WO2001066714A1 - INHIBITEURS DE L'ACTIVITE DE L'AMYLASE-$g(a) - Google Patents

INHIBITEURS DE L'ACTIVITE DE L'AMYLASE-$g(a) Download PDF

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Takashi Makino
Ritsuo Aiyama
Yoriko Deguchi
Masaaki Watanuki
Masako Nakazawa
Harumi Mizukoshi
Masato Nagaoka
Katsuhisa Harada
Kuniko Osada
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Kabushiki Kaisha Yakult Honsha
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    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to an ⁇ -amylase activity inhibitor comprising, as an active ingredient, polyphenols derived from guava (Psidium guajava Linn.) (Hereinafter, also referred to as “guavapolyphenols”), and an inhibitor comprising the same.
  • polyphenols derived from guava Psidium guajava Linn.
  • Guava a shrub native to Central America, whose fruits, roots and leaves are used in the private sector as a crude drug for diabetes and diarrhea control, have recently been obtained by extracting the leaves with water or a hydrophilic solvent.
  • the extract was found to have ⁇ -amylase activity inhibitory activity, and it was reported that it could be used as a health drink (Japanese Patent Publication No. 60-36746) or a diet food or drink (Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-59539). I have.
  • the extract of guava contained various components such as sesquiterpene and tannin, and its monoamylase inhibitory activity was not sufficient, and it was not possible to exert an excellent dietary effect.
  • an object of the present invention is to provide a component having particularly excellent ⁇ -amylase inhibitory activity among guava extracts and exhibiting a more effective diet effect, and a drink containing the same. To provide food. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies on the polymer component in the guava extract, and have found that an aqueous extract of guava leaves or fruits obtained by ultrafiltration has a molecular weight of 5,000 or more.
  • the present inventors have found that polyphenols obtained by fractionating the fractions using specific hydrophobic chromatography have high inhibitory activity on human amylase, and completed the present invention.
  • the present invention extracts guava leaves and / or fruits from one or more solvents selected from water and a hydrophilic solvent, and removes substances having a molecular weight of less than 5000 from the extract by ultrafiltration. After that, using hydrophobic chromatography using a butyl group-supporting filler as the stationary phase, at a flow rate of 1 mL / min, a 0.02 mol / L aqueous solution of monosodium dihydrogen phosphate and a 0.02 mol / L aqueous solution were added.
  • an ⁇ -amylase activity inhibitor comprising, as an active ingredient, a polyamylase activity inhibitor and a polyphenol having the following physicochemical properties.
  • the molecular weight is from 5,000 to 100,000.
  • UV absorption photometer (measurement wavelength: 60nm)
  • Solution B 0. 02mo l / L ⁇ Na 3 P0 Asetonitoriru Z water mixture containing 4 (15: 85 (v / v) in accordance solution (pH 11. 4)
  • the present invention also provides a food or drink containing the above ⁇ -amylase activity inhibitor. '
  • the present invention also provides use of the above polyphenols for producing a diet food or drink.
  • FIG. 1 is a diagram showing an infrared absorption spectrum of guava polyphenols.
  • FIG. 2 is a diagram showing a spectrum of CP-MAS of guava polyphenols.
  • FIG. 3 is a diagram showing an elution curve of partially purified guava polyphenols.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of liquid mouth Matodaraf analysis of guava polyphenols. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the polyphenols of the present invention can be obtained by the following steps 1 to 3.
  • Guava leaves and Z or fruit are extracted with one or more solvents selected from water and a hydrophilic solvent to obtain a guava extract.
  • Guava used in the present invention is guava (Ps idium guaj ava Linn.) Belonging to the genus Bunjiro of the family Myrtaceae, and its production area is not particularly limited. Those that are widely grown or grown locally can be used.
  • the guava leaves or fruits are used, which may be raw, semi-dried, or dried, but dried leaves are particularly preferred. In the case of using fruits, it is preferable to use immature young fruits, ban-ka. These raw materials are preferably used by pulverization. For example, in the case of leaves, it is preferable to use those cut into a size of about 3 to 5 mm. In order to improve the flavor, roasting after drying may be used.
  • One or more solvents selected from water and a hydrophilic solvent are used as the extraction solvent.
  • the hydrophilic solvent include methanol, ethanol, n-propyl alcohol, acetone, propylene glycol and the like. These may be used as a mixture of two or more kinds, or may be used in the form of a hydrated solvent mixed with water at an arbitrary ratio.
  • the most preferred solvent is water in consideration of operability and safety.
  • the amount of solvent used is not particularly limited, but when guava leaves are used, the ratio of leaf to extraction solvent is 1:20 (weight). When berries are used, fruit is used. Result) It is preferable to use about 10 times by weight of the solvent with respect to 1.
