CN108559769A - 一种饲料用酶的评估方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的一种饲料用酶的评估方法，包括如下步骤：(1)体外酶解复合处理步骤；(2)离心失重计算步骤；(3)依据酶解失重对饲料用酶饲用效果评估步骤。本发明饲料用酶饲用效果的评估方法以动物饲料或饲用原料为底物，集酶活力单位测定和动物养殖实验两方面的优势，虽然其结果的客观性不及与动物实验体系相比，但是与单纯意义上的酶活力单位测定相比，它的结果更具实用意义，而且它有着周期短、重复性好、耗费少、差异显著、外界条件易于控制等优点。本发明为酶在饲料业的合理使用提供科学依据，为饲用酶制剂作用效果的快速评定提供新的方法。

Description

一种饲料用酶的评估方法
技术领域
本发明涉及一种饲料用酶的评估方法，其通过酶对饲用原料的酶解，提供了一种将酶加入到饲用原料模拟饲养动物消化过程进行不同pH值条件下的反应处理，反应后的离心分离，分离后固体烘干称重计算失重，上清液测还原糖、小肽等的动物体外酶解评估方法。
背景技术
饲料用酶制剂的应用效果现已毋庸置疑，它既能提高饲料的消化率和利用率，提高畜禽生产性能，又能减少畜禽排泄物中的氮、磷的排泄量，保护水体和土壤免受污染，因而饲用酶制剂作为一类高效、无毒副作用和环保型的“绿色”饲料添加剂，在二十一世纪将有着十分广泛的应用前景。然而酶制剂在饲料中的应用还面临一些问题，如评价酶作用的方法，酶活性检测标准，如何合理选用使用酶制剂等等。
酶的来源很广泛，包括动植物性来源和微生物来源。目前应用较为广泛的是微生物来源的酶，不同来源酶的性质差异较大，它们的差异在宏观上是通过外界条件表现出来的，如温度、pH值、底物特异性等等。目前市场上已有的通过不同微生物发酵生产的酶商品种类很多，但是关于不同酶性能优劣的评价体系尚未建立完善。普通意义上的酶活测定与酶在动物体内期望作用的状态差距很大，已不能够科学全面评价一种酶的性能，虽然动物养殖实验体系对酶的评价较为客观，但是其周期长，耗费大，差异不显著，外界因素条件气候、环境、人为操作等影响大等原因使这种方法不能作为一种常规的试验评估方法得到推广。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对全面评价一种酶的性能所存在的问题而提供一种饲料用酶的评估方法，该方法提供一种饲料用酶对饲用原料的酶解方法，模拟饲养动物消化过程将酶对饲用原料的酶解在动物体外完成，通过反应前后的失重等表达酶的降解效果。
本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：
一种饲料用酶的评估方法，包括如下步骤：
(1)体外酶解复合处理步骤；
(2)离心失重计算步骤；
(3)依据酶解失重对饲料用酶饲用效果评估步骤。
在本发明一个优选实施例中，所述体外酶解复合处理步骤具体包括如下步骤：
A.称取饲料于离心管中，加入由摩尔浓度为1mol/L的盐酸溶液、pH3.0 的缓冲液、质量百分浓度1％环丙沙星构成的第一混合液，浸润饲料得到pH值为3.0的第一酶解料糜；
B.将上述pH值为3.0的第一酶解料糜于40℃水浴锅中预热30min，加入预先设定好的添加量添加酶液，迅速摇匀，40℃静置保温计时1～4h；
C.步骤B计时结束后迅速加入由摩尔浓度为2mol/L氢氧化钠溶液、 pH6.5缓冲液构成的第二混合液，迅速摇匀得到pH值为6.5的第二酶解料糜，然后将此pH值为6.5的第二酶解料糜在40℃静置保温计时30min；
D.步骤C计时结束后迅速加入由摩尔浓度为2mol/L氢氧化钠溶液、 pH6.5缓冲液构成的第三混合液，迅速摇匀得到pH值为6.5的第二酶解料糜，然后将pH值为6.5的第三酶解料糜在40℃静置保温计时2.5～23.5h；
