CN107807102A - 一种α‑淀粉酶抑制剂活性的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种α‑淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其经过以下步骤：（I）建立标准曲线；（II）配制淀粉酶抑制剂供试品溶液；（III）配制淀粉酶溶液；（IV）将供试品溶液、猪胰淀粉酶溶液在水浴中预热，混合保温，加入可溶性淀粉溶液反应；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A2；（V）将猪胰淀粉酶溶液水浴中预热，加入可溶性淀粉溶液和磷酸缓冲液，加蒸馏水达到步骤IV的相同体积，并且反应后滴加稀盐酸；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A1；（VI）计算活性。本发明具有操作便捷、检测准确、效率高、应用范围广、回收率高的优点，适用于保健食品和药品及原料中α‑淀粉酶抑制剂活性的测定。
Description
技术领域
本发明涉及包含酶的测定方法，尤其是一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法。
背景技术
α-淀粉酶抑制剂(α-amylase inhibitor，简称α-AI)，是抑制糖苷水解酶α-淀粉酶的抑制剂。α-AI能抑制胃肠道内唾液、胰淀粉酶的活性，阻碍或延缓人体对食物中主要的碳水化合物的水解和消化，降低食物中淀粉糖类物质的分解吸收，起到降低血糖、血脂以及抑制血糖浓度的升高，从而有利于糖尿病患者的饮食治疗。对于肥胖患者，可减少糖向脂肪转化，延缓肠道排空，增加脂肪消耗以减轻体质量，国外已将α-淀粉酶抑制剂作为减肥保健食品进行应用。因此，α-AI可以用来防治肥胖症、脂肪过多症、动脉硬化症、高血脂及糖尿病等疾病。
目前，对于α-淀粉酶抑制剂的检测项目主要包括活性、含量、纯度及相对分子质量。文献显示，α- 淀粉酶抑制剂一般都为蛋白质类物质，其含量、纯度和相对分子质量都可依照蛋白质的测定方法进行。而抑制活性的测定方法主要包括碘比色法和3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法（Bernfeld 法）2种。其中，3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定原理：α-AI能特异性地抑制α-淀粉酶，减少α-淀粉酶对淀粉的水解，使其淀粉降解产物还原糖减少，还原糖可与3，5-二硝基水杨酸共热被还原成棕红色的氨基化合物，显红棕色，在一定波长下有最大吸收峰，且在此波长下还原糖含有量与吸光值呈线性关系。对添加抑制剂前后生成还原糖的量进行定量测定，可从前后变化测得α-AI 的活性。碘比色法原理：α－AI能特异性抑制α－淀粉酶，从而减少α－淀粉酶对淀粉的水解，碘试液与淀粉呈蓝色反应，并在一定波长下有最大吸光度。通过定量测定添加抑制剂前后淀粉量的变化可测得α－AI的活性。
DNS比色法是通过检测还原性糖的含量来推算α-AI的活性，此法的缺陷在于反应中的还原性糖不一定都是由淀粉水解成的还原性糖，对于加淀粉酶之前已经有还原性糖的存在的样品检测α-AI活性，检测结果是不准确的，只适用于纯粹的α-淀粉酶抑制剂，检测之前还需要做α-淀粉酶抑制剂的提纯步骤，因此此种方法操作复杂，对α-淀粉酶抑制剂的纯度要求较高，因而对于企业会造成成本较高、耗费时间长等弊端。碘比色法可直接检测样品中的α-淀粉酶抑制剂活性，不需要对α-淀粉酶抑制剂进行提纯的处理，操作简单，缩短检测时间，极大地降低了成本，但是此方法对反应的各条件要求严格，倘若反应条件的参数不合理，会造成检测结果的误差。现有的文献所给的最优化参数方法的平均回收率较低（99.03%），因此需要对此方法的各反应条件参数进行优化，使得检测结果更加准确并提高平均回收率。
发明内容
为了克服现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种操作便捷、检测准确、效率高、应用范围广、回收率高的α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法。该检测方法适用于保健食品和药品及原料中α-淀粉酶抑制剂活性的测定。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其特征在于：其经过以下步骤：