  • Extraction using guava leaves varies depending on the solvent used, but in the case of water, 50 to 100 ° (preferably, 80 to 100 ° C). It is preferred to extract for 0 minutes, preferably for 5 to 25 minutes.
  • the pH may be increased by adding an aqueous solution of sodium bicarbonate or the like to the extraction solvent to increase the pH.
  • Dilute mineral acids for example, dilute hydrochloric acid
  • organic acids for example, succinic acid, citric acid, lactic acid, malic acid
  • Tartaric acid weakly acidic for extraction.
  • the guava extract thus obtained may be concentrated or diluted to an appropriate concentration.
  • Ultra-filtration is used to remove low-molecular substances having a molecular weight of less than 5000 from the guava extract obtained in Step-1.
  • a method using a pressurized filtration device, a dialysis method, a centrifugal method, or the like can be applied, and these methods may be used in combination.
  • the guava extract is sealed in a semipermeable membrane dialysis tube such as cell ester or cellophane that allows substances with a molecular weight of less than 5000 to pass through, and sometimes in an outer dialysis solution consisting of water or a dilute buffer.
  • the low-molecular substance is diffused and removed in the dialysis solution by exchanging the dialysis solution or by dialysis in running water for 1 to 7 days, preferably 2 to 3 days.
  • the filler used for the stationary phase of hydrophobic chromatography is not particularly limited as long as it has a butyl group as a functional group and has sufficient mechanical strength.
  • polystyrene polystyrene, carboxylated polystyrene , Polymethyl acrylate, cellulose derivatives and the like.
  • a 0.02 mol / L aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate and a 0.02 mol / L aqueous solution of sodium triphosphate are used.
  • the separation pattern eluted at a flow rate of 1 mL / min is detected by measuring the absorbance at 260 nm, and the fraction identified as the single peak at the third is collected and dried under reduced pressure or freeze-dried by a conventional method. As a result, the polyphenols of the present invention can be obtained.
  • the fraction is considered to be low in nitrogen content and free of protein. (Molecular weight)
  • the sugar content was determined by subjecting the sample to thermal decomposition in 4 mol / L-trifluoroacetic acid at 100 ° C for 2 hours, converting it into an aldono nitrile acetate derivative according to a conventional method, and performing gas chromatographic analysis. As a result, glucose 2.1%, arabinose 2.0%, galactose 1.3, mannose 0.4, rhamnose 0.3% and xylose 0.3 were detected.
  • the gallic acid and ellagic acid contents were determined by HPLC analysis of the sample in a butanol / hydrochloric acid mixture (95: 5 v / v) containing iron (III) ammonium sulfate at 100 ° (:, 24 hours).
  • Gallic acid content was 0.6% and ellagic acid content was 5.2% .
  • the proanthocyanidin content was determined by subjecting the sample to thermal decomposition at 95 ° C for 40 minutes using the same reagent. The amount of proanthocyanidin was calculated to be 6.8 in terms of cyanidin.
  • the measurement was carried out using a transmission method by rolling the sample between BaF 2 crystals. According to the obtained infrared absorption spectrum, it said fraction wavenumber 3428cm- around 1, near 1705Cm- 1, to exhibit strong absorption in the vicinity of 1 615CHT 1 near ⁇ beauty 1220Cm- 1 was confirmed. Fig. 1 shows this infrared absorption spectrum.
  • Examples of the form of the food and drink of the present invention include solid foods, semi-liquid foods, gel foods, drinks, etc. Specifically, tablets, capsules, granules and the like, and confectionery such as cookies, jelly, snacks, etc. Form, sprinkle, bread, udon, etc .; drink form such as soft drink, juice, lactic acid bacteria drink.
  • various materials commonly used as foods can be used in combination with the polyphenols of the present invention.
  • sugar alcohols such as glucose, sucrose, fructose, sorbitol, xylitol, erythritol, lactitol, and paratitol
  • sucrose fatty acid esters such as glucose, sucrose, fructose, sorbitol, xylitol, erythritol, lactitol, and paratitol
  • sucrose fatty acid esters such as glucose, sucrose, fructose, sorbitol, xylitol, erythritol, lactitol, and paratitol
  • sucrose fatty acid esters such as glucose, sucrose, fructose, sorbitol, xylitol, erythritol, lactitol, and paratitol
  • sucrose fatty acid esters such as glucose, sucrose, fructose,
  • minerals such as vitamin A, vitamin B, vitamin E (Vitamin E, etc.), calcium lactate, calcium dalconate, calcium pantothenate, various magnesium, zinc compounds, etc., herbs It is also possible to mix an extract or the like.
  • the content of the polyphenols varies depending on the dosage form, but is preferably 0.005 to 5% by weight.
  • the daily intake is preferably 5 to 500 mg, more preferably 10 to 100 mg, as the polyphenols.