E.步骤D计时结束后迅速加入摩尔浓度为0.4mol/L的三氯乙酸(TCA) 溶液,迅速摇匀，以终止酶的反应。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤A中的饲料用量为5.0000g± 0.0005g。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤A中的样品数量为三个。
在本发明的一个优选实施例中，所述第一混合液由0.1～5ml的摩尔浓度为1mol/L的盐酸溶液、15ml pH3.0的缓冲液、1ml质量百分浓度1％环丙沙星构成。
在本发明的一个优选实施例中，所述酶液是经过稀释的酶液。
在本发明的一个优选实施例中，所述酶液的添加量依据饲料量和酶品种进行计算。
在本发明的一个优选实施例中，所述酶液的添加量为1ml。
在本发明的一个优选实施例中，所述第二混合液由0.2～5ml摩尔浓度为 2mol/L氢氧化钠溶液、2.20ml pH6.5缓冲液构成。
在本发明的一个优选实施例中，所述第三混合液由0.2～5ml摩尔浓度为 2mol/L氢氧化钠溶液、2.20ml pH6.5缓冲液构成。
在本发明的一个优选实施例中，所述pH3.0的缓冲液的配制过程如下：称取0.836g柠檬酸C6H8O7·H2O，0.73097g磷酸氢二钠Na2HPO4·12H2O以蒸馏水溶解并定容至1000ml。以pH计测量并校正至pH为3.0。
在本发明的一个优选实施例中，所述pH6.5的缓冲液的配制过程如下：称取0.609g柠檬酸C6H8O7·H2O，5.083g磷酸氢二钠Na2HPO4·12H2O以蒸馏水溶解并定容至1000ml。以pH计测量并校正至pH为6.5。
在本发明的一个优选实施例中，所述离心失重计算步骤是将离心管在 2000～6000rpm下离心1～20min后，离心管倾去上清液，放入烘箱85℃48h 烘干,称重,计算失重。
在本发明的一个优选实施例中，所述离心失重计算步骤还包括上清液测还原糖、小肽步骤。
本发明饲料用酶饲用效果的评估方法以动物饲料或饲用原料为底物，集酶活力单位测定和动物养殖实验两方面的优势，虽然其结果的客观性不及与动物实验体系相比，但是与单纯意义上的酶活力单位测定相比，它的结果更具实用意义，而且它有着周期短、重复性好、耗费少、差异显著、外界条件易于控制等优点。和以往体外酶解方法相比，抛弃了滤纸过滤分离选用了离心分离，操作误差大大减小，实验评估结果更加精准，从而样品平行从六个减少到三个，减少实验工作量。第二次调pH分二次进行，避免了料液局部瞬间过碱而损失酶活，保障实验正确进行。
本发明为酶在饲料业的合理使用提供科学依据，为饲用酶制剂作用效果的快速评定提供新的方法。
具体实施方式
本发明的实验方法为将酶加入到饲用原料进行不同pH值条件下的反应处理，反应后的离心，离心后烘干称重计算失重等的体外酶解方法。
本发明所用原料和试剂可选自市售任意一种，例如：
NaOH，可选自国药集团。
盐酸，可选自国药集团。
本发明所使用的实验仪器均为本行业常用实验仪器，包括烧杯、容量瓶、恒温水浴锅、离心机、烘箱、分析天平等。
实施例1：
玉米豆粕用酶进行猪消化酶解实验
预备实验：
称取玉米3.5000g±0.0005,豆粕1.5000g(±0.0005)于烧杯中，加入 15ml蒸馏水搅匀，实验滴定得知加入1.1ml 1mol/L的盐酸溶液可至酶解料糜的pH值至3.0。
称取玉米3.5000g(±0.0005),豆粕1.5000g(±0.0005)于烧杯中，加入1.1ml1mol/L的盐酸溶液,15ml pH3.0缓冲液搅匀，实验滴定得知加入 0.60ml 2mol/L的氢氧化钠溶液可改变酶解料糜的pH值至6.5。
体外酶解复合处理过程：
pH3.0(40℃ 4h)→pH6.5(40℃ 19h)总反应保温时间为23h
A.称取玉米3.5000g(±0.0005),豆粕1.5000g(±0.0005)于50ml离心管中，加入(1.1ml 1mol/L盐酸溶液，15ml pH3.0缓冲液，1ml 1％环丙沙星的混合液)，浸润。
B.上述料液于40℃水浴锅中预热30min，迅速加入1ml经过适当稀释的酶液，迅速摇匀，40℃静置保温计时4h。
