WO2005094572A1 - 抗体作製用非ヒト動物およびこれを用いた抗体作製方法およびシステム - Google Patents

抗体作製用非ヒト動物およびこれを用いた抗体作製方法およびシステム Download PDF

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antibody
protein
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membrane
human animal
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Tatsuhiko Kodama
Yoshiki Yamada
Nobuo Kamada
Kou-Ichi Jishage
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C12N2710/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a non-human animal for producing an antibody and an antibody producing method and system using the same.
  • the present invention relates to an antibody production system for producing an antibody specific to a target antigen by immunizing the animal with an immunogen containing a background antigen in addition to the target antigen, and more particularly to immunizing an immunized animal against a background antigen consisting of a membrane protein.
  • the present invention relates to a system in which immunized animals carry a gene encoding a soluble form of a membrane protein in order to induce tolerance.
  • Non-Patent Document 1 When it is difficult to express and purify a target antigen necessary for producing an antibody, it is extremely difficult to produce an antibody. This tendency is remarkable for membrane proteins. Therefore, by developing an antigen protein on the membrane surface of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV), a technique that uses a protein that is difficult to express or purify, such as a seven-transmembrane protein, as an antigen has been developed. (Non-Patent Document 1).
  • the baculovirus expression system is useful as an expression system for various proteins including membrane proteins.
  • gp64 membrane proteins Non-Patent Documents 2 and 3
  • gp64 is a major component of the surface of budding virus with a molecular weight of 64 kDa and is known to be a protein involved in the fusion of envelope at low pH. This gp64 is more easily recognized as non-self than a human-derived antigen protein. If gp64 is mixed in an immunogen, an antibody against gp64 is more likely to be produced than a target antigen.
  • Non-Patent Document 4 As a means for solving this problem, the present inventors have created a gp64 transgenic mouse (hereinafter, referred to as “Tgm”).
  • Tgm gp64 transgenic mouse
  • gp64Tgm retains exogenous gp64 as well as endogenous genes before the development of the immune system. Therefore, this Tgm shows immunotolerance to gp64 similarly to the endogenous gene, and recognizes the target antigen protein expressed by baculovirus, and can advantageously produce a specific antibody (Patent Document 1) .
  • gp64Tgm showed a phenotype that the testes did not develop and no sperm was formed! Therefore, maintenance of strains is limited to females, and while strains can be maintained, efficient breeding is not possible. Furthermore, it is difficult to use when producing hybrids by crossing with other gene-deficient mice or Tgm. was there.
  • Patent document l WO 03/104453
  • Non-Patent Document 1 Biotechnology, vol.13, 1079-84 1995.
  • Non-Patent Document 4 Journal of Virology, vol. 69, No. 4, 2583-2595 1995
  • gp64Tgm has a problem of infertility, which is useful as an immunized animal for producing a specific antibody against a protein expressed using baculovirus. Therefore, in order to be able to express and maintain such a foreign membrane protein in transgenic animals, it is necessary to develop a more useful Tgm that has no unfavorable phenotype such as suppression of testis development. It is an object of the present invention to provide a method for producing an antibody using the novel Tgm, and the like.
  • sgp64 soluble gp64
  • pCAGGS vector Gene, vol. 108, 193-200 1991
  • sgp64 expression vector hereinafter, referred to as “sgp64”.
  • mice and sgp64Tgm Male Tgm also maintained its reproductive ability and succeeded in solving the conventional problem of testis development suppression. Further, these sgp64Tgm and control non-transgenic mice were immunized with budding baculovirus, and serum was collected to examine whether or not gp64 was tolerant to gp64. As a result, in the control non-transgenic mouse, the antibody against gp64 was produced. In sgp64Tgm, the antibody against gp64 was hardly detected.
  • the inventors of the present application use the sgp64 to Male infertility observed with gp64Tgm could be avoided, and transgenic mice effective for antibody production using antigens expressed in baculovirus could be established.
  • the present invention is based on these findings, and is specifically as follows.
  • a non-human animal carrying a gene encoding a soluble form of a membrane protein [1] A non-human animal carrying a gene encoding a soluble form of a membrane protein.
  • the non-human animal according to [1], wherein the gene encoding the soluble protein comprises a transgenic animal into which an exogenous force has been introduced.
  • An antibody production method comprising a step of obtaining an antibody against the target antigen or a gene encoding the antibody.
  • the “target antigen” refers to an antigen recognized by a target antibody.
  • the target antigen any substance having antigenicity can be selected. Specifically, proteins, Sugar chains, lipids, and inorganic substances are known as substances exhibiting antigenicity.
  • the target antigen can be naturally occurring or artificially synthesized. Artificially synthesized products include recombinant proteins produced using genetic engineering techniques and various organic substances chemically synthesized.
  • back ground antigens refers to a substance that does not wish to produce an antibody! —A substance having an antigenic determinant, or the antigenic determinant itself.
  • Antigenic substances other than antigens are background antigens, and typical background antigens are proteins mixed with a target antigen in a crudely purified state, and more specifically, proteins derived from a host contained in a recombinant protein.
  • the background antigen can be defined as an antigen contained in an immunogen for inducing the production of a target antibody and causing the production of an undesired antibody.
  • the background antigen is generally considered to indicate an antigenic substance having a different substance from the target antigen, but is not limited to this in the present invention, and includes an antigenic determinant existing on the same molecule as the target antigen in the background antigen.
  • the antigenic determinant is included in the background antigen in the present invention.
  • Immunotolerance refers to the antigen (tolerance
  • An individual is said to have tolerance to a tolerogen when the immune response of an individual to the same tolerogen is reduced relative to the immune response to a tolerogen of a normally immunized animal. For example, a decrease in the amount of antibody to the tolerogen produced when a tolerogen is administered can be considered to indicate a decreased immune response.
  • FIG. 1-a is a view showing a nucleotide sequence of a soluble gp64 gene used in Examples. Shows 1 to 720 bases.
  • FIG. 1-b is a view showing a nucleotide sequence of a soluble gp64 gene used in Examples. Indicates 721 to 1486 bases.
  • FIG. 2 is a view showing a schematic map of a pCAG-sgp64 vector.
  • the present invention provides a transgenic animal useful for producing an antibody against a target antigen using an immunogen in which a membrane protein is mixed as a background antigen in addition to the target antigen.
  • a method and a system for producing an antibody using a digenic animal are provided.
  • the background antigen is a membrane protein.
  • a membrane protein is mixed as a background antigen
  • examples of the case where a membrane protein is mixed as a background antigen include a case where a membrane protein derived from the host organism used for preparing the target antigen is mixed and a case where a membrane protein derived from the virus used in the expression system is mixed. And the like.
  • a target antigen is expressed together with a viral vector-derived membrane protein, such as when a membrane protein is prepared as a target antigen using a baculovirus expression system, a large amount of the membrane protein is mixed as a background antigen. .
  • membrane protein generally means a protein constituting a biological membrane, for example, a force that means a protein buried inside a biological membrane. Also include proteins that are connected to the cell membrane surface via anchors, such as GPI-anchored proteins.
  • virus-derived membrane protein usually refers to a protein that constitutes an outer part of a budding virus.
  • gp64 corresponds to a membrane protein. Many of these membrane protein structures are buried in the cell membrane (transmembrane region), exposed outside the cell membrane (extracellular region), and located inside the cell membrane (intracellular region). ).
  • membrane proteins include proteins constituting membranes, proteins involved in signal transmission such as receptors and transporters, and proteins that perform specific reactions such as membrane enzymes. Therefore, when such a foreign membrane protein is introduced into an immunized animal, it may be expressed in any of the biological membranes of the immunized animal or the like, and may confer other unfavorable properties, not only inducing immune tolerance. .
  • membrane protein g p64-derived Baki Yurowirusu is introduced, a problem that male infertility arising.
  • immunological tolerance is induced against a virus-derived membrane protein that can be mixed in the immunogen as the background antigen.
  • a virus-derived membrane protein that can be mixed in the immunogen as the background antigen.
  • Baku mouth When an immunogen prepared using a virus expression system is used, a non-human animal in which tolerance to baculovirus-derived membrane protein gp64 has been induced is used as the immunized animal.
  • a method for inducing immune tolerance a method of retaining a gene encoding the full-length membrane protein as a background antigen in an immunized animal has been developed.However, in the present invention, a solubilized membrane protein (hereinafter referred to as ⁇ The gene encoding the "soluble protein”) in non-human animals
  • soluble protein refers to a protein obtained by modifying a membrane protein (insoluble protein) originally expressed on a biological membrane so that it can be expressed outside the biological membrane.
  • membrane proteins include receptors that can participate in signal transduction, transporters, membrane enzymes, and other functions that perform functions such as in vivo switches.
  • the immunized animal When expressed in a biological membrane, the immunized animal may be imparted with unfavorable properties other than inducing immune tolerance to a background antigen.
  • the soluble type is used so that the membrane protein can be expressed outside the biological membrane.
  • the membrane protein can be expressed in a soluble form in the systemic cytoplasm in the present invention. This can be expected to increase the efficiency of guidance.
  • a method for modifying a gene encoding a membrane protein by genetic engineering is used in the present invention.
  • deletion of a transmembrane region can be mentioned.
  • the degree of the transmembrane region defect may be a partial defect of the transmembrane region or a defect of the entire transmembrane region as long as the membrane protein can be expressed extracellularly. Since the transmembrane domain generally has an ⁇ - helical structure of 20 to 30 amino acids, it may be made soluble by removing a mutation that changes the structure.
  • a membrane protein when a membrane protein is modified into a soluble protein, there are an intracellular region and an extracellular region as regions other than the transmembrane region, but there is no need to provide an intracellular region. It may be limited to only the extracellular region having an antigenic determinant that can be used. In addition, the extracellular region can be limited to a range that can induce immune tolerance, for example, a range that has antigenic determinants that can maintain antigenicity and induce immune tolerance to membrane proteins.
  • the above-mentioned soluble protein may be composed of a chimeric protein having an additional or inserted peptide such as another peptide in addition to deletion of a transmembrane region such as a membrane protein.
  • the peptide to be inserted into the chimeric protein can also be used as an antigenic determinant for other background antigens (this "other background antigen" may or may not be a membrane protein).
  • this "other background antigen” may or may not be a membrane protein.
  • gp64 is encoded by the DNA sequence described in SEQ ID NO: 1, of which the transmembrane region is encoded by 1465 to 1515 nucleotides, and the extracellular region is encoded by 1 to 1464 nucleotides. Therefore, in order to make gp64 a soluble form, the ability to delete the transmembrane region or the substitution of a sequence encoding an amino acid having an ⁇ -heritus structure with another amino acid can be mentioned.
  • the entire protein having 488 amino acid residues and coding for 1 to 1464 nucleotides shown in SEQ ID NO: 3 may be used, but cross-reactivity with gp64 in the extracellular region may be used. May be shortened to the extent that gp64 can be maintained and immune tolerance of gp64 can be induced.
  • one or more amino acids in the amino acid sequence of the extracellular region of gp64 are within a range that can induce immune tolerance to gp64 in the immunized animal described below. Mutations such as deletion, substitution, addition or insertion of!
  • a gene encoding such a soluble protein is retained in a non-human animal to induce immunological tolerance.
  • Non-human animals that can be used in the present invention include, for example, sal, pig, dog, rat, mouse, and egret.