（I）称取可溶性淀粉M1克，配置成100mL的可溶性淀粉溶液，将该可溶性淀粉溶液中加入碘的浓度为60-100mg/L且碘化钾的浓度为150-200mg/L的碘和碘化钾的混合溶液，来得到在加入的碘和碘化钾的混合溶液的量一定的情况下，溶液的660nm光吸收值与可溶性淀粉溶液关系的一元一次拟合方程，当可溶性淀粉溶液加入毫升数为X轴，吸收值为Y轴的情况下，得到其斜率为B；
（II）配制淀粉酶抑制剂供试品溶液：将精密称量的待测样品粉末M2克置于容量瓶中，加水定容到100mL并且放置20-40分钟之后取上清液作为供试品溶液；
（III）配制淀粉酶溶液：精密称量猪胰淀粉酶加蒸馏水制成0.10-0.20mg/mL的溶液并且摇匀；
（IV）将等体积的步骤II的供试品溶液、步骤III的猪胰淀粉酶溶液各3-8mL，并且分别在35℃±0.2℃水浴中预热5-10分钟，混合并且继续保温5-10分钟，在混合液中加入步骤I的可溶性淀粉溶液和pH为6.0的磷酸缓冲液，并且在35℃±0.2℃水浴中反应T时间后，滴加稀盐酸2-6mL使得反应终止；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A2；
（V）将与步骤IV等量的猪胰淀粉酶溶液在35℃±0.2℃水浴中预热5-10分钟，加入与步骤IV等量的可溶性淀粉溶液和pH为6.0的磷酸缓冲液，加蒸馏水达到步骤IV的相同体积，并且在35℃±0.2℃水浴中反应T时间后，滴加稀盐酸3-5mL；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A1；
（VI）按照以下公式来计算α-淀粉酶抑制剂活性活性：
式中，U：为α-淀粉酶抑制剂活性，单位为U/g；
M1：为淀粉的取样量，单位为g；
M2：为α-淀粉酶抑制剂的取样量，单位为g；
B：为淀粉标准曲线回归方程中的斜率；
A1：为淀粉酶对照品的吸光度；
A2：为α-淀粉酶抑制剂的吸光度；
342.3：为麦芽糖的摩尔质量，g/mol；
T：为反应时间，min。
在本发明优选的方面，所述的步骤I按照以下的方法来进行：称取可溶性淀粉0.18-0.22克于烧杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边慢慢加入沸水中，搅拌到完全透明，冷却后定容，得到质量体积比浓度为1.8-2.2%的可溶性淀粉溶液；配制pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液；配制碘和碘化钾的混合溶液，其中碘的浓度为60-100mg/L，碘化钾的浓度为150-200mg/L；分别取0、1、2、3、4、5、6、7mL的质量体积比浓度为2.0%的可溶性淀粉溶液，加入10mL的碘和碘化钾的混合溶液、5mL的0.1M的HCl溶液、2.5mL的磷酸盐缓冲溶液，并且分别加蒸馏水7、6、5、4、3、2、1、0毫升，配制得到8组的淀粉标准曲线样品，在660nm下测定吸光度，以所取的淀粉的毫升数与对应的吸光度作图并且按照一次方程拟合得到标准曲线方程，斜率为B。
在本发明优选的方面，在步骤I中，碘和碘化钾的混合溶液中碘的浓度为88 mg/L，碘化钾的浓度为176 mg/L；反应时间T为4-6分钟。
在本发明优选的方面，在步骤II中，将精密称量的待测样品粉末0.08-0.12克置于容量瓶中，加水定容到100mL并且放置30分钟之后取上清液作为供试品溶液。
在本发明优选的方面，在步骤III中，精密称量猪胰淀粉酶加蒸馏水制成0.15mg/mL的溶液并且摇匀。
在本发明优选的方面，在步骤IV中，将等体积的步骤II的供试品溶液、步骤III的猪胰淀粉酶溶液各5mL，并且分别在35℃±0.2℃水浴中预热8分钟，混合并且继续保温5分钟，在混合液中加入步骤I的可溶性淀粉溶液和pH为6.0的磷酸缓冲液，并且在35℃±0.2℃水浴中反应T时间后，滴加稀盐酸4 mL使得反应终止；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A2。