C.计时结束后迅速加入(0.30ml 2mol/L氢氧化钠溶液，2.20ml pH6.5缓冲液的混合液)迅速摇匀。40℃静置保温计时30min。
D.计时结束后迅速加入(0.30ml 2mol/L氢氧化钠溶液，2.20ml pH6.5缓冲液的混合液)迅速摇匀。40℃静置保温计时18hr30min。
E.计时结束后迅速加入20ml浓度为0.4mol/L的三氯乙酸(TCA)溶液, 迅速摇匀，以终止酶的反应。
F.离心管离心(3000r/min,5min)，倾去上清液。离心管放入烘箱(85℃ 48h)烘干,称重,计算失重，结果见表1。
表1
实施例2：
鼎晟817肉鸡配合饲料(制粒)用酶进行鸡消化酶解实验
预备实验：
称取鼎晟817肉鸡配合饲料5.0000g(±0.0005)于烧杯中，加入15ml蒸馏水搅匀，实验滴定得知加入2.3ml 1mol/L的盐酸溶液可至酶解料糜的pH值至3.0。
称取鼎晟817肉鸡配合饲料5.0000g(±0.0005)于烧杯中，加入2.3ml 1mol/L的盐酸溶液,15ml pH3.0缓冲液搅匀，实验滴定得知加入1.38ml 2mol/L的氢氧化钠溶液可改变酶解料糜的pH值至6.5。
体外酶解复合处理过程：
pH3.0(40℃ 2h)→pH6.5(40℃ 5h)总反应保温时间为7h
A.称取鼎晟817肉鸡配合饲料5.0000g(±0.0005)酶解料于50ml离心管中，加入(2.3ml1mol/L的盐酸溶液，15ml pH3.0的缓冲液，1ml 1％环丙沙星的混合液)，浸润。
B.上述料液于40℃水浴锅中预热30min，迅速加入1ml经过适当稀释的酶液，迅速摇匀，静置保温计时2h。
C.计时结束后迅速加入(0.69ml 2mol/L氢氧化钠溶液，2.20ml pH6.5缓冲液的混合液)迅速摇匀。40℃静置保温计时30min。
D.计时结束后迅速加入(0.69ml 2mol/L氢氧化钠溶液，2.20ml pH6.5缓冲液的混合液)迅速摇匀。40℃静置保温计时4hr30min。
E.计时结束后迅速加入20ml浓度为0.4mol/L的三氯乙酸(TCA)溶液, 迅速摇匀，以终止酶的反应。
F.离心管离心(3000r/min,5min)，吸取上清液测还原糖和小肽。离心管倾去上清液放入烘箱(85℃48h)烘干,称重,计算失重，结果见表2。
表2
实施例3：
混合饲料用商品复合酶进行猪消化酶解实验
预备实验：
称取玉米2.6500g(±0.0005)，小麦0.5500g(±0.0005)，豆粕 0.9500g(±0.0005)，棉粕0.2500g(±0.0005)，DDGS 0.3500g(± 0.0005)，花生粕0.2500g(±0.0005)于烧杯中，加入15ml蒸馏水搅匀，实验滴定得知加入1.5ml 1mol/L的盐酸溶液可至酶解料糜的pH值至3.0。
称取玉米2.6500g，小麦0.5500g，豆粕0.9500g，棉粕0.2500g，DDGS 0.3500g，花生粕0.2500g(±0.0005)于烧杯中，加入1.5ml 1mol/L的盐酸溶液,15ml pH3.0缓冲液搅匀，实验滴定得知加入0.84ml 2mol/L的氢氧化钠溶液可改变酶解料糜的pH值至6.5。
体外酶解复合处理过程：
pH3.0(40℃ 4h)→pH6.5(40℃ 19h)总反应保温时间为23h
A.称取玉米2.6500g，小麦0.5500g，豆粕0.9500g，棉粕0.2500g， DDGS 0.3500g，花生粕0.2500g(±0.0005)于50ml离心管中，加入(1.5ml 1mol/L盐酸溶液，15ml pH3.0缓冲液，1ml 1％环丙沙星的混合液)，浸润。
B.上述料液于40℃水浴锅中预热30min，迅速加入1ml经过适当稀释的酶液，迅速摇匀，40℃静置保温计时4h。
C.计时结束后迅速加入(0.42ml 2mol/L氢氧化钠溶液，2.20ml pH6.5缓冲液的混合液)迅速摇匀。40℃静置保温计时30min。
D.计时结束后迅速加入(0.42ml 2mol/L氢氧化钠溶液，2.20ml pH6.5缓冲液的混合液)迅速摇匀。40℃静置保温计时18hr30min。
