CN102127508A - α-淀粉酶抑制剂产生菌及其筛选方法 - Google Patents

α-淀粉酶抑制剂产生菌及其筛选方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102127508A
CN102127508A CN 201010605912 CN201010605912A CN102127508A CN 102127508 A CN102127508 A CN 102127508A CN 201010605912 CN201010605912 CN 201010605912 CN 201010605912 A CN201010605912 A CN 201010605912A CN 102127508 A CN102127508 A CN 102127508A
Authority
CN
China
Prior art keywords
alpha
salivin
amylase inhibitor
water
abs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN 201010605912
Other languages
English (en)
Other versions
CN102127508B (zh
Inventor
郑裕国
王远山
冯志华
薛亚平
王亚军
沈寅初
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University of Technology ZJUT
Hangzhou Zhongmei Huadong Pharmaceutical Co Ltd
Huadong Medicine Co Ltd
Original Assignee
Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University of Technology ZJUT filed Critical Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority to CN 201010605912 priority Critical patent/CN102127508B/zh
Publication of CN102127508A publication Critical patent/CN102127508A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102127508B publication Critical patent/CN102127508B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种α-淀粉酶抑制剂产生菌，即游动放线菌Actinoplanes sp.ZJB-08196，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M209022，保藏日期2009年2月23日，所述α-淀粉酶抑制剂为阿卡波糖。并公开了所述α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法。本发明提供的筛选方法简单有效，可以在短时间内筛选大量样品，灵敏度高、减少了HPLC处理样品、分析时间漫长等过程，提高了检测效率。