在本发明优选的方面，在步骤V中，将与步骤IV等量的猪胰淀粉酶溶液在35℃±0.2℃水浴中预热8分钟，加入与步骤IV等量的可溶性淀粉溶液和pH为6.0的磷酸缓冲液，加蒸馏水达到步骤IV的相同体积，并且在35℃±0.2℃水浴中反应T时间后，滴加稀盐酸4 mL；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A1。
在本发明优选的方面，在步骤IV和V中，所述的T时间是3-7分钟。
在本发明优选的方面，在步骤IV和V中，所述的T时间是5分钟。
在本发明优选的方面，在步骤IV和V中，可溶性淀粉溶液、碘和碘化钾的混合溶液与添加盐酸终止反应之前的反应液的体积比是1:1.5-3.0:1.5-3.0。
在本发明优选的方面，在660nm下的吸收值是通过以下的方法来得到的：选择第一光强Y1、第二光强Y2和第三光强Y3，分别测量得到三个光强下的吸收值AY1、AY2和AY3，将三个光强下吸收值的几何平均值来作为660nm下的吸收值读数，其中Y1、Y2和Y3满足关系Y1：Y2：Y3=1:1.5-3:3-5。
在本发明优选的方面，在660nm下的吸收值通过以下的方法来得到：使用完全透明吸收池、贴覆了660nm下透光率为1/2的吸收片的吸收池，贴覆了660nm下透光率为1/4的吸收片的吸收池分别测量三个光强下的吸收值，扣除空白之后取几何平均值来作为660nm下的吸收值读数。
在本发明的其他方面，各种溶液的制备方法如下文所述：
（1）供试品溶液的制备：精密称取α-淀粉酶抑制剂粉末0.1g于容量瓶中，加水定容至100ml，放置30min，充分溶解后取上清液作为供试品溶液。
（2）α-淀粉酶液的制备：精密称取猪胰淀粉酶加蒸馏水制成0.15mg/ml的溶液，摇匀即可。
（3）α-淀粉酶与抑制剂结合溶液的制备：精密量取（1）和（2）各5ml，于35℃±0.2℃水浴中预热5-10min，备用。
在本发明的其他方面，还提供了以下的测量方法。
按照下表吸取一定溶液加入各试管中，活性测定的实验设定显示在表1中。
表1：α-淀粉酶抑制剂活性测定时各溶液加入量
| 加入量 | 空白管 | 对照空白 | 酶对照 | 样品 |
| 磷酸缓冲液（pH=6.0） | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
| 水 | 7 | 2 | 1 | 0 |
| 淀粉基质液 | 0 | 5 | 5 | 5 |
| 淀粉酶 | 0 | 0 | 1 | 0 |
| 淀粉酶与供试品结合液 | 0 | 0 | 0 | 2 |
混匀各试管中溶液，将样品管在35℃±0.2℃水浴中准确反应5min，加入3-5ml稀盐酸终止反应。取上述溶液各1ml，加入10ml稀碘液中，摇匀，并以空白管为空白，在660nm波长下，测定吸光度（A），并记录数据。
本发明在碘试液比色法的基础上，针对检测α-淀粉酶抑制剂活性的试验中的反应条件参数：淀粉基质液的浓度、酶促反应的时间进行了优化，最终找到最佳的条件参数是：淀粉基质液的浓度为2%，酶促反映的最适温度为35℃左右（35℃±0.2℃）。此条件下的平均回收率达到99.39%（n=6）。
本发明对碘试液比色法测定α－淀粉酶抑制剂活性的试验条件进行系列试验，寻找到了最佳的试验条件，为α－AI的检测提供保证。本发明是将淀粉基质液浓度控制为1.8-2.2%，淀粉酶和待测样品的结合时间控制在5-10min，酶促反应最适温度控制在35℃±0.2℃，加入淀粉基质溶液后反应时间定为5min，采用添加稀盐酸的方式终止反应。该反应条件在保证活性测定准确的前提下，简化了实验步骤，缩短了淀粉酶和待测样品的结合时间，采用稀盐酸及时终止反应，避免了试验的误差，增强了试验的可控性，使得检测结果更准确。本发明具有操作便捷、检测准确、效率高、应用范围广、回收率高的特点，适用于保健食品和药品及原料中α-淀粉酶抑制剂活性的测定。
出人意料的是，本发明还发现了在α-淀粉酶抑制剂活性的试验中存在一定的非线性吸收现象，在改进了试验之后，测量准确度进一步提高。
附图说明
下面结合附图来详细说明本发明的实施方案。
图1是本发明实施例1的拟合曲线，其中横坐标为加入的可溶性淀粉溶液的毫升数，纵坐标为吸收值。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