E.计时结束后迅速加入20ml浓度为0.4mol/L的三氯乙酸(TCA)溶液, 迅速摇匀，以终止酶的反应。
F.离心管离心(3000r/min,5min)，倾去上清液。离心管放入烘箱(85℃ 48h)烘干,称重,计算失重,结果见表3。
表3

Claims (14)

1.一种饲料用酶的评估方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)体外酶解复合处理步骤；
(2)离心失重计算步骤；
(3)依据酶解失重对饲料用酶饲用效果评估步骤。
2.如权利要求1所述的一种饲料用酶的评估方法，其特征在于，所述体外酶解复合处理步骤具体包括如下步骤：
A.称取饲料于离心管中，加入由摩尔浓度为1mol/L的盐酸溶液、pH3.0的缓冲液、质量百分浓度1％环丙沙星构成的第一混合液，浸润饲料得到pH值为3.0的第一酶解料糜；
B.将上述pH值为3.0的第一酶解料糜于40℃水浴锅中预热30min，加入预先设定好的添加量添加酶液，迅速摇匀，40℃静置保温计时1～4h；
C.步骤B计时结束后迅速加入由摩尔浓度为2mol/L氢氧化钠溶液、pH6.5缓冲液构成的第二混合液，迅速摇匀得到pH值为6.5的第二酶解料糜，然后将此pH值为6.5的第二酶解料糜在40℃静置保温计时30min；
D.步骤C计时结束后迅速加入由摩尔浓度为2mol/L氢氧化钠溶液、pH6.5缓冲液构成的第三混合液，迅速摇匀得到pH值为6.5的第二酶解料糜，然后将pH值为6.5的第三酶解料糜在40℃静置保温计时2.5～23.5h；
E.步骤D计时结束后迅速加入摩尔浓度为0.4mol/L的三氯乙酸(TCA)溶液,迅速摇匀，以终止酶的反应。
3.如权利要求2所述的一种饲料用酶的评估方法，其特征在于，所述步骤A中的饲料用量为5.0000g±0.0005g。
4.如权利要求2所述的一种饲料用酶的评估方法，其特征在于，所述步骤A中的样品数量为三个。
5.如权利要求2所述的一种饲料用酶的评估方法，其特征在于，所述第一混合液由0.1～5ml的摩尔浓度为1mol/L的盐酸溶液、15ml pH3.0的缓冲液、1ml质量百分浓度1％环丙沙星构成。
6.如权利要求2所述的一种饲料用酶的评估方法，其特征在于，所述酶液是经过稀释的酶液。
7.如权利要求2所述的一种饲料用酶的评估方法，其特征在于，所述酶液的添加量依据饲料量和酶品种进行计算。
8.如权利要求2所述的一种饲料用酶的评估方法，其特征在于，所述酶液的添加量为1ml。
9.如权利要求2所述的一种饲料用酶的评估方法，其特征在于，所述第二混合液由0.2～5ml摩尔浓度为2mol/L氢氧化钠溶液、2.20ml pH6.5缓冲液构成。
10.如权利要求2所述的一种饲料用酶的评估方法，其特征在于，所述第三混合液由0.2～5ml摩尔浓度为2mol/L氢氧化钠溶液、2.20ml pH6.5缓冲液构成。
11.如权利要求2所述的一种饲料用酶的评估方法，其特征在于，所述pH3.0的缓冲液的配制过程如下：称取0.836g柠檬酸C6H8O7·H2O，0.73097g磷酸氢二钠Na2HPO4·12H2O以蒸馏水溶解并定容至1000ml。以pH计测量并校正至pH为3.0。
12.如权利要求2所述的一种饲料用酶的评估方法，其特征在于，所述pH6.5的缓冲液的配制过程如下：称取0.609g柠檬酸C6H8O7·H2O，5.083g磷酸氢二钠Na2HPO4·12H2O以蒸馏水溶解并定容至1000ml。以pH计测量并校正至pH为6.5。
13.如权利要求1所述的一种饲料用酶的评估方法，其特征在于，所述离心失重计算步骤是将离心管在2000～6000rpm下离心1～20min后，离心管倾去上清液，放入烘箱85℃48h烘干,称重,计算失重。
14.如权利要求1所述的一种饲料用酶的评估方法，其特征在于，所述离心失重计算步骤还包括上清液测还原糖、小肽步骤。
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