Description

α-淀粉酶抑制剂产生菌及其筛选方法
(一)技术领域
本发明别涉及到α-淀粉酶抑制剂产生菌及其筛选方法。
(二)背景技术
糖尿病是一种重大多发性疾病，在世界范围内普遍存在。由于生活方式的巨大转变以及人们保健意识的不足，目前我国糖尿病患者已达9240万人，其中男性5020万人，女性4220万人，超过印度，成为世界糖尿病患者最多的国家，发病率(9.7％)仅次于美国(11％)，其中II型糖尿病患者占93.7％。目前常用的治疗II型糖尿病药物有：增加胰岛素敏感性的双胍类——甲福明；促胰岛素分泌的磺酰脲类——格列齐特(Gliclazide，商品名唐并康)；α-糖苷酶抑制剂——阿卡波糖、米格列醇(Miglitol，商品名奥恬苹)、伏格列波糖(Voglibose，商品名倍欣)。其中由于α-糖苷酶抑制剂具有作用温和持久、毒副作用小甚至无毒的优点，得到越来越多国内外研究者的青睐。
在中国，人们膳食结构中以谷类为主，碳水化合物含量高，餐后血糖水平易升高，而糖苷酶抑制剂可以很好的缓解II型糖尿病患者的症状。因此，糖尿病患者对糖苷酶抑制剂类治疗药物有着巨大的需求。α-淀粉酶抑制剂作为这一类物质的代表，备受关注。
α-淀粉酶(α-amylase)为1，4-α-D-葡聚糖水解酶，能够水解淀粉、 糖原以及相关多糖为寡糖片段。在消化、吸收过程中，食物中的碳水化合物先经唾液α-淀粉酶、胰α-淀粉酶作用分解为寡糖，然后在小肠中经α-葡萄糖苷酶分解为单糖，最后被小肠上皮细胞吸收进入血液循环。α-淀粉酶抑制剂作为一种糖苷水解酶抑制剂，能有效抑制唾液α-淀粉酶和胰α-淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，减少葡萄糖的产生和摄取，降低血糖和血脂含量水平。在临床上淀粉酶抑制剂可有效预防与治疗糖尿病和高脂血症。既可单独使用，也可以与其他降糖药或降血脂药联合使用。临床医学上用于防治糖尿病、高血糖、高脂血等症，如阿卡波糖已成为糖尿病治疗的首选药物。
根据文献和专利报道，α-淀粉酶抑制剂的筛选是以淀粉酶活性抑制为基础，测定方法主要包括碘比色法(US3876766)和3，5-二硝基水杨酸(DNS)法(Bernfeld法)。其中碘显色法属半定量方法，灵敏度低。3，5-二硝基水杨酸法筛选α-淀粉酶抑制剂基于以下原理：淀粉在胰α-淀粉酶作用下水解产生的还原基团，将3，5-二硝基水杨酸与还原为硝基氨基水杨酸，从而产生颜色变化。通过在波长546nm处测定吸光度(Abs546)可以判断上述反应的进行。由于α-淀粉酶抑制剂对淀粉水解有抑制作用，可使Abs546值下降，从而可以计算待测物对淀粉酶活性的抑制率。测定时，一般通过调整待测溶液及α-淀粉酶溶液的浓度或用量，使Abs546的值在0.4～0.7范围内为宜。但该反应中可溶性淀粉与α-淀粉酶对测定系统本底Abs546值的影响接近0.2，对测定区间0.4-0.7而言本底影响较大，而且难以测定抑制剂浓度与酶活的关系。同时该反应显色需经沸水浴，无法实现在96孔 板上进行，不能利用酶标仪等进行高通量筛选。目前，还没有高效、灵敏、快速的微生物源α-淀粉酶抑制剂筛选方法报道。
(三)发明内容
本发明目的在于提供一种快速、灵敏的α-淀粉酶抑制剂筛方法。
为达到发明目的本发明采用以下技术方案：
α-淀粉酶抑制剂产生菌，即游动放线菌Actinoplanes sp.ZJB-08196，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 209022，保藏日期2009年2月16日，所述α-淀粉酶抑制剂为阿卡波糖。
本发明所述的α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法，其特征在于所述方法为：
(1)待筛选菌株接种到平皿培养基上，20～37℃(优选28℃)培养至长出单菌落，挑选单菌落，接种至斜面培养基上，20～37℃(优选28℃)培养直到菌落长成；所述平皿培养基或斜面培养基的组成为：蔗糖5-30g/L，蛋白胨1-5g/L，酪氨酸0.5-2g/L，K2HPO4·3H2O0.5-2g/L，KCl 0.5-2g/L，MgSO4·7H2O 0.5-2g/L，FeSO4·7H2O 0.1-1g/L，琼脂15-20g/L，溶剂为水，初始pH 6.0-7.5；
