CN103966206A - 一重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明“一重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质的制备及应用”涉及一种新的重组α-淀粉酶抑制剂的制备方法、基因序列及应用。该重组α-淀粉酶抑制剂对哺乳动物α-淀粉酶有很好的特异性抑制作用，能有效地抑制消化道内淀粉酶的活性，减少糖分和能量的摄取，从而降低血糖和减肥，因此该α-淀粉酶抑制剂具有防治糖尿病等的药用潜力，该α-淀粉酶抑制剂对昆虫淀粉酶亦有一定的抑制作用，可以应用于害虫防治，所以本发明将在医药保健和害虫治理领域具有良好的应用前景。

Description

一重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质的制备及应用

技术领域

本发明公开了一种α-淀粉酶抑制剂蛋白质的氨基酸和基因序列及其制备和应用。属于生物技术领域。发明涉及微生物源α-淀粉酶抑制剂的氨基酸序列、表达该抑制剂的基因核苷酸序列；发明也涉及重组的α-淀粉酶抑制剂蛋白质在医药、蛋白质农药和害虫治理中的应用；本发明的应用还涉及该α-淀粉酶抑制剂蛋白质在减肥、保健食品和饮料加工生产中的应用。

背景技术

α-淀粉酶抑制剂是一类可以抑制α-淀粉酶的糖苷水解酶抑制剂，它对哺乳动物和昆虫α-淀粉酶活性有特异性抑制作用。生物源α-淀粉酶抑制剂大致分4种类型：(1)微生物产含氮碳水化合物；(2)微生物产多肽，如从链霉菌S.tendae中分离得到的Tendamistat蛋白质；(3)谷类、豆类以及其它较高等植物中发现的大分子蛋白质类α-淀粉酶抑制剂；(4)利用生物技术制备的工程菌株表达得到的重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质。用工程菌提取的重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质比传统方法提取的天然α-淀粉酶抑制剂纯度高，来源稳定，生产成本低，因此重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质在农、林业、医药和保健领域、食品和饮料加工生产中的应用前景十分广阔。

该发明在农业、林业、园艺或装饰植物害虫治理中的应用：α-淀粉酶抑制剂对某些害虫的α-淀粉酶具有抑制作用，将它作为抗虫基因用于转基因植物来提高植物的抗虫性；也可将α-淀粉酶抑制剂制成生物农药，其抗虫性比较稳定，在农产品中无残留，有较高的开发利用价值。

该发明在医药上的应用：近几年的研究发现，糖尿病病人长时间高血糖水平是导致病人多系统和多脏器损害的主要原因，因此，减少淀粉分解为单糖从而降低餐后血糖水平对糖尿病人就显得十分重要。α-淀粉酶抑制剂能有效地抑制消化道内唾液及胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，减少糖分的摄取，从而降低血糖，因此α-淀粉酶抑制剂具有重要的药用价值潜力，它可用于防治高血糖和糖尿病以及能量过甚引起的高血脂等。同时，大多数α-淀粉酶抑制剂具有对哺乳动物无毒，在低浓度即可发挥很高的生物活性等优点。

该发明另一个重要应用方面是减肥和保健方面。能量摄入过多是引起肥胖的主要原因。α-淀粉酶抑制剂能够在生物体内抑制所摄入食物向能量转化，本发明的重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质对哺乳动物的α-淀粉酶具有很强的抑制作用，可以特异性的抑制哺乳动物源α-淀粉酶，因此α-淀粉酶抑制剂可以使消费者在消费含α-淀粉酶活性抑制剂的食品和饮料时减少能量的摄入，从而产生一种有效的减肥、保健方法。

发明内容

本发明包括以下内容：

1.本发明提供一种编码蛋白质的多核苷酸分子SEQ ID No.1，所述的多核苷酸分子包括与SEQ ID No.1基本相符合的核苷酸序列以及与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列部分相符合并具有相似功能的片断。

2.本发明提供一种蛋白质，所述的蛋白质包含与SEQ ID No.2氨基酸序列基本及部分相符合的氨基酸序列。及该蛋白质的制备方法。该方法包括：

(1)、α-淀粉酶抑制剂基因的克隆：以提取的基因组DNA为模板PCR扩增α-淀粉酶抑制剂基因，回收PCR产物与载体连接，转化感受态细胞，过夜培养，随机挑取阳性菌落进行PCR鉴定；

(2)、α-淀粉酶抑制剂基因的表达：以鉴定过的阳性克隆为模板进行PCR，扩增出α-淀粉酶抑制剂基因全长，与原核表达载体进行连接反应，转化感受态细胞，将过夜培养的含重组质粒的菌种，37℃振荡培养，加IPTG诱导表达目的蛋白质，并进行SDS-PAGE检测重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质；