除非另有说明，本发明的说明书和实施例中的“吸收值”均是指在扣除了空白吸收之后的吸收值。
除非另有说明，“碘试液”均是指按照实施例1的第1部分第（3）-（4）节所描述的方式所制备得到的“稀碘液”。两个术语具有相同的含义，并且可以交换使用。
除非另有说明，“直接将扣除了空白读数的吸收值作为最终吸收值”是指在试验组之外，还进行了空白组的试验。该空白组中不含有可溶性淀粉溶液、碘试液和酶，但是含有相同浓度的磷酸盐缓冲溶液，并且以蒸馏水补足体积。
除非另有说明，本发明各实施例中，淀粉标准曲线是按以下方法建立：
1）、试剂配制
（1）可溶性淀粉基质溶液（2%）：称取2.00g（精确至0.001g）可溶性淀粉（以绝干计）于烧杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓缓加入80ml沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯中，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100ml，溶液现配现用；
（2）磷酸缓冲液（pH=6.0）：称取45.23g磷酸氢二钠和8.07g柠檬酸，用水溶解并定容至1000ml，用pH计校正后使用；
（3）原碘液：称取11.0g碘和22.0g碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500ml，贮存于棕色瓶中；
（4）稀碘液：吸取原碘液2.00ml，用水溶解并定容至500ml，贮存于棕色瓶中；
（5）盐酸溶液（0.1mol/L）：取盐酸9ml，加水适量定容至1000ml，摇匀；
（6）猪胰淀粉酶：按GB8275-2009测定α－淀粉酶活性，贮藏于冰箱中。
2）、测定条件的选择
淀粉基质液浓度的确定配制0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%系列可溶性淀粉溶液，分别取10mL于各试管中，再各加1mL蒸馏水混合，取其0.1mL于10mL碘试液中，立即混合后于波长620nm处测定吸光度，并作为淀粉基质液进行活性测定，观察在波长620nm 处试验溶液的蓝色消失并变为红色时管数，确定淀粉基质液的浓度。试验结果见表2。
表2：各种浓度下可溶性淀粉溶液在加入碘试液之后的吸光度及目测结果
| 浓度(%) | 取液量（ml） | 加水量（ml） | 吸光度 | 管数 | 结果 |
| 0.5 | 10 | 1 | 0.1-0.3 | 第1管 | 无法观察 |
| 1.0 | 10 | 1 | 0.3-0.5 | 第1 管 | 无法观察 |
| 1.5 | 10 | 1 | 0.5-0.7 | 第1 管 | 无法观察 |
| 2.0 | 10 | 1 | 0.7-0.9 | 第2 管至第15 管 | 可以观察到 |
| 2.5 | 10 | 1 | 0.9-1.0 | 15管以后 | 无法观察 |
注：所有试验组均重复进行5次取平均值。
从表2可以看出，淀粉基质液浓度在1.5%及以下时，由于淀粉少、相对酶量大，待反应5min后观察时几乎看不到蓝色消失而直接是浅红色；而淀粉基质液浓度在2.5%及以上时，由于淀粉多、相对酶量少，待反应5min后观察至10min时仍未见蓝色消失的迹象；淀粉基质液浓度在2%时，待反应5min后，6～10min内可观察到蓝色消失转变为浅红色的过程。因此，淀粉基质液浓度确定为2%。
3）、反应温度的确定
取5mL基质液于25mL容量瓶中，分别在25、30、35、40 、45、50℃恒温振荡器内振摇15min后，准确加入1mLα－淀粉酶试样溶液，立即振摇混匀后放回相应温度振荡器内继续振摇。从计时反应5min后开始每过1min取出0.1mL于10mL碘试液中，立即混合并作为试验溶液。于波长660nm处测定试验溶液的蓝色消失并变为红色时的管数，确定酶促反应的最适温度。试验结果见表3。
表3 酶促反应最适温度的确定
| 温度（℃） | 管数 | 结果 |
| 25 | 第30管以后 | 无法观察 |
| 30 | 第20管至第30管 | 可观察到 |
| 35 | 第2管至第20管 | 可观察到 |
| 40 | 第20管至第30管 | 可观察到 |
| 45 | 第30管以后 | 无法观察 |
