CN102127508B - α-淀粉酶抑制剂产生菌及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α-淀粉酶抑制剂产生菌，即游动放线菌Actinoplanes sp.ZJB-08196，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 209022，保藏日期2009年2月16日，所述α-淀粉酶抑制剂为阿卡波糖。并公开了所述α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法。本发明提供的筛选方法简单有效，可以在短时间内筛选大量样品，灵敏度高、减少了HPLC处理样品、分析时间漫长等过程，提高了检测效率。

Description

α-淀粉酶抑制剂产生菌及其筛选方法

(一)技术领域

本发明别涉及到α-淀粉酶抑制剂产生菌及其筛选方法。

(二)背景技术

糖尿病是一种重大多发性疾病，在世界范围内普遍存在。由于生活方式的巨大转变以及人们保健意识的不足，目前我国糖尿病患者已达9240万人，其中男性5020万人，女性4220万人，超过印度，成为世界糖尿病患者最多的国家，发病率(9.7％)仅次于美国(11％)，其中II型糖尿病患者占93.7％。目前常用的治疗II型糖尿病药物有：增加胰岛素敏感性的双胍类——甲福明；促胰岛素分泌的磺酰脲类——格列齐特(Gliclazide，商品名唐并康)；α-糖苷酶抑制剂——阿卡波糖、米格列醇(Miglitol，商品名奥恬苹)、伏格列波糖(Voglibose，商品名倍欣)。其中由于α-糖苷酶抑制剂具有作用温和持久、毒副作用小甚至无毒的优点，得到越来越多国内外研究者的青睐。

在中国，人们膳食结构中以谷类为主，碳水化合物含量高，餐后血糖水平易升高，而糖苷酶抑制剂可以很好的缓解II型糖尿病患者的症状。因此，糖尿病患者对糖苷酶抑制剂类治疗药物有着巨大的需求。α-淀粉酶抑制剂作为这一类物质的代表，备受关注。

α-淀粉酶(α-amylase)为1，4-α-D-葡聚糖水解酶，能够水解淀粉、糖原以及相关多糖为寡糖片段。在消化、吸收过程中，食物中的碳水化合物先经唾液α-淀粉酶、胰α-淀粉酶作用分解为寡糖，然后在小肠中经α-葡萄糖苷酶分解为单糖，最后被小肠上皮细胞吸收进入血液循环。α-淀粉酶抑制剂作为一种糖苷水解酶抑制剂，能有效抑制唾液α-淀粉酶和胰α-淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，减少葡萄糖的产生和摄取，降低血糖和血脂含量水平。在临床上淀粉酶抑制剂可有效预防与治疗糖尿病和高脂血症。既可单独使用，也可以与其他降糖药或降血脂药联合使用。临床医学上用于防治糖尿病、高血糖、高脂血等症，如阿卡波糖已成为糖尿病治疗的首选药物。

根据文献和专利报道，α-淀粉酶抑制剂的筛选是以淀粉酶活性抑制为基础，测定方法主要包括碘比色法(US3876766)和3，5-二硝基水杨酸(DNS)法(Bernfeld法)。其中碘显色法属半定量方法，灵敏度低。3，5-二硝基水杨酸法筛选α-淀粉酶抑制剂基于以下原理：淀粉在胰α-淀粉酶作用下水解产生的还原基团，将3，5-二硝基水杨酸与还原为硝基氨基水杨酸，从而产生颜色变化。通过在波长546nm处测定吸光度(Abs546)可以判断上述反应的进行。由于α-淀粉酶抑制剂对淀粉水解有抑制作用，可使Abs546值下降，从而可以计算待测物对淀粉酶活性的抑制率。测定时，一般通过调整待测溶液及α-淀粉酶溶液的浓度或用量，使Abs546的值在0.4～0.7范围内为宜。但该反应中可溶性淀粉与α-淀粉酶对测定系统本底Abs546值的影响接近0.2，对测定区间0.4-0.7而言本底影响较大，而且难以测定抑制剂浓度与酶活的关系。同时该反应显色需经沸水浴，无法实现在96孔板上进行，不能利用酶标仪等进行高通量筛选。目前，还没有高效、灵敏、快速的微生物源α-淀粉酶抑制剂筛选方法报道。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种快速、灵敏的α-淀粉酶抑制剂筛方法。

