される （W098/46777、 特開 200卜 333773) 。 これらの方法を用いるとバキュロウィ ルスの膜上に目的とする膜蛋白質を大量に発現させることができる。

ところが、 こうして得られるパキュロウィルスの膜上には、 外来性の膜蛋白質 以外にもバキュロウィルス由来の膜蛋白質が発現している。 そのため、 出芽バキ ュロウィルスを免疫原として抗体を作製した場合には、 バキュロウィルス由来の 膜蛋白質に対する抗体も産生される。 その結果、 公知の免疫方法によって効率よ く目的の膜蛋白質に対する抗体を作製することは困難であった。

たとえば、 出芽バキュロウィルスによる免疫は、 しばしば gp64を認識する抗体 を誘導する。 gp64は、 バキュロウィルスの膜蛋白質に大量に含まれている。 加え て、 gp64は、 抗原性が高いため免疫動物において非自己と認識されやすい。 結果 的に、 出芽バキュロウィルスは、 抗 gp64抗体を優先的に誘導すると考えられる。 したがって、 バキュロウィルス膜上に発現した目的の膜蛋白質を抗原として使 用するためには、 該膜蛋白質を十分に精製する必要がある。 ところが、 一般に出 芽バキュロウィルスから外来性の膜蛋白質を精製することは難しい。 したがって、 免疫に十分な量の、 高度に精製された膜蛋白質を得ることは、 現実にはできない といってよい。 このような精製が困難な抗原については、 通常の方法によって目 的とする抗体を得ることは困難であった。 発明の開示

本発明は上記の問題点を解決することを目的とする。 すなわち本発明は、 目的 とする抗体を容易に得ることができる抗体の製造方法の提供を課題とする。 また 本発明は、 目的とする抗体を効率良く産生するトランスジエニック非ヒト動物の 提供を課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するために、 免疫原に含まれる目的とする抗体の 取得を妨げる抗原の存在に着目した。 そして、 この種の抗原に対する免疫応答を 抑制した免疫動物を用いることによって、 目的とする抗体を容易に得ることがで きると考えた。 更に、 目的とする抗体の取得を妨げる抗原に対する免疫寛容を利 用して免疫動物の免疫応答を調節すれば、 上記課題を解決できることを見出し、 本発明を完成した。

すなわち本発明は、 以下の抗体作製方法、 該方法に有用なトランスジエニック 非ヒト動物、 並びに該非ヒト動物の製造方法に関する。

〔 1〕 免疫原に含まれている背景抗原に対して免疫寛容を有する非ヒト動物を、 標的抗原と背景抗原を含む免疫原で免疫し、 標的抗原に対する抗体または 抗体をコードする遺伝子を取得する工程を含む標的抗原を認識する抗体の 作製方法。

〔2〕 免疫寛容を人為的に誘導することを特徴とする 〔1〕 に記載の方法。

〔3〕 非ヒト動物がトランスジエニック非ヒ卜動物である 〔1〕 に記載の方法。 〔4〕 以下の工程を含む、 標的抗原に対する抗体の作製方法。

(a)標的抗原と背景抗原を含む免疫原を調製する工程、

(b)背景抗原をコードする遺伝子を発現可能に保持したトランスジエニック非 ヒ卜動物を作製する工程、

(c) (a)の免疫原を（b)のトランスジエニック非ヒト動物に投与する工程、 およ び

(d)トランスジエニック非ヒト動物から標的抗原に対する抗体を採取する工程 〔5〕 免疫原がウィルス粒子、 またはその一部である 〔4〕 に記載の方法。

〔6〕 ウィルスがバキュロウィルスである 〔5〕 に記載の方法。

〔7〕 標的抗原が膜蛋白質である 〔4〕 に記載の方法。

〔8〕 背景抗原が gp64である 〔6〕 に記載の方法。

〔9〕 非ヒト動物がマウスである 〔4〕 に記載の方法。

〔1 0〕 〔1〕 〜 〔9〕 のいずれかに記載の方法により作製された抗体。

〔1 1〕 〔1 0〕 に記載の抗体を元にして作製した非ヒト動物ーヒトキメラ抗体、 またはヒト型化抗体。

〔12〕 ウィルス由来膜蛋白質をコードする遺伝子が導入された卜ランスジェニ ック非ヒト動物。

〔13〕 ウィルスがバキュロウィルスである 〔12〕 に記載のトランスジェニッ ク非ヒ卜動物。

〔14〕 ウィルス由来膜蛋白質が gp64である 〔13〕 に記載の非ヒト動物。

〔15〕 非ヒト動物がマウスである 〔12〕 に記載の非ヒト動物。

〔16〕 ウィルス由来蛋白質を含む抗原に対する抗体製造用である 〔12〕 に記. 載の非ヒト動物。

〔17〕 背景抗原をコードする遺伝子を導入したトランスジエニック非ヒト動物 を作製する工程を含む非ヒト免疫動物の製造方法。

〔18〕 〔17〕 に記載の方法によって製造された、 背景抗原を含む標的抗原に 対する抗体を得るための非ヒト免疫動物。

〔19〕 次の工程を含む、 PepTlに対する抗体の製造方法。

a) PepTlまたはその断片をコ一ドする DNAを発現可能に保持したバキ ュロウィルスを調製する工程

b) a) のバキュロウィルスを宿主細胞に感染させ、 PepTlまたはその断 片を発現した出芽ウィルスを得る工程

c) バキュロウィルスの膜蛋白質 g_P64をコードする遺伝子を発現可能に 保持したトランスジエニック非ヒト動物を作製する工程

d) c) のトランスジエニック非ヒト動物に b) の出芽ウィルスまたは P epTlまたはその断片を含む分画を免疫する工程、 および

e) 免疫動物から、 PepTlを認識する抗体を回収する工程

本発明は、 免疫原に含まれている背景抗原に対して免疫寛容を有する非ヒト 動物を、 標的抗原と背景抗原を含む免疫原で免疫する工程を含む標的抗原を認識 する抗体の作製方法に関する。 本発明において、 標的抗原とは、 目的とする抗体が認識する抗原を言う。 標的 抗原は、 抗原性を有する任意の物質から選択することができる。 具体的には、 蛋 白質、 糖鎖、 脂質、 あるいは無機物質などが抗原性を示す物質として知られてい る。 標的抗原は、 天然に存在するものであることもできるし、 人工的に合成され たものであっても良い。 人工的に合成されたものには、 遺伝子工学技術を利用し て作製された組み換え蛋白質や、 化学的に合成された様々な有機物質が含まれる。 一方、 本発明において、 背景抗原（back ground ant igens)とは、 抗体の産生を 希望しない抗原決定基を有する物質、 またはその抗原決定基そのものを言う。 た とえば、 標的抗原に混在する標的抗原以外の抗原性物質は、 背景抗原である。 代 表的な背景抗原は、 粗精製状態の標的抗原に混在する蛋白質である。 より具体的 には、 組み換え蛋白質に含まれる宿主に由来する蛋白質を、 背景抗原として示す ことができる。 背景抗原とは、 目的とする抗体産生を誘導するための免疫原に含 まれ、 目的としない抗体の産生を誘導する原因となる抗原と定義することもでき る。

一般に、 背景抗原とは、 標的抗原以外の抗原性物質である。 しかし本発明にお いては、 標的抗原と同じ分子上に存在する抗原決定基を背景抗原と言う場合もあ る。 たとえば標的抗原と同じ分子上に抗体の産生を希望しない抗原決定基がある 場合、 該抗原決定基は背景抗原である。 あるいは背景抗原である抗原決定基を含 み、 かつ標的抗原を含まない物質は、 本発明における背景抗原に含まれる。

本発明における好ましい背景抗原として、 蛋白質、 ペプチド、 糖、 あるいは糖 タンパク質を示すことができる。 中でも、 蛋白質あるいはペプチドは、 本発明に おける特に好ましい背景抗原である。 ペプチドとは、 たとえば 1 0 0以下のアミ ノ酸残基からなるポリペプチドを言う。 ペプチドは蛋白質に含まれる。

