WO2000070070A1 - Vecteur de virus paramyxoviridae defectueux dans un gene enveloppe - Google Patents

Vecteur de virus paramyxoviridae defectueux dans un gene enveloppe Download PDF

Info

Publication number
WO2000070070A1
WO2000070070A1 PCT/JP2000/003195 JP0003195W WO0070070A1 WO 2000070070 A1 WO2000070070 A1 WO 2000070070A1 JP 0003195 W JP0003195 W JP 0003195W WO 0070070 A1 WO0070070 A1 WO 0070070A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
virus
gene
protein
vector
Prior art date
Application number
PCT/JP2000/003195
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kaio Kitazato
Tsugumine Shu
Hidekazu Kuma
Yasuji Ueda
Makoto Asakawa
Mamoru Hasegawa
Akihiro Iida
Fumino Tokitou
Takahiro Hirata
Tsuyoshi Tokusumi
Original Assignee
Dnavec Research Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dnavec Research Inc. filed Critical Dnavec Research Inc.
Priority to CA2368948A priority Critical patent/CA2368948C/en
Priority to JP2000618476A priority patent/JP3602058B2/ja
Priority to DK00927807T priority patent/DK1186667T3/da
Priority to DE60035589T priority patent/DE60035589T2/de
Priority to EP00927807A priority patent/EP1186667B1/en
Priority to AU46146/00A priority patent/AU4614600A/en
Publication of WO2000070070A1 publication Critical patent/WO2000070070A1/ja
Priority to US09/966,277 priority patent/US20020169306A1/en
Priority to HK02105976A priority patent/HK1044352A1/xx
Priority to US10/316,535 priority patent/US7226786B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18822—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18845—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18861—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/18862—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6072—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses
    • C12N2810/6081—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses rhabdoviridae, e.g. VSV
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an envelope gene-deficient paramyxovirus vector
  • viral vectors such as retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses.
  • gene therapy vectors have major problems in medical applications, such as limited transfer efficiency and sustained expression, and the vector itself has cytotoxicity and immunogenicity (Lamb, RA & Kolakof sky, D. Paramyxovindae: the viruses and their replication, in Fields Virology, 3rd edn, (Edited by BN Fields, DM Knipe & PP Howley) pp.1177-1204 (Phi ladelphia, Lippincott-Raven. (1996)).
  • RNA viruses have been delayed in the past.
  • Recombinant RNA viruses show high gene transfer efficiency and expression ability, suggesting high potential as a vector for gene therapy (Roberts, A. & Rose, J., K., Virology 247, 1-6 (1998) Acad. Sci. USA 94, 14998-15000 (1996); Palese, P. et. Al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11354-11358 (1996). ).
  • no practically available paramyxovirus vector derived from the defective genome of the attenuated virus has been reported yet.
  • Paramyxovirus vectors with negative-strand RNA in their genomes have several characteristics that are significantly different from retrovirus, DNA virus, or positive-strand RNA virus vectors. Its genome or antigenome does not directly function as mRNA and cannot initiate viral protein synthesis or genome replication. Both the viral RNA genome and antigenome are always present in the form of a ribonucleoprotein complex (RNP), and naked genomes with complementary mRNAs, such as those found in positive-strand RNA viruses. There are few antisense problems, such as hybridizing to RNA and interfering with the assembly of the genomic RNP. These viruses have their own RNA polymerase, and make the RNP complex type II for transcription of viral mRNA or replication of viral genome. Notable minus strand RNA
  • the (nsRNA) virus grows only in the cytoplasm of the host cell and does not integrate into the chromosome because it has no DNA fusion. Furthermore, homologous recombination between RNAs has not been observed. These properties are thought to greatly contribute to the stability and safety of the gene expression vector of the minus-strand RNA virus.
  • SeV Sendai virus
  • HN hemagglutinin-neuraminidase
  • HN fuglutinin-neuraminidase
  • F fusion protein
  • RNP ribonucleoprotein
  • Viral envelope protein F is synthesized as an inactive precursor protein (F 0 ), It is cleaved into Fl and F2 by proteolytic cleavage (Kido, H. et al., Biopolymers (Peptide Science) 51 (l): 79-86, 1999), and becomes an active protein and causes membrane fusion. .
  • the virus is said to be non-pathogenic to humans. Lab attenuated strains (Z strains) have also been isolated and only induce mild pneumonia in rodents, the natural host.
  • This strain has been widely used as a research model at the molecular level, such as the transcription / replication mechanism of paramyxovirus, and has also been used to produce hybridomas. In addition to such high safety, this virus has a high production yield of 10 11 fu / ml in cell lines or chicken eggs.
  • Sendai virus shows particularly high reconstitution efficiency. The ability to efficiently and stably express a foreign gene into a recombinant wild-type virus into which a foreign gene has been introduced has attracted attention.
  • minus-strand RNA viruses have many advantages as gene transfer vectors, but for gene therapy applications, a highly safe vector that does not release infectious particles when cells are infected. It is desired to develop. For this purpose, a technique for mass-producing a deficient virus in which the ability to produce a wild-type virus is deficient is required. However, development of a vector based on an envelope gene-deficient genome that can be applied has not been successful so far.
  • An object of the present invention is to provide a paramyxovirus vector lacking an envelope gene.
  • the present inventors have deleted the FV gene of SeV from the genome and obtained a cDNA transfected with the GFP gene as a repo-Euichi.
  • a method for recovering infectious virus particles from cell lines expressing Sendai virus F protein was established.
  • This F gene deficient virus Kuta-1 was highly efficiently transfected into a variety of cells, including primary cultured rat neurons, primitive mouse blood stem cells, and normal human cells, and showed high gene expression. Furthermore, in vivo, high expression was obtained by administration to rat brain.
  • This F gene-deficient SeV vector expresses the gene relatively long and persistently and strongly in infected cells, does not produce secondary infectious virions, and does not spread to adjacent cells. Therefore, its usefulness as a vector for gene therapy was suggested.
  • the present inventors have established a method for producing SeV vector cDNA deficient in both the F gene and the HN gene and recovering infectious virus particles from a cell line expressing the Sendai virus F protein and HN protein. did.
  • this SeV vector-one cDNA into F-expressing cells, the HN protein-deleted SeV vector was successfully produced.
  • the present invention establishes, for the first time, a new envelope gene-deficient vector system using a minus-strand RNA virus as a basic skeleton and which can be practically used.
  • the successful recovery of infectious deficient virions from F-gene deficient or FHN-deficient genomic cDNA using helper cells has led to the research and development of novel gene therapy vectors that take advantage of Sendai virus's superior features. It opens the way.
  • the defective Sendai virus vector of the present invention has an extremely high gene transfer efficiency for a wide variety of cell types and has the ability to express a foreign gene surprisingly. Furthermore, since it is continuously expressed in infected cells and does not release secondary infectious virus particles, it has been found to be a highly safe vector that has completely eliminated virus transmission.o
  • a vector based on this negative-strand RNA virus replicon is a vector that has already been successfully used for the positive strand (positive- strand) Genomic stability and lack of force psid structural protein compared to viral vectors based on the replicons of the RNA viruses Semi iki forest virus or Sindbis viruses
  • the wild-type Sendai virus vector can introduce foreign DNA up to at least 4 kbp, and the deletion vector becomes even larger. By adding a transcription unit, it may be possible to express two or more genes simultaneously.
  • Sendai virus vectors based on this Sendai virus replicon are theoretically expected to have continuous expression because RNPs replicated in multiple copies in the cytoplasm are distributed to daughter cells as the cells divide. In fact, it has been proven in certain blood cells by in vitro experiments. Furthermore, the present inventors have confirmed that the Sendai virus vector is highly efficiently transfected into blood cells, particularly granulocyte cells, and is also transduced into c-kit positive primitive cells. This suggests that this vector could be a highly applicable vector with a very wide tissue coverage.
  • the present invention relates to an envelope gene-deficient Sendai virus vector, and more specifically,
  • RNA derived from a paramyxovirus modified so as not to express at least one envelope protein of the Paramyxovirus
  • the single-stranded (-) strand A paramyxovirus vector containing a complex consisting of a protein that binds to RNA
  • a vector DNA encoding a (single) single-stranded RNA or a complementary strand thereof derived from a paramyxovirus modified so as not to express at least one envelope protein of the Paramyxovirus is enveloped. Introducing the protein into a cell that expresses the protein and expressing the protein;
  • At least one of the envelope proteins expressed by the cells The method according to any one of (8) to (11), wherein at least one of the envelope proteins modified so as not to be expressed from the single-stranded RNA is the same.
  • vector refers to a virus particle in which a nucleic acid molecule for expressing a foreign gene in a host is packaged.
  • NP, P, M, F, HN, and L genes of the paramyxoviridae virus are nucleocapsid, phospho, matrix, fusion, hemagglutinin-neuraminidase, and large protein, respectively.
  • NP gene Each gene in each virus belonging to the subfamily Paramyxovirinae is generally represented as follows. In general, the NP gene may be described as “N gene”.
  • accession number of the base sequence of each gene of Sendai virus classified as Respirovirus of Paramyxoviridae is M29343, M30202, M30203, NP gene for NP gene.
  • the present invention relates to an envelope gene-deficient paramyxovirus vector.
  • the virus vector is characterized in that it contains a (single) single-stranded RNA derived from a paramyxovirus modified so as not to express at least one envelope protein.
  • Paramyxoviruses generally contain a complex (ribonucleoprotein; RNP) consisting of RNA and protein inside the envelope.
  • RNP ribonucleoprotein
  • the RNA contained in the RNP is a single-stranded (single-strand) (negative-strand) RNA that is the genome of the paramyxovirus, and proteins bind to this RNA to form a complex.
  • the paramyxovirus virus vector of the present invention comprises: (a) a paramyxovirus derived from a paramyxovirus modified so as not to express at least one envelope protein of the paramyxovirus; (b) single-stranded RNA; and (b) The virus particle contains a complex consisting of the (1) single-stranded RNA and a protein that binds to the single-stranded RNA.
  • the protein that binds to the (-) single-stranded RNA is directly and / or indirectly bound to the (-) single-stranded RNA to form a complex with the (-) single-stranded RNA. Refers to protein.
  • RNA protein, P protein, and L protein are bound to (single) single-stranded RNA (genomic RNA) of paramyxovirus.
  • the RNA contained in this RNP becomes type I for transcription and replication of the viral genome (Lamb, RA, and D. Kolakofsky, 1996, Paramyxoviridae The viruses and their replication, pp. 1177-1204.
  • Fields Virology 3rd edn. Fields, B.N., DM Knipe, and PM Howley et al. (Ed.), Raven Press, New York, NY).
  • the complex of the present invention includes a complex composed of a (-) single-stranded RNA derived from a paramyxovirus and a protein derived from the paramyxovirus that binds thereto.
  • the vector of the present invention contains, for example, RNP in which these proteins (NP, P, and L proteins) are bound to (1) single-stranded RNA of paramyxovirus.
  • the RNP complex of paramyxovirus has the ability to replicate the P complex autonomously in cells.
  • the vector introduced into the cell increases the copy number of the gene (RNA contained in the complex) by amplifying RNP in the cell. This results in high expression of the foreign gene from the vector carrying the foreign gene.
  • the vector of the present invention is preferably It has the ability to replicate RNA contained in the complex (MP) in cells.
  • Paramyxoviruses to which the present invention is applicable include, in addition to Sendai virus, for example, measles virus, simian parainfluenza virus (SV5), and human parainfluenza virus type 3, but are not limited thereto.
  • the (single-strand) single-stranded RNA in the viral vector is typically modified to express NP, P and L proteins, and not to express F and / or HN proteins. I have.
  • Sendai virus Sendai virus
  • SeV Sendai virus
  • the genome size of the natural virus is about 15,000 bases, the negative strand is followed by a 3 'short leader region, NP (nucleocapsid), P (phospho), M ( Matrix), F (Fusion), HN (Hemagglutinin-neuraminidase), and six genes encoding L (Large) proteins are arranged side by side, with a short 5 'trailer region at the other end.
  • NP nucleocapsid
  • P phospho
  • M Matrix
  • F Fusion
  • HN Hemagglutinin-neuraminidase
  • L Large proteins
  • the transcript of this genomic RNA (positive strand or negative strand) in the presence of NP, P, and L proteins should produce the RNP of the present invention.
  • RNP formation can be performed, for example, in LLC-MK2 cells.
  • the NP, P, and L proteins can be supplied by introducing expression vectors encoding the respective genes into cells (see Examples). Further, each gene may be integrated into the chromosome of the host cell.
  • the NP, P, and L genes expressed to form RNP need not be exactly the same as the NP, P, and L genes encoded in the genome.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by these genes is not limited to the amino acid sequence of the protein encoded by the MP genome, but can be mutated as long as it has the activity of binding genomic RNA and replicating RNP in cells. Or other ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ A virus homologous gene may be used instead.
  • the NP, P, and L genes are expressed from the RNP, and the RNP replicates autonomously in the cell to produce a viral vector.
  • the envelope protein is expressed in the cell when the vector is reconstituted in the cell, this envelope protein can be incorporated into the viral vector and produce a viral vector that retains the infectivity of the envelope protein. it can. Once such a vector infects a cell, it can reproduce RNP in the cell, but does not itself have an envelope gene, so it re-produces a virus with the same envelope protein as at the beginning. I can't. Such a vector is extremely useful especially in a field requiring high safety such as gene therapy.
  • an envelope protein that has been modified so that it is not expressed in (-) single-stranded RNA that is, an envelope gene that has been deleted in the genome
  • an envelope gene that has been deleted in the genome is as infectious as a wild-type virus.
  • a virus vector having the F protein in the envelope is produced.
  • Viruses that do not have the HN protein but have only the F protein can be used as a vector that specifically infects cells in the liver via Asiatic glycoprotein receptor Yuichi (ASG-R).
  • ASG-R Asiatic glycoprotein receptor Yuichi
  • a paramyxovirus virus vector containing at least one of the envelope proteins modified so as not to be expressed in single-stranded RNA is also included in the present invention.
  • the vector of the present invention can be reconstituted using an envelope protein different from the envelope protein modified so as not to be expressed in single-stranded RNA.
  • envelope proteins of other viruses such as vesicular stomatitis (VSV-G) protein (VSV-G).
  • the Paramyxovirus virus vector of the present invention includes a pseudotyped virus vector containing an envelope protein derived from a virus other than the virus from which the genome is derived, such as VSV-G protein.
  • the virus vector of the present invention generally comprises (a) a paramyxovirus derived from a paramyxovirus modified so as not to express at least one envelope protein of a paramyxovirus, and (1) a single-stranded RNA or its complement.
  • the vector encoding the chain can be prepared by introducing into a cell (helper cell) expressing the envelope protein and expressing it, and (b) culturing the cell and collecting virus particles from the culture supernatant. it can.
  • helper cell expressing the envelope protein and expressing it
  • the vector-DNA to be expressed in the helper cell encodes (1) single-stranded RNA (negative strand) or its complementary strand (positive strand) contained in the vector of the present invention.
  • a DNA encoding ( ⁇ ) single-stranded RNA or its complementary strand is ligated downstream of T7 promoter and transcribed into RNA by T7 RNA polymerase.
  • Vector DNA may be cloned into plasmid so that it can be amplified in E. coli.
  • the strand transcribed in the cell may be the viral positive strand or the negative strand, but it is preferable that the positive strand be transcribed in order to increase the efficiency of reconstitution.
  • helper cell a cell that expresses an envelope protein is used.
  • helper cells are not limited to cells that express all envelope gene proteins deficient in the viral vector.
  • the F protein A cell that expresses only one can also be used as a helper cell.
  • the virus vector differs from the protein encoded by the missing envelope gene in the virus vector. It can be a cell that expresses the velveb protein.
  • an envelope protein that is not the envelope protein of the Paramyxomycetes virus eg, VSV-G protein
  • VSV-G protein an envelope protein that is not the envelope protein of the Paramyxomycetes virus
  • a plasmid expressing a recombinant Sendai virus vector genome in which the envelope gene has been deleted can be combined with a vector expressing the defective envelope protein and a vector expressing the NP, P / C and L proteins.
  • the virus vector can be reconstituted. Further, for example, it can also be produced using a host cell in which the F gene has been integrated into a chromosome.
  • These proteins which are supplied from sources other than the viral genome, may be mutated if the amino acid sequence is not the same as the virus-derived sequence but the activity in nucleic acid introduction is equal to or higher than that of the natural type.
  • a homologous gene of another virus may be used.
  • the vector of the present invention can be amplified by introducing the RNP or virus into the above-mentioned helper cells again and culturing them.
  • This process comprises: (a) a (1) single-stranded RNA derived from a paramyxovirus modified so as not to express at least one envelope protein of the paramyxovirus; and (1) a single-stranded RNA.
  • Introducing a complex comprising the protein to be bound into cells expressing the envelope protein; and (b) culturing the cells and collecting virus particles from the culture supernatant.
  • RNP Ribonucleic acid
  • various transfusion reagents can be used.
  • DOTMA Boehringer
  • Superfect QIAGEN # 301305
  • D0TAP DOPE
  • DOSPER Boehringer # 1811169
  • a closin can be added (Calos, MP, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015).
  • the virus vector can be further amplified by co-culturing the cells with cells that express the envelope protein.
  • a method for example, as described in Example 12, a method in which a cell producing an envelope protein is overlaid on a cell producing a virus is preferable.
  • the envelope protein in addition to the viral envelope protein, for example, it has a polypeptide derived from an adhesion factor, a ligand, a receptor, or the like that can adhere to a specific cell in an extracellular region. It is possible to use chimeric proteins and the like having a derived polypeptide in the intracellular region. This can also create vectors that target specific tissues.
  • the viral vector of the present invention has a modified viral gene contained in the vector, for example, to reduce immunogenicity or to increase the efficiency of RNA transcription or replication. Is also good.
  • the viral vector of the present invention may contain (1) RNA encoding a foreign gene in single-stranded RNA.
  • a desired gene that is desired to be expressed in a target cell can be used.
  • a gene for treating a target disease is inserted into the virus vector.
  • Viral vector-When a foreign gene is introduced into DNA for example, in the case of Sendai virus vector DNA, the number of bases is a multiple of 6 between the transcription termination (E) sequence and the transcription initiation (S) sequence. It is desirable to insert a sequence having the following sequence (Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, 1993, p. 4822-4830).
  • Foreign genes can be inserted before or after each virus gene (NP, P, M, F, HN, and L genes) (see Examples).
  • An EI-S sequence transcription initiation sequence-intervening sequence-transcription termination sequence
  • the expression level of the inserted foreign gene can be regulated by the type of transcription initiation sequence added upstream of the foreign gene. In addition, it can be regulated by the position of gene insertion or the nucleotide sequence before and after the gene.
  • Cloning sites can be designed at the insertion site to facilitate insertion of foreign genes.
  • the cloning site can be, for example, a recognition sequence for a restriction enzyme.
  • a foreign gene fragment can be inserted into the relevant restriction enzyme site in the vector encoding the genome.
  • the cloning site may be a so-called multi-cloning site having a plurality of restriction enzyme recognition sequences.
  • the vector of the present invention may have another foreign gene at a position other than the insertion as described above.
  • Recombinant Sendai virus vectors having foreign genes are described, for example, in Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 and Yu, D. et al., 1997, Genes Cels 2: 2: 457-. According to the description in 466, it can be constructed as follows.
  • a DNA sample containing the cDNA sequence of the desired foreign gene is prepared. It is preferable that the DNA sample can be confirmed as a single plasmid electrophoretically at a concentration of 25 ng / ⁇ l or more.
  • a case where a foreign gene is inserted into DNA encoding a viral genome using a Notl site will be described as an example.
  • Notl recognition in target cDNA base sequence When a site is included, it is preferable to modify the nucleotide sequence using a site-specific mutation insertion method or the like so as not to change the amino acid sequence to be encoded, and to remove the Notl site in advance. From this sample, the desired gene fragment is amplified and recovered by PCR.
  • the ends of the amplified fragment are Notl sites.
  • the forward synthetic DNA sequence may have any two or more nucleotides (preferably derived from the Notl recognition site of GCG or GCC) on the 5 'side to ensure cleavage by Notl.
  • any two or more nucleotides preferably 4 bases not containing the sequence derived from the Notl recognition site of GCG and GCC, more preferably ACTT
  • an oligo DNA of an inserted fragment for adjusting the length is added to the 3 ′ side.
  • the length of this oligo DNA, including the Notl recognition site gcggccgc is designed so that the sum of the complementary nucleotide sequence of the cDNA and the EIS nucleotide sequence of the Sendai virus genome derived from Sendai virus described later is a multiple of 6 (The so-called “rule of six” j; Kolakofski, D.
  • Sequence complementary to the sequence preferably 5, -CTTTCACCCT-3 ,, I sequence, preferably 5'- The complementary strand sequence of the AAG-3, E sequence, preferably 5'-TTTTTTCTTACTACGG-3, and further 3 'end of the complementary strand corresponding to about 25 bases, counting backward from the stop codon of the desired cDNA sequence Select the length so that the base is G or C, add a sequence, and use it as the 3 'end of the reverse synthetic oligo DNA.
  • PCR for example, an ordinary method using ExTaq polymerase (Takara Shuzo) can be used. Preferably, it is carried out using Vent polymerase (NEB).
  • the amplified target fragment is digested with Notl and inserted into the Notl site of plasmid vector pBluescript. Confirm the base sequence of the obtained PCR product with a sequencer and select a plasmid with the correct sequence.
  • the insert is excised from this plasmid with Notl and cloned into the Notl site of the plasmid containing the genomic cDNA lacking the envelope gene. It is also possible to obtain a recombinant Sendai virus cDNA by inserting directly into the NotI site without using the plasmid vector pB1uescript.
  • the viral vector DNA of the present invention can be transcribed in a test tube or in a cell, reconstituted by the L, P, and NP proteins of the virus to produce a viral vector containing the RNP.
  • Reconstitution of a virus from DNA of a viral vector can be carried out using cells expressing an envelope protein according to a known method (WO 97/16539; WO 97/16538; Durbin, AP et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, SP et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. MJ et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F.
  • the virus does not form an infectious virus particle as it is, but these deletions occur in the host cell.
  • infectious virus particles can be formed.
  • Viral vector DNA can be introduced into cells by the following methods, (1) a method of preparing a DNA precipitate that can be taken up by the target cell, (2) suitable for uptake by the target cell and low in cytotoxicity. There are three methods: one is to make a complex containing DNA with positive charge characteristics, and the other is (3) a method of instantaneously drilling a hole in the target cell membrane by an electric pulse to allow DNA molecules to pass through.
  • transfusion reagents can be used.
  • D0TMA Boehringer
  • Superfect QIAGEN # 301305
  • D0TAP D0TAP
  • DOPE DOSPER Boehringer # 1811169
  • the transfection method using calcium phosphate can be mentioned as (1).
  • DNA that has entered the cells is taken up by phagocytic vesicles, but it is known that a sufficient amount of DNA enters the nucleus.
  • Method (3) is a method called electroporation, which is more versatile than method (2) in that it has no cell selectivity. Is the duration of the pulse current, the shape of the pulse, the strength of the electric field (gap between electrodes, voltage), and the conductivity of the buffer. Optimum conditions for electrical conductivity, DNA concentration and cell density are all right.
  • the method (1) among the three categories is easy to operate and can examine a large number of samples using a large number of cells. Therefore, in the present invention, the transfection reagent is suitable.
  • the transfection reagent is suitable.
  • Superfect Transfection Ragent QIAGEN, Cat No. 301305
  • DOSPER Liposomal Transfection Reagent Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169
  • Reconstitution from cDNA can be specifically performed as follows.
  • FCS fetal calf serum
  • antibiotics 100 units / ml Nisillin G and 100 g / ml streptomycin
  • MCS fetal calf serum
  • antibiotics 100 units / ml Nisillin G and 100 g / ml streptomycin
  • MEM fetal calf serum
  • UV irradiation was inactivated in the presence of lg / ml psoralen (psoralen) by a 20-minute treatment.
  • Recombinant vaccinia virus expressing polymerase VTF7-3 (Fuerst, TR et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the cells may be serum containing only 100 ⁇ g / ml rifampicin (Sigma) and cytosine arabinoside (AraC), more preferably only 40 ⁇ g / ml cytosine arabinoside (AraC) (Sigma).
  • Optimal drug concentrations are set to maximize virus recovery (Kato, A. et al., 1996, Genes Cels. 1: 569-579). After culturing for about 48 to 72 hours from the transfection, collect the cells, freeze and thaw three times to crush the cells, and then transfect into LLC-MK2 cells that express the envelope protein and culture. .
  • the culture solution After 3 to 7 days of culture, collect the culture solution.
  • the NP, L, P expression plasmid is transfected into LLC-MK2 cells expressing the envelope protein from the beginning, or if the envelope expression plasmid is transfected together, an infectious virus vector can be obtained. Can be obtained more efficiently.
  • These cells can amplify the viral vector by layering and culturing LLC-MK2 cells expressing the envelope protein (see Examples).
  • the virus titer contained in the culture supernatant can be determined by measuring the hemagglutination activity (HA). HA can be determined by the “endo-point dilution method” (Kato, A. et al., 1996, Genes Cell 1: 569-579).
  • the resulting virus stock can be stored at -80 ° C.
  • the recombinant Sendai virus vector of the present invention can be appropriately diluted with, for example, saline / phosphate-buffered saline (PBS) to obtain a composition.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the recombinant Sendai virus vector of the present invention is propagated in chicken eggs, etc., it can also contain chorioallantoic fluid.
  • the recombinant Sendai virus vector-containing composition of the present invention may contain a physiologically acceptable medium such as deionized water and a 5% dextrose aqueous solution.
  • a stabilizer, a biocide, and the like may be further contained.
  • the host cell used for reconstitution is not particularly limited.
  • cultured cells such as monkey kidney-derived CV-I cells and LLC-MK2 cells, and hamster kidney-derived BHK cells can be used.
  • infectious virus particles having the envelope can also be obtained.
  • a virus vector obtained from the above-described host together with a vector expressing an envelope gene can be infected into embryonated chicken eggs to amplify the vector.
  • the envelope protein gene It is also possible to produce a viral vector using the integrated transgenic chicken egg.
  • a method for producing a viral vector using chicken eggs has already been developed (Nakanishi et al., Eds., (1993), "Advanced Technology Protocol for Neuroscience III, Molecular Neuronal Biology"), Kouseisha, Osaka, pp.153 -172).
  • a fertilized egg is placed in an incubator and cultured at 37 to 38 ° C. for 9 to 12 days to grow an embryo.
  • the Sendai virus vector is inoculated into the chorioallantoic space together with the vector expressing the envelope protein, and the eggs are cultured for several days to propagate the virus vector. Conditions such as the culture period may vary depending on the recombinant Sendai virus used. Then collect the allantoic fluid containing the virus.
  • Separation and purification of Sendai virus vector from chorioallantoic fluid can be carried out according to a conventional method (Masato Tashiro, “Virus Experimental Protocol”, Nagai, Ishihama supervision, Megumi Rubiyu Isha, pp.68-73, (1995)).
  • the virus vector of the present invention itself as a vector for expressing the envelope protein.
  • the envelope proteins that are missing on each will be supplied by expression from the other complex, so that Complementary and infectious virus particles are formed and the replication cycle takes place, amplifying the viral vector. That is, if two or more vectors of the present invention are inoculated with a combination that complements the envelope protein, a mixture of each of the envelope gene-deficient virus vectors can be produced in large quantities at low cost. The mixed virus thus produced is also useful for vaccines and the like.
  • these viruses have a smaller genome size and can retain a longer exogenous gene because of the lack of the envelope gene, because of the lack of the envelope gene.
  • these originally non-infectious viruses are diluted extracellularly, making it difficult to maintain co-infection and sterilize them.
  • a virus vector is prepared using a gene for treating a disease as a foreign gene
  • the gene therapy can be performed by administering this vector.
  • Application of the virus vector of the present invention to gene therapy includes gene expression by direct administration and gene expression by indirect (ex vivo) administration. It is possible to express endogenous genes that are in short supply.
  • the foreign gene is not particularly limited, and may be a nucleic acid that does not encode a protein such as antisense or ribozyme, in addition to a nucleic acid that encodes a protein.
  • a gene encoding an antigen of a bacterium or virus relating to infectious disease is used as a foreign gene, immunity can be induced in the animal by administering the gene to the animal. That is, it can be used as a vaccine.
  • the viral vector of the present invention When used as a vaccine, it is conceivable to apply the viral vector of the present invention to, for example, tumors, infectious diseases, and other common diseases.
  • a gene having a therapeutic effect can be expressed in tumor cells or antigen-presenting cells (APC) such as DC cells using the vectors of the present invention.
  • APC antigen-presenting cells
  • genes include the cancer antigen Muc-1 or Muc-1-like mucin tandem repeat peptide (US Pat. No. 5,744,144), melanomeric gplOO antigen, and the like.
  • Such gene therapy has been applied to a wide range of applications such as breast cancer, colon cancer, kidney cancer, prostate cancer, and lung cancer. It is also effective to combine site power-ins that enhance the adjuvant effect.
  • Such genes include, for example, i) a combination of IL-2 and a single-chain IL-12 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15): 8591-8596, 1999), ii) IL-2 And interferon-a (US Pat. No. 5,798,100), iii) Granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF) used alone, iv) Combination of GM-CSF and IL-4 for treating brain tumors (J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999)), etc.
  • GM-CSF Granulocyte colony-stimulating factor
  • influenza for example, the virulent strain H5N1 envelope
  • Japanese encephalitis for example, envelope quinula (Vaccine, vol. 17, No. 15-16, 1869-1882 (1999)
  • AIDS for example, HIVgag or SIVgag. Protein
  • treatment of chain cutin by oral administration of HIV envelope protein administration in polylactic acid-glycol copolymer (Kaneko, H. et.
  • cholera for example, the B subunit of cholera toxin (CTB) (Arakawa T, et al., Nature Biotechnology (1998) 16 (10): 934-8 Arakawa T, et al., Nature Biotechnology (1998) 16 (3): 292-7).
  • CTB cholera toxin
  • rabies for example, glycoproteins of rabies virus (Lodmell DL et al., 1998, Nature Medicine 4 (8): 949-52)
  • cervical cancer include human papillomavirus type 6 capsid protein LI (J. Med. Virol, 60, 200-204 (2000)).
  • insulin fragment peptides have been expressed in type I diabetes model animals (Coon, B. et al., J. Clin. Invest., 1999, 104 (2): 189-94). BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a photograph showing the result of Western plot analysis in which the expression of F protein by the Cre-loxP induction expression system was analyzed. The results of detection of a protein on the transfer membrane that can be crossed with an anti-SeV-F antibody by a chemiluminescence method are shown.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of analyzing the display of the F protein whose expression was induced by the Cre-loxP system on the cell surface. The results of flow cytometry analysis of LLC-MK2 / F7 using an anti-SeV-F antibody are shown.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of confirming the cleavage of the expressed F protein by trypsin by Western blotting.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of confirming the expression of HN on the cell surface in an experiment of adsorption of erythrocytes to the cell surface.
  • Figure 5 shows the results of an attempt to recover a deleted virus using cells expressing the deleted protein. It is a photograph showing. It was found that the vaccinia virus used during the reconstitution of F-deficient SeV quickly shut off F protein expression from the helper cell line.
  • LLC-MK2 and CV-1 refer to cell lysates of each cell line only.
  • LLC-MK2 / F + ad and CV-1 / F + ad refer to cell expression lysates with the adenovirus AxCANCre.
  • LLC-MK2 / F-ad and CV-1 / F-ad refer to the cell lysates of each F gene transfected strain without the addition of adenovirus AxCANCre.
  • LLC-K2 / F + ad 3rd refers to a lysate of cells that were further subcultured three times from cells induced and expressed by the adenovirus AxCANCre.
  • Id and 3d refer to 1 and 3 days after inducible expression, respectively.
  • Vacld and Vac 3d refer to cells one day and three days after vaccinia virus infection, respectively.
  • AraCld and AraC3d refer to cells 1 and 3 days after adding AraC
  • CHX Id and CHX 3d refer to cells 1 and 3 days after addition of the protein synthesis inhibitor cycloheximide.
  • FIG. 6 shows the results of transfection of GFP-introduced F-deleted SeV cDNA (pSeV18 + / AF-GFP) into non-F-expressing LLC-MK2 cells and observation of GFP expression (RNP detection). It is a photograph shown.
  • SeV cDNA F-shuffled SeV
  • “All” means that in addition to SeV cDNA, plasmids (pGEM / NP, pGEM / P, and pGEM / L) expressing NP, P, and L genes were also transfected.
  • CDNA indicates a transfection of cDNA (pSeV18 + / AF-GFP) only.
  • RNP transfection collects P0 cells expressing GFP, suspends them in OptiMEM (GIBCO BRL) (10 7 cells / ml), freeze-thaw, and repeats the lysate three times. (Minheim) 25/1, leave at room temperature for 15 minutes, and add to F-expression induced cells (+
  • Figure 7 shows the results of investigating whether functional RNP reconstructed with F-deleted genomic cDNA could be rescued in F-expressing helper cells to form infectious deletion viral virions. It is.
  • RNP / o refers to cells overlaid with RNP
  • RNP / t refers to cells transfected with RNP.
  • FIG. 8 is a photograph showing the result of confirming that the F-deficient virus is specifically amplified by F-expressing cells.
  • a lysate containing a functional RNP constructed from the gene-deleted genome was lipofused to the F-expressing cells described in Example 2, and the culture supernatant was collected. This culture supernatant was added to the medium of F-expressing cells for infection, and the culture supernatant collected on day 3 was added simultaneously to F-expressing cells and F-non-expressing cells for 3 days in the presence and absence of tribsine. Cultivated. The results are shown. In F-expressing cells, the virus was amplified only in the presence of tribsine.
  • FIG. 9 is a photograph showing the result of confirming that F-deficient virus was specifically released into the culture supernatant when introduced into F-expressing cells.
  • a lysate containing a functional RNP constructed from the gene-deleted genome was ribofoxted into the F-expressing cells described in Example 2, and the culture supernatant was collected.
  • the culture supernatant is added to the medium of F-expressing cells for infection, and the culture supernatant collected on day 3 is added simultaneously to F-expressing cells and F-non-expressing cells, and cultured for 3 days in the presence and absence of trypsin did.
  • the lower row shows the results for supernatants of non-F expressing cells o
  • Figure 10 shows that the virus in the culture supernatant of F-expressing cells was recovered, total RNA was extracted, and F and HN were probed to confirm the genomic structure of the virions recovered from the F-deleted cDNA. This is a photograph showing the results of Northern blot analysis performed on the sample. Virus recovered from F-expressing cells had the HN gene detected, but not the F gene, and the F gene was not found on the viral genome.
  • FIG. 11 is a photograph showing the result of RT-PCR showing that the GFP gene exists at the same F deletion site as in the cDNA construction.
  • 1 Confirmation of + 18-NP, +18 Not I site.
  • 2 Confirmation that the M-GFP and GFP genes are present at the F gene deficient site.
  • 3 Confirmation of the presence of F gene and F gene.
  • the genomic structures of wild-type SeV and F-deficient GFP-expressing SeV are shown above. It was confirmed that the GFP gene was present at the F-deficient site, the Notl site derived from +18 was located at the 3 'end of the NP, and the F gene was not present anywhere in the RNA genome.
  • Fig. 12 is a photograph showing the results of immunoelectron microscopy using a gold colloid-bound IgG (antiF, antiHN) that specifically reacts with virus F and HN.
  • the spike-like structure of the viral envelope was revealed to consist of F and HN proteins.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of RT-PCR confirming that the structures of other genes other than the GFP gene are similar to those of the wild type.
  • Figure 14 is a photograph showing the results of examining the morphology of F-deficient virus particles by electron microscopy.
  • the F-deficient virus particles had a helical RNP structure and a spike-like structure inside as well as the wild-type virus.
  • FIG. 15 is a photograph showing the results of highly efficient gene transfer into various cells in vitro using the F-deleted SeV vector.
  • FIG. 16 shows the results of analyzing the introduction of F-deficient SeV vector into mouse primary bone marrow cells (BM c-kit +/-). Open bars indicate PE positive / GFP negative, black bars indicate PE positive / GFP positive.
  • FIG. 17 is a photograph showing the results of in vivo administration of Vector-1 into the rat ventricle.
  • Figure 18 shows that the culture supernatant containing F-deficient SeV viruses recovered from F-expressing cells was infected into F-nonexpressing LLC-MK2 cells and cultured for 3 days in the presence or absence of tribsine, and the virus in the supernatant 4 is a photograph showing the result of confirming the presence of HA by an HA assay.
  • FIG. 11 A photograph showing the results of HA assay of chorioallantoic fluid 2 days after cultivation after reinoculation of embryonated chicken eggs with lane 12).
  • FIG. 20 is a photograph showing the results of examining a virus solution that is HA-positive and has no infectivity by immunoelectron microscopy. Virus particles were confirmed, and the virion envelope reacted with the antibody recognizing the gold colloid-labeled HN protein, but not with the antibody recognizing the gold colloid-labeled F protein.
  • FIG. 21 is a photograph showing the results of transfection of F-deficient virus particles into cells.
  • FIG. 22 is a photograph showing the result of Western blotting of the formation of F, HN co-expressing cells.
  • LLC / VacT7 / pGEM / FHN is a cell obtained by transfection of GEM / FHN plasmid after vaccinia infection of LLC-MK2 cells.
  • LLC / VacT7 is vaccinia-infected LLC-MK2 cells.
  • LLCMK2 / FHNmix is LLC-K2 cells into which F and HN genes have been introduced but not cloned.
  • LLC / FHN is a cell after introducing F and HN genes into LLC-MK2 cells and inducing expression with adenovirus (3 days later), 1-13, 2-6, 2-16, 3-3, 3-18, 3-22, 4-3 and 5-9 indicate the cell line number (name) when cloned.
  • FIG. 23 is a photograph showing the results of confirming virus formation depending on whether pGEM / FHN was added or not.
  • FHN-deficient GFP-expressing SeV cDNA, pGEM / NP, pGEM / P, pGEM / L and pGEM / FHN were mixed and transfected into LLC-MK2 cells.
  • the medium was replaced with MEM containing AraC and trypsin, and the cells were further cultured for 3 days.
  • the cells were observed with a fluorescent stereomicroscope to verify the difference in the presence or absence of pGEM / FHN, and the spread of GFP-expressing cells confirmed virus formation. The results are shown.
  • Spread of GFP-expressing cells was confirmed when pGEM / FHN was added during reconstitution, and GFP expression was observed only in single cells when pGEM / FHN was not added.
  • FIG. 24 is a photograph showing reconstitution and amplification of F, HN-deficient virus by RNP transfection.
  • FORN co-expressing cells (12 wells) were ribo-fused with PORNP using overlay or D0SPER, and 4 days later, GFP was observed.
  • MP tiger In the case of transfection, as in the case of F deficiency, P1 FHN-expressing cells successfully recovered the virus (top).
  • Six hours after infection with Ade / Cre cells in which FHN protein was induced and expressed were infected with the FHN-deficient virus solution, and amplification was confirmed (bottom).
  • Figure 25 shows that virus reconstituted from cDNA expressing FHN-deficient GFP infected LLC-MK2, LLC-MK2 / F, LLC-MK2 / HN, and LLC-MK2 / FHN with or without trypsin.
  • 4 is a photograph showing the result of culturing in. After 3 days of culture, the spread of GFP protein-expressing cells was confirmed. The results are shown. The spread of GFP was observed only in LLC-MK2 / FHN, confirming that this virus solution was amplified specifically for FHN co-expression and in a trypsin-dependent manner.
  • FIG. 26 is a photograph showing the result of confirming the genomic structure of RNA derived from the culture supernatant of FHN-expressing cells.
  • FIG. 27 is a photograph showing the result of confirming the genomic structure of RNA derived from the culture supernatant of F-expressing cells infected with the FHN-deficient virus.
  • FIG. 28 is a graph showing the inactivation of Pixinia virus and the T7 activity when the psoralen concentration in psoralen / UV irradiation was changed.
  • FIG. 29 is a diagram showing the inactivation of vaccinia virus and T7 RNA polymerase activity when the UV irradiation time in psoralen-UV irradiation was changed.
  • FIG. 30 is a photograph showing the cytotoxicity (CPE) of psoralen UV-irradiated vaccinia virus.
  • CPE cytotoxicity
  • Figure 31 shows the effect of UV treatment time of vaccinia virus on Sendai virus reconstitution efficiency.
  • FIG. 32 is a diagram showing the titer of replicable vaccinia virus remaining in cells used in the Sendai virus reconstitution experiment.
  • Fig. 33 is a photograph showing the results of Western blot analysis using an anti-VSV-G antibody.
  • FIG. 11B is a photograph showing the results obtained by collecting the supernatant after infection, infecting cells before ( ⁇ ) and after (+) induction of VSV-G, and observing cells expressing GFP on day 5.
  • FIG. 11B is a photograph showing the results obtained by collecting the supernatant after infection, infecting cells before ( ⁇ ) and after (+) induction of VSV-G, and observing cells expressing GFP on day 5.
  • FIG. 36 is a photograph showing the result of examining the amount of virus production over time.
  • Fig. 37 shows that infectivity was affected by treating pseudo-Ipsendai virus and FHN-deficient Sendai virus with F gene-deleted genomes obtained using VSV-G expression strains with anti-VSV antibodies. It is a photograph which shows the result of having investigated.
  • Fig. 38 shows whether F, HN-deficient Sendai virus containing the GFP gene is infected with LLCG-L1 cells expressing VSV-G gene and production of pseudo-Eve virus with VSV-G in the envelope is observed.
  • 5 is a photograph showing the result of examining the expression of GFP gene as an index.
  • FIG. 39 is a photograph showing the result of a Western analysis of the protein in the infected cell extract, which confirmed that the virus grown in the VSV-G gene-expressing cells was F- and HN-deleted.
  • FIG. 40 is a photograph showing the result of observing GFP-expressing cells under a fluorescence microscope.
  • Figure 41 shows the results of the combination of envelope expression plasmid and cell overlay.
  • FIG. 3 is a diagram showing an improvement in the reconstitution efficiency of F-GFP. Significant improvement was observed in d3 ⁇ (! 4 (day 3 ⁇ 4)) of P0 (before passage).
  • Fig. 42 shows the SeV / ⁇ by the combination of envelope expression plasmid and cell overlay.
  • FIG. 3 is a view showing the results of examination of processing conditions for reconstitution of F-GFP.
  • GFP positive cells represent the reconstituted viral load.
  • FIG. 43 shows the results of an investigation on the rescue of F-deficient Sendai virus from cDNA. This figure shows the improvement of the reconstitution efficiency of SeV / ⁇ F-GFP by the combination of envelope expression plasmid and cell overlay. On day 7, all challenges were positive, but we focused on day 3, which is a medium area of success, and examined efficiency.
  • FIG. 44 is a photograph showing the expression of lacZ in a LacZ-loaded F-deficient Sendai virus vector not containing GFP.
  • FIG. 45 is a diagram showing the subcloning of Sendai virus genomic cDNA fragments (A) and the structures of five Sendai virus genomic cDNAs constructed by introducing new Notl sites (B).
  • FIG. 46 is a diagram showing the structure of a cloning plasmid for adding a Notl site, a transcription initiation signal, an intervening sequence, and a transcription termination signal to SEAP.
  • Figure 47 is a photograph showing the results of plaque assay for each Sendai virus vector. A part of a fluorescence image of plaque atssy taken by LAS1000 is shown.
  • FIG. 48 is a diagram showing the result of comparing the difference in the expression level of the repo overnight gene (SEAP) between each Sendai virus vector. The relative values were expressed assuming that the SeV18 + / SEAP data was 100 overnight. It was found that the activity, ie, the expression level, decreased as the SEAP gene was positioned downstream.
  • SEAP repo overnight gene
  • FIG. 49 is a photomicrograph showing GFP expression in PI FHN co-expressing cells.
  • Fig. 50 shows the extract of VSV-G pseudotype SeV / AF: GFP infected cells using anti-F antibody (anti-F), anti-HN antibody (anti-HN), and anti-Sendai virus antibody (anti-SeV).
  • 4 is a photograph showing a result of performing an estamp lot analysis.
  • FIG. 51 is a photograph showing GFP fluorescence of cells infected with VSV-G pseudotype SeV lacking F and HN in the presence or absence of a neutralizing antibody (VGV antibody).
  • FIG. 52 is a photograph showing the results of Western analysis of a VSV-G pseudotype Sendai virus having a genome lacking the F gene or F, HN gene fractionated by density gradient ultracentrifugation.
  • Fig. 53 is a photograph showing the hemagglutination reaction of Sendai virus having the F gene-deficient genome or VSV-G pseudotype Sendai virus having the F gene or the F, HN gene deleted genome. is there.
  • FIG. 54 is a diagram showing the specificity of infection of cultured cells by Sendai virus having a genome in which the F gene has been deleted or VSV-G pseudo-Ipsendai virus.
  • FIG. 55 is a photograph showing confirmation of the structure of F-deficient Sendai virus carrying NGF expression (NGF / SeV / AF).
  • FIG. 56 shows the activity of NGF expressed from NGF-loaded F-deficient SeV-infected cells.
  • FIG. 57 is a photograph showing NGF activity expressed from NGF-loaded F-deficient SeV-infected cells.
  • a culture supernatant diluent of SeV-infected cells or NGF protein as a control was added at the same time as the start of the culture.
  • FIG. 58 is a photograph showing the expression levels of Ad-Cre moi and F protein.
  • FIG. 59 is a photograph showing the expression of LLC-MK2 / F by Adeno-Cre.
  • FIG. 60 is a photograph showing the persistence of the expression by the passage.
  • FIG. 61 is a photograph showing localization of F protein by passage.
  • FIG. 62 is a diagram showing a correlation between GFP-CIU and anti-SeV-CIU. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • pSeV18 + b (ten) is also called “pSeV18 + " Was digested with Sphl / Kpnl to collect a fragment (14673 bp), which was cloned into pUC18 to obtain a plasmid pUC18 / KS. Construction of the F-deficient site was performed on this PUC18 / KS. The deletion of the F gene was performed by a combination of the PCR-ligation method.