为达到发明目的本发明采用以下技术方案：

α-淀粉酶抑制剂产生菌，即游动放线菌Actinoplanes sp.ZJB-08196，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 209022，保藏日期2009年2月16日，所述α-淀粉酶抑制剂为阿卡波糖。

本发明所述的α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法，其特征在于所述方法为：

(1)待筛选菌株接种到平皿培养基上，20～37℃(优选28℃)培养至长出单菌落，挑选单菌落，接种至斜面培养基上，20～37℃(优选28℃)培养直到菌落长成；所述平皿培养基或斜面培养基的组成为：蔗糖5-30g/L，蛋白胨1-5g/L，酪氨酸0.5-2g/L，K₂HPO₄·3H₂O0.5-2g/L，KCl 0.5-2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-2g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1-1g/L，琼脂15-20g/L，溶剂为水，初始pH 6.0-7.5；

(2)挑选步骤(1)得到的菌落接种至发酵培养基中培养，培养温度25～37℃(优选28℃)，摇床转速150～200rpm，培养1～7天，收集得到发酵液，取发酵液于4000～12000rpm离心，取上清液备用。所述发酵培养基的组成为：麦芽糖10-120g/L，葡萄糖10-50g/L，黄豆饼粉5-25g/L，碳酸钙2-10g/L，甘油2-10g/L，谷氨酸钠2-10g/L，溶剂为水，初始pH 6.0-7.5；

(3)将步骤(2)获得的上清液用水稀释10-100倍，即为待测样品，在96板孔内分别加入唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，每分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U，5mmol/l 2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷(Gal-G2-α-CNP)40μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90μl(50mmol/l，pH 6.0)，40μl待测样品。对照组为：所述唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，5mmol·L^-12-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130μl(50mmol/l，pH 6.0)，用酶标仪于405nm处检测Abs₄₀₅，每5秒钟读一次数，直至Abs₄₀₅不再增加，通常需要读数5min，将Abs₄₀₅相对于对照组降低30％以上的样品孔标记为阳性菌株，并保存阳性菌株。

步骤(3)所得阳性菌株可按照步骤(2)进行进一步培养，并按照步骤(3)进行复筛、验证。这是本领域人员公知的复筛验证方法。

本发明方法相对于高效液相(HPLC)分析方法，可以节约大量的分析时间，以及可以节省HPLC中大量作为流动相使用的色谱纯有机试剂，这些试剂一般比较昂贵并且对人体有害。因此本方法可以直接用于产α-淀粉酶抑制剂诱变育种时高产突变株的筛选，也可以用于筛选土壤中产α-淀粉酶抑制剂的微生物，还可应用于其它来源的淀粉酶抑制剂的筛选。

本发明所述平皿培养基或斜面培养基按以下方法制得：水中加入琼脂条，边加热边搅拌，直到完全溶解，然后加入蔗糖，蛋白胨，酪氨酸，K₂HPO₄·3H₂O，KCl，MgSO₄·7H₂O，FeSO₄·7H₂O，搅拌至完全溶解，配制得到终浓度为：蔗糖5-30g/l，蛋白胨1-5g/l，酪氨酸0.5-2g/l，K₂HPO₄ 0.5-2g/l，KCl 0.5-2g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5-2g/l，FeSO₄0.1-1g/l，琼脂15-20g/l的培养基，通常按照每支5ml的量倒入体积为20ml的试管中，121℃灭菌20min，摆放斜面，冷却得到斜面培养基；同时，将灭过菌的培养基冷却至60℃左右，在无菌条件下倒入已灭菌的平皿中，冷却得到平皿培养基。

所述平皿培养基或斜面培养基的组成优选为：蔗糖25～30g/l，蛋白胨2g/l，酪氨酸1g/l，K₂HPO₄·3H₂O 0.5～1g/l，KCl 0.5g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5g/l，FeSO₄·7H₂O 0.1g/l，琼脂20g/l，溶剂为水，初始pH 7.0。

所述发酵培养基的组成优选为：麦芽糖40-80g/L，葡萄糖20-40g/L，黄豆饼粉10-15g/L，碳酸钙5g/L，甘油5g/L，谷氨酸钠5g/L，溶剂为水，初始pH 7.0。