  • Ban fruit extract was obtained by using a solvent about 10 times the weight of Ban fruit and extracting at 90 ° C for 25 minutes.
  • a guava extract was obtained by blending the obtained guava leaf extract with the extract of the niea fruit at a ratio of about 0.1 to 0.2%.
  • a fraction having a molecular weight of 5000 or more was obtained from the guava extract prepared in Example 1.
  • the internal dialysis solution obtained from this fraction using a membrane having a molecular weight cut off of 6000 to 8000 was freeze-dried to obtain a crudely purified polyphenol.
  • the resulting partially purified polyphenols were dissolved in a 0.02 mol / L aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate and sodium hydroxide, and the mixture was subjected to hydrophobic hydrophobic chromatography using a macroprep column in which a butyl group was bonded to a filler. Purified.
  • -Amylase inhibitory activity was measured by a conventional method. That is, human amylase was derived from swine solution and prepared with 0.02M sodium phosphate buffer (pH 6.5). The substrate solution was prepared with 8% soluble starch and 0.08M sodium phosphate buffer (pH 6.5). The reaction was carried out by mixing the enzyme, the substrate solution, the test solution or water as a control, and 37 ° C for 7 minutes. After stopping the reaction at 100 ° C, maltose produced was measured by HPLC using arabinose as an internal standard. The inhibitory activity was calculated by the following equation. Table 3 shows the results.
  • Inhibitory activity (3 ⁇ 4) ⁇ 1—Amount of maltose formed in sample Z Amount of maltose formed in control ⁇ X 100
  • the purified guava polyphenols of the present invention exhibited a higher inhibitory activity (about 30% higher inhibitory effect) than the guava extract.
  • the maltase inhibitory activity was measured by a conventional method. That is, maltase was obtained by homogenizing rat intestinal acetone powder (manufactured by SIGMA) with 9 volumes of 56 mM maleic acid buffer (pH 6.0), and centrifuging the supernatant to obtain a crude enzyme solution.
  • the substrate solution was prepared with 224 mM maleate buffer (pH 6.0) so that the final maltose concentration was 1%.
  • the reaction was carried out at 37 ° C.