  • the F gene was ligated with atgcatgccggcagatga (SEQ ID NO: 1) except for the ORF of the F gene (ATG-TGA2 1698 bp), and the F-deleted SeV genome was cDNA (pSeV18 + / AF) was constructed.
  • PCR is performed at the upstream of F (forward: 5, -gttgagtactgcaagagc / SEQ ID NO: 2, reverse: 5, -tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaaccZ distribution ij number: 3) ⁇
  • the PCR product was ligated with EcoT22I.
  • the plasmid thus obtained was digested with Sacl and Sail, and a fragment (4931 bp) containing the F-deficient site was recovered and cloned into pUC18 to obtain pUC18 / dFSS.
  • This pUC18 / dFSS was digested with Drain, the fragment was recovered, replaced with a Drall fragment in the region containing the F gene of pSeV18 + , and ligated to obtain plasmid pSeV18 + / AF.
  • the EGFP gene was amplified by PCR.
  • Nsil-tai ld primer— 5'-atgcatatggtgatgcggttttggcagtac: SEQ ID NO: 6
  • the NgoMIV-tai led board PCR was performed using Lima-1 (5, -Tgccggctattattacttgtacagctcgtc: SEQ ID NO: 7).
  • the PCR product was digested with restriction enzymes Nsil and NgoMIV, the fragment was recovered from the gel, and ligated to the restriction enzyme sites Nsil and NgoMIV at the F deletion site of pUC18 / dFSS, and the sequence was confirmed. From here, to recover a Dral ll fragment containing the EGFP gene was replaced with Drai n fragment of the region comprising the F gene of P SeV18 +, was obtained plasmid pSeV18 + / AF-GFP and Raigeshiyon.
  • Cre / loxP-inducible expression plasmid that expresses the F gene is designed so that the SeV F gene is amplified by PCR, the sequence is confirmed, and the gene product is induced and expressed by Cre DNA recombinase.
  • Cre DNA recombinase was inserted into the unique site Swal site of plasmid pCALNdlw (Arai et al., J. Virology 72, 1998, plll 5-1121) to obtain plasmid pCALNdLw / F.
  • helper cell line expressing SeV-F protein was established.
  • the cells used were monkey kidney-derived cell lines, LLC-MK2 cells, which are often used for the growth of SeV. LLC-MK2 cells were incubated at 37 ° C, 5% in MEM supplemented with 10% heat-treated immobilized fetal calf serum (FBS), penicillin G sodium 50 units / ml, and streptomycin 50 ⁇ g / ml. 0 2 and cultured in.
  • FBS immobilized fetal calf serum
  • penicillin G sodium 50 units / ml penicillin G sodium 50 units / ml
  • streptomycin 50 ⁇ g / ml. 0 2 and cultured in.
  • SeV- for F gene product is cytotoxic, the above-mentioned plasmid pCALNdLw / F, which was designed to enable inducible expression of the F gene product by Cre DNA recombinase one peptidase, calcium phosphate method (Mammal Using the ian transfection kit (Stratagene), the gene was introduced into LLC-MK2 cells according to the protocol.
  • SeV-F protein expression was westernized using anti-SeV-F protein monoclonal IgG (f236, J. Biochem. 123: 1064-1072). Investigation was performed as follows by the plotting method.
  • the cells can be stored at -80 ° C and thawed for use as needed.
  • the collected cells are suspended in 150 ⁇ 1 PBS buffer, and the same volume of 2xTris-SDS-BME sample loading buffer (0.625M Tris, H 6.8, 5% SDS, 25% 2-ME, 50% glycerol, 0.025% BPB, manufactured by Owl Corporation), and subjected to a heat treatment at 98 ° C. for 3 minutes.
  • the sample (lxlO 5 cells per lane) was fractionated by electrophoresis using SDS-polyacrylamide gel (Multigel 10/20, manufactured by Daiichi Kagaku), and the fractionated protein was semi-dried.
  • PVDF transfer membranes Immobilon-P transfer membranes, manufactured by Millipore
  • the transfer was performed for 1 hour under the condition of ImA / cin 2 constant current using a transfer membrane immersed in 100% methanol for 30 seconds and water for 30 minutes.
  • the transfer film is shaken for 1 hour in a blocking solution containing 0.05% Tween20 and 1% BSA (PROC ACE, manufactured by Snow Brand) and diluted 1/1000 with a blocking solution containing 0.05% Tween20 and 1% BSA.
  • the reaction was carried out at room temperature for 2 hours with the obtained anti-SeV-F antibody 236).
  • the transfer membrane was washed by shaking three times in 20 ml of PBS-0.1% Tween 20 for 5 minutes, and then washed with PBS buffer for 5 minutes. Shake and wash.
  • the transfer membrane was diluted with a blocking solution containing 0.05% Tween 20, 1% BSA and diluted 1/2000 with a peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (Goat anti-mouse IgG, manufactured by Zymed). Allowed to react for hours.
  • the transfer membrane was washed three times with 20 ml of PBS-0.1% Tween 20 for 5 minutes, and then washed with PBS buffer for 5 minutes.
  • the protein on the transfer membrane which was crossed with the anti-SeV-F antibody was detected by the danigaku luminescence method (ECL western blotting detection reagents, manufactured by Amersham). The results are shown in FIG. AxCANCre infection-specific SeV-F expression was detected, confirming the production of LLC-MK2 cells that induce and express the SeV-F gene product.
  • Example 2 Confirmation of function of SeV-F protein expressed in helper cells It was examined whether SeV-F protein induced and expressed in helper cells maintained the conventional protein function.
  • SeV-F protein is synthesized as the inactive precursor protein F0, and is cleaved into two subunits, F1 and F2, by the proteolytic action of tribsine and activated.
  • the F protein was continuously expressed and expressed even when subcultured in the same manner as ordinary cells: no cytotoxicity due to the F protein was observed.
  • Example 3 Formation of functional RNP and virion having F-deficient genome
  • virions In recovering a defective virus, virions must be recovered using cells expressing the deleted protein.
  • the vaccinia virus used during the reconstitution of F-deficient SeV quickly shut off the F protein expression from the helper cell line. It turned out (Fig. 5) that the virus was not successfully reconstituted by supplying F protein directly from a helper cell line. ⁇ It has been reported that treatment with long-wave UV (PLWUV) by adding psoralen to vaccinia virus inactivates the vaccinia virus replication ability and does not impair T7 expression activity.
  • PLWUV long-wave UV
  • the functional RNP formed from the F-deficient virus genome is the F protein derived from F-expressing cells In the presence of E. coli, they were further formed as infectious virus particles and released extracellularly.
  • the presence of infectious F-deficient virions in the culture supernatant was proved by the following experiment.
  • a lysate containing a functional RNP constructed from the F gene-deleted genome was lipofused to the F-expressing cells described in Example 2, and the culture supernatant was collected. This culture supernatant was added to the medium of F-expressing cells to infect the cells.
  • the culture supernatant collected on day 3 was added simultaneously to F-expressing cells and F-non-expressing cells, and the cells were added for 3 days in the presence and absence of tribsine. Cultured. In F-expressing cells, the virus was amplified only in the presence of tribsine (Fig. 8).
  • the morphology of the recovered F-deficient virus particles was examined by electron microscopy.
  • the F-deleted virion had a helical RNP structure and a spike-like structure inside like the wild-type virus (Fig. 14).
  • the spike-like structure of the virus envelope was found.
  • Fig. 12 was found to be composed of F and HN proteins (Fig. 12), indicating that the F protein produced by helper cells was efficiently incorporated into this virion. The details are described below.
  • RNA was extracted from the culture supernatant on the third day after virus infection of F-expressing cells LLC-MK2 / F7 using a QIAamp Viral RNA mini kit (QIAGEN) according to the protocol.
  • the purified total RNA (5 ⁇ g) was electrophoretically separated on a 1% denaturing agarose gel containing formaldehyde, and then transferred to a Hybond-N + membrane using a vacuum blotting device (Amersham Pharmacia).
  • the prepared membrane was fixed with 0.05 M NaOH, rinsed with 2-fold diluted SSC buffer (Nacalai tesque), and then prehybridized with a hybridization solution (Boehringrer Mannheim) for 30 minutes.
  • a probe of the F or HN gene prepared by a random prime DNA labeling method using digoxigenin (DIG) -dUTP (alkali sensitivity) (DIG DNA Labeling Kit, Boehringer mannheim) was added and hybridized for 16 hours. Thereafter, the membrane was washed, reacted with an alkaline phosphatase-labeled anti-DIG antibody (anti-digoxigenin-AP), and analyzed using a DIG ditection kit.
  • DIG DNA Labeling Kit digoxigenin-dUTP
  • anti-digoxigenin-AP alkaline phosphatase-labeled anti-DIG antibody
  • RT-PCR Further detailed analysis was performed by RT-PCR.
  • purified viral RNA was synthesized using the SUPERSCRIPT II Preamplification System (Gibco BRL), first strand cDNA was synthesized according to the protocol, and the LA PCR kit (TAKARA ver2.1) was used under the following conditions.
  • PCR was performed. After reacting at 94 ° C for 3 minutes, amplify 30 cycles with 94 ° C / 45 seconds, 55 ° C / 45 seconds, and 72 ° C / 90 seconds as one cycle, place at 72 ° C for 10 minutes, and add 2% agarose. The gel was electrophoresed for ⁇ / 30 minutes, stained with ethidium umide, and photographed.
  • the primers used to confirm the EGFP inserted into the M gene and F deletion sites were forward 1: 5,- atcagagacctgcgacaatgc (Rooster sequence number: 8), reverse 1: 5'-aagtcgtgctgcttcatgtgg (SEQ ID NO: 9),
  • the primer used to confirm the EGFP and HN genes inserted into the F deletion site was forward 2: 5'- acaaccactacctgagcacccagtc (system 'J number: 10), reverse 2: 5'-gcctaacacatccagagatcg (SEQ ID NO: 11), and forward3: 5'-acattcatgagtcagctcgc between M gene and HN gene (sequence number: 12) )
  • the reverse2 primer SEQ ID NO: 11).
  • the morphology of the recovered F-deficient virus particles was examined by electron microscopy. First, 28,000 rpm the supernatant of deficient virus infected cells, after centrifugation the virus for 30 minutes to pellet was resuspended in lX10 9 HAU / ml to become as 10-fold diluted PBS, the drop The solution was dropped on a microgrit with a support membrane and dried at room temperature. After fixation treatment with PBS containing 3.7% formalin for 15 minutes, pretreatment with PBS solution containing 0.1% BSA for 30 minutes, and further dilute 200-fold with the same solution to obtain anti-F monoclonal antibody (f236) or anti-F monoclonal antibody An HN monoclonal antibody (Miura, N.
  • the cells B27 supplement added with neural basal medium (GibcoBRL, Burl ington , Ontario, Canada) was re Kaka ⁇ to adversely - d - 1 lysine (Becton Dickinson Lab are, Seed lxl0 5 cel ls / dish on plates coated at Bedford, MA, USA). They were cultured in the C ⁇ 5% C0 2.
  • MAP-2 anti-rat microtubule-associated protein 2
  • Normal human smooth muscle cells, normal human hepatocytes, and normal human lung capillary endothelial cells were purchased from Dainippon Pharmaceuticals and purchased with SFM CS-C Medium Kit (Cell Systems) 37. They were cultured in C ⁇ 5% C0 2.
  • 3Xl0 6 mononuclear cells in contrast, Piochin labeled anti CD45R (B220), anti-Ly6G (Gr-1), anti-Ly- 76 (TER- 119), anti-1 (Thyl.2), anti-Mac-1 stress but-avidin magnetic beads coupled with (fa - Mijen Co., Funakoshi Co.) mixed and reacted for 1 hour at 4 ° C was added a 3X10 7 things, by the magnet, collect the fractions excluding the Lin + cells (Lin cells) (Erlich, S. et al., Blood 1999. 93 (1), 80-86).
  • GFP-SeV can, SeV transcription Yunitto 11 (; 18 71 ⁇ 2.0 ⁇ (+ 18) (661 ⁇ 306113, 1996,1: 569-579)
  • R1 and R2 transcription initiation and termination
  • IG intervening sequence
  • the virus containing the GFP gene was reconstructed using LLC-MK2 cells and embryonated chicken eggs, and the virus containing the gene of interest was recovered. After infection with GFP-SeV and culturing for 48 hours, the cells were divided into two groups, one of which was reacted with phycoerythrin (PE) -labeled anti-CD117 (c-kit, Pharmingen) for 1 hour The other group was the control group. After washing three times with PBS, analysis was performed using a flow cytometer (EPICS Elite ESP; Coulter, Miami, FL).
  • PE phycoerythrin
  • Rats (F334 / Du Crj, 6-week-old, female, Charles River) were intraperitoneally injected with Nembu citrate sodium solution (Dynabot) diluted 10-fold (5 mg / ml) with physiological saline (Otsuka Pharmaceutical). After anesthesia, the virus was administered using a stereotaxic apparatus for small animals (DAVID K0PF).
  • DAVID K0PF stereotaxic apparatus for small animals
  • GFP protein expression was observed only in ependymal cells or nerve cells to which the virus in the vicinity of the injection site could contact, and no lesions were observed in these sites. No apparent behavioral abnormalities or changes in body weight were observed in the administered rats before dissection, and after dissection each organ, brain, and liver No pathological findings were observed in any of the tissue organs such as lung, kidney, heart, spleen, stomach, and intestine.
  • F-expressing LLC-MK2 cells and F-expressing LLC-MK2 cells were infected with F-deficient SeV virus and cultured 3 days after trypsin presence (+) and absence (1).
  • the results of the HA assay of the cell culture supernatant were shown (Fig. 18A). These culture supernatants were inoculated into embryonated chicken eggs, respectively, and the results of HA assay of the chorioallantoic fluid of the chicken eggs after 2 days of culture were shown (FIG. 18B).
  • “C” at the top of the panel indicates PBS used as a control group. The number of dilution indicates the dilution ratio of the virus solution.
  • the chorioallantoic fluid (lane 11 and lane 12), which was HA-positive in the embryonated hen's eggs, was re-inoculated into the embryonated hen's eggs, and HA assay was performed on the allantoic fluid two days after culture (FIG. 19C).
  • the virus was not amplified at all when re-inoculated into embryonated chicken eggs, and the HA-positive virus solution was It was found to be non-infectious.
  • RNA prepared from culture supernatants of F-expressing cells, HA-positive, non-infectious chorioallantoic fluid, and wild-type SeV using the QIAamp viral RNA mini kit (QIAGEN) Ting was done.
  • QIAamp viral RNA mini kit QIAGEN
  • F-less virus virions transiently amplified in embryonated chicken eggs show no infectivity to cells that can be infected with Sendai virus. Therefore, in order to confirm that the functional RNP structure is enveloped in the envelope, it was mixed with cationic liposomes (DOSPER, Boehringer mannheim) and incubated at room temperature for 15 minutes to inhibit expression of F-expressing cells. The cells were transfused. As a result, no GFP-expressing cells were observed when not mixed with the cationic ribosome, whereas when mixed with the cationic ribosome, GFP expression was observed in any of the cells.
  • DOSPER cationic liposomes
  • pUC18 / KS is first digested with EcoRI to construct pUC18 / Eco, and the entire sequence from the start codon of the F gene to the stop codon of the HN gene was constructed by deleting (4866- 8419) and ligating at the Bsiwl site (cgtacg). After confirming the sequence of the FHN-deficient site by sequencing, the EcoRI fragment (4057 bp) was recovered from the gel and constructed by replacing the EcoRI fragment of PUC18 / KS.
  • FHN Kpnl / Sphl fragment that contains the defective area (14673bp) gel recovered and replaced with pSeV18 + of Kpnl / Sphl fragment were obtained plasmid pSeV18 + / AFHN.
  • FHN-deficient SeV cDNA into which GFP was introduced was constructed as follows. A Sall / Xhol fragment (7842 bp) was recovered from pSeV18 + / m FHN and cloned into pGEMllZ (Promega) to obtain a plasmid pGEMllZ / SXdFHN.
  • a PCR product in which a Bsiwl site was added to both ends of an ATG-TAA (846 bp) of d2EGFP (Clontech) at the FHN deletion site was digested with the Bsiwl enzyme, and ligated to the Bsiwl site of the FHN deletion site of pGEMllZ / SXdFHN.
  • the obtained plasmid was pSeV18 + / AFHN-d2GFP.
  • the plasmid that expresses the F gene is the same as that used in the preparation of the cell line expressing the F-deficient protein described above, and the plasmid that expresses the HN gene is constructed in the same manner and contains the HN 0RF.
  • the fragment was inserted into the unique Swal site of pCALNdlw (Arai et al., Supra), resulting in plasmid pCALNdLw / HN.
  • the F and HN fragments used for constructing pCALNdLw / F and pCALNdLw / HN were cloned into pGEM4Z and pGEM3Z (Promega), respectively, to obtain pGEM4Z / F and pGEM3Z / HN.
  • a fragment obtained by digesting the region containing the T7 promoter and HN of pGEM3Z / HN with the PvuI I enzyme was collected, and ligated to the site that was cut at the Sacl unique site downstream of the F gene of PGEM4Z / F and flattened. did.
  • the F gene and the HN gene are arranged in the same direction, Performed Western blotting with an anti-HN monoclonal antibody, and confirmed that both F and HN proteins could be expressed simultaneously.
  • Reconstitution (P0) of the FHN-deficient virus was performed in two ways.
  • a plasmid that expresses the F and HN proteins under the control of the T7 promoter was separately produced, and the F and HN proteins were supplied to reconstruct the plasmid.
  • the reconstructed cells were amplified in FHN co-expressing cells.
  • FHN-deficient GFP-expressing SeV cDNA (pSeV187AFHN-d2GFP), pGEM / NP, pGEM / P, pGEM / L, pGEM / FHN, respectively 12 / g / 10cra dish, 4 / ⁇ g / 10cm dish, 2 ⁇ g / 10cm Dish, 4 zg / lOcm dish, and 4 / g / 10cm dish were mixed at the final volume ratio (final volume, 3 ml / 10cm dish), and the gene was transfected into LLC-MK2 cells in the same manner as the F-deficient SeV described above. did.
  • the medium was replaced with MEM containing AraC (40 ⁇ g / ml, SIGMA) and trypsin (7.5 ⁇ g / ml, GIBC0), and the cells were further cultured for 3 days.
  • the cells were observed with a fluorescent stereo microscope to verify the difference in the presence or absence of pGEM / FHN, and the formation of virus was confirmed by the spread of GFP-expressing cells.
  • pGEM / FHN was added at the time of reconstitution, the spread of GFP-expressing cells was confirmed, and when pGEM / FHN was not added, GFP expression was observed only in single cells (FIG. 23).
  • the virus solution reconstructed from cDNA expressing FHN-deficient GFP was infected with LLC-MK2, LLC-MK2 / F, LLC-MK2 / HN, LLC-MK2 / FHN and cultured with or without trypsin. After 3 days of culture, the spread of GFP protein-expressing cells was confirmed, and only with LLC-MK2 / FHN. The spread of GFP was observed, and it was confirmed that this virus solution was amplified specifically for FHN co-expression and in a trypsin-dependent manner (FIG. 25).
  • PCR primers were used using a combination of the M gene and the GFP gene or a combination of the M gene and the L gene (for the combination of the M gene and the GFP gene (M-GFP), forward: 5, one atcagagacctgcgacaatgc "rooster").
  • FHN-deficient virus was infected to F-expressing cells in the same manner as F-deficiency, and the cells were cultured. On day 4, the culture supernatant was collected, and the cells were infected with LLC-MK2, LLC-K2 / F, and LLC-MK2 / FHN. An experiment was performed. As a result, no GFP-expressing cells were observed in any of the infected cells, indicating no infectivity to these cells. However, it has already been reported that the F protein alone can form virus particles (Kato, A. et al., Genes cels 1, 569-579 (1996)), and that the ashia oral glycoprotein receptor (ASG) in the liver has been reported.
  • ASG oral glycoprotein receptor
  • the virus envelope has an FHN-deficient RNA genome, and virions formed of only the F protein It is possible that it could be released into the culture supernatant of the expressing cells. Therefore, the culture supernatant of F-expressing cells infected with the FHN-deficient virus was collected, centrifuged, RNA extracted in the same manner as described above, and analyzed by RT-PCR in the same manner as described above. As a result, as shown in FIG. 27, it was found that RNA containing the FHN-deficient genome was present.
  • VSV-G and virions of the virus pseudotyped by Western blot analysis clearly show that F and HN proteins are not expressed. It can be said that a production system for FHN-deficient virus virions has been established.
  • virions released from F protein-expressing cells were overlaid on FHN-expressing cells or non-expressing LLC-MK2 cells with or without mixing with catonic ribosomes (50/1 D0SPER / 500/1 / wel 1).
  • catonic ribosomes 50/1 D0SPER / 500/1 / wel 1.
  • Virus-like particles recovered from such F-expressing cells infect and overlap with ASG-R gene-expressing or non-expressing cell lines, or hepatocytes, and are liver-specific or as described by Spiegel et al. It can be examined whether or not ASG-R is specifically infected.
  • the F-deficient RNP amplified in the system described above is enveloped in the virus envelope of F-less, and this envelope is chemically modified to have the desired cell transduction ability by gene modification or gene transfection.
  • the recombinant RNA genome can continue autonomously producing RNA replication or protein in the transfected cells.
  • a specific target Vector production By leaving the intracellular domain of HN, fusing the extracellular domain with a ligand that can specifically target other receptors, and incorporating a recombinant gene capable of producing chimeric proteins into the viral genome, a specific target Vector production
  • a vector can be prepared from a cell producing this recombinant protein. These vectors can be applied to gene therapy and vaccines.
  • the gene for the envelope chimera protein which can be obtained overnight, was introduced into the FHN-deficient site in place of the GFP gene, and the method was similar to that for the FHN-defective vector Reconstitute and amplify once with FHN expressing cells
  • the production of the targeting vector becomes possible.
  • the virus particles having the FHN co-deficient SeV virus genome and only the F protein having the envelope protein recovered by the present invention are RNA vectors capable of autonomously replicating in the cytoplasm efficiently regardless of cell division. Virus particles and a practical system that can be mass-produced.
  • RNA viruses such as Sendai virus and measles virus
  • a technology has been established to reconstitute virus particles that can be transmitted from cDNA cloned from the viral genome.
  • plasmids into which cDNA and NP, P, and L genes have been introduced downstream of the T7 promoter are introduced into cells, and cDNA and each gene are expressed using T7 polymerase to regenerate them.
  • the power of construction The supply of T7 polymerase is primarily made of recombinant vaccinia virus expressing T7 polymerase.
  • Vaccinia virus expressing T7 can efficiently express T7 polymerase in almost all cells.However, due to cytotoxicity derived from vaccinia virus, surviving infected cells for only a few days Can not. In many cases, rifampicin is used as an anti-vaccinia drug, but Kato et al. (Kato, A. et al., Genes cels 1, 569-579 (1996)) used AraC in addition to rifampicin. By using them in parallel, we succeeded in minimizing the growth of vaccinia virus and efficiently reconstructing Sendai virus.
  • Adenovirus systems other than vaccinia have also been tried as a means of supplying T7 polymerase, but have not yielded good results.
  • Vaccinia virus in addition to T7 polymerase, encodes an A-capping enzyme that works in the cytoplasm as its own protein. It is thought that efficiency has been improved.
  • by treating vaccinia virus by the Psoralen-Long-Wave-UV method it was attempted to avoid cell damage derived from vaccinia virus and increase the reconstitution efficiency of Sendai virus.
  • DNA cross-linking with psoralen and long-wave ultraviolet light can create a condition that inhibits the replication of viruses that carry DNA in the genome, but does not particularly affect the expression of early genes. Since the vaccinia virus has a long genome length, the effect of virus inactivation by this system is considered to be remarkable (Tsung, K. et al., J Virol 70, 165-171 (1996)).
  • the transfected cells can be inoculated into embryonated chicken eggs to propagate Sendai virus. You don't have to worry too much about the efficiency of the virus and the residual vaccinia virus.
  • the irradiation time was set to 2 minutes, and the psoralen concentration was tested.
  • Inactivation test The measurement was carried out by measuring vaccinia virus in Thailand by plaque formation and measuring T7 polymerase activity by the T7 promoter-controlled pGEM-luci plasmid and Sendai virus minigenome.
  • the measurement of T7 polymerase activity by the Sendai virus minigenome was performed simultaneously with the plasmid of the Sendai virus minigenome and the pGEM / NP, pGEM / P, and pGEM / L plasmids that express Sendai virus NP, P, and L proteins in T7.
  • This system transfects cells, forms a ribonucleoprotein complex, and examines the transcription of luciferase enzyme protein using Sendai virus A-polymerase.
  • VSV-G gene product is cytotoxic
  • a plasmid pCALNdLG designed to induce the expression of the VSV-G gene product by Cre recombinase (Arai T. et al. J. Virology 72 (1998) Using pl 11-1512)
  • Cre recombinase Arai T. et al. J. Virology 72 (1998) Using pl 11-1512
  • stable transfected strains were produced in LLC-MK2 cells. Plasmid was introduced into LLC-MK2 cells by the calcium phosphate method (CalPhosTM Ma Ryan Alien Transfection Kit, Clontech) according to the manual attached thereto.
  • VSV-G After infecting each clone with the recombinant adenovirus AxCANCre containing Cre recombinase, the expression of VSV-G was examined by the Western plot method described below using an anti-VSV-G monoclonal antibody.
  • PBS buffer containing 0.05% trypsin and 0.02% EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid)
  • the cells can be stored at ⁇ 20 ° C., and can be thawed and used as needed.
  • the collected cells were lysed with 100 jul of a cell lysate (RIPA buffer, manufactured by Boehringer Mannheim), and Western blotting was performed using the total protein of the cells (lxlO 5 cells per lane).
  • Transfer the cell lysate to sample buffer for SDS-polyacrylamide gel electrophoresis [buffer consisting of 6 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol] After dissolving and heating at 95 ° C for 5 minutes, it was used as a sample for electrophoresis.
  • the sample was fractionated by electrophoresis using SDS-polyacrylamide gel (Multigel 10/20, manufactured by Daiichi Kagaku Co., Ltd.), and the fractionated protein was transferred to the transfer membrane (I (Oki obilon-P TransferMembranes, manufactured by Millipore).
  • the transfer was performed for 1 hour under the conditions of ImA / cm 2 constant current using a transfer film immersed in 100% methanol for 20 seconds and water for 1 hour.
  • the transfer membrane was shaken in 40 ml of a blocking solution (Block Ace, manufactured by Snow Brand) for 1 hour, and then washed once with a PBS buffer.
  • a blocking solution (Block Ace, manufactured by Snow Brand) for 1 hour
  • the transfer membrane was immersed twice in 40 ml of PBS-O.l% Tween 20 for 5 minutes, washed, immersed in PBS buffer for 5 minutes, and washed.
  • Peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (anti-mouse immunoglobulin 1 obu 11 n, Amersham, Inc.) diluted 1/2500 in PBS buffer containing the transfer membrane and 10% blocking solution 5 ml was put in a vinyl bag, sealed, and shaken at room temperature for 1 hour.
  • the transfer membrane was immersed twice in PBS-0.1% Tween 20 for 5 minutes, washed, immersed in a PBS buffer for 5 minutes, and washed.
  • the protein on the transfer membrane which crossed with the anti-VSV-G antibody, was detected by a luminescence method (ECL Western blotting detection reagents, manufactured by Amersham). The results are shown in FIG. In three clones, AxCANCre infection-specific VSV-G expression was detected, and the production of LLC-MK2 cells that induced and expressed the VSV-G gene product was confirmed.
  • LLCG-L1 One of the obtained cell lines was called LLCG-L1, and flow cytometry analysis was performed using an anti-VSV antibody (Fig. 34).
  • Fig. 34 An anti-VSV antibody
  • the GFP gene described in the above Example was used to infect a VSV-G gene-expressing cell with a Sendai virus having a genome lacking the F gene and to determine whether a pseudotyped virus having VSV-G in the coat was observed.
  • a pseudotyped virus having VSV-G in the coat was observed.
  • the expression of the GFP gene was used as an indicator.
  • in LLCG-L1 which is not infected with the recombinant adenovirus AxCANCre containing Cre recombinase, viral genes are introduced by infection with the F-deficient Sendai virus, and GFP-expressing cells are detected, but the number of cells increases.
  • the virus titer was determined by adding a 10-fold serially diluted virus solution to the cells before VSV-G induction and counting the GFP-expressing cells 5 days after infection. The number of infectious particles (CIU) on cells was determined. As a result, the maximum virus production was 5 ⁇ 10 5 CIU / ml.
  • Anti-mouse IgG antibody labeled with peroxidase for Sendai virus polyclonal antibody, anti-Frog monoclonal antibody, anti-F protein monoclonal antibody, and anti-HN protein monoclonal antibody labeled with peroxidase was used. As a result, the protein and HN protein derived from Sendai virus were detected, but the F protein was not detected, confirming that the protein was F-deleted.
  • the expression of the GFP gene was examined in the same manner as in the above Examples using the expression of the GFP gene as an index. As a result, it was observed that the virus multiplied specifically to VSV-G-expressing cells, and generation of pseudo-type F and HN-deleted Sendai virus with VSV-G was observed (FIG. 38).
  • the virus titer was determined by adding a 10-fold serially diluted virus solution to the cells before VSV-G induction, and counting the GFP-expressing cells 5 days after infection. The number of infectious particles (CIU) was determined. As a result, the maximum virus production is 1 x 10 6 ClU / ml
  • Plasmid KpSeV18 + / AF-GFP, pGEM / NP, pGEM / P, and pGEM / L were suspended in 0 £ ground (& 18 (0)) at a ratio of 12 ⁇ g, 4 ⁇ g, 2 ⁇ g, and 4 ⁇ g / dish, respectively, and the SuperFect transfection reagent (1 g DNA / 5 ⁇ l SuperFect, QIAGEN) was added and left at room temperature for 15 minutes.
  • the DNA-SuperFect mixture in 3 ml of Opt-MEM medium containing 3% FBS was added to the cells and cultured. After culturing for 3 hours, the cells are washed twice with serum-free MEM medium and cultured for 70 hours in MEM medium containing cytosine /?-D-arabinofuranoside 40 ⁇ g / ml (AraC, Sigma) The cells and supernatant were collected and used as P0-d3 samples, and P0-d3 pellets were suspended in Opti-MEM medium (10 7 cels / ml).
  • Transfusion was performed in the same manner as above, except that 4 g / dish of envelope plasmid pGEM / FHN was added to the plasmid. After culturing for 3 hours, the cells were washed twice with serum-free MEM medium, and MEM containing cytosine 5-D-arabinofuranoside 40 ⁇ g / ml (AraC, Sigma) and trypsin 7.5 ⁇ g / ml The cells were cultured in the medium for 48 hours.
  • the culture supernatant was removed, and F-expressed LLC-MK2 / F7 cells for one 100-banded petri dish suspended in serum-free MEM medium (containing 40 g / ml AraC, 7.5 g / m tribsine) 5 ml of the cell suspension was overlaid. After 48 hours of culture, these cells and supernatant were collected and used as P0-d4 samples.
  • P0- d4 of the pellets were suspended in Opti MEM medium (2 x 10 7 cel ls / ml), layered on 3 cycles of freeze-thawing F expressing LLC-MK2 / F7 cell line (2 x l0 6 cel ls / Then, the cells were cultured in a serum-free MEM medium (containing 40 ⁇ g / ml AraC, 7.5 / g / m trypsin). On day 3 and day 7 after culture, supernatants were collected and used as PI-d3 and Pl-d7 samples, respectively. For comparison, an experiment was performed using the same method as the above-mentioned conventional method, except that no envelope was added and only the envelope plasmid was added.
  • LLC-MK2 cells were plated in 12wel l-plate at 2 x l0 5 cel ls / wel l, after 24 hours of culture, washed once with MEM medium without serum, the above sample (P0-d3 or P0 -d4, the Pl-d3 and Pl-d7), positive cells were appropriately diluted so that the number between 10 to 100 in 10 cm 2, were infected with 100 l / wel l. After 15 minutes, 1 ml / well of MEM medium without serum was added. After culturing for an additional 24 hours, observe the cells under a fluorescence microscope and express GFP. Cell counting was performed.
  • Example 13 Examination of PLWUV (Psoralen and Long-Wave UV Light) processing conditions for vaccinia virus (vTF7-3), which is optimal for improving the efficiency of reconstitution of a deletion Sendai virus vector
  • the plasmids pSeV18 + / AF-GFP, pGEM / NP, pGEM / P, and pGEM / L (Kato, A.
  • the cells were washed twice with serum-free MEM medium and cultured for 48 hours in MEM medium containing cytosine /?-D-arabinofuranoside 40 ⁇ g / ml (AraC, Sigma). Approximately 1/20 fields of the cells in a 100 ° bird dish were observed under a fluorescence microscope, and GFP-expressing cells were counted. To test for inactivation of vaccinia virus (VTF7-3), titers were measured by plaque formation (Miyuki Nagai et al., Experimental Virus Protocol, p291-296, 1995).
  • vaccinia virus vTF7-3 treated with each PLWUV
  • the efficiency of Sendai virus reconstitution was examined. Reconstruction was carried out by modifying the method of Kato et al. (Above) and following the procedure below. Seed LLC-MK2 cells in a 6-well microplate at 5 x 10 5 cells / well and culture overnight (assuming they are growing to 1 x 10 6 cells / well). evening was diluted vaccinia Awirusu (vTF7-3) such that 2 x l0 6 pfu / 100 ⁇ L one terms were infected cells after PBS washing.
  • plasmid, pGEM / NP, pGEM / P, and pGEM / L, and additional SeV cDNA (pSeV18 + b (+)) (Hasan) were added to 501 Opti-MEM medium (GIBC0).
  • GIBC0 Opti-MEM medium
  • 1 ml of 0pti-MEM (containing AraC at 40 / g / ml) was added, and the cells were overlaid.
  • the cells were collected on the third day after transfection, centrifuged, and suspended in 100 d / well of PBS. 10 times this suspension Three-hundred-fold dilutions of the cell solution were ingested into embryonated chicken eggs 10 days after fertilization. (Each lxlO 5 , lxlO 4 , lxlO 3 cells are ingested). Three days later, urine was collected from the eggs and the presence of virus reconstitution was examined by HA test. LxlO 5 out of cells ingestion chicken eggs, single point eggs had HA activity, the 10 4 ten-point, counted and 10 3 in hundred points were determined the efficiency of the reconstruction.
  • Example 12 The results of Examples 12 and 13 are shown in FIGS.
  • the improvement of the reconstitution efficiency of SeV / AF-GFP was confirmed by the combination of the expression plasmid and cell overlay.
  • d3 to d4 day 3 to 4
  • significant improvement was observed (Fig. 41).
  • eggs were inoculated into eggs 3 days after transfection. This condition was optimized because treatment with a psoralen concentration of 0.3 ⁇ g / ml for 20 minutes provided the highest reconstitution efficiency (day 3) (Table 2).
  • the LacZ gene was adjusted to a multiple of 6 (Hausmann, S et al., RNA 2, 1033-1045 (1996)) and a primer with a Notl cleavage site added at the 5 'end (5, -GCGCGGCCGCCGTACGGTGGCAACCATGTCGTTTACTTTGACCAA-3' / SEQ ID NO: 17) at the 3 'end, SeV transcription termination signal (E), intervening sequence (I) and transcription initiation signal Primer (5'-)
  • PCR was carried out using plasmid pCMV-5 (manufactured by Clontech) as type III.
  • the reaction conditions were as follows: pCMV-? 50 ng, 200 ⁇ MdNTP (Pharmacia Biotech), 100 pM primer, Vent Polymerase (New England Biolab) 4U mixed with the attached reaction buffer The reaction was performed with 25 reaction temperature cycles at 30 ° C for 30 seconds, 1 minute at 50 ° C, and 2 minutes at 72 ° C.
  • LLC-MK2 cells were plated in 100 negation petri dishes at 5xl0 6 cells / dish, cultured for 24 hours, washed once with MEM without serum, 3 ig / ml of Zoraren and long-wave ultraviolet light (365 nm) Recombinant vaccinia virus (vTF7-3) expressing T7 RNA polymerase treated for 5 minutes (Fuerst, TR et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)).
  • the serum-free MEM medium (40 g / ml AraC, containing 7.5 zg / m trypsin).
  • the supernatant was collected and used as a P2-d7 sample.
  • the serum-free MEM medium (7.5% g / m trypsin).
  • the supernatant was collected and used as a P3-d7 sample. Furthermore, after incubating the whole supernatant in a 10-cm plate on an F-expressing LLC-MK2 / F7 cell line at 37 ° C for 1 hour, washing once with MEM medium, serum-free MEM medium (40 ⁇ g) / ml AraC, 7.5 ⁇ g / m containing tribcine). On the 7th day after the culture, the supernatant was collected and used as a P4-d7 sample.
  • Sendai virus (SeV) full-length genomic cDNA, pSeV (+) (Kato, A. et al., Genes to Cels 1: 569-579, 1996) And the ATG translation initiation signal.
  • pSeV (+) was digested with Spjl / SalI (2645 bp), ClaI digested fragment (3246 bp), and C7al / EcoRI.
  • the digested fragment (5146 bp) was separated by agarose electrophoresis, the corresponding band was cut out, and recovered and purified using QIAEXI I Gel Extraction System (manufactured by QIAGEN).
  • the fragment digested with Sph l / Sal I was ligated to LITMUS38 (NE W ENGLAND BI0LABS), and the fragment digested with C7a I and the fragment digested with Cal / Eco RI were ligated to pBluescriptl KS + (Stratagene). , Sub-cloning.
  • I introduced the I site this was Quickchange Site-Directed Mutagenesis kit (manufactured by STRATAGENE). The primer used for each introduction was the sense strand between NP-P: 5 '.
  • antisense strand 5' -ccaccgaccacacccagcggccgcgacagccacggcttcgg-3 '(distribution U number: 19), antisense strand: 5' -ccgaagccgtggctgtcgcggccgctgggtgtggtcggtgg-3 '(distribution!
  • PSEAP-Basic manufactured by CL0NTECH
  • / u tourbo DNA polymerase manufactured by STRATAGENE
  • the product was digested with 4 scI, purified and recovered by electrophoresis. ⁇ ?
  • pBluescriptl KS + as a subcloning plasmid Synthetic double-stranded DNA [sense strand] including multicloning site (Pmel-Ascl-SwaI) and termination signal-intervening sequence-start signal at I site : 5'-gcggccgcgtttaaacggcgcgccatttaaatccgtagtaagaa aaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc-3 '(Distribution number: 31) ⁇ Antisense strand: 5, and -gc-3' (SEQ ID NO: 32)] were prepared (FIG. 46). ).
  • the purified and recovered PCR product was ligated to the ⁇ cI site of this plasmid and cloned. This was digested with I, and the SEAP gene fragment was recovered and purified by electrophoresis, and ligated and incorporated into the five types of Sendai virus genomic cDNA and the pSeV18 + ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ I site, respectively.
  • virus vector pSeV (+) NPP / SEAP, pSeV (+) PM / SEAP ⁇ SeV (+) MF / SEAP, pSeV (+) FHN / SEAP, pSeV (+) HNL / SEAP and pSeV18 (+) / SEAP.
  • PLWUV- VacT7 UV treated T7 polymerase
  • each Sendai virus cDNA, pGEM / NP, pGEM / P, and pGEM / L into which SEAP has been incorporated are added at a volume ratio of 12 ⁇ g, 4 ⁇ g, 2 ⁇ g, and 4 g / dish, respectively.
  • OptiMEM GEB0C0BRL
  • Add 1101 ⁇ SuperFect transfection reagent (QIAGEN) mix, leave at room temperature for 15 minutes, and finally add 3 ml of OptiMEM containing 3% FBS and add to cells And cultured for 3-5 hours.
  • the cells were washed twice with serum-free MEM and cultured for 72 hours in MEM containing cytosine /?-D-arapinofuranoside (AraC). These cells were collected, the pellet was suspended in 1 ml of PBS, and freeze-thawing was repeated three times. These were inoculated into chicken eggs that had been incubated for 10 days at 100 ⁇ 1 and incubated at 35 ° C for 3 days, after which urine was collected. For vaccinia virus-free, then further diluted to 10-5 to 10-7 these collected urine was re-inoculated into chicken eggs, harvested in the same manner and, aliquoted - were stocked in 80 ° C.
  • One virus vector is called SeVNPP / SEAP, SeVPM / SEAP ⁇ Se Symbol / SEAP ⁇ SeVFHN / SEAP, SeVHNL / SEAP and SeV18 / SEAP.
  • CV-1 cells were seeded on a 6-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells / well and cultured for 24 hours. After PBS washing, BSA / PBS (1% BSA in PBS) at 10 3, 10 4, 10 5, 10 6, after 1 hour fin-incubated over Chillon recombinant SeV diluted 10_ 7, Wash with PBS, overlay 3 ml of BSA / MEM / agas mouth (a mixture of 0.2% BSA + 2XMEM and an equal volume of 2% agarose) per well, and incubate at 37 ° C, 0.5% for 6 days at 37 ° C did.
  • BSA / PBS 1% BSA in PBS
  • the SEAP activity decreased as it was located downstream of the genome, that is, the expression level decreased.
  • the SEAP gene is inserted between the NP and P genes, In this case, an intermediate expression level was detected between the vector in which the SEAP gene was inserted upstream of the NP gene and the vector in which the SEAP gene was inserted between the P gene and the M gene.
  • Example 16 Improvement of Efficiency of Amplification of Deleted SeV by Double Deletion
  • the reconstitution method of currently used SeV virus uses recombinant vaccinia TF7-3 expressing T7 RNA polymerase). Due to the cytotoxicity of vaccinia, the infected cells are partially killed and the virus can be amplified in some of the reconstituted cells. It is preferable to be able to amplify the DNA.
  • paramyxovirus when both the F and HN proteins of the same type of virus are present on the cell surface, they cause cell fusion and form syncytium (Lamb and Kolakofsky, 1996, Fields virology, pl 89).
  • RhaC D-arabinofuranoside
  • SIGMA trypsin
  • the cells were collected by low-speed centrifugation (1000 rpm / 2 min), suspended in a serum-free MEM medium containing AraC (40 g / ml, SIGMA) and tribcine (7.5 g / ml, GIBC0), and co-deleted with FHN.
  • the cells were added to the virus reconstituted cells (P0) and cultured overnight.
  • Two days after cell overlay, the cells were observed with a fluorescence microscope, and the spread of the virus was confirmed by the expression of GFP in the cells.
  • the results are shown in Figure 49. Compared to the conventional case without cell overlay (left), when cells were overlaid (right), the number of GFP-expressing cells was remarkably larger in the layered cells.
  • the cells were harvested, 10 7 were suspended in a cell / ml Opti MEM medium (GIBCOL), three times freeze thawed license one DOO prepared, 10 to induce expression FHN co-expressing cells 2 days after 6 cel ls / 100 ⁇ L / wel l infected, AraC (40 g / ml, SIGMA), in serum-free MEM culture locations contain trypsin (7.5 ⁇ G / ml, GIBC0), 37 ° C 5% C0 2 incubator The virus titer of the culture supernatant of PI cells cultured for two days was measured by CIU-GFP (Table 4).
  • Example 17 Confirmation that pseudotyped Sendai virus has F-deficient genome It was examined by Western analysis of the protein of the infected cell extract that the virus grown by VSV-G gene expression was F-deficient. As a result, although Sendai virus-derived protein was detected, F protein was not detected, confirming that the protein was of the F-deletion type (FIG. 50).
  • Example 18 Effect of infectivity of pseudotype Sendai virus having a genome lacking F and HN genes by anti-VSV antibody
  • a pseudo-Ipsendai virus with a genome lacking the F and HN genes obtained using a VSV-G expression strain is infected with an anti-VSV antibody to determine whether the coat has VSV-G protein. Neutralizing activity to determine whether gender was affected was examined. The virus solution and the antibody were mixed, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and then infected with LLCG-L1 cells that did not express VSV-G, and the gene transfer ability on day 4 was examined by the presence or absence of GFP-expressing cells. .
  • the pseudo-Shipsendai virus (VSV-G in the figure), which has a genome lacking the F and HN genes, showed complete suppression of infectivity by anti-VSV antibody, Suppression was not observed in Sendai virus (Fig. 51). From this, it was clarified that the virus obtained in this example was a pseudo-type Sendai virus having a VSV-G protein in the coat and its infectivity was specifically suppressed by the antibody.
  • sucrose density gradient centrifugation was performed to fractionate and purify the pseudo-Ipsendai virus having a genome lacking the F gene and the F and HN genes.
  • the virus solution was layered on the sucrose solution in which a gradient of 20 to 60% was formed, and ultracentrifuged at 29,000 rpm for 15 to 16 hours with SW41 mouth overnight (Beckman). After ultracentrifugation, a hole was made in the bottom of the tube, and fractionation was performed using a fraction collector at 300 ⁇ 1 each. For each fraction, it should be a pseudo-type Sendai virus that has a genome lacking the F gene or F and HN genes and has VSV-G protein in the coat.
  • the surface of the infected cells expressing GFP was observed.
  • viruses having a genome in which the F gene has been deleted (SeV / ⁇ F, and SeV / AF (VSV-G) sieved with VSV-G) have been used together with Sendai viruses having the original coat, An agglutination reaction was observed on the surface of the infected cells.
  • the infection efficiency of VSV-G pseudo-Ipsendai virus having a genome lacking the F gene in cultured cells was determined by measuring the amount of GFP expressed in living cells on day 3 after infection using flow cytometry. Pseudo-type Sendai virus with F gene-deleted genome and Sendai virus with original coat, almost the same infection efficiency The comparison was performed using LLC-MK2 cells showing the above as a control. As a result, the infection efficiency of human ovarian cancer cells, HRA, was almost the same as that of LLC-MK2 cells, but the T cell line Jurkat cells lacked about twice the F gene compared to control cells. Increased infection efficiency of VSV-G pseudotype Sendai virus having the lost genome was observed (Fig. 54).
  • NGF / SeV / ZF Reconstitution of NGF / SeV / ZF was performed according to the above-mentioned “envelope plasmid + F expressing cell overlay method”.
  • the measurement in Thailand was performed according to the method using an anti-SeV polyclonal antibody.
  • NGF-N and NGF-C were performed using NGF-N and NGF-C.
  • NGF-N forward: ACTTGCGGCCGCCAAAGTTCAGTAATGTCCA TGTTGTTCTACACTCTG (SEQ ID NO: 33);
  • NGF-C reverse: ATCCGCGGC CGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGCCTCTTCTTGTAGCCTTCCTGC.
  • NGF / SeV / AF detected a band specific to NGF under RT conditions. No band was detected in the control group ( Figure 55, bottom).
  • NGF / SeV / ⁇ F NGF / SeV / ⁇ F-GFPii LLCMK2 / F cells
  • NGF / SeV and GFP / SeV infect LLC-MK2 cells with moi0.01, 7.5 ⁇ g / mL Trypsin ( The cells were cultured for 3 days in MEM medium containing GIBCO) and no serum. Three days later, after almost 100% of the cells were infected, the cells were replaced with MEM medium without Trypsin and serum, and cultured for another 3 days.
  • LLC-MK2 / F cells were infected with F-deficient SeV (NGF / SeV / AF, NGF / SeV / ⁇ F-GFP) (see FIG. 55). If 1) or 3) is infected, that is, if nearly 100% of the cells are infected from the beginning, naturally, experiments showing the same results can be performed on F non-expressing cells.
  • F-deficient SeV NGF / SeV / AF, NGF / SeV / ⁇ F-GFP
  • NGF protein was quantified using the ELISA Kit, NGF Emax Immuno Assay System (Promega). The protocol followed the instructions in the package insert.
  • the NGF / SeV / AF, 32.4 // g / mL, 37.4 g / mL, and 10.5 g / mL NGF proteins were present in the culture supernatants of infected cells of NGF / SeV / AF, NGF / SeV / ⁇ F-GFP, and NGF / SeV, respectively. confirmed.
  • NGF / SeV / AF, NGF / SeV / ⁇ F-GFP infected cell culture supernatant contains high concentration of NGF protein, which is comparable to the amount of NGF protein in NGF / SeV infected cell culture supernatant. In addition, it was confirmed that a sufficient amount of NGF was expressed by F-deleted SeV.
  • NGF protein The in vitro activity of NGF protein was measured using the survival-sustaining activity of the dorsal root ganglion, a sensory nerve of chickens, in the primary neuronal cell dispersion culture system (Nerve Growth Factors (Wiley, New York), pp. 95-109 (1989)).
  • Dorsal root ganglia were removed from 10-day-old chick embryos, treated with 0.25% Trypsin (GIBC0) at 37 ° C for 20 minutes, and dispersed.
  • NGF protein as a control or the culture supernatant prepared above after the infection with SeV was added.
  • the cells are observed under a microscope, Alamer blue (CosmoBio) is added, and the reduction activity by mitochondria is used as an index (measurement of the fluorescence intensity at 590 nm excited in a 530 plate).
  • LLC-MK2 / F cells in which the expression of F protein was induced were placed in a chamber bar glass, cultured overnight, and the medium was removed and washed once with PBS. -Fixed at? 83 for 5 minutes. After washing the cells once with PBS, the cells were treated with 0.1% Triton X100-PBS for 5 minutes, and then the anti-F protein monoclonal antibody (y-236) (100-fold dilution) and the FITC-labeled goat anti-Peagle IgG antibody ( The cells were treated in the order of ( ⁇ 200) and finally washed with PBS and observed with a laser microscope.
  • a multicloning site was added to the SeV vector. The following two methods are used.
  • the method of introduction is as follows: first, a fragment (2644 bp) of pSeV18 + digested with Eag I, a fragment (3246 bp) digested with Clal, a fragment digested with Clal / Eco RI (5146 bp), and Eco RI
  • the digested fragment (5010 bp) was separated by agarose gel electrophoresis, the corresponding band was cut out, and recovered and purified using a QIAEXI I Gel Extraction System (QIAGEN).
  • the fragment digested with Eag I was ligated to LITMUS38 (manufactured by NEW ENGLAND BI0LABS), the fragment digested with Cla I, the fragment digested with Clal / Eco RI, and the fragment digested with Eco RI were pBluescriptl KS + (manufactured by STRATAGENE).
  • LITMUS38 manufactured by NEW ENGLAND BI0LABS
  • the fragment digested with Cla I the fragment digested with Clal / Eco RI
  • Eco RI were pBluescriptl KS + (manufactured by STRATAGENE).
  • STRATAGENE Quickchange Site-Directed Mutagenesis kit
  • Sal I (sense strand) 5,-ggagaagtctcaacaccgtccaccc to destroy restriction enzyme sites aagataatcgatcag-3 '(SEQ ID NO: 35), (antisense strand) 5' -ctgatcgattatctt gggtggacggtgttgagacttctcc-3 '(SEQ ID NO: 36), Nhe I: (sense strand) 5, -gtat atgtgttcagttgagcttgctgtcggtctaagg No .: 3 7), (antisense strand) 5 '-gccttagaccgacagcaagctcaactgaacacatatac-3' (distribution number: 38), Xho I: (sense strand) 5 '-caatgaactctctagagaggctggagtcactaaagagttacctgg-3' (Toriki
  • the chain is 5) -ggccgcttaattaacggtttaaacgcgcgccaacagtgttgataa gaaaaacttagggtgaaagttcatcac-3 '(distribution ij number: 51), (antisense strand) 5' -ggc
  • each synthetic MA is phosphorylated, annealed at 85 ° C for 2 minutes, 65 ° C for 15 minutes, 37 ° C for 15 minutes, and room temperature for 15 minutes, and incorporated into SeV cDNA. is there
  • the subcloning is performed by subcloning a multiple cloning site such as pUC18 or pB1uescript II by PCR with a primer containing a termination signal, an intervening sequence and a start signal, and incorporating this into SeV cDNA.
  • Virus reconstitution with the resulting cDNA is performed as described above. Industrial applicability
  • a Paramyxomycete virus vector deficient in an envelope gene there is provided a Paramyxomycete virus vector deficient in an envelope gene.
  • the present invention establishes, for the first time, a new envelope gene-deficient vector system that can be put into practical use using a minus-strand RNA virus as a basic skeleton.
  • the defective Sendai virus vector of the present invention has an extremely high gene transfer efficiency for a wide variety of cell types and has the ability to express a foreign gene surprisingly. Furthermore, since it is continuously expressed in infected cells and does not release secondary infectious virus particles, it is a highly safe vector that completely eliminates virus transmission.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