  • rodents such as rats, mice, hamsters, etc. are preferred non-human animals.
  • a non-human animal, such as a rodent that has a fast-maturing genetic engineering approach is advantageous.
  • mice are non-human animals that can meet these conditions at high and high levels.
  • the non-human animal carrying the gene encoding the soluble protein can be obtained by preparing a transgenic animal into which a gene encoding the soluble protein has been introduced as a foreign gene.
  • transgenic mice are produced according to known methods. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384 (1980)) 0 Specifically, a target gene is introduced into a totipotent cell of a mammal, and this cell is developed into an individual. Let it.
  • a transgenic mouse of interest can be produced by selecting, from the obtained individuals, those in which the transgene has been incorporated into somatic cells and germ cells. Examples of totipotent cells into which a gene is introduced include fertilized eggs and early embryos, as well as cultured cells such as multipotent ES cells. More specifically, it can be produced by the method described in the examples described later.
  • the non-human animal carrying the gene encoding the soluble protein of the present invention may be a progeny of the transgenic animal. Once the transgenic animal is established, it is usually easy to transmit the trait (in the present invention, the trait of immune tolerance) due to the introduced gene to the offspring. However, transgenic animals transfected with baculovirus gp64, which has been developed in the past, have a problem of male infertility, and it has been difficult to efficiently reflect the immune tolerance traits in offspring. On the other hand, in the present invention, by producing a transgenic animal using a gene encoding a soluble protein of a membrane protein, it is preferable to use a transgenic animal into which a gene encoding a full-length membrane protein has been introduced.
  • transgenic animals using a gene encoding a soluble protein of baculovirus gp64, male fertility can be maintained and the trait can be transmitted to offspring by efficient breeding. It's getting easier.
  • Transgenic animals retaining soluble gp64 can reproduce efficiently and their offspring also retain immune tolerance traits, and thus are useful as immunized animals for producing antibodies as described below.
  • a non-human animal to carry a gene encoding a soluble protein that is not the full length of a membrane protein, it is possible to make it easier to use immune animals that have been induced tolerant to the membrane protein more widely. Can be.
  • the non-human animal carrying the gene encoding the soluble form of the membrane protein of the present invention may be prepared based on a gene-deficient animal lacking the target antigen protein (so-called knockout animal).
  • a transgenic animal expressing a background antigen may be bred to a non-human animal carrying a gene encoding a soluble protein of a protein with such a target antigen protein knockout animal.
  • the present invention relates to a method for producing an antibody using a non-human animal carrying a gene encoding a soluble form of the above-mentioned membrane protein.
  • the immunogen of the present invention contains at least a membrane protein as a background antigen in addition to the target antigen.
  • the target antigen is also a substance derived from biological material. Biological materials are complex mixtures containing various components. Therefore, target antigens are usually prepared from various mixtures as raw materials. As a result, it is difficult to highly purify the target antigen. In other words, it takes a lot of effort and time to purify the target antigen in a large amount and at a high level.
  • the present invention provides a method for efficiently obtaining an antibody against a target antigen using an immunogen in which a membrane protein is mixed as a background antigen in addition to such a target antigen.
  • examples of the immunogen of the present invention include cells, cell culture solutions, cell lysates, viruses, and unpurified antigens that can contain membrane proteins as background antigens.
  • cells or viruses those in which the gene encoding the target antigen is introduced into the cells or virus by gene recombination technology to artificially express the target antigen can be used.
  • Cells and viruses can be used not only as whole but also only a part of them as immunogens.
  • only the cell membrane and virus envelope Can also be used as an immunogen.
  • a cell membrane or virus envelope is used as an immunogen as a whole or part of such cells or viruses, membrane proteins contained in the cell membrane or virus envelope are mixed as background antigens.
  • One of the desirable immunogens in the present invention can be a virus particle or a part thereof.
  • Viruses are composed of nucleic acids and relatively simple components such as limited proteins and sugars. Therefore, the types of background antigens that interfere with the acquisition of the target antigen are also limited. Background antigens that interfere with the acquisition of target antigens in virus particles and some of them include membrane proteins on the particle surface.
  • the particle surface When administered to an immunized animal, the particle surface is highly antigenic and readily induces antibody production. Therefore, among the few background antigens, if an immune tolerance is induced in an immunized animal against a background antigen that is a membrane protein such as a particle surface, the method for producing an antibody according to the present invention can be performed more advantageously. it can.
  • Baculovirus is one of the preferable viruses that can be used as an immunogen.
  • Baculovirus is an insect virus having a structure in which a genome consisting of double-stranded DNA is covered with a capsid protein.
  • an expression system that utilizes nuclear polyhedrosis virus (NPV), a type of baculovirus, is useful as an expression system for foreign genes.
  • NPV nuclear polyhedrosis virus
  • NPV nuclear polyhedrosis virus
  • any protein can be produced in large quantities.
  • a gene encoding a protein called polyhedrin is recombined with an arbitrary gene, whereby strong expression of an exogenous gene is induced.
  • the exogenous gene that can be expressed by the baculovirus expression system is not particularly limited, and any gene can be used.
  • Baculovirus can be used as a suitable system for expressing a membrane protein. Examples of suitable genes include genes encoding membrane proteins.
  • a target membrane protein can be expressed together with the baculovirus membrane protein while maintaining its structure. It is also an advantage of the baculovirus expression system that the expression product can be easily recovered as a budding virus.
  • Examples of a method for expressing a target antigen, a membrane protein, using a baculovirus include the following. Examples thereof include a method using a budding baculovirus described in W098 / 46777 and Loisel et al. (TP ⁇ oisel et al, Nature Biotech. 15: 1300-1304 (1997)). More specifically, a recombinant vector for insect cells containing a gene encoding a foreign protein is prepared, and introduced together with baculovirus DNA into insect cells such as S19. The foreign membrane protein encoded by the recombinant vector is expressed on mature virions (virions) that are released from infected cells before the infected cells die, and expresses the foreign protein. Can be obtained.
  • virions mature virions
  • a budding virus is a virus from which infectious cell power is also released by budding.
  • a virus that has covered the cell membrane destroys the cell, and in any state, the cell infected with the virus germinates and continually releases, whereas the virus that covers the membrane can damage the adenovirus and the nuclear membrane. Herpes virus is released simultaneously when the cells are destroyed.
  • budding viruses are particularly preferred.
  • a host to be infected with the recombinant virus those skilled in the art can appropriately select a host that enables propagation of the virus according to the type of the virus to be used. For example, when baculovirus is used, use of insect cells such as S19 can be considered.
  • a protein expression system using baculovirus-insect cells should be modified at the same time as translation, such as acetylation of fatty acid and addition of a sugar chain, or post-translationally, as in mammalian cells.
  • Higher levels of heterologous protein expression than cell lines are considered to be advantageous systems.
  • a virus expressing a foreign protein as a target antigen can be obtained, for example, by culturing a host infected with a recombinant virus containing a gene encoding a foreign protein.
  • a recombinant vector encoding an exogenous protein can be used together with a baculovirus, as in the method of W098 / 46777 and Loisel et al. (TP ⁇ oisel et al., Nature Biotech. 15: 1300-1304 (1997)).
  • foreign proteins When introduced into insect cells, foreign proteins can be expressed on the baculovirus membrane that is released extracellularly, and 3 ⁇ 1 et al. (D. Strehlow et al., Proc.
  • the recombinant virus prepared as described above can be purified, if necessary, by a known method. For example, augment density gradient centrifugation (Augment density gradient centrifogation XAlbrechtsen et al, J. Virological Methods 28: 245—256 (1990);
  • An immunized animal is immunized with the immunogen prepared as described above.
  • the immunized animal used in the present invention a non-human animal whose immune tolerance has been induced to a membrane protein which is a background antigen contained in the immunogen is used.
  • induction of immune tolerance to a membrane protein of a background antigen can be carried out by allowing a immunized animal to carry a gene encoding a soluble protein of the membrane protein.
  • the immunized animal When the baculovirus expression system described above as the most suitable expression system is used for preparing an immunogen for the preparation of membrane proteins, the immunized animal carries the gene encoding soluble gp64. U, preferably using non-human animals in which tolerance to gp64 has been induced.
  • a non-human animal having a gene encoding the full length of gp64 can be used as the immunized animal, but a soluble gp64 transgenic animal that can be efficiently produced and widely used since both males and females have the ability to reproduce is used.
  • a non-human animal carrying a gene encoding soluble gp64 is used as an immunized animal, and immunization is performed using a budding baculovirus expressing a membrane protein as a target antigen as an immunogen.
  • the antibody production method of the present invention it is possible to suppress the interfering effect of obtaining an antibody against a target antigen due to the presence of a membrane protein as a background antigen. Therefore, by using the present invention, the advantages of the baculovirus expression system as an exogenous protein expression system can be fully utilized in the production of immunogens.
  • a known method can be used for the method of obtaining immunity and antibody. Immunization of an animal with an immunogen is performed according to a known method. As a general method, the sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal. Specifically, the immunogen
  • An appropriate amount of a normal adjuvant is mixed with an appropriate amount of a suspension diluted with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, if necessary, emulsified, and then administered to a mammal.
  • the adjuvant for example, Freund's complete adjuvant is used. Further, thereafter, it is preferable to administer the immunogen mixed with an appropriate amount of Freund's incomplete adjuvant several times every 4 to 21 days. Immunization is performed in this manner, and it is confirmed by an ordinary method that the level of the desired antibody in the serum increases.
  • the blood of the immunized animal is collected, and the serum is separated.
  • a serum containing the polyclonal antibody may be used. If necessary, a fraction containing the serum-containing polyclonal antibody may be further isolated and used.
  • the monoclonal antibody production method may be combined with the antibody production method of the present invention.
  • the antibody-producing cells are collected from the mammal and cloned.
  • spleen cells can be used as the antibody-producing cells.
  • the cell fusion method can be used for closing antibody-producing cells.
  • a mammalian myeloma cell is used as the other parent cell fused with the antibody-producing cell.
  • a myeloma cell having a special auxotrophy and drug resistance, which serves as a selection marker for a fusion cell can be mentioned.
  • the antibody producing cell and myelo Mamma cells can be subjected to cell fusion basically according to a known method.
  • a method for producing a monoclonal antibody using cell fusion has been established, for example, by Milstein et al. (Galfre, G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).
  • the hybridoma obtained by cell fusion is selected by culturing it in a selective culture solution.
  • the selection culture solution is selected according to the characteristics of the myeloma cells used for cell fusion, and the like.
  • a HAT culture solution a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine
  • the hybridoma is cultured in the HAT culture medium for a time sufficient for the death of cells (non-fused cells) other than the target and hybridomas.
  • a hybridoma can be selected.
  • a conventional limiting dilution method is performed, and screening and cloning of hybridomas producing the desired antibody are performed.
  • the obtained hybridoma is transplanted intraperitoneally into a mouse, and the monoclonal antibody can be recovered as ascites of the mouse.
  • Monoclonal antibodies can also be purified from ascites fluid.
  • purification of the monoclonal antibody for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G columns, DEAE ion exchange chromatography, and an affinity column to which the target antigen is coupled can be used.