本発明において免疫寛容（immunotolerance)とは、 免疫寛容の対象となる抗原 (寛容原； immunotolerance ant igens) に対して特異的に免疫応答が失われるか、 または低下することを言う。 正常な免疫動物の寛容原に対する免疫応答に対して、 ある個体の同じ寛容原に対する免疫応答が低下しているとき、 この個体は寛容原 に対する免疫寛容を有すると言う。 たとえば寛容原を投与した場合に産生される 寛容原に対する抗体の量が減少していれば、 免疫応答が低下していると見なすこ とができる。 免疫寛容のレベルは制限されない。

なお寛容原とは、 その個体の免疫応答が低下している抗原性物質を言う。 また 本発明において寛容原に対して特異的な免疫応答の低下とは、 他の抗原に対する 免疫応答と比較して、 寛容原に対する免疫応答の低下のレベルが大きいことを言 う。 したがって、 寛容原以外の抗原に対する免疫応答が低下していても、 その低 下のレベルが寛容原に対する免疫応答のレベルよりも小さい場合には、 免疫寛容 が成立している。 また本発明における免疫寛容は、 背景抗原以外の抗原性物質に 対する免疫寛容を伴っている場合も含む。 複数の抗原に対する免疫寛容を有する 場合であっても、 標的抗原に対する免疫応答を有する限り本発明に利用すること ができる。 一方、 免疫応答そのものが低下している免疫不全状態は、 標的抗原に 対する抗体の産生が期待できないので望ましくない。

本発明は、 背景抗原に対して免疫寛容を有する非ヒト動物を免疫動物として利 用する。 本発明における免疫寛容を有する非ヒト動物は、 人為的に免疫寛容を誘 導されていることが好ましい。 免疫寛容を有する非ヒト動物は、 たとえば次のよ うにして作製することができる。

まず、 背景抗原をコードする遺伝子を非ヒト動物に導入し、 背景抗原遺伝子ト ランスジエニック動物を作製することができる。 トランスジエニック動物は、 導 入された遺伝子の発現産物 （背景抗原） に対して免疫寛容となる。 また、 胎児期 ないし生後間もない非ヒト動物に寛容原 （背景抗原） を複数回投与することによ り、 免疫寛容を誘導することもできる。

胎児期または生後間もない非ヒト動物に寛容原となる抗原を投与する方法とし ては、 抗原となる物質そのものを非ヒト動物に投与する方法を示すことができる < その他、 寛容原を間接的に投与することもできる。 例えば、 生体内で寛容原をコ 一ドする遺伝子を発現させることによって、 目的とする寛容原を投与することも できる。 このような方法の例としては、 抗原をコードする DNAを直接投与する方法 (naked DNA me thod) や、 抗原を発現する細胞を非ヒト動物に移植する方法、 ゥ ィルスべクタ一を用いる方法、 DNAワクチンを用いる方法などを挙げることができ る。

これらの方法の中でも、 寛容原をコ一ドする遺伝子を発現可能な状態で保持し た卜ランスジエニック非ヒト動物は、 本発明における免疫寛容を有する非ヒト動 物として好ましい。 トランスジエニック動物は、 免疫機能が成熟する前に、 本来 は外来性の蛋白質である寛容原を生体内に有している。 そのため、 免疫機能は、 寛容原を完全に自己と見なす可能性が非常に高い。 したがって、 本発明における 免疫寛容を誘導する方法としては、 トランスジエニック非ヒト動物を利用するこ とは有利である。 寛容原を導入したトランスジエニック動物において、 寛容原に 対する抗体がほとんど産生されないことは、 実施例においても示したとおりであ る。

またトランスジエニック動物は、 免疫寛容の形質を子孫に伝えることができる < したがって、 本発明のためのトランスジエニック非ヒト動物が樹立されれば、 同 様の形質を有する免疫動物を安定して供給することができる。

本発明はまた、 ウィルス由来蛋白質を含む抗原に対する抗体製造用の、 ウィル ス由来膜蛋白質をコードする遺伝子が導入されたトランスジエニック非ヒト動物 に関する。 あるいは本発明は、 ウィルス由来膜蛋白質をコードする遺伝子発現可 能に保持したトランスジエニック非ヒト動物の、 ウィルス由来蛋白質を含む抗原 に対する抗体を製造するための免疫動物としての使用に関する。 更に本発明は、 背景抗原をコードする遺伝子を導入したトランスジエニック非ヒト動物を作製す る工程を含む非ヒト免疫動物の製造方法に関する。

様々な遺伝子が導入されたトランスジエニック非ヒト動物が公知である。 しか し背景抗原をコードする外来性遺伝子を導入した動物が、 背景抗原を含む標的抗 原の免疫動物として有用であることは知られていない。

標的抗原蛋白を欠失させた遺伝子欠損動物 （いわゆるノックアウト動物） は、 標的抗原を先天的に保有していないため、 この遺伝子欠損動物に、 標的抗原を投 与することにより、 抗原と投与される動物のそれとの相同性の高い蛋白であって も、 標的抗原に対する抗体を得ることができる。 この標的抗原欠損動物と当該ト ランスジエニック動物との交配で標的抗原蛋白欠損 ·寛容原発現動物も作出可能 である。

また、 胎児期あるいは生後間もない非ヒト動物に、 naked MA法や MAワクチン、 あるいは背景抗原を発現している細胞を移植する方法などにより胎児期以降に遺 伝子を導入することも可能である。 上記のように作製された非ヒト動物も本発明 のトランスジエニック非ヒト動物に含まれる。

本発明に用いる免疫寛容を有する非ヒト動物において、 免疫寛容を誘導するた めの背景抗原の数は限定されない。 すなわち、 少なくとも 1つの背景抗原に対し て、 免疫寛容が誘導された非ヒト動物を本発明の抗体作製方法に利用することが できる。 あるいは複数種の背景抗原に対して免疫寛容が誘導された非ヒト動物を 免疫動物とすることもできる。

免疫動物において、 免疫原に含まれる可能性のある、 全ての背景抗原に対して, 抗体の産生が抑制されることは必ずしも重要ではない。 標的抗原に対する抗体の 産生と取得が妨げられない範囲であれば、 背景抗原を認識する抗体の産生は許容 される。 したがって、 たとえば、 主要な背景抗原に対してのみ免疫寛容が誘導さ れた免疫動物であっても、 本発明の好ましい免疫動物として利用することができ る。

本発明において、 非ヒト動物としては、 例えば、 サル、 ブ夕、 ィヌ、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 などを挙げることができる。 たとえば、 ラット、 マウス、 ハム スターなどのげつ歯類は、 好ましい非ヒト動物である。 卜ランスジエニック動物 とすることで免疫寛容を誘導するには、 げっ歯類のような、 成熟が早く、 遺伝子 操作の手法が確立されている非ヒト動物が有利である。 特にマウスは、 これらの 条件を高い水準で満たすことができる非ヒト動物である。

本発明は、 ウィルス由来の膜蛋白質をコードする遺伝子を導入したトランスジ エニック非ヒト動物に関する。 本発明のトランスジエニック非ヒト動物は、 ウイ ルスの膜蛋白質が混在する標的抗原の免疫に有用である。 本発明におけるウィル スの膜蛋白質とは、 通常、 出芽ウィルスの外披を構成する蛋白質を言う。 バキュ ロウィルスであれば、 たとえば、 gp64と呼ばれる蛋白質が膜蛋白質に相当する。 たとえば、 バキュロウィルスの gp64に対する免疫寛容を有するトランスジェニ ック非ヒト動物は、 バキュロウィルス発現系で製造した免疫原の免疫動物として 有用である。 バキュロウィルス発現系は、 様々な蛋白質を製造することができる < したがって、 このトランスジエニック動物とバキュ口ウィルス発現系を組み合せ て利用することによって、 様々な蛋白質抗原を標的抗原として、 容易に目的とす る抗体を得ることができる。