エンベロープ遺伝子欠損パラミクソ科ウィルスベクター 技術分野
本発明は、 エンベロープ遺伝子欠損型パラミクソウィルスベクタ一に関する, 景技 fe「
これまでの遺伝子治療の臨床研究のアプローチの多くはレトロウィルス、 アデ ノウィルスおよびアデノ随伴ウィルスなどのウィルスベクタ一が利用されている 。 これらの遺伝子治療用ベクターは、 導入効率および持続発現に制限があり、 ベ クタ一自体に細胞毒性及び免疫原性があるなど、 医学応用上の大きな問題が存在 する (Lamb,R.A. & Kolakof sky， Dリ Paramyxovindae : the viruses and their repl ication, in Fields Virology, 3rd edn, (Edited by B. N. Fields, D.M. Knipe & P.P Howley) pp.1177-1204(Phi ladelphia, Lippincott-Raven. ( 1996 ) )。 これ らの対策として新たなベクターがレンチウィルスや HSVをベースに提案されてお り、 また既存べクタ一の改良研究が精力的になされている。 しかしながら、 これ らのベクタ一はいずれも生活環において、 核内で DNAの形態で存在する。 従って、 患者の染色体とのランダムな相互作用に関わる安全性への危惧は完全に回避する ことは難しい。
最近のリバースジエネテックス技術の急速な進歩により、 従来開発が遅れてい た RNAウィルスをベースにしたべクタ一の開発が可能となりつつある。 組み換え RNAウィルスは高い遺伝子導入効率と発現能力を示し、遺伝子治療用ベクターとし ての高いポテンシャリティが示唆される （Roberts, A. & Rose, J. ，K. ， Virology 247, 1-6 ( 1998) ; Rose, J. ， Proc. Natl . Acad. Sci . USA 94, 14998-15000 ( 1996) ; Palese, P. et. al . ， Proc. Natl . Acad. Sci . USA 93, 11354-11358 ( 1996) )。 しかし、 実用的に利用可能な弱毒ウィルスの欠損型ゲノム由来のパラミクソウイ ルスベクターはまだ報告されていない。
マイナス鎖 RNAをゲノムに持つパラミクソウィルスベクターは、レトロウィルス 、 DNAウィルス、 またはプラス鎖 RNAウィルスベクターとは大きく異なる幾つかの 特徴を持っている。 そのゲノムまたはアンチゲノムは直接に mRNAとしては機能せ ず、 ウィルスのタンパク質合成やゲノム複製を開始させることはできない。 ウイ ルスの RNAゲノ ムもアンチゲノムも常に リボ核酸タ ンパク質複合体 （ ribonucleoprote in complex; RNP) の形で存在し、 プラス鎖 RNAウィルスに見られ るような、 mRNAsが相補的な裸のゲノム RNAにハイプリダイズしてゲノムの RNPへの ァセンブリを妨害するといったアンチセンスの問題が殆ど起きない。 これらのゥ ィルスは自身の RNAポリメラーゼを持っており、 RNP複合体を鍩型にしてウィルス mRNAの転写またはウィルスゲノムの複製を行う。特筆すべきことにマイナス鎖 RNA
(nsRNA) ウィルスは宿主細胞の細胞質でのみ増殖し、 DNAフヱ一ズを持たないた め染色体への組み込み（integration)は起こらない。更には RNA同士の相同組み換 えも認められていない。これらの性質はマイナス鎖 RNAウィルスの遺伝子発現べク 夕一としての安定性と安全性に大きく寄与するものと思われる。
本発明者らはネガティブ鎖 RNAウィルスの中でもセンダイウィルス （Sendai virus; SeV) に注目してきた。 SeVは非分節型マイナス鎖 RNAウィルスで、 パラミ クソゥイノレス (paramyxovirus) に属し、 murine parainfluenza virusの——種であ る。このウィルスは二つのエンベロープ糖夕ンパク質であるへマグルチニン-ノィ ラミニダ一ゼ (hemagglutinin— neuraminidase; HN) とフユ一ジョン夕ンノ、。ク質 ( fusion protein; F) を介して宿主細胞膜に接着、 膜融合を起こし、 効率的に自分 の RNAポリメラーゼとリボヌクレオプロテイン （RNP) 複合体の形で存在する RNA ゲノムを細胞質に放出し、 そこでウィルスの mRNAの転写及びゲノムの複製を行う
(Bitzer, M. et al .， J. Virol . 71 (7) : 5481- 5486， 1997)。 ウィルスェンベロー プ蛋白質 Fは活性の無い前駆蛋白 （F0 ) として合成され、 トリプシンによるタン パク質分解 (proteolytic cleavage) で Fl と F2に解裂され (Kido, H. et al .， Biopolymers (Peptide Science ) 51 ( l ) : 79-86, 1999)、 活性型蛋白質となり膜融 合を引き起こす。 このウィルスはヒトに対して病原性がないと言われている。 ま た、 ラボ弱毒株 （Z strain) も分離されており、 自然宿主であるげつ歯類に対し 軽度の肺炎を誘発する程度である。 この株はパラミクソウィルスの転写複製機構 等の分子レベルにおける研究モデルとして広く用いられており、 またハイプリ ド —マの作製にも使われてきた。 このような高い安全性の外にこのウィルスは細胞 株または鶏卵で 10 11 fu/mlという高い生産タイ夕一を示す。 最近成功したネガ ティブ鎖 RNAウィルスベクターの cDNAからの回収システムの中で、センダイウィル スの場合は特に高い再構成効率を示している。 外来遺伝子を導入した組み換え型 野生ウィルスでは効率的且つ安定的に導入外来遺伝子を発現する能力が注目され ている。
このように、マイナス鎖 RNAウィルスは遺伝子導入べクタ一として多くの利点を 有するが、 遺伝子治療に応用するには、 細胞に感染させた場合、 感染性粒子が放 出されない安全性の高いベクターを開発することが望まれる。 このためには、 野 生型のウィルス産生能を欠損させた欠損型ウィルスを大量生産する技術が必要で ある。 しかし、 これまで応用可能なエンベロープ遺伝子欠損型ゲノムをべ一スに したベクターの開発はまだ成功していない。
発明の開示
本発明は、 エンベロープ遺伝子を欠損したパラミクソウィルスベクタ一を提供 することを課題とする。
伝播性を欠く、 遺伝子治療により適したパラミクソウィルスベクターを構築す るため、 本発明者らは、 SeVの F遺伝子をゲノム上から欠失させ、 GFP遺伝子をレポ —夕一として導入した cDNAを用いて、センダイウィルスの F蛋白を発現する細胞株 で感染性ウィルス粒子を回収する方法を確立した。 この F遺伝子欠損ウィルスべ クタ一は、 初代培養したラットの神経細胞、 primitiveなマウスの血液幹細胞、 ヒ 卜の正常細胞など多様な細胞に高い効率で遺伝子導入され、 高い遺伝子発現を示 した。 さらに、 in vivoではラッ トの脳に投与して高発現が得られた。 この F遺伝 子欠損型 SeVベクタ一は感染した細胞で比較的に長く持続的にかつ強力に遺伝子 を発現し、 二次的に感染性ウィルス粒子を産生せず、 隣接した細胞へも伝播しな いため、 遺伝子治療用ベクターとしての有用性が示唆された。
さらに本発明者らは、 F遺伝子と HN遺伝子の両方を欠損させた SeVベクター cDNA を作製し、センダイウィルスの F蛋白および HN蛋白質を発現する細胞株で感染性ゥ ィルス粒子を回収する方法を確立した。 また、 この SeVベクタ一 cDNAを、 F発現細 胞に導入することによって、 HN蛋白質を欠失した SeVベクターを作製することにも 成功した。
このように本発明は、マイナス鎖 RNAウィルスを基本骨格とした実用化可能な新 しいエンベロープ遺伝子欠損型べクタ一システムを初めて確立するものである。 F 遺伝子欠損、 または FHN遺伝子欠損ゲノム cDNAから、ヘルパー細胞を利用して感染 性欠損ウィルス粒子の回収に成功したことは、 センダイウィルスの優れた特徴を 生かした新規な遺伝子治療用ベクターの研究開発に道を開くものである。
本発明の欠損型センダイウィルスベクターは遺伝子導入効率も広範な細胞種に 対して極めて高く外来遺伝子を驚異的に発現する能力を持っている。 さらに、 感 染細胞で持続的に発現し、 2次的な感染性ウィルス粒子を放出しないことから、 ウィルスの伝播性を完全に無く した安全性の高いベクターであることが判明した o
RNAウィルスではゲノムの安定性の問題が指摘され得るが、 SeVベクタ一による 異種遺伝子発現の結果ではウィルスを連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認め られず、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Yu， D. et al . Genes cel ls 2, 457-466 ( 1997))。 このマイナス鎖 RNAウィルスレプリ コンをべ一スにしたベクタ一は、 既に成功しているポジティブ鎖 （positive- strand) RNAウィルスであるセムリキ森林ウィルス （Semi iki forest virus) また はシンドビスウィルス （Sindbis viruses) のレプリコンをべ一スにしたウィルス ベクターに比べ、 ゲノムの安定性や、 力プシド構造タンパク質を持たないことに よる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（flexibi l ity)など性質 上幾つかのメリッ卜がある。野生型センダイウィルスベクターは、外来 DNAを少な くとも 4 kbpまで導入可能であり、欠失型ベクターではさらに導入サイズが大きく なる。 転写ュニットを付加することによって 2種類以上の遺伝子を同時に発現す る事が可能かもしれない。 このセンダイウィルスのレプリコンをベースにしたべ クタ一は理論的には細胞質で多コピーに複製された RNPが細胞の分裂に伴い娘細 胞にも分配されるため持続発現が期待される。 実際ある種の血液系細胞では in vitro実験によりそれが証明されている。 さらに、 本発明者等は、 センダイウィル スベクターが血球系の細胞、 特に顆粒球系細胞に高い効率で遺伝子導入され、 c- kit陽性の primitive細胞にも導入されることを確認していることから、 このべク 夕一は非常に広い組織適用範囲を持つ応用可能性の高いベクターになり得ること が示唆される。
即ち本発明は、 エンベロープ遺伝子欠損センダイウィルスベクターに関し、 よ り具体的には、
( 1 ) ( a )パラミクソ科ウィルスの少なくとも一つのエンベロープタンパク質を 発現しないように改変されたパラミクソウィルスに由来する （一） 鎖一本鎖 RNA 、 および （b ) 該 （―） 鎖一本鎖 RNAと結合するタンパク質、 からなる複合体を含 むパラミクソ科ウィルスベクタ一、
( 2 ) ( - ) 鎖一本鎖 RNAが NPタンパク質、 Pタンパク質、 および Lタンパク質を発 現し、 Fタンパク質および/または HNタンパク質を発現しないように改変されてい る、 （ 1 ) に記載のベクタ一、
( 3 ) (―) 鎖一本鎖 RNAから発現しないように改変されたエンベロープタンパク 質の少なくとも一つを含む、 （ 1 ) または （2 ) に記載のベクタ一、 (4) VSV- Gタンパク質を含む、 （ 1 ) から （3) のいずれかに記載のベクター、
(5) (一）鎖一本鎖 RNAがセンダイウィルスに由来する、 （ 1)から （4)のいず れかに記載のベクター、
(6) (一） 鎖一本鎖 RNAがさらに外来遺伝子をコードしている、 （1) から （5) のいずれかに記載のベクタ一、
(7) ( 1 )力 ら （6)のいずれかに記載のベクターに含まれる（一）鎖一本鎖 RNA またはその相補鎖をコードする DNA、
(8) ( 1) から （6) のいずれかに記載のベクターの製造方法であって、
(a) パラミクソ科ウィルスの少なくとも一つのエンベロープタンパク質を発 現しないように改変されたパラミクソウィルスに由来する（一）鎖一本鎖 RNAまた はその相補鎖をコ一ドするベクター DNAを、エンベロープタンパク質を発現する細 胞に導入して発現させる工程、 および
(b) 該細胞を培養し、 その培養上清からウィルス粒子を回収する工程、 を含 む方法、
(9) ( 1) から （6) のいずれかに記載のベクターの製造方法であって、
(a) パラミクソ科ウィルスの少なくとも一つのエンベロープタンパク質を発 現しないように改変されたパラミクソウィルスに由来する （一）鎖一本鎖 RNA、 お よび該 （―）鎖一本鎖 RNAと結合するタンパク質、 からなる複合体を、 ェンベロー プタンパク質を発現する細胞に導入する工程、 および
(b) 該細胞を培養し、 その培養上清からウィルス粒子を回収する工程、 を含 む方法、
(10) 工程 （b) における細胞の培養が、 エンベロープタンパク質を発現する 細胞との共培養である、 （8) または （9) に記載の方法、
(1 1) 工程 （b) における細胞の培養において、 該細胞に、 エンベロープタン パク質を発現する細胞を重層して培養を行う、 （8) または （9) に記載の方法、
( 12) 細胞が発現するエンベロープタンパク質の少なくとも 1つが、 前記 （一 )鎖一本鎖 RNAから発現しないように改変されたエンベロープタンパク質の少なく とも 1つと同一である、 （8) から （ 1 1 ) のいずれかに記載の方法、
( 1 3 )細胞が発現するエンベロープタンパク質の少なくとも 1つが VSV- Gタンパ ク質である、 （8 ) から （ 1 2 ) のいずれかに記載の方法、 に関する。
なお、 本発明において 「ベクタ一」 とは、 宿主内で外来遺伝子を発現させるた めの核酸分子をパッケージングしたウィルス粒子を指す。
また、 パラミクソウィルス科ウィルスの 「NP、 P、 M、 F、 HN、 および L遺伝子」 とは、 それぞれヌクレオキヤプシド、 ホスホ、 マトリックス、 フュージョン、 へ マグルチニン-ノィラミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコ一ドする遺伝子のこと を指す。 パラミクソウィルス亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、 一般 に次のように表記される。 また、 一般に、 NP遺伝子は 「N遺伝子」 と表記されるこ ともある。
レスピロウィルス属 N P/C/V M F HN - L
ルブラウィルス属 N P/V M F HN (SH) L
モーピリウィルス属 N P/C/V M F H - L
例えばパラミクソウィルス科 （Paramyxoviridae ) のレスピロウィルス （ Respirovirus) に分類されるセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデ一夕べ —スのァクセッション番号は、 NP遺伝子については M29343、 M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218, P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, XI 7008, M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、 F遺伝子に ついては D00152, D 11446, D17334, D17335, M30202, M30203, 30204, M69046, X00152, X0213U HN遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X5613K L遺伝子については D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886を参照のこと。
本発明は、 エンベロープ遺伝子欠損型のパラミクソ科ウィルスベクターに関す る。 該ウィルスベクタ一は、 少なくとも一つのエンベロープタンパク質を発現し ないように改変されたパラミクソウィルスに由来する（一）鎖一本鎖 RNAを含むこ とを特徴とする。パラミクソウィルスは、 一般に、 エンベロープの内部に RNAと夕 ンパク質からなる複合体 （リボヌクレオプロテイン； RNP) を含んでいる。 RNPに 含まれる RNAはパラミクソウィルスのゲノムである （一）鎖 （ネガティブ鎖） の一 本鎖 RNAであり、 タンパク質はこの RNAに結合して複合体を形成している。 本発明 のパラミクソ科ウィルスベクターは、 （a )パラミクソ科ウィルスの少なくとも一 つのエンベロープ夕ンパク質を発現しないように改変されたパラミクソウィルス に由来する （―） 鎖一本鎖 RNA、 および （b ) 該 （一） 鎖一本鎖 RNAと結合する夕 ンパク質、からなる複合体をそのゥィルス粒子内に含んでいる。 （―）鎖一本鎖 RNA と結合するタンパク質とは、 該 （―） 鎖一本鎖 RNAと直接および/または間接に結 合し、 該 （―）鎖一本鎖 RNAと複合体を形成するタンパク質のことを言う。 一般に 、 パラミクソウィルスの（一）鎖一本鎖 RNA (ゲノム RNA) には、 NPタンパク質、 P タンパク質、 および Lタンパク質が結合している。この RNPに含まれる RNAがウィル スゲノムの転写および複製のための鐯型となる （Lamb, R.A. , and D. Kolakofsky, 1996， Paramyxoviridae The viruses and their repl ication, pp. 1177-1204. In Fields Virology, 3rd edn. Fields, B . N. , D. M. Knipe, and P. M. Howley et al . (ed. )， Raven Press, New York, N. Y. )。 本発明の複合体には、 パラミクソ ウィルスに由来する（―）鎖一本鎖 RNAおよびそれに結合するパラミクソウィルス に由来するタンパク質からなる複合体が含まれる。 本発明のベクタ一は、 例えば パラミクソウィルスの （一） 鎖一本鎖 RNAにこれらのタンパク質 （NP、 P、 および L タンパク質）が結合した RNPを含むものである。一般に、パラミクソウィルスの RNP 複合体は、 細胞内で自立的に P複合体を複製する能力を有する。 このように、 細 胞に導入されたべクタ一は細胞内で RNPを増幅させることにより、遺伝子（複合体 に含まれる RNA)のコピー数を増やす。 これにより、 外来遺伝子を持つベクタ一か らの外来遺伝子の高い発現がもたらされる。 本発明のベクターは、 好ましくは、 細胞内で複合体 （MP) に含まれる RNAを複製する能力を有するものである。 本発明を適用可能なパラミクソ科ウィルスとしては、 センダイウィルスに加え 、 例えば、 麻疹ウィルス、 サルパラインフルエンザウイルス （SV5)、 ヒトパライ ンフルェンザウィルス 3型が挙げられるが、 これらに制限されない。
ウィルスベクタ一中の （一） 鎖一本鎖 RNAは、 典型的には、 NPタンパク質、 P夕 ンパク質、および Lタンパク質を発現し、 Fタンパク質および/または HNタンパク質 を発現しないように改変されている。
センダイウィルス （Sendai virus; SeV) の場合、 天然のウィルスのゲノムサイ ズは約 15, 000塩基で、 ネガティブ鎖は 3'の短いリーダー領域に続き、 NP (ヌクレ ォキヤプシド）、 P (ホスホ）、 M (マトリックス）、 F (フユ一ジョン）、 HN (へマグ ルチニン-ノィラミニダ一ゼ）、 および L (ラージ）蛋白質をコ一ドする 6つの遺伝 子が並んでおり、 短い 5' トレイラ一領域を他端に有する。 本発明においては、 こ のうち F、 HN、 および M遺伝子のうちいずれか、 あるいはそれらの組み合わせを 欠損するゲノムを設計することにより、 エンベロープタンパク質を発現しないよ うに改変することができる。 好ましくは F遺伝子または HN遺伝子、 あるいは F遺伝 子と HN遺伝子の両方を欠損している。 RNPの形成にはこれらの蛋白質は必要ないた め、 NP、 P、 および Lタンパク質の存在下でこのゲノム RNA (ポジティブ鎖またはネ ガティブ鎖）を転写させることにより、本発明の RNPを製造することができる。 RNP の形成は、 例えば LLC- MK2細胞などで行わせることができる。 NP、 P、 および Lタン パク質の供給は、 各遺伝子をコードする発現べクタ一を細胞に導入することによ り行われ得る （実施例参照）。 また、 各遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込まれて いてもよい。 RNPを形成させるために発現させる NP、 P、 および L遺伝子は、 べク 夕一のゲノムにコードされる NP、 P、および L遺伝子と完全に同一である必要はな い。すなわち、 これらの遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列は、 MPゲノム がコードするタンパク質のァミノ酸配列そのままでなくとも、ゲノム RNAと結合し 、 細胞内で RNPの複製を行う活性を持つ限り、 変異を導入したり、 あるいは他のゥ ィルスの相同遺伝子で代用してもよい。一端 RNPが形成されれば、 この RNPから NP 、 P、 および L遺伝子が発現され、 細胞内で自立的に RNPが複製し、 ウィルスベクタ 一が生産される。
細胞内でベクタ一を再構成させる時にエンベロープ夕ンパク質を細胞に発現さ せれば、 このエンベロープタンパク質がウィルスベクターに取り込まれ、 ェンべ ロープタンパク質による感染性を保持するウィルスベクターを生産することがで きる。 このようなベクターは、 一度細胞に感染すると、 細胞内で RNPを増殖させる ことはできても、 それ自身はエンベロープ遺伝子を持たないため、 初めと同じよ うなエンベロープ夕ンパク質を持つウィルスを再度生産することはできない。 こ のようなベクターは、 特に遺伝子治療など高い安全性が要求される分野に極めて 有用である。
ウィルス再構成の際に、 （―） 鎖一本鎖 RNAにおいて発現しないように改変され たエンベロープタンパク質、 すなわちゲノムにおいて欠損させたエンベロープ遺 伝子を発現させれば、 野生型ウィルスと同等の感染性を有するウィルスベクター を製造することができる。 また、 ゲノムにおいて欠損させたエンベロープ遺伝子 の一部を発現させることも考えられる。例えば、 F遺伝子と HN遺伝子の両方を欠損 するゲノムに対して Fタンパク質のみを発現させると、 Fタンパク質をェンベロ一 プに有するウィルスベクターが生産される。 HNタンパク質を持たず Fタンパク質の みを持つウィルスは、ァシァ口糖蛋白リセプ夕一 (ASG-R)を介して肝臓の細胞に特 異的に感染するべクタ一として利用され得る。 このように、 （一） 鎖一本鎖 RNAに おいて発現しないように改変されたエンベロープタンパク質の少なくとも 1つを 含むパラミクソ科ウィルスベクタ一も、 本発明に含まれる。
また、 （一） 鎖一本鎖 RNAにおいて発現しないように改変されたエンベロープ夕 ンパク質とは異なるエンベロープタンパク質を用いて本発明のベクターを再構成 させることも可能である。 このようなエンベロープ夕ンパク質に特に制限はない 。 例えば、 他のウィルスのエンベロープタンパク質、 例えば水疱性口内炎ウィル ス （VSV) の Gタンパク質 （VSV- G) を挙げることができる。 本発明のパラミクソ科 ウィルスベクターは、 VSV- G夕ンパク質などのように、 ゲノムが由来するウィルス 以外のウィルスに由来するエンベロープ夕ンパク質を含むシユードタイプウィル スベクタ一が含まれる。
本発明のウィルスベクタ一は、通常、 （a )パラミクソ科ウィルスの少なくとも 一つのエンベロープ夕ンパク質を発現しないように改変されたパラミクソウィル スに由来する （一） 鎖一本鎖 RNAまたはその相補鎖をコードするベクター DNAを、 エンベロープタンパク質を発現する細胞（ヘルパー細胞）に導入して発現させ、 （ b ) 該細胞を培養し、 その培養上清からウィルス粒子を回収することにより調製 することができる。 ベクター DNAを発現させる時に、 NP、 L、 および Pタンパク質を 共発現させておくことで RNPが形成され、エンベロープタンパク質を持つウィルス が構築される。
ヘルパー細胞で発現させるベクタ一 DNAは、 本発明のベクターに含まれる （一） 鎖一本鎖 RNA (ネガティブ鎖） またはその相補鎖 （ポジティブ鎖） をコードしてい る。例えば、 （― )鎖一本鎖 RNAまたはその相補鎖をコードする DNAを T7プロモー夕 —の下流に連結させ、 T7 RNAポリメラ一ゼにより RNAに転写させる。 ベクタ一 DNA は、 大腸菌で増幅できるようにプラスミ ドにクロ一ニングされていてもよい。 細 胞内で転写させる鎖は、 ウィルスのポジティブ鎖でもネガティブ鎖でもよいが、 ポジティブ鎖が転写されるようにすることが再構成の効率を上げるためには好ま しい。
ヘルパー細胞としては、 エンベロープタンパク質を発現する細胞が用いられる 。 上記のように、 ヘルパー細胞は、 ウィルスベクターにおいて欠損している全て のエンベロープ遺伝子のタンパク質を発現する細胞に限定されず、 例えば、 F，HN 遺伝子欠損センダイウィルスベクタ一 DNAに対しては、 Fタンパク質のみを発現す る細胞をヘルパー細胞として用いることもできる。 また、 該ウィルスベクタ一に おいて欠損しているエンベロープ遺伝子がコードするタンパク質とは異なるェン ベロ一ブタンパク質を発現する細胞でありうる。 例えば、 上記のようにェンベロ —プタンパク質として、 パラミクソ科ウィルスのエンベロープ夕ンパク質ではな いエンベロープタンパク質（例えば、 VSV-Gタンパク質） を用いることも可能であ る。
例えば、 エンベロープ遺伝子が欠損した組換えセンダイウィルスベクタ一ゲノ ムを発現するプラスミ ドを、 欠損したエンベロープ蛋白質を発現するべクタ一な らびに、 NP、 P/Cおよび L蛋白質の発現べク夕一と共に宿主細胞にトランスフエク シヨンすることにより、 ウィルスベクタ一の再構成を行うことができる。 また、 例えば、 F遺伝子が染色体に組込まれた宿主細胞を用いて製造することもできる。 ウィルスゲノム以外から供給されるこれらの蛋白質群は、 そのアミノ酸配列はゥ ィルス由来の配列そのままでなくとも、 核酸の導入における活性が天然型のそれ と同等かそれ以上ならば、 変異を導入したり、 あるいは他のウィルスの相同遺伝 子で代用してもよい。 一般に、 エンベロープタンパク質は細胞毒性を示すものが 多いため、 誘導性プロモーターの制御下にベクタ一の再構成時にのみ発現させる こともできる （実施例参照）。
RNPまたはウィルスが形成されれば、 この RNPまたはウィルスを上記のヘルパー 細胞に再度導入して培養することにより、 本発明のベクターを増幅することがで きる。この過程は、 （a )パラミクソ科ウィルスの少なくとも一つのエンベロープ タンパク質を発現しないように改変されたパラミクソウィルスに由来する （一） 鎖一本鎖 RNA、 および該 （一） 鎖一本鎖 RNAと結合するタンパク質、 からなる複合 体を、 エンベロープタンパク質を発現する細胞に導入する工程、 および （b ) 該 細胞を培養し、 その培養上清からウィルス粒子を回収する工程、 を含む。
RNPを細胞に導入するには、例えばリボフェクトァミンやポリカチォニックリポ ゾームなどと共に複合体を形成させて導入することが可能である。 具体的には、 種々のトランスフエクシヨン試薬が利用できる。 例えば、 DOTMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN #301305)、 D0TAPヽ DOPEヽ DOSPER (Boehringer #1811169) な どが挙げられる。 エンドソ一ム中での分解を防ぐため、 クロ口キンを加えること もできる （Calos, M.P. , 1983, Proc. Natl . Acad. Sci . USA 80 : 3015)。
上記のようにして細胞においてウィルスべク夕一が構築されれば、 この細胞を 、 エンベロープタンパク質を発現する細胞と共培養することにより、 ウィルスべ クタ一をさらに増幅することができる。 このような方法としては、 例えば実施例 1 2に記載したように、 ウィルスを産生する細胞にエンベロープタンパク質を発 現する細胞を重層する方法が好適である。
エンベロープタンパク質としては、 ウィルスのエンベロープ夕ンパク質以外に も、 例えば、 特定の細胞に接着しうるような、 接着因子、 リガンド、 受容体等由 来のポリペプチドを細胞外領域に有し、 ウィルスエンベロープ由来のポリべプチ ドを細胞内領域に有するキメラ夕ンパク質などを用いることが可能である。 これ により、 特定の組織を標的とするベクターを作り出すこともできる。 また、 本発 明のウィルスベクターは、 例えば、 免疫原性を低下させるために、 または、 RNA の転写効率や複製効率を高めるために、 ベクターに含まれるウィルス遺伝子が改 変されたものであってもよい。
本発明のウィルスベクタ一は、 （一） 鎖一本鎖 RNA中に外来遺伝子をコードする RNAを含みうる。外来遺伝子としては、標的細胞中で発現させたい所望の遺伝子を 用いることが可能である。 例えば、 遺伝子治療などを目的とする場合には、 該ゥ ィルスべクタ一 DNAに対象となる疾患の治療用遺伝子を挿入する。ウィルスベクタ —DNAに外来遺伝子を導入する場合は、 例えば、 センダイウィルスベクタ一 DNAに おいては、転写終結 (E)配列と転写開始（S)配列との間などに、 6の倍数の塩基数を 有する配列を挿入することが望ましい (Journal of Virology, Vol .67, No.8， 1993， p.4822-4830)。 外来遺伝子は、 ウィルスの各遺伝子 （NP、 P、 M、 F、 HN、 お よび L遺伝子） の前または後ろに挿入することができる （実施例参照）。 前後の遺 伝子の発現を妨げないようにするため、 外来遺伝子の前または後ろに適宜 E-I- S 配列 （転写開始配列一介在配列—転写終結配列） またはその部分を挿入する。 挿 入した外来性遺伝子の発現量は、 外来遺伝子の上流に付加する転写開始配列の種 類により調節することができる。 また、 遺伝子挿入の位置、 また遺伝子の前後の 塩基配列により調節しうる。 例えば、 センダイウィルスにおいては、 挿入位置が (― )鎖 RNAの 3'端に近いほど（野生型ウィルスのゲノム上の遺伝子配置において は、 NP遺伝子に近いほど）、 挿入された遺伝子の発現量が高い。外来遺伝子の高い 発現を得るためには、 外来遺伝子を NP遺伝子の上流 （マイナス鎖においては 3'側 )または NP遺伝子と P遺伝子の間など、ネガティブ鎖ゲノムにおいて上流領域に挿 入することが好ましい。逆に、 挿入位置がネガティブ鎖 RNAの 5'端に近いほど（野 生型ウィルスのゲノム上の遺伝子配置においては、 L遺伝子に近いほど）、 挿入さ れた遺伝子の発現量が低くなる。 外来遺伝子の発現を低く抑えるためには、 例え ばネガティブ鎖の最も 5'側、すなわち野生型ウィルスゲノムにおいては L遺伝子の 下流（ネガティブ鎖においては L遺伝子の 5'隣接部位）、 または L遺伝子の上流（ネ ガティブ鎖においては L遺伝子の 3'隣接部位）に外来遺伝子を挿入する。外来遺伝 子を容易に挿入できるようにするために、 挿入部位にクロ一ニングサイ トを設計 することができる。 クローニングサイ トは、 例えば制限酵素の認識配列とするこ とができる。ゲノムをコードするべクタ一 DNA中の当該制限酵素部位に外来遺伝子 断片を挿入することができる。 クローニングサイ トは、 複数の制限酵素認識配列 を有する、 いわゆるマルチクロ一ニングサイ 卜としてもよい。 本発明のベクター は、 このように挿入した以外に位置に他の外来遺伝子を保持していてもよい。 外来遺伝子を有する組換えセンダイウィルスベクタ一は、 例えば、 Kato，A. et al . , 1997， EMBO J. 16 : 578-587及び Yu, D. et al . , 1997, Genes Cel ls 2 : 457-466 の記載に準じて、 次のようにして構築することができる。
まず、 所望の外来遺伝子の cDNA塩基配列を含む DNA試料を用意する。 DNA試料は 、 25ng/〃l以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミ ドと確認できることが好ま しい。 以下、 外来遺伝子を Notl部位を利用してウィルスゲノムをコードする DNA に挿入する場合を例にとって説明する。 目的とする cDNA塩基配列の中に Notl認識 部位が含まれる場合は、 部位特異的変異挿入法などを用いて、 コードするァミノ 酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、 Notl部位を予め除去しておくこ とが好ましい。 この試料から所望の遺伝子断片を PCRにより増幅回収する。増幅さ れた断片の両端が Notl部位とし、 さらに一端にセンダイウィルスの転写終結配列 ( E )、 介在配列 （I ) 及び転写開始配列 （S ) ( E I S配列） のコピーを付加す るために、 Notl制限酵素切断部位配列及び転写終結配列 （E )、 介在配列 （ I )及 び転写開始配列 （S ) と目的遺伝子の一部の配列を含むプライマ一対として、 フ ォヮード側合成 DNA配列及びリバース側合成 DNA配列（アンチセンス鎖）を作成する 例えば、 フォワード側合成 DNA配列は、 Notlによる切断を保証するために 5'側 に任意の 2以上のヌクレオチド （好ましくは GCG、 GCCの Notl認識部位由来の配列 が含まれない 4塩基、 更に好ましくは ACTT) を選択し、 その 3'側に Notl認識部位 gcggccgcを付加し、 さらにその 3'側にスぺーサ一配列として任意の 9塩基または 9に 6の倍数を加えた数の塩基を付加し、 さらにその 3'側に所望の cDNAの開始コ ドン ATGからこれを含めて 0RFの約 25塩基相当の配列を付加した形態とする。 最後 の塩基は Gまたは Cとなるように該所望の cDNAから約 25塩基を選択してフォワード 側合成ォリゴ DNAの 3'の末端とすることが好ましい。
リバース側合成 DNA配列は 5'側から任意の 2以上のヌクレオチド （好ましくは GCG、 GCCの Notl認識部位由来の配列が含まれない 4塩基、 更に好ましくは ACTT) を選択し、 その 3'側に Notl認識部位 gcggccgcを付加し、 さらにその 3'側に長さを 調節するための挿入断片のオリゴ DNAを付加する。 このオリゴ DNAの長さは、 Notl 認識部位 gcggccgcを含め、 cDNAの相補鎖塩基配列と後述するセンダイウィルスに 由来するセンダイウィルスゲノムの E I S塩基配列の合計が 6の倍数になるよう に塩基数を設計する （いわゆる 「6のル一ル (rule of six)j； Kolakofski , D. et al . , J. Virol . 72: 891-899, 1998)。 さらに揷入断片の 3，側にセンダイウィルス の S配列の相補鎖配列、 好ましくは 5，- CTTTCACCCT- 3，、 I配列、 好ましくは 5' - AAG- 3，、 E配列の相補鎖配列、 好ましくは 5'- TTTTTCTTACTACGG- 3，、 さらにその 3' 側に所望の cDNA配列の終始コドンから逆に数えて約 25塩基相当の相補鎖の最後の 塩基が Gまたは Cになるように長さを選択して配列を付加し、 リバース側合成ォ リゴ DNAの 3'の末端とする。
PCRは、 例えば、 ExTaqポリメラーゼ （宝酒造） を用いる通常の方法を用いるこ とができる。 好ましくは Ventポリメラ一ゼ （NEB) を用いて行い、 増幅した目的断 片は Notlで消化した後、 プラスミ ドベクタ一 pBluescriptの Notl部位に揷入する。 得られた PCR産物の塩基配列をシークェンサ一で確認し、正しい配列のプラスミ ド を選択する。 このプラスミ ドから挿入断片を Notlで切り出し、 エンベロープ遺伝 子を欠損するゲノム cDNAを含むプラスミ ドの Notl部位にクローニングする。 また プラスミ ドベクタ一 pB 1 uescr i ptを介さずに Not I部位に直接挿入し、組換えセンダ ィウィルス cDNAを得ることも可能である。
本発明のウィルスベクター DNAは、 これを試験管内または細胞内で転写させ、 ゥ ィルスの L、 P、 NPタンパク質により、 RNPを再構成させ、 この RNPを含むウィルス ベクタ一を生成させることができる。ウィルスベクタ一 DNAからのウィルスの再構 成は、 エンベロープタンパク質を発現する細胞を用いて、 公知の方法に従って行 うことができる （国際公開 97/16539号； 国際公開 97/16538号； Durbin, A.P. et al.， 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S.P. etal., 1995， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M.J. et al.， 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al.， 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996， Genes Cells 1: 569-579; Baron, M.D. and Barrett, T.， 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R.M., 1996， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404)。 ウィルスベクタ一 DNAに おいて、 F遺伝子、 HN遺伝子、 および/または M遺伝子を欠失させた場合には、 その ままでは感染性のウィルス粒子を形成しないが、 宿主細胞に、 これら欠失させた 遺伝子や他のウィルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、 導 入し発現させることにより、 感染性のウィルス粒子を形成させることが可能であ る。
ウィルスベクタ一 DNAを細胞内に導入する方法には、次のような方法、①目的の 細胞が取り込めるような DNA沈殿物を作る方法、②目的の細胞による取りこみに適 し、 かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つ DNAを含む複合体を作る方法、③目的 の細胞膜に、 DNA分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間 的に開ける方法などがある。