更进一步，本发明所述的α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法按以下步骤进行：

(1)将待筛选菌株接种到平皿培养基上，28℃培养至长出单菌落，挑选单菌落，接种至斜面培养基上，28℃培养直到菌落长成；所述平皿培养基或斜面培养基的组成为：蔗糖25～30g/l，蛋白胨2g/l，酪氨酸1g/l，K₂HPO₄·3H₂O 0.5～1g/l，KCl 0.5g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5g/l，FeSO₄·7H₂O 0.1g/l，琼脂20g/l，溶剂为水，初始pH 7.0；

(2)挑选步骤(1)得到的菌落接种至发酵培养基中培养，培养温度28℃，摇床转速150～200rpm，培养7天，得到发酵液，取发酵液于10000～12000rpm离心，取上清液备用；所述发酵培养基的组成为：麦芽糖40-80g/L，葡萄糖20-40g/L，黄豆饼粉10-15g/L，碳酸钙5g/L，甘油5g/L，谷氨酸钠5g/L，溶剂为水，初始pH 7.0；

(3)将步骤(2)获得的上清液用水稀释25-100倍，即为待测样品，在96板孔内分别加入唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，每1分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U，5mmol/l的2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol/l磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90μl，40μl待测样品；对照组为：所述唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，5mmol/l 2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol/l磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130μl，用酶标仪于405nm处检测Abs₄₀₅，每5秒读一次数，直至Abs₄₀₅不再增加，将Abs₄₀₅相对于对照组降低30％以上的样品孔标记为阳性菌株，并保存阳性菌株。

本发明以上步骤中所用的唾液淀粉酶购自美国Lee BioSolutions公司。α-淀粉酶的浓度为0.1U/ml，其中，每1分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U。

本发明所用的底物2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷(Gal-G2-α-CNP)，购自日本TOYOBO公司，使用时用水配成5mmol/l标准液，避光，冷藏。由于本底物见光易分解，故保存在棕色瓶中，最多存放两周。若405nm处吸光值大于0.05则需重新配制。

所用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液按照常用方法配制，浓度50mM，pH 6.0。之所以选pH 6.0是由于经过反复实验，发现在该条件下，酶表现出最大活力，并且发现该酶表现出良好的酸碱耐受(pH4.0-8.0)和温度耐受。

本发明的原理为：

底物2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷(Gal-G2-α-CNP)在α-淀粉酶的作用下会生成2-氯-4-硝基苯酚(CNP)，该产物在405nm处有特征吸收峰，其浓度可以通过酶标仪在405nm处测定得到。如果待筛选的样品中有α-淀粉酶抑制剂存在，可以相应的抑制α-淀粉酶的活力，水解反应被抑制，导致生成的CNP产量降低，通过与对照组对比，可以确定样品中是否存在α-淀粉酶抑制剂，以及其含量的相对高低。正是基于本原理，发明了此快速、高通量的筛选方法。实践表明，该模型在筛选α-淀粉酶抑制剂产生菌的试验中效果良好。通过这个模型，筛选得到了产α-淀粉酶抑制剂的菌株。

本发明的有益效果为：操作简单、快速，结果可靠，可同时筛选大量样品，包括微生物发酵液、以及其它来源的淀粉酶抑制剂，实现高通量筛选，减少劳动量。

反应式如下式所示：

本发明简单有效，可以在短时间内筛选大量样品，其突出优点主要在于：(1)灵敏度很高，检测结果与HPLC检测结果一致，重复验证证明，本发明通过抑制率-抑制剂浓度曲线计算阿卡波糖含量的方法快速可靠，重复性好；(2)减少了HPLC处理样品、分析时间漫长等过程，提高了检测效率。本发明基于96孔板作为检测筛选，样品不需要微滤等处理过程，并且检测结果在5min之内获得，简单快速；(3)本发明经济有效，相对于HPLC中作为流动相使用的昂贵并有一定毒性的色谱纯有机试剂来说，本发明涉及的底物Gal-G2-α-CNP作为常规的淀粉酶活力检测试剂，安全易得，并且由于反应在96孔板上进行，筛选用量较小。

(四)具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例中唾液淀粉酶液购自美国Lee BioSolutions公司。α-淀粉酶的浓度为0.1U/ml，其中，每1分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U。