| 50 | 第30管以后 | 无法观察 |
从表3可以看出，25、45、50℃时由于不是酶促反应最适温度，第30管以后仍无法观察到蓝色消失；30、40℃时虽接近酶促反应最适温度，但不是最适温度，在第20管至第30管可观察到蓝色消失，但时间过长不利于检测；35℃时是酶促反应的最适温度，在第2管至第20 管可观察到蓝色消失，能满足检测观察的需要。
4）、淀粉标准曲线的建立
按照下表精密量取，置于试管中，混匀。取1ml淀粉基质液浓度加入稀碘液10ml中，混匀，在660nm下测定吸光度；同时以0号管做空白，见表4。
表4淀粉标准曲线（回归方程）测定方案
| 试管编号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 淀粉溶液（ml） | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 蒸馏水（ml） | 7 | 6 | 5 | 4 | 3 | 2 | 1 | 0 |
| 0.1mol/L盐酸溶液（ml） | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 磷酸缓冲液（ml） | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
以所取淀粉的质量与相对应的吸光度，计算线性回归方程，其拟合结果显示在图1中，从此处可以得到B为0.117。
实施例1
一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其经过以下步骤：
（I）淀粉标准曲线的建立；
（II）配制淀粉酶抑制剂供试品溶液：精密称取汉中天然谷生产的白芸豆粉末（含α-淀粉酶抑制剂）0.1g于容量瓶中，加水定容至100ml，放置30min，充分溶解后取上清液作为供试品溶液；
（III）配制α-淀粉酶溶液：α-淀粉酶液的制备：精密称取猪胰淀粉酶加蒸馏水制成0.15mg/ml的溶液，摇匀即可；
（IV）供试品抑制条件下的淀粉水解试验：精密量取步骤II的供试品溶液、步骤III的猪胰淀粉酶溶液各5mL，并且分别在34.8℃水浴中预热8分钟，混合并且继续保温5分钟，在混合液中加入步骤I的可溶性淀粉溶液和pH为6.0的磷酸缓冲液，并且在34.8℃水浴中反应5分钟时间后，滴加稀盐酸3 mL使得反应终止；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A2；
（V）无抑制条件下的淀粉水解试验：将与步骤IV等量的猪胰淀粉酶溶液在34.8℃水浴中预热8分钟，加入与步骤IV等量的可溶性淀粉溶液和pH为6.0的磷酸缓冲液，加蒸馏水达到步骤IV的相同体积，并且在34.8℃水浴中反应5分钟后，滴加稀盐酸3 mL；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A1；
（VI）计算：按照以下公式来计算α-淀粉酶抑制剂活性活性：
式中，U：为α-淀粉酶抑制剂活性，单位为U/g；
M1：为淀粉的取样量，单位为g；
M2：为α-淀粉酶抑制剂的取样量，单位为g；
B：为淀粉标准曲线回归方程中的斜率；
A1：为淀粉酶对照品的吸光度；
A2：为α-淀粉酶抑制剂的吸光度；
342.3：为麦芽糖的摩尔质量，g/mol；
T：为反应时间，min。
经计算得到汉中天然谷生产的白芸豆粉末α-淀粉酶抑制剂活性为770.74 U/g，回收率为99.40%。
实施例2
一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其经过以下步骤：
（I）淀粉标准曲线的建立；
（II）配制淀粉酶抑制剂供试品溶液：精密称取云南天保桦生产的白芸豆粉末（含α-淀粉酶抑制剂）0.1g于容量瓶中，加水定容至100ml，放置30min，充分溶解后取上清液作为供试品溶液；
（III）配制α-淀粉酶溶液：α-淀粉酶液的制备：精密称取猪胰淀粉酶加蒸馏水制成0.15mg/ml的溶液，摇匀即可；
（IV）供试品抑制条件下的淀粉水解试验：精密量取步骤II的供试品溶液、步骤III的猪胰淀粉酶溶液各5mL，并且分别在35℃水浴中预热8分钟，混合并且继续保温8分钟，在混合液中加入步骤I的可溶性淀粉溶液和pH为6.0的磷酸缓冲液，并且在35℃水浴中反应3分钟后，滴加稀盐酸4 mL使得反应终止；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A2；