(3)、重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质的纯化：将含重组质粒的工程菌大量诱导表达，并将重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质变性，然后利用亲和树脂柱纯化α-淀粉酶抑制剂蛋白质；

(4)、纯化重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质复性。

3.本发明提供一种表达载体或宿主细胞，其特征在于它含有基本及部分相符合的SEQ ID NO.1多核苷酸分子序列。

4.一种重组微生物或工程菌株，该重组微生物的特征在于它含有以上1所述的基本及部分相符合的多核苷酸分子转化得到并表达该多核苷酸分子，或根据以上2-3所述的重组微生物，该重组微生物的特征在于它表达的蛋白质含有与SEQ IDNo.2氨基酸序列基本及部分相符合的氨基酸序列。

5.一种药物组合物，其特征在于它含有以上1-4所述的重组微生物或工程菌株的发酵液或产物。该组合物被用于制备α-淀粉酶抑制剂类的生物农药剂或应用于医药和生化领域。

6.一种生产α-淀粉酶抑制剂的方法，包括在适合于编码α-淀粉酶抑制剂的多核苷酸分子表达的条件下培养一种以上1-5所述的微生物以及回收和提纯重组微生物表达蛋白质的方法。

7.一种治理有害昆虫的方法，所述的方法包括将SEQ ID No.1作为目的基因导入原核表达系统，构建具有杀虫功能的工程菌株，将有效剂量的以上1-6所述的重组微生物及其表达产物与一种可接受的农用载体混合的方式应用到害虫治理中。

8.一种以上1-3的任何一个的多核苷酸分子转化并表达该多核苷酸分子的植物，所述的植物可以是易受有害昆虫摄食而造成损害的任何具有农业、林业、园艺或装饰价值的植物。该基因可作为目的基因导入植物，提高植物抗虫性，进行植物品种改良。

9.本发明得到的基因及其编码抑制剂蛋白质也可以应用于医药、蛋白质工程，生产含该α-淀粉酶抑制剂蛋白质的药品等，或生产含有以上1-4所述方法任一项制备的重组α-淀粉酶抑制剂的减肥食品、饮料和功能性保健食品产品。

文中涉及核苷酸序列的地方使用“基本相符”这一术语是想包含那些不会造成编码的蛋白质发生改变的核苷酸序列的变化。此外，使用这一术语还想包含那些在特殊体系中需用来增加编码的蛋白质表达，但这些变化不会导致编码的蛋白质生物活性降低的序列上的其它变化。文中涉及氨基酸序列的地方使用“基本相符”这一术语是想包含那些不会导致α-淀粉酶抑制剂生物活性降低的氨基酸序列上的变化，这些变化可能包括保守的氨基酸替代等。

有益效果

1.本发明公开了一种α-淀粉酶抑制剂基因(sail基因)及其所编码的蛋白质。该α-淀粉酶抑制剂基因将为α-淀粉酶抑制剂的应用如转基因抗虫植物以及环境友好型生物农药的开发提供新基因。该基因可作为目的基因导入原核表达系统，构建具有杀虫功能的工程菌株用于生产蛋白质农药或用于转基因抗虫作物的开发。

2.该发明有望应用于生物途径生产含该重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质的产品。该基因及其编码的α-淀粉酶抑制剂蛋白质也可以用于医药领域中α-淀粉酶抑制剂的生产和应用，如本发明提供的重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质可以很好的抑制哺乳动物源α-淀粉酶，可用于制备治疗糖尿病、肥胖症等的药物。sail基因及其编码产物也可用于蛋白质工程，生产重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质。

3.本发明的重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质能应用于减肥食品和饮料、功能性食品和保健食品等产品中，从而产生一种有效、经济的减肥和保健方法。

下面将引用非限定性实例对本发明作进一步的说明。

具体实施方式

实例1：重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质的制备方法

1)、α-淀粉酶抑制剂基因的克隆：以提取的基因组DNA为模板PCR扩增α-淀粉酶抑制剂基因，回收PCR产物与载体连接，转化感受态细胞，过夜培养，随机挑取阳性菌落进行PCR鉴定；

2)、α-淀粉酶抑制剂基因的表达：以鉴定过的阳性克隆为模板进行PCR，扩增出α-淀粉酶抑制剂基因全长，与原核表达载体进行连接反应，转化感受态细胞，将过夜培养的含重组质粒的菌种，加IPTG诱导表达目的蛋白质，并用SDS-PAGE检测重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质；