②としては、 種々のトランスフエクシヨン試薬が利用できる。 例えば、 D0TMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN #301305)、 D0TAP、 DOPEヽ DOSPER (Boehringer #1811169) などが挙げられる。 ①としては例えばリン酸カルシウムを用いたトラ ンスフエクシヨン法が挙げられ、この方法によって細胞内に入った DNAは貧食小胞 に取り込まれるが、 核内にも十分な量の DNAが入ることが知られている （Graham, F.L. and Van Der Eb, J" 1973， Virology 52 : 456 ; Wigler, M. and Si lverstein, S.， 1977, Cel l 11 : 223)。 Chenおよび Okayamaはトランスファー技術の最適化を 検討し、 1 )細胞を共沈殿物のインキュベーション条件を 2〜4% C02、 35°C、 15 〜24時間、 2) MAは直鎖状より環状のものが活性が高く、 3) 沈殿混液中の MA濃 度が 20〜30 g/mlのとき最適な沈殿が得られると報告している （Chen, C. and Okayama, H.， 1987， Mol . Cel l . Biol . 7: 2745)。 ②の方法は、 一過的なトラン スフエクシヨンに適している。 古くは DEAE-デキストラン （Sigma #D-9885 M.W. 5 x lO5 ) 混液を所望の DNA濃度比で調製し、 トランスフヱクシヨンを行う方法が知 られている。 複合体の多くはエンドゾームの中で分解されてしまうため、 効果を 高めるためにクロ口キンを加えることもできる （Calos, M.P. , 1983, Proc. Natl . Acad. Sci . USA 80: 3015)。 ③の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、 細胞選択 性がないという点で①ゃ②の方法に比べて汎用性が高い。 効率はパルス電流の持 続時間、 パルスの形、 電界 （電極間のギャップ、 電圧） の強さ、 バッファ一の導 電率、 DNA濃度、 細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、 3つのカテゴリ一の中で②の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多 数の検体を検討することができるので、 本発明においては、 トランスフヱクショ ン試薬が適している。好適には Superfect Transfection Ragent (QIAGEN, Cat No. 301305)、 または DOSPER Liposomal Transfection Reagent (Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169) が用いられる。
cDNAからの再構成は具体的には次のようにして行うことができる。
24穴から 6穴程度のプラスチックプレートまたは lOOrnmぺトリ皿上で、 10%ゥシ 胎児血清（FCS)および抗生物質 （100 units/mlぺニシリン Gおよび 100 g/ml スト レブトマイシン）を含む最少必須培地（MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株 LLC-MK2 を 70〜80%コンフルェントになるまで培養し、 例えば l g/ml psoralen (ソラレ ン）存在下 UV照射処理を 20分処理で不活化した、 T7ポリメラーゼを発現する組換 えワクシニアウィルス vTF7- 3 (Fuerst, T.R. et al . , Proc. Natl . Acad. Sci . USA 83: 8122-8126, 1986、 Kato, A. et al . , Genes Cel ls 1 : 569-579, 1996) を 2 PFU/ 細胞で感染させる。 ソラレンの添加量および UV照射時間が適宜調整することがで きる。 感染 1時間後、 2〜60〃g、 より好ましくは 3〜5〃gの上記の組換えセンダイ ウィルス cDNAを、 全長センダイウィルスゲノムの生成に必須なトランスに作用す るウィルスタンパク質を発現するプラスミ ド （24- 0.5〃gの pGEM- N、 12- 0.25〃g の pGEM- P、 および 24- 0.5 /gの pGEM- L、 より好ましくは l〃gの pGEM-N、 0.5〃gの pGEM- P、 および l〃gの pGEM- (Kato, A. et al . , Genes Cel ls 1 : 569-579, 1996 ) と共に Superfect (QIAGEN社） を用いたリポフエクシヨン法等により トランスフ ェクシヨンする。 トランスフエクシヨンを行った細胞は、 所望により 100〃g/ml のリファンピシン （Sigma) 及びシトシンァラビノシド （AraC)、 より好ましくは 40〃g/mlのシトシンァラビノシド（AraC) (Sigma)のみを含む血清不含の MEMで培 養し、 ワクシニアウィルスによる細胞毒性を最少にとどめ、 ウィルスの回収率を 最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Kato, A. et al .， 1996, Genes Cel ls 1 : 569-579)。 トランスフヱクシヨンから 48〜72時間程度培養後、 細胞を回収し、 凍結融解を 3回繰り返して細胞を破碎した後、 エンベロープタンパク質を発現す る LLC-MK2細胞にトランスフヱクシヨンして培養する。培養 3〜 7日後に培養液を 回収する。 あるいは、 NP、 L、 P発現プラスミ ドを初めからエンベロープタンパク 質を発現する LLC-MK2細胞にトランスフエクシヨンするか、またはエンベロープ発 現プラスミ ドを共にトランスフエクシヨンすれば、 感染性ウィルスベクターをよ り効率良く得ることができる。 この細胞は、 エンベロープタンパク質を発現する LLC- MK2細胞に重層して培養することによってウィルスベクターを増幅すること ができる （実施例参照）。培養上清に含まれるウィルス力価は赤血球凝集活性 (HA) を測定することにより決定することができる。 HAは 「endo- point希釈法」 （Kato, A. et al . , 1996， Genes Cel l s 1 : 569-579) により決定することができる。 得ら れたウィルスストックは- 80°Cで保存することができる。
本発明の組換えセンダイウィルスベクタ一は、 例えば生理食塩水ゃリン酸緩衝 生理食塩水（PBS)などで適宜希釈して組成物とすることができる。本発明の組換 えセンダイウィルスベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては漿尿液を含む こともできる。 本発明の組換えセンダイウィルスベクタ一含有組成物には、 脱ィ オン水、 5%デキストロース水溶液等の生理学的に許容しうる媒体を含んでいても よい。 さらに、 その他にも、 安定剤、 殺生物剤等が含有されていてもよい。
ウィルスベクタ一が再構成する限り、 再構成に用いる宿主細胞は特に制限され ない。例えば、センダイウィルスベクターの再構成においては、サル腎由来の CV-I 細胞や LLC- MK2細胞、 ハムスター腎由来の BHK細胞などの培養細胞を使うことがで きる。 これらの細胞に適当なエンベロープタンパク質を発現させることで、 その エンベロープを有する感染性ウィルス粒子を得ることもできる。 また、 大量にセ ンダイウィルスベクターを得るために、 例えばエンベロープ遺伝子を発現するべ クタ一と共に上記の宿主から得られたウィルスベクターを発育鶏卵に感染させ、 該ベクタ—を増幅することができる。 または、 エンベロープタンパク質遺伝子が 組み込まれたトランスジヱニック鶏卵を用いてウィルスベクタ一を生産すること も可能である。 鶏卵を使ったウィルスベクタ一の製造方法は既に開発されている (中西ら編，（1993),「神経科学研究の先端技術プロトコール I I I，分子神経細胞生 理学」 ， 厚生社， 大阪， pp.153- 172)。 具体的には、 例えば、 受精卵を培養器に入 れ 9〜12日間 37〜38°Cで培養し、 胚を成長させる。 エンベロープタンパク質を発 現するベクターと共にセンダイウィルスベクターを漿尿膜腔へ接種し、 数日間卵 を培養してウィルスベクタ一を増殖させる。 培養期間等の条件は、 使用する組換 えセンダイウィルスにより変わり得る。 その後、 ウィルスを含んだ漿尿液を回収 する。 漿尿液からのセンダイウィルスベクタ一の分離 ·精製は常法に従って行う ことができる （田代眞人， 「ウィルス実験プロトコ一ル」 ，永井、 石浜監修， メジ 力ルビユ一社， pp.68- 73, ( 1995))。
エンベロープ夕ンパク質を発現するベクターとして、 本発明のウィルスベクタ —自体を用いることが考えられる。 例えば、 ゲノム上で欠損しているェンベロ一 プ遺伝子が異なる 2種のベクターを同じ細胞に導入すれば、 それぞれで欠損する エンベロープタンパク質が、 もう一方の複合体からの発現により供給されるため 、 互いに相補しあって感染力のあるウィルス粒子が形成され、 複製サイクルがま わりウィルスベクタ一が増幅される。 すなわち、 2種またはそれ以上の本発明の ベクタ一を、 エンベロープタンパク質を相補する組み合わせで接種すれば、 それ それのェンベロープ遺伝子欠損型ウィルスベクタ一の混合物を大量かつ低コスト で生産することができる。 このようにして生産された混合ウィルスは、 ワクチン 等にも有用である。 また、 これらのウィルスは、 エンベロープ遺伝子が欠損して いる分、 エンベロープ遺伝子を欠損していないウィルスに比べゲノムサイズが小 さくなり、 長い外来遺伝子を保持することができる。 また、 元々感染性のないこ れらのウィルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、 不稔化 するため、 環境放出管理上の利点がある。
外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてウィルスベクターを調製すれば 、 このべクタ一を投与して遺伝子治療を行なうことが可能となる。 本発明のウイ ルスベクターの遺伝子治療への応用としては、 直接投与による遺伝子発現、 間接 (ex vivo) 投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても、 治療効果を期待で きる外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を発現さ せることが可能である。 外来遺伝子としては特に制限はなく、 蛋白質をコードす る核酸に加え、 例えば、 アンチセンスまたはリボザィムなどのタンパク質をコ一 ドしない核酸であってもよい。 また、 外来遺伝子として、 感染症に関する細菌ま たはウィルスの抗原をコ一ドする遺伝子を用いれば、 これを動物に投与すること により、 該動物において免疫を誘導することができる。 即ち、 ワクチンとして利 用することができる。
ワクチンとして用いる場合、 例えば腫瘍、 感染症、 およびその他の一般的な疾 患に対し本発明のウィルスベクタ一を適用することが考えられる。 例えば腫瘍治 療としては、 腫瘍細胞、 または DC細胞などの抗原提示細胞（APC) に本発明のべク 夕一を用いて治療効果を有する遺伝子を発現させることができる。 このような遺 伝子としては、癌抗原 Muc- 1または Muc-1様ムチンタンデムリピートペプチド （ 米国特許第 5，744，144号）、 メラノ一マ gplOO抗原などが挙げられる。このような 遺伝子による治療は、 乳癌、 結腸癌、 脬臓癌、 前立腺癌、 肺癌等、 幅広い応用が 示されている。 また、 アジュバント効果を高めるサイ ト力イン類を組み合わせる ことも有効である。このような遺伝子としては、例えば i ) IL-2と一本鎖 IL- 12と の組み合わせ （Proc. Natl . Acad. Sci . USA 96 ( 15) : 8591-8596, 1999)、 i i ) IL-2とインターフェロン-ァ （米国特許第 5, 798, 100号)、 i i i )単独で用いられる 顆粒球コロニー刺激因子（GM- CSF)、 iv)脳腫瘍を治療対象とした GM-CSFと IL-4 の組み合わせ (J. Neurosurgery 90 (6 )， 1115-1124 ( 1999)) などが挙げられる ο
感染症の治療としては、 インフルエンザにおいては、 例えば強毒株 H5N1 型ェ ンべロープ、日本脳炎においては、例えばエンベロープキヌラ（Vaccine, vol . 17, No.15-16, 1869-1882 (1999))、 エイズにおいては、 例えば HIVgagまたは SIVgag 夕ンハ。ク質 (J. Immunology (2000) vol. 164, 4968-4978)、 HIVエンベロープタンパ ク質の経口投与による鎖クチン治療、ポリ乳酸-グリコール共重合体に包んでの投 与 (Kaneko, H. et al.， Virology 267: 8-16 (2000))、 コレラにおいては、 例え ばコレラ毒素の Bサブユニッ ト (CTB) (Arakawa T, et al. , Nature Biotechnology (1998) 16(10): 934-8、 Arakawa T, et al., Nature Biotechnology (1998) 16(3): 292-7)、 狂犬病においては、 例えば狂犬病ウィルスの糖タンパク （LodmellDLet al., 1998, Nature Medicine 4(8) :949-52), 子宮頸癌においては、 ヒトパピロー マウィルス 6型のカプシドタンパク LI (J. Med. Virol, 60, 200-204 (2000)) な どが挙げられる。
また、 一般病への適用も考えられる。糖尿病におては、 例えば I型糖尿病モデル 動物におて、 インシュリン断片のペプチドの発現が行われている （Coon, B. et al., J. Clin. Invest., 1999， 104(2) : 189-94)。 図面の簡単な説明
図 1は、 Cre-loxP誘導発現系による F蛋白質の発現を解析したウェスタンプロッ ト解析の結果を示す写真である。化学発光法により抗 SeV- F抗体と交叉のみられる 該転写膜上の蛋白質の検出を行った結果を示す。
図 2は、 Cre-loxP系により発現を誘導した F蛋白質の細胞表面へのディスプレイ を解析した結果を示す図である。抗 SeV- F抗体を用いて LLC-MK2/F7のフローサイ ト メ トリー解析を行った結果を示す。
図 3は、 発現された F蛋白質のトリブシンによる解裂をウエスタンブロット法 により確認した結果を示す写真である。
図 4は、 細胞表面における HNの発現を赤血球の細胞表面への吸着実験で確認し た結果を示す写真である。
図 5は、 欠失タンパク質発現細胞を用いて欠失型ウィルスの回収を試みた結果 を示す写真である。 F欠損 SeVの再構築時に用いたワクシニアウィルスによりヘル パ一細胞株からの F蛋白発現が素早くシャットオフしたことが判明した。
1 . LLC-MK2および CV-1はそれぞれの細胞株のみの細胞ライセートを指す。
2. LLC- MK2/F+adおよび CV-1/F+adはアデノウイルス AxCANCreを加えたそれそれの 誘導発現細胞ライセートを指す。
3. LLC-MK2/F-adおよび CV- 1 /F- adはアデノウイルス AxCANCreを加えていないそれ それの F遺伝子導入株の細胞ライセートを指す。
4. LLC- K2/F+ad 3rdはアデノウィルス AxCANCreで誘導発現した細胞をさらに 3 回継代した細胞のライセートを指す。
5. Idおよび 3dはそれそれ誘導発現後 1日および 3日を指す。
6. Vacldおよび Vac 3 dはそれぞれワクシニアウィルス感染後 1日および 3日の細 胞を指す。
7. AraCldおよび AraC3dはそれそれ AraCを添加して 1日および 3日の細胞を指す
8. CHX Idおよび CHX 3dはそれぞれ蛋白合成阻害剤サイクロへキシミ ドを添加し て 1日および 3日の細胞を指す。
図 6は、 GFP導入 F欠失 SeV cDNA(pSeV18+ / A F-GFP )を F非発現 LLC- MK2細胞にト ランスフヱクシヨンして GFPの発現 （RNPの検出） を観察した結果を示す写真であ る。対照群として F遺伝子を NP遺伝子の 3'末端にシャフルし、 F欠失部位に GFPを導 入した SeV cDNA(Fシャフル型 SeV)を用いた。 「al l」 は SeV cDNAの他に、 NP，P，L遺 伝子を発現するプラスミ ド （pGEM/NP, pGEM/P，及び pGEM/L) も同時にトランスフ ェクシヨンしたものを表わす。 「cDNA」 は cDNA (pSeV18+ /AF-GFP) のみのトラン スフエクシヨンを表わす。 RNPトランスフエクシヨンは GFPを発現している P0細胞 を回収し、 OptiMEM (GIBCO BRL)に懸濁し （107 細胞/ ml )、 凍結融解 3回く り返 したライセート をカチオン性リボソーム D0SPER (ベーリンガ一マインハイ ム） 25 / 1と混合し、 室温に 15分間放置してから、 F発現誘導細胞 （+ad) に添加し 、 RNPトランスフヱクシヨンを行った。 細胞の対照群として Cre DNAリコンビナー ゼを発現する組換えアデノウイルス非添加 （-ad)細胞を用いた。 その結果、 P0の LLC-MK2細胞では GFPは SeVウィルス RNPの形成に依存的に発現することが判明し、 P1では、 F欠失ウィルスは F誘導発現に依存的に増幅されることが判明した。
図 7は、 F欠失ゲノム cDNAで再構築された機能的な RNPが、 F発現ヘルパー細胞 でレスキューされ、 感染性を有する欠失型ウィルスビリオンを形成し得るかを調 ベた結果を示す写真である。 RNP/oは RNPを重層 （overlay)した細胞を指し、 RNP/t は RNPを transfectionした細胞を指す。
図 8は、 F欠失ウィルスが、 F発現細胞に特異的に増幅されることを確かめた結 果を示す写真である。遺伝子欠失型ゲノムから構築した機能的 RNPを含むライセー トを実施例 2に記載の F発現細胞にリポフエクシヨンし、培養上清を回収した。こ の培養上清を F発現細胞の培地に加え感染させ、 3日目に回収された培養上清を、 F発現細胞と F非発現細胞に同時に添加し、 トリブシン存在と非存在下で 3日間培 養した。その結果を示す。 F発現細胞では、 トリブシン存在下でのみウィルスが増 幅された。
図 9は、 F発現細胞に導入した場合に特異的に F欠失ウィルスが培養上清に放出 されることを確かめた結果を示す写真である。 遺伝子欠失型ゲノムから構築した 機能的 RNPを含むライセートを実施例 2に記載の F発現細胞にリボフヱクシヨンし 、 培養上清を回収した。 この培養上清を F発現細胞の培地に加え感染させ、 3日目 に回収された培養上清を、 F発現細胞と F非発現細胞に同時に添加し、 トリプシン 存在と非存在下で 3日間培養した。下段は F非発現細胞の上清の場合の結果を示す o
図 1 0は、 F欠失 cDNAから回収されたビリオンのゲノム構造を確認するため、 F 発現細胞の培養上清中のウィルスを回収し、 total RNAを抽出して、 Fと HNをプロ —ブにしてノーザンブロッ ト解析を行った結果を示す写真である。 F発現細胞か ら回収されたウィルスは HN遺伝子は検出されたが: F遺伝子は検出されず、 F遺伝子 がウィルスゲノム上に存在しないことが明らかとなった。
図 1 1は、 GFPの遺伝子は cDNAの構築の際と同様の Fの欠失部位に存在すること を示す RT-PCRの結果を示す写真である。 1： +18- NP、 +18 Not Iサイ トの存在の確 認。 2 : M- GFP、 GFP遺伝子が F遺伝子欠損部位に存在することの確認。 3： F遺伝子 、 F遺伝子の存在の確認。野生型 SeVと F欠損 GFP発現 SeVのゲノム構造を上に示した 。 GFP遺伝子が F欠損部位に存在し、 NPの 3'末端に +18由来の Notlサイ 卜があり、 F 遺伝子が RNAゲノムのどこにも存在しないことが確認された。
図 1 2 は、 ウィルスの Fと HNに特異的に反応する金コ ロイ ド結合 IgG(antiF，antiHN)を用いた免疫電顕により調べた結果を示す写真である。ウィル スのエンベロープのスパイク様構造は Fと HNの蛋白質からなることが明らかとな つた o
図 1 3は、 GFPの遺伝子以外の他の遺伝子の構造は野生型と同様であることを確 認した RT-PCRの結果を示す図である。
図 1 4は、 F欠失ウィルス粒子を電顕により、 その形態を調べた結果を示す写 真である。 F欠失ウィルス粒子は野生型ウィルスと同様に内部にヘリカルな RNP 構造とスパイク様構造を有していた。
図 1 5は、 F欠失型 SeVベクターによる in vitroでの多様な細胞への高効率遺伝 子導入の結果を示す写真である。
図 1 6は、 マウス初代骨髄細胞 （BM c- kit+/- ) への F欠失型 SeVベクターの導入 を解析した結果を示す図である。 白抜きバーは PE陽性/ GFP陰性を指し、 黒いバー は PE陽性/ GFP陽性を指す。
図 1 7は、 ラット脳室へのベクタ一の in vivo 投与の結果を示す写真である。 図 1 8は、 F発現細胞から回収した F欠損 SeVゥィルスを含む培養上清を F非発 現 LLC- MK2細胞に感染し、 トリブシン存在下または非存在下で 3日間培養し上清中 のウィルスの存在を HA assayで確認した結果を示す写真である。
図 1 9は、 図 1 8 Bにおいて発育鶏卵で HA陽性であった漿尿液（lane 11および lane 12) を発育鶏卵に再接種して培養 2日後の漿尿液の HA assayを行った結果を 示す写真である。
図 2 0は、 HA陽性で感染性がないウィルス液を免疫電顕で調べた結果を示す写 真である。 ウィルス粒子が確認され、 ビリオンのエンベロープは金コロイ ド標識 した HN蛋白を認識する抗体では反応したが、 金コロイ ド標識した F蛋白を認識す る抗体では反応しなかった。
図 2 1は、 F欠損ウィルス粒子の細胞へのトランスフヱクシヨンの結果を示す写 真である。
図 2 2は、 F、 HN共発現細胞の造成をウエスタンブロットにより調べた結果を示 す写真である。 LLC/VacT7/pGEM/FHNは LLC-MK2細胞にヮクシニア感染後、 GEM/FHN プラスミ ドをトランスフエクシヨンした細胞。 LLC/VacT7はワクシニア感染した LLC- MK2細胞。 LLCMK2/FHNmixは F、 H N遺伝子導入された LLC- K2細胞でクロ一二 ングしていない細胞。 LLC/FHNは LLC-MK2細胞に F、 H N遺伝子を導入してアデノ ウィルスで発現誘導後（3日後） の細胞、 1 - 13、 2-6 , 2-16， 3-3 , 3-18， 3-22, 4- 3 , 5- 9はクロニングしたときの細胞株の番号 （名前） を指す。
図 2 3は、 pGEM/FHNの添加の有無の違いによるウィルスの形成を確認した結果 を示す写真である。 FHN欠損 GFP発現 SeV cDNA, pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L , pGEM/FHN をそれそれ混合し LLC- MK2細胞に遺伝子導入した。 遺伝子導入 3時間後培地を AraC，トリプシン入りの MEMに交換し、 さらに 3日間培養した。 遺伝子導入後 2日 目で蛍光実体顕微鏡で観察し、 pGEM/FHNの添加の有無の違いを検証し、 GFP発現細 胞の広がりでウィルスの形成を確認した。 その結果を示す。 再構築時に pGEM/FHN を添加した場合は GFP発現細胞の広がりが確認され、 pGEM/FHNの添加がない場合は GFP発現はシングル細胞でしか観察されなかった
図 2 4は、 RNPトランスフエクシヨンによる F、 HN欠損ウィルスの再構築と増幅 を示す写真である。 発現誘導後 3日目の F HN共発現細胞 （12wel l ) に PO RNPを重 層または D0SPERを用いてリボフヱクシヨンし、 4日後に GFPを観察した。 MPトラ ンスフエクションの場合は F欠損と同様に P1の FHN発現細胞でゥィルスの回収に成 功した（上）。 Ade/Creを感染して 6時間以後に FHN蛋白が誘導発現された細胞に FHN 欠損ウィルス液を感染し増幅ができたことを確認した （下）。
図 2 5は、 FHN欠損 GFPを発現する cDNAから再構築されたウィルス液は LLC- MK2， LLC-MK2/F , LLC-MK2/HN, LLC-MK2/FHNに感染してトリプシンの添加の有無で培養 した結果を示す写真である。 培養 3日後に GFP蛋白発現細胞の広がりを確認した。 その結果を示す。 LLC-MK2/FHNでのみ GFPの広がりが観察され、 このウィルス液は FHN共発現に特異的かつトリプシン依存的に増幅されることが確認された。
図 2 6は、 F H N発現細胞の培養上清由来 R N Aのゲノム構造を確認した結果 を示す写真である。
図 2 7は、 F H N欠損ウィルスで感染した F発現細胞の培養上清由来 R N Aの ゲノム構造の確認の結果を示す写真である。
図 2 8は、 ソラレン · UV照射におけるソラレンの濃度を変化させたときの、 ヮ クシニアウィルスの不活性化と T7活性を示す図である。
図 2 9は、 ソラレン · UV照射における UV照射時間を変化させたときの、 ヮクシ ニァウィルスの不活性化と T7 RNAポリメラーゼ活性を示す図である。
図 3 0は、 ソラレン ' UV照射したワクシニアウィルスの細胞傷害性（CPE) を示 す写真である。 3 X 105の LLC- ΜΚ2細胞を 6ゥエルプレートに播いた。 細胞をー晚培 養後、 ワクシニアウィルスを moi=2で感染させた。 24時間後、 CPEを測定した。 偽 処理のワクシニアウィルスによる CPEは A、 15、 20、 および 30分間処理したヮクシ ニァウィルスによる CPEは、 それぞれ B、 C、 および Dに示した。
図 3 1は、 ワクシニアウィルスの UV処理時間のセンダイウィルス再構成効率に 対する影響を示した図である。
図 3 2は、 センダイウィルス再構成実験に用いた細胞に残存する複製可能なヮ クシニアウィルスの力価を示す図である。
図 3 3は、抗 VSV-G抗体によるウエスタンブロッ 卜解析の結果を示す写真である 図 3 4は、抗 VSV-G抗体を用いたフローサイ トメ トリ一解析の結果を示す図であ る。 AxCANCre感染 4日目の LLC- MK2 VSV- G誘導発現株 （U ) (mo i =0, 2. 5， 5) の解 析結果を示す。 一次抗体は抗 VSV- G抗体 （MoAb l - 1 )、 二次抗体は FITC化 抗マウス Igを用いた。
図 3 5は、 AxCANCre の感染量 （MOI= 0、 1 . 2 5、 2 . 5、 5、 1 0 ) を変え、 一定量の F 遺伝子を欠失したゲノムを有するシユードタイプセンダイウィルスを 感染後上清を回収し、 さらに VSV- G 誘導前（-）、 誘導後（+ )の細胞に感染させ、 5 日目の GFP の発現している細胞を観察した結果を示す写真である。
図 3 6は、 経時的にウィルス産生量を調べた結果を示す写真である。
図 3 7は、 VSV- G 発現株を用いて得られた F 遺伝子を欠失したゲノムを有する シユード夕イプセンダイウィルスおよび FHN欠損センダイウィルスを抗 VSV抗体で 処理し、 感染性が影響されるを調べた結果を示す写真である。
図 3 8は、 GFP遺伝子を含む F、 HN欠失型センダイウィルスを VSV- G遺伝子発現 細胞 LLCG- L 1に感染させ、 VSV- Gを外被に有するシユード夕イブウィルスの産生が 見られるかを GFP遺伝子の発現を指標に調べた結果を示す写真である。
図 3 9は、 VSV- G 遺伝子発現細胞で増殖したウィルスが Fおよび HN 欠失型で あることを、 感染細胞抽出液のタンパク質のウエスタン解析により調べた結果を 示す写真である。
図 4 0は、 蛍光顕微鏡下で GFP発現細胞を観察した結果を示す写真である。 図 4 1は、 エンベロープ発現ブラスミ ドと細胞重層の組み合わせによる SeV/ Δ
F-GFPの再構成効率の向上を示す図である。 P0 (継代前） の d3〜(！ 4 ( 3日目〜 4日 目） において、 著しい改善が認められた。
図 4 2は、 エンベロープ発現プラスミ ドと細胞重層の組み合わせによる SeV/ Δ
F-GFPの再構成の処理条件の検討結果を示す図である。 GFP陽性細胞は再構成され たウィルス量を表す。 図 4 3は、 cDNAからの F欠損センダイウィルスのレスキューの検討結果を示す図 である。エンベロープ発現ブラスミ ドと細胞重層の組み合わせによる SeV/ Δ F-GFP の再構成効率の向上を示す。 7日目は全チャレンジとも陽性となるが、成功確率の 中程度領域である 3日目に着目し、 効率の検討を行った。
図 4 4は、 GFPを含まない LacZ搭載 F 欠失型センダイウィルスベクタ一の lacZ の発現を示す写真である。
図 4 5は、 センダイウィルスゲノム cDNA断片のサブクローニング（A) と新たに Notlサイ トを導入し構築した 5種類のセンダイウィルスゲノム cDNAの構造 （B) を 示す図である。
図 4 6は、 SEAPに Notlサイ ト、 転写開始シグナル、 介在配列、 転写終結シグナ ルを付加するためのクローニング用プラスミ ドの構造を示す図である。
図 4 7は、 各センダイウィルスベクターのプラークアツセィの結果を示す写真 である。 LAS1000で取り込んだプラークアツセィの蛍光画像の一部を示す。
図 4 8は、 各センダイウィルスベクタ一間におけるレポ一夕一遺伝子 （SEAP) の発現量の違いを比較した結果を示す図である。 SeV18+/SEAPのデ一夕を 100とし てそれぞれ相対値を表した。 SEAP遺伝子が下流に位置するに従ってその活性すな わち発現量が低下していくことがわかった。
図 4 9は、 PI FHN共発現細胞における G F P発現を示す顕微鏡写真である。 図 5 0は、 VSV- Gシユードタイプ SeV/ AF : GFP感染細胞の抽出液を、 抗 F抗体 （ anti-F)、 抗 HN抗体 （anti - HN)、 抗センダイウィルス抗体（anti- SeV) を用いてゥ エスタンプロット解析を行った結果を示す写真である。
図 5 1は、 中和抗体 （VGV抗体） の存在下または非存在下で Fおよび HNを欠損し た VSV- Gシユードタイプ SeVを感染させた細胞の GFPの蛍光を示す写真である。 図 5 2は、 密度勾配超遠心法を用いて分画した F遺伝子あるいは F， HN遺伝子を 欠失したゲノムを有する VSV-Gシユードタイプセンダイウィルスのウエスタン解 祈の結果を示す写真である。 図 5 3は、 F遺伝子を欠損したゲノムを有するセンダイウィルス、 あるいは F遺 伝子または F，HN遺伝子を欠失したゲノムを有する VSV-Gシュ一ドタイプセンダイ ウィルスによる赤血球凝集反応を示す写真である。
図 5 4は、 F遺伝子を欠失したゲノムを有するセンダイウィルスまたは VSV-Gシ ユード夕イプセンダイウィルスによる培養細胞への感染特異性を示す図である。 図 5 5は、 NGF発現を搭載した F欠失型センダイウィルス （NGF/SeV/AF)の構造 の確認を示す写真である。
図 5 6は、 NGF搭載 F欠失型 SeV感染細胞より発現される NGFの活性を示す図であ る。 ニヮトリの後根神経節の初代神経細胞分散培養系に、 培養開始と同時に SeV 感染細胞の培養上清希釈液或レ、はコントロールとしての NGF蛋白を添加し、 3日後 にミ トコンドリアによる還元活性を指標として生細胞を定量した （n=3)。 培養上 清は 1/1000希釈相当量添加した。
図 5 7は、 NGF搭載 F欠失型 SeV感染細胞より発現される NGFの活性を示す写真で ある。ニヮトリの後根神経節の初代神経細胞分散培養系に、培養開始と同時に SeV 感染細胞の培養上清希釈液或いはコントロールとしての NGF蛋白を添加し、 3曰後 に検鏡した。
A ) コントロール （NGF添加無し）、
B ) NGF蛋白 10ng/mL添加、
C ) NGF/SeV感染細胞培養上清 1/100希釈添加、
D ) NGF/SeV感染細胞培養上清 1/100希釈添加、
E ) NGF/SeV/ A F感染細胞培養上清 1/100希釈添加、
F ) NGF/SeV/ A F- GFP感染細胞培養上清 1/100希釈添加
図 5 8は、 Ad- Creの moiと F蛋白の発現量を示す写真である。
図 5 9は、 Adeno-Creによる LLC-MK2/Fの発現を示す写真である。
図 6 0は、 継代による発現の持続性を示す写真である。
図 6 1は、 継代による F蛋白の局在化を示す写真である。 図 6 2は、 GFP- CIUと抗 SeV- CIUとの相関関係を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に限 定されるものではない。
[実施例 1 ] F欠失型センダイゥィルスの構築
<1> F欠失型 SeVゲノム cDNAおよび F発現プラスミ ドの構築
センダイウィルス （SeV) 全長ゲノム cDNA、 pSeV18+ b ( + ) (Hasan, M. K. et al . , 1997, J. General Virology 78: 2813-2820) (「pSeV18+ b (十）」 は 「pSeV18+」 と もいう） の cDNAを Sphl/Kpnlで消化してフラグメント（14673bp)を回収し、 pUC18 にクロ一ニングしてともいうプラスミ ド pUC18/KSとした。 F欠損部位の構築はこの PUC18/KS上で行った。 F遺伝子の欠損は、 PCR-ライゲ一シヨン方法の組み合わせで 行い、 結果として F遺伝子の ORF (ATG-TGA二 1698bp) を除いて atgcatgccggcagatga (配列番号： 1 ) で連結し、 F欠失型 SeVゲノム cDNA (pSeV18+/AF) を構築した 。PCRは、 Fの上流には (forward: 5， - gttgagtactgcaagagc/配列番号： 2， reverse: 5， - tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaaccZ配歹 ij番号： 3 )ヽ F遺伝子の下 流には ( forward: 5， - atgcatgccggcagatga ,配歹 !j番号 ： 4 , reverse : 5， - tgggtgaatgagagaatcagc/配列番号： 5 )の PCR産物を EcoT22Iで連結した。 このよ うに得られたプラスミ ドを Saclと Sai lで消化して、 F欠損部位を含む領域の断片 （ 4931bp) を回収して pUC18にクロ一ニングし、 pUC18/dFSSとした。 この pUC18/dFSS を Drai nで消化して、 断片を回収して pSeV18+の F遺伝子を含む領域の Dral l l断片 と置き換え、 ライゲ一シヨンしてプラスミ ド pSeV18+ /AF を得た。
さらに、 F欠失部位に EGFP遺伝子を搭載した cDNA (pSeV18+/AF-GFP) を構築す るため、 PCRにより、 EGFP遺伝子の増幅を行った。 EGFP遺伝子を 6の倍数 (Hausmann, S. et al .， RNA 2, 1033-1045 ( 1996 )) に合わせるため 5，は Nsi l- tai ldプライマ — ( 5' -atgcatatggtgatgcggttttggcagtac：配列番号： 6 )、 3,は NgoMIV- tai ledプ ライマ一（5，- Tgccggctattattacttgtacagctcgtc：配列番号： 7 )を用いて PCRを ί亍 つた。 PCR産物を制限酵素 Nsi l と NgoMIVで消化してゲルから断片を回収し、 pUC18/dFSSの F欠失部位にある Nsi l と NgoMIVという制限酵素部位に連結し、 シー クエンスを確認した。 ここから、 EGFP遺伝子を含む Dral l l断片を回収し、 PSeV18+ の F遺伝子を含む領域の Drai n断片と置き換え、 ライゲーシヨンしてプラスミ ド pSeV18+/AF-GFP を得た。
一方、 F遺伝子を発現する Cre/loxP誘導型発現プラスミ ドの構築は SeV F遺伝子 を PCRで増幅し、 シーケンスを確認した後、 Cre DNAリコンビナ一ゼにより遺伝子 産物を誘導発現されるように設計されたプラス ミ ド pCALNdlw(Araiら J. Virology72, 1998, plll5- 1121 )のユニークサイ ト Swal部位に挿入し、 プラスミ ド pCALNdLw/Fとした。
<2> SeV-F蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
F欠損ゲノムから感染ウィルス粒子を回収するため、 SeV-F蛋白を発現するヘル パー細胞株を樹立した。細胞は SeVの増殖によく用いられているモンキー腎臓由来 細胞株、 LLC- MK2細胞を用いた。 LLC- MK2細胞は、 10%の熱処理した不動化ゥシ胎 児血清（FBS)、ペニシリン Gナトリウム 50単位/ ml、およびストレプトマイシン 50 〃g/mlを添加した MEMで 37°C、 5% (：02で培養した。 SeV- F遺伝子産物は細胞傷害性 を有するため、 Cre DNAリコンビナ一ゼにより F遺伝子産物を誘導発現されるよう に設計された上記プラスミ ド pCALNdLw/Fを、 リン酸カルシウム法 （mammal ian transfection kit (Stratagene)) により、 そのプロトコ一ルに従って LLC-MK2細 胞に遺伝子導入を行った。
10cmプレートを用い、 40%コンフルェントまで生育した LLC- MK2細胞に 10 gの プラスミ ド pCALNdLw/Fを導入後、 10mlの 10% FBSを含む MEM培地にて、 37°Cの 5 % C02 インキュベータ一中で 24時間培養した。 24時間後に細胞をはがし、 10ml培地 に懸濁後、 10cmシャーレ 5枚を用い、 5ml 夂、 2ml 2枚、 0.2ml 2枚に蒔き、 G418 (GIBC0-BRL)を 1200〃g/mlを含む 10mlの 10%FBSを含む MEM培地にて培養を行い、 2 日毎に培地交換しながら、 14日間培養し、 遺伝子の安定導入株の選択を行った。 該培地により生育してきた G418に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて 30株を回収した。 各クローンは 10cmプレー卜でコンフルェントになるまで拡大培 養を続けた。
各クローンについて Cre DNAリコンビナ一ゼを発現する組み換えアデノウィル ス AxCANCreで感染後、 抗 SeV-F蛋白質モノクローナル IgG (f236, J. Biochem.123: 1064-1072) を用いて SeV-F蛋白の発現をウエスタンプロット法により以下のよう に調べた。
各クローンは 6cmシャーレにてコンフルェントまで生育させた後、アデノウィル ス AxCANCreを斉藤らの方法 （Saito et al., Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821 (1995); Arai, T.et al., J Virol 72,1115-1121 (1998)) により moi=3 で感染 後、 3日間培養した。 該細胞は培養上清を取り除いた後、 PBS緩衝液で 2回洗浄し 、 スクレーパーで細胞をはがし、 1500xgで 5分間遠心し、 細胞を集めた。
該細胞は - 80°Cで保存し、必要に応じて解凍して使用することができる。集めた 細胞は 150〃 1 PBSバッファ一に懸濁後、 同量の 2xTris-SDS-BME sample loading buffer (0.625M Tris, H 6.8, 5%SDS， 25% 2-ME, 50% glycerol, 0.025%BPB, Owl 社製） を加え、 98°C 3分間加熱処理後電気泳動用試料に供した。 該試料 （ 1レー ン当たり lxlO5 細胞） を SDS-ポリアクリルアミ ドゲル （マルチゲル 10/20、 第一 化学社製） を用い、 電気泳動により分画し、 分画された蛋白はセミ ドライブロッ 卜法により PVDF転写膜 (Immobilon-P transfer membranes, Millipore社製) に転 写した。 転写は 100% メタノールに 30秒、 水に 30分間浸した転写膜を使用し、 ImA/cin2定電流の条件で 1時間行った。
