CN114199863A - 一种α-淀粉酶抑制剂活力的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物科技技术领域，具体为一种α‑淀粉酶抑制剂活力的检测方法，包括步骤1：选用麦芽糖制作标准曲线；步骤2：选用酶解过程的生成物衡量抑制剂活力更为合理准确，麦芽糖与3,5‑二硝基水杨酸(DNS)在高温下发生显色反应，颜色深浅(A540)与麦芽糖浓度存在对应关系；步骤3：将淀粉酶活力值统一折算到100IU后再计算抑制剂活力值，其设计合理，将α‑淀粉酶实际活力统一折算到100IU后，再计算抑制剂活力更为合理，保证了检测结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物科技技术领域，具体为一种α-淀粉酶抑制剂活力的检测方法。
背景技术
现有的淀粉酶抑制剂活力的检测方法在使用的过程中存在着一下不足：
1、标准曲线的建立：采用葡糖糖标准曲线作为检测判定依据，由于α-淀粉酶酶解淀粉的直接产物主要为麦芽糖、异麦芽糖、麦芽寡糖等，因此采用葡萄糖标准曲线作为检测依据存在不合理性，结果存在偏差；
2、显色方案的选取：利用淀粉溶液在碘-碘化钾作用下显蓝色，在一定浓度范围内，660nm处的吸光值和淀粉的量呈线性关系的特点，再根据加入α-淀粉酶抑制剂前后α-淀粉酶分解淀粉量的差值，计算淀粉酶抑制剂的活力。此方法的不合理之处是如果待测样品中含有淀粉会影响活力测定结果，而且淀粉含量越高，所测得的活力相应就越高。而本方法采用的原理是：麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)在高温下发生显色反应，颜色深浅(A540)与麦芽糖浓度存在对应关系，因此按生成物的量衡量抑制剂活力更为合理准确。
3、淀粉酶活力的标准限定：
作为淀粉酶抑制剂，其所抑制的目标淀粉酶活力值对抑制活力的测定存在很大影响，如所用的α-淀粉酶活力较低则测试所得的抑制剂活力会很高，因此规范所要抑制的目标α-淀粉酶的活力对检测结果的规范性很有必要。
α-淀粉酶抑制剂活力(IU)定义为：在37℃/pH6.9下，在α-淀粉酶催化淀粉水解的反应中，当反应体系的α-淀粉酶活力为100IU时，1min内抑制1μg麦芽糖生成所需α-淀粉酶抑制剂的量。
因此，根据将α-淀粉酶实际活力统一折算到100IU后，再计算抑制剂活力更为合理。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于现有淀粉酶抑制剂活力的检测方法中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种α-淀粉酶抑制剂活力的检测方法，能够实现将α-淀粉酶实际活力统一折算到100IU后，再计算抑制剂活力更为合理，保证了检测结果的准确性。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：
一种α-淀粉酶抑制剂活力的检测方法，其包括如下步骤：
步骤1：选用麦芽糖制作标准曲线；
步骤2：选用酶解过程的生成物衡量抑制剂活力更为合理准确，麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)在高温下发生显色反应，颜色深浅(A540)与麦芽糖浓度存在对应关系；
步骤3：将淀粉酶活力值统一折算到100IU后再计算抑制剂活力值。
作为本发明所述的一种α-淀粉酶抑制剂活力的检测方法的一种优选方案，其中：步骤1具体包容如下步骤：
(1)取7只试管编号，分别加入麦芽糖标准溶液(1mg/mL)0，0.15，0.45，0.75，1.05，1.35，1.5mL，然后用去离子水将各试管中液体体积补足至1.5mL；
(2)向各试管中加入1mLDNS后，于沸水浴中加入10min后冷却；
(3)向各试管中加入10mL去离子水，振荡混匀后，于540nm波长下测定吸光度值，用去离子水调零。
作为本发明所述的一种α-淀粉酶抑制剂活力的检测方法的一种优选方案，其中：所述步骤2的具体流程为：
将粉末样品与磷酸盐缓冲液(PBS)按1:500(m/V，g/mL)的比例制成液体样品(需分散完全，不用离心)；将0.25mLα-淀粉酶液和0.25mL液体样品加入到0.5mLPBS中，于37℃水浴10min后，加入0.5mL可溶性淀粉溶液，精确反应5min后加入1mL3,5—二硝基水杨酸试剂(DNS)以终止反应；将反应液于沸水浴中加热10min后迅速置于冰水浴中冷却至室温，然后加入10mL去离子水，混合均匀后于540nm波长下测定吸光值；
其中，在测定过程中，设置空白管、空白对照管、抑制管和抑制对照管，空白管中不添加样品，空白对照管中不加α-淀粉酶液和样品，抑制对照管中不加α-淀粉酶液，体积不足处均以PBS补足。