3)、重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质的纯化：将含重组质粒的工程菌大量诱导表达，离心收集菌体，进行蛋白质的变性处理，超声破碎细胞，离心收集的上清中含有变性的重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质。上清经微孔滤膜过滤后，用亲和树脂柱纯化α-淀粉酶抑制剂蛋白质；

4)、将变性的重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质的复性。

实例2：重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质在害虫防治中的应用

重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质对棉铃虫幼虫生长的影响：用系列浓度的重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质与人工饲料混合，饲喂2龄棉铃虫幼虫。试验设5个处理(包括1个PBS阴性对照CK)，其中重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质浓度按照倍比稀释：其浓度分别为5μg/g(抑制剂/人工饲料)、10μg/g、20μg/g、40μg/g。不同处理(包括对照CK)分别与人工饲料以1∶10(v/w)混合均匀，平均分成20等份添于养虫板中。每孔挑入1头试虫，每个处理20头，重复3次。96小时后，分别称量不同处理的棉铃虫体重，计算平均单体体重。结果表明，重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质对棉铃虫幼虫的生长发育有较大的影响。经方差分析检测，不同浓度的重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质对棉铃虫幼虫的生长发育在0.05水平上有显著性差异(p＜0.05)。重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质浓度在5～40μg/g(抑制剂/人工饲料)时，棉铃虫幼虫平均体重随浓度的增加而减小，即在此浓度范围内，幼虫虫重与重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质浓度在一定范围内呈负相关关系，当浓度为5μg/g、10μg/g时和浓度为20μg/g、40μg/g时，差异显著。

表1不同浓度重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质对棉铃虫幼虫体重的影响(单位：毫克)

表注：表中数据为M±SE(平均数±标准误)，字母表不差异显著(p＜0.05)。CK：PBS缓冲液；AI：重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质，从A-D浓度分别为5μg/g(抑制剂/人工饲料)、10μg/g、20μg/g、40μg/g。

实例3：重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质降血糖应用

重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质对正常小鼠的淀粉耐量的影响及降血糖作用。取体重相似的小鼠60头，随机分为6组，即空白对照组、淀粉负荷对照组、重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质三个剂量组及阳性药物对照组。动物禁食不禁水12h后，给药组分别灌服(ig)50、15、5mg/kg的重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质和0.1g/kg的阿卡波糖(Acarbose)，淀粉负荷对照组和空白对照组则ig等体积生理盐水。给药后5min，除空白对照组ig生理盐水外，其余各组均ig一定量的淀粉(2g/kg)。分别于ig淀粉后，0、0.5、1和2h取尾静脉血，测定血清血糖含量，观察重组α淀粉酶抑制剂蛋白质对小鼠淀粉负荷耐量的影响。

统计学分析结果。数据以均数±标准差形式表示，采用t检验进行统计学分析，p＜0.05为有显著性差异，p＜0.01为有极显著性差异。结果如表2所示，各组的血糖值均比空白组有所增加。但与淀粉负荷组相比，重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质组的血糖值在餐后0.5h和1h明显降低。可以说明重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质能够抑制小鼠肠胃中淀粉的吸收，降低小鼠餐后血糖。

表2：重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质对正常小鼠的淀粉耐量的影响

表注：与淀粉负荷组相比，a∶p＜0.05，b∶p＜0.01。AI：重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质。

实例4：α-淀粉酶抑制剂对各种来源α-淀粉酶的抑制效果

5μLα-淀粉酶抑制剂与5μL各种来源α-淀粉酶混合，37℃温育10min，使抑制剂和α-淀粉酶充分结合。用α-淀粉酶测定试剂盒测定剩余α-淀粉酶活性，计算α-淀粉酶抑制剂的抑制率。不同样品的收集方法如下：(1)人唾液淀粉酶粗提液的获得：收集唾液后等体积稀释，10000rpm离心，取上清即为人唾液淀粉酶的粗提液。(2)小鼠血清淀粉酶样品的获得：取尾静脉小鼠血液，4000rpm/min离心20min，分离血清测血清淀粉酶活性。(3)昆虫α-淀粉酶粗提液的获得：挑取昆虫适量，置于-20℃冰箱冷冻致死。取出放入预冷的研钵中，加入预冷的PBS缓冲液(含1％的1mM蛋白酶抑制剂PMSF)充分研磨成匀浆。注意整个试验过程在冰上操作。4℃下10000rpm离心30min，可见匀浆分为三层，枪头透过上层油脂吸取上清液，即为昆虫的α-淀粉酶粗提液。棉铃虫血液α-淀粉酶的收集，收集血液后迅速置于冰箱中防止氧化。(4)植物α-淀粉酶粗提液的获得：禾谷类种子萌发时的α-淀粉酶活性很强，取萌发3～4天的小麦种子1.0g(芽长1.0～1.5cm)，放入研钵内，加少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨成匀浆后转入离心管中，用8mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。室温放置20min，每隔数分钟搅拌一次，使其充分提取。将提取液在3000r/min转速下离心10min，上清液即为小麦α-淀粉酶粗体液。