  • the monoclonal antibody thus obtained can also be a recombinant antibody produced using genetic recombination techniques (eg, Borrebaeck, CAK and Larrick, JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • Recombinant antibodies are produced by cloning DNA encoding the antibodies into antibody-producing cells such as hybridomas or sensitized lymphocytes that produce the antibodies, incorporating the DNA into an appropriate vector, and introducing it into a host.
  • antibody fragments and modified antibodies can be obtained by combining the antibody production method of the present invention with antibody modification and modification techniques.
  • antibody fragments and modified antibodies can be obtained by combining the antibody production method of the present invention with antibody modification and modification techniques.
  • Fab, F (ab ') 2, Fv or a single chain Fv (scFv) obtained by linking a heavy chain and a light chain Fv with an appropriate linker (Huston, JS et al, Proc. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5588).
  • a modified antibody it binds to various molecules such as polyethylene glycol (PEG).
  • Antibodies can also be used.
  • Such a modified antibody can be obtained by subjecting the obtained antibody to chemical modification. These methods are already established in this field.
  • the antibody production method of the present invention may be combined with a technique for modifying a human antibody.
  • Transgenic animals having the entire repertoire of human antibody genes see International Patent Application Publication Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735)
  • To obtain the desired human antibody by introducing a gene encoding a soluble protein of the background antigen, maintaining human antibody-producing ability and immunological tolerance against the background antigen, and immunizing with the desired antigen. You can.
  • the antibody obtained by the method of the present invention can be a chimeric antibody having a variable region derived from a non-human antibody derived from an immunized animal and a constant region derived from a human antibody. It is also possible to use a CDR (complementarity determining region) of a non-human antibody derived from an immunized animal, a FR (framework region) derived from a human antibody, and a humanized antibody having constant region strength. These modified antibodies can be produced using known methods. Specifically, for example, a chimeric antibody is an antibody that also has the variable regions of the heavy and light chains of the antibody of the immunized animal and the constant regions of the heavy and light chains of the human antibody.
  • a chimeric antibody can be obtained by ligating DNA encoding the variable region of an antibody derived from an immunized animal to DNA encoding the constant region of a human antibody, inserting the DNA into an expression vector, and introducing into a host to produce. it can.
  • a humanized antibody is a modified antibody also called a reshaped human antibody.
  • a humanized antibody is constructed by transplanting the complementarity determining region (CDR) of an antibody derived from an immunized animal into the complementarity determining region of a human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • a CDR of a mouse antibody and a framework region of a human antibody (framework region;
  • the DNA sequence designed to ligate FR is also synthesized by PCR using several oligonucleotides created to have overlapping portions at the ends.
  • the obtained DNA is ligated to DNA encoding the constant region of a human antibody, and the resulting DNA is inserted into an expression vector and introduced into a host to produce a humanized antibody (European Patent Application Publication No. EP 239400, International Patent Application Publication No. WO 96/02576).
  • Linked via CDR Human antibody FRs whose complementarity determining regions form a favorable antigen-binding site are selected.
  • amino acids in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted such that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al, Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • a gene encoding an antibody can be obtained from an antibody-producing cell of an immunized animal.
  • the method for obtaining the gene encoding the antibody is not limited.
  • a gene encoding an antibody can be obtained by amplifying the gene encoding a variable region or CDR using the gene encoding PCR by PCR. Primers for amplifying antibody genes by PCR are known.
  • the desired antibody can be produced by expressing the obtained gene using an appropriate expression system.
  • the gene obtained by the present invention can be used to complement various modified antibodies (chimera antibodies, which are constant regions derived from human antibodies, and complementarity determining regions (CDRs) of antibodies derived from immunized animals, to human antibodies). It can also be used to produce a humanized antibody transplanted into the sex-determining region.
  • an antibody production system including a non-human animal carrying a gene encoding a soluble protein of a membrane protein.
  • a membrane protein derived from the virus or a host cell into which the virus expression vector has been introduced may be mixed as a background antigen.
  • the membrane protein as the background antigen is not derived from a foreign gene as a target antigen but is derived from an expression system such as a vector or a host. Therefore, a membrane protein of a background antigen that can be mixed in each expression system is identified. Then, a gene encoding a soluble form of the membrane protein is introduced into a non-human animal by a transgenic technique, and it is confirmed whether the resulting transgenic animal can induce immune tolerance to the membrane protein. . Whether immunotolerance was induced in non-human animals was confirmed by the ability to generate antibodies against the membrane protein, which is a background antigen, in the serum, as described in the Examples. Can be performed.
  • Non-human animals in which induction of tolerance to the background antigen has been confirmed are expressed in a soluble form of the membrane protein of the background antigen.
  • Application of an unfavorable phenotype, such as loss of reproductive ability in the animal can be avoided and can be provided as a widely available immunized animal. Therefore, by combining an immunized animal having a gene encoding a soluble form of the membrane protein of the present invention with an expression system in which the membrane protein is produced as a background antigen, efficient antibody production is supported. A system that can do this can be constructed.
  • the advantage of the baculovirus expression system is reflected in antibody production by combining with a non-human animal holding a gene encoding soluble gp64.
  • a desired protein particularly a membrane protein
  • the expression product is easily recovered as a budding virus.
  • this budding virus as an immunogen, a non-human animal carrying a gene encoding soluble gp64 is immunized as an immunized animal.
  • gp64 In non-human animals that harbor the gene encoding this soluble form of gp64, a large amount of gp64 is expressed on the immunogenic budding virus due to induction of tolerance to gp64. In addition, it is possible to produce an antibody against a target antigen, a membrane protein, in a state where production of the antibody against gp64 is suppressed. Therefore, by using a non-human animal carrying a gene encoding soluble gp64, gp64 is present on baculovirus as a background antigen, and even in a state where gp64 is present, antibody production against the target antigen can be advantageously produced. It is possible to guide. As a result, the antibody obtained by the present system makes it possible to obtain an antibody with high purity for the target antigen.
  • g P 64 gene (SEQ ID NO: 1, the total length; 1539Bp) of the transmembrane region (1465 bases from 1539 bases) gene fragment with only the extracellular region is deficient (soluble gp64; 1464bp, SEQ ID NO: 3) Prepared by PCR.
  • the composition of the PCR reaction solution was 5 ⁇ L of 10X ExTaq buffer (TaKaRa), 4 L of dNTP mixture with ExTaq, 1 ⁇ L of primer 64FK10 ⁇ mol / L), 1 ⁇ L of primer s64Rl (10 ⁇ mol / L), pCAG-gp64 (500 pg / ⁇ L) l ⁇ L, ExTaq (5 units / ⁇ L, TaKaRa) 0.5 ⁇ L, HO 37.5 ⁇ . Cycling
  • the reaction was heated at 94 ° C for 5 minutes, then 25 cycles at 94 ° C for 15 seconds, 57 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds, then treated at 72 ° C for 7 minutes, and stored at 4 ° C. did.
  • the amplified band was subcloned into pGEM-Teasy (Promega) and then transformed into E. coli (DH5 ⁇ ,).
  • ⁇ 7 primer one (5'-TAATACGACTCACTATA-3 ', SEQ ID NO: 7), and SP6 primer
  • Colony PCR was performed using (5'-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3 ', SEQ ID NO: 8), and the nucleotide sequence of the clone in which the insert was confirmed was subjected to BigDye and ycle Sequence kit (Applied Biosystems) A and a T7 fiuma were analyzed using SP6 primers, and clones containing the gene of interest were identified.
  • the fragment containing the clone gp64 was excised by treatment with EcoRI restriction enzyme, inserted into the pCAGGS vector treated with EcoRI restriction enzyme, and transformed into E. coli (DH5 ⁇ ).
  • the direction of insertion of the gp64 fragment was determined based on the size of the band (about 2.1 kb) obtained by treatment with the restriction enzymes Xhol and Xbal, and the pCAG-sgp64 vector was prepared (FIG. 2).
  • the clones as designed were cultured at 370C in 250 mL of LB medium and purified using Endofree MAXI kit (QIAGEN) to obtain a plasmid (581.6 / zg).
  • the DNA fragment for injection used for Tgm production is prepared by treating the pCAG-sgp64 vector with the restriction enzymes Sail and Pstl, cutting out the sgp64 gene-containing fragment (approximately 3.7 kb), and recovering it with the Gel Extraction Kit (QIAGEN). Then, this fragment was diluted to 3 ng / ⁇ l with PBS.
  • the mouse pronuclear stage embryo to which the DNA fragment was injected was collected as follows.
  • BALB / cA female mice (CLEA Japan) were superovulated (5 iu eCG (serotopic pin; imperial organ) was intraperitoneally administered, and 48 hours later, 5 iu hCG (puberogen; Sankyo) was administered intraperitoneally, and then mated with the same strain of male mice (CLEA Japan) .
  • pronuclear stage embryos were collected by perfusing the oviducts of female mice with confirmed vaginal plugs.
  • the DNA fragment was injected into the pronuclear stage embryo using a micromanipulator (the latest technology of gene targeting (Yodochi), 190-207 2000).
  • the DNA fragment was injected into 497 BALB / cA mouse pronuclear stage embryos, of which 430 that developed in the 2-cell stage embryo were transplanted into the oviduct of a pseudopregnancy recipient female.
  • 430 that developed in the 2-cell stage embryo were transplanted into the oviduct of a pseudopregnancy recipient female.
  • 66 offspring were obtained.
  • the genes introduced into the offspring obtained here were confirmed as follows.
  • the mouse tail was collected, and the Lysis buffer (50 mM Tris-HC1 pH 8.0, 0.1 M NaCl, 20 mM EDTA,
  • genomic DNA is extracted using an automatic nucleic acid separation device (KURABO, NA-1000P) and introduced by Southern blotting and PCR. The gene was confirmed.
  • KURABO, NA-1000P automatic nucleic acid separation device
  • the extracted genomic DNA (15 g) was treated with the restriction enzyme EcoRI, electrophoresed on agarose gel, and then transferred to a nylon membrane (Hybond N +: Amersham) by alkaline blotting.
  • a fragment of about 1.5 kb containing the sgp64 of the pCAG-sgp64 vector treated with EcoRI restriction enzyme was used, followed by labeling with 32 P, followed by hybridization with the transferred genomic DNA, followed by Southern blotting.
  • the hybridization was carried out at 45 ° C using 5x SSPE, 50% formamide, 5x Denhardt, 0.5% SDS as a hybridization solution.
  • the conditions for washing the nylon membrane were as follows: 2x SSC containing 0.1% SDS at 65 ° C for 30 minutes, and further, lx SSC containing 0.1% SDS at 65 ° C for 30 minutes. Thereafter, a signal was detected with BAS2000 (FUJIX).
  • the PCR reaction solution consists of 1 ⁇ L of genomic DNA (100 ng / ⁇ L), 5 ⁇ L of 10X ExTaq buffer (TaKaRa), and ExTaq included.
  • the obtained founder was bred with BALB / cA mice at the age of 8 weeks of age. Specifically, out of the three Founders, 26 male offspring were obtained by crossing a male Founder (line No. 41) with 5 females, and 12 of these offspring were Tgm (F1 mouse). Met. The remaining two female founders (line numbers 36 and 51) yielded 16 and 15 offspring, respectively, with 9 and 8 Tgm (Fl mice, including male and female), respectively, and male Tgm There were 4 and 1 animals, respectively (Table 2).