本発明における免疫原は、 標的抗原と背景抗原を含む。 既に述べたとおり、 標 的抗原や背景抗原を構成する物質は特に制限されない。 免疫寛容を有する免疫動 物を、 背景抗原をコードする遺伝子の導入によって得る場合には、 背景抗原は蛋 白質である。 免疫原は、 標的抗原と背景抗原以外の物質を含むことができる。

また本発明において、 免疫原に含まれる背景抗原の種類は制限されない。 した がって、 標的抗原に対する抗体の産生を妨げる背景抗原が複数種含まれた免疫原 を本発明に用いることもできる。 免疫動物が各背景抗原に対していずれも免疫寛 容を有していれば、 これらの背景抗原の存在は問題とならない。 あるいは、 標的 抗原に対する抗体の取得を実質的に妨げることがない背景抗原については、 免疫 動物の免疫寛容の有無に関わらず、 免疫原に含まれることが許される。

一般に、 標的抗原は生物材料に由来する物質からなる。 生物材料は、 様々な成 分を含む複雑な混合物である。 したがって、 標的抗原は、 通常、 多様な混合物を 原料として調製されている。 その結果、 標的抗原を高度に精製することは困難で ある。 言いかえれば、 標的抗原を大量に、 かつ高度に精製するには、 多くの手間 と時間を要する。 つまり、 免疫原が、 標的抗原以外の物質を含むことは、 事実上、 避けられないといって良い。

具体的には、 本発明の免疫原として、 細胞、 細胞培養液、 細胞溶解物、 ウィル ス、 あるいは未精製の抗原などを挙げることができる。 細胞やウィルスなどは、 その全体のみならず、 その一部分のみを免疫原として用いることもできる。 例え ば、 細胞膜やウィルスェンベロ一プ部分のみを免疫原として用いることも可能で ある。 細胞やウィルスを用いる場合には、 目的の抗原をコ一ドする遺伝子を遺伝 子組み換え技術により細胞やウィルスに導入して、 目的の抗原を人為的に発現さ せたものを用いることができる。

本発明における望ましい免疫原の一つに、 ウィルス粒子、 またはその一部を示 すことができる。 ウィルスは、 核酸と、 限られた蛋白質や糖等の比較的単純な成 分で構成されている。 したがって、 標的抗原の取得を妨害する背景抗原の種類も 限られる。 つまり、 より少ない背景抗原についてのみ、 免疫動物の免疫寛容を誘 導すれば、 本発明に基づく抗体の作製方法を実施することができる。

本発明において、 免疫原として用いることができるウィルスの中では、 たとえ ばバキュロウィルス（Baculovi rus)が好ましい。 バキュロウィルスは、 2本鎖 DNA からなるゲノムがキヤプシド蛋白質に覆われた構造を有する昆虫ウィルスである 中でもバキュロウィルスの一種である核多角体病ウィルス（NPV)を利用した発現系 は、 外来性遺伝子の発現システムとして有用である。 NPVは強力なプロモーター活 性を有している。 したがって、 NPVのゲノムに外来性の遺伝子を組み込むことで、 任意の蛋白質を大量に生産させることができる。 具体的には、 ポリヘドリンと呼 ばれる蛋白質をコードする遺伝子を、 任意の遺伝子に組み換えることによって、 外来性の遺伝子の強力な発現が誘導される。

一方、 バキュロウィルスに導入する外来性遺伝子には、 任意の遺伝子を用いる ことができる。 外来性遺伝子として、 たとえば膜蛋白質をコードする遺伝子を用 いることもできる。

バキュロウィルスを用いることによって、 ウィルスの膜蛋白質とともに目的の 膜蛋白質を、 その構造を維持した状態で発現させることができる。 また、 発現生 成物を出芽ウイルスとして容易に回収できることも、 バキュロウィルス発現系の 大きな利点である。

膜蛋白質には、 受容体やトランスポーターなどの、 生物学的に重要な分子が多 い。 しかし、 多くの膜蛋白質は、 細胞膜に存在することによってその構造を維持 している。 また、 糖鎖や脂質による翻訳後修飾を伴うことも多い。 そのため膜蛋 白質は、 大腸菌などの原核生物を用いた発現系では、 しばしば本来の構造を再現 できない場合がある。

膜蛋白質等の外来性蛋白質のウィルス膜上への発現方法としては、 例えば、 TO9 8/46777及び Loi selら（T. P. Loi sel et al . , Nature Bi otech. 15 : 1300-1304 (199 7) )の出芽バキュロウィルスを用いた膜タンパク質の発現方法を挙げることができ る。 より詳細には、 外来性蛋白質をコードする遺伝子を含む昆虫細胞用の組換え ベクターを作製し、 バキュロウィルス DNAと共に Sf 9等の昆虫細胞へ導入する。 す ると、 組換えベクターにコードされる外来性蛋白質は、 感染細胞が死滅する前に 感染細胞より細胞外に放出される成熟ウィルス粒子（ビリオン)上に発現され、 外 来性蛋白質を発現する組換えウィルスを得ることができる。

本発明において、 出芽ウィルスとは出芽 (budding)により感染細胞から放出され るウィルスのことである。 一般に細胞膜を被ったウィルスは細胞が破壊されてい ない状態でも当該ウィルスに感染した細胞から発芽し、 継続的に放出されるのに 対し、 膜を被らないアデノウイルスや、 核膜を被ったヘルぺスウィルスは細胞が 破壊された時に一斉に放出される。 本発明においては、 特に出芽ウィルスが好ま しい。 また、 本発明において組換えウィルスを感染させる宿主は、 当業者であれ ば、 用いるウィルスの種類に応じて、 ウィルスの増殖を可能ならしめる宿主を適 宜選択することができる。 例えば、 バキュロウィルスを用いる場合、 Sf 9等の昆虫 細胞の使用が考えられる。 一般に、 バキュロウィルス-昆虫細胞を用いたタンパク 質発現系は、 哺乳動物細胞と同様に脂肪酸ァセチル化及び糖鎖付加等の翻訳と同 時または翻訳後の修飾が行われること、 並びに、 哺乳動物細胞系よりも異種タン パク質の発現レベルが高いこと（Luckow V.A. and Summers M.D., Virol. 167: 56 (1988))から有利な系であると考えられている。

外来性蛋白質を発現しているウィルスは、 例えば、 外来性蛋白質をコードする 遺伝子を含む組換えウィルスを感染させた宿主を培養することによって得ること ができる。 または、 上述の W098/46777及び Loiselら（T.P.Loisel et al., Nature Biotech. 15: 1300-1304 (1997))の方法の様に、 外来性蛋白質をコードする組換 えべクタ一をバキュ口ウィルスと共に昆虫細胞に導入することにより、 細胞外へ 放出されるバキュロウィルスの膜上に外来性蛋白質を発現させることもできる。 また、 Strehlowe. (D.Strehlow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 4209-421 4(2000)) の方法のように、 外来性蛋白質をコードする遺伝子を導入した Moloney ウィルス由来べクタ一より作製した組換えウィルスを PA317等のパッケージング細 胞に感染させることにより、 細胞外へ放出される Moloney murine leukemiaウィル スの膜上に外来性蛋白質を発現させることができる。 しかしながら、 本発明の免 疫原に用いることができる外来性蛋白質を発現しているウィルスは、 これらの方 法により調製されたものに限定されない。