（V）无抑制条件下的淀粉水解试验：将与步骤IV等量的猪胰淀粉酶溶液在35℃水浴中预热8分钟，加入与步骤IV等量的可溶性淀粉溶液和pH为6.0的磷酸缓冲液，加蒸馏水达到步骤IV的相同体积，并且在34.8℃水浴中反应8分钟后，滴加稀盐酸4 mL；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A1；
（VI）计算：按照以下公式来计算α-淀粉酶抑制剂活性活性：
式中，U：为α-淀粉酶抑制剂活性，单位为U/g；
M1：为淀粉的取样量，单位为g；
M2：为α-淀粉酶抑制剂的取样量，单位为g；
B：为淀粉标准曲线回归方程中的斜率；
A1：为淀粉酶对照品的吸光度；
A2：为α-淀粉酶抑制剂的吸光度；
342.3：为麦芽糖的摩尔质量，g/mol；
T：为反应时间，min。
经计算得到云南天保桦生产的白芸豆粉末α-淀粉酶抑制剂活性为1336 U/g，回收率为99.62%
实施例3
一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其经过以下步骤：
（I）淀粉标准曲线的建立；
（II）配制淀粉酶抑制剂供试品溶液：精密称取控卡白芸豆固体饮料（含α-淀粉酶抑制剂）0.1g于容量瓶中，加水定容至100ml，放置30min，充分溶解后取上清液作为供试品溶液；
（III）配制α-淀粉酶溶液：精密称取猪胰淀粉酶加蒸馏水制成0.15mg/ml的溶液，摇匀即可；
（IV）供试品抑制条件下的淀粉水解试验：精密量取步骤II的供试品溶液、步骤III的猪胰淀粉酶溶液各5mL，并且分别在35℃水浴中预热8分钟，混合并且继续保温10分钟，在混合液中加入步骤I的可溶性淀粉溶液和pH为6.0的磷酸缓冲液，并且在35.2℃水浴中反应7分钟时间后，滴加稀盐酸5mL使得反应终止；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A2；
（V）无抑制条件下的淀粉水解试验：将与步骤IV等量的猪胰淀粉酶溶液在35.2℃水浴中预热8分钟，加入与步骤IV等量的可溶性淀粉溶液和pH为6.0的磷酸缓冲液，加蒸馏水达到步骤IV的相同体积，并且在34.8℃水浴中反应8分钟后，滴加稀盐酸5 mL；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A1。
（VI）计算：按照以下公式来计算α-淀粉酶抑制剂活性活性：
式中，U：为α-淀粉酶抑制剂活性，单位为U/g；
M1：为淀粉的取样量，单位为g；
M2：为α-淀粉酶抑制剂的取样量，单位为g；
B：为淀粉标准曲线回归方程中的斜率；
A1：为淀粉酶对照品的吸光度；
A2：为α-淀粉酶抑制剂的吸光度；
342.3：为麦芽糖的摩尔质量，g/mol；
T：为反应时间，min。
经计算得到控卡白芸豆固体饮料α-淀粉酶抑制剂活性为1258U/g，回收率为100.05%。
结论：本发明提出检测α-淀粉酶抑制剂活性的方法，可以方便、准确地检测样品或成品中的α-淀粉酶抑制剂活性，本发明的活性测定方法相比其他方法操作简便、准确度高、可控性好、平均回收率高。
为了考察本发明的方法的准确度，还进行了以下的试验：
试验一：精密度测定
取试验分离纯化的白芸豆α－AI样品，精确称取，按照α－淀粉酶抑制剂活性的测定方法进行测定，6次连续重复测定，试验结果表明，该比色测定方法测定α－AI有良好的精密度，RSD=1.82%(n=6)。
试验二：加样回收率试验
从已知α－AI 活性的样品溶液中精密吸取300μL，共6份，分别准确加入α－ AI对照品溶液200μL，按照实施例1所述的方法进行测定，测加入量的回收率。测定结果见表5。
表5 α－AI加样回收率试验( n = 6)
注: n =6。
从表5得出，α－AI平均回收率为99.39%(n=6)。
试验三：光吸收值的取得方式对比
本试验中，采取了四种的以下仪器设置：
（1）试验组0：条件和实施例1相同，使用的石英吸收池没有贴覆透光片。直接将扣除了空白读数的吸收值作为最终吸收值。
（2）试验组1：条件和实施例1基本相同，其区别在于：在石英吸收池上贴覆透光片1，其透光率在660nm下约为50%。直接将扣除了空白读数的吸收值作为最终吸收值。