  • Example 2 The fertility of the male Tgm (Fl mouse) obtained in Example 2 was examined. Fertility is male sgp64Tgm (Fl mouse) At the age of one week, mating with BALB / cA mice This was performed by confirming the presence and number of pups.
  • Sprout baculovirus (pepTl-AcMNPV (pepTl-BV)) was immunized to sgp64Tgm as follows, and the presence or absence of tolerance induction for gp64 was confirmed.
  • Immunization was performed by preparing an emulsion using Freund's complete adjuvant (Difco) and incomplete adjuvant (Difco) according to a conventional method, and subcutaneously administering the emulsion.
  • the initial immunization dose was 1 mg / animal and the second immunization dose was 0.5 mg / animal.
  • Two immunizations were performed 14 days after the first immunization. 17 days after the initial immunization, orbital blood was collected and serum was collected. As a control, non-transgenic mice were similarly immunized and subsequently collected with serum.
  • Non-Tgm Anti-Mouse IgG staining of all three non-transgenic mice (non-Tgm) showed strong staining (Fig. 3). On the other hand, sgp64Tgm showed almost no gp64 staining, indicating that sgp64Tgm could induce tolerance to gp64.
  • a novel transgenic animal in which the problem of male infertility in transgenic animals into which the conventional baculovirus membrane protein gp64 gene has been introduced and which has been solved are eliminated.
  • This aims to solve the above-mentioned problem by expressing soluble gp64 (ie, expressing gp64 outside the cell membrane) by deleting the sequence encoding the transmembrane region among the genes encoding a membrane protein called gp64. I was able to.
  • transgenic animal into which a gene encoding a soluble protein has been introduced similar to a transgenic animal into which a gene encoding the full length of a membrane protein has been introduced, It has been confirmed that immune tolerance to membrane proteins is induced. Therefore, when a membrane protein is mixed as a background antigen in an immunogen, a gene encoding a soluble protein in which the transmembrane region of the membrane protein or the like has been deleted is used as a foreign gene. It is advantageous to use transgenic animals as immunized animals.
  • the immunized animal induces immune tolerance to the membrane protein of the background antigen, advantageously produces a specific antibody against the target antigen, and is not an unfavorable transgenic animal in which the full-length membrane protein has been introduced. Since the appearance of a phenotype is avoided, it becomes easier to use as a system for producing antibodies.
  • antibodies produced using the animal of the present invention are provided as high-purity antibodies because antibodies to background antigens are not mixed or very few!

Abstract

　背景抗原である膜蛋白質を可溶型とし、これをコードする遺伝子を用いてトランスジェニック動物を作製した。このトランスジェニック動物では、免疫原中に含まれる背景抗原の膜蛋白質に対する抗体が見られず、可溶型蛋白質をコードする遺伝子を用いても全長の膜蛋白質に対する免疫寛容が誘導することができた。その上、トランスジェニック動物の生体内で背景抗原の膜蛋白質を可溶型蛋白質として発現させることにより、膜蛋白質全長を発現させた場合の好ましくない表現型の出現を回避することができ、広く免疫動物として利用可能にすることができた。

Description

抗体作製用非ヒト動物およびこれを用いた抗体作製方法およびシステム 技術分野
[0001] 本発明は、標的抗原以外に背景抗原を含む免疫原で動物を免疫して標的抗原に 対する特異抗体を作製する抗体作製システム等に関し、特に免疫動物に膜蛋白質 からなる背景抗原に対する免疫寛容を誘導するために、免疫動物に膜蛋白質の可 溶型蛋白質をコードする遺伝子を保持させたシステム等に関する。
背景技術
[0002] 抗体の作製に必要な標的抗原の発現、精製が困難な場合、抗体は作製することが 極めて困難である。膜タンパクではこの傾向が顕著である。そこで、抗原タンパクをバ =Tュロウイノレス【こ属する Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV)の 膜表面に発現させる事により、 7回膜貫通タンパクなど発現や精製が困難なタンパク を抗原として利用する手法が開発されている (非特許文献 1)。
[0003] し力しながら、バキュロウィルス発現系は膜タンパク質を含め種々のタンパク質の発 現系として有用である力 バキュロウィルスの表面には膜タンパク質 gp64(非特許文献 2、 3)が多数存在し、これがバキュロウィルス発現系による発現産物に混在する。 gp64 は分子量 64 kDaの出芽ウィルス表面の主要な構成成分であり、低 pHにおけるェンべ ロープの融合に関与するタンパクである事が知られている。この gp64は、ヒト由来抗 原タンパクと比較し非自己として認識され易ぐ免疫原中に gp64が混在すると、標的 抗原よりも gp64に対する抗体が産生され易い。そのため、バキュロウィルス発現系を 用いて免疫原を調製した場合、抗原タンパクに対する特異抗体の産生 ·取得は困難 である (非特許文献 4)。この問題を解決する手段として、本願発明者らにより gp64トラ ンスジエニックマウス（以下、「Tgm」という）が創出された。この Tgm (以下、「gp64Tgm」 という）は、免疫系が発達する以前から内在性遺伝子と同様に外来性の gp64を保持 している。そのため、この Tgmは、内因性遺伝子と同様に gp64に対し免疫寛容を示し 、バキュロウィルスで発現させた標的抗原タンパクを認識し有利に特異抗体を産生さ せることが可能となる (特許文献 1)。 [0004] しかしながら、 gp64Tgmは精巣が発達せず、精子が形成されな!ヽと!、う表現型を示 すものだった。したがって、系統の維持は雌に限定され、系統の維持はできるものの 効率的な繁殖ができなぐまた、他の遺伝子欠損マウスあるいは Tgmとの交配による 交雑種を作製する際にも、利用しにくい面があった。
特許文献 l :WO 03/104453
非特許文献 1 : Biotechnology , vol.13, 1079-84 1995.
非特許文献 2 Journal of Immunological Methods, vol.234, 123-135 2000 非特許文献 3 Journal of Virology, vol.70, No.7, 4607-4616 1996
非特許文献 4 Journal of Virology, vol.69, No.4, 2583-2595 1995
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 上述したとおり、上記 gp64Tgmはバキュロウィルスを用いて発現させた蛋白質に対 する特異的な抗体を産生させるための免疫動物として有益である力 不妊という問題 があった。そこで、このような外来の膜蛋白質をトランスジエニック動物で発現'維持す ることを可能にするために、精巣の発達抑制等のような好ましくない表現型を持たな Vヽ一層有益な Tgmの創出、及びこの新規な Tgmを用いた抗体作製方法等を提供す ることを課題とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本願発明者らは、精巣発達抑制の原因が精巣内の細胞膜上への gp64の発現によ ると予想した。そこで、 gp64 (全長）の膜貫通領域を削除した可溶型 gp64 (以下、「 sgp64」という)を pCAGGSベクター（Gene, vol.108, 193-200 1991)につなぎ sgp64発 現ベクター（以下、「pCAG- Sgp64ベクター」と 、う）を構築した。これをマウスに導入し て、 sgp64Tgmを作製したところ、雄 Tgmも繁殖能を保持し、従来の精巣の発達抑制と いう問題を解消することに成功した。さらに、これら sgp64Tgmおよびコントロールの非 トランスジェニックマウスを出芽バキュロウィルスで免疫し、血清を採取し、 gp64に対す る免疫寛容の有無を調べた。その結果、コントロールの非トランスジエニックマウスで は、 gp64に対する抗体が産生されていた力 sgp64Tgmでは gp64に対する抗体はほと んど検出されな力つた。すなわち、本願発明者らは、 sgp64を用いることにより従来の gp64Tgmで見られた雄の不妊を回避でき、バキュロウィルスに発現させた抗原を用い た抗体作製にとって有効なトランスジエニックマウスを確立することができた。本願発 明は、これら知見に基づくものであり、具体的には以下の通りである。
[0007] 〔1〕 膜蛋白質の可溶型蛋白質をコードした遺伝子を保持した非ヒト動物。
〔2〕 可溶型蛋白質をコードした遺伝子が外来力も導入されたトランスジエニック動物 力らなる、〔1〕記載の非ヒト動物。
〔3〕 可溶型蛋白質をコードした遺伝子が外来力も導入されたトランスジエニック動物 の子孫である、〔2〕記載の非ヒト動物。
〔4〕 膜蛋白質がウィルス由来である、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の非ヒト動物。 〔5〕 ウィルスがバキュロウィルスである、〔4〕に記載の非ヒト動物。
〔6〕 膜蛋白質が gp64である、〔5〕記載の非ヒト動物。
〔7〕 可溶型蛋白質が膜貫通領域を欠損した gp64である、〔6〕記載の非ヒト動物。
〔8〕 可溶型蛋白質が gp64の細胞外領域からなる、〔6〕記載の非ヒト動物。