上述のようにして調製された組換えウィルスは、 公知の手法により精製するこ とができる。 例えば、 増加密度勾配遠心法（augment densitygradient centrifuga tion) (Albrechtsen et al., J.Virological Methods 28: 245-256 (1990)； Hew is h et al., J.Virological Methods 7: 223-228 (1983))、 サイズ排除（size exclu sion)クロマトグラフィー (Hjorth and Mereno-Lopez, J.Virological Methods 5: 151-158 (1982)； Crooks et al., J.Chrom. 502: 59-68 (1990)； Men to S.J. (V iagene, Inc. ) 1994 Williamsburg Bioprocessing Conference) _¾ モノクロ一ナル 抗体及びフコース硫酸含有多糖類等を利用したァフィ二ティ - - (Naj ayou et al . , J. Vi ro logi cal Methods 32 : 67-77 (1991)； Di aco e t al . , J. Gen. Vi rol . 67 : 345-351 (1986)； Fowler, J. Vi rological Methods 11 : 59-74 (1986)； 特再表 97/032010)、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー (Haruna et al . , Vi ro logy 13 : 264-267 (1961) )等がウィルスを精製する方法として知られている _c したがって、 上述の方法、 または、 これらの方法を組み合せて精製しても良い。 本発明において、 免疫動物を免疫寛容とするための寛容原となる背景抗原は、 特に制限されない。 免疫原中に含有量の多い物質や抗原性の強い物質などを寛容 原とすることが好ましい。 例えば、 バキュロウィルスを免疫原として用いる場合 には、 gp64を寛容原とすることが好ましい。 gp64は、 ウィルス膜上に大量に発現 しており、 かつ免疫動物によって非自己と認識されやすい主要な背景抗原である ₍ バキュロウィルスは、 外来性蛋白質の発現系としては望ましい特徴を有してい る。 しかし一方で、 発現産物を免疫原として用いる場合には、 背景抗原の産生を 伴うという問題点を有しているといえる。 特に免疫原に用いるための膜蛋白質を バキュロウィルス発現系によって作製した場合には、 gp64の存在が大きな問題と なる。 gp64はウィルスの膜蛋白質に大量に含まれている。 そのため、 外来性の膜 蛋白質には、 gp64の混入が避けられない。

本発明の抗体作製方法によれば、 背景抗原による標的抗原に対する抗体取得の 妨害作用を抑制することができる。 したがって、 本発明を用いれば、 パキュロウ ィルス発現系の外来性蛋白質の発現システムとしての利点を、 免疫原の作製にお いても十分に生かすことが可能となる。

本発明において、 天然のウィルスやその部分を免疫原とすることもできる。 天 然のウィルスにおいても、 ウィルスの特異的な検出や、 感染の予防または治療に おいて、 特定の抗原決定基を認識する抗体は、 重要である。 そして、 主要な抗原 に対する抗体が生成されやすいのに対して、 特定の抗原決定基を認識する抗体を 得ることがしばしば困難であることも、 先に述べたバキュロウィルス発現産物を 免疫原に利用する場合と共通している。 天然のウィルスを本発明の免疫原として用いる場合には、 ウィルスを構成する 蛋白質のうち、 背景抗原として作用する蛋白質をコードする遺伝子を非ヒト動物 に導入してトランスジエニック動物とする。 一方、 免疫原としては、 ウィルス粒 子そのもの、 あるいは標的抗原を含むウィルスの部分を用いる。 こうして、 標的 抗原を認識する抗体を、 効率的に得ることができる。

たとえばインフルエンザウイルスの表面抗原は、 ウィルスの株を決定する重要 な抗原である。 インフルエンザの株ごとに、 その株に固有の表面抗原を認識する 抗体を容易に得ることができれば、 ウィルスの同定や、 感染の予防または治療に 有用である。 しかしウィルス粒子をそのまま免疫原とした場合には、 ウィルスに 共通する構造を認識する抗体も多く産生される。

本発明を利用して、 インフルエンザウイルスに共通するエンベロープ蛋白質に 対して免疫寛容としたトランスジエニック非ヒト動物を利用すれば、 各株に固有 の表面抗原を認識する抗体を効率的に得ることができる。 すなわち、 ウィルス株 に固有の表面抗原を標的抗原とし、 ウィルスに共通の構造を背景抗原として、 本 発明を応用することができる。

本発明の抗体作製方法の好ましい態様を次に述べる。 この態様においては、 膜 蛋白質を標的抗原として用いる。 膜蛋白質としては、 ヒト由来の膜蛋白質などを 用いることができる。

まず標的蛋白質をバキュロウィルス膜上に発現させ、 該バキュ口ウイルスを免 疫原として用いる。 バキュロウィルスを用いた膜蛋白質の発現方法としては、 例 えば、 W098/46777, 特開 200卜 333773及び Loi selら（T. P. Loi sel et al .， Nature Biotech. 15 : 1300-1304 (1997) )の出芽バキュロウィルスを用いた膜蛋白質の発 現方法を利用することができる。

より詳細には、 膜蛋白質をコードする遺伝子を含む昆虫細胞用の組換えべクタ 一を作製し、 バキュロウィルス DNAと共に昆虫細胞へ導入する。 昆虫細胞には、 Sf 9細胞等が利用される。 組換えベクターにコードされる膜蛋白質は、 感染細胞が死 滅する前に感染細胞より細胞外に放出される成熟ウィルス粒子 （ビリオン） 上に 発現される。 したがって成熟ウィルス粒子の回収によって、 膜蛋白質 （標的抗 原） を発現している出芽バキュロウィルスを得ることができる。 培養細胞から出 芽バキュロウィルスを回収する方法も公知である。 このようにして得た膜蛋白質 (標的抗原） を発現している出芽バキュロウィルスを本発明における免疫原とし て用いる。

バキュロウィルス膜上には膜蛋白質 （標的抗原） 以外にもバキュロウィルス由 来の膜蛋白質が発現していることは既に述べたとおりである。 特に gp64はバキュ ロウィルス膜上に大量に発現しており、 かつ抗原性が高い。 したがって出芽バキ ュロウィルスを免疫すると抗 gp64抗体が産生されてしまい、 膜蛋白質 （標的抗 原） に対する抗体を効率よく取得できない。

そこで本発明においては、 免疫動物として、 gp64を発現する動物を用いる。 具 体的には、 gp64をコードする遺伝子を含むベクターの導入によって gp64を発現す るトランスジエニック動物を作製する。 トランスジエニック動物としては、 非ヒ ト動物が用いられる。 たとえば、 gp64遺伝子を導入したトランスジエニックマウ スが本発明における免疫動物に用いられる。

本発明においては、 該トランスジエニックマウスが、 先に取得した出芽バキュ ロウィルスで免疫される。 gp64発現トランスジエニックマウスは gp64を Endogenou sに発現するので、 背景抗原である gp64に対して免疫寛容になっている。 つまり出 芽バキュロウィルスで免疫したときの、 抗 gp64抗体の産生が抑制される。 その結 果、 標的抗原である膜蛋白質に対する抗体を効率よく産生することができる。

トランスジエニックマウスの作製方法は公知である。 例えば、 Proc. Nat l . Ac a d. Sc i . USA 77 : 7380-7384 (1980)に記載の方法により、 トランスジエニックマウ スを得ることができる。 具体的には、 目的の遺伝子を哺乳動物の全能細胞に導入 し、 この細胞を個体へと発生させる。 得られた個体のうち、 体細胞および生殖細 胞中に導入遺伝子が組み込まれてた個体を選別することによって、 目的とするト ランスジエニックマウスを作製することができる。 遺伝子を導入する全能細胞と しては、 受精卵や初期胚のほか、 多分化能を有する ES細胞のような培養細胞など が挙げられる。

より具体的には、 たとえば後で述べる実施例の方法により作製できる。

本発明の抗体の作製方法は、 モノクローナル抗体ゃポリクローナル抗体の作製 に利用することができる。 免疫動物から標的抗原に対する抗体を採取することに よって、 ポリクローナル抗体を得ることができる。 あるいは、 免疫動物の抗体産 生細胞をクローン化することによって、 モノクローナル抗体を産生する抗体産生 細胞を得ることもできる。

更に、 マウスなどの免疫動物に由来する抗体、 あるいはその遺伝子を利用して、 免疫動物とヒトのキメラ抗体や、 ヒト型化抗体を得ることもできる。 これらの改 変された構造を有する抗体の作製方法も公知である。

更に本発明は、 本発明の方法によって得ることができる抗体に関する。 本発明 の抗体は、 上^のような方法を含む工程によって得ることができるあらゆる抗体 を含む。 したがって、 たとえばモノクローナル抗体、 ポリクロ一ナル抗体、 免疫 動物とヒトのキメラ抗体、 ヒト型化抗体、 あるいはヒト抗体は、 いずれも本発明 に含まれる。 たとえば、 免疫システムをヒトの免疫システムに置換されたトラン スジエニックマウスが公知である。 このようなマウスに免疫することによって得 ることができる抗体は、 ヒト抗体である。