  • Inhibitory activity (%): (1 glucose produced in one sample, glucose produced in control) X 100
  • the ⁇ -amylase activity inhibitor of the present invention has extremely excellent ⁇ -amylase inhibitory activity as compared to guava extract and also has ⁇ -darcosidase inhibitory activity.
  • Food with anti-obesity effect and anti-obesity effect Goods are obtained. That is, dietary foods and drinks suitable for people with high blood sugar levels or hyperlipidemia can be provided by mixing it with foods containing a large amount of starch, such as sprinkle don, bread and cookies.

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Description

明 細 書 α—アミラーゼ活性阻害剤
技術分野
本発明は、 グアバ (Ps i d ium guaj ava L i nn. ) 由来のポリフエノール類 （以 下、 「グアバポリフエノール類」 ともいう） を有効成分とする α—アミラーゼ活 性阻害剤及びこれを含有する飲食品に関する。 背景技術
近年、 摂取カロリーの過多が生活習慣病の原因となっていることから、 摂取力 口リ一の制限力 S求められている力 S、 摂取した食物が生体内でエネルギーに変換さ れるのを阻止し得る物質があれば、 食事量を減らさずにダイエットできる。 特に デンプンを始めとする炭水ィヒ物の消化を抑えることは肥満の予防 ·治療に有効で あると考えられ、 デンプンの消化酵素であるひ一アミラーゼの活性を阻害する物 質力 s近年注目されている。
中央アメリカ原産の灌木であるグアバは、 その果実、 根及び葉が民間で生薬と して糖尿病や下痢止めに用いられているが、 最近、 その葉を水又は親水性溶媒に より抽出して得られたエキスに、 α—アミラーゼ活性阻害作用があることが見出 され、 健康飲料 （特公昭 60-36746号） やダイエット飲食品 （特開平 7- 59539号） として使用され得ることが報告されている。
しかしながら、 当該グアバ抽出エキスには、 セスキテルペンやタンニン等様々 な成分が含まれ、 そのひ一アミラーゼ阻害活性は十分なものでなく、 優れたダイ エツト効果を発揮できるものではなかった。
従って、 本発明の目的は、 グアバ抽出液の中から特に優れた α—アミラーゼ阻 害活性を有し、 より有効なダイエツト効果を発揮する成分及びこれを含有する飲 食品を提供することにある。 発明の開示
本発明者らは、 斯かる実情に鑑み、 グアバ抽出物中の高分子成分について鋭意 研究を行った結果、 グアバ葉又は果実の水性抽出物を限外濾過して得られる分子 量 5000以上の画分を、 特定の疎水性クロマトグラフィーを用いて分涵して得られ るポリフエノール類に高いひ一アミラーゼ阻害活性があることを見出し、 本発明 を完成した。
すなわち、 本発明は、 グアバの葉及び/又は果実を水及び親水性溶媒より選ば れる 1種以上の溶媒より抽出し、 該抽出液から限外濾過法を用いて分子量 5000未 満の物質を除去した後、 ブチル基を担持した充填剤を固定相とする疎水性クロマ トグラフィ一を用い、 流速 lmL/minで、 0. 02mol/Lのリン酸二水素一ナトリウム水 溶液と 0. 02mol/Lのリン酸三ナトリウム水溶液による濃度勾配を与えながら溶出 し、 260nmにおける吸光度を測定した場合に、 3番目の単一ピークとして確認さ れる画分を回収して得られるポリフエノ一ル類を有効成分とするひ一アミラーゼ 活性阻害剤及び次の物理化学的性質を有するポリフエノ一ル類を有効成分とする α—アミラーゼ活性阻害剤を提供するものである。
(a) 構成元素として、 炭素を 49. 6¾、 水素を 4. 6%、 及び窒素を 0. 6含有する。
(b) 分子量が 5, 000〜100, 000である。
(c) 赤外線吸収スペクトル： 3428CDT1付近、 nOScnf1付近、 1615CHT1付近及び 1220CHT'付近に強い赤外線吸収を示す。
(d) 固体炭素核磁気共鳴スペクトル：糖のシグナル （76ppm付近） 、 芳香族シ グナル （115. 0ρρηι付近） 、 フエノールシグナル （144及び 156ppm付近） 及びエス テルカルポニルシグナル （168卯 m付近） に相当する共鳴スぺクトルを示す。