〔9〕 非ヒト動物がマウスである、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の非ヒト動物。
〔10〕 雄が繁殖能を有する、〔6〕〜〔9〕のいずれかに記載の非ヒト動物。
〔11〕〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の非ヒト動物を、標的抗原を含有する免疫原で 免疫する工程、
前記標的抗原に対する抗体または抗体をコードした遺伝子を取得する工程を含む 、抗体作製方法。
〔12〕 免疫原がウィルス粒子またはその一部である、〔11〕記載の抗体作製方法。
〔13〕 ウィルスがバキュロウィルスである、〔12〕記載の抗体作製方法。
〔14〕 標的抗原が膜蛋白質である、〔11〕〜〔13〕のいずれかに記載の抗体作製方 法。
〔15〕〔1〕〜〔10〕記載の非ヒト動物を含む抗体作製システム。
[0008] 上記本発明の理解を容易にするために、前提となるいくつかの用語の意味を説明 する。
本発明において、「標的抗原」とは、 目的とする抗体が認識する抗原を言う。標的抗 原は、抗原性を有する任意の物質力も選択することができる。具体的には、蛋白質、 糖鎖、脂質、あるいは無機物質などが抗原性を示す物質として知られている。標的抗 原は、天然に存在するものであることもできるし、人工的に合成されたものであっても 良い。人工的に合成されたものには、遺伝子工学技術を利用して作製された組み換 え蛋白質や、化学的に合成された様々な有機物質が含まれる。
[0009] 「背景抗原 (back ground antigens)]とは、抗体の産生を希望しな!ヽ抗原決定基を有 する物質、またはその抗原決定基そのものを言う。たとえば、標的抗原に混在する標 的抗原以外の抗原性物質は、背景抗原である。代表的な背景抗原は、粗精製状態 の標的抗原に混在する蛋白質である。より具体的には、組み換え蛋白質に含まれる 宿主に由来する蛋白質を、背景抗原として示すことができる。背景抗原とは、目的と する抗体産生を誘導するための免疫原に含まれ、目的としない抗体の産生を誘導す る原因となる抗原と定義することもできる。背景抗原は、一般には標的抗原とは別物 質の抗原性物質を指すものと考えられるが、本発明ではこれに限定されず標的抗原 と同じ分子上に存在する抗原決定基を背景抗原に含めることができる。例えば、標的 抗原と同じ分子上に抗体の産生を希望しない抗原決定基がある場合、該抗原決定 基は本発明における背景抗原に含まれる。
[0010] 「免疫寛容 (immunotolerance)」とは、免疫寛容の対象となる抗原 (寛容原
； immunotolerance antigens)に対して特異的に免疫応答が失われる力、または低下 することを言う。正常な免疫動物の寛容原に対する免疫応答に対して、ある個体の同 じ寛容原に対する免疫応答が低下しているとき、この個体は寛容原に対する免疫寛 容を有すると言う。たとえば寛容原を投与した場合に産生される寛容原に対する抗体 の量が減少して 、れば、免疫応答が低下して 、ると見なすことができる。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1-a]実施例で用いた可溶型 gp64遺伝子の塩基配列を示す図である。 1から 720塩 基を示す。
[図 1-b]実施例で用いた可溶型 gp64遺伝子の塩基配列を示す図である。 721から 1486塩基を示す。
[図 2]pCAG-sgp64ベクターの模式的な地図を示す図である。
[図 3]Anti- Mouse IgGを用いたウェスタンブロット解析により、 sgp64Tgmにおいて gp64 に対する免疫寛容が誘導されていることを確認した結果を示す写真である。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明は、標的抗原以外に背景抗原として膜タンパク質が混在している免疫原を 用いて、標的抗原に対する抗体を作製する場合に有益なトランスジヱニック動物を提 供するとともに、このトランスジエニック動物を用いた抗体作製方法及びシステムを提 供する。
[0013] 本発明では、上述した通り、背景抗原は膜蛋白質である。背景抗原として膜蛋白質 が混在する場合としては、例えば、標的抗原を調製に用いた宿主生物由来の膜蛋白 質が混在する場合や、発現系に使用されたウィルス由来の膜蛋白質が混在する場 合などが挙げられる。たとえば、バキュロウィルス発現系を用いて標的抗原として膜蛋 白質を調製する場合のように、標的抗原がウィルスベクター由来の膜蛋白質とともに 発現される場合には、背景抗原として膜蛋白質が多量に混在する。
[0014] ここで、「膜蛋白質」とは、通常、生体膜を構成している蛋白質を意味し、例えば、生 体膜の内部に埋もれて 、る蛋白質を意味する力 本発明にお 、ては GPIアンカー型 蛋白質などのようにアンカーなどを介して細胞膜面につながれている蛋白質も含まれ る。また、ウィルス由来の膜蛋白質は、通常、出芽ウィルスの外披を構成する蛋白質 を言う。一例として、バキュロウィルスであれば、 gp64と呼ばれる蛋白質が膜蛋白質に 相当する。このような膜蛋白質の構造の多くは、細胞膜内に埋もれた領域 (細胞膜貫 通領域)、細胞膜の外に露出している領域 (細胞外領域)、細胞膜の内側に位置する 領域 (細胞内領域)を有する。また、膜蛋白質を機能的にみると、膜を構成する蛋白 質、受容体、輸送体などのシグナル伝達等に関与する蛋白質や、膜酵素など特異的 な反応を行うものなどが含まれる。そのため、こうした外来の膜蛋白質を免疫動物内 に導入した場合、免疫動物のいずれかの生体膜等で発現して、免疫寛容を誘導す るだけではなぐその他の好ましくない特性を付与することがある。その例として、バキ ュロウィルス由来の膜蛋白質 gp64が導入されたマウスでは、雄の不妊という問題が生 じる。
[0015] 本発明の抗体作製システムの非ヒト動物では、上記背景抗原として免疫原中に混 在し得るウィルス由来の膜蛋白質に対して免疫寛容が誘導される。例えば、バキュ口 ウィルス発現系を用いて調製した免疫原を用いる場合には、バキュロウィルス由来膜 蛋白質 gp64に対して免疫寛容が誘導された非ヒト動物が免疫動物として使用される 。免疫寛容の誘導方法として、従来では、背景抗原である膜蛋白質全長をコードす る遺伝子を免疫動物に保持させる方法が開発されていたが、本発明では、可溶化さ れた膜蛋白質 (以下「可溶型蛋白質」）をコードする遺伝子を非ヒト動物に保持させる
[0016] 「可溶型蛋白質」とは、本来、生体膜上で発現している膜蛋白質 (不溶性蛋白質)を 生体膜外で発現し得るように改変した蛋白質を指す。上述した通り、膜タンパク質に は、シグナル伝達に関与し得るような受容体や輸送体、膜酵素などの生体内のスイツ チのような機能を担うものが存在するため、こうした膜蛋白質が免疫動物の生体膜で 発現した場合に免疫動物に背景抗原に対する免疫寛容を誘導する以外に好ましく ない特性を付与し得る。このような不都合を回避すベぐ本発明では、膜蛋白質を生 体膜外で発現させ得るように可溶型としている。また、膜蛋白質全長を用い生体膜と いう局在した部位で発現させる従来の方法に比して、本発明では膜蛋白質を可溶型 として全身的な細胞質で発現可能となるため、より免疫寛容の誘導効率を高めること が期待できる。
[0017] 膜蛋白質を可溶型とする改変として、本発明では遺伝子工学的に膜蛋白質をコー ドする遺伝子を改変する方法が用いられる。遺伝子工学的な膜蛋白質の可溶化方 法として、膜貫通領域を欠損させることが挙げられる。膜貫通領域の欠損の程度は、 膜蛋白質を細胞外で発現させ得る限り、膜貫通領域の一部の欠損であってもよぐ 膜貫通領域全体の欠損であってもよい。膜貫通領域は、一般に 20-30アミノ酸よりな る αヘリックス構造をとるため、こうした構造に変化を与えるような変異をカ卩えることに より、可溶型としてもよい。
[0018] また、膜蛋白質を可溶型蛋白質に改変する場合、膜貫通領域以外の領域として細 胞内領域と細胞外領域とがあるが細胞内領域は備えている必要はなぐ免疫寛容を 誘導し得る抗原決定基を備えた細胞外領域のみに限定してもよ ヽ。さらに細胞外領 域としても免疫寛容を誘導し得る範囲、例えば、抗原性を保持し、膜蛋白質に対する 免疫寛容を誘導し得る抗原決定基を備えた範囲に限定することもできる。 [0019] 上記可溶型蛋白質は、膜蛋白質等力 膜貫通領域などを欠損させる以外に、他の ペプチドなど付加または挿入したキメラ蛋白質カゝら構成してもよい。キメラ蛋白質に付 カロ '挿入するペプチドとして、他の背景抗原 (この「他の背景抗原」は、膜蛋白質であ る力否かを問わな 、）の抗原決定基とすることもできる。このように一つの蛋白質に複 数の背景抗原に対する抗原決定基を備えることにより、複数の背景抗原に対する免 疫寛容を誘導することもできる。
[0020] 可溶型蛋白質の構築例として、バキュロウィルス膜蛋白質 gp64の場合を例に挙げ 説明する。 gp64は配列番号 1記載の DNA配列にコードされ、このうち膜貫通領域は 1465塩基から 1515塩基に、細胞外領域は 1塩基から 1464塩基にコードされている。し たがって、 gp64を可溶型とするには、上記膜貫通領域を欠失させる力または αへリツ タス構造を担うアミノ酸をコードする配列を他のアミノ酸に置換させることなどが挙げら れる。また、上記細胞外領域については配列番号 3に示す 1塩基から 1464塩基にコ ードされた 488アミノ酸残基力もなるタンパク質全体を用いてもよいが、細胞外領域の うち gp64とのクロスリアクティビティを維持し gp64の免疫寛容を誘導し得る範囲でその 長さを短縮してもよい。また、後述する免疫動物において gp64に対する免疫寛容を 誘導し得る範囲で、 gp64の細胞外領域のアミノ酸配列（配列番号 1から 3に記載の 1 力も 488アミノ酸残基）において一つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、付加ま たは挿入などの変異を加えてもよ!、。
[0021] 本発明では、こうした可溶型蛋白質をコードした遺伝子を非ヒト動物に保持させ、免 疫寛容を誘導している。本発明に用いることができる非ヒト動物としては、例えば、サ ル、ブタ、ィヌ、ラット、マウス、ゥサギ、などを挙げることができる。たとえば、ラット、マ ウス、ハムスターなどのげつ歯類は、好ましい非ヒト動物である。トランスジエニック動 物とすることで免疫寛容を誘導するには、げっ歯類のような、成熟が早ぐ遺伝子操 作の手法が確立されている非ヒト動物が有利である。特にマウスは、これらの条件を 高 、水準で満たすことができる非ヒト動物である。
[0022] 上記可溶型蛋白質をコードした遺伝子を保持する非ヒト動物は、外来遺伝子として 可溶型蛋白質をコードする遺伝子が導入されたトランスジエニック動物を作製するこ とにより得ることができる。例えば、トランスジエニックマウスは公知の方法に従って作 製することができる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380-7384(1980)) 0具体的には、 目的の遺伝子を哺乳動物の全能細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させる。得 られた個体のうち、体細胞および生殖細胞中に導入遺伝子が組み込まれた個体を 選別することによって、目的とするトランスジエニックマウスを作製することができる。遺 伝子を導入する全能細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有する ES細 胞のような培養細胞などが挙げられる。より具体的には、後述する実施例記載の方法 により作製できる。
[0023] また、本発明の可溶型蛋白質をコードした遺伝子を保持する非ヒト動物は、上記トラ ンスジエニック動物の子孫であってもよ 、。トランスジエニック動物が一且榭立されれ ば、通常、導入された遺伝子による形質 (本発明では免疫寛容の形質)を子孫に伝 えることは容易である。しかし、従来開発されているバキュロウィルス gp64が導入され たトランスジエニック動物では雄の不妊の問題が生じ、その免疫寛容の形質を効率よ く子孫に反映させることが困難であった。一方、本発明では、膜蛋白質の可溶型蛋 白質をコードした遺伝子を用いてトランスジェニック動物を作製することにより、膜タン ノ ク質全長をコードした遺伝子が導入されたトランスジエニック動物における好ましく ない特性の発現が回避された。その一例として、バキュロウィルス gp64の可溶型蛋白 質をコードする遺伝子を用いてトランスジェニック動物を作製することにより、雄の繁 殖能が維持され、効率的な繁殖により形質を子孫に伝えることが容易になっている。 可溶型 gp64を保持したトランスジエニック動物は効率良く繁殖することができ、その子 孫も免疫寛容の形質を保持しているため、後述する抗体作製等の免疫動物として有 用となる。このように膜蛋白質全長ではなぐ可溶型蛋白質をコードした遺伝子を非ヒ ト動物に保持させることにより、当該膜蛋白質に対する免疫寛容が誘導された免疫動 物をより広く利用しやすいものとすることができる。