（3）试验组2：条件和实施例1基本相同，其区别在于：在石英吸收池上贴覆透光片1，其透光率在660nm下约为25%。直接将扣除了空白读数的吸收值作为最终吸收值。
（4）试验组3：条件和实施例1基本相同，其区别在于：使用完全透明吸收池、贴覆了660nm下透光率为1/2的吸收片的吸收池，贴覆了660nm下透光率为1/4的吸收片的吸收池分别测量三个光强下的吸收值，扣除空白之后取几何平均值来作为660nm下的吸收值读数。
在本试验中，采取了以下的样品处理和试验方法：
（1）实施例1：实施例1的样品处理和反应方法；
（2）实施例1改A：基本和实施例1的样品处理和反应方法相同，区别在于白芸豆粉末的加入量为0.2g；
（3）实施例1改B：基本和实施例1的样品处理和反应方法相同，区别在于白芸豆粉末的加入量为0.5g；
理论上，白芸豆粉末的加入量提高的时候，其增加效应会在M2中得到抵消。
以下各个序号的实验全部都使用相同的起始原料，也就是汉中天然谷生产的白芸豆粉末。
按照表6的设置来完成了以下实验：
表6：光吸收值取得方式对比试验设置
从表6中可见，在使用试验组3的设置时，所测量的结果具有较好的可重复性。当单纯使用试验组0、1或者2时，其在不同光强下得到的活性数值波动较大，具有较大的不确定性。
Claims (12)
1.一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其特征在于：其经过以下步骤：
（I）称取可溶性淀粉M1克，配置成100mL的可溶性淀粉溶液，将该可溶性淀粉溶液中加入碘的浓度为60-100mg/L且碘化钾的浓度为150-200mg/L的碘和碘化钾的混合溶液，来得到在加入的碘和碘化钾的混合溶液的量一定的情况下，溶液的660nm光吸收值与可溶性淀粉溶液关系的一元一次拟合方程，当可溶性淀粉溶液加入毫升数为X轴，吸收值为Y轴的情况下，得到其斜率为B；
（II）配制淀粉酶抑制剂供试品溶液：将精密称量的待测样品粉末M2克置于容量瓶中，加水定容到100mL并且放置20-40分钟之后取上清液作为供试品溶液；
（III）配制淀粉酶溶液：精密称量猪胰淀粉酶加蒸馏水制成0.10-0.20mg/mL的溶液并且摇匀；
（IV）将等体积的步骤II的供试品溶液、步骤III的猪胰淀粉酶溶液各3-8mL，并且分别在35℃±0.2℃水浴中预热5-10分钟，混合并且继续保温5-10分钟，在混合液中加入步骤I的可溶性淀粉溶液和pH为6.0的磷酸缓冲液，并且在35℃±0.2℃水浴中反应T时间后，滴加稀盐酸2-6mL使得反应终止；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A2；
（V）将与步骤IV等量的猪胰淀粉酶溶液在35℃±0.2℃水浴中预热5-10分钟，加入与步骤IV等量的可溶性淀粉溶液和pH为6.0的磷酸缓冲液，加蒸馏水达到步骤IV的相同体积，并且在35℃±0.2℃水浴中反应T时间后，滴加稀盐酸3-5mL；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A1；
（VI）按照以下公式来计算α-淀粉酶抑制剂活性活性：
式中，U：为α-淀粉酶抑制剂活性，单位为U/g；
M1：为淀粉的取样量，单位为g；
M2：为α-淀粉酶抑制剂的取样量，单位为g；
B：为淀粉标准曲线回归方程中的斜率；
A1：为淀粉酶对照品的吸光度；
A2：为α-淀粉酶抑制剂的吸光度；
342.3：为麦芽糖的摩尔质量，g/mol；
T：为反应时间，min。
2.根据权利要求1所述的一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其特征在于：所述的步骤I按照以下的方法来进行：称取可溶性淀粉0.18-0.22克于烧杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边慢慢加入沸水中，搅拌到完全透明，冷却后定容，得到质量体积比浓度为1.8-2.2%的可溶性淀粉溶液；配制pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液；配制碘和碘化钾的混合溶液，其中碘的浓度为60-100mg/L，碘化钾的浓度为150-200mg/L；分别取0、1、2、3、4、5、6、7mL的质量体积比浓度为2.0%的可溶性淀粉溶液，加入10mL的碘和碘化钾的混合溶液、5mL的0.1M的HCl溶液、2.5mL的磷酸盐缓冲溶液，并且分别加蒸馏水7、6、5、4、3、2、1、0毫升，配制得到8组的淀粉标准曲线样品，在660nm下测定吸光度，以所取的淀粉的毫升数与对应的吸光度作图并且按照一次方程拟合得到标准曲线方程，斜率为B。