(e) 以下の条件の液体クロマトグラフ法分析により、 10分付近に単一ピークを 示す。 カラム：ブチル基を化学結合した硬質合成ポリマー系逆相分配型ゲルを充填し たカラム（昭和電工製 Shodex Asahipak C4P-50 4D、 内径 4. 6讓、 長さ 150mm、 又 はこれと同等品）
流速： 1. 5JIIL/分
カラム温度： 40°C付近の一定温度
検出器：紫外吸光光度計 （測定波長： 60nm)
移動相：
A液： 0. 02mo l/Lの Na P04を含むァセトニトリル 水混液（15： 85 (v/v)による 溶液 (pH 4. 6)
B液： 0. 02mo l/L© Na3P04を含むァセトニトリル Z水混液（15： 85 (v/v)による 溶液 (pH 11. 4)
分析法：次の表に基づき、 ステップグラジェント分析を行う。
Figure imgf000005_0001
また本発明は、 上記 α—アミラーゼ活性阻害剤を含有する飲食品を提供するも のである。 '
また本発明は、 ダイエツト飲食品製造のための上記ポリフエノール類の使用を 提供するものである。
更に本発明は、 上記飲食品を摂取することを特徴とするダイエツト方法を提供 するものである。 図面の簡単な説明 図 1は、 グアバポリフエノール類の赤外線吸収スぺクトルを示す図である。 図 2は、 グアバポリフエノール類の CP- MASのスぺクトルを示す図である。 図 3は、 粗精製グアバポリフエノール類の溶出曲線を示す図である。
図 4は、 グアバポリフエノ一ル類の液体ク口マトダラフ分析の結果を示す図で ある。 発明を実施するための最良の形態
本発明のポリフエノール類は、 以下に示す工程 1〜 3により得ることができ る。
1 ) 工程一 1
グアバの葉及び Z又は果実を水及び親水性溶媒より選ばれる 1種以上の溶媒よ り抽出し、 グアバ抽出液を得る。
本発明において用いられるグアバは、 フトモモ科バンジロウ属に属するグアバ (Ps idium guaj ava Linn. ) であり、 その産地は特に限定されるものではなく、 東南アジア、 南アジア、 南米、 北米等の熱帯、 亜熱帯地域において広く自生又は 栽培されているものを使用することができる。 本発明においては当該グアバの葉 又は果実が用いられ、 これらは生、 半乾燥又は乾燥品のいずれでもよいが、 特に 乾燥した葉が好ましい。 また、 果実を用いる場合は未成熟な幼果である蕃果を用 いるのが好ましい。 これらの原料は粉砕して用いるのが好ましく、 例えば葉の場 合は 3〜5mm程度の大きさに切断したものを用いるのが好適である。 また、 風味を 改善するために、 乾燥後焙煎したものを用いてもよい。
抽出溶媒には、 水及び親水性溶媒より選ばれる 1種以上の溶媒が用いられる が、 斯かる親水性溶媒としては、 メタノール、 エタノール、 n—プロピルアルコ ール、 アセトン、 プロピレングリコール等が挙げられ、 これらを 2種以上を混合 して用いてもよく、 また水と任意の割合で混合した含水溶媒の形で用いることも できる。 操作性及び安全性を考慮すれば最も好ましい溶媒は水である。 溶媒の ί吏用量は特に限定されるものではないが、 グアバ葉を用いる場合、 葉と 抽出溶媒の比率は 1 ： 2 0 (重量） 、 果実 （蕃果） を使用する場合は、 果実 （蕃 果） 1に対し約 1 0重量倍の溶媒を使用することが好ましい。
グアバ葉を用いた抽出は、 使用する溶媒によっても異なるが、 水の場合には、 5 0〜 1 0 0 ° (：、 好ましくは 8 0〜； L 0 0 °Cの温度で、 5〜 6 0分、 好ましくは 5〜2 5分間抽出するのが好ましい。
また、 果実 （蕃果） を用いる場合は、 6 0〜1 0 0 °Cの温度で、 1 0〜6 0分 間抽出するのが好ましい。
上記抽出に際して、 抽出溶媒に重曹等のアル力リを加えて pHを上げて抽出して もよく、 希鉱酸 （例えば、 希塩酸） 又は有機酸 （例えば、 コハク酸、 クェン酸、 乳酸、 リンゴ酸、 酒石酸） を加え、 弱酸性にして抽出してもよい。
抽出工程終了後、 抽出液を冷却し、 遠心分離等によって不純物を分離除去する ことが好ましい。 このようにして得られたグアバ抽出液は適当な濃度に濃縮又は 稀釈してもよい。
2 ) 工程一 2
工程— 1で得られたグアバ抽出液から限外濾過法を用いて分子量 5000未満の低 分子物質を除去する。
用いられる限外濾過法は、 加圧式濾過装置を使用する方法、 透析法、 遠心法等 が適用でき、 これらを組み合わせて行ってもよい。
透析法による場合、 グアバ抽出液を分子量 5000未満の物質を透過させるセル口 ースエステルやセロファン等の半透膜の透析チューブ内に封入し、 水又は希薄な 緩衝液からなる透析外液中で、 時々透析外液を交換しながら又は流水中で 1〜 7 日間、 好ましくは 2〜3日間透析することによって、 低分子物質を透析外液中に 拡散させて除去する。
3 ) 工程 _ 3
工程一 2で得られた分子量 5000以上の画分をブチル基を担持した充填剤を固定 相とする疎水性クロマトグラフィーを用いて、 流速 lmL/minで、 0· 02mol/Lのリン 酸二水素ーナ卜リゥム水溶液と 0. 02mo l/Lのリン酸三ナトリゥム水溶液による濃 度勾配を与えながら溶出する。