(2)挑选步骤(1)得到的菌落接种至发酵培养基中培养，培养温度25～37℃(优选28℃)，摇床转速150～200rpm，培养1～7天，收集得到发酵液，取发酵液于4000～12000rpm离心，取上清液备用。所述发酵培养基的组成为：麦芽糖10-120g/L，葡萄糖10-50g/L，黄 豆饼粉5-25g/L，碳酸钙2-10g/L，甘油2-10g/L，谷氨酸钠2-10g/L，溶剂为水，初始pH 6.0-7.5；
(3)将步骤(2)获得的上清液用水稀释10-100倍，即为待测样品，在96板孔内分别加入唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，每分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U，5mmol/l 2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷(Gal-G2-α-CNP)40μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90μl(50mmol/l，pH 6.0)，40μl待测样品。对照组为：所述唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，5mmol·L-12-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130μl(50mmol/l，pH 6.0)，用酶标仪于405nm处检测Abs405，每5秒钟读一次数，直至Abs405不再增加，通常需要读数5min，将Abs405相对于对照组降低30％以上的样品孔标记为阳性菌株，并保存阳性菌株。
步骤(3)所得阳性菌株可按照步骤(2)进行进一步培养，并按照步骤(3)进行复筛、验证。这是本领域人员公知的复筛验证方法。
本发明方法相对于高效液相(HPLC)分析方法，可以节约大量的分析时间，以及可以节省HPLC中大量作为流动相使用的色谱纯有机试剂，这些试剂一般比较昂贵并且对人体有害。因此本方法可以直接用于产α-淀粉酶抑制剂诱变育种时高产突变株的筛选，也可以用于筛选土壤中产α-淀粉酶抑制剂的微生物，还可应用于其它来源的淀粉酶抑制剂的筛选。
本发明所述平皿培养基或斜面培养基按以下方法制得：水中加入 琼脂条，边加热边搅拌，直到完全溶解，然后加入蔗糖，蛋白胨，酪氨酸，K2HPO4·3H2O，KCl，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，搅拌至完全溶解，配制得到终浓度为：蔗糖5-30g/l，蛋白胨1-5g/l，酪氨酸0.5-2g/l，K2HPO4 0.5-2g/l，KCl 0.5-2g/l，MgSO4·7H2O 0.5-2g/l，FeSO40.1-1g/l，琼脂15-20g/l的培养基，通常按照每支5ml的量倒入体积为20ml的试管中，121℃灭菌20min，摆放斜面，冷却得到斜面培养基；同时，将灭过菌的培养基冷却至60℃左右，在无菌条件下倒入已灭菌的平皿中，冷却得到平皿培养基。
所述平皿培养基或斜面培养基的组成优选为：蔗糖25～30g/l，蛋白胨2g/l，酪氨酸1g/l，K2HPO4·3H2O 0.5～1g/l，KCl 0.5g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，FeSO4·7H2O 0.1g/l，琼脂20g/l，溶剂为水，初始pH 7.0。
所述发酵培养基的组成优选为：麦芽糖40-80g/L，葡萄糖20-40g/L，黄豆饼粉10-15g/L，碳酸钙5g/L，甘油5g/L，谷氨酸钠5g/L，溶剂为水，初始pH 7.0。
更进一步，本发明所述的α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法按以下步骤进行：
(1)将待筛选菌株接种到平皿培养基上，28℃培养至长出单菌落，挑选单菌落，接种至斜面培养基上，28℃培养直到菌落长成；所述平皿培养基或斜面培养基的组成为：蔗糖25～30g/l，蛋白胨2g/l，酪氨酸1g/l，K2HPO4·3H2O 0.5～1g/l，KCl 0.5g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，FeSO4·7H2O 0.1g/l，琼脂20g/l，溶剂为水，初始pH 7.0；