該転写膜を 0.05%Tween20， 1 %BSAを添加したプロッキング溶液（プロックエー ス、 雪印社製） 中で 1時間振蕩後、 0.05%Tween20， 1 %BSAを添加したブロッキン グ溶液で 1/1000希釈した抗 SeV-F抗体 236) で室温で 2時間反応させた。 該転写 膜を 3回 20mlの PBS- 0. l%Tween20に 5分間振蕩して洗浄した後、 PBS緩衝液で 5分 間振蕩し洗浄した。該転写膜を 0.05%Tween20, 1 %BSAを添加したプロッキング溶 液で 1/2000希釈したパーォキシダ一ゼで標識した抗マウス IgG抗体 （Goat anti - mouse IgG, Zymed社製） 10mlを室温で 1時間反応させた。 該転写膜を 3度 20mlの PBS- 0. l %Tween20に 5分間振蕩して洗浄した後、 PBS緩衝液で 5分間振蕩し洗浄し た。
ィ匕学発光法 (ECL western blotting detection reagents, Amersham社製) によ り抗 SeV-F抗体と交叉のみられる該転写膜上の蛋白質の検出を行った。結果は図 1 に示す。 AxCANCre感染特異的な SeV-Fの発現が検出され、 SeV- F遺伝子産物を誘導 発現する LLC- MK2細胞の作出が確認された。
得られた数細胞株の内の一つの LLC- MK2/F7細胞を抗 SeV-F抗体を用いてフロー サイ トメ トリー解析を行った （図 2 )。 すなわち、 l x lO5細胞を 15，000rpm 4 °Cで 5分間スピンダウンし、 PBS 200〃1で洗浄し、 100倍希釈した抗 Fモノクローナル抗 体 （f236)、 0.05 %アジ化ナトリウム、 2%FCSを含む FACS用 PBS (日研化学） で 4 °C、 1時間遮光して反応させた。 再び 15，000rpm 4 °Cで 5分間スピンダウンし、 PBS 200〃1で洗浄し、 FITC標識した抗マウス IgG (CAPPEL社） 1 /g/mlと 30分間氷上で 反応させ、 再び PBS 200〃1で洗浄し、 15，000rpm 4 °Cで 5分間遠心して細胞をスピ ンダウンし、 1mlの FACS用 PBSに懸濁した。 EPICS ELITE (コール夕一社製） ァルゴ ンレ—ザ—を用いて、 励起波長 488nm、 蛍光波長 525皿で解析した。 その結果、 LLC-MK2/F7 では SeV- F遺伝子誘導発現時特異的に抗体との高い反応性が検出さ れ、 SeV- F蛋白質が細胞表面に発現されることが確認された。
[実施例 2 ] ヘルパー細胞で発現された SeV-F夕ンパク質の機能確認 ヘルパー細胞で誘導発現された SeV- F蛋白質は従来の蛋白機能が保たれている かを調べた。
LLC-MK2/F7細胞を 6cmシャーレに蒔き、 コンフルェントまで生育させた後、 アデ ノウィルス AxCANCreを斉藤らの方法（上記） により moi=3で感染後、 トリプシン （ 7.5 g/ml , GIBC0BRL )を含む MEM (serum free)で 37°C 5%C02 インキュベータ一 で 3日間培養した。
該細胞は培養上清を取り除いた後、 PBS緩衝液で 2回洗浄し、 スクレーパーで細 胞をはがし、 1500 x gで 5分間遠心し、 細胞を集めた。前述したウエスタンプロッ ト法により発現された F蛋白質のトリブシンによる解裂を確認した（図 3 )。SeV-F 蛋白質は非活性型の前駆蛋白の F0として合成され、 トリブシンの蛋白分解作用に より、 F1と F2の 2つのサブユニットに解裂し活性化される。 このように F蛋白が 誘導発現後の LLC-MK2/F7細胞は普通の細胞同様に継代しても F蛋白が持続的に発 現し、 発現された: F蛋白による細胞傷害性が観察されず、 F蛋白発現細胞同士で の細胞融合も観察されなかった。 しかし、 この F発現細胞に SeV- HN発現プラスミ ド（pCAG/SeV-HN )をトランスフエクシヨンしてトリプシンを含む MEMで 3日間培養 すると、 細胞間の融合が多く観察された。 細胞表面における HNの発現は赤血球の 細胞表面への吸着実験 （Hematoadsorpt ion assay; Had assey) で確認した （図 4 ) oすなわち、 培養細胞に 1 %ニヮトリ赤血球を 1 ml /di shを加え、 4°Cで 10分間静 置した後、細胞を PBS緩衝液で 3回洗浄したところ、細胞表面の赤血球のコ口ニー が観察された。 赤血球凝集した細胞で細胞融合が観察され、 F蛋白は HNと相互作 用して細胞融合を引き起こしたことが判明し、 LLC-MK2/F7で持続発現している F 蛋白は従来の機能を保っていることが示された。
[実施例 3 ] F欠失型ゲノムを持つ機能的 RNPおよびビリオンの形成 欠失型ウィルスの回収ではビリオンの回収は欠失タンパク質発現細胞を使う必 要がある。 ところが、 欠失タンパク質発現細胞を用いて欠失型ウィルスの回収を 試みたところ、 F欠損 SeVの再構築時に用いたワクシニアウィルスによりへルパ一 細胞株からの F蛋白発現が素早くシャットオフしたことが判明し （図 5 )、 ヘルパ 一細胞株から直接の F蛋白の供給によるウィルスの再構成に成功しなかった。 ヮ クシニアウィルスに対するゾラレン（psoralen)添加で長波長紫外線（long-waveUV ) での処理 （PLWUV処理） は、 ワクシニアウィルスの複製能力を失活させ、 T 7発 現活性が損なわないことが報告されている （Tsungら、 J Virol 70, 165- 171、 1996 )o そこで、 この PLWUV処理したワクシニアウィルス （PLWUV- VacT7) を用いてウイ ルスの再構築を試みた。紫外線照射装置は、 15ヮットバルブを 5本が装備された UV Stratakinker 2400 (カタログ番号 400676 (100V),ストラ夕ジーン社， LaJolla, CA, USA) を用いた。 その結果、 再構築に用いた F発現細胞から F蛋白の発現は阻 害されたものの、この PLWUV- VacT7で再構築した細胞の 1 ysateをヘルパー細胞へ感 染しても araCの存在下ではワクシニアが殆ど増殖せず、 ヘルパー細胞株からの F 蛋白発現にも殆ど影響しないことが判明した。さらに、 この PLWUV- VacT7を用いた 組み換え野生型 SeVの再構築では従来が 105 以上の細胞がないとウィルスが回収 されなかったのに対し、 103の細胞からもウィルス回収が可能となり、 ウィルスの 再構築の効率が大きく改善された。 この方法を用いて、 F欠失 SeVウィルスの再構 築を試みた。
< F欠失 SeVゥィルスの再構築及び増幅〉
F欠損部位に enhanced green fluorescent protein(EGFP) 遺伝子をレポ一タ一 として 6nルールに従って導入した上記 pSeV18+/AF- GFP を下記のようにして LLC- MK2細胞にトランスフヱクシヨンして GFPの発現を観察した。この時 RNP形成に 必要な構成要素である、 3つのウィルス由来遺伝子 NP、 P、 Lの有無による影響も 検討した。
LLC- MK2細胞を 5xl06cells/dishで 100mmペトリ皿に蒔き、 24時間培養後、 ソ ラレンと長波長紫外線 （365nm) で 20分間処理し、 T7 RNAポリメラーゼを発現す るリコンビナントワクシニアウィルス （Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)) に室温で 1時間感染させた （moi=2) (moi=2〜3 、 好適には moi=2が用いられる）。 細胞を 3回洗浄してからプラスミ ド pSeV18+/ Δ F-GFP, pGEM/NP, pGEM/P, 及び pGEM/L(Kato， A. et al., Genes cells 1, 569-579 (1996)) をそれぞれ 12 zg， 4〃g， 2 g, 及び 4 /g /dish の量比で OptiMEM(GIBCO)に懸濁し、 SuperFect transfection reagent (1 zg DNA/5 /1 の SuperFect, QIAGEN)を入れて混合し、 室温で 10 分間放置後、 最終的に 3%FBSを含 む OptiMEM 3mlに入れ、 細胞に添加して培養した。 pSeV18+/AF-GFPの代わりに対 照として野生型 SeVゲノム cDNA (pSeV( + ) ) (Kato, A. et al . , Genes cel ls 1， 569-579 ( 1996 ) ) を用いて同様の実験を行った。 3時間培養後、 細胞を、 血清を 含まない MEM で 2回洗浄し、 シ トシン/? - D-ァラビノフラノシ ド 40〃g/ml (AraC , Sigma) , トリプシン 7.5 /g/ml (GIBC0) を含む MEMで 70時間培養した。 これらの 細胞を回収し、 ペレツ卜を OptiMEMに懸濁した （107 cel ls/ ml )。 凍結融解を 3 回繰り返して l ipofection reagent D0SPER (Boehringer mannheim)と混合し ( 106cel ls/25 l DOSPER) 室温で 15分放置した後、 F発現 LLC- MK2/F7細胞株にトラ ンスフエクシヨン （106cel ls /wel l 12- wel l- plate) し、 血清を含まない MEM (40 ^g/ml AraC, 7.5 zg/ml トリプシンを含む）で培養した。
その結果、 ウィルス由来の 3つの構成要素、 NP、 P、 Lがすべて揃ったときにの み GFPの発現が認められ、 外来遺伝子を発現する欠失ウィルス RNPが形成し得るこ とが判明した （図 6 )。
く F欠失型ビリオンの確認 >
上記のようにして F欠失ゲノム cDNAで再構築された機能的な RNPが、 F発現ヘル パ一細胞でレスキューされ、 感染性を有する欠失型ウィルスビリオンを形成し得 るかを調べた。 前述したように機能的 RNPを形成される条件 （pSeV18+/ A F-GFP , pGEM/NP, pGEM/P， 及び pGEM/Lを同時に卜ランスフエクトする条件） と形成され ない条件 （pSeV18+/AF-GFP， pGEM/NPの 2種のプラスミ ドのみをトランスフヱクト する条件） で再構築を行った細胞を凍結/融解して得たライセ一トをカチォニッ クリボソームと混合し F発現細胞と非発現細胞にそれそれリポフエクシヨンし、こ れらの細胞における GFP発現細胞の広がりでウィルス粒子の形成を観察した。その 結果、 機能的 RNPが再構築された条件のライセートを用い、 F発現細胞に導入した 際にのみ GFP発現細胞の広がりが観察された （図 7 )。 さらに、 プラークアツセィ においても、 同様の条件でのみプラークの形成が観察された。 これらの結果から 、 F欠損ウィルスゲノムから形成された機能的 RNPが F発現細胞由来の Fタンパク質 の存在下で、 さらに感染性ウィルス粒子として形成され、 細胞外に放出されたこ とが明らかになった。
培養上清中の感染性 F欠失型ビリオンの存在は以下の実験により証明された。 F 遺伝子欠失型ゲノムから構築した機能的 RNPを含むライセ一卜を実施例 2に記載 の F発現細胞にリポフエクシヨンし、 培養上清を回収した。 この培養上清を F発現 細胞の培地に加え感染させ、 3日目に回収された培養上清を、 F発現細胞と F非発 現細胞に同時に添加し、 トリブシン存在と非存在下で 3日間培養した。 F発現細胞 では、 トリブシン存在下でのみウィルスが増幅された（図 8 )。 F非発現細胞の上清 (図 9 下段）、またはトリプシン非存在下で培養した F発現細胞からは感染性を持 たないウイルス粒子が放出されていることが明らかとなつた。 以上のことをまと めると、 F欠損 GFP発現ウィルスは F発現細胞に特異的かつトリブシン解裂に依存的 に増幅されることが明らかとなった。 このように増幅された感染性 F欠失型セン ダイウィルスのタイ夕一は 0.5 x l07〜l x l07 CIU/mlの範囲にあった。
[実施例 4 ] F欠失型 GFP発現ウィルスの解析
F欠失 cDNAから回収されたビリオンのゲノム構造を確認するため、 F発現細胞の 培養上清中のウィルスを回収し、 total MAを抽出して、 Fと HNをプローブにして ノーザンブロッ ト解析を行った。 その結果 F発現細胞から回収されたウィルスは HN遺伝子は検出されたが F遺伝子は検出されず、 F遺伝子がウィルスゲノム上に存 在しないことが明らかとなった（図 1 0 )。さらに RT- PCRにより GFPの遺伝子は cDNA の構築の際と同様の Fの欠失部位に存在すること （図 1 1 )、 また、 他の遺伝子の 構造は野生型と同様であることを確認した。 以上のことからウイルス再構成中に ゲノムの再編成は起きていないことが示された。 また、 回収された F欠失ウィル ス粒子を電顕により、 その形態を調べた。 F欠失ウィルス粒子は野生型ウィルス と同様に内部にヘリカルな RNP構造とスパイク様構造を有していた （図 1 4 )。 さ らに、 ウィルスの Fと HNに特異的に反応する金コロイ ド結合 IgG(antiF, antiHN)を 用いた免疫電顕により調べたところ、 ウィルスのエンベロープのスパイク様構造 は Fと HNの蛋白質からなることが明らかとなり（図 1 2 )、ヘルパー細胞の生産する F蛋白質がこのビリオンに効率的に取り込まれていることがわかった。 以下に詳 述する。
く Total RNAの抽出、 ノーザンプロット解析、 および RT- PCR>
F発現細胞 LLC- MK2/F7にウィルス感染して 3日目の培養上清から QIAamp Viral RNA mini kit(QIAGEN)を用い、 そのプロトコールに従い total RNAの抽出を行った 。 精製した total RNA (5〃g ) をホルムアルデヒドを含む 1 %変性ァガロースゲ ルにて泳動分離してから、 バキュームブロッテイング装置 （Amersham Pharmacia 社）を用い Hybond- N+メンブランにトランスファした。作成したメンブランは 0.05M の NaOHで固定し、 2倍希釈した SSC緩衝液 （Nacalai tesque) ですすいだ後、 ハイ ブリダイゼーション溶液 （Boehringrer Mannheim) で 30分間プレハイブリダイゼ —シヨンを行った。 ジゴキシゲニン （DIG) -dUTP (アルカリ感受性） を用いたラン ダムプライム DNA標識法（DIG DNA Label ing Kit, Boehringer mannheim)により作 成した Fあるいは HN遺伝子のプローブを添加して 16時間ハイブリダイズさせた。 その後、 メンブランを洗浄して、 アルカリフォスフオタ一ゼ標識抗 DIG抗体 (anti- digoxigenin- AP)と反応させ、 DIG ditection kitを用いて解析した。 その 結果 F発現細胞から回収されたウイルスは HN遺伝子は検出されたが F遺伝子は検 出されず、 F遺伝子がウィルスゲノム上に存在しないことが明らかとなった（図 1 0 )。
さらに RT- PCRにより詳細な解析を行った。 RT-PCRは精製したウィルス RNAを SUPERSCRIPT I I Preampl if ication System(Gibco BRL)を用い、 そのプロトコール に従い first strand cDNA を合成し、 LA PCR kit (TAKARA ver2.1 )を用いて次の ような条件で P C Rを行った。 94°C/3分反応後、 94°C/45秒， 55°C/45秒， 72°C/90 秒を 1サイクルとして 30サイクルを増幅して 72°Cで 10分間置き、 2 %ァガロース ゲルで ΙΟΟν/30分電気泳動してェチジゥムブ口マイ ド染色し、撮影した。 M遺伝子 と F欠失部位に挿入した EGFPの確認に用いたプライマーは forward 1 : 5， - atcagagacctgcgacaatgc (酉己列番号： 8 ) , reverse 1： 5' -aagtcgtgctgcttcatgtgg (配列番号： 9 )、 F欠失部位に挿入した EGFPと H N遺伝子の確認に用いたプライ マ一は forward 2 : 5' -acaaccactacctgagcacccagtc (配歹 'J番号 : 1 0 ) , reverse 2 ： 5' -gcctaacacatccagagatcg (配列番号： 1 1 )、 さらに、 M遺伝子と H N遺伝子 との間は forward3 : 5' -acattcatgagtcagctcgc (配列番号： 1 2 ) と reverse2プ ライマー （配列番号： 1 1 ) で行った。 その結果、 GFPの遺伝子は cDNAの構築の際 と同様の Fの欠失部位に存在すること （図 1 1 )、 また、 他の遺伝子の構造は野生 型と同様であることを確認した（図 1 3 )。以上のことからウィルス再構成中にゲ ノムの再編成は起きていないことが示された。
<金コロイ ド免疫標識電顕解析〉
回収された F欠失ウィルス粒子を電顕により、 その形態を調べた。 まず、 欠損 型ウィルス感染細胞の培養上清を 28，000rpm、30分間遠心してウィルスをペレット にした後で、 lX109 HAU/mlになるように 10倍希釈した PBSに再懸濁し、 その一滴を 支持膜付きのマイクログリット上に滴下して室温で乾燥させた。 3.7%ホルマリ ンを含む PBSにより 15分間固定処理後、 0. 1%BSAを含む PBS溶液で 30分前処理をし 、 さらに同溶液で 200倍希釈した抗 Fモノクロナール抗体（f236)、 または抗 HNモノ クローナル抗体 （Miura, N. et al .， Exp. Cel l Res. ( 1982) 141 : 409-420) を 滴下して保湿状態で 60分間反応させた。 その後グリットを PBSで洗浄して、 200倍 希釈した金コ口ィ ド標識抗マウス IgG抗体を滴下して同じく保湿状態で 60分間反 応させた。続いてグリットを PBS、 滅菌蒸留水の順で洗浄し室温で風乾後、 グリッ トの上に 4%の酢酸ウラニウム溶液で 2分間染色し乾燥させた上、 JEM-1200EXI I電 子顕微鏡 （日本電子） を用いて観察、 撮影した。 その結果、 ウィルスのェンベロ —プのスパイク様構造は Fと HNのタンパク質からなることが明らかとなり（図 1 2 )、ヘルパー細胞の生産する Fタンパク質がこのビリオンに効率的に取り込まれて いることがわかった。 また、 F欠失ウィルス粒子は野生型ウィルスと同様に内部 にヘリカルな RNP構造とスパイク様構造を有していた （図 1 4 )。 [実施例 5 ] F欠失型 SeVベクターによる in vitroでの多様な細胞への高効率 遺伝子導入
くラット大脳皮質神経細胞の初代培養細胞への導入〉
ラッ ト大脳皮質神経細胞の初代培養細胞を、 以下のようにして調製し培養した 。 妊娠 18日 SDラット (SPF/VAF Crj : CD, 雌， 332g，〜9週 Charles River)をジェ チルエーテルにより深麻酔し、 腋下動脈放血により安楽死させた。 開腹し子宮か ら胎児を摘出し皮膚頭蓋を切り開き脳を取り出した。 実体顕微鏡下で大脳半球を 作業液 （5%ゥマ血清と 5%子牛血清、 10%DMS0を含む） DMEMに移し、 スライスして 氷温冷却したパパイン溶液 （1.5U,システィン 0.2mg、 ゥシ血清アルブミン 0.2mg 、 グルコース 5mg、 DNase O. lmg/ml ) を加え、 32°Cで 5分毎に転倒攪拌して 15分間 インキュベーションした。 懸濁液が十分濁り、 組織片が半透明になったことを確 認して組織片がばらばらになるまでピぺテイングを繰り返した。 32°Cにて 1200rpm 5分間遠心した後、細胞を B27 supplement添加した neural basal medium (GibcoBRL, Burl ington, Ontario, Canada)に再懸溺し、 不リ- d - 1リジン (Becton Dickinson Lab are, Bedford, MA, U. S.A. )でコ ーテ ィ ン グされた プレー ト 上に lxl05cel ls/dish蒔き、 37。Cヽ 5 %C02 で培養を行った。
その大脳皮質初代培養神経細胞 5xl05/wel lを 5日間培養後、 F欠失型 SeVベクタ —を感染させ （moi=5)、 さらに 3日間培養した。 1 % パラホルムアルデヒド、 5 % ャギ血清， 0.5% Triton- Xを含む固定液で 5分間室温で固定し、 BlockAce (雪 印乳業）にて室温 2時間プロッキングして 500倍に希釈されたャギ抗ラヅ ト microtubule - associated protein 2 (MAP - 2) (Boerhinger) IgGと 室温で 1時間 インキュベーションした。 PBS (-)で 1 5分毎に 3回洗浄後、 5%ャギ血清/ PBSで 100 倍希釈された cys3-結合抗マウス IgGと室温で 1時間インキュベーションした。 さ らに PBS (-)で 1 5分毎に 3回洗浄後、 細胞に Vectashield mounting medium (Vector Laboratories, Burl ingame, U. S.A. )をカロえ、 共焦点顕微鏡 (Nippon Bio-Rad MRC 1024, Japan)で 470- 500-nm または 510- 550- nm の excitation band-pass filterを付けた Nikon Diaphot 300倒立顕微鏡で MAP- 2の免疫染色と GFPの蛍光による 2重染色の蛍光観察を行った。 その結果、 MAP2 陽性神経細胞に は GFPがほぼ 100%導入されたことが明らかとなった （図 1 5)。
く正常ヒト細胞への導入〉
正常ヒト平滑筋細胞、 正常ヒト肝細胞、 正常ヒト肺毛細血管内皮細胞 （セルシ ステムズ） は大日本製薬から購入し、 SFM CS-C培地キット （セルシステムズ） で 37。Cヽ 5% C02で培養した。
正常ヒト平滑筋細胞 （図 1 5， Muscle)、 正常ヒト肝細胞 （図 15， Liver)、 正 常ヒト肺毛細血管内皮細胞（図 15 , Lung)等のヒト正常細胞に F欠失型 SeVベクタ —を感染して （m.o.i=5)、 GFP発現を観察した。 いずれの細胞においてもほぼ 100 %の導入効率で強力な GFP遺伝子発現をしていることが確認された （図 1 5)。 くマウス初代骨髄細胞への導入〉
さらに、 マウス初代骨髄細胞をリンネジマ一力一で分離して、 F欠失型 SeVべク ターを感染させる実験を行った。 まず、 C57BL マウス （6週令雄） に i50mg/kg に なるように 5- fluorouracil (5-FU,Wako Pure Chemical Industries) を腹腔内注 射（IP injection)し、投与 2日後、大腿骨より骨髄細胞を回収した。 Lympholyte - M (Cedarlane)を用いた密度勾配遠心によって単核細胞を分離した。 3xl06の単核細 胞に対し、 ピオチン標識された抗 CD45R (B220), 抗 Ly6G (Gr-1), 抗 Ly- 76 (TER- 119),抗 1 (Thyl.2)， 抗 Mac- 1を結合させたストレブトアビジン磁気ビーズ （ファ —ミジェン社， フナコシ社） の混合したものを 3X107を加え 4°Cにて 1時間反応 させ、 磁石により、 Lin+の細胞を除いた分画を回収した （Lin 細胞） （Erlich, S. et al.， Blood 1999. 93 (1), 80-86)。 Lin"細胞 4xl05細胞に対し、 2xl07 HAU/ml の SeV を加え、 さらに、 組換えラッ ト SCF (100ng/ml, BRL), 組換えヒ ト IL-6 (100U/ml)を加えた。 また 8xl05の トータル骨髄細胞に対して F欠損 SeV 4xl07HAU/m lxlO6の細胞に対し 5xl07HAU/mlの GFP- SeVを加えた。 なお、 GFP- SeV は、 SeV転写ュニット 11(；18 71^^2.0^(+18)(661^306113，1996,1:569-579)の制 限酵素 Notl開裂部位に、 緑色蛍光タンパク質 (GFP)遺伝子 （構造遺伝子長 717bp) に転写開始 (R1 )と終結 (R2)シグナルと介在（IG)配列を付加した Notl断片を PCRに より増幅させ、 導入して作製した。 既知の方法（Genes Cel ls, 1996 , 1 : 569-579 )に 従い、 LLC-MK2細胞および発育鶏卵を用いて GFP遺伝子を含むウィルスの再構築を 行い、 目的の遺伝子を含むウィルスを回収した。 GFP-SeVを感染して 48時間培養し た後、 細胞をそれぞれ 2群に分け、 一つにはフィコエリスリン （phycoerythrin ) (PE)標識抗 -CD117 (c-kit、 Pharmingen)を 1時間反応させ、 もう一群は対照群 とした。 3回 PBSにて洗浄した後、フローサイ トメ一タ（EPICS El ite ESP; Coulter, Miami , FL)による解析を行った。
その結果、 血液の primitive幹細胞のマ一力一である抗 C- kit抗体でェンリツチ した骨髄細胞にも F欠失型 SeVベクタ一は感染し、 GFP遺伝子発現が観察された （ 図 1 6 )。培養上清中の感染性粒子の確認は、細胞培養上清をトリプシンで処理後 、 LLC- MK2細胞に添加し、 3日後に GFP発現細胞の存在の有無により行った。 これ らの細胞のいずれにおいても感染性のあるウィルス粒子が放出されていないこと が確認された。
[実施例 6 ] ラット脳室へのベクターの投与
ラット（F334/Du Crj, 6 週令、 雌、 Charles River)に生理食塩水 （大塚製薬） で 10倍希釈した（5 mg/ml )ネンブ夕一ルナトリウム溶液 （ダイナボット） を腹腔内 注射により麻酔し、 小動物用脳定位固定装置 （DAVID K0PF社） を用いてウィルス の投与を行った。 投与部位は interaural l ineよりブレグマ （bregma) へ 5.2mm、 ラムダより右耳へ 2.0匪、 脳表面より 2.4匪 の位置に 30G の交換針 (Hami lton社） で 20〃1 (108 CIU) 注入した。 すると脳室の上衣細胞に GFPの高い発現が観察され た（図 1 7 )。さらに、 F欠失型 SeVベクタ一では注射部位の周辺のウィルスが接触 しうる上衣細胞または神経細胞にしか GFPタンパク質の発現が観察されず、これら の部位に病変所見が観察されなかった。 投与されたラットでは解剖されるまでに 外見的な行動異常や体重変化などが観察されず、 解剖後各臓器、 脳のほか、 肝臓 、 肺、 腎臓、 心臓、 脾臓、 胃、 腸等の組織器官のいずれにおいても病変所見が観 察されなかった。
[実施例 Ί ] F欠損 SeVゲノムからの F- l essウィルス粒子の形成
<1>
F非発現 LLC- MK2細胞および F発現 LLC- MK2細胞（LC- MK2/F7)に F欠損 SeVゥィルス を感染し、トリプシン存在下（ + )と非存在下（一）で培養して 3日後の細胞培養上清 の HA assayの結果を示した （図 1 8 A)。 これらの培養上清をそれぞれ発育鶏卵に 接種し、 2日培養後の鶏卵の漿尿液の HA assayの結果を示した（図 1 8 B)。 パネル 上部の 「C」 は対照群として用いた PBSを表わす。 Di lution (希釈） の数字はウイ ルス液の希釈倍率を表わす。 さらに、 発育鶏卵で HA陽性であった漿尿液（lane 11 および lane 12) を発育鶏卵に再接種して培養 2日後の漿尿液の HA assayを行った (図 1 9 C)。この結果、 F欠損 SeVウィルスを感染した F非発現細胞または発育鶏卵 では HAが陽性にもかかわらず、 発育鶏卵に再接種してもウィルスが全く増幅され ず、 この HA陽性のウィルス液が二次感染性がないものと判明した。
<2>
F非発現細胞で増幅された非感染性ウィルス液にウィルス粒子が存在するかに ついて検討した。 F発現細胞の培養上清、 HA陽性で非感染性漿尿液、 および野生 型 SeVから QIAamp viral RNA mini kit(QIAGEN)により調製した total RNAを F遺伝 子と HN遺伝子をプローブとして用いてノーザンプロッティングを行った。 その結 果、漿尿液、 または F発現細胞の培養上清のウィルス由来の RNAのいずれも HN遺伝 子のプローブでバンドが検出されたが、 F遺伝子のプローブでバンドが検出され なかった（図 1 0 )。 この HA陽性で感染性がない液には F欠損ゲノムを持っている 非感染性のウィルス様粒子が存在することが判明した。 さらに、 この HA陽性で感 染性がないウィルス液を免疫電顕で調べたところ、 ウィルス粒子が確認され、 ビ リオンのェンベロープは金コ口ィ ド標識した HN蛋白を認識する抗体では反応した が、 金コロイ ド標識した F蛋白を認識する抗体では反応しなかった（図 2 0 )。 こ のことは F- lessのビリオンの存在を示し、 F蛋白がなくても HN蛋白単独でウィルス がビリオンとして形成されることが判明した。 F単独で SeVビリオンが形成できる ことはすでに報告されおり (Leyer, S. et al . , J Gen. Virol 79, 683-687 ( 1998) )、 今回の結果は HN蛋白単独に SeVビリオンを形成できることが初めて明らかとな つた。 このような F- lessビリオンを発育鶏卵で一過的に大量調製できることは、 SeV F欠損 RNPを包むビリオンを大量に生産ができることを示している。
<3>
前述したように発育鶏卵で一過的に増幅された F- lessウィルスビリオンはセン ダイウイルスが感染可能な細胞にはまったく感染性を示さない。 そこで機能的な RNP構造はエンベロープに包まれていることを確認するために、カチォニックリポ ゾーム（DOSPER，Boehringer mannheim)と混合して、 室温で 15分間インキュべ一シ ヨンして F発現細胞と非発現細胞にトランスフヱクシヨンした。 その結果、 カチ ォニックリボソームと混合しない場合は全く GFP発現細胞が観察されなかったの に対し、力チォニックリボソームと混合した場合は GFPの発現がいずれの細胞にお いても観察された。 F非発現細胞では GFPは単細胞で発現し、隣細胞に広がらない のに対し、 F発現細胞では GFP発現細胞は広がって、 コロニーが形成されることが 観察された （図 2 1 )。 このことから、 発育鶏卵で一過的に増幅された感染性のな いビリオンはトランスフエクシヨンなどの方法を用いて細胞に導入すれば、 遺伝 子を発現しうることが明らかとなった。
[実施例 8 ] FHN欠損 SeVゲノムからウイルスの再構築および増幅
く FHN欠損ゲノム cDNAの構築〉
FHN欠失型 SeVゲノム cDNA (pSeV18+/AFHN) の構築はまず pUC18/KSを EcoRIで消 化して pUC18/Ecoを構築し、 F遺伝子の開始コドンから HN遺伝子の終止コドンまで の間の全配列を（4866- 8419) を欠失させ、 Bsiwl部位（cgtacg)で連結し構築した。 FHN欠損部位の配列をシーケンスで確認した後、 EcoRIフラグメント （4057bp) を ゲルから回収して PUC18/KSの EcoRIフラグメントと置き換えて構築した。 この FHN 欠損領域を含む Kpnl/Sphlフラグメン ト（14673bp)をゲル回収して pSeV18+の Kpnl/Sphlフラグメントと置き換え、 プラスミ ド pSeV18+/AFHN が得られた。 一方、 GFPを導入した FHN欠損 SeV cDNAの構築は次のように行った。 pSeV18+/厶 FHN から Sal l/Xholフラグメント（7842bp)を回収して pGEMllZ(Promega)にクロ二 ーングし、ブラスミ ド pGEMl lZ/SXdFHNとした。 FHN欠失部位に d2EGFP (Clontech)の ATG-TAA (846 bp) の両端に Bsiwl部位を付加した PCR産物を Bsiwl酵素で消化して 、 pGEMllZ/SXdFHNの FHN欠損部位の Bsiwl部位に連結した。 得られたプラスミ ドは pSeV18+/AFHN-d2GFP とした。
く FHN欠損蛋白共発現細胞の作成〉
F遺伝子を発現するプラスミ ドは前述した F欠損蛋白発現細胞株の作製に用い たものと同一のもので、 HN遺伝子を発現するプラスミ ドはそれと同様な方法で構 築し、 HNの 0RFを含むフラグメントを pCALNdlw (Araiら，前記）のユニークな Swal部 位に挿入し， プラスミ ド pCALNdLw/HNとした。
LLC- MK2細胞に pCALNdLw/Fと pCALNdLw/HNを同量または異なる量比で混合し、 mammal ian transfection kit (Stratagene) を用レ、そのフ。口卜コ——リレ（こ従って遺 伝子導入を行った。 G418で 3週間選択した後クロニーングした。 得られた薬剤耐 性クローンはそれぞれ Cre DNA レコンビナーゼを発現する組換えアデノウイルス (Ade/Cre) (斉藤ら，前記） で感染し （moi=10)、 Fと HN蛋白質の誘導発現 3日後細 胞を PBS (-)で 3回洗浄して回収し、 ウエスタンプロッティング法を用いて抗 SeV F と抗 SeV HN蛋白質のモノクローナル IgGにより検出した（図 2 2 )。
く pGEM/FHNの構築〉
pCALNdLw/Fと pCALNdLw/HNを構築に用いた Fと HNフラグメントをそれぞれ pGEM4Z 、 pGEM3Z (Promega社）にクローニングし、 pGEM4Z/Fと pGEM3Z/HNを得た。 pGEM3Z/HN の T7プロモ一ターと HNを含む領域を PvuI I酵素で消化して得られたフラグメント を回収し、 PGEM4Z/Fの F遺伝子下流の Saclユニークサイ 卜で切断し平端化した部位 にライゲーシヨンした。 F遺伝子と HN遺伝子を同一方向に並べたものは、 抗 Fまた は抗 HNモノクロナ一ル抗体でウエスタンブロッティングを行い、 Fと HN両方の蛋白 質は同時に発現できることを確認した。
く FHN欠損ウィルスの再構築〉
FHN欠損ウィルスの再構築（P0) は二通りに行った。一つは F欠損ウィルスの再 構築と同様に RNPトランスフヱクシヨン法を用いた。 もう一つは T7で FHN蛋白を共 発現プラスミ ドを供給して再構築を行った。 すなわち、 T7プロモーターの制御下 で F， HNタンパク質を発現するプラスミ ドを別途作製して、 これにより Fおよび HN タンパク質を供給して再構築を行った。 いずれの方法においても再構築したもの は FHN共発現細胞で増幅を行った。 FHN欠損 GFP発現 SeV cDNA (pSeV187AFHN-d2GFP ) ， pGEM/NP, pGEM/P， pGEM/L, pGEM/FHNをそれぞれ、 12 /g/10cra dish, 4/^g/10cm dish, 2〃g/10cm dish, 4 zg/lOcm dish, 4 /g/10cm dishの量比で混合し （最終 容量， 3ml/10cm dish)、 前述した F欠損 SeVの再構築と同様な方法で LLC- MK2細胞に 遺伝子導入した。 遺伝子導入 3時間後培地を AraC(40〃g/ml， SIGMA)，トリプシン (7.5〃g/ml，GIBC0)入りの MEMに交換し、 さらに 3日間培養した。 遺伝子導入後 2 日目で蛍光実体顕微鏡で観察し、 pGEM/FHNの添加の有無の違いを検証し、 GFP発現 細胞の広がりでウィルスの形成を確認した。 その結果、 再構築時に pGEM/FHNを添 加した場合は GFP発現細胞の広がりが確認され、 pGEM/FHNの添加がない場合は GFP 発現はシングル細胞でしか観察されなかった （図 2 3 )。 FHN蛋白再構築時に添加 することでウィルスのビリオンが形成されたことを示した。一方、 RNPトランスフ ェクションの場合は F欠損と同様に P1の FHN発現細胞でゥィルスの回収に成功した (図 2 4上）。
Ade/Creを感染して 6時間以後に FHN蛋白が誘導発現された細胞に FHN欠損ウイ ルス液を感染し増幅ができたことを確認した （図 2 4下）。
FHN欠損 GFPを発現する cDNAから再構築されたウィルス液は LLC-MK2， LLC- MK2/F, LLC-MK2/HN, LLC-MK2/FHNに感染してトリプシンの添加の有無で培養した 。 培養 3日後に GFP蛋白発現細胞の広がりを確認したところ、 LLC- MK2/FHNでのみ GFPの広がりが観察され、 このウィルス液は FHN共発現に特異的かつトリブシン依 存的に増幅されることが確認された（図 2 5 )。
FHN欠損ウィルスゲノムを確認するため、 LLC- MK2/FHN細胞から回収された培養 上清を遠心した後、 QIAamp Viral RNA mini kit (QIAGEN)でそのプロトコ一ルに 従って RNA抽出を行った。 この RNAを Superscript Preampl if i cation System for first Strand Synthesis (GIBCO BRいにより RT-PCRのテンプレート合成を行い、 TAKARA Z- Taq (宝酒造） を用いて PCRを行った。 対照群は F欠損ウィルスを用いた 。PCRプライマーは M遺伝子と GFP遺伝子の組み合わせ、 または M遺伝子と L遺伝子 の組み合わせを用いて行った（M遺伝子と GFP遺伝子の組み合わせ （M-GFP) につい ては forward: 5，一 atcagagacctgcgacaatgc "酉己歹 ll番号 ： 1 3， reverse : 5，一 aagtcgtgctgcttcatgtgg/配列番号： 1 4 ; M遺伝子と L遺伝子の組み合わせ （M- につレヽては forward: 5，一 gaaaaacttagggataaagtccc ΐ己列番号： 1 5， reverse : 5， -gttatctccgggatggtgc/配列番号： 1 6 )。 その結果、 Mと GFP遺伝子をプライ マ一に用いた場合は RT条件下で F欠損と FHNとも欠損ウィルス共に特異的なバンド が検出された。 Mと L遺伝子をプライマーに用いた場合は、 FHN欠損は GFPを含んだ 所定のサイズのバンドが検出され、 F欠損の場合は HN遺伝子を含んだサイズで長く なったバンドが観察された。ゲノム構造は FHN欠損していることは明らかとなった (図 2 6 )。
一方、 FHN欠損ウィルスを F発現細胞に F欠損と同様に感染して、培養して 4日目 培養上清を回収し、 LLC- MK2， LLC- K2/F， LLC- MK2/FHNへの感染実験を行った。 そ の結果、 いずれの感染細胞においても GFP発現細胞が観察されず、 これらの細胞へ の感染性がないことを示した。 しかし、 F蛋白単独でウィルス粒子を形成できるこ とがすでに報告され (Kato, A. et al .， Genes cel ls 1 , 569-579 ( 1996) )、 肝臓 にあるァシァ口糖蛋白リセプタ一（ASG-R)を介して肝細胞に特異的に感染できる ことが報告された (Spiegelら J. Virol 72, 5296-5302, 1998)。 従って、 FHN欠損 RNAゲノムを持ち、ウィルスェンベロープは F蛋白のみで形成されたビリオンが F 発現細胞の培養上清に放出されうることが考えられる。そこで、 FHN欠損ウィルス を感染した F発現細胞の培養上清を回収し、 遠心した後上記の方法と同様に RNA 抽出を行い、 前述した方法と同様に RT- PCRで解析した。 その結果、 図 2 7で示し たように FHN欠損ゲノムを含む RNAが存在することが判明した。
この他、 VSV- Gとシユードタイプ化したウィルスのビリオンのウエスタンブロッ ティングによる解析では、 F、 HN蛋白が発現していないことは明らかである。 FHN 欠損ウィルスビリオンの生産系が確立したと言える。
さらに、 F蛋白発現細胞から放出されたビリオンをカチォニックリボソーム （ 50〃 1の D0SPER/500〃 1/wel 1 )との混合の有無で FHN発現細胞または非発現 LLC-MK2 細胞に重層した。 その結果、 前述した F-less粒子の場合と同様、 D0SPERと混合し て細胞に重層した場合には GFP発現細胞の広がりが観察されが、 HN- lessのビリォ ンのみでは全く細胞に感染性なく、 GFP発現細胞が観察されなかった。 FHN非発現 細胞では GFP発現細胞が観察されたが、ウィルスが再形成され広がったことが認め られなかった。