[0024] 本発明の膜蛋白質の可溶型蛋白質をコードした遺伝子を保持した非ヒト動物は、 標的抗原蛋白を欠失させた遺伝子欠損動物 (いわゆるノックアウト動物)を基に作製 してもよい。また、蛋白質の可溶型蛋白質をコードした遺伝子を保持した非ヒト動物 は背景抗原発現トランスジヱニック動物をこうした標的抗原蛋白ノックアウト動物と交 配してもよい。これらにより、背景抗原発現および標的抗原蛋白質欠損という形質を 非ヒト動物に備えさせることもできる。このように両形質を保持した動物では、背景抗 原に対しては免疫寛容が誘導され、一方、標的抗原は先天的に保有していないため 、標的抗原をより異物として認識され易ぐ目的の抗体を効率よく得ることができる。
[0025] なお、本発明の背景抗原に対して免疫寛容が誘導された非ヒト動物において、免 疫原に含まれる可能性のある全ての背景抗原に対して、抗体の産生が抑制されるこ とは必ずしも重要ではない。標的抗原に対する抗体の産生と取得が妨げられない範 囲であれば、背景抗原を認識する抗体の産生は許容される。したがって、たとえば、 主要な背景抗原に対してのみ免疫寛容が誘導された免疫動物であっても、本発明 の好ましい免疫動物として利用することができる。
[0026] 本発明は上記膜蛋白質の可溶型蛋白質をコードした遺伝子を保持した非ヒト動物 を利用した抗体作製方法に関する。
上記膜蛋白質の可溶型蛋白質をコードした遺伝子を保持した非ヒト動物に標的抗 原以外に背景抗原として当該膜蛋白質を含む免疫原を免疫する工程と、前記標的 抗原に対する抗体または抗体をコードした遺伝子を取得する工程とが含まれる。
[0027] 本発明における免疫原には、標的抗原以外に背景抗原として少なくとも膜蛋白質 が含まれる。一般に、標的抗原は生物材料に由来する物質力もなる。生物材料は、 様々な成分を含む複雑な混合物である。したがって、標的抗原は、通常、多様な混 合物を原料として調製されている。その結果、標的抗原を高度に精製することは困難 である。言いかえれば、標的抗原を大量に、かつ高度に精製するには、多くの手間と 時間を要する。本発明では、このような標的抗原以外に背景抗原として膜蛋白質が 混在する免疫原を用いて、効率よく標的抗原に対する抗体を取得し得る方法が提供 される。
[0028] 具体的には、本発明の免疫原として、背景抗原として膜蛋白質が混在し得る細胞、 細胞培養液、細胞溶解物、ウィルス、あるいは未精製の抗原などを挙げることができ る。細胞やウィルスを用いる場合には、目的の抗原をコードする遺伝子を遺伝子組 み換え技術により細胞やウィルスに導入して、目的の抗原を人為的に発現させたも のを用いることができる。細胞やウィルスなどは、その全体のみならず、その一部分の みを免疫原として用いることもできる。また、細胞膜やウィルスエンベロープ部分のみ を免疫原として用いることも可能である。こうした細胞やウィルス全体、その一部として 細胞膜やウィルスエンベロープを免疫原として用いた場合、細胞膜やウィルスェンべ ロープに含まれる膜蛋白質が背景抗原として混在する。
[0029] 本発明における望ましい免疫原の一つに、ウィルス粒子、またはその一部を示すこ とができる。ウィルスは、核酸と限られた蛋白質や糖等の比較的単純な成分で構成さ れている。したがって、標的抗原の取得を妨害する背景抗原の種類も限られる。ウイ ルス粒子、その一部中の標的抗原の取得を妨害する背景抗原として、粒子表面の膜 蛋白質が挙げられる。粒子表面は免疫動物に投与された場合には、抗原性が高ぐ 抗体産生を誘導し易い。従って、この少ない背景抗原の中でも、粒子表面などの膜 蛋白質である背景抗原に対して免疫動物に免疫寛容を誘導すれば、本発明に基づ く抗体の作製方法をより有利に実施することができる。
[0030] 本発明において、免疫原として用いることができるウィルスの中で、好適なものの一 つにバキュロウィルス (Baculovirus)がある。バキュロウィルスは、 2本鎖 DNAからなるゲ ノムがキヤプシド蛋白質に覆われた構造を有する昆虫ウィルスである。中でもバキュ ロウィルスの一種である核多角体病ウィルス (NPV)を利用した発現系は、外来性遺伝 子の発現システムとして有用である。 NPVは強力なプロモーター活性を有して 、る。 したがって、 NPVのゲノムに外来性の遺伝子を組み込むことで、任意の蛋白質を大 量に生産させることができる。具体的には、ポリヘドリンと呼ばれる蛋白質をコードす る遺伝子を、任意の遺伝子に組み換えることによって、外来性の遺伝子の強力な発 現が誘導される。
[0031] 上記バキュロウィルス発現系で発現させ得る外来性遺伝子には、特に限定はなく 任意の遺伝子が用いられる力 バキュロウィルスは膜蛋白質を発現させるための好 適な系として利用し得ることから、好適な遺伝子の例としては膜蛋白質をコードする 遺伝子が挙げられる。バキュロウィルス発現系では、バキュロウィルスの膜蛋白質とと もに目的の膜蛋白質を、その構造を維持した状態で発現させることができる。また、 発現生成物を出芽ウィルスとして容易に回収できることも、バキュロウィルス発現系の 利点である。
[0032] バキュロウィルスを用いて標的抗原である膜蛋白質を発現させる方法としては、例 えば、 W098/46777及び Loiselら (T.P丄 oisel et al, Nature Biotech. 15: 1300-1304 (1997))に記載の出芽バキュロウィルスを用いた方法が挙げられる。より詳細には、外 来性蛋白質をコードする遺伝子を含む昆虫細胞用の組換えベクターを作製し、バキ ュロウィルス DNAと共に S19等の昆虫細胞へ導入する。組換えベクターにコードされた 外来性の膜蛋白質は、感染細胞が死滅する前に感染細胞より細胞外に放出される 成熟ウィルス粒子 (ビリオン)上に発現され、外来性蛋白質を発現する組換えウィルス を得ることができる。
[0033] 本発明において、出芽ウィルスとは出芽 (budding)により感染細胞力も放出されるゥ ィルスのことである。一般に細胞膜を被ったウィルスは細胞が破壊されて 、な 、状態 でも当該ウィルスに感染した細胞力 発芽し、継続的に放出されるのに対し、膜を被 らな 、アデノウイルスや、核膜を被ったヘルぺスウィルスは細胞が破壊された時に一 斉に放出される。本発明においては、特に出芽ウィルスが好ましい。また、本発明に おいて組換えウィルスを感染させる宿主は、当業者であれば、用いるウィルスの種類 に応じて、ウィルスの増殖を可能ならしめる宿主を適宜選択することができる。例えば 、バキュロウィルスを用いる場合、 S19等の昆虫細胞の使用が考えられる。一般に、バ キュロウィルス-昆虫細胞を用いたタンパク質発現系は、哺乳動物細胞と同様に脂肪 酸ァセチルイ匕及び糖鎖付加等の翻訳と同時または翻訳後の修飾が行われること、並 びに、哺乳動物細胞系よりも異種タンパク質の発現レベルが高いこと (Luckow V.A. and Summers M.D., Virol. 167: 56 (1988))から有利な系であると考えられている。
[0034] 標的抗原である外来性蛋白質を発現しているウィルスは、例えば、外来性蛋白質 をコードする遺伝子を含む組換えウィルスを感染させた宿主を培養することによって 得ることができる。または、上述の W098/46777及び Loiselら (T.P丄 oisel et al., Nature Biotech. 15: 1300-1304 (1997》の方法の様に、外来性蛋白質をコードする組換えべ クタ一をバキュロウィルスと共に昆虫細胞に導入することにより、細胞外へ放出される バキュロウィルスの膜上に外来性蛋白質を発現させることもできる。また、 3 ^1 ら（ D.Strehlow et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 97: 4209- 4214(2000))の方法のように、 外来性蛋白質をコードする遺伝子を導入した Moloneyウィルス由来ベクターより作製 した組換えウィルスを PA317等のパッケージング細胞に感染させることにより、細胞外 へ放出される Moloney murine leukemiaウィルスの膜上に外来性蛋白質を発現させる ことができる。これらは外来性蛋白質を発現させるウィルスの一例であり、本発明の免 疫原に用いることができる外来性蛋白質を発現しているウィルスは、これらの方法に より調製されたものに限定されない。
[0035] 上述のようにして調製された組換えウィルスは、必要に応じて公知の手法により精 製することができる。例えば、増加密度勾配遠心法 (augment densitygradient centrifogationXAlbrechtsen et al, J.Virological Methods 28: 245—256 (1990);
Hewish et al., J.Virological Methods 7: 223-228 (1983》、サイズ排除 (size exclusion) クロマトグラフィー (Hjorth and Mereno- Lopez, J.Virological Methods 5: 151-158 (1982); Crooks et al., J.Chrom. 502: 59—68 (1990); Mento S.J. (Viagene, Inc.) 1994 Williamsburg Bioprocessing Conference)^モノクローナノレ抗体及びフコース硫酸含有 多糖類等を利用したァフィ-ティークロマトグラフィー (Najayou et al., J.Virological Methods 32: 67-77 (1991); Diaco et al., J.Gen.Virol. 67: 345-351 (1986); Fowler, J.Virological Methods 11: 59—74 (1986);特再表 97/032010)、 DEAEイオン交換クロマ トグラフィー (Haruna et al., Virology 13: 264-267 (1961》等がウィルスを精製する方 法として知られている。したがって、上述の方法、または、これらの方法を組み合せて 精製しても良い。
[0036] 上記のように調製された免疫原を用いて、免疫動物を免疫する。本発明で用いられ る免疫動物は、免疫原中に含まれる背景抗原である膜蛋白質に対して免疫寛容が 誘導された非ヒト動物が用いられる。背景抗原の膜蛋白質に対する免疫寛容の誘導 は、上述した通り、当該膜蛋白質の可溶型蛋白質をコードした遺伝子を免疫動物に 保持させること〖こより実施することができる。
[0037] 上記にぉ 、て膜蛋白質調製にぉ 、て好適な発現系として示したバキュロウィルス 発現系を免疫原調製に用いた場合、免疫動物には、可溶型 gp64をコードした遺伝子 を保持させ gp64に対して免疫寛容が誘導された非ヒト動物を用いることが好ま U、。 ここで免疫動物として gp64全長をコードした遺伝子を保持した非ヒト動物を用いること もできるが、雌雄共に繁殖能を有することから効率的に生産され広く利用可能な可溶 型 gp64トランスジエニック動物などを用いることが好ましい。従って、本発明の好適な 実施形態として、可溶型 gp64をコードした遺伝子を保持した非ヒト動物を免疫動物に 用い、標的抗原として膜蛋白質を発現させた出芽バキュロウィルスを免疫原として免 疫を行うことが挙げられる。
[0038] 本発明の抗体作製方法によれば、背景抗原として膜蛋白質の混在による標的抗原 に対する抗体取得の妨害作用を抑制することができる。したがって、本発明を用いれ ば、バキュロウィルス発現系の外来性蛋白質の発現システムとしての利点を、免疫原 の作製においても十分に生かすことが可能となる。
[0039] なお、免疫力も抗体取得までの方法は公知の方法を用いることができる。免疫原に よる動物の免疫は、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗 原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、免疫原を
PBS(Phosphate-Buffered Saline)や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに 対し、所望により通常のアジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。 アジュバントには、たとえばフロイント完全アジュバントが用いられる。さらに、その後、 フロイント不完全アジュバントに適量混合した免疫原を、 4〜21日毎に数回投与する ことが好ましい。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法 により確認する。
[0040] 血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、免疫した動物の血液を 採取し、血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血 清を使用してもよいし、必要に応じこの血清力 ポリクローナル抗体を含む画分をさら に単離して、これを使用してもよい。