(2)挑选步骤(1)得到的菌落接种至发酵培养基中培养，培养温度28℃，摇床转速150～200rpm，培养7天，得到发酵液，取发酵液于10000～12000rpm离心，取上清液备用；所述发酵培养基的组成为：麦芽糖40-80g/L，葡萄糖20-40g/L，黄豆饼粉10-15g/L，碳酸钙5g/L，甘油5g/L，谷氨酸钠5g/L，溶剂为水，初始pH 7.0；
(3)将步骤(2)获得的上清液用水稀释25-100倍，即为待测样品，在96板孔内分别加入唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，每1分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U，5mmol/l的2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol/l磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90μl，40μl待测样品；对照组为：所述唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，5mmol/l 2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol/l磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130μl，用酶标仪于405nm处检测Abs405，每5秒读一次数，直至Abs405不再增加，将Abs405相对于对照组降低30％以上的样品孔标记为阳性菌株，并保存阳性菌株。
本发明以上步骤中所用的唾液淀粉酶购自美国Lee BioSolutions公司。α-淀粉酶的浓度为0.1U/ml，其中，每1分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U。
本发明所用的底物2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷(Gal-G2-α-CNP)，购自日本TOYOBO公司，使用时用水配成5mmol/l标准液，避光，冷藏。由于本底物见光易分解，故保存在棕色瓶中，最多存放两周。若405nm处吸光值大于0.05则需重新配制。
所用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液按照常用方法配制，浓度50mM，pH 6.0。之所以选pH 6.0是由于经过反复实验，发现在该条件下，酶表现出最大活力，并且发现该酶表现出良好的酸碱耐受(pH4.0-8.0)和温度耐受。
本发明的原理为：
底物2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷(Gal-G2-α-CNP)在α-淀粉酶的作用下会生成2-氯-4-硝基苯酚(CNP)，该产物在405nm处有特征吸收峰，其浓度可以通过酶标仪在405nm处测定得到。如果待筛选的样品中有α-淀粉酶抑制剂存在，可以相应的抑制α-淀粉酶的活力，水解反应被抑制，导致生成的CNP产量降低，通过与对照组对比，可以确定样品中是否存在α-淀粉酶抑制剂，以及其含量的相对高低。正是基于本原理，发明了此快速、高通量的筛选方法。实践表明，该模型在筛选α-淀粉酶抑制剂产生菌的试验中效果良好。通过这个模型，筛选得到了产α-淀粉酶抑制剂的菌株。
本发明的有益效果为：操作简单、快速，结果可靠，可同时筛选大量样品，包括微生物发酵液、以及其它来源的淀粉酶抑制剂，实现高通量筛选，减少劳动量。
反应式如下式所示：
Figure BDA0000040678540000081
本发明简单有效，可以在短时间内筛选大量样品，其突出优点主要在于：(1)灵敏度很高，检测结果与HPLC检测结果一致，重复验证证明，本发明通过抑制率-抑制剂浓度曲线计算阿卡波糖含量的方法快速可靠，重复性好；(2)减少了HPLC处理样品、分析时间漫长等过程，提高了检测效率。本发明基于96孔板作为检测筛选，样品不需要微滤等处理过程，并且检测结果在5min之内获得，简单快速；(3)本发明经济有效，相对于HPLC中作为流动相使用的昂贵并有一定毒性的色谱纯有机试剂来说，本发明涉及的底物Gal-G2-α-CNP作为常规的淀粉酶活力检测试剂，安全易得，并且由于反应在96孔板上进行，筛选用量较小。