本発明における好ましい抗体として、 ヒト膜蛋白質を認識する抗体を示すこと ができる。 膜蛋白質は、 創薬ターゲットとして重要なものが多く含まれる。 一方 で、 精製が困難なために、 特異的な抗体を得ることが難しいとされていた。 しか し本発明によって、 遺伝子組み換えによって作製された、 背景抗原と共存した状 態にある膜蛋白質であっても、 目的とする抗体を効率良く得ることが可能となつ た。 膜蛋白質としては、 たとえば PepTlは重要な分子である。 PepTlの塩基配列、 アミノ酸配列は既に知られている (ヒト PepTl： GenBank XM 007063、 J. Biol . Chem. 270 (12)： 6456-6463 (1995)； マウス PepTl： GenBank AF205540、 Biochim. Bioph ys. Acta. 1492 : 145-154 (2000) ) „

PepTlに対する抗体の中でも、 PepTlの細胞外領域に結合する抗体は有用である。 特に PepTlの細胞外領域に特異的に結合する抗体は、 本発明による望ましい抗体で ある。 本発明において、 細胞外領域に対する特異的な結合とは、 PepTlの細胞外領 域とそれ以外の領域を免疫学的に識別しうることを言う。 より具体的には、 細胞 外領域には結合するが、 細胞内領域等や膜貫通ドメインとは結合しない抗体を、 P epTlの細胞外領域に特異的に結合する抗体と言うことができる。 本発明において、 好ましい PepTlは、 ヒト PepTlである。 ヒト PepTlは、 ヒトに由来のみならず、 ヒト PepTlをバキュロウィルス発現系で発現させて得ることができる組み換え体である こともできる。

免疫原に用いられるヒト PepTlは、 標的抗原の構造を維持していれば、 必ずしも 完全な分子である必要はない。 たとえば、 PepTlの細胞外領域を含む断片を免疫原 とすることもできる。 本発明における免疫原として好ましい PepTlは、 トランスポ —ト活性を有するヒト PepTl、 または全長ヒト PepTlである。 中でも、 トランスポ ―ト活性を有する全長ヒト PepTlは特に好ましい。 ヒト PepTlのトランスポ一ト活 性は、 基質を細胞内に取り込む作用を指標として検知することができる。 PepTlは グリシルザルコシン等を基質として取りこむことが知られている。 グリシルザル コシンの取りこみは、 [¹⁴C]ダリシルザルコシン等を利用することにより評価する ことができる。

ヒト PepTlは膜上 （例えば、 ウィルス膜や細胞膜など） に発現していることが好 ましい。 ウィルス膜上に発現させた PepTlのトランスポ一ト活性は、 ウィルス溶液 と基質とを接触させ、 ウィルスによる基質の取りこみを観察することによって検 出することができる。

免疫から抗体取得までの方法は公知の方法を用いることができる。 免疫原によ る動物の免疫は、 公知の方法にしたがって行われる。 一般的方法としては、 感作 抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。 具体的には、 免疫原を PBS (Phospha te - Buf fered Sal ine)や生理食塩水等で適当量に希釈、 懸濁したものに対し、 所望 により通常のアジュパントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に投与する。 アジュ バントには、 たとえばフロイント完全アジュバントが用いられる。 さらに、 その 後、 フロイン卜不完全アジュバントに適量混合した免疫原を、 4〜21日毎に数回投 与することが好ましい。

また、 免疫原の免疫時に適当な担体を使用することができる。 このように免疫 し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。

目的の抗体を得るためには、 血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認 した後、 免疫した動物の血液を採取する。 そして採取した血液から公知の方法に より血清を分離する。 ポリクロ一ナル抗体としては、 ポリクローナル抗体を含む 血清を使用してもよいし、 必要に応じこの血清からポリク口一ナル抗体を含む画 分をさらに単離して、 これを使用してもよい。

例えば、 目的の抗原をカップリングさせたァフィ二ティ一カラムを用いて、 目 的の抗原のみを認識する画分を得て、 さらにこの画分をプロティン Aあるいはプロ ティン G力ラムを利用して精製することにより、 免疫グロブリン Gあるいは Mを調製 することができる。

モノクローナル抗体を得るには、 上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望 の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳動物から抗体産生細胞を採取し てクローニングする。 抗体産生細胞としては、 たとえば脾細胞を用いることがで きる。 抗体産生細胞のクローエングには、 細胞融合法を用いることができる。 前 記抗体産生細胞と融合される他方の親細胞としては、 たとえば哺乳動物のミエ口 一マ細胞が用いられる。 より好ましくは、 融合細胞 ひ、イブリドーマ） の選択マ 一力一となる、 特殊な栄養要求性や薬剤耐性を有するミエローマ細胞が挙げられ る。

前記抗体産生細胞とミエローマ細胞は、 基本的には公知の方法に準じて細胞融 合させることができる。 細胞融合を利用したモノクローナル抗体の作製方法は、 たとえばミルスティンらによって確立されている（Gal f re, G. and Mi l s tein, ， Methods Enzymol . (1981) 73, 3-46) ₀

細胞融合により得られたハイプリドーマは、 選択培養液で培養することにより 選択される。 選択培養液は、 細胞融合に用いたミエローマ細胞の特性などに応じ て選択される。 選択培養液としては、 たとえば、 HAT培養液 （ヒポキサンチン、 ァ ミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） が用いられる。 ハイプリドーマは、 目的とするハイプリドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間、 当該 HAT培養液で培養される。 通常、 数日〜数週間培養を継続することにより、 ハ イブリドーマを選択することができる。 次いで、 通常の限界希釈法を実施し、 目 的とする抗体を産生するハイプリドーマのスクリーニングおよびクロ一ニングを 行う。

次いで、 得られたハイプリドーマをマウス腹腔内に移植し、 同マウスの腹水と してモノクローナル抗体を回収することができる。 腹水からモノク口一ナル抗体 を精製することもできる。 モノクローナル抗体の精製には、 例えば、 硫安沈殿、 プロテイン A、 プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 目的の 抗原をカップリングしたァフィ二ティ一カラムなどを利用することができる。

ハイプリドーマを用いて抗体を産生する以外に、 抗体を産生する感作リンパ球 等の抗体産生細胞を癌遺伝子 (oncogene)やウィルスなどを用いること等により不 死ィ匕させた細胞を用いることもできる。 細胞を不死化するためのウィルスとして は、 ェプスタインバーウィルス（EBV)などを用いることができる。

このように得られたモノクローナル抗体はまた、 遺伝子組換え技術を用いて産 生させた組換え型抗体とすることができる （例えば、 Borrebaeck, C. A. K. and Larr ick, J. W. , THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publ i shed in the Uni te d Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。 組換え型抗体は、 それを コードする DNAをハイプリドーマ、 または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産 生細胞からクロ一エングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し 産生させる。 本発明は、 この組換え型抗体を包含する。

さらに、 本発明の方法により得られた抗体は、 その抗体断片や抗体修飾物であ つてよい。 たとえば、 抗体断片としては、 Fab、 F(ab')2, Fv又は重鎖と軽鎖の Fv を適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv(scFv) (Huston, J. S. et a l.， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879— 5883)が挙げられる。 具体 的には、 抗体を酵素、 例えば、 パパイン、 ペプシンで処理し抗体断片を生成させ ることによって、 抗体断片を得ることができる。 または、 これら抗体断片をコ一 ドする遺伝子を構築し、 これを発現ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で発 現させる （例えば、 Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ； B etier, M. and Horwitz, A. H.， Methods Enzymol. (1989) 178， 476-496 ； Pluc kthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ； Lamoyi, E. , Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ； Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663—669 ； Bird, R. E. and Walker, B. W. , Trends Biot echnol. (1991) 9, 132 - 137参照）。