疎水性ク口マトグラフィ一の固定相に用いられる充填剤は、 官能基としてプチ ル基が担持され、 十分な機械的強度を有していれば特に制限はないが、 例えばポ リスチレン、 カルボキシル化ポリスチレン、 ボリメチルァクリレート、 セルロー ス誘導体等を例示することができる。
移動層には、 0. 02mol/Lのリン酸ニ水素ーナトリゥム水溶液と 0. 02mol/Lのリン 酸三ナトリゥム水溶液が用いられ、 濃度勾配を与えて溶出する。
流速 lmL/minで溶出したときの分離パターンを、 260nmにおける吸光度を測定す ることにより検出し、 3番目に単一ピークとして確認される画分を回収し、 常法 により減圧乾燥又は凍結乾燥することにより本発明のポリフエノ一ル類を得るこ とができる。
上記の如くして得られる水溶性画分の物理化学的性質は以下の通りである。 (元素分析）
元素分析は常法に従つて行つた。 結果を表 2に示す。
表 2
元素分析結果
Figure imgf000008_0001
該画分は、 窒素含量が少なく、 タンパク質の含有はないものと考えられる。 (分子量）
常法に従い多角度光散乱検出器を用いた GPC-HPLC分析〖こよる分子量測定を行つ た結果、 該画分の分子量は5, 000〜100，000、 平均分子量は 70, 000であった。 (構成成分の分析）
糖含有量は試料を 4mol/L-トリフルォロ酢酸中で 100°C、 2時間加熱分解後、 常 法に従いアルドノ二トリルァセテート誘導体とし、 ガスクロマトダラフ分析より 算出した。 その結果、 グルコース 2. 1%、 ァラビノース 2. 0%、 ガラクトース 1. 3 、 マンノース 0.4、 ラムノ一ス 0. 3%及びキシ口一ス 0. 3 が検出された。
(没食子酸、 エラグ酸及びプロアントシァニジン含有量）
没食子酸及びエラグ酸含有量は、 試料を硫酸鉄 （I I I) アンモニゥムを含むブ タノ一ル ·塩酸混液 （95 : 5 v/v) 中で、 100° (：、 24時間加熱分解後、 HPLC分析し て求めた。 没食子酸は 0. 6%、 エラグ酸は 5. 2%であった。 プロアントシァニジン含 有量は、 試料を同一の試薬を用いて 95°C、 40分間加熱分解して得られた分解液の 吸光度から算出した。 プロアントシァニジンはシァニジン換算で 6. 8であった。
(赤外線吸収スぺクトル）
測定は、 試料を BaF2結晶に挟み圧延し、 透過法で行った。 得られた赤外線吸収 スペクトルによれば、 該画分は波数 3428cm—1付近、 1705cm—1付近、 1 615CHT1付近及 び 1220cm— 1付近に強い吸収を示すことが確認された。 この赤外線吸収スぺクトル を図 1に示す。
(固体炭素核磁気共鳴スぺクトル （固体13 C-薩 R) )
測定は、 常法である交差分極マジックアングルスピニング法 （CP- MAS) で行つ た。 得られた CP - MASのスペクトルでは糖、 芳香族、 フエノール、 エステル力ルポ ニル等のシグナルが観察され、 この画分はエラジタンニンの集合体を主体とする ポリフエノール類であることが確認された。 CP-MASのスぺクトルを図 2に示す。 上記グアバポリフエノール類は、 後記実施例に示すように優れた Q!—アミラー ゼ阻害作用を有すると共に、 Q!—ダルコシダーゼ阻害活性も併せ持つ。 従って、 当該ポリフエノール類を食品に配合すれば、 デンプンからデキストリンゃマルト ースへの分解が強く抑制され、 更に二糖類 （マルトース、 イソマルト一ス、 スク ロース） からグルコースへの分解も抑制されることから、 血糖値の上昇抑制及び 抗肥満作用を有する飲食品とすることができる。
本発明の飲食品の形態としては、 固形食品、 半流動食品、 ゲル状食品、 飲料等 が挙げられ、 具体的には錠剤、 カプセル、 顆粒等の形態、 クッキー、 ゼリー、 ス ナック類等の菓子の形態、 ふりかけ、 パン、 うどん等の形態；清涼飲料、 ジュ一 ス、 乳酸菌飲料等のドリンク剤の形態とすることができる。
斯かる飲食品には、 本発明のポリフエノール類に、 更に食品として通常用いら れている種々の素材を併用することができる。 具体的には、 ブドウ糖、 ショ糖、 果糖、 ソルビトール、 キシリト一ル、 エリスリトール、 ラクチトール、 パラチ二 ット等の糖アルコール、 ショ糖脂肪酸エステル、 ポリグリセリン脂肪酸エステ ル、 レシチン等の乳化剤、 ぺクチン、 カルポキシメチルセルロース、 7K溶性大豆 多糖類、 ジエランガム、 アラビアガム、 キサンタンガム、 カラギーナン、 グァ一 ガム等の安定ィ匕剤等が挙げられる。 この他にも、 ビタミン A、 ビタミン B類、 ビ 夕ミン (：、 ビタミン E等の各種ビタミン類や乳酸カルシウム、 ダルコン酸カルシ ゥム、 パントテン酸カルシウムや各種マグネシウム、 亜鉛化合物等のミネラル 類、 ハーブエキス等を配合することも可能である。
本発明のポリフエノール類を飲食品に含有せしめる場合のポリフエノール類の 含有量は、 その剤形によっても異なるが、 0. 005〜 5重量％とすることが好まし く、 該飲食品の 1日あたりの摂取量は該ポリフエノール類として 5〜500mg、 特に 10〜100mgとするのが好ましい。 実施例