作为本发明所述的一种α-淀粉酶抑制剂活力的检测方法的一种优选方案，其中：所述步骤3具体包括：
(1)设麦芽糖浓度标准曲线为：c＝f(A)。
其中，c-麦芽糖浓度，mg/mL；A-相应麦芽糖浓度下的吸光度值；
(2)空白组中α-淀粉酶活力(Φ)的计算公式如下：
Φ＝α-淀粉酶活力(IU)＝(f(A1)-f(A2))×1.5×1000/5
其中，1.5-酶解反应体系的体积，mL；5-酶解反应时间，min；
(3)样品中α-AI活力的计算公式如下：
α-AI活力(IU/g)＝(f(A1)-f(A2)-f(A3)+f(A4))×1.5×100×V×100/(5×0.25×m×Φ)
其中，A1-空白管吸光值；A2-空白对照管吸光值；A3-抑制管吸光值；A4-抑制对照管吸光值；V-制备液体样品时所用PBS的体积，mL；m-制备液体样品时所取粉末样品的质量，g；1.5-酶解反应体系的体积，mL；5-酶解反应时间，min；0.25-测定中所取液体样品的体积，mL；Φ-α-淀粉酶活力，IU。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：α-淀粉酶抑制剂(α-AI)能通过与α-淀粉酶的结合来抑制α-淀粉酶的活力。预先与α-AI作用过的α-淀粉酶其活力会降低，单位时间内催化淀粉生成麦芽糖的量会减少。麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)在高温下发生显色反应，颜色深浅(A540)与麦芽糖浓度存在对应关系，将α-淀粉酶实际活力统一折算到100IU后，再计算抑制剂活力更为合理，保证了检测结果的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明结构示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
1.1麦芽糖标准曲线的制作
1)取7只试管编号，分别加入麦芽糖标准溶液(1mg/mL)0，0.15，0.45，0.75，1.05，1.35，1.5mL，然后用去离子水将各试管中液体体积补足至1.5mL。
(见表1)
表1不同浓度麦芽糖溶液配制表
2)向各试管中加入1mLDNS后，于沸水浴中加入10min后冷却。
3)向各试管中加入10mL去离子水，振荡混匀后，于540nm波长下测定吸光度值。用去离子水调零。
1.2测定
将粉末样品与磷酸盐缓冲液(PBS)按1:500(m/V，g/mL)的比例制成液体样品(需分散完全，不用离心)。将0.25mLα-淀粉酶液和0.25mL液体样品加入到0.5mLPBS中，于37℃水浴10min后，加入0.5mL可溶性淀粉溶液，精确反应5min后加入1mL3,5—二硝基水杨酸试剂(DNS)以终止反应。将反应液于沸水浴中加热10min后迅速置于冰水浴中冷却至室温，然后加入10mL去离子水，混合均匀后于540nm波长下测定吸光值。在测定过程中，设置空白管、空白对照管、抑制管和抑制对照管。空白管中不添加样品，空白对照管中不加α-淀粉酶液和样品，抑制对照管中不加α-淀粉酶液。体积不足处均以PBS补足。测定体系如表2所示。α-淀粉酶活力(IU)定义为：在37℃/pH6.9下，1min内催化淀粉生成1μg麦芽糖所需α-淀粉酶的量。
表2 α-AI活力测定体系
样品中α-AI对α-淀粉酶的抑制率(AR)按下式计算：AR＝(1-(A3-A4)/(A1-A2))×100％
其中，A1、A2、A3和A4分别为540nm下空白管、空白对照管、抑制管和抑制对照管的吸光值。
样品的AR值应在20％～50％之间，相应的数据才能用于计算α-AI活力，否则需要调整粉末样品与PBS的比例。
α-AI活力(IU)定义为：在37℃/pH6.9下，在α-淀粉酶催化淀粉水解的反应中，当反应体系的α-淀粉酶活力为100IU时，1min内抑制1μg麦芽糖生成所需α-AI的量。
1.3计算
①设麦芽糖浓度标准曲线为：c＝f(A)。
其中，c-麦芽糖浓度，mg/mL；
A-相应麦芽糖浓度下的吸光度值。
②空白组中α-淀粉酶活力(Φ)的计算公式如下：
Φ＝α-淀粉酶活力(IU)＝(f(A1)-f(A2))×1.5×1000/5
其中，1.5-酶解反应体系的体积，mL；
5-酶解反应时间，min。
③样品中α-AI活力的计算公式如下：
α-AI活力(IU/g)＝(f(A1)-f(A2)-f(A3)+f(A4))×1.5×100×V×100/(5×0.25×m×Φ)
其中，A1-空白管吸光值；
A2-空白对照管吸光值；
A3-抑制管吸光值；
A4-抑制对照管吸光值；
V-制备液体样品时所用PBS的体积，mL；
m-制备液体样品时所取粉末样品的质量，g；
1.5-酶解反应体系的体积，mL；
5-酶解反应时间，min；
0.25-测定中所取液体样品的体积，mL；