3.根据权利要求1所述的一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其特征在于：在步骤I中，碘和碘化钾的混合溶液中碘的浓度为88 mg/L，碘化钾的浓度为176 mg/L；反应时间T为4-6分钟。
4.根据权利要求1所述的一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其特征在于：在步骤II中，将精密称量的待测样品粉末0.08-0.12克置于容量瓶中，加水定容到100mL并且放置30分钟之后取上清液作为供试品溶液。
5.根据权利要求1所述的一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其特征在于：在步骤III中，精密称量猪胰淀粉酶加蒸馏水制成0.15mg/mL的溶液并且摇匀。
6.根据权利要求1所述的一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其特征在于：在步骤IV中，将等体积的步骤II的供试品溶液、步骤III的猪胰淀粉酶溶液各5mL，并且分别在35℃±0.2℃水浴中预热8分钟，混合并且继续保温5分钟，在混合液中加入步骤I的可溶性淀粉溶液和pH为6.0的磷酸缓冲液，并且在35℃±0.2℃水浴中反应T时间后，滴加稀盐酸4 mL使得反应终止；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A2。
7.根据权利要求1所述的一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其特征在于：在步骤V中，将与步骤IV等量的猪胰淀粉酶溶液在35℃±0.2℃水浴中预热8分钟，加入与步骤IV等量的可溶性淀粉溶液和pH为6.0的磷酸缓冲液，加蒸馏水达到步骤IV的相同体积，并且在35℃±0.2℃水浴中反应T时间后，滴加稀盐酸4 mL；加入碘和碘化钾的混合溶液，并且在660nm下测量吸收值A1。
8.根据权利要求1所述的一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其特征在于：在步骤IV和V中，所述的T时间是3-7分钟。
9.根据权利要求1所述的一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其特征在于：在步骤IV和V中，所述的T时间是5分钟。
10.根据权利要求1所述的一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其特征在于：在步骤IV和V中，可溶性淀粉溶液、碘和碘化钾的混合溶液与添加盐酸终止反应之前的反应液的体积比是1:1.5-3.0:1.5-3.0。
11.根据权利要求1所述的一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其特征在于：在660nm下的吸收值是通过以下的方法来得到的：选择第一光强Y1、第二光强Y2和第三光强Y3，分别测量得到三个光强下的吸收值AY1、AY2和AY3，将三个光强下吸收值的几何平均值来作为660nm下的吸收值读数，其中Y1、Y2和Y3满足关系Y1：Y2：Y3=1:1.5-3:3-5。
12.根据权利要求1所述的一种α-淀粉酶抑制剂活性的检测方法，其特征在于：在660nm下的吸收值通过以下的方法来得到：使用完全透明吸收池、贴覆了660nm下透光率为1/2的吸收片的吸收池，贴覆了660nm下透光率为1/4的吸收片的吸收池分别测量三个光强下的吸收值，扣除空白之后取几何平均值来作为660nm下的吸收值读数。
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