抗体修飾物として、 ポリエチレングリコール （PEG) 等の各種分子と結合した抗 体を使用することもできる。 本発明の 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含さ れる。 このような抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的な修飾を施すこ とによって得ることができる。 これらの方法はこの分野において既に確立されて いる。

また、 ヒト抗体の取得方法も知られている。 ヒト抗体遺伝子の全てのレパート リーを有するトランスジエニック動物を目的の抗原で免疫することで目的のヒト 抗体を取得することができる （国際特許出願公開番号 W0 93/12227, W0 92/03918, W0 94/02602, W0 94/25585, W0 96/34096, W0 96/33735参照) 。

また、 本発明の方法により得られた抗体は、 免疫動物に由来する非ヒト抗体由 来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体とすることができる c また免疫動物に由来する非ヒト抗体の CDR (相補性決定領域） とヒト抗体由来の FR

(フレームワーク領域） および定常領域からなるヒト型化抗体とすることもでき る。

これらの改変抗体は、 既知の方法を用いて製造することができる。 具体的には、 たとえばキメラ抗体は、 免疫動物の抗体の重鎖、 および軽鎖の可変領域と、 ヒト 抗体の重鎖および軽鎖の定常領域からなる抗体である。 免疫動物由来の抗体の可 変領域をコードする DNAを、 ヒト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し、 これ を発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによって、 キメラ抗体 を得ることができる。

ヒト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体とも称される改変抗体である。 ヒト型化抗体は、 免疫動物由来の抗体の相補性決定領域 （CDR; co即 l einentar i ty determining regi on) を、 ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構 築される。 その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。

具体的には、 マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームヮ一ク領域 （f ramework re gion； FR) を連結するように設計した DNA配列を、 末端部にオーバ一ラップする部 分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドから PCR法により合成する。 得られた DNAをヒト抗体定常領域をコードする DNAと連結し、 次いで発現ベクター に組み込んで、 これを宿主に導入し産生させることによりヒト型化抗体を得られ る （欧州特許出願公開番号 EP 239400 、 国際特許出願公開番号 W0 96/02576参照） 。 CDRを介して連結されるヒト抗体の FRは、 相補性決定領域が良好な抗原結合部位を 形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適 切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミ ノ酸を置換してもよい （Sato， L et al . , Cancer Res. (1993) 53, 851-856) 。 更に、 免疫動物の抗体産生細胞から、 抗体をコードする遺伝子を取得すること ができる。 抗体をコードする遺伝子を取得する方法は、 制限されない。 たとえば、 可変領域や CDRをコードする遺伝子を铸型として、 PCR法によって当該遺伝子を増 幅することによって抗体をコードする遺伝子を得ることができる。 抗体遺伝子を P CR法によって増幅するためのプライマーが公知である。 得られた遺伝子を適当な 発現系を用いて発現させることによって、 目的とする抗体を製造することができ る。 あるいは、 本発明によって得られた遺伝子を、 先に述べた種々の改変抗体を 製造するために利用することもできる。

前記のように得られた抗体は、 均一なィムノグロプリン分子にまで精製するこ とができる。 精製方法は、 特に限定されない。 本発明で使用される抗体の分離、 精製は通常のポリペプチドで使用されている分離、 精製方法を使用すればよい。 例えば、 ァフィ二ティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、 フ ィルター、 限外濾過、 塩析、 透析、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、 等電点 電気泳動等を適宜選択、 組み合わせれば、 ィムノグロブリンを分離、 精製するこ とができる (Antibodies ： A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Co Id Spring Harbor Laboratory, 1988) 。 上記で得られた抗体の濃度は、 吸光度の 測定、 または酵素結合免疫吸着検定法 (Enzyme-linked immunosorbent assay； ELI SA)等により測定することができる。

ァフィ二ティ一クロマトグラフィーに用いるカラムとしては、 プロテイン A力 ラム、 プロテイン Gカラムが挙げられる。 例えば、 プロテイン Aを用いたカラム として、 Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。

ァフィ二ティークロマ卜グラフィ一以外のクロマトグラフィーとしては、 例え ば、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 逆 相クロマトグラフィ一、 吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization ： A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。 これらのクロマトグラフィーは HPIX、 FPLC等の液相クロマトグラフィ一を用いて 行うことができる。 図面の簡単な説明

図 1および図 2は、 構築した gp64遺伝子の塩基配列を表す図である。

図 3は、 実施例において構築した pCAG-gp64ベクターの構造を表す図である。 図 4は、 Founderマウスの精巣を示す写真である。

図 5は、 ノーザンプロット法による mRNA発現解析の結果を示す写真である。 図 中の Hは心臓、 Bは脳、 Iは腸、 Mは筋肉を表す。

図 6は、 Ant i-Mouse IgGによるウェスタンブロット解析の結果を示す写真であ る。 図中、 preは免疫前採血、 2ndは 2回免疫後採血を表す。

gp64TgM:トランスジエニックマウス、 wtBALB/c : non-トランスジエニックマウス 図 7は、 Ant i- Mouse IgMによるウエスタンプロット解析の結果を示す写真であ る。

gp64TgM:トランスジエニックマウス、 wtBALBA: :non-トランスジエニックマウス 図 8は、 マウス血清中の pepT 1特異的抗体の抗体価を FACSによつて解析した結果 を表す図である。 図中、 縦軸は細胞数 （対数） を、 また横軸は蛍光強度を示す。 (上） マウス #1、 (下） マウス #2

図 9は、 図 8と同じ実験の結果を表す図である。 （上） マウス #3、 （下） 抗体 なし 発明を実施するための最良の形態

以下、 本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。

1 ) gp64トランスジエニックベクターの構築

gp64の塩基配列を配列番号： 3に、 また gp64遺伝子によってコードされるアミ ノ酸配列を配列番号： 4に示す （GenBank Acc No. 9627742) 。 gp64の遺伝子配列 を铸型とし6じ 1認識配列と!(02八1(配列を5'末端に有する5' 01^1116 64F1 (配列番 号： 1 ) と EcoRI認識配列を 5'末端に有する 3' pr imer 64R1 (配列番号： 2 ) を用 7071

- 24 - い （図 1および図 2) 、 以下の条件で PCRを行った。

PCR反応溶液の組成は、 xlO ExTaq buffer 5^L, ExTaq付属 dNTP Αμ,Ι, lO^mol e/L 64F1 I ill, lO^mole/L 64R1 l^L, 500 pg/^L pBac-N-blue l^L, 5 unit/ Hi ExTaq 0.5^L, diw 37.5 Lとした。 反応シーケンスは次のとおりである。

94°C 5min →

(94°C 15sec, 57°C 30sec, 72°C 30sec) x 25 cycles →

72°C 7min. →

4°C forever

増幅されたバンドを pGEM-Teasyにサブクロ一ニング後、 E.coli DH5aをトラン スフオームした。 T7および SP6プライマーを用いて colony PCRを行い、 インサート が確認されたクロ一ンを用いて ABI Prism377 DNA sequencerと BigDye Cycle Sequ ence kitと T7プライマ一あるいは SP6プライマ一により塩基配列を解析し目的の遺 伝子を含むクローンを確認した。 このクローンから塩基配列に変異が入っていな いことを確認した gp64を含む断片を EcoRIにより切り出し、 同じく EcoRIカツ卜し た pCAGGSlに挿入し、 E.coli DH5 αをトランスフォームした。 設計通りのクローン を 250 mLの LB培地を用い 37°Cでー晚培養し、 Endofree MAXI kitを用いて精製し 58 1.6 gのプラスミドを得た。

2) 遺伝子の導入

インジェクション用 DNAフラグメントは、 次のようにして調製した。 まず gp64遺 伝子を揷入した pCAGGSベクタ一 (pCAG- gp64；図 3)を、 Sailおよび Pstlで処理した 後、 gp64遺伝子を含む断片 (約 3.8kb)を切り出した。 この断片 (約 3.8kb)を、 Gel E xtraction Kit (QIAGEN)により回収し、 3 ng/ 1になるように PBS—で希釈してィ ンジェクション用 DNAフラグメントとした。