このような F発現細胞から回収されるウイルス様粒子が ASG- R遺伝子を持続発現 する細胞株や非発現細胞株、 または肝細胞に重層して感染し、 Spiegelらの方法で 肝臓特異的、 または ASG-Rに特異的に感染するかを調べることができる。
[実施例 9 ] 欠損ゲノム Aウィルスベクタ一の応用性
1. 上に述べた系で増幅された F欠損 RNPは F- lessのウィルスエンベロープに包ま れており、 このエンベロープを化学的に修飾法などにより所望の細胞導入能を付 加し、 または遺伝子導入試薬や遺伝子銃のようなもので細胞に導入して（RNPトラ ンスフエクシヨン、 または RNPインジェクション）、 その組み換え RNAゲノムが導 入細胞で自律的に RNA複製または蛋白を生産し続けることが可能である。
2. HNの細胞内ドメインを残し、 細胞外ドメインを他のレセプ夕一を特異的に標 的できるリガンドを融合させ、 キメラ蛋白を生産できる組み換え遺伝子をウィル スゲノムに組み込めば、 特異性のある標的できるベクターの生産が可能となり、 また、 この組み換え蛋白の生産細胞でベクターを調製可能である。 これらのべク 夕一は遺伝子治療、 ワクチンなどに応用可能である。
3. FHNとも欠損する SeVウィルスの再構築に成功したことから、 GFP遺伝子の代わ りに夕一ゲッティング可能なエンベロープキメラ蛋白の遺伝子を FHN欠損部位に 導入し、 FHN欠損ベクターと同様な方法で再構築し、 FHN発現細胞で一度増幅して
、 非発現細胞に感染して、 ウィルスゲノムから転写された夕ーゲッティング可能 なキメラエンベロープ蛋白のみによって形成されたビリオンを回収すれば、 夕一 ゲヅティングベクターの生産が可能となる。
4. これまでに、 センダイウィルスのミニゲノム、 ^，？ と？遺伝子で細胞に同時 に遺伝子導入してミニゲノムを包む F蛋白単独で形成されたビリオンが報告され
(Leyerら， J Gen.Virol 79, 683-687、 1998) また、 マウスの白血病ウィルスをセ ンダイ F蛋白でシュ一ド化したベクタ一も報告されている（Spiegelら J. Virol 72, 5296-5302, 1998)。 また、 F蛋白質がトリプシンで解裂された後 ASG-Rを介して肝 臓細胞に特異的に夕一ゲッティ ングできると報告されている （Bitzerら J.Virol .71 , 5481-5486, 1997)。 前の報告の系は一過的な粒子形成系であり、 持 続的にベクタ一の粒子回収が困難である。また Spiegelらはセンダイ F蛋白でシュ 一ドタイプ化したレトロウィルスベクターを報告しているが、 レトロウイルスは 分裂細胞にしか遺伝子導入できないなどの固有の問題を抱えている。 本発明で回 収された、 FHN共欠損 SeVウィルスゲノムを持ち、 F蛋白のみエンベロープ蛋白を持 つウィルス粒子等は、 細胞分裂に関係なく効率的な細胞質で自律複製可能な RNA ベクターであり、 新規のウィルス粒子であり、 またその大量生産が可能な実用的 な系である。
[実施例 1 0 ] FHN欠損 SeVゲノムからウィルスの再構築および増幅
センダイウィルス、 麻疹ウィルス等の多くの一本鎖マイナス鎖 RNAウィルスで、 ウィルスゲノムをクロ一ニングした cDNAから感染可能なウィルス粒子を再構成す る技術が確立された。 ほとんどの系で、 T7プロモー夕一下流に cDNA、 NP, P, L遺伝子を導入したプラス ミ ドを細胞内に導入し、 T7ポリメラ一ゼを用いて cDNA、 各遺伝子を発現させるこ とにより再構成を行っている力 T7ポリメラーゼの供給には、 T7ポリメラーゼ発 現組み換えワクシニアウィルスが主に使われている。
T7発現ワクシニアウィルスは、 ほぼすベての細胞に効率よく T7ポリメラ一ゼを 発現させることができるが、 ワクシニアウィルス由来の細胞障害性のために、 感 染細胞を 2、 3日しか生存させることができない。 多くの場合、 抗ワクシニア薬 剤としてリファンピシンを用いているが、 加藤らの系 （Kato， A. et al .， Genes cel ls 1 , 569-579 ( 1996 ) ) では、 リファンピシンのほかに、 AraCを並行して用い ることにより、 ワクシニアウィルスの増殖を最小限に抑え、 センダイウィルスの 再構成を効率よく行うことに成功した。
しかしながら、センダイウィルスを始めとするマイナス鎖 RNAウィルスの再構成 は I x lO5細胞中に再構成されたウィルスが数粒子かそれ以下という効率で、 レト ロウィルス等のほかのウィルスに比べるといまだにかなり低いのが実情である。 この理由として、 ウィルス自体が持つ、 再構成までの複雑な過程（裸の MAに別途 転写、 翻訳されたタンパク質がついて RNP様構造となり、 その後、 ポリメラーゼに より転写、 複製が行われる） とともに、 ワクシニアウィルスを用いることによる 細胞障害性も挙げられる。
T7ポリメラ一ゼを供給する手段として、 ワクシニア以外にアデノウイルスの系 も試みたが、 よい結果は得られなかった。 ワクシニアウィルスは T7ポリメラ一ゼ のほかに細胞質で働く Aキャッピング酵素も自身の蛋白としてコードしており、 この酵素が、細胞質で T7プロモーターにより転写された RNAをキヤッビングして安 定化することにより翻訳効率を高めていると考えられる。 本発明では、 ワクシニ ァウィルスを Psoralen- Long- Wave-UV法で処理することにより、ワクシニアウィル スに由来する細胞障害を回避し、 センダイウィルスの再構成効率を高めることを 試みた。 ソラレンと長波長紫外線による DNAクロスリンキングにより、 DNAをゲノムに持 つウィルスの複製を阻害し、 しかし特に初期遺伝子の発現には影響を与えない状 態を作り出すことが可能である。 ワクシニアウィルスはゲノム長が長いので、 こ の系によるウィルスの不活化の影響が顕著にあらわれると考えられる（Tsung, K. et al .， J Virol 70, 165-171 ( 1996 ) )。
自立増殖可能な野生型ウィルスの場合、 再構成により一粒子でもウィルスがで きていればトランスフヱクシヨンした細胞を発育鶏卵に接種してセンダイウィル スを増殖させることが可能なため、 再構成の効率、 そしてワクシニアウィルスの 残留にそれほど気を使わなくてもよい。
しかし、 ウィルスの複製、 粒子形成の機構などを調べるために作る様々な変異 ウィルスの再構成では、 増殖に発育鶏卵を使用できずにウィルス由来のタンパク 質を発現している細胞株などを用いざるを得ない場合もありうる。 また、 変異ゥ ィルスまたは欠損ウィルスが野生型ウィルスに比べて顕著に増殖が遅いケースも 、 十分考えられる。
こうした変異を持つセンダイウィルスを増殖させるためには、 トランスフエク シヨン後の細胞を次代の細胞に重層して長時間培養しなければならない。 そのた めに、 再構成の効率とワクシニアウィルスの残存夕イタ一が問題になってくる。 本方法では、 再構成効率を上昇させるとともに、 残存ワクシニアウィルスのタイ 夕一を減少させることもできた。
本方法を用いて、 現在までの、 未処理のワクシニアウィルスを用いた系では得 られなかった変異ウィルスを再構成によりうることができた（F、F H N欠損ウイ ルス）。この系は、今後増えるであろう変異ウィルスの再構成に大きなツールとな ると考える。 そこで本発明者らは、 ソラ一レンと紫外線（UV)の量を検討し、 ワク シニアウィルスの不活化の条件を検討した。
<実験 >
まず、 照射時間を二分間に定め、 ソラレン濃度の検定を行った。 不活化の検定 は、 プラーク形成によるワクシニアウィルスのタイ夕一の測定と、 T7プロモータ —支配下 pGEM- luciプラスミ ド、センダイウィルスミニゲノムによる T7ポリメラー ゼ活性の測定によって行った。 センダイウィルスミニゲノムによる T7ポリメラ一 ゼ活性の測定はセンダイウィルスミニゲノムのプラスミ ドと、 T7でセンダイウイ ルス NP、 P、 L蛋白を発現する pGEM/NP, pGEM/P， pGEM/Lプラスミ ドと同時に細胞に トランスフエクシヨンし、 リボヌクレオ蛋白複合体を形成させ、 センダイウィル スの Aポリメラ一ゼによりルシフェラ一ゼ酵素蛋白の転写を調べる系である。
UV照射二分間では、 ソラレンの濃度に応じてワクシニアウィルスのタイ夕一の 減少が見られた。 しかし、 T7ポリメラ一ゼ活性は、 ソラレン濃度が 0、 0.3, 1 μ. g/ml迄は変化を見せず、 10〃g/mlでは 10分の 1 程度に減少していた。 （図 2 8 ) さらに、 ソラレン濃度を 0.3〃g/mlに固定し、 紫外線照射時間を検討した。照射 時間が増大するに連れ、 ワクシニアウィルスの夕イタ一は減少したが、 3 0分ま での照射では T7ポリメラーゼ活性への影響は見られなかった。 このとき、 0.3 g/ml、 3 0分照射の条件では、 T7ポリメラーゼ活性に影響を与えず、 夕イタ一を 1000分の 1にまで減少させることができた。 （図 2 9 )
しかしながら、タイ夕一が 1000分の 1にまで減少したワクシニアウィルスでも処 理前のタイ夕一に換算して moi=2 (処理後の残存タイ夕一で moi=0.002) で感染し たときの 24時間後の CPEは、 未処理のウィルスを moi=2で感染させたときのそれと 変わらなかった （図 3 0 )。
この条件で処理したワクシニアウィルスを用い、 センダイウィルス再構成の効 率を検討した。 再構成は、 前記加藤らの方法をモディファイし、 以下の手順で行 つた。 6wel lのマイクロプレートに LLC- MK2細胞を 3x l05細胞/ wel lで撒き、 終夜 培養した後、 PLWUV処理前の夕イタ一換算で 6xl05pfu/100〃lとなるようにヮクシ ニァウィルスを希釈し、 PBS洗浄後の細胞に感染させた。 1時間の感染後、 100 1の 0PTI-MEMにプラスミ ド、 pGEM- NP， P, L、 そして cMAをそれぞれ 1 , 0.5， 1 , 4〃gを加えたものに、 Superfect (QIAGEN) を 10/ 1加え、 室温で 1 5分放置し た後 l mlの 0PTI- MEM (GIBCO) (Rif . AraCを含む） をくわえ、 細胞に重層した。
トランスフエクシヨン後 2、 3、 4日目に細胞を回収し、 遠心後、 300〃l/wel l の PBSに縣濁した。 この縣濁液を原液、 あるいは 10倍、 100倍希釈した細胞溶液 100 〃1を受精後 10日目の発育鶏卵に各希釈 4個ずつ接種した（1χ105，1χ104, 1χ103細胞 をそれぞれ接種）。 3日後鶏卵から尿液を回収し HA試験によりウィルス再構成の有 無を調べた （表 1 )。 lxlO5細胞を接種した鶏卵のうち、 HA活性があった鶏卵を一 点、 104では十点、 103では百点と数えて、 再構成の効率 （Reconstitute Score) を求めた （図 3 1 )。 計算式は表 1の通り。
"Cヽ
表 1 ワクシニアウィルスの UV処理時間のセンダイウィルス再構成効率に対する
) (μ ίε+89ηUο ! 3J8 υΕβ x-
Figure imgf000057_0001
また、 トランスフエクシヨン後 2 、 3 、 4日での、 細胞に残存するワクシニア ウィルスのタイ夕一を測ったところ、 トランスフエクシヨン前に与えたタイ夕一 に比例して、 処理をしたものが少なくなつていた （図 3 2 )。
ワクシニアウィルスを PLWUVで不活化することにより、 T7ポリメラ一ゼ活性には 影響を与えず、 タイ夕一を 1000分の 1にまで下げることができた。 しかし、 ヮクシ ニァウィルス由来の CPEは、顕微鏡観察で未処理の、 1000倍の夕イタ一を持つウイ ルスのそれと変わらなかった。 この条件で処理をしたワクシニアウィルスを、 センダイウィルス再構成に用い ることにより、 センダイウィルスの再構成効率が、 数十倍から百倍ほど増大した
(図 3 1 )。同時に、 トランスフエクシヨン後に残ったワクシニアウィルスのタイ 夕一は、 5pfu/105 cel ls以上ではなかった。 従って、 複製可能なワクシニアウイ ルスの残留は 0.005%以下に抑えられた。
[実施例 1 1 ] シユード夕イプセンダイウィルスの作製
<1> VSV-G 遺伝子産物を誘導発現するヘルパー細胞の作製
VSV-G 遺伝子産物は細胞障害性を有しているため、 Cre リコンビナ一ゼにより VSV-G遺伝子産物が誘導発現されるよう設計されたプラスミ ド pCALNdLG(Arai T. ら J. Virology 72 ( 1998) pl l l5- 1121 ) を用い、 LLC-MK2 細胞での安定導入株の 作出を行った。 LLC-MK2 細胞へのプラスミ ドの導入は、 リン酸カルシウム法 （ CalPhosTMMa龍 al ian Transfection Kit、 クローンテック社製） により、 添付マ二 ュアルに従って行った。
10 cmプレートを用い、 60%コンフルェントまで生育した LLC- MK2細胞に 10〃 gのプラスミ ド pCALNdLGを導入後、 10 ml の MEM- FCS10%培地にて、 37°Cの 5 % C02 インキュベータ一中で 24時間培養した。 24時間後に細胞を剥がし、 10 mlの 培地に懸濁後、 10 cm シャーレ 5枚を用い 5 mi l枚、 2 ml 2枚、 0.5 ml 2枚に 捲き、 G418(GIBC0- BRL社製） 1200 〃g/mlを含む 10 ml の MEM-FCS10%培地で培養 を行い、 2日毎に培地交換しながら、 14日間培養し、 遺伝子の安定導入株の選択を 行った。 該培養により生育してきた G418に耐性を示す細胞は、 クロ一ニングリン グを用いて 2 8株を回収した。 各クローンは 10 cm プレートでコンフルェントに なるまで拡大培養を続けた。
各クローンについて、 Cre リコンビナ一ゼを含む組み換えアデノウイルス AxCANCreを感染後、 抗 VSV-Gモノクローナル抗体を用いて、 VSV-Gの発現を以下 に記載のウエスタンプロット法により調べた。
各クローンは 6 cm シャーレにて、 コンフルェントまで生育させた後、 アデノ ウィルス AxCANCreを齋藤らの方法 （上記） により M0I=10で感染後、 3日間培養 した。 該細胞は培養上清を取り除いた後、 PBS緩衝液で洗浄し、 0.05% トリプシ ン、 0.02% EDTA (エチレンジァミン 4酢酸）を含む PBS緩衝液 0.5 mlを加え、 37 °C、 5分間インキュベートすることによりシャーレより剥がした。 該細胞は 3 ml PBS緩衝液に懸濁後、 l，500 x gで 5分間遠心し、 細胞を集めた。 得られた細胞は さらに 2ml PBS緩衝液に再度懸濁後、 l,500 x gで 5分間遠心分離することにより 、 細胞を集めた。
該細胞は- 20°Cで保存することが可能で、必要に応じて解凍して使用することが できる。 集めた細胞は 100 jul の 細胞溶解液 （RIPA バッファー、 ベ—リンガー マンハイム社製） により溶解し、 該細胞の全蛋白質 （ 1レーン当たり l xlO5細胞 )を用いてウエスタンブロットを行った。細胞溶解液を SDS—ポリアクリルアミ ド ゲル電気泳動用サンプルバッファー 〔6mM トリス—塩酸 （pH6.8)、 2 % SD S, 1 0% グリセロール、 5% 2—メルカブトエタノールからなる緩衝液〕 に溶解 し、 95 °C 5分加熱後電気泳動用試料に供した。 該試料を SD S—ポリアクリル アミ ドゲル （マルチゲル 10/20、 第一化学社製） を用い、 電気泳動により分画し 、 分画された蛋白質をセミ ドライブロッ ト法によ り転写膜 （ I隱 obilon- P TransferMembranes, Millipore社製）に転写した。 転写は、 1 00% メタノ 一 ルに 20秒、 水に一時間浸した転写膜を使用し、 ImA/cm2定電流の条件で 1時間行った。
該転写膜を、 40 m 1のブロッキング溶液 （ブロックエース、 雪印社製） 中で 1時間振盪させた後、 PB S緩衝液で一度洗浄した。
該転写膜および 1 0%ブロッキング溶液を含む PB S緩衝液で 1/1 000に 希釈した抗 VSV- G 抗体 （クローン P4D4、 シグマ社製） 5mlをビニールバッグ に入れてシールし、 4°Cで静置させた。
該転写膜を 2度 40 ml の PB S—O. l %Twe e n20に 5分間浸漬し、 洗 浄した後、 PB S緩衝液で 5分間浸潰し、 洗浄した。 該転写膜および 1 0 %ブロッキング溶液を含む P B S緩衝液で 1 / 2 5 0 0に 希釈したパーォキシダーゼで標識された抗マウス I g G抗体 （anti- mouse i mmunog 1 obu 11 n , Amersham社製) 5 m 1をビニールノ^*；ヅグに入れ、 シ一ル をした後、 室温で 1時間振盪させた。
振盪後、 該転写膜を 2度 P B S— 0. 1 % T w e e n 2 0に 5分間浸漬し、 洗浄 した後、 P B S緩衝液に 5分間浸潰し、 洗浄した。
発光法 (ECL Western blotting detection reagents, Amersham 社製) により 、抗 VSV-G抗体と交叉の見られる該転写膜上の蛋白質の検出を行った。結果を図 3 3に示す。 3クローンで、 AxCANCre感染特異的な VSV- Gの発現が検出され、 VSV- G 遺伝子産物を誘導発現する LLC- MK2 細胞の作出が確認された。
得られた細胞株の一株を LLCG- L1と呼び、 抗 VSV抗体を用いてフローサイ トメ ト リー解析を行った （図 3 4 )。 その結果、 LLCG- L1では、 VSV-G 遺伝子誘導発現時 特異的に抗体との反応性が検出され、 VSV- G タンパク質が細胞表面に発現される ことが確認された。
<2> ヘルパー細胞を用いた F 遺伝子を欠失したゲノムを有するシユードタイプ センダイウィルスの作製
F 遺伝子を欠失したゲノムを有するセンダイウィルスを VSV-G遺伝子発現細胞 に感染させ、 VSV-Gを外被に有するシユードタイプウィルスの産生が見られるかを 、 上記実施例に記載の GFP遺伝子を含む F 欠失型センダイウィルスを用い、 GFP遺 伝子の発現を指標に調べた。 その結果、 Creリコンビナーゼを含む組み換えアデ ノウィルス AxCANCre を感染しない LLCG- L1では、 F 欠失型センダイウィルスの感 染によりウィルス遺伝子が導入され、 GFP発現細胞は検出されるものの、 その細胞 数は増えず、 VSV-Gを誘導発現させた紬胞では、 経時的に GFP発現細胞の増加が認 められた。 その上清の 1 / 5量をさらに、 新たな VSV- G を誘導発現させた細胞に 添加したところ、 前者由来の上清では、 遺伝子導入が全くみとめらず、 後者由来 の上清では遺伝子導入および GFP発現細胞の増加が認められた。また、後者由来の 上清を VSV- Gを誘導しない LLCG- LI細胞に添加した際には、遺伝子導入はされるも のの、 GFP発現細胞の増加は認められなかった。 以上の結果から、 VSV- G 発現細 胞特異的にウィルスが増殖することが認められ、 VSV-Gとのシュ一ドタイプの F欠 失型センダイウィルスの生成が認められた。
<3> F 遺伝子を欠失したゲノムを有するシユード夕イプセンダイウィルスの産 生条件の検討
VSV-G 遺伝子の発現量の影響を調べるため、 AxCANCre の感染量 （MOI= 0、 1. 2 5、 2 . 5、 5、 1 0 ) を変え、 一定量の F遺伝子を欠失したゲノムを有するシ ユードタイプセンダイウィルスを感染後、 7日目から 8日目の上清を回収し、 さ らに VSV- G誘導前、 誘導後の細胞に感染させ、 5日目の GFPの発現している細胞の 数を比較したところ、 MOI= 0 ではウィルスの産生が全く認められず、 M0I=10の条 件で最も多いことがわかった （図 3 5 )。 また、 経時的にウィルス産生量を調べた ところ、 シュ一ドタイプセンダイウィルス感染後 5日目以降から産生量が上昇し、 8日目まで産生が確認できた （図 3 6 )。 ウィルス力価の測定は、 VSV- G誘導前の 細胞に、 1 0倍ずつ段階的に希釈したウィルス液を添加し、 感染後 5日目の GFPの 発現細胞を数えることにより、 ウイルス液中の細胞への感染粒子数（CIU) を求め た。 その結果、 最高ウィルス産生量は 5 X 105 CIU/mlであった。
<4> F遺伝子を欠失したゲノムを有するシユード夕イプセンダイウィルスの抗 VSV抗体による感染性の影響
VSV-G 発現株を用いて得られた F 遺伝子を欠失したゲノムを有するシユード夕 イプセンダイウィルスが、 外被に VSV-G タンパク質を有するかに関して、 抗 VSV 抗体を用いて感染性の影響されるかどうかの中和活性を調べた。 ウィルス液と抗 体を混合し、 室温で 3 0分静置後、 VSV- G を誘導発現していない LLCG- L1 細胞に 感染し、 5日目の遺伝子導入能を GFP発現細胞の有無で調べた。 その結果、 抗 VSV 抗体で感染性の完全な抑制が認められ、 本来の外被を有する F 遺伝子を欠失した
'つた（図 3 7 )。このこ とから、 今回得られたウィルスが、 外被に VSV- G タンパク質を有するシユード夕 ィプのセンダイウィルスであり、 抗体によりその感染性が特異的に抑えられるこ とが明らかとなった。
<5> シユード夕イプセンダイウィルスが F 欠失型ゲノムを有することの確認 今回 VSV-G遺伝子発現細胞で増殖したウィルスが F欠失型であることを、 感染 細胞抽出液のタンパク質のウエスタン解析により調べた。 ウエスタン解析は、 上 記に記載の方法により行った。 一次抗体として、 ゥサギより調製された、 抗セン ダイウィルスポリクローナル抗体、マウスより調製された抗 Fタンパク質モノクロ ーナル抗体、 マウスより調製された抗 HN夕ンパク質モノクローナル抗体を用い、 2次抗体に、 抗センダイウィルスポリクローナル抗体の場合はパーォキシダーゼ で標識された抗ゥサギ I g G抗体、抗 Fタンパク質モノクローナル抗体、抗 HNタン パク質モノクローナル抗体の場合はパーォキシダ一ゼで標識された抗マウス I g G抗体を用いた。 その結果、 センダイウィルス由来のタンパク質および HNタンパ ク質は検出されるものの、 Fタンパク質は検出されなかったことから、 F欠失型で あることが確認された。
<6> ヘルパー細胞を用いた Fおよび HN遺伝子を欠失したゲノムを有するシユー ド夕ィプセンダイウイルスの作製
Fおよび HN 遺伝子を欠失したゲノムを有するセンダイウィルスを VSV- G遺伝 子発現細胞 LLCG- L1に感染させ、 VSV- Gを外被に有するシユードタイプウィルスの 産生が見られるかを、 上記実施例に記載の GFP遺伝子を含む F、 HN欠失型センダイ ウィルスを用い、 上記実施例と同様の方法で GFP遺伝子の発現を指標に調べた。 その結果、 VSV-G発現細胞特異的にウィルスが増殖することが認められ、 VSV-Gと のシユードタイプの F 、 HN欠失型センダイウィルスの生成が認められた （図 3 8 )。 ウィルス力価の測定は、 VSV- G誘導前の細胞に、 1 0倍ずつ段階的に希釈した ウィルス液を添加し、 感染後 5日目の GFPの発現細胞を数えることにより、 ウィル ス液中の細胞への感染粒子数 （CIU) を求めた。 その結果、 最高ウィルス産生量は 1 x 106 ClU/mlであった
o
<7> シユード夕イプセンダイウィルスが Fおよび HN欠失型ゲノムを有するこ との確認
今回 VSV- G 遺伝子発現細胞で増殖したウィルスが Fおよび HN 欠失型であるこ とを、 感染細胞抽出液のタンパク質のウエスタン解析により調べた。 その結果、 センダイウィルス由来の夕ンパク質は検出されるものの、 Fおよび HNタンパク質は 検出されなかったことから、 Fおよび HN欠失型であることが確認された （図 3 9 )。
[実施例 1 2 ] ウィルス再構成法の検討
ぐ従来法 >
LLC-MK2 細胞を 5 x l06 cel ls/dishで 100醒ぺトリ皿に蒔き、 24時間培養後 、 血清を含まない MEM培地 で 1 回洗浄した後、 3 〃g/ml のソラレンと長波長紫 外線 （365nm) で 5 分間処理した T7 RNA ポリメラーゼを発現するリコンビナン トワクシニアウィルス （Fuerst, T.R. et al .， Proc. Natl . Acad. Sci . USA 83， 8122-8126 1986)(vTF7- 3)に室温で 1 時間感染させた （moi=2) (moi=2〜3、 好 適には moi=2 が用いられる）。 細胞を、 血清を含まない MEM培地で 2 回洗浄した 後、 プラスミ KpSeV18+/AF-GFP, pGEM/NP, pGEM/P,及び pGEM/L(Kato, A. et al . , Genes cel ls 1， 569-579( 1996 ) ) をそれぞれ 12〃g, 4〃g, 2〃g， 及び 4〃g/dish の量比で 0 £ 咅地（&18( 0) に懸濁し、 SuperFect transfection reagent ( 1 g DNA/5〃lの SuperFect, QIAGEN)を入れ、 室温で 15分間放置後、 最終的に 3% FBSを含む Optト MEM培地 3 ml に入れた DNA- SuperFect混合物を細胞に添加して 培養した。 3時間培養後、 細胞を、 血清を含まない MEM培地で 2 回洗浄し、 シト シン/? - D-ァラビノフラノシド 40〃g/ml (AraC, Sigma)を含む MEM培地で 70時間 培養した。 これらの細胞と上清を回収し、 それぞれ P0-d3 サンプルとした。 P0 - d3 のペレツトを Opt i -MEM培地に懸濁した （107 cel ls/ml )。 凍結融解を 3 回繰 り返して l ipofection reagent DOSPER (Boehringer m纖 heim)と混合し ( 106 cel ls/25〃 l DOSPER)室温で 15 分間放置した後、 F発現 LLC- MK2/F7 細胞株にト ランスフヱクシヨン（106 cel ls/wel l 24- wel卜 plate)し、 血清を含まない MEM培地 (40 g/ml AraC, 7.5 /g/m トリブシンを含む）で培養した。 培養後 3 日目および 7 日目に上清を回収し、 それぞれ PI- d3 および Pl-d7サンプルとした。
<エンベローププラスミ ド +F発現細胞重層法 >
プラスミ ドにエンベローププラスミ ド pGEM/FHNを 4 g/dish加えた以外は、上 記と同様の操作を行い、 トランスフヱクシヨンを行った。 3 時間培養後、 細胞を 、 血清を含まない MEM培地で 2回洗浄し、 シトシン 5 -D-ァラビノフラノシド 40 〃g/ml ( AraC, Sigma) とトリブシン 7.5〃g/ml を含む MEM培地 で 48時間培養 した。培養上清を取り除き、血清を含まない MEM培地 (40〃g/ml AraC, 7.5 g/m ト リブシンを含む）に懸濁された 100 匪 ペトリ皿 1 枚分の F 発現 LLC-MK2/F7 細 胞懸濁液 5 ml を重層した。 培養 48時間後、 これらの細胞と上清を回収し、 それ それ P0-d4 サンプルとした。 P0- d4 のペレットを Opti- MEM培地 に懸濁し （2 x 107cel ls/ml ), 凍結融解を 3 回繰り返して F 発現 LLC- MK2/F7 細胞株に重層（2 x l06cel ls/wel l 24-wel卜 plate)し、 血清を含まない MEM培地（40〃g/ml AraC, 7.5 /g/m トリプシンを含む）で培養した。 培養後 3 日目および 7日目に上清を回収 し、 それぞれ PI- d3 および Pl-d7サンプルとした。 比較のため、 重層を行わず、 エンベローププラスミ ドのみを添加し、 上記の従来法と全く同じ方法でも実験を 仃つた。
<GFP発現細胞のカウントによる CIUの測定（GFP-CIU) >
LLC- MK2細胞を 2 x l05 cel ls/wel lで 12wel l-plateに蒔き、 24時間培養後、 血 清を含まない MEM培地 で 1 回洗浄した後、 上記のサンプル（P0-d3または P0-d4 、 Pl-d3および Pl-d7)を、 陽性細胞が 10cm2中に 10〜100個の間の数になるよう に適宜希釈し、 100 l/wel lで感染させた。 15分後血清を含まない MEM培地を 1 ml/wel l 加えた。 さらに 24 時間培養後、 細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、 GFP発現 細胞のカウントを行った。
<CIU(Cell-Infected Unit)測定 >
LLC-MK2 細胞を xl05 cells/dish で 12wel卜 plate に蒔き、 4 時間培養後、 血清を含まない MEM培地 で 1 回洗浄した後、 上記サンプル （含まれるウィルス ベクタ一を SeV/AF- GFPと称す） を 100〃 1/wel 1で感染した。 15分後、 血清を含ま ない MEM培地を Iml/well加え、 さらに 24時間培養した。 培養後、 PBS (-)で 3回 洗浄した後、 細胞を乾燥させ （約 10分〜 15分室温放置）、 細胞を固定するため、 ァ セトンを lml/well 加え直ちに取り除き、 再び乾燥させた （約 10分〜 15分室温放 置）。 PBS (-)で 100 倍希釈したゥサギより調製された抗 SeVポリクローナル抗体 (DN-1)を 300 l/well加え、 37°Cで 45分間インキュベートした後、 PBS (-)で 3回 洗浄し、 PBS (-)で 200 倍希釈した抗ゥサギ IgG(H+L)蛍光標識二次抗体 (AlexaTM568:Molecular Probes社製）を 300 ^1/well 加え、 37°Cで 45分間インキ ュペートした。 PBS (-)で 3 回洗浄した後、 蛍光顕微鏡下（Emission:560nm ， Absorption:645nmフィルタ一：ライカ社製）で蛍光を発する細胞を観察した（図 4 0)。
対照として上記サンプル（SeV/ΔΡ- GFP)を 100〃l/we】lで感染し 15分後、 血清 を含まない MEMを lml/well 加え、 さらに 24時間培養後、 以後の操作を行わずに 細胞を蛍光顕微鏡下（Emission:360nm， Absorption :470皿フィルター： ライカ社 製）で GFP発現細胞を観察した。
[実施例 13] 欠失型センダイウィルスベクターの再構成効率向上のための最 適なワクシニアウィルス（vTF7- 3)の PLWUV(Psoralen and Long-Wave UV Light)処 理条件検討
LLC-MK2 細胞を 5xl06 cells/dish で 100 mmぺ卜リ皿に蒔き、 24時間培養後 、 血清を含まない MEM培地 で 1 回洗浄した後、 0.3〜3 ig/ml のソラレンと長 波長紫外線 （365nm) で 2〜20 分間処理した T7 RNAポリメラーゼを発現するリ コ ン ビナ ン ト ワ ク シ ニア ウ ィ ルス （vTF7 - 3) (Fuerst, T.R. et al.， Proc. Natl . Acad. Sci . USA 83， 8122- 8126( 1986 )に室温で 1 時間感染させた (raoi=2) (moi=2〜3、 好適には moi=2が用いられる）。細胞を血清を含まない MEM 培地で 2 回洗浄した後、 プラスミ ド pSeV18+/ A F- GFP, pGEM/NP, pGEM/P, 及び pGEM/L(Kato, A. et al .， Genes cel ls 1， 569-579( 1996 ) ) , をそれぞれ 12〃g, 4 〃g, 2〃g,及び 4〃g/dishの量比で Opti- MEM培地（GIBCO)に懸濁し、 SuperFect transfection reagent ( l〃g DNA/5 l の SuperFect, QIAGEN)を入れ、 室温で 15 分間放置後、 最終的に 3%FBSを含む Opti- MEM培地 3 ml に入れた DNA- SuperFect 混合物を細胞に添加して培養した。 3 時間培養後、 細胞を、 血清を含まない MEM 培地 で 2 回洗浄し、 シ トシン/? - D-ァラビノフラノシ ド 40 ^g/ml ( AraC, Sigma) を含む MEM培地 で 48時間培養した。 100舰ぺトリ皿の約 1/20視野の 細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、 GFP発現細胞のカウントした。ワクシニアウィルス (VTF7-3 )の不活化の検定にはプラーク形成によるタイターの測定（永井美之ら， ウィルス実験プロトコ一ル， p291- 296， 1995)を行った。
さらに、 トランスフヱクシヨン後の回収時期を 3日目に着目し、 ソラレンと UV 照射時間の検討を行った。各 PLWUV処理を行ったワクシニアウィルス （vTF7- 3) を 用い、 センダイウィルス再構成の効率を検討した。 再構成は加藤らの方法 （上記 ) を改変し、 以下の手順で行った。 6 wel lのマイクロプレートに LLC- MK2細胞を 5 x l05 細胞/ wel lで撒き、 終夜培養した後 （1 X 106 細胞/ wel lに増殖していると 仮定）、 PLWUV処理前のタイ夕一換算で 2 x l06 pfu/100〃l となるようにワクシニ ァウィルス（VTF7-3)を希釈し、 PBS洗浄後の細胞に感染させた。 1時間の感染後、 50 1の Opti-MEM培地（GIBC0)にプラスミ ド、 pGEM/NP, pGEM/P,及び pGEM/L、 そ して付加型 SeV cDNA (pSeV18+ b( + )) (Hasan, M. K. et al .， J. General Virology 78: 2813-2820, 1997 ) をそれぞれ 1， 0.5， 1， 4 gを加えたものに、 SuperFect(QIAGEN)を 10〃1 加え、 室温で 15分放置した後、 1 mlの 0pti-MEM(40 /g/mlの AraCを含む） を加え、 細胞に重層した。 トランスフヱクシヨン後、 3日 目に細胞を回収し、 遠心後、 100 d/wel lの PBSに懸濁した。 この懸濁液を 10倍、 100倍、 1000倍希釈した細胞溶液 を受精後 10日目の発育鶏卵に各希釈 3 個ずつ摂取した。 （lxlO5, lxlO4, lxlO3 細胞をそれそれ摂取）。 3 日後鶏卵か ら尿液を回収し HA試験によりウィルス再構成の有無を調べた。 lxlO5細胞を摂 取した鶏卵のうち、 HA活性があった鶏卵を一点、 104 では十点、 103 では百点と 数えて、 再構成の効率を求めた。
ぐ結果 >
実施例 1 2および 13の結果を図 40〜43、 および表 2に示す。 ェンベロ一 プ発現プラスミ ドと細胞重層の組み合わせによる SeV/AF- GFPの再構成効率の向 上が確認された。 P0 (継代前） の d3〜d4 (3日目〜 4日目） において、 著しい改 善が認められた （図 41 )。表 2では、 トランスフエクシヨン後 3日目の細胞を卵 に接種した。 0.3〃g/mlのソラレン濃度で 20分間の処理が、 最も再構成効率が高 かった （3日目） ことから、 この条件を最適条件とした （表 2)。
) ¾上gS¾¾B皿 ΒΛ is!
表 2 センダイウィルス再構成に及ぼすワクシニアウィルスの PLWUV処理の影響
のppq SJ0O uor-
Figure imgf000068_0001
[実施例 1 4 ] GFPを含まない LacZ搭載 F 欠失型センダイウィルスベクタ一の 作製
<LacZ 遺伝子を含む F 欠失型 SeV ベクター cDNA の構築 >
実施例 1記載の pSeV18+/AF の NP遺伝子上流域に存在する Not I 切断部位に LacZ遺伝子を搭載した cDNA (pSeV(+18:LacZ)/AF) を構築するため PCRにより LacZ遺伝子の増幅を行った。 LacZ遺伝子を 6の倍数 （Hausmann, S et al . , RNA 2， 1033-1045 ( 1996) ) にあわせ、 5' 末側には Notl 切断部位を付与したプライ マ一 （5， - GCGCGGCCGCCGTACGGTGGCAACCATGTCGTTTACTTTGACCAA-3' /配列番号： 1 7 )を、 3'末に SeVの転写終結シグナル （E)、 介在配列 （I ) および転写開始シグナ ル （ S ) を付与 し、 Notl 切断部位を付与 し た プラ イ マ一 （5' -
AACTGGTA-3' /配列番号： 1 8)を用い、 プラスミ ド pCMV- 5 (クローンテック社 製） を銪型として PCR反応を行った。 反応条件は、 pCMV- ? 50ng、 200〃MdNTP (フアルマシアバイオテク社製）、 100 pM プライマ一、 Vent ポリメラ一ゼ （ニュ —イングランドバイオラボ社製） 4U を添付の反応バッファ一とともに混合後、 94°C 30 秒、 50 °C 1 分、 72 °C 2 分の反応温度サイクル 25回で行った。 反応産 物をァガロースゲル電気泳動で泳動後、 3.2 キロベースの断片を切り出し、 精製 後、 Notl で切断し、 pSeV18+/AF Not I 切断片とライゲ一シヨンして pSeV(+18:LacZ)/AF を得た。
ぐ従来法〉
LLC-MK2 細胞を 5xl06 cells/dishで 100匪ぺトリ皿に蒔き、 24 時間培養後 、 血清を含まない MEMで 1 回洗浄した後、 3 ig/ml のゾラレンと長波長紫外線 (365nm) で 5分間処理した T7 RNAポリメラ一ゼを発現するリコンビナントワク シニアウィルス（vTF7-3) (Fuerst, T.R. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126(1986)に室温で 1時間感染させた （moi=2) (moi=2〜3、好適には moi=2 が用いられる）。 細胞を血清を含まない MEMで 2回洗浄した後、 LacZ搭載 F欠 失型センダイウィルスベクタ一 cDNA (pSeV (+18:LacZ)AF), pGEM/NP, pGEM/P, 及び pGEM/L(Kato, A. et al.， Genes Cells 1, 569-579(1996)), をそれぞれ 12 jug, Ajug, 2 g, 4 g/dish およびエンベローププラスミ ド pGEM/FHN を 4〃 g/dish加え、 Opti-MEM(GIBCO) に懸濁し、 SuperFect transfection reagent (1 〃gDNA/5〃lの SuperFect, QIAGEN)を入れ、 室温で 15分間放置後、 最終的に 3% FBSを含む Opti-MEM 3 ml に入れた DNA- SuperFect 混合物を細胞に添加して培養 した。 3 時間培養後、 細胞を、 血清を含まない MEM で 2 回洗浄し、 シトシン/? -D-ァラビノフラノシド 40 jug/ l (AraC, Sigma) とトリプシン 7.5〃g/ml を含 む MEMで 24 時間培養した。 培養上清を取り除き、 血清を含まない MEM培地 (40 g/ml AraC, 7.5 /g/m トリプシンを含む） に懸濁された 100 mm ペトリ皿 1 枚分 の F発現 LLC- MK2/F7細胞懸濁液 5 ml を重層した。 さらに培養 48時間後、 これ らの細胞と上清を回収し、 それそれ P0-d3サンプルとした。 P0- d3のペレットを Opti-MEM培地 に懸濁し （2x l07 cells/ml), 凍結融解を 3 回繰り返して lipofection reagent DOSPER (Boehringer mannheim)と混合し (106 cells/25〃l DOSPER)室温で 15 分間放置した後、 F発現 LLC-MK2/F7細胞株にトランスフエク シヨン（106 cells/well 24- well- plate)し、 血清を含まない MEM培地（40〃g/ml AraC, 7.5〃g/m トリブシンを含む）で培養した。 培養後 7 日目に上清を回収し、 Pl-d7サンプルとした。 さらに上清全量を 12- weU-plateに捲いた F発現 LLC- MK2/F7細胞株に 37°C 1時間感染後、 MEM培地 培地で一回洗浄した後、 血清を含 まない MEM培地 (40 g/ml AraC, 7.5 zg/m トリプシンを含む）で培養した。 培養後 7 日目に上清を回収し、 P2-d7サンプルとした。 さらに上清全量を 6- wel卜 plate に捲いた F発現 LLC- MK2/F7細胞株に 37°C1時間感染後、 MEM培地 培地で一回洗 浄した後、 血清を含まない MEM培地（7.5〃g/m トリプシンを含む）で培養した。 培 養後 7日目に上清を回収し、 P3-d7サンプルとした。 さらに上清全量を 10 cm plate に捲いた F発現 LLC- MK2/F7細胞株に 37°C 1時間感染後、 MEM培地 培地で一回洗 浄した後、 血清を含まない MEM培地（40〃g/ml AraC, 7.5〃g/m 卜リブシンを含む） で培養した。 培養後 7 日目に上清を回収し、 P4-d7サンプルとした。