次に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、 本発明はこれら実施例に 限定されるものではない。
実施例 1 グアバ抽出エキスの調製
( 1 ) グアバ葉 （中国、 広西省産） を乾燥し、 121°Cで 15分で焙煎した後、 5mm程 度に細断した。 この茶葉 100kgを 80°Cの熱水 2000kgに入れ、 25分間抽出を行つ た。 抽出液を 30°C以下に冷却し、 1500rpmで 10分間遠心分離で清澄ィ匕し、 グアバ 葉抽出液を得た。
( 2 ) 蕃果抽出液は、 蕃果 1に対し約 10重量倍の溶媒を使用し、 90°Cで、 25分間 抽出することにより得られた。
( 3 ) 得られたグアバ葉抽出液に蕃果抽出液を約 0. 1〜0. 2%の割合で配合し、 グ アバ抽出エキスを得た。
実施例 2 グァバポリフエノ一ル類の調製
分画分子量 5000の限外濾過膜を用いて、 実施例 1で調製したグアバ抽出エキス から分子量 5000以上の画分を得た。 次にこの画分から分画分子量 6000〜8000の透 析膜を用いて得られた透析内液を凍結乾燥して粗精製ポリフエノ一ル類を得た。 得られた粗精製ポリフエノール類を、 0. 02mol/Lのリン酸ニ水素一ナトリゥム水 溶液に溶解し、 充填剤にブチル基を結合したマクロプレップカラムを用いて、 疎 水性ク口マトグラフィ一により精製した。 カラムの 2倍容量の 0. 02B1O 1/Lのリン酸 二水素ーナトリゥム水溶液で洗浄後、 カラムの 2倍量の 0. 02mo l/Lのリン酸ニ水 素ーナトリゥム水溶液と 0. 02mo l/Lのリン酸三ナトリゥム水溶液の直線勾配によ り溶出し、 次いで 0. 02m o l /Lのリン酸三ナトリゥム水溶液で溶出した。 260nmにおける吸光度を測定し、 溶出曲線を作成するとともに、 アミラーゼ阻害 活性を測定した （図 3 ) 。 この溶出曲線より、 最後に溶出する単一ピークに阻害 活性が認められた。 得られた単一ピークに相当する画分を電気透析した後、 凍結 乾燥し、 精製グアバポリフヱノ一ル類とした。
得られた精製グアバポリフエノール類を、 上記 (e)に示す条件で測定した結果 を図 4に示す。 本条件による測定おいて本発明の精製ポリフエノ一ル類は単一の ピークとして観察された。
実施例 3 ひ一アミラーゼ阻害活性
実施例 1及び実施例 2で得られたグアバ抽出エキス及び精製 —ル類が 0!—アミラーゼに及ぼす影響を検討した。
—アミラーゼ阻害活性は常法により測定した。 すなわち、 ひ一アミラーゼは ブタ塍液由来のものを用い 0. 02Mリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH6. 5) で調製した。 基質溶液は 8%可溶性デンプンと 0. 08Mリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH6. 5) で調製し た。 反応は酵素、 基質溶液、 試験溶液又は対照として水を混合し、 37°C 7分間行 つた。 100°Cで反応を停止後、 ァラビノースを内部標準物質として、 生成したマ ルトースを HPLCで測定した。 阻害活性は下式により算出した。 結果を表 3に示 す。
阻害活性 (¾) = { 1—試料中の生成マルト一ス量 Z対照中の生成マルト一ス量 } X 100
表 3
Figure imgf000012_0001
表 3に示したように、 本発明の精製グアバポリフエノール類はグアバ抽出ェキ スに比べ高い阻害活性を示した （約 30%高い阻害効果を示した） 。
実施例 4 a -ダルコシダーゼ阻害活性
実施例 1及び実施例 2で得られたグアバ抽出エキス及び精製グアバポリフエノ ール類が α—ダルコシダーゼの一つであるマルターゼに及ぼす影響を検討した。 マルターゼ阻害活性は常法により測定した。 すなわち、 マルターゼはラット腸 管アセトン粉末 （SIGMA社製） を 9倍量の 56mMマレイン酸緩衝液 （pH6. 0) でホモ ゲナイズしてその遠心上精を粗酵素液とした。 基質溶液はマルト一スの終濃度が 1 %になるよう 224mMマレイン酸緩衝液 （pH6. 0) で調製した。 反応は酵素、 基質 溶液、 試験溶液又は対照として水を混合し、 37°C 5分間行った。 100°Cで反応を 停止後、 ァラビノースを内部標準物質として、 生成したグルコース量を HPLCで測 定した。 阻害活性は下式により算出した。 結果を表 4に示す。
阻害活性 （％) ： ( 1一試料中の生成グルコース量 対照中の生成グルコース 量） X 100
表 4
Figure imgf000013_0001
実施例 5
実施例 2で得られた精製グアバポリフエノ一ルを用いて以下に示す配合でパン を作成した。
(重量部)
配合 小麦粉 52
上白糖 3
練乳 4
無塩バタ、 3
卵 3
1
生イースト 1. 5
水 31. 5
'グアバポリフエノール 1 この製品は特徴的なハ一ブ風味があり、 味も良好であり、 通常のパンに比べて 遜色のないものであった。
産業上の利用可能性