[0041] 本発明の抗体作製方法にモノクローナル抗体作成方法を組み合わせてもよい。モ ノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体 レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から抗体産生細胞を採取してクロー ユングする。抗体産生細胞としては、たとえば脾細胞を用いることができる。抗体産生 細胞のクローユングには、細胞融合法を用いることができる。前記抗体産生細胞と融 合される他方の親細胞としては、たとえば哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。 より好ましくは、融合細胞 (ハイブリドーマ）の選択マーカーとなる、特殊な栄養要求 性や薬剤耐性を有するミエローマ細胞が挙げられる。前記抗体産生細胞とミエロー マ細胞は、基本的には公知の方法に準じて細胞融合させることができる。細胞融合 を利用したモノクローナル抗体の作製方法は、たとえばミルスティンらによって確立さ れている (Galfre, G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46)。
[0042] 細胞融合により得られたハイプリドーマは、選択培養液で培養することにより選択さ れる。選択培養液は、細胞融合に用いたミエローマ細胞の特性などに応じて選択さ れる。選択培養液としては、たとえば、 HAT培養液 (ヒポキサンチン、アミノプテリンお よびチミジンを含む培養液）が用いられる。ハイプリドーマは、 目的とするノ、イブリドー マ以外の細胞 (非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、当該 HAT培養液で培養さ れる。通常、数日〜数週間培養を継続することにより、ハイプリドーマを選択すること ができる。次いで、通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのスクリーニングおよびクロー-ングを行う。
[0043] 次いで、得られたノヽイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスの腹水としてモ ノクローナル抗体を回収することができる。腹水からモノクローナル抗体を精製するこ ともできる。モノクローナル抗体の精製には、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテ イン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 目的の抗原をカップリングしたァフ ィ-ティーカラムなどを利用することができる。
[0044] このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生さ せた組換え型抗体とすることができる（例えば、 Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. W.， THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照)。組換え型抗体は、それ をコードする DNAをハイプリドーマ、または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産 生細胞力 クローユングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生 させる。
[0045] さらに、本発明の抗体作成方法に抗体の改変および修飾の技術を組み合わせて、 抗体断片、抗体修飾物を得ることもできる。たとえば、抗体断片としては、 Fab, F(ab')2、 Fv又は重鎖と軽鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv(scFv) (Huston, J. S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879—5883) などである。抗体修飾物として、ポリエチレングリコール (PEG)等の各種分子と結合し た抗体を使用することもできる。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化 学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において 既に確立されている。
[0046] 発明の抗体作成方法にヒト抗体への改変技術を組み合わせることもできる。ヒト抗 体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジエニック動物（国際特許出願公開 番号 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735参照）を基に背景抗原の可溶型蛋白質をコードする遺伝子を導入し、 ヒト抗体作製能および背景抗原に対する免疫寛容能を保持させて、 目的の抗原で免 疫することで目的のヒト抗体を取得してもよ 、。
[0047] また、本発明の方法により得られた抗体は、免疫動物に由来する非ヒト抗体由来の 可変領域とヒト抗体由来の定常領域力もなるキメラ抗体とすることができる。また免疫 動物に由来する非ヒト抗体の CDR (相補性決定領域）とヒト抗体由来の FR (フレームヮ ーク領域)および定常領域力もなるヒト化抗体とすることもできる。これらの改変抗体 は、既知の方法を用いて製造することができる。具体的には、たとえばキメラ抗体は、 免疫動物の抗体の重鎖、および軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖および軽鎖の定 常領域力もなる抗体である。免疫動物由来の抗体の可変領域をコードする DNAを、ヒ ト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主 に導入し産生させることによって、キメラ抗体を得ることができる。
[0048] ヒト化抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は 、免疫動物由来の抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region)を、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般 的な遺伝子糸且換え手法も知られて ヽる。
[0049] 具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region;
FR)を連結するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有す るように作製した数個のオリゴヌクレオチド力も PCR法により合成する。得られた DNA をヒト抗体定常領域をコードする DNAと連結し、次 、で発現ベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し産生させることによりヒト化抗体を得られる（欧州特許出願公開番 号 EP 239400、国際特許出願公開番号 WO 96/02576参照）。 CDRを介して連結され るヒト抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択さ れる。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成 するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよ ヽ（Sato, K.et al, Cancer Res. (1993) 53, 851—856)。
[0050] 更に、免疫動物の抗体産生細胞から、抗体をコードする遺伝子を取得することがで きる。抗体をコードする遺伝子を取得する方法は、制限されない。たとえば、可変領 域や CDRをコードする遺伝子を铸型として、 PCR法によって当該遺伝子を増幅するこ とによって抗体をコードする遺伝子を得ることができる。抗体遺伝子を PCR法によって 増幅するためのプライマーが公知である。得られた遺伝子を適当な発現系を用いて 発現させることによって、目的とする抗体を製造することができる。あるいは、本発明 によって得られた遺伝子を、種々の改変抗体 (ヒト抗体由来の定常領域力 なるキメ ラ抗体、免疫動物由来の抗体の相補性決定領域 (CDR; complementarity determining region)をヒト抗体の相補性決定領域に移植されたヒト化抗体)を製造す るために利用することもできる。
本発明により、膜蛋白質の可溶型蛋白質をコードした遺伝子を保持した非ヒト動物 を含む抗体作製システムが提供される。
[0051] ウィルスの発現ベクターなどを用いて免疫原を調製した場合、そのウィルス由来あ るいはウィルス発現ベクターが導入された宿主細胞由来の膜蛋白質が背景抗原とし て混在する場合がある。この背景抗原である膜蛋白質は、標的抗原である外来性遺 伝子によるものではなく、ベクターや宿主などの発現系に由来する場合がほとんどで ある。そのため、発現系毎に混在し得る背景抗原の膜蛋白質を同定する。そして、そ の膜蛋白質の可溶型蛋白質をコードした遺伝子をトランスジエニック技術により非ヒト 動物に導入し、得られたトランスジ ニック動物において膜蛋白質に対する免疫寛容 を誘導されて ヽるかを確認する。非ヒト動物にお ヽて免疫寛容が誘導されて ヽるか否 かは、実施例に示したように、血清中に背景抗原である膜蛋白質に対する抗体が生 成されている力否かを確認することにより行うことができる。
[0052] 上記背景抗原に対する免疫寛容の誘導が確認された非ヒト動物は、背景抗原の膜 蛋白質が可溶型として発現されるため、バキュロウィルス gp64で観られたような雄に おける繁殖能の欠損などの好ましくない表現系の出願が回避され、広く利用可能な 免疫動物として提供し得る。そのため、本発明の膜蛋白質の可溶型をコードした遺伝 子を保持する免疫動物と、当該膜蛋白質が背景抗原として産生される発現系とを組 み合わせることにより、効率的な抗体作製を支援し得るシステムを構築することができ る。
[0053] 例えば、上述において詳述したバキュロウィルス発現系であれば、可溶型 gp64をコ ードした遺伝子を保持した非ヒト動物と組み合わせることにより、バキュロウィルス発現 系の利点を抗体作製に反映させることができる。より具体的には、バキュロウィルス発 現系では、 gp64とともに標的抗原として所望の蛋白質、特に、膜蛋白質をその立体 構造を保持したまま発現させることができ、この発現産物は出芽ウィルスとして容易に 回収することができる。この出芽ウィルスを免疫原とし、可溶型 gp64をコードした遺伝 子を保持した非:ヒト動物を免疫動物として免疫する。この可溶型 gp64をコードした遺 伝子を保持した非:ヒト動物では、 gp64に対して免疫寛容が誘導されているため、免 疫原である出芽ウィルス上に gp64が多量に発現されていても、この gp64に対する抗 体産生は抑制された状態で、標的抗原である膜蛋白質に対する抗体を産生させるこ とが可能となる。従って、可溶型 gp64をコードした遺伝子を保持した非:ヒト動物を用 V、ることにより、 gp64が背景抗原としてバキュロウィルス上で存在して 、る状態でも、 標的抗原に対する有利に抗体産生を誘導することが可能となる。その結果、本シス テムにより得られる抗体は、標的抗原に対する純度の高い抗体を得ることが可能とな る。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0054] [実施例 l]sgp64トランスジヱニックベクターの構築
gP64遺伝子 (配列番号：1、全長； 1539bp)の膜貫通領域（1465塩基から 1539塩基） を欠損させ細胞外領域のみを持つ遺伝子断片 (可溶型 gp64; 1464bp、配列番号： 3) を PCRにて調製した。
[0055] 具体的には、 gp64の 5 '末端配列と制限酵素 EcoRI認識配列と KOZAK配列を結合 した 5'プライマー（64F1 : 5，- GAATTCCACCATGGTAAGCGCTATTGTT- 3'、配列 番号： 5)と gp64の膜貫通領域直前の配列に EcoRI認識配列を 5'末端接続した 3 'ブラ イマ一（s64Rl : 5'- GAATTCTCATTATACATGACCAAACATGAACGA- 3'、配列番 号： 6) (図 1- a、図 1- b)、およびテンプレート DNAとして pCAG- gp64ベクターを用い、 以下の条件で PCR(Polymerase Chain Reaction)法を行った。 PCR反応溶液の組成は 、 10 X ExTaq buffer(TaKaRa) 5 μ L, ExTaq付属 dNTPミクスチヤ一 4 L,プライマー 64FK10 μ mole/L) 1 μ L,プライマー s64Rl(10 μ mole/L) 1 μ L, pCAG- gp64 (500 pg/ μ L) l μ L, ExTaq (5 units/ μ L, TaKaRa) 0.5 ^ L, H O 37.5 μしとした。サイクノレ
2