く LacZ発現細胞の力ゥントによる CIUの測定（LacZ- CIU)>
LLC-MK2細胞を .5X106 cells/wellで 6 well-plateに蒔き、 24 時間培養後、 血清を含まない MEM培地 で 1 回洗浄した後、 P3-d7の 1/10希釈系列を MEM培地で 作製し、 37°C1時間感染後、 MEM培地で一回洗浄し、 10%血清を含む MEM培地 1.5 ml を添加した。 37°Cで 3日培養後、 細胞を/? -Gal 染色キット （インビトロジヱ ン社） により染色した。 3回の実験の結果を図 44に示す。 LacZ染色陽性細胞数 を数えた結果、 いずれの場合でも P3-d7サンプルにおいて lxlO6 CIU/mlのウイ ルスが得られていることがわかった。 [実施例 1 5 ] センダイウィルスにおける極性効果を利用した遺伝子発現量の 制御
く SeVゲノム cDNAの構築〉
センダイウィルス （SeV) 全長ゲノム cDNA、 pSeV ( + ) (Kato, A. et al . , Genes to Cel ls 1 : 569-579, 1996)の cDNAに新たな Not I サイ トを各遺伝子のス夕一 トシグナルと ATG翻訳開始シグナルの間に導入した。導入方法としてはまず、 図 4 5 (A)のように pSeV( + )を Sp j l/Sal Iで消化した断片（2645bp)、 Cla Iで消化した 断片 （3246bp)、 及び C7a l/Eco RIで消化した断片 （5146bp) をそれぞれァガロー ス電気泳動で分離、 該当するバンドを切り出し、 QIAEXI I Gel Extraction Syste m (QIAGEN社製） で回収 .精製した。 Sph l/Sal Iで消化した断片は LITMUS38 (NE W ENGLAND BI0LABS社製）、 C7a Iで消化した断片と C a l/Eco RIで消化した断片は pBluescriptl l KS+ (STRATAGENE社製） にライゲ一シヨンし、 サブクロ一ニング した。 続レ、て Λ¾ί Iサイ 卜の導入 (こ（ま Quickchange Site-Directed Mutagenesis k it ( STRATAGENE社製） を使った。 それぞれの導入に用いたプライマ一は NP-P間で はセンス鎖： 5' -ccaccgaccacacccagcggccgcgacagccacggcttcgg-3' (配歹 U番号： 1 9 )、 アンチセンス鎖： 5' -ccgaagccgtggctgtcgcggccgctgggtgtggtcggtgg-3' (配 歹 !J番号： 2 0 )、 P - M間ではセンス鎖： 5' -gaaatttcacctaagcggccgcaatggcagatatc tatag-3' (配列番号： 2 1 )、 アンチセンス鎖： 5， - ctatagatatctgccattgcggccgc ttaggtgaaatttc-3' (配列番号： 2 2 )、 M-F間ではセンス鎖： 5' -gggataaagtccct tgcggccgcttggttgcaaaactctcccc-3' (配列番号： 2 3 )、 アンチセンス鎖： 5， - gg ggagagttttgcaaccaagcggccgcaagggactttatccc-3' (配列番号： 2 4 )、 F - HN間では センス鎖： 5， -ggtcgcgcggtactttagcggccgcctcaaacaagcacagatcatgg-3' (配列番号 : 2 5 )、 アンチセンス鎖： 5， - ccatgatctgtgcttgtttgaggcggccgctaaagtaccgcgcg acc-3' (配列番号： 2 6 )、 HN- L間ではセンス鎖： 5，- cctgcccatccatgacctagcggc cgcttcccattcaccctggg-3' (配列番号： 2 7 )、 アンチセンス鎖： 5' -cccagggtgaa tgggaagcggccgctaggtcatggatgggcagg-3' (配列番号： 2 8 ) をそれぞれ合成し、 用いた。
铸型として NPP間は Sa7I/Sp 2l断片、 PM間、 MF間は Cl al断片、 FHN間、 HNL間は C a l/Eco RI断片をそれそれ上記でサブクローニングしたものを用レ、て Qui ckchange Site- Directed Mutagenesi s kitのプロトコルに従い、 導入を行った。 導入したも のを再びサブクローニングした酵素で消化して同様に回収 ·精製し、 元のセンダ ィゲノム cDNAへアセンブリした。その結果、図 4 5 (B )のように各遺伝子間に新た に Notlを導入した 5種類 （pSeV( + )NPP、 pSeV( + )PM、 pSeV( + )MF、 pSeV( + )FHNおよび pSeV ( + ) HNL) のセンダイウィルスゲノム cDNAを構築した。
遺伝子発現量を見るためのレポ一夕遺伝子としてヒト分泌型アル力リフォスフ ァ夕一ゼ （SEAP) を PCRでサブクロ一ニングした。 ブライマ一には^ 4sc I 制限酵素 サイ 卜を付カロした 5， プラィマー： 5， -gcggcgcgccatgctgctgctgctgctgctgctgggcc tg-3' (配列番号： 2 9 )、 3，プライマ一： 5， -gcggcgcgcccttatcatgtctgctcgaagc ggccggccg-3' (配列番号： 3 0 ) を合成し、 PCRを行った。 铸型には pSEAP- Basic (CL0NTECH社製）、 酵素には /u tourbo DNAポリメラ一ゼ （STRATAGENE社製） を用 いた。 PCR後、 産物を 4sc Iで消化し、 電気泳動により精製 ·回収した。 サブクロ —ニングするプラスミ ドとして pBluescriptl l KS+の^? : Iサイ 卜にマルチクロ一 ニングサイ ト (Pme l-Asc l-Swa I ) と終結シグナル-介在配列-開始シグナル含む 合成二本鎖 DNA [センス鎖： 5' -gcggccgcgtttaaacggcgcgccatttaaatccgtagtaagaa aaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc-3' (配歹幡号： 3 1 )ヽ アンチセンス鎖： 5， -g c-3' (配列番号： 3 2 ) ] を組み込んだものを作製した （図 4 6 )。 このプラスミ ドの^ c Iサイ 卜に精製 ·回収した PCR産物をライゲ一シヨンし、 クローニングし た。 これを Iで消化して SEAP遺伝子断片を電気泳動で回収 ·精製し、 上記の 5 種類のセンダイウィルスゲノム cDNAと pSeV18+の Λ¾ί Iサイ 卜にそれぞれライゲー シヨンし組み込んだ。 それぞれのウィルスベクタ一を pSeV( + )NPP/SEAP、 pSeV ( + ) PM/SEAPヽ SeV ( + ) MF/SEAP, pSeV( + )FHN/SEAP、 pSeV( + )HNL/SEAPおよび pSeV18( + ) /SEAPとした。
<ウィルスの再構築 >
LLC- MK2細胞を 2xl06 cells/dish で 100匪シャーレに蒔き、 24時間後培養後、 ソラレンと UV処理した T7ポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイ ルス （PLWUV- VacT7) (Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126,1986、 Kato, A. etal., Genes Cells 1: 569-579, 1996) に室温で moi=2 で 1時間感染させた。 細胞を洗浄してから SEAPを組み込んだ各センダイウィルス cDNA、 pGEM/NP, pGEM/P、および pGEM/Lをそれぞれ 12〃g、 4〃g、 2〃g、及び 4 g/dish の量比で OptiMEM (GIB0C0BRL社製） に懸濁し、 110 1 ©SuperFect transfection reagent (QIAGEN社製） を入れて混合し、 室温で 15分放置後、 最終的に 3%FBSを 含む OptiMEM 3mlを加え、 細胞に添加して 3〜5時間培養した。 培養後、 細胞を血清 を含まない MEMで 2回洗浄し、シトシン/?- D-ァラピノフラノシド（AraC)を含む MEM で 72時間培養した。 これらの細胞を回収し、 ペレットを lmlの PBSで懸濁し、 凍結 融解を 3回繰り返した。 これらを 10日間孵卵させた鶏卵に 100〃1接種し、 35°Cで 3 日間孵卵させたのち、 尿液を回収した。 ワクシニアウィルスフリーにするため、 これら回収した尿液をさらに 10—5〜10— 7 に希釈して鶏卵に再接種し、 同様に回収 し、分注して- 80°Cにストックした。それぞれのウィルスベクタ一名を SeVNPP/SEAP 、 SeVPM/SEAPヽ Se響/ SEAPヽ SeVFHN/SEAP、 SeVHNL/SEAPおよび SeV18/SEAPとする )。
<プラークアツセィによる夕イタ一の測定 >
CV-1細胞を 6well プレートに lwellあたり 5xl05 cellsずつ蒔き、 24時間培養し た。 PBS洗浄後、 BSA/PBS (1% BSA in PBS) で 10-3、 10—4、 10- 5、 10- 6、 10_7 に希釈 した組換え SeVを 1時間ィンキュベーシヨンした後、 PBSで洗浄、 BSA/MEM/ァガ口一 ス （0.2% BSA+2XMEMと等量の 2%ァガロースを混合したもの） を wellあたり 3mlず つ重層し、 6日間 37°C、 0.5%で培養した。 培養後、 3mlのエタノール/酢酸 （エタ ノール：酢酸 =1:5) を加え、 3時間放置し、 ァガロースとともに除去した。 PBSで 三回洗浄後、 100倍希釈したゥサギ抗センダイウィルス抗体で室温で 1時間ィンキ ュベーシヨンした。 PBSで三回洗浄後、 200倍希釈した Alexa Flour™標識ャギ抗 ゥサギ Ig(G+H) (Molecular Probe社） を加えて室温で 1時間インキュベーションし た。 PBSで三回洗浄後、 ルミノイメージアナライザー LAS1000 (富士フィルム） で 蛍光画像を取り込み、 プラークを測定した。 結果を図 4 7に示す。 またこれから 得られたタイ夕一の結果を表 3に示す。 表 3 プラークアツセィの結果から測定した各組換えセンダイウィルスのタイ夕 一の結果 組み換えウィルス タイタ一 (pfu/ml)
SeV18/SEAP 3.9X109
SeVNPP/SEAP 4.7X108
SeVPM/SEAP 3.8X109
SeVMF/SEAP 1 .5X1010
SeVFHN/SEAP 7.0X109
SeVHNUSEAP 7.1X109
ぐレポ一ター遺伝子発現の比較 >
LLC- MK2細胞を 6wel l プレートに lwel lあたり l〜5 x l05 cel lsずつ蒔き、 24時間 培養した後、各ウィルスベクターを moi=2感染させ、 24時間後培養上清を 100 1回 収し、 SEAPアツセィを行った。 アツセィは Reporter Assay Kit -SEAP- (東洋紡） で行い、 ルミノイメージアナライザ一 LAS1000 (富士フィルム） で測定した。 測定 値は SeV18+/SEAPの値を 100としてそれぞれ相対値として表した。 その結果、 図 4 8に示したいずれの位置に SEAP遺伝子を挿入した場合でも SEAP活性が検出された 。 SEAP活性はゲノムの下流に位置するに従って下がり、 すなわち発現量が下がつ ていることがわかった。また、 NP遺伝子と P遺伝子の間に SEAP遺伝子を挿入した場 合には、 NP遺伝子の上流に SEAP遺伝子を挿入したベクターと、 P遺伝子と M遺伝子 の間に SEAP遺伝子を挿入したベクタ一の中間の発現量が検出された。
[実施例 1 6 ] ダブル欠失 A F- HN細胞重層法による欠失 SeV増幅効率の向上 現在用いている SeVウィルスの再構築法では、 T7 RNAポリメラーゼを発現する組 換えワクシニア TF7-3 )を用いるため、 ワクシニアの細胞傷害性により、 感染細 胞が一部分死滅しており、 再構築を行った一部の細胞でゥィルスが増幅すること ができても、 さらに多くの細胞で効率よく、 持続的に増幅できるようにすること が好ましい。 しかし、パラミクソウィルスでは同型ウィルスの Fと HN蛋白が細胞表 面に共に存在すると細胞融合を引き起こし、 シンシチュムが形成されることが知 られている (Lamb and Kolakofsky, 1996 , Fields virology, pl l89)。 それ故 FHN 共発現細胞の継代が困難であった。 そこで、 これらの再構築された細胞に新たに 欠失蛋白（Fおよび HN)を発現するヘルパー細胞を重層することにより欠失ウィル スの回収効率を向上することができると考えた。 FHN発現誘導時間が異なる細胞を 重層することを検討することにより FHN共欠失ゥィルス回収効率を大きく向上し
/ヒ o
10cm細胞培養皿に 100 %コンフレントになった LLC- MK2細胞 （1 x 107/di sh)を PLWUV-処理ワクシニアを moi=2で室温において感染 1時間後、 d2EGFPを搭載する FHN欠失 cDNA (pSeV18+/ A FHN-d2GFP (実施例 8 ) , pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L, pGEM/FHNをそれぞれ、 12〃g/10cm dish, 4〃g/10cm dish, 2 ig/10cm dish, 4j g/lOcm dish, 4 g/10cra dishの量比で混合し (final vol , 3ml/10cm dish)ヽ 遺 伝子導入試薬 SuperFect(QIAGEN)を用いて、 前述した F欠失ウィルスの再構築と 同様な方法で LLC-MK2細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入 3時間後細胞を無血清培 地で 3回洗浄し、 低速遠心（1000rpm/2inin)で剥がれた細胞を回収し、 シトシン/? -D-ァラビノフラノシド （AraC) 40〃g/ml， SIGMA) , トリプシン（7.5〃g/ml , GIBC0) を含むの無血清 MEM培地に懸濁し、細胞に加え、一晩培養した。別途に用意した 10cm シャーレで 100%コンフレントになった FHN共発現細胞をアデノウィルス AxCANCre を M0I=10で発現誘導後、 4時間、 6時間、 8時間、 2日目、 3日目の細胞をそれそれ 5ml PBS (-)で一回洗浄し、 cel l dissociation solution (SIGMA)により細胞を剥がし 、低速遠心（1000rpm/2min)で細胞を集め、 AraC(40〃g/ml， SIGMA), トリブシン（7.5 g/ml， GIBC0)を含むの無血清 MEM培地に懸濁し、 FHN共欠失ウィルスの再構築し た細胞 （P0) に加え一晩培養した。 細胞重層後 2日目で蛍光顕微鏡で細胞を観察 し、 細胞における GFPの発現でウィルスの広がりを確認した。 その結果、 図 4 9に 示した。 細胞重層しない従来の場合 （左） に比べ、 細胞を重層した場合 （右） は 重層された細胞の方が GFP発現細胞が顕著に多く認められた。これらの細胞を回収 し、 107細胞/ mlの Opti- MEM培地 （Gibcol )に懸濁し、 3回凍結融解したライセ一ト を調製し、 発現誘導して 2日後の FHN共発現細胞に 106 cel ls/100〃l/wel l感染し、 AraC (40 g/ml , SIGMA)，トリプシン （7.5〃g/ml， GIBC0) を含むの無血清 MEM培 地で、 37°C 5%C02インキュベータ一で 2日間培養した PI細胞培養上清のウィルス 力価を CIU- GFPで測定した （表 4 )。 その結果、 FHN発現誘導後 4時間ではウィルス の増幅効果が認められず、 誘導 6時間以後の細胞重層による増幅効果が顕著に認 められた。特に、 P 1細胞上清中に放出されたウィルスは 6時間後の細胞重層する 方が細胞重層しない方に比べ約 10倍に上った。 表 4 ダブル欠失 AF- HN細胞重層法による欠失 SeV増幅
GFP -CIU xl03/ml
FHNce l l +ad/cre
FHN ce l l - 4h 6h 8h 2d 3d
8- 10 6-9 80-100 70-100 60-100 20-50
[実施例 1 7 ] シユードタイプセンダイウィルスが F欠失型ゲノムを有すること の確認 VSV- G遺伝子発現で増殖した上記ゥィルスが F欠失型であることを、 感染細胞抽 出液のタンパク質のウエスタン解析により調べた。 その結果、 センダイウィルス 由来の夕ンパク質は検出されるものの、 Fタンパク質は検出されなかったことから 、 F欠失型であることが確認された （図 5 0 )。
[実施例 1 8 ] Fおよび HN遺伝子を欠失したゲノムを有するシユードタイプセン ダイウィルスの抗 VSV抗体による感染性の影響
VSV-G発現株を用いて得られた Fおよび HN遺伝子を欠失したゲノムを有するシュ 一ド夕イプセンダイウィルスが、外被に VSV-Gタンパク質を有するかに関して、抗 VSV抗体を用いて感染性が影響されるかどうかの中和活性を調べた。ウィルス液と 抗体を混合し、 室温で 30分静置後、 VSV-Gを誘導発現していない LLCG- L1細胞に感 染し、 4日目の遺伝子導入能を GFP発現細胞の有無で調べた。 その結果、 Fおよび HN遺伝子を欠失したゲノムを有するシュ一ド夕ィプセンダイウィルス （図中 VSV-G) は、 抗 VSV抗体で感染性の完全な抑制が認められたが、 本来の外被を有す るセンダイウィルス （図中 F , HN) では抑制が認められなかった （図 5 1 )。 この ことから、本実施例で得られたウィルスが、外被に VSV- Gタンパク質を有するシュ ードタイプのセンダイウィルスであり、 抗体によりその感染性が特異的に抑えら れることが明らかとなった。
[実施例 1 9 ] F遺伝子と Fおよび HN遺伝子を欠失したゲノムを有するシユード 夕イプセンダイウイルスの密度勾配超遠心法を用いた精製
ウィルス感染細胞の培養上清を用いて、 ショ糖密度勾配遠心を行い、 F遺伝子と Fおよび HN遺伝子を欠失したゲノムを有するシユード夕イプセンダイウィルスの 分画精製を行った。 20〜60%のグラジヱントを形成させたショ糖溶液にウイルス液 を上層させ、 SW41口一夕一 （Beckman) で 29000rpm、 15〜16時間超遠心を行った。 超遠心後チューブの底に穴を開け、 フラクションコレクターで 300〃1ずつ分画し た。 各画分について、 F遺伝子あるいは Fおよび HN遺伝子を欠失したゲノムを有し 、外被に VSV- G夕ンパク質を有するシユードタイプのセンダイウィルスであること をウエスタン解析により調べた。 ウエスタン解析は、 上記に記載の方法により行 つた。 その結果、 F欠失型のシュ一ド夕イプセンダイウィルスでは、 センダイウイ ルス由来の夕ンパク質および HN夕ンハク質、 VSV-Gタンパク質は同フラクションに 検出されるものの、 Fタンパク質は検出されなかったことから、 F欠失型シユード タイプのセンダイウィルスであることが確認された。一方、 Fおよび HN欠失型のシ ユードタイプセンダイウィルスでは、 センダイウィルス由来のタンパク質、 VSV- G夕ンパク質は同フラクションに検出されるものの、 Fおよび HNタンパク質は検出 されなかったことから、 Fおよび HN欠失型のシュ一ド夕ィプのセンダイウィルスで あることが確認された （図 5 2 )。
[実施例 2 0 ] F遺伝子と Fおよび HN遺伝子を欠失したゲノムを有するシユード 夕イプセンダイウイルスによる赤血球凝集反応の回避
F遺伝子、または F,HN遺伝子を欠失したゲノムを有するシユード夕イプセンダイ ウィルス、あるいは本来の外被を有するセンダイウィルスを LLC- MK2細胞に感染さ せ、 3日目に 1 %トリ赤血球浮遊液を加え 4°Cで 30分静置後、 GFPを発現した感染細 胞表面を観察した。その結果、 F遺伝子を欠失したゲノムを有するウィルス （SeV/ △ F、および VSV- Gでシユード化した SeV/AF(VSV-G))シユード夕イプセングイゥ ィルスは本来の外被を有するセンダイゥィルスと共に、 感染細胞の表面に凝集反 応が起きているのが確認された。一方、 Fおよび HN遺伝子を欠失したゲノムを有す るシユードタイプセンダイウィルス （SeV/AF-HN(VSV- G))では、 感染細胞上に凝 集は全く起きていないことが明らかとなった （図 5 3 )。
[実施例 2 1 ] F遺伝子を欠失したゲノムを有する VSV-Gシユード夕イプセンダ ィウィルスによる培養細胞への感染特異性
培養細胞への F遺伝子を欠失したゲノムを有する VSV-Gシユード夕イプセンダイ ゥィルスの感染効率は、 細胞に感染後 3日目の生細胞に発現した GFP量を Flow cytometoryを用いて測定した。 F遺伝子を欠失したゲノムを有するシュ一ドタイプ センダイウィルスと本来の外被を有するセンダイウィルスで、 ほぼ同じ感染効率 を示す LLC- MK2細胞をコン卜ロールとして比較を行った。その結果、 ヒト卵巣ガン 細胞 HRAでの感染効率は、 LLC- MK2細胞とほとんど差異はなかったが、 T細胞系の Jurkat細胞では、コント口ールと比較して 2倍程度の F遺伝子を欠失したゲノムを 有する VSV-Gシュ一ドタイプセンダイウィルスの感染効率の上昇が観察された（図 5 4 )。
[実施例 2 2 ] NGF発現を搭載した F欠失型センダイウィルスベクタ一の作製 <NGF/SeV/AFの再構成〉
NGF/SeV/Z Fの再構成は上記「エンベローププラスミ ド + F発現細胞重層法」に 従って行った。 また、 タイ夕一の測定は、 抗 SeVポリクロ一ナル抗体を用いた方法 に従って'仃つた。
<NGF/SeV/AFのゥィルスゲノム確認（RT- PCR) >
NGF/SeV/AFウィルスゲノム （図 5 5上） を確認するため、 LLC- MK2/F7細胞から 回収された培養上清を遠心した後、 QIAamp Viral RNA mini kit (QIAGEN)でその プロトコールに従って RNA抽出を行った。 この RNAを SUPERSCRIPT™ ONE-STEP™ RT- PCR SYSTEM (GIBCO BRL) により RT- PCRのテンプレート合成および PCRを行った。 対照群は、 付加型 SeV cDNA (pSeV18+ b( + ) ) (Hasan, M. . et al .， J. General Virology 78 : 2813-2820, 1997) を用いた。 PCRプライマ一は NGF- Nと NGF- Cを用 いて行った。 NGF- Nについては、 フォワード ： ACTTGCGGCCGCCAAAGTTCAGTAATGTCCA TGTTGTTCTACACTCTG (配列番号： 3 3 )、 NGF-Cについては、 リバ一ス ： ATCCGCGGC CGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGCCTCTTCTTGTAGCCTTCCTGC (配列番号 : 3 4 ) を使用した。 その結果、 NGF- Nと NGF- Cとをプライマーに用いた場合は、 R T条件下で NGF/SeV/A Fは NGFに特異的なバンドが検出された。対照群にはバンドは 検出されなかった （図 5 5下）。
[実施例 2 3 ] NGF遺伝子を搭載した F欠失型 SeVの細胞感染後に発現する NGF蛋 白の定量と in vitro活性測定
感染及び NGF蛋白の発現は、 直径 10cm或いは直径 6cmプレートにほぼ confluent に増殖させた LLC-MK2/F或いは LLC-MK2細胞を用いて行った。 NGF/SeV/ Δ F , NGF/SeV/ Δ F-GFP ii LLCMK2/F 細胞に、 NGF/SeV及び GFP/SeVは LLC- MK2細胞に m.o.i.0.01で感染させ、 7.5〃g/mLの Trypsin (GIBCO) を含み血清を含まない MEM 培地で 3日間培養した。 3日後ほぼ 100%の細胞が感染した後に、 Trypsin及び血清を 共に含まなし、MEM培地に交換し更に 3日間培養した。 それぞれの培養上清を回収し 、 48，000xgにて 60分遠心後、 上清について NGF蛋白の定量及び in vitro活性測定 を行った。 本実施例では、 F欠失型 SeV (NGF/SeV/ AF, NGF/SeV/ Δ F-GFP) (図 5 5 参照） を LLC- MK2/F細胞に感染させているが、 高 m.o.i. (例えば 1或いは 3) を感 染すれば、即ちはじめから 100%近い細胞に感染すれば、 当然のことながら F非発現 細胞でも同様の結果を示す実験を行うことができる。
NGF蛋白の定量は ELISA Kitである NGF Emax Immuno Assay System (Promega) を 利用した。 プロ トコールは添付文書の指示に従った。 NGF/SeV/AF, NGF/SeV/ Δ F-GFP及び NGF/SeVの感染細胞培養上清中にはそれぞれ 32.4//g/mL, 37.4 g/mL 及び 10.5 g/mLの NGF蛋白の存在が確認された。 NGF/SeV/AF, NGF/SeV/ Δ F-GFP の感染細胞培養上清中には、 高濃度の NGF蛋白が存在し NGF/SeVの感染細胞培養上 清中の NGF蛋白量と同程度であり、 F欠失型 SeVによっても十分量の NGFの発現があ ることが確認された。
NGF蛋白の in vitro活性測定は、 ニヮトリの感覚神経である後根神経節の初代神 経細胞分散培養系での生存維持活性を指標に行った （Nerve Growth Factors (Wiley, New York), pp.95-109 (1989))。 胎生 10日齢のニヮトリ胚より後根神経 節を取り出し、 0.25% Trypsin (GIBC0)で 37°C 20分処理後分散した。 100units/mL ( penicillin (Gibco), 100units/mL (D streptomycin (Gibco), 250ng/mLの amphotericin B (Gibco), 20〃 Mの 2 - deoxyuridine (Nakarai), 20 / Mの 5 - f luorodeoxyuridine (Nakarai ), 2mM L-glutamine (Sigma)及び 5%の血清を含む高 グルコースの D-MEM培地を使用し、 96- wellプレートに lwellあたり約 5000個の細胞 密度で培養を開始した。プレートは polylysinコートした 96- wellプレート（Iwaki) を更に laminin ( Sigma) でコートして準備した。 培養開始時にコントロールであ る NGF蛋白或いは先に調製した SeV感染後の培養上清を添加した。 3日後、顕微鏡下 で細胞を観察すると共に、 Alamer blue (CosmoBio ) を添加しミ トコンドリアによ る還元活性を指標として （530皿で励起した 590nmの蛍光強度を測定） 生細胞の定 量を行った。 コントロール （NGF添加無し） 及び SeV/付加型- GFP (GFP/SeV) の感 染細胞培養上清の添加 （1/1000希釈） では同程度の生細胞を示す蛍光強度であつ たが、 NGF/SeV/ A F , NGF/SeV/ A F- GFP及び NGF/SeVの感染細胞培養上清を添加 ( 1/1000希釈） することにより、 顕著な蛍光強度の上昇が見られ生細胞数が多く生 存維持活性を有していると判断された （図 5 6 )。 そして、 その値は ELISAにより 求めた NGF蛋白量の添加に匹敵する効果であった。同様のことが顕微鏡下で視覚的 にも観察され、 NGF/SeV/ AF, NGF/SeV/A F-GFP及び NGF/SeVの感染細胞培養上清を 添加することにより、 生細胞数の増加と顕著な突起伸展が観察された （図 5 7 ) 。 即ち、 NGF搭載 F欠失型 SeVの感染によって発現される NGFは活性型として発現し ていると確認された。
[実施例 2 4 ] F発現細胞の詳細な解析
1 ) Adeno- Creの moiと誘導時間
異なる Adeno-Creの moiを使って LLC-MK2/Fに感染させ F蛋白の発現を誘導した後 、 蛋白の発現量と細胞の形態変化を調べた。
moi=lの場合に比べ moi=10の場合発現量が若干高かったが （図 5 8 )、 誘導後 6h 、 12h、 24h、 48h後の発現量を調べたところ、 いずれも誘導後 48時間目に F蛋白の 発現量が高いことが分かつた。
また、 moi=l、 3、 10、 30、 100で細胞に感染して細胞の形態変化を経時的に観察 したが、 moi=10までに細胞間に顕著の差が認められなかったが、 moi=30以上にな ると細胞傷害性が観察された （図 5 9 )。
2 ) 継代数
LLC-MK2/Fに対して Adeno-Cre使つて F蛋白の発現を誘導してから 7代まで継代し 、 細胞の Fの発現量と細胞の形態を顕微鏡観察で調べた。 一方、 F蛋白の発現を誘 導してから 20代まで継代した細胞内 F蛋白の存在状態をレーザー顕微鏡を用いて 調べた。
レーザー顕微鏡観察においては、チャーンバーガラスに F蛋白の発現を誘導した LLC- MK2/F細胞を入れ、 一晩培養した後、 培地を取り除き PBSで一回洗浄してから 、 3.7%の 0 1&1 ^-?83で5分間固定した。 その後、 PBSで細胞を一回洗浄した後、 0.1% Triton X100- PBSで 5分間処理して、抗 F蛋白モノクロナール抗体（ y -236 ) ( 100 倍希釈）と FITC標識山羊抗ゥサギ IgG抗体 (200倍）の順で細胞を処理して、 最後に PBSで洗浄してレ一ザ一顕微鏡をもつて観察した。
その結果、 7代目まで継代した細胞の F蛋白の発現量に差はなかった （図 6 0 ) 。形態的にも、 そして SeVの感染性と生産性にも顕著な差が観察されなかった。一 方、 20代目まで継代した細胞を免疫抗体法で細胞内の F蛋白の存在状況を調べたと ころ、 15代まで大きな差がなかったが、それ以上継代した細胞内に F蛋白の局在化 傾向が観察された （図 6 1 )。
以上の結果から、 F欠失型 SeVの生産には継代後 15代目までの細胞が望ましいと 判断される。
[実施例 2 5 ] GFP- CIUと抗 SeV-CIUとの相関関係
2種類の方法による CIU (Cel l-Infected Unit) の測定結果を相関関係を調べた LLC- K2細胞を 2 x l05 cel ls/dishで 12weU- plateに蒔き、 24時間培養後、 血清 を含まない MEM培地で 1回洗浄した後、 SeV/AF- GFPを 100 z l/wel lで感染した。 15 分後、 血清を含まない MEM培地を lml/wel l加え、 さらに 24時間培養した。 培養後、 PBS (-)で 3回洗浄した後、細胞を乾燥させ（約 10分〜 15分室温放置)、細胞を固定す るため、 アセトンを 1 ml/wel l加え直ちに取り除き、 再び乾燥させた（約 10分〜 15 分室温放置）。 PBS (-)で 100倍希釈したゥサギより調製された抗 SeVポリクローナル 抗体 (DN- 1 )を 300〃l/wel l加え、 37°Cで 45分間インキュベートした後、 PBS (-)で 3 回洗浄し、 PBS ( -)で 200倍希釈した抗ゥサギ IgG(H+D)蛍光標識二次抗体 （Alex™ 568: Molecular Probes社製）を 300〃 1/wel l加え、 37°Cで 45分間ィンキュベ一卜し た。 PBS ( - )で 3回洗浄した後、蛍光顕微鏡下（Emission : 560nm, Absorption: 645nm フィルター：ライカ社製） で蛍光を発する細胞を観察した。
対照として SeV/AF- GFP を 100〃 1 /we 11で感染し 15分後、 血清を含まない MEM を 1 ml/wel l加え、 さらに 24時間培養後、 以後の操作を行わずに細胞を蛍光顕微 鏡下 （Emission: 360皿， Absorption: 470nmフィルター：ライカ社製） で GFP発現 細胞を観察した。
両者の蛍光強度を定量化して関係を評価したところ、 良好な相関を示した （図 6 2 )。
[実施例 2 6 ] マルチクロ一ニングサイ 卜の作製
マルチクローニングサイ トを SeVベクターに付加させた。 方法は以下の二種類。
1) センダイウィルス （SeV) 全長ゲノム cDNA、 pSeV18+ の cDNAのゲノム中のいく つかの制限酵素サイ トを壊し、 つぶした制限酵素サイ 卜を含む新たな制限酵素サ イ トを各遺伝子のスタートシグナルと ATG翻訳開始シグナルの間に導入した。
2) すでに構築した SeVベクタ一 cDNAにマルチクローニングサイ ト配列と転写開始 シグナル-介在配列 -終結シグナルを付加させて Not Iサイ トへ組み込む。
1) の場合、 導入方法としてはまず、 pSeV18+ を Eag Iで消化した断片 （2644bp )、 Cla lで消化した断片 (3246bp)、 Clal/Eco RIで消化した断片 （5146bp)、 及び Eco RIで消化した断片 （5010bp) をそれそれァガロース電気泳動で分離、 該当す るバンドを切り出し、 QIAEXI I Gel Extraction System (QIAGEN社製） で回収 .精 製した。 Eag Iで消化した断片は LITMUS38 (NEW ENGLAND BI0LABS社製）、 Cla Iで 消化した断片、 Clal/Eco RIで消化した断片、 及び Eco RIで消化した断片は pBluescriptl l KS+ (STRATAGENE社製） にライゲ一シヨンし、 サブクロ一ニングし た。 続いて制限酵素サイ 卜の破壊、 導入には Quickchange Site-Directed Mutagenesis kit ( STRATAGENE社製) を使った。
制限酵素サイ 卜の破壊には Sal I： (センス鎖） 5， - ggagaagtctcaacaccgtccaccc aagataatcgatcag-3' (配列番号： 3 5 )、 (アンチセンス鎖) 5' -ctgatcgattatctt gggtggacggtgttgagacttctcc-3' (配列番号： 3 6 )、 Nhe I： (センス鎖) 5， - gtat atgtgttcagttgagcttgctgtcggtctaaggc-3' (配列番号： 3 7 )、 (アンチセンス鎖) 5' -gccttagaccgacagcaagctcaactgaacacatatac-3' (配歹番号： 3 8 )、 Xho I： ( センス鎖) 5' -caatgaactctctagagaggctggagtcactaaagagttacctgg-3' (酉己歹 ij番号： 3 9 ンチセンス鎖) 5' -ccaggtaactctttagtgactccagcctctctagagagttcattg -3' (配列番号： 4 0 )、 また制限酵素導入には NP- P間： （センス鎖） 5' - gtgaaagt tcatccaccgatcggctcactcgaggccacacccaaccccaccg-3' (配歹 ϋ番号： 4 1 )、 (アンチ センス鎖） 5， -cggtggggttgggtgtggcctcgagtgagccgatcggtggatgaactttcac-3' (配 列番号： 4 2 )、 P - M間： (センス鎖) 5' -cttagggtgaaagaaatttcagctagcacggcgcaa tggcagatatc-3' (配列番号： 4 3 )、 （アンチセンス鎖） 5， -gatatctgccattgcgccg tgctagctgaaatttctttcaccctaag-3' (配列番号： 4 4 )、 M-F間： (センス鎖) 5， -c ttagggataaagtcccttgtgcgcgcttggttgcaaaactctcccc-3' (配列番号： 4 5 (アン チセンス鎖) 5' -ggggagagttttgcaaccaagcgcgcacaagggactttatccctaag-3' (配歹 ϋ番 号： 4 6 )、 F - ΗΝ間： (でンス鎖) 5' -ggtcgcgcggtactttagtcgacacctcaaacaagcaca gatcatgg-3' (配列番号： 4 7 )、 （アンチセンス鎖） 5， - ccatgatctgtgc gtttgag gtgtcgactaaagtaccgcgcgacc-3' (配列番号： 4 8 )、 HN- L間： （センス鎖） 5' -ccc agggtgaatgggaagggccggccaggtcatggatgggcaggagtcc-3' (配列番号： 4 9 )、 （アン チセンス鎖) 5， -ggactcctgcccatccatgacctggccggcccttcccattcaccctggg-3' (配歹 U 番号： 5 0 ) をそれぞれ合成し反応に用いた。 導入後、 それぞれの断片を上記同 様に回収 '精製し、 cDNAをアセンブリした。
2) の場合ヽ でンス鎖) 5' -ggccgcttaattaacggtttaaacgcgcgccaacagtgttgataa gaaaaacttagggtgaaagttcatcac-3' (配歹 ij番 ： 5 1 )、 (アンチセンス鎖) 5' -ggc
(配列番号： 5 2 ) を合成し、 それぞれの合成 MAをリン酸化し、 85°C 2分、 65 °C 15分、 37°C 15分、 室温 15分でアニーリングさせ、 SeV cDNAへ組み込む。 ある レ、は pUC 18または pB 1 uescript I I等のマルチクローニングサイ トを終結シグナル- 介在配列-開始シグナル含むプライマーで PCRしてサブクローニングし、 これを Se V cDNAへ組み込む。 できた cDNAでのウィルス再構成は上記の通り行う。 産業上の利用の可能性
本発明により、 エンベロープ遺伝子を欠損したパラミクソ科ウィルスベクター が提供された。本発明は、マイナス鎖 RNAウィルスを基本骨格とした実用化可能な 新しいエンベロープ遺伝子欠損型べクタ一システムを初めて確立するものである
。 ヘルパー細胞を用いた F遺伝子欠損、 FHN遺伝子欠損ゲノム cDNAからの感染性欠 損ウィルス粒子の回収の成功は、 センダイウィルスの優れた特徴を生かした新規 な遺伝子治療用ベクターの研究開発に道を開いた。 本発明の欠損型センダイウイ ルスベクターは遺伝子導入効率も広範な細胞種に対して極めて高く外来遺伝子を 驚異的に発現する能力を持っている。 さらに、 感染細胞で持続的に発現し、 2次 的な感染性ウィルス粒子を放出しないことから、 ウィルスの伝播性を完全に無く した安全性の高いベクターである。