(四)具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例中唾液淀粉酶液购自美国Lee BioSolutions公司。α-淀粉酶的浓度为0.1U/ml，其中，每1分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U。
实施例1：
(1)培养基的制备：
平皿培养基以及斜面培养基的制备：所述的培养基组份如下(g/L)：蔗糖25g/l，蛋白胨2g/l，酪氨酸1g/l，K2HPO4·3H2O 0.5g/l，KCl 0.5g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，FeSO4·7H2O 0.1g/l，琼脂20g/l，溶剂为水，初始pH 7.0；配制时，1000mL水中加入20g琼脂条，边加热边搅拌，直到完全溶解，然后加入25g蔗糖，2g蛋白胨，1g酪氨酸，K2HPO4·3H2O 0.5g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O0.1g，并搅拌至完全溶解，然后补水至1000ml。
按照每支5ml的量倒入体积为20ml的试管中，121℃灭菌20min，摆放斜面，冷却得到斜面培养基；同时，将灭过菌的培养基冷却至60℃，在无菌条件下倒入已灭菌的平皿中，冷却得到平皿培养基。发酵培养基制备：在1000ml水中加入麦芽糖80g，葡萄糖20g，黄豆饼粉10g，碳酸钙5g，甘油5g，谷氨酸钠5g，调节pH7.0，分装到500ml三角瓶中，装液量50ml，然后121℃灭菌20min。冷却得到发酵培养基。
(2)将要筛选的土样(从浙江省稻田采集得到土样)去杂研碎，加入无菌生理盐水，充分振荡，取上清液待用；
(3)分离培养：将步骤(2)制备的上清液梯度稀释涂布于平皿培养基上，在28℃条件下培养一周，期间按照生长快慢逐个挑选单菌落，分别接种到2个斜面培养基上，28℃培养直到菌落长成。
(4)初步筛选：将步骤(3)得到的单菌落分别接种到发酵培养基中， 在28℃，摇床转速150rpm条件下，培养168h。培养结束以后，取样1ml在10000rpm条件下离心10min，得到上清液；上清液稀释25倍得到样品；在96板孔内分别加入唾液淀粉酶液30μl，5mmol/lGal-G2-α-CNP 40μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90μl(50mmol/l，pH6.0)，40μl待测样品；同时对照组为：唾液淀粉酶液30μl，5mmol/lGal-G2-α-CNP 40μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130μl(50mmol/l，pH6.0)。空白组为：唾液淀粉酶液30μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130μl(50mmol/l，pH 6.0)，待测样品40μl。用酶标仪于405nm处连续检测Abs405，每5秒读一次数，直至反应结束，即Abs405不再增加。通过计算，Abs405值相对于对照组减少30％的样品孔，初步断定为阳性菌株。同时保存相应的阳性菌株斜面。
(5)复筛
将生长良好的8株阳性斜面分别接种到发酵培养基中，在28℃，摇床转速180rpm条件下培养168h，再用步骤(4)的方法筛选检测，其中α-淀粉酶抑制剂的含量相对稳定。
将发酵液按专利US 4062950进行分离纯化、鉴定，该抑制剂确定为阿卡波糖，利用HPLC分析，阿卡波糖浓度为1500mg/l。HPLC的检测条件为：LC-10AVP Plus(岛沣，日本)，色谱柱Hypersil NH2柱(4.6mm×250mm，5μm，大连依利特分析仪器有限公司)。流动相为乙腈/磷酸缓冲液(70/30，v/v)，流速1ml/min，磷酸缓冲液每升含0.6克磷酸二氢钾和0.279克磷酸氢二钠。
经鉴定，此次筛选得到的α-淀粉酶抑制剂——阿卡波糖产生菌 为游动放线菌(Actinoplanes sp.)，保藏在中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M 209022，保藏日期2009年2月23日。
实施例2
(1)培养基的制备：