本発明の α—アミラ一ゼ活性阻害剤は、 グアバ抽出エキスに比べて極めて優れ た α—アミラーゼ阻害活性を有すると共に α—ダルコシダーゼ阻害活性を併せ持 ち、 これを飲食品に含有せしめれば血糖値抑制作用及び抗肥満作用を有する飲食 品が得られる。 すなわち、 ふりかけゃゥドン、 パン、 クッキー等デンプンを多く 含む食品にこれを混ぜることで血糖値の高い人、 あるいは高脂血症の人に適した ダイエツト飲食品を提供できる。

Claims

請求の範囲
1 . グアバの葉及び Z又は果実を水及び親水性溶媒より選ばれる 1種以上の溶 媒より抽出し、 該抽出液から限外濾過法を用いて分子量 5000未満の物質を除去し た後、 ブチル基を担持した充填剤を固定相とする疎水性クロマトグラフィーを用 い、 流速 lmL/minで、 0. 02mol/Lのリン酸ニ水素ーナトリゥム水溶液と 0. 02mol/L のリン酸三ナトリゥム水溶液による濃度勾配を与えながら溶出し、 におけ る吸光度を測定した場合に、 3番目の単一ピークとして確認される画分を回収し て得られるポリフエノール類を有効成分とするひ一アミラーゼ活性阻害剤。
2 . ポリフエノール類が、 次の物理ィヒ学的性質を有するものである請求項 1記 載の α—アミラーゼ活性阻害剤。
(a) 構成元素として、 炭素を 49. 6%、 水素を 4. 6%、 及び窒素を 0. 6含有する。
(b) 分子量が 5, 000〜100, 000である。
(c) 赤外線吸収スぺクトル： 3428cnrl付近、 1705 CHT1付近、 1615 CHT1付近及び 1 220CHT1付近に強い赤外線吸収を示す。
(d) 固体炭素核磁気共鳴スぺクトル：糖のシグナル （76ppm付近） 、 芳香族シ グナル (1 15. 0ppm付近) 、 フエノールシグナル （144及び 156ppm付近） 及びエス テルカルポニルシグナル (168ppm付近） に相当する共鳴スペクトルを示す。
(e) 以下の条件の液体クロマトグラフ法分析により、 10分付近に単一ピークを 示す。
カラム：ブチル基を化学結合した硬質合成ポリマー系逆相分配型ゲルを充填し たカラム（昭和電工製 Shodex Asahipak C4P-50 4D、 内径 4. 6匪、 長さ 150腿、 又 はこれと同等品）
流速： 1. 5mL/分
カラム温度： 40°C付近の一定温度
検出器：紫外吸光光度計 （測定波長： 260nm) 移動相：
A液： 0,02mol/Lの NaH2P04を含むァセトニトリル/水混液（15： 85(v/v)による 溶液 （pH 4.6)
B液： 0.02mol/Lの Na3P04を含むァセトニトリル/水混液（15： 85(v/v)による 溶液 (pH 11.4)
分析法：次の表に基づき、 ステップグラジェント分析を行う。
表 1
Figure imgf000016_0001
3. 次の物理化学的性質を有するポリフエノール類を有効成分とする 0!—アミ ラ一ゼ活性阻害剤。
(a) 構成元素として、 炭素を 49.6°ん 水素を 4.6 、 及び窒素を 0.6%含有する。
(b) 分子量が5， 000〜100， 000でぁる。
(c) 赤外線吸収スペクトル： 3428cm—1付近、 1705cm— 1付近、 1615CBT1付近及び 1220CHT1付近に強い赤外線吸収を示す。
(d) 固体炭素核磁気共鳴スぺクトル：糖のシグナル （76ppm付近） 、 芳香族シ グナル （U5.0ppm付近） 、 フエノールシグナル （144及び 156ppm付近） 及びエス テルカルボニルシグナル （168ppm付近） に相当する共鳴スぺクトルを示す。
(e) 以下の条件の液体クロマトグラフ法分析により、 10分付近に単一ピークを 示す。
カラム：ブチル基を化学結合した硬質合成ポリマー系逆相分配型ゲルを充填し たカラム（昭和電工製 Shodex Asahipak C4P-504D、 内径 4.6腿、 長さ 150mm、 又 はこれと同等品） 流速： 1. 5mL/分
カラム温度： 40°C付近の一定温度
検出器：紫外吸光光度計 （測定波長： 260nm)
移動相：
A液: 0. 02mo l/Lの Na P04を含むァセトニトリル Z水混液（15： 85 (v/v)による 溶液 ( H 4. 6)
B液: 0. 02mol/Lの Na3P04を含むァセトニトリル/水混液（15： 85 (v/v)による 溶液 (pH 11.4)
分析法：次の表に基づき、 ステップグラジェント分析を行う。
表 1
分析時間 （分） 八液％ 3液％
0 (〜 4) 100 0
4 (〜 8) 65 35
8 〜 12) 0 100
12 〜 20) 100 0
4. 更に α—ダルコシダ一ゼ阻害活性を有するものである請求項 1 ~ 3のいず れか 1項記載の α—アミラ一ゼ活性阻害剤。
5 . 請求項 1〜 4のいずれか 1項記載のひ一アミラーゼ活性阻害剤を含有する 飲食品。
6 . ダイエツト飲食品製造のための請求項 1〜 3のいずれか 1項記載のポリフ エノ一ル類の使用。
7 . 請求項 5記載の飲食品を摂取することを特徴とするダイエツト方法。
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