实施例1：

(1)培养基的制备：

平皿培养基以及斜面培养基的制备：所述的培养基组份如下(g/L)：蔗糖25g/l，蛋白胨2g/l，酪氨酸1g/l，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/l，KCl 0.5g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5g/l，FeSO₄·7H₂O 0.1g/l，琼脂20g/l，溶剂为水，初始pH 7.0；配制时，1000mL水中加入20g琼脂条，边加热边搅拌，直到完全溶解，然后加入25g蔗糖，2g蛋白胨，1g酪氨酸，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g，KCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O0.1g，并搅拌至完全溶解，然后补水至1000ml。

按照每支5ml的量倒入体积为20ml的试管中，121℃灭菌20min，摆放斜面，冷却得到斜面培养基；同时，将灭过菌的培养基冷却至60℃，在无菌条件下倒入已灭菌的平皿中，冷却得到平皿培养基。发酵培养基制备：在1000ml水中加入麦芽糖80g，葡萄糖20g，黄豆饼粉10g，碳酸钙5g，甘油5g，谷氨酸钠5g，调节pH7.0，分装到500ml三角瓶中，装液量50ml，然后121℃灭菌20min。冷却得到发酵培养基。

(2)将要筛选的土样(从浙江省稻田采集得到土样)去杂研碎，加入无菌生理盐水，充分振荡，取上清液待用；

(3)分离培养：将步骤(2)制备的上清液梯度稀释涂布于平皿培养基上，在28℃条件下培养一周，期间按照生长快慢逐个挑选单菌落，分别接种到2个斜面培养基上，28℃培养直到菌落长成。

(4)初步筛选：将步骤(3)得到的单菌落分别接种到发酵培养基中，在28℃，摇床转速150rpm条件下，培养168h。培养结束以后，取样1ml在10000rpm条件下离心10min，得到上清液；上清液稀释25倍得到样品；在96板孔内分别加入唾液淀粉酶液30μl，5mmol/lGal-G2-α-CNP 40μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90μl(50mmol/l，pH6.0)，40μl待测样品；同时对照组为：唾液淀粉酶液30μl，5mmol/lGal-G2-α-CNP 40μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130μl(50mmol/l，pH6.0)。空白组为：唾液淀粉酶液30μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130μl(50mmol/l，pH 6.0)，待测样品40μl。用酶标仪于405nm处连续检测Abs₄₀₅，每5秒读一次数，直至反应结束，即Abs₄₀₅不再增加。通过计算，Abs₄₀₅值相对于对照组减少30％的样品孔，初步断定为阳性菌株。同时保存相应的阳性菌株斜面。

(5)复筛

将生长良好的8株阳性斜面分别接种到发酵培养基中，在28℃，摇床转速180rpm条件下培养168h，再用步骤(4)的方法筛选检测，其中α-淀粉酶抑制剂的含量相对稳定。

将发酵液按专利US 4062950进行分离纯化、鉴定，该抑制剂确定为阿卡波糖，利用HPLC分析，阿卡波糖浓度为1500mg/l。HPLC的检测条件为：LC-10AVP Plus(岛津，日本)，色谱柱Hypersil NH2柱(4.6mm×250mm，5μm，大连依利特分析仪器有限公司)。流动相为乙腈/磷酸缓冲液(70/30，v/v)，流速1ml/min，磷酸缓冲液每升含0.6克磷酸二氢钾和0.279克磷酸氢二钠。

经鉴定，此次筛选得到的α-淀粉酶抑制剂——阿卡波糖产生菌为游动放线菌(Actinoplanes sp.)，保藏在中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M 209022，保藏日期2009年2月16日。

实施例2

(1)培养基的制备：

斜面培养基、平皿培养基以及种子培养基、发酵培养基的配制：斜面培养基和平皿培养基是成分相同的培养基，按照如下配制：在1000mL水中加入20g琼脂条，边加热边搅拌，直到完全溶解，然后再加入蔗糖30g，蛋白胨2g，酪氨酸1g，K₂HPO₄·3H₂O 1g，KCl0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.1g，并搅拌至完全溶解，然后补水至1000ml，调pH至7.0。按照每支5ml的量倒入体积为20ml的试管中，121℃灭菌20min，摆放斜面，冷却得到斜面培养基；同时，将灭过菌的培养基冷却至60℃，在无菌条件下倒入已灭菌的平皿中，冷却得到平皿培养基；