DNAフラグメントを注入するマウス前核期卵は、 次のようにして回収した。 すな わち、 まず BALB/c系雌マウス（日本クレア）に 5 i.uの PMSGを腹腔内投与、 さらに 48 時間後 5 i.uの hCGを腹腔内投与することによって、 過排卵処理した。 この雌マウ スを同系統の雄マウスと交配させた。 交配の翌朝、 プラグを確認したマウスの卵 管を灌流してマウス前核期卵を回収した。

インジェクション用 DNAフラグメントは、 マイクロマニピユレ一ターを用いて前 核期卵へ注入した （ジーン夕ーゲティングの最新技術 （羊土社） 、 190-207 200 0) 。 DNAフラグメントを 373個の BALB/c胚へ注入し、 翌日、 2細胞期に発生してい た胚 216個を、 偽妊娠 1日目の受容雌の卵管に片側当たり 10個前後 （1匹あたり 20個. 前後） を移植した。

分娩予定日に至つても産仔を娩出しなかつた受容雌については、 帝王切開を施 し里親に哺育させた。 結果を表 1にまとめた。 50例の産仔が得られ、 そのうちの 4 例が gp64遺伝子が導入されたトランスジエニックマウス （以下、 Tgmと記載する） であった。 以下、 最初に得られたマウスを Founderと記載する。

Founderは全て雄マウスで、 これら 4ラインの内 2ライン （No. 30, No. 31) から、 それぞれ 4匹、 20匹の産仔 （F1マウス） が得られた。 得られた F1マウスの遺伝子型 解析を行ったところ、 ライン 30では Tgmが 3例存在しており、 gp64遺伝子の次世代 への伝達を確認した。 しかしながら、 ライン 31では 20例全例において gp64遺伝子 が確認されない野生型のマウス （non-Tgm) であったことから、 ライン 31の Founde rマウスは gp64遺伝子がモザイク状態で挿入されたマウスであつたと思われた。 ま た、 ライン 34、 46の Founderマウスは繁殖能がなく、 全く産仔が得られなかった。 ライン 30の Founderマウスについても、 交配開始直後の 1腹分のみ相手雌を妊娠さ せることができたが、 これ以降全く産仔が得られなくなってしまった （表 2 ) 表 2

そこで、 体外受精を行うため、 ライン 30、 34、 46の Founderマウスの精子採取を 試みたが、 これら 3例とも精巣が異常に小さく（図 4)、 精巣上体尾部には精子が存 在せず、 体外受精を行うことはできなかった。 以上の結果から、 gp64蛋白質が、 マウス造精能に影響を与えることが発見された。 従って gp64は避妊等に応用でき る可能性があると考えられる。

3 ) 導入遺伝子の確認

3週齢になった時点でマウスの尾から DNAを、 核酸自動分離装置 （KURAB0) を用 い抽出し、 サザンプロット法および 1PCR法による導入遺伝子の確認を行った。 サザ ンブロット法による導入遺伝子の確認は、 15 x gの genome DNAを EcoRI処理、 泳動 後、 ナイロンメンブレンへトランスファーし、 EcoRI処理した pCAG-gp64ベクター の gp64を含む約 1. 5kbの断片をプローブに用い、 トランスファ一した DNAと八イブ リダィズさせることにより行った。 また約 100ngの DNAをテンプレートとし、 次の 1

- 2 7 - プライマーを用いた PCR法によって導入遺伝子を確認した。

センスプライマ一 64F1 (配列番号： 1 ) ：

GAATTCCACCATGGTAAGCGCTATTGTT

アンチセンスプライマ一 64R1 (配列番号： 2 ) ：

GAATTCTTAATATTGTCTATTACGGT

PCRの反応シーケンスは次のとおりである。

94 5min→

(94°C 15sec, 57°C 30sec, 72°C 30sec) x 35 cyc les →

72°C 7min→

4°C forever

PCR産物を泳動し、 約 1. 5kbのバンドの有無に基づいて導入遺伝子を確認した。

4 ) gp64Tgmにおける gp64遺伝子の発現確認

gp64遺伝子の次世代への伝達が確認できたライン 30の Founderマウスにおいて、 ノーザンプロット法によって gp64遺伝子の発現を確認した。 Total RNAを、 IS0GEN (二ツボンジーン） を用いて、 心臓、 脳、 小腸、 大腿筋の 4臓器より回収した。 20 の total RMを電気泳動し、 ナイロンメンブレンへトランスファーした。 EcoRI 処理した pCAG-gp64ベクタ一の gp64を含む約 1. 5kbの断片をプローブとした。 べク 夕一コンストラクトから予想されるバンドは 1. 5k程度である。

結果を図 5に示した。 少なくとも心臓、 脳、 大腿筋でその発現が確認できた。 バンドが 3本見られたが、 その原因は不明である。

5 ) ライン 30雌 Tgmの繁殖能 （マウスの交配）

8週齢になった時点で同系統のマウスとの交配を開始した。

その結果、 3匹の F1雌マウスから各 2産の産仔、 合計で 3 1匹（早 14、 d 7)の産 仔 （F2) が得られた （表 3 ) 。 得られた産仔のうち、 U匹 （早 5、 ^ 9 ) が Tgmで あった。 また、 3産目の産仔も得られており、 雌 Tgmの繁殖能は正常であった。 表 3

6 ) PepTl発現出芽バキュロウィルスの調製

免疫原として用いる、 PepTl発現出芽バキュロウィルスを次のようにして調製し た。 PepTlは、 膜蛋白質であるトランスポー夕一である。 PepTlの構造は公知であ る（GenBank XM— 007063、 J. Biol. Chem. 270 (12) : 6456-6463 (1995))。

ヒト腎臓ライブラリーから PCRを用いて完全長の PepTl遺伝子を単離した。 完全 長のヒト PepTl遺伝子を pBlueBacHis2A (Invi trogen) に挿入することでトランス ファーべクタ一 pBlueBacHi s- PepTlを作製した後、 Bac-N-Blue transfect ion ki t (Invi trogen) を用いて Bac- N- Blue DNAと共にトランスファーベクターを Si9細胞 に導入することでヒト PepTl発現用組換えウィルスを調製した。 即ち、 4 gの pBlu eBacHis- PepTlを Bac_N- Blue DNAに加え、 さらに lmLの Grace' s培地（GIBCO) 20 / Lの Cel l FECTIN試薬を加え、 混和し、 室温で 15分間静置した後、 Grace' s培地で 1回洗 浄した 2 X 個の Sf9細胞に滴下した。 室温で 4時間静置した後、 さらに 2mLの完全 培地（10%ゥシ胎児血清（Sigma社製）、 lOOuni ts/mLのペニシリン、 及び 100 g/mL ストレプトマイシン（GIBCO- BRL社製）を含む Grace' s培地）を加え、 27°Cで培養した _c 相同組換えにより作製されたヒト PepTl発現用組換えウィルスはキット添付の指示 書に従い二度の純化を行った後、 組換えウィルスのウィルスストックを得た。

ヒ卜 PepTlを発現する出芽型ウィルスの調製は以下のようにして行った。 すなわ ち、 上記により調製した組換えウィルスを M0I= 5となるように 500mLの Si9細胞（2 X lOVmL)に感染させた。 27°Cで 3日間培養した後、 培養液を 800 Xgで 15分間遠心 分離し、 細胞ならぴに細胞破砕物を除去した。 遠心分離により回収した上清は 45, OOOXgで 30分間遠心した後、 沈殿物を PBSに懸濁し、 さらに 800 Xgで 15分遠心する ことで細胞成分を除去した。 上清は再度 45， OOOXgで 30分間遠心した後、 沈澱物を PBSに再懸濁したものを出芽型ウィルス画分とした。 ウィルスならびに Sf-9細胞膜 上での PepTl発現は抗 His抗体を用いたウェスタン解析で確認した。 また、 タンパ ク質濃度は Dc Protein Assay kit (Bio-Rad) を用い、 BSAを標準物として測定し た。