Φ-α-淀粉酶活力，IU。
工作原理：α-淀粉酶抑制剂(α-AI)能通过与α-淀粉酶的结合来抑制α-淀粉酶的活力。预先与α-AI作用过的α-淀粉酶其活力会降低，单位时间内催化淀粉生成麦芽糖的量会减少。麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)在高温下发生显色反应，颜色深浅(A540)与麦芽糖浓度存在对应关系。
虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。
Claims (4)
1.一种α-淀粉酶抑制剂活力的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：选用麦芽糖制作标准曲线；
步骤2：选用酶解过程的生成物衡量抑制剂活力更为合理准确，麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)在高温下发生显色反应，颜色深浅(A540)与麦芽糖浓度存在对应关系；
步骤3：将淀粉酶活力值统一折算到100IU后再计算抑制剂活力值。
2.根据权利要求1所述的一种α-淀粉酶抑制剂活力的检测方法，其特征在于：步骤1具体包容如下步骤：
(1)取7只试管编号，分别加入麦芽糖标准溶液(1mg/mL)0，0.15，0.45，0.75，1.05，1.35，1.5mL，然后用去离子水将各试管中液体体积补足至1.5mL；
(2)向各试管中加入1mLDNS后，于沸水浴中加入10min后冷却；
(3)向各试管中加入10mL去离子水，振荡混匀后，于540nm波长下测定吸光度值，用去离子水调零。
3.根据权利要求1所述的一种α-淀粉酶抑制剂活力的检测方法，其特征在于：所述步骤2的具体流程为：
将粉末样品与磷酸盐缓冲液(PBS)按1:500(m/V，g/mL)的比例制成液体样品(需分散完全，不用离心)；将0.25mLα-淀粉酶液和0.25mL液体样品加入到0.5mLPBS中，于37℃水浴10min后，加入0.5mL可溶性淀粉溶液，精确反应5min后加入1mL3,5—二硝基水杨酸试剂(DNS)以终止反应；将反应液于沸水浴中加热10min后迅速置于冰水浴中冷却至室温，然后加入10mL去离子水，混合均匀后于540nm波长下测定吸光值；
其中，在测定过程中，设置空白管、空白对照管、抑制管和抑制对照管，空白管中不添加样品，空白对照管中不加α-淀粉酶液和样品，抑制对照管中不加α-淀粉酶液，体积不足处均以PBS补足。
4.根据权利要求1所述的一种α-淀粉酶抑制剂活力的检测方法，其特征在于：所述步骤3具体包括：
(1)设麦芽糖浓度标准曲线为：c＝f(A)。
其中，c-麦芽糖浓度，mg/mL；A-相应麦芽糖浓度下的吸光度值；
(2)空白组中α-淀粉酶活力(Φ)的计算公式如下：
Φ＝α-淀粉酶活力(IU)＝(f(A1)-f(A2))×1.5×1000/5
其中，1.5-酶解反应体系的体积，mL；5-酶解反应时间，min；
(3)样品中α-AI活力的计算公式如下：
α-AI活力(IU/g)＝(f(A1)-f(A2)-f(A3)+f(A4))×1.5×100×V×100/(5×0.25×m×Φ)
其中，A1-空白管吸光值；A2-空白对照管吸光值；A3-抑制管吸光值；A4-抑制对照管吸光值；V-制备液体样品时所用PBS的体积，mL；m-制备液体样品时所取粉末样品的质量，g；1.5-酶解反应体系的体积，mL；5-酶解反应时间，min；0.25-测定中所取液体样品的体积，mL；Φ-α-淀粉酶活力，IU。
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| US4337309A (en) * | 1978-02-28 | 1982-06-29 | Pharmacia Diagnostics Ab | Method of deterining the concentration of pancreatic and salivary α-amylase in body fluids |
| CN107807102A (zh) * | 2017-11-02 | 2018-03-16 | 威海百合生物技术股份有限公司 | 一种α‑淀粉酶抑制剂活性的检测方法 |
| CN108703989A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-10-26 | 新产业大健康科技（珠海）有限公司 | 一种工业化制备白芸豆α-淀粉酶抑制剂的方法 |
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2021
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