发酵培养基：在1000ml水中加入麦芽糖40g，葡萄糖40g，黄豆饼粉15g，碳酸钙5g，甘油5g，谷氨酸钠5g，调节pH7.0，分装到500ml三角瓶中，装液量50ml，然后121℃灭菌20min。冷却得到发酵培养基。

(2)诱变育种

准备螺旋口玻璃试管若干，加入5ml水，10颗左右直径2-3mm的玻璃珠，灭菌后备用；将ZJB-08196菌株(保藏编号CCTCC NO：M 209022)斜面用接种铲挖取一个完整的菌落，放入无菌的玻璃试管内，振荡破碎；然后通过两层无菌纱布过滤得到菌悬液，涂布于无菌的培养皿内，在无菌工作台内晾干后，进行等离子注入诱变，等离子注入采用IBBe-III型低能离子束注入仪(南京三乐电真空设备制造有限公司)，所用离子源为N⁺，N⁺能量为15keV，离子注入强度为60×2.6×10¹³离子/cm²；注入结束后用1ml无菌水将菌体冲洗下来，得到菌悬液，即为待筛选的菌株，然后按照每块平皿100μl菌悬液梯度稀释涂布于上述无菌平皿培养基上，28℃培养至长出单菌落，挑选单菌落，接种至斜面培养基上，28℃培养直到菌落长成。

(3)发酵阶段

将步骤(2)培养好的菌落接种于发酵培养基中，28℃，150rpm培养168h，收集发酵液，12000rpm离心10min，取上清液，稀释100倍，得到待筛选的样品。

(4)初步筛选

将步骤(3)得到样品分别编号；在96板孔内分别加入唾液淀粉酶液30μl，5mmol/l Gal-G2-α-CNP 40μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90μl(pH6.0，50mmol/l)，40μl待测样品；同时对照组为：唾液淀粉酶液30μl，5mmol/l Gal-G2-α-CNP 40μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130μl(pH6.0，50mmol/l)，用酶标仪405nm处检测Abs₄₀₅，每5秒读一次数，直到Abs₄₀₅不再增加，通过计算，Abs₄₀₅值值相对于对照组减少30％以上的样品，为产量提高比较多的菌株。通过计算抑制率

式中Y为抑制率(％)，

为只加Gal-G2-α-CNP和唾液淀粉酶的处理于405nm处测得的吸光值，

为加入Gal-G2-α-CNP、唾液淀粉酶和待测样品的处理于405nm处测得的吸光值。利用反应体系中抑制率-抑制剂浓度曲线(见附图1)，计算突变株的阿卡波糖产量。按下式进行计算：

其中X为待测样品中阿卡波糖浓度，mg/l；Y为抑制率，％；M为待测样品稀释倍数；V₁为加入反应体系中的稀释的待测样品体积(μl)；V为反应体系的总体积(μl)。

(5)复筛

将步骤(4)筛选得到的产量相对较高的突变株按照步骤(2)和步骤(3)重复操作进行培养，并按照步骤(4)进行复筛，并利用HPLC验证。利用HPLC分析，检测条件为：LC-10AVP Plus(岛津，日本)，色谱柱Hypersil NH₂柱(4.6mm×250mm，5μm，大连依利特)。流动相为乙腈/磷酸缓冲液(70/30，v/v)，流速1ml/min，磷酸缓冲液每升含0.6克磷酸二氢钾和0.279克磷酸氢二钠。

利用上述显色方法，测得产量最高的突变株阿卡波糖产量为3349mg/l，通过HPLC进行分析验证，其阿卡波糖的产量为3500mg/l，与通过96孔板检测结果基本一致，比出发菌株ZJB-08196提高了130％。

经过初筛，可以在短时间内筛选大量样品，然后得到产量相对较高的样品进行复筛，减少了HPLC处理样品、分析时间漫长的过程，提高了劳动率。

Claims (1)

1.α-淀粉酶抑制剂产生菌，即游动放线菌Actinoplanes sp.ZJB-08196，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号CCTCCNO：M 209022，保藏日期2009年2月16日，所述α-淀粉酶抑制剂为阿卡波糖。

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