表3明显可以看出，α-淀粉酶抑制剂可以很好的抑制哺乳动物源α-淀粉酶的活性，抑制猪胰淀粉酶和人唾液淀粉酶的活性可达95％以上。α-淀粉酶抑制剂也可抑制昆虫α-淀粉酶，但是不抑制植物和真菌α-淀粉酶活性。

表3α-淀粉酶抑制剂对不同来源α-淀粉酶的抑制率

综上所述，本发明公开了一种α-淀粉酶抑制剂基因(AI-1基因)及其所编码的α-淀粉酶抑制剂蛋白质。本发明基因(sail)DNA序列SEQ ID NO.1序列完整，包括完整的启动子和终止子序列。该基因表达的重组α-淀粉酶抑制剂对α-淀粉酶具有明显的抑制作用；本发明实例证明该基因编码产物重组α-淀粉酶抑制剂对哺乳动物、昆虫α-淀粉酶有特异性抑制作用，该AI-1基因具有的抗虫功能。生物活性测定结果表明其表达的重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质能显著抑制棉铃虫幼虫的生长发育，因此AI-1基因可作为目的基因导入原核或其他表达系统，构建具有杀虫功能的工程菌株或将该基因作为目的基因导入植物，来进行植物品种改良，提高植物的抗虫性。因此AI-1基因及其表达的α-淀粉酶抑制剂能应用于害虫治理如转基因抗虫植物和蛋白质农药的生产。本发明实例也表明该重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质特异性的抑制哺乳动物源淀粉酶，降低小鼠餐后血糖。因此重组α-淀粉酶抑制剂具有很大的潜能用于治疗糖尿病、高血脂症、动脉硬化症等。除以上用途外，该发明的重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质可能在食品和饮料制备中应用，用于减肥食品和饮料、功能性食品和保健食品等。因为本发明α-淀粉酶抑制剂能高效抑制哺乳动物源淀粉酶，所以该抑制剂能抑制所摄入食物向能量转化，这样本发明的重组α-淀粉酶抑制剂对体重超重需要减肥者意义重大，因为α-淀粉酶抑制剂可以使他们在消费含α-淀粉酶活性抑制剂的食品或饮料时减少能量的摄入，从而减少体重增加。因此本发明及其重组α-淀粉酶抑制剂在医药、保健食品和害虫治理如生物农药和转基因抗虫植物领域具有良好的应用前景。

Claims (9)

1.一种编码α-淀粉酶抑制剂的多核苷酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。

2.如权利要求1所述多核苷酸编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No.2所示。

3.含有权利要求1所述多核苷酸的表达载体。

4.一种表达权利要求2所述蛋白质的重组微生物。

5.一种生产权利要求2所述蛋白质的方法，其特征在于：包括在适合于权利要求1所述多核苷酸表达的条件下，培养权利要求4所述的重组微生物，以及回收、提纯权利要求2所述的蛋白质。

6.一种用于防治害虫的药物组合物及其在农业、林业、园艺或装饰植物害虫治理中应用的方法，其特征在于该药物组合含有如权利要求2所述的蛋白质或权利要求4所述重组微生物的发酵液，可抑制某些昆虫的α-淀粉酶活性和幼虫生长。所述的方法包括权利要求4所述的重组微生物及其表达产物的有效剂量与一种可接受的农用载体混合的方式应用到害虫治理中；或将权利要求1基因作为目的基因导入植物，提高植物抗虫性等。所述的植物可以是易受有害昆虫摄食而造成损害的任何具有农业、林业、园艺或装饰价值的植物。

7.一种药物组合物，其特征在于它含有如权利要求2所述的蛋白质或权利要求4所述重组微生物的发酵液，该重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质特异性的抑制哺乳动物源淀粉酶，降低小鼠餐后血糖。因此重组α-淀粉酶抑制剂具有很大的潜能用于制备治疗糖尿病和肥胖症的医药药品等。

8.一种权利要求3-4中任一项所述方法制备的重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质在减肥和保健食品以及饮料制备中的应用。

9.一种权利要求2-4所述任一项方法制备的重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质的应用，其特征是：该重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质作为添加剂用于面包、饼干等功能性食品和其他保健食品等产品中。