斜面培养基、平皿培养基以及种子培养基、发酵培养基的配制：斜面培养基和平皿培养基是成分相同的培养基，按照如下配制：在1000mL水中加入20g琼脂条，边加热边搅拌，直到完全溶解，然后再加入蔗糖30g，蛋白胨2g，酪氨酸1g，K2HPO4·3H2O 1g，KCl0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.1g，并搅拌至完全溶解，然后补水至1000ml，调pH至7.0。按照每支5ml的量倒入体积为20ml的试管中，121℃灭菌20min，摆放斜面，冷却得到斜面培养基；同时，将灭过菌的培养基冷却至60℃，在无菌条件下倒入已灭菌的平皿中，冷却得到平皿培养基；
发酵培养基：在1000ml水中加入麦芽糖40g，葡萄糖40g，黄豆饼粉15g，碳酸钙5g，甘油5g，谷氨酸钠5g，调节pH7.0，分装到500ml三角瓶中，装液量50ml，然后121℃灭菌20min。冷却得到发酵培养基。
(2)诱变育种
准备螺旋口玻璃试管若干，加入5ml水，10颗左右直径2-3mm的玻璃珠，灭菌后备用；将ZJB-08196菌株(保藏编号CCTCC NO：M 209022)斜面用接种铲挖取一个完整的菌落，放入无菌的玻璃试管 内，振荡破碎；然后通过两层无菌纱布过滤得到菌悬液，涂布于无菌的培养皿内，在无菌工作台内晾干后，进行等离子注入诱变，等离子注入采用IBBe-III型低能离子束注入仪(南京三乐电真空设备制造有限公司)，所用离子源为N+，N+能量为15keV，离子注入强度为60×2.6×1013离子/cm2；注入结束后用1ml无菌水将菌体冲洗下来，得到菌悬液，即为待筛选的菌株，然后按照每块平皿100μl菌悬液梯度稀释涂布于上述无菌平皿培养基上，28℃培养至长出单菌落，挑选单菌落，接种至斜面培养基上，28℃培养直到菌落长成。
(3)发酵阶段
将步骤(2)培养好的菌落接种于发酵培养基中，28℃，150rpm培养168h，收集发酵液，12000rpm离心10min，取上清液，稀释100倍，得到待筛选的样品。
(4)初步筛选
将步骤(3)得到样品分别编号；在96板孔内分别加入唾液淀粉酶液30μl，5mmol/l Gal-G2-α-CNP 40μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90μl(pH6.0，50mmol/l)，40μl待测样品；同时对照组为：唾液淀粉酶液30μl，5mmol/l Gal-G2-α-CNP 40μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130μl(pH6.0，50mmol/l)，用酶标仪405nm处检测Abs405，每5秒读一次数，直到Abs405不再增加，通过计算，Abs405值值相对于对照组减少30％以上的样品，为产量提高比较多的菌株。通过计算抑制率 式中Y为抑制率(％)， 为只加Gal-G2-α-CNP和唾液淀粉酶的处理于405nm处测得的吸光值， 
Figure BDA0000040678540000131
为加入Gal-G2-α-CNP、唾液淀粉酶和待测样品的处理于405nm处测得的吸光值。利用反应体系中抑制率-抑制剂浓度曲线(见附图1)，计算突变株的阿卡波糖产量。按下式进行计算：
Figure BDA0000040678540000132
其中X为待测样品中阿卡波糖浓度，mg/l；Y为抑制率，％；M为待测样品稀释倍数；V1为加入反应体系中的稀释的待测样品体积(μl)；V为反应体系的总体积(μl)。
(5)复筛
将步骤(4)筛选得到的产量相对较高的突变株按照步骤(2)和步骤(3)重复操作进行培养，并按照步骤(4)进行复筛，并利用HPLC验证。利用HPLC分析，检测条件为：LC-10AVP Plus(岛沣，日本)，色谱柱Hypersil NH2柱(4.6mm×250mm，5μm，大连依利特)。流动相为乙腈/磷酸缓冲液(70/30，v/v)，流速1ml/min，磷酸缓冲液每升含0.6克磷酸二氢钾和0.279克磷酸氢二钠。
利用上述显色方法，测得产量最高的突变株阿卡波糖产量为3349mg/l，通过HPLC进行分析验证，其阿卡波糖的产量为3500mg/l，与通过96孔板检测结果基本一致，比出发菌株ZJB-08196提高了130％。
经过初筛，可以在短时间内筛选大量样品，然后得到产量相对较高的样品进行复筛，减少了HPLC处理样品、分析时间漫长的过程，提高了劳动率。