反応は、 94°Cで 5分加熱した後、 94°C 15秒、 57°C 30秒および 72°C 30秒を 25サイク ル、その後、 72°C 7分処理し、 4°C保存とした。増幅バンドを pGEM- Teasy (Promega) にサブクロー-ング後、 E.coli (DH5 α ,ΤΟΥΟΒΟ)へトランスフォームした。 Τ7プライマ 一 (5'- TAATACGACTCACTATA- 3'、配列番号： 7)、および SP6プライマー
(5'- CATACGATTTAGGTGACACTATAG- 3'、配列番号： 8)を用いてコロニー PCRを 行い、インサートが確認されたクローンの塩基配列を ABI Prism377 DNA sequencerを 用 ヽて、 BigDyeし ycle Sequence kit (Applied Biosystems)と T7フフイマ ~~、ある ヽは SP6プライマーにより解析し、 目的の遺伝子を含むクローンを確認した。このクローン 力 gp64を含む断片を制限酵素 EcoRI処理により切り出し、制限酵素 EcoRI処理した pCAGGSベクターに挿入し、 E.coli (DH5 α )へトランスフォームした。 gp64断片の挿入 方向は、制限酵素 Xholおよび Xbal処理により得られたバンドのサイズ (約 2.1kb)で 判断し、 pCAG-sgp64ベクターを作製した（図 2)。設計通りのクローンを 250 mLの LB 培地を用い 37 °Cでー晚培養し、 Endofree MAXI kit (QIAGEN)を用いて精製して、プ ラスミド（581.6 /z g)を得た。
[実施例 2] sgp64Tgm榭立
Tgm作製に用いるインジェクション用 DNAフラグメントの調製は、 pCAG-sgp64ベクタ 一を制限酵素 Sailおよび Pstlで処理した後、 sgp64遺伝子を含む断片 (約 3.7kb)を切り 出し、 Gel Extraction Kit (QIAGEN)により回収し、この断片を 3ng/ μ 1になるように PBS—で希釈することにより行った。 DNAフラグメントを注入するマウス前核期胚の回収 は、次のように行なった。すなわち、 BALB/cA雌マウス（日本クレア)を過排卵処理 (5 i.uの eCG (セロト口ピン;帝国臓器)を腹腔内投与、さらに 48時間後 5 i.uの hCG (プべ ローゲン;三共)を腹腔内投与した後、同系統の雄マウス（日本クレア)と交配した。翌 朝、膣栓を確認した雌マウスの卵管を灌流することにより、前核期胚を回収した。 DNAフラグメントの前核期胚への注入は、マイクロマニピュレーターを用いて行った（ ジーンターゲテイングの最新技術 (洋土社)、 190-207 2000) o翌日、 2細胞期に発生 していた胚を、偽妊娠 1日目の受容雌の左右の卵管に、各 10個前後（1匹あたり 20個 前後）を移植した。分娩予定日に至っても産仔を娩出しな力つた受容雌については、 帝王切開を施し里親に哺育させた。
[0057] 上記方法に基づいて、 DNAフラグメントを 497個の BALB/cAマウス前核期胚へ注入 し、そのうちの 2細胞期胚に発生した 430個を偽妊娠受容雌の卵管に移植した。その 結果、 66例の産仔が得られた。ここで得られた産仔について導入された遺伝子の確 認を以下の通り行った。
[0058] マウス尾を採取し、 Lysis buffer (50mM Tris- HC1 pH8.0, 0.1M NaCl, 20mM EDTA,
1%SDS, Proteinase K lmg/mL:TaKaRa)で 55°C—晚処理した後、核酸自動分離装 置（KURABO, NA-1000P)を用いゲノム DNAを抽出し、サザンブロット法および PCR 法による導入遺伝子の確認を行った。サザンプロット法による導入遺伝子の確認は、 抽出したゲノム DNA (15 ^ g)を制限酵素 EcoRIで処理し、ァガロースゲルで泳動後、 ナイロンメンブレン（Hybond N+： Amersham)へアルカリブロット法によりトランスファー した。プローブには、制限酵素 EcoRI処理した pCAG-sgp64ベクターの sgp64を含む約 1.5kbの断片を用い、 32Pでラベルした後、トランスファーしたゲノム DNAとハイブリダィ ズさせることによりサザンブロットを行った。ハイブリダィゼーシヨンは、 5x SSPE, 50%ホ ルムアミド， 5xデンハルト， 0.5% SDSをハイブリダィゼーシヨン溶液として用い、 45°Cに てー晚ハイブリダィズさせた。ナイロンメンブレンの洗浄条件は、 0.1% SDSを含む 2x SSCで 65°C 30分間、さらに、 0.1% SDSを含む lx SSCで 65°C 30分間で行なった。そ の後 BAS2000(FUJIX )にて、シグナルを検出した。
[0059] また、 PCR法による導入遺伝子の確認は、センスプライマーに上記 64F1を、アンチ センスプライマーには上記 s64Rlを用い、以下の条件で行なった。 PCR反応溶液の組 成は、ゲノム DNA(100ng/ ^ L) 1 ^ L, 10 X ExTaq buffer(TaKaRa) 5 μ L, ExTaq付属 dNTPミクスチヤ一 4 L,プライマー 64F1(10 μ mole/L) 1 μ L,プライマー s64Rl(10 μ mole/L) 1 μ L, ExTaq (5 units/ μ L, TaKaRa) 0.5 ^ L, H O 37.5 μしとした。サイク
2
ル反応は、 94° Cで 5分後、 94° C 15秒、 57° C 30秒、 72° C 30秒を 35サイクル、 72° C で 7分処理後、 4° C保存とした。増幅された産物を電気泳動し、約 1.5kbのバンドの有 無により行った。
[0060] 上記方法により、 66例の産仔のうち、 3例力 gp64遺伝子が導入された Tgm(DNAフラ グメントを注入して得られた Tgmを Founderと以下記載)であることが確認された (表 1) 。この 3匹の Founderは 1匹が雄で 2匹が雌であつた。
[0061] [表 1]
Figure imgf000021_0001
[0062] 得られた founderは 8週齢になった時点で、 BALB/cAマウスと交配させた。具体的に は、上記 3匹 Founderの内、雄 Founder (ライン番号 41)と 5例の雌との交配により 26匹 の産仔が得られ、これら産仔の内 12匹が Tgm (F1マウス）であった。残りの 2匹の雌 Founder (ライン番号 36および 51)からは、それぞれ 16匹、 15匹の産仔が得られ、 Tgm (Flマウス、雌雄含む）はそれぞれ 9匹、 8匹であり、雄 Tgmはそれぞれ 4匹、 1匹であつ た (表 2)。
[0063] [表 2]
Figure imgf000021_0002
[実施例 3]雄 Tgmの繁殖能
実施例 2において得られた雄 Tgm(Flマウス)の繁殖能を調べた。繁殖能は 雄 sgp64Tgm (Flマウス）力 週齢になった時点で、 BALB/cAマウスと交配させ、その産 仔の有無、数を確認することにより行った。
[0065] 3ラインの Founderからそれぞれ得られた雄 Tgm(Flマウス）（各一匹）と 2例の雌との 交配により、それぞれ 9匹 (雌 5、雄 4)、 9匹 (雌 2、雄 7)、 10匹 (雌 6、雄 4)の産仔が得られ 、これらの内 Tgmは、それぞれ 9匹 (雌 5、雄 4)、 8匹 (雌 2、雄 6)、 5匹 (雌 4、雄 1)であり（ 表 3)、 3ラインいずれの雄 Tgmにおいても、正常な繁殖能を有していることが確認でき た。
[0066] sgp64雄 Tgm (F1マウス）の繁殖成績
[表 3]
Figure imgf000022_0001
[0067] [実施例 4]ウェスタンブロット法による gp64に対するトレランスの確認
sgp64Tgmに出芽バキュロウィルス (pepTl-AcMNPV(pepTl-BV))を以下の通り免 疫し、 gp64に対するトレランス誘導の有無を確認した。
免疫はフロイント完全アジュバント (Difco)と不完全アジュバント (Difco)を用いて常 法に従ってェマルジヨンを作製し、皮下投与する事により行った。初回免疫量は lmg/ 匹で、 2回免疫量は 0.5mg/匹で行った。また 2回免疫は初回免疫から 14日後に行つ た。初回免疫力も 17日後に眼窩採血を行い、血清を採取した。コントロールとして、非 トランスジェニックマウスに対しても同様に免疫およびその後の血清採取を行った。
[0068] Tgmにおける gp64に対するトレランスを確認するために以下のウェスタンブロット解 析を行った。
抗原に用いた pepTl-BVを、 12%ゲルを用い 1 μ g/レーンで還元条件下 SDS-PAGE を行った。泳動後 PVDF膜にエレクトロブロットした。この膜に、上記において採取した 血清を 1/1000希釈し、反応させた後、 PBS-T (0.05% Tween20含有 PBS)を用いて、室 温で 5分間の洗浄を 3回行なった。洗浄後、 1/1000希釈した Biotin-Anti-Mouse IgG( y XZymed)と Streptavidin-AlkalinPhosphatase(Zymed)を反応させた。発色はアルカリ ホスファターゼ染色キットけ力ライ)を用いて行った。 [0069] Anti-Mouse IgGによる染色では非トランスジエニックマウス (non- Tgm)では 3匹とも強 く染色されていた（図 3)。一方、 sgp64Tgmでは gp64力 ほとんど染まらず、 sgp64Tgm において、 gp64に対するトレランス誘導を確認することができた。
産業上の利用可能性
[0070] 本発明により、従来のバキュロウィルスの膜蛋白質 gp64遺伝子が導入されたトラン スジエニック動物おける雄の不妊と 、う問題が解消された新たなトランスジエニック動 物が提供された。これは gp64という膜蛋白質をコードする遺伝子のうち、膜貫通領域 をコードする配列を欠損等させて可溶型 gp64を発現 (つまり gp64を細胞膜外に発現） させることにより、上記問題の解決を図ることができた。したがって、本発明のように、 膜蛋白質の可溶型蛋白質をコードした遺伝子が導入されたトランスジエニック動物で は、膜蛋白質全長をコードした遺伝子が導入されたトランスジヱニック動物における 好ましくない表現型、例えば、雄不妊などの好ましくない特性の出現を回避すること が可能となる。
[0071] また、上記の通り、可溶型蛋白質をコードした遺伝子が導入されたトランスジ -ッ ク動物では、膜蛋白質の全長をコードした遺伝子が導入されたトランスジヱニック動 物と同様に、膜蛋白質に対する免疫寛容が誘導されることが確認されている。したが つて、免疫原中に背景抗原として膜蛋白質が混在しているような場合には、当該膜 蛋白質の膜貫通領域等を欠損させた可溶型蛋白質をコードする遺伝子を外来遺伝 子として有するトランスジエニック動物を免疫動物として用いることが有利となる。つま り、当該免疫動物は背景抗原の膜蛋白質に対する免疫寛容が誘導され、目的の抗 原に対する特異的な抗体が有利に産生される上に、膜蛋白質全長が導入されたトラ ンスジエニック動物の好ましくない表現型の出現が回避されるため、抗体作成用のシ ステムとして一層利用し易いものとなる。
[0072] また、本発明の動物を用いて作製された抗体は、背景抗原に対する抗体の混在が な ヽか又は極めて少な!/、ため、高純度の抗体として提供される。

Claims

請求の範囲
[I] 膜蛋白質の可溶型蛋白質をコードした遺伝子を保持した非ヒト動物。
[2] 可溶型蛋白質をコードした遺伝子が外来力も導入されたトランスジエニック動物から なる、請求項 1記載の非ヒト動物。
[3] 可溶型蛋白質をコードした遺伝子が外来力も導入されたトランスジエニック動物の子 孫である、請求項 2記載の非ヒト動物。
[4] 膜蛋白質がウィルス由来である、請求項 1〜3のいずれかに記載の非ヒト動物。
[5] ウィルスがバキュロウィルスである、請求項 4に記載の非ヒト動物。
[6] 膜蛋白質が gp64である、請求項 5記載の非ヒト動物。
[7] 可溶型蛋白質が膜貫通領域を欠損した gp64である、請求項 6記載の非ヒト動物。
[8] 可溶型蛋白質が gp64の細胞外領域からなる、請求項 6記載の非ヒト動物。
[9] 非ヒト動物がマウスである、請求項 1〜8のいずれかに記載の非ヒト動物。
[10] 雄が繁殖能を有する、請求項 6〜9のいずれかに記載の非ヒト動物。
[II] 請求項 1〜10のいずれかに記載の非ヒト動物を、標的抗原を含有する免疫原で免疫 する工程、
前記標的抗原に対する抗体または抗体をコードした遺伝子を取得する工程を含む 、抗体作製方法。
[12] 免疫原がウィルス粒子またはその一部である、請求項 11記載の抗体作製方法。
[13] ウィルスがバキュロウィルスである、請求項 12記載の抗体作製方法。
[14] 標的抗原が膜蛋白質である、請求項 11〜13のいずれかに記載の抗体作製方法。
[15] 請求項 1〜10記載の非ヒト動物を含む、抗体作製システム。
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