7) マウスの免疫

Difcoのフロイント完全アジュバントと不完全アジュバントを用いて常法に従つ てェマルジョンを作製した免疫原を皮下投与して免疫した。 初回免疫量は lmg/mic eで、 2回免疫量は 0.5mg/miceとした。 また 2回免疫は初回免疫から 14日後に行った。 初回免疫から 17日後に眼窩採血し、 血清を採取した。

8) Western blotによる gp64に対するトレランスの確認

pepTl- BVを 12% Gelを用いて 1 /^g/laneで還元条件下 SDS-PAGEを行った。 泳動後 P VDF膜にエレクトロブロットした。 この膜に 1/1000希釈した血清を反応させ、 順次 洗浄を挟み、 1/1000希釈 Biot in- Anti-Mouse IgG(r) (Zymed)と Streptavidin- Alka linPhosphatase(Zymed)を反応させた。 発色はアルカリホスファタ一ゼ染色キット (ナカライ）を用いて行つた。 gp64検出用の陽性コントロール抗体は N0VAGENから購 入して用いた。

結果を図 6に示す。 Anti- Mouse IgGによる染色では non-トランスジエニックマ ウスでは 2匹とも強く染色されていた。 一方 gp64トランスジエニックマウスでは 3 匹とも gp64が染まるものの染色の度合いは弱く、 抗 gp64抗体量が non-トランスジ エニックマウスに比べ相当少ないことが確認された。 Anti-Mouse IgMによる染色 では non-トランスジエニックマウスが 2匹とも弱く染色されているのに対し、 gp64 トランスジエニックマウスでは非常に弱いか全く染色されないことが確認された

(図 7) 。

8) gp64TgMによる抗 pepTl抗体作製 初回免疫は以下の手順で行った。 pepTl- BV lmg及び per tus s i s toxin l OOngが入 つた PBS 200 Lを皮下投与した。 2回目以降の免疫は PBSに懸濁した pepTl- BV 0. 5 mgを皮下投与した。

細胞表面に pepTlを発現している Ba/F3細胞 （以後 Ba/F3-pepTlとする） と Ba/F3 細胞を PBSで 2回洗浄した。 それぞれの細胞 10^δ個に PBSで 220倍に希釈したマウス血 清 100 Lを加え、 on i ceで 30分間反応させた。 500 Lの PBSで 1回洗浄後、 PBSで 20 0倍に希釈した F I TC-抗マウス IgGを I OO L加え、 on i ceで 30分間反応させた。 遠心 後回収した細胞を 500 1^の PBSに懸濁し、 FACSにより解析した。 5回免疫後の FACS による解析の結果を図 8および図 9に示す。 図中、 Ba/F3細胞の結果を実線で、 Ba /F3- pepTl細胞の結果を点線で示した。

以上の結果より、 pepTl- BVを免疫したマウスの血清中の pepTl特異的に反応する 抗体の抗体価が上昇している事が確認された。 産業上の利用の可能性

本発明によって、 背景抗原をともなった標的抗原を用いて、 標的抗原に対する 抗体を効率的に得ることができる。 本発明の抗体作製方法は、 背景抗原の混入を 避けることができない免疫原を用いた抗体作製において有用である。

たとえばバキュロウィルス発現系として知られる外来遺伝子発現システムは、 組み換え蛋白質を容易に、 かつ大量に得るための方法として有用である。 特に膜 蛋白質に応用した場合には、 バキュロウィルス発現系は、 膜蛋白質とウィルス粒 子の膜蛋白質とともに、 構造を維持した状態で回収することができる優れた発現 システムである。 しかし一方でその発現産物を免疫原として用いる場合には、 gp6 4が背景蛋白質となって標的蛋白質に対する抗体の取得を妨げるという問題点を伴 つていた。

本発明の抗体製造方法を利用すれば、 バキュロウィルス発現系によって得られ た蛋白質における背景抗原の影響を効果的に抑制することができる。 その結果、 パキュロウィルス発現系によって大量に得ることができる膜蛋白質抗原を標的抗 原に用いて、 効率的に抗膜蛋白質抗体を製造することができる。

膜蛋白質には、 受容体、 あるいは細胞接着因子等の、 機能的に重要な蛋白質が 多い。 したがって膜蛋白質を認識する抗体は、 その機能解析、 局在の解析、 定量 診断、 あるいは膜蛋白質の活性を制御する治療剤開発において、 重要な役割が期 待される。

一方で、 免疫原として利用可能な膜蛋白質を得ることは一般に難しいとされて いた。 しかし本発明を利用すれば、 バキュロウィルス発現系などによって作製さ れた大量の膜蛋白質を、 背景抗原を伴つたまま免疫原として利用することができ る。 その結果、 これまで作製が困難とさてきた、 様々な膜蛋白質の枋体を容易に しかも効率的に得ることができる。

本発明の抗体作製方法は、 抗体を用いた膜蛋白質の機能解析や診断、 膜蛋白質 の活性の制御に基づく医薬品の開発に貢献する。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、 参照として本明細書 に組み入れられる。

Claims

請求の範囲

1 . 免疫原に含まれている背景抗原に対して免疫寛容を有する非ヒト動物を、 標的抗原と背景抗原を含む免疫原で免疫し、 標的抗原に対する抗体または抗 体をコードする遺伝子を取得する工程を含む標的抗原を認識する抗体の作製 方法。

2 . 免疫寛容を人為的に誘導することを特徴とする請求項 1に記載の方法。

3 . 非ヒ卜動物がトランスジエニック非ヒト動物である請求項 1に記載の方法

4. 以下の工程を含む、 標的抗原に対する抗体の作製方法。

(a)標的抗原と背景抗原を含む免疫原を調製する工程、

(b)背景抗原をコードする遺伝子を発現可能に保持したトランスジエニック非 ヒ卜動物を作製する工程、

(c) (a)の免疫原を（b)のトランスジエニック非ヒト動物に投与する工程、 およ び

(d)トランスジヱニック非ヒト動物から標的抗原に対する抗体を採取する工程

5 . 免疫原がウィルス粒子、 またはその一部である請求項 4に記載の方法。

6 . ウィルスがバキュロウィルスである請求項 5に記載の方法。

7 . 標的抗原が膜蛋白質である請求項 4に記載の方法。

8 . 背景抗原が gp64である請求項 6に記載の方法。

9 . 非ヒ卜動物がマウスである請求項 4に記載の方法。

1 0 . 請求項 1〜 9のいずれかに記載の方法により作製された抗体。

1 1 . 請求項 1 0に記載の抗体を元にして作製した非ヒト動物ーヒトキメラ抗 体、 またはヒト型化抗体。

1 2 . ウィルス由来膜蛋白質をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニッ ク非ヒト動物。

1 3 . ウィルスがバキュロウィルスである請求項 1 2に記載のトランスジェニ ック非ヒ卜動物。

4. ウィルス由来膜蛋白質が gp64である請求項 1 3に記載の非ヒト動物。 5 非ヒト動物がマウスである請求項 1 2に記載の非ヒト動物。

6 ウィルス由来蛋白質を含む抗原に対する抗体製造用である、 請求項 1 2 に記載の非ヒト動物。

7 背景抗原をコ一ドする遺伝子を導入したトランスジエニック非ヒト動物 を作製する工程を含む非ヒト免疫動物の製造方法。

8 請求項 1 7に記載の方法によって製造された、 背景抗原を含む標的抗原 に対する抗体を得るための非ヒト免疫動物。

9 次の工程を含む、 PepTlに対する抗体の製造方法。

a ) PepTlまたはその断片をコードする D NAを発現可能に保持したバキュ ロウィルスを調製する工程

b ) a ) のバキュロウィルスを宿主細胞に感染させ、 PepTlまたはその断片 を発現した出芽ウィルスを得る工程

c ) パキュロウィルスの膜蛋白質 gp64をコードする遺伝子を発現可能に保 持したトランスジエニック非ヒト動物を作製する工程

d ) c ) のトランスジエニック非ヒト動物に b ) の出芽ウィルスまたは Pep T1またはその断片を含む分画を免疫する工程、 および

e ) 免疫動物から、 PepTlを認識する抗体を回収する工程