Claims (4)

1.α-淀粉酶抑制剂产生菌，即游动放线菌Actinoplanes sp.ZJB-08196，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号CCTCCNO：M 209022，保藏日期2009年2月16日，所述α-淀粉酶抑制剂为阿卡波糖。
2.一种如权利要求1所述的α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法，其特征在于所述方法为：
(1)将待筛选菌株接种到平皿培养基上，20～37℃培养至长出单菌落，挑选单菌落，接种至斜面培养基上，20～37℃培养直到菌落长成；所述平皿培养基或斜面培养基的组成为：蔗糖5-30g/l，蛋白胨1-5g/l，酪氨酸0.5-2g/l，K2HPO4·3H2O 0.5-2g/l，KCl 0.5-2g/l，MgSO4·7H2O 0.5-2g/l，FeSO4·7H2O 0.1-1g/l，琼脂15-20g/l，溶剂为水，初始pH 6.0-7.5；
(2)挑选步骤(1)得到的菌落接种至发酵培养基中培养，培养温度25～37℃，摇床转速150～200rpm，培养1～7天，得到发酵液，取发酵液于4000～12000rpm离心，取上清液备用；所述发酵培养基的组成为：麦芽糖10-120g/l，葡萄糖10-50g/l，黄豆饼粉5-25g/l，碳酸钙2-10g/l，甘油2-10g/l，谷氨酸钠2-10g/l，溶剂为水，初始pH6.0-7.5；
(3)将步骤(2)获得的上清液用水稀释10-100倍，即为待测样品，在96板孔内分别加入唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，每1分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U，5mmol/l的2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol·L-1磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90μl，40μl待测样品；对照组为：所述唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，5mmol/l 2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol·L-1磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液130μl，用酶标仪于405nm处检测Abs405，每5秒读一次数，直至Abs405不再增加，将Abs405相对于对照组降低30％以上的样品孔标记为阳性菌株，并保存阳性菌株。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述平皿培养基或斜面培养基按以下方法制得：水中加入琼脂条，边加热边搅拌，直到完全溶解，然后加入蔗糖，蛋白胨，酪氨酸，K2HPO4·3H2O，KCl，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，并搅拌至完全溶解，配制得到终浓度为：蔗糖5-30g/l，蛋白胨1-5g/l，酪氨酸0.5-2g/l，K2HPO4·3H2O 0.5-2g/l，KCl 0.5-2g/l，MgSO4·7H2O 0.5-2g/l，FeSO4·7H2O 0.1-1g/l，琼脂15-20g/l的溶液，调节pH 6.0-7.5，121℃灭菌20min，冷却到60℃，在无菌条件下，倒入无菌的试管中，摆放斜面，冷却得到斜面培养基；在无菌条件下倒入无菌的平皿中，冷却得到平皿培养基。
4.一种如权利要求1所述的α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法，其特征在于所述方法为：
(1)将待筛选菌株接种到平皿培养基上，28℃培养至长出单菌落，挑选单菌落，接种至斜面培养基上，28℃培养直到菌落长成；所述平皿培养基或斜面培养基的组成为：蔗糖25～30g/l，蛋白胨2g/l，酪氨酸1g/l，K2HPO4·3H2O 0.5～1g/l，KCl 0.5g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，FeSO4·7H2O 0.1g/l，琼脂20g/l，溶剂为水，初始pH 7.0；
(2)挑选步骤(1)得到的菌落接种至发酵培养基中培养，培养温度28℃，摇床转速150～200rpm，培养7天，得到发酵液，取发酵液于10000～12000rpm离心，取上清液备用；所述发酵培养基的组成为：麦芽糖40-80g/L，葡萄糖20-40g/L，黄豆饼粉10-15g/L，碳酸钙5g/L，甘油5g/L，谷氨酸钠5g/L，溶剂为水，初始pH 7.0； 
(3)将步骤(2)获得的上清液用水稀释25-100倍，即为待测样品，在96板孔内分别加入唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，每1分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U，5mmol/l的2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol/l磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90μl，40μl待测样品；对照组为：所述唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，5mmol/l 2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol/l磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130μl，用酶标仪于405nm处检测Abs405，每5秒读一次数，直至Abs405不再增加，将Abs405相对于对照组降低30％以上的样品孔标记为阳性菌株，并保存阳性菌株。 
CN 201010605912 2010-12-25 2010-12-25 α-淀粉酶抑制剂产生菌及其筛选方法 Active CN102127508B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010605912 CN102127508B (zh) 2010-12-25 2010-12-25 α-淀粉酶抑制剂产生菌及其筛选方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010605912 CN102127508B (zh) 2010-12-25 2010-12-25 α-淀粉酶抑制剂产生菌及其筛选方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210224287.7A Division CN102864207B (zh) 2010-12-25 2010-12-25 一种α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102127508A true CN102127508A (zh) 2011-07-20
CN102127508B CN102127508B (zh) 2013-01-16

Family

ID=44265783

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201010605912 Active CN102127508B (zh) 2010-12-25 2010-12-25 α-淀粉酶抑制剂产生菌及其筛选方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102127508B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103114122A (zh) * 2012-12-31 2013-05-22 浙江工业大学 利用游动放线菌制备反式-4-氨甲基-环己烷甲酸的方法
CN103207156A (zh) * 2013-03-28 2013-07-17 山东博科生物产业有限公司 一种稳定的α-淀粉酶检测试剂及应用
CN103966206A (zh) * 2013-01-25 2014-08-06 中国农业科学院植物保护研究所 一重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质的制备及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1262543A1 (en) * 2000-03-10 2002-12-04 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Alpha-amylase activity inhibitors
CN101139569A (zh) * 2007-07-27 2008-03-12 南开大学 一株α-淀粉酶抑制剂生产菌及α-淀粉酶抑制剂的制备方法与应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1262543A1 (en) * 2000-03-10 2002-12-04 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Alpha-amylase activity inhibitors
CN101139569A (zh) * 2007-07-27 2008-03-12 南开大学 一株α-淀粉酶抑制剂生产菌及α-淀粉酶抑制剂的制备方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《食品科学》 20021231 吕凤霞等 alpha-淀粉酶抑制剂的研究进展 152-155 1-4 第23卷, 第3期 2 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103114122A (zh) * 2012-12-31 2013-05-22 浙江工业大学 利用游动放线菌制备反式-4-氨甲基-环己烷甲酸的方法
CN103114122B (zh) * 2012-12-31 2014-06-11 浙江工业大学 利用游动放线菌制备反式-4-氨甲基-环己烷甲酸的方法
CN103966206A (zh) * 2013-01-25 2014-08-06 中国农业科学院植物保护研究所 一重组α-淀粉酶抑制剂蛋白质的制备及应用
CN103207156A (zh) * 2013-03-28 2013-07-17 山东博科生物产业有限公司 一种稳定的α-淀粉酶检测试剂及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN102127508B (zh) 2013-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tailliez et al. Enhanced cellulose fermentation by an asporogenous and ethanol-tolerant mutant of Clostridium thermocellum
CN102796716B (zh) 一种制备单宁酶的方法
CN102127508B (zh) α-淀粉酶抑制剂产生菌及其筛选方法
CN104987316A (zh) 一种海洋真菌来源的聚酮类化合物及其治疗ii型糖尿病的应用
CN111218406B (zh) 卷枝毛霉mf-8及其提高土茯苓中花旗松素含量的应用
CN105838614B (zh) 一种利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法
CN104911135B (zh) 一种海藻糖合酶生产菌株及其应用
CN104988125A (zh) 高耐受性β-葡萄糖苷酶及其应用
CN103937732B (zh) 产中性纤维素酶菌株及选育方法和其生产纤维素酶的方法
CN106167753A (zh) 一种同步吸附‑共菌发酵法完全去除残次苹果酿造苹果酒中展青霉毒素的方法
CN101215537A (zh) 地衣芽孢杆菌及其应用
CN102864207B (zh) 一种α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法
CN103880826A (zh) 一种异苯并呋喃酮化合物及其制备方法和应用
CN102433289B (zh) 一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法
CN107125432B (zh) 一种玉屏风药渣发酵的工艺方法
CN108823118A (zh) 一株能抑制α-葡萄糖苷酶活性的勒克菌及其应用
CN103333872B (zh) 一种制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法
CN109456898A (zh) 一种球毛壳菌右旋糖酐酶的发酵制备及其应用
CN104818235A (zh) 一种路氏肠杆菌及其应用
US20220370538A1 (en) Method for extracting functional ingredients of mulberry leaves using enzymes
CN105368740A (zh) 粘滑白蚁球菌TSB47、木聚糖酶TmXyn1及其编码基因和应用
CN100582234C (zh) 克列维醇在制备抗氧化剂的应用
CN107056761A (zh) 一种海洋真菌来源的九元环内酯衍生物及其制备方法和应用
CN102559511B (zh) 高产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的肉座菌及其应用
CN102732462B (zh) 一株鲑鱼肾杆菌及其生产的酶

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: ZHONGMEI HUADONG PHARMACEUTICAL CO. LTD., HANGZHOU

Effective date: 20140103

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20140103

Address after: Hangzhou City, Zhejiang province 310014 City Zhaohui District Six

Patentee after: Zhejiang University of Technology

Patentee after: Zhongmei Huadong Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou

Patentee after: Huadong Medicine Co., Ltd.

Address before: Hangzhou City, Zhejiang province 310014 City Zhaohui District Six

Patentee before: Zhejiang University of Technology