Claims

請求の範囲
1 . ( a ) パラミクソ科ウィルスの少なくとも一つのエンベロープタンパク質 を発現しないように改変されたパラミクソウィルスに由来する （一）鎖一本鎖 RNA 、 および （b ) 該 （―） 鎖一本鎖 RNAと結合するタンパク質、 からなる複合体を含 むパラミクソ科ウィルスベクター。
2 . ( - ) 鎖一本鎖 RNAが NPタンパク質、 Pタンパク質、 および Lタンパク質を発 現し、 Fタンパク質および/または HNタンパク質を発現しないように改変されてい る、 請求項 1に記載のベクタ一。
3 . (―)鎖一本鎖 RNAから発現しないように改変されたエンベロープタンパク 質の少なくとも一つを含む、 請求項 1または 2に記載のベクター。
4 . VSV- Gタンパク質を含む、 請求項 1から 3のいずれかに記載のベクター。
5 . (—）鎖一本鎖 RNAがセンダイウィルスに由来する、 請求項 1から 4のいず れかに記載のベクタ一。
6 . (―)鎖一本鎖 ϋΝΑがさらに外来遺伝子をコードしている、 請求項 1から 5 のいずれかに記載のベクタ一。
7 . 請求項 1から 6のいずれかに記載のベクターに含まれる （―） 鎖一本鎖 RNA またはその相補鎖をコードする DNA。
8 . 請求項 1から 6のいずれかに記載のベクタ一の製造方法であって、
( a ) パラミクソ科ウィルスの少なくとも一つのエンベロープタンパク質を発現 しないように改変されたパラミクソウィルスに由来する（―）鎖一本鎖 RNAまたは その相補鎖をコードするべクタ一 DNAを、エンベロープタンパク質を発現する細胞 に導入して発現させる工程、 および
( b ) 該細胞を培養し、 その培養上清からウィルス粒子を回収する工程、 を含む 方法。
9 . 請求項 1から 6のいずれかに記載のベクタ一の製造方法であって、 (a) パラミクソ科ウィルスの少なくとも一つのエンベロープタンパク質を発現 しないように改変されたパラミクソウィルスに由来する （一）鎖一本鎖 RNA、 およ び該 （一）鎖一本鎖 RNAと結合するタンパク質、 からなる複合体を、 エンベロープ タンパク質を発現する細胞に導入する工程、 および
(b) 該細胞を培養し、 その培養上清からウィルス粒子を回収する工程、 を含む 方法。
10. 工程 （b) における細胞の培養が、 エンベロープタンパク質を発現する 細胞との共培養である、 請求項 8または 9に記載の方法。
1 1. 工程 （b) における細胞の培養において、 該細胞に、 エンベロープタン パク質を発現する細胞を重層して培養を行う、 請求項 8または 9に記載の方法。
12. 細胞が発現するエンベロープタンパク質の少なくとも 1つが、 前記 （― )鎖一本鎖 RNAから発現しないように改変されたエンベロープタンパク質の少なく とも 1つと同一である、 請求項 8から 1 1のいずれかに記載の方法。
13. 細胞が発現するエンベロープタンパク質の少なくとも 1つが VSV- Gタンパ ク質である、 請求項 8から 12のいずれかに記載の方法。
PCT/JP2000/003195 1999-05-18 2000-05-18 Vecteur de virus paramyxoviridae defectueux dans un gene enveloppe WO2000070070A1 (fr)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA2368948A CA2368948C (en) 1999-05-18 2000-05-18 Envelope gene-deficient virus vector of paramyxoviridae
JP2000618476A JP3602058B2 (ja) 1999-05-18 2000-05-18 エンベロープ遺伝子欠損パラミクソ科ウイルスベクター
DK00927807T DK1186667T3 (da) 1999-05-18 2000-05-18 Kappegendeficient virusvektor af Paramyxoviridae
DE60035589T DE60035589T2 (de) 1999-05-18 2000-05-18 Viraler paramyxoviridae vektor mit einem defekten hüllprotein-gen
EP00927807A EP1186667B1 (en) 1999-05-18 2000-05-18 Envelope gene-deficient virus vector of paramyxoviridae
AU46146/00A AU4614600A (en) 1999-05-18 2000-05-18 Paramyxoviridae virus vector defective in envelope gene
US09/966,277 US20020169306A1 (en) 1999-05-18 2001-09-27 Envelope gene-deficient paramyxovirus vector
HK02105976A HK1044352A1 (en) 1999-05-18 2002-08-15 Envelope gene-deficient virus vector of paramyxoviridae
US10/316,535 US7226786B2 (en) 1999-05-18 2002-12-10 Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP11/200739 1999-05-18
JP20073999 1999-05-18

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US09/966,277 Continuation-In-Part US20020169306A1 (en) 1999-05-18 2001-09-27 Envelope gene-deficient paramyxovirus vector

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2000070070A1 true WO2000070070A1 (fr) 2000-11-23

Family

ID=16429375

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2000/003195 WO2000070070A1 (fr) 1999-05-18 2000-05-18 Vecteur de virus paramyxoviridae defectueux dans un gene enveloppe

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP1186667B1 (ja)
JP (2) JP3602058B2 (ja)
KR (2) KR20070058607A (ja)
CN (1) CN1330767C (ja)
AT (1) ATE367445T1 (ja)
AU (1) AU4614600A (ja)
CA (1) CA2368948C (ja)
DE (1) DE60035589T2 (ja)
DK (1) DK1186667T3 (ja)
ES (1) ES2288473T3 (ja)
HK (1) HK1044352A1 (ja)
WO (1) WO2000070070A1 (ja)

Cited By (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2826010A1 (fr) * 2001-06-14 2002-12-20 Mahmood Salman Al Oligonucleotides antisens capables d'inhiber la formation des tubes capillaires par les cellules endotheliales
WO2003025570A1 (en) * 2001-09-18 2003-03-27 Dnavec Research Inc. Method of examining (-) strand rna virus vector having lowered ability to form grains and method of constructing the same
WO2005042737A1 (ja) 2003-11-04 2005-05-12 Dnavec Research Inc. 遺伝子導入された樹状細胞の製造方法
WO2005071085A1 (ja) * 2004-01-22 2005-08-04 Dnavec Research Inc. ウイルスベクターの製造方法
WO2005097988A1 (ja) * 2004-03-23 2005-10-20 Dnavec Research Inc. 組織の維持および／または修復に関連する骨髄関連細胞
EP1094115A4 (en) * 1998-07-03 2005-11-02 Dnavec Research Inc NEGATIVE STRENGTH RNA VIRUS VECTOR
WO2006001122A1 (ja) * 2004-06-24 2006-01-05 Dnavec Research Inc. Rnaウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤
EP1662003A2 (en) 2000-11-08 2006-05-31 DNAVEC Research, Inc. Paramyxovirus vector for gene transfer to the cardiovascular system
JP2006524511A (ja) * 2003-04-25 2006-11-02 メッドイミューン バクシーンズ，インコーポレイティド メタニューモウイルス由来の異種抗原を含む組換えパラインフルエンザウイルス発現系およびワクチン
WO2006134917A1 (ja) 2005-06-14 2006-12-21 Dnavec Corporation 抗体の作製方法
WO2006137517A1 (ja) * 2005-06-24 2006-12-28 Dnavec Corporation 幼少個体への遺伝子導入用ベクター
US7226786B2 (en) 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
US7241617B2 (en) 1998-07-03 2007-07-10 Dnavec Research, Inc. Sendai viral vectors comprising foreign genes inserted between the R1 and R2 Loci
WO2007083644A1 (ja) 2006-01-17 2007-07-26 Dnavec Corporation 新規タンパク質発現系
WO2007139178A1 (ja) 2006-05-31 2007-12-06 Dnavec Corporation アルツハイマー病治療薬
WO2008007581A1 (fr) 2006-07-13 2008-01-17 Dnavec Corporation Vecteur de virus paramyxoviridae non répliquant
US7402427B2 (en) 2002-04-30 2008-07-22 Dnavec Research Inc. Vectors with modified protease-dependent tropism
WO2008096811A1 (ja) 2007-02-07 2008-08-14 Dnavec Corporation 弱毒化マイナス鎖rnaウイルス
WO2008129971A1 (ja) * 2007-04-13 2008-10-30 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 改良された持続感染型センダイウイルスベクター
WO2008136438A1 (ja) 2007-04-27 2008-11-13 Kyushu University, National University Corporation 遺伝子治療用ウイルスベクター
US7521043B2 (en) 2004-01-13 2009-04-21 Dnavec Research Inc. Gene therapy for tumors using minus-strand RNA viral vectors encoding immunostimulatory cytokines
US7585667B2 (en) * 2003-06-13 2009-09-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Negative strand RNA virus replicon
WO2010008054A1 (ja) 2008-07-16 2010-01-21 ディナベック株式会社 染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いてリプログラムされた細胞を製造する方法
WO2010050586A1 (ja) 2008-10-31 2010-05-06 ディナベック株式会社 組み換え蛋白質の発現を増強する方法
WO2011083881A1 (ja) 2010-01-08 2011-07-14 国立大学法人京都大学 タウオパチー治療用ワクチン
WO2012029770A1 (ja) 2010-08-30 2012-03-08 ディナベック株式会社 多能性幹細胞を誘導するための組成物およびその使用
EP2434020A2 (en) 2004-01-22 2012-03-28 Dnavec Research Inc. Method of producing minus strand RNA virus vector with the use of hybrid promoter containing cytomegalovirus enhancer and avian beta-actin promoter
WO2012053646A1 (ja) 2010-10-22 2012-04-26 国立大学法人北海道大学 ワクシニアウイルスベクターおよびセンダイウイルスベクターからなるプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター
US8211868B2 (en) 2000-11-27 2012-07-03 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vector encoding angiogenesis gene and use thereof
US8217019B2 (en) 2000-03-30 2012-07-10 Dnavec Research Inc. AIDS virus vaccines using Sendai virus vector
WO2012108195A1 (ja) * 2011-02-08 2012-08-16 国立大学法人三重大学 遺伝子導入用ウイルスベクターの製造方法
US8715922B2 (en) 2001-01-19 2014-05-06 ViroNovative Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US8722341B2 (en) 2001-01-19 2014-05-13 Vironovative B.V. Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and sequences
US8841433B2 (en) 2002-02-21 2014-09-23 Vironovative Bv Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
WO2015046229A1 (ja) 2013-09-24 2015-04-02 ディナベック株式会社 多能性幹細胞の誘導効率を改善する方法
US9447432B2 (en) 2010-04-16 2016-09-20 Keio University Method for producing induced pluripotent stem cells
WO2018092887A1 (ja) 2016-11-17 2018-05-24 国立感染症研究所長が代表する日本国 非感染性パラミクソウイルス粒子を用いた感染症ワクチン
US10017784B2 (en) 2005-10-28 2018-07-10 Id Pharma Co., Ltd. Gene transfer into airway epithelial stem cell by using lentiviral vector pseudotyped with RNA virus or DNA virus spike protein
WO2019017438A1 (ja) 2017-07-21 2019-01-24 株式会社Ｉｄファーマ 標的配列を改変するためのポリヌクレオチドおよびその使用
WO2019142933A1 (ja) 2018-01-22 2019-07-25 国立感染症研究所長が代表する日本国 選択的ｃｄ８陽性ｔ細胞誘導ワクチン抗原
WO2022050419A1 (ja) 2020-09-04 2022-03-10 Ｈｅａｒｔｓｅｅｄ株式会社 ｉＰＳ細胞の品質改善剤、ｉＰＳ細胞の製造方法、ｉＰＳ細胞、及びｉＰＳ細胞製造用組成物
WO2022138964A1 (ja) 2020-12-25 2022-06-30 国立大学法人京都大学 体細胞からのナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞製造方法
US11421248B2 (en) 2019-12-31 2022-08-23 Elixirgen Therapeutics, Inc. Temperature-based transient delivery of nucleic acids and proteins to cells and tissues

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1251174A4 (en) * 2000-01-19 2003-05-02 Dnavec Research Inc USE OF A PARAMYXOVIRUS VECTOR FOR GENTE TRANSFER IN BLOOD VESSELS
KR100587388B1 (ko) * 2003-02-14 2006-06-08 주식회사 효성 고강도 폴리비닐알코올 섬유의 제조방법 및 그로부터수득되는 고강도 폴리비닐알코올 섬유
JP2008105946A (ja) * 2005-02-08 2008-05-08 Dnavec Corp 遺伝子導入造血細胞から血液細胞を再構築させる方法
DE102005015005A1 (de) * 2005-04-01 2006-10-05 Qiagen Gmbh Verfahren zur Behandlung einer Biomoleküle enthaltenden Probe
JP5102630B2 (ja) * 2005-11-24 2012-12-19 ジェノミディア株式会社 改変パラミクソウイルスおよびその作製方法
EP2607476B1 (en) 2009-02-27 2015-04-08 Kyoto University Novel nuclear reprogramming substance
US8900871B2 (en) 2009-08-07 2014-12-02 Kyoto University Method of producing induced pluripotent stem cells using inhibitors of P53
EP2480657B1 (en) 2009-09-24 2018-01-17 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
EP2497493A1 (en) * 2009-11-02 2012-09-12 Mie University Nebulizable tuberculosis vaccine for transnasal administration comprising paramyxovirus vector
US9005967B2 (en) 2010-01-22 2015-04-14 Kyoto University Myc variants improve induced pluripotent stem cell generation efficiency
WO2012036299A1 (en) 2010-09-14 2012-03-22 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
WO2012074106A1 (ja) 2010-12-03 2012-06-07 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞からの好酸球の製造方法
WO2012074117A1 (ja) 2010-12-03 2012-06-07 国立大学法人京都大学 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
WO2014103310A1 (ja) * 2012-12-26 2014-07-03 バイオコモ株式会社 ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターを利用したワクチン
CN107849558A (zh) * 2015-06-12 2018-03-27 国立大学法人三重大学 2型人副流感病毒载体和疫苗

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5512421A (en) * 1991-02-19 1996-04-30 The Regents Of The University Of California Generation, concentration and efficient transfer of VSV-G pseudotyped retroviral vectors
DE69634904T2 (de) * 1995-10-31 2006-05-18 Dnavec Research Inc., Tsukuba Negativstrand rna virus mit selbständiger replikationsaktivität
JP3992200B2 (ja) * 1995-11-01 2007-10-17 株式会社ディナベック研究所 組換え体センダイウイルスを利用した膜融合性リポソーム
ATE470704T1 (de) * 1995-11-01 2010-06-15 Dnavec Research Inc Rekombinantes sendai-virus
ATE399206T1 (de) * 1999-05-18 2008-07-15 Dnavec Research Inc Ribonukleoproteinkomplex aus paramyxovirus

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D. YU ET AL.: "Sendai virus-based expression of HIV-1 gp120: reinforcement by the V(-) version", GENES TO CELLS, vol. 2, no. 7, 1997, pages 457 - 466, XP002931598 *
H. KIDO ET AL.: "The human mucus protease inhibitor and its mutants are novel defensive compounds against infection with influenza A and sendai viruses", BIOPOLYMERS (PEPTIDE SCIENCE), vol. 51, no. 1, June 1999 (1999-06-01), pages 79 - 86, XP002931597 *
HAI-OU LI ET AL.: "A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible sendai virus with efficient gene transfer and expression", J. VIROL., vol. 74, no. 14, July 2000 (2000-07-01), pages 6564 - 6569, XP002931595 *
M. BITZER ET AL.: "Sendai virus efficiently infects cells via the asialo-glycoprotein receptor and requires the presence of cleaved F precursor proteins for this alternative route of cell entry", J. VIROL., vol. 71, no. 7, 1997, pages 5481 - 5486, XP002931596 *

Cited By (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1094115A4 (en) * 1998-07-03 2005-11-02 Dnavec Research Inc NEGATIVE STRENGTH RNA VIRUS VECTOR
US7241617B2 (en) 1998-07-03 2007-07-10 Dnavec Research, Inc. Sendai viral vectors comprising foreign genes inserted between the R1 and R2 Loci
US7226786B2 (en) 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
US8217019B2 (en) 2000-03-30 2012-07-10 Dnavec Research Inc. AIDS virus vaccines using Sendai virus vector
EP1662003A2 (en) 2000-11-08 2006-05-31 DNAVEC Research, Inc. Paramyxovirus vector for gene transfer to the cardiovascular system
US8211868B2 (en) 2000-11-27 2012-07-03 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vector encoding angiogenesis gene and use thereof
US9334543B2 (en) 2001-01-19 2016-05-10 Erasmus University Medical Center Rotterdam Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US11162148B2 (en) 2001-01-19 2021-11-02 Erasmus University Medical Center Rotterdam Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US9593386B2 (en) 2001-01-19 2017-03-14 Erasmus Universiteit Medical Center Rotterdam Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US8927206B2 (en) 2001-01-19 2015-01-06 Vironovative B.V. Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US10519517B2 (en) 2001-01-19 2019-12-31 Vironovative Bv Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US8715922B2 (en) 2001-01-19 2014-05-06 ViroNovative Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US8722341B2 (en) 2001-01-19 2014-05-13 Vironovative B.V. Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and sequences
US10167524B2 (en) 2001-01-19 2019-01-01 Erasmus University Medical Center Rotterdam Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US9376726B2 (en) 2001-01-19 2016-06-28 Erasmus University Medical Center Rotterdam Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US9803252B2 (en) 2001-01-19 2017-10-31 Erasmus University Medical Center Rotterdam Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
FR2826010A1 (fr) * 2001-06-14 2002-12-20 Mahmood Salman Al Oligonucleotides antisens capables d'inhiber la formation des tubes capillaires par les cellules endotheliales
WO2003025570A1 (en) * 2001-09-18 2003-03-27 Dnavec Research Inc. Method of examining (-) strand rna virus vector having lowered ability to form grains and method of constructing the same
US9834824B2 (en) 2002-02-21 2017-12-05 Erasmus University Medical Center Rotterdam Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US8841433B2 (en) 2002-02-21 2014-09-23 Vironovative Bv Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US9567653B2 (en) 2002-02-21 2017-02-14 Erasmus University Medical Center Rotterdam Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US9944997B2 (en) 2002-02-21 2018-04-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US11220718B2 (en) 2002-02-21 2022-01-11 Erasmus University Medical Center Rotterdam Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US10287640B2 (en) 2002-02-21 2019-05-14 Erasmus University Medical Center Rotterdam Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences
US7709621B2 (en) 2002-04-30 2010-05-04 Dnavec Research Inc. Vectors with modified protease-dependent tropism
US7402427B2 (en) 2002-04-30 2008-07-22 Dnavec Research Inc. Vectors with modified protease-dependent tropism
JP2006524511A (ja) * 2003-04-25 2006-11-02 メッドイミューン バクシーンズ，インコーポレイティド メタニューモウイルス由来の異種抗原を含む組換えパラインフルエンザウイルス発現系およびワクチン
US7585667B2 (en) * 2003-06-13 2009-09-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Negative strand RNA virus replicon
JP2012065652A (ja) * 2003-11-04 2012-04-05 Dnavec Research Inc 遺伝子導入された樹状細胞の製造方法
WO2005042737A1 (ja) 2003-11-04 2005-05-12 Dnavec Research Inc. 遺伝子導入された樹状細胞の製造方法
US7521043B2 (en) 2004-01-13 2009-04-21 Dnavec Research Inc. Gene therapy for tumors using minus-strand RNA viral vectors encoding immunostimulatory cytokines
US8741650B2 (en) 2004-01-22 2014-06-03 Dnavec Research Inc. Methods for producing minus-strand RNA viral vectors using hybrid promoter comprising cytomegalovirus enhancer and chicken β-actin promoter
EP2434020A2 (en) 2004-01-22 2012-03-28 Dnavec Research Inc. Method of producing minus strand RNA virus vector with the use of hybrid promoter containing cytomegalovirus enhancer and avian beta-actin promoter
WO2005071085A1 (ja) * 2004-01-22 2005-08-04 Dnavec Research Inc. ウイルスベクターの製造方法
WO2005097988A1 (ja) * 2004-03-23 2005-10-20 Dnavec Research Inc. 組織の維持および／または修復に関連する骨髄関連細胞
KR101270839B1 (ko) * 2004-06-24 2013-06-05 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 Ｒｎａ 바이러스가 도입된 수상세포를 포함하는 항암제
US8889118B2 (en) 2004-06-24 2014-11-18 Dna Vec Research Inc. Anticancer agent containing dendritic cell having RNA virus transferred thereinto
WO2006001122A1 (ja) * 2004-06-24 2006-01-05 Dnavec Research Inc. Rnaウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤
JP2013151523A (ja) * 2004-06-24 2013-08-08 Dnavec Research Inc Ｒｎａウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤
JP5296983B2 (ja) * 2004-06-24 2013-09-25 株式会社ディナベック研究所 Ｒｎａウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤
WO2006001120A1 (ja) * 2004-06-24 2006-01-05 Dnavec Research Inc. マイナス鎖rnaウイルスを含む抗癌剤
JPWO2006001122A1 (ja) * 2004-06-24 2008-04-17 株式会社ディナベック研究所 Ｒｎａウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤
WO2006134917A1 (ja) 2005-06-14 2006-12-21 Dnavec Corporation 抗体の作製方法
WO2006137517A1 (ja) * 2005-06-24 2006-12-28 Dnavec Corporation 幼少個体への遺伝子導入用ベクター
US10017784B2 (en) 2005-10-28 2018-07-10 Id Pharma Co., Ltd. Gene transfer into airway epithelial stem cell by using lentiviral vector pseudotyped with RNA virus or DNA virus spike protein
WO2007083644A1 (ja) 2006-01-17 2007-07-26 Dnavec Corporation 新規タンパク質発現系
JPWO2007083644A1 (ja) * 2006-01-17 2009-06-11 ディナベック株式会社 新規タンパク質発現系
WO2007139178A1 (ja) 2006-05-31 2007-12-06 Dnavec Corporation アルツハイマー病治療薬
WO2008007581A1 (fr) 2006-07-13 2008-01-17 Dnavec Corporation Vecteur de virus paramyxoviridae non répliquant
WO2008096811A1 (ja) 2007-02-07 2008-08-14 Dnavec Corporation 弱毒化マイナス鎖rnaウイルス
WO2008129971A1 (ja) * 2007-04-13 2008-10-30 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 改良された持続感染型センダイウイルスベクター
JPWO2008129971A1 (ja) * 2007-04-13 2010-07-22 独立行政法人産業技術総合研究所 改良された持続感染型センダイウイルスベクター
WO2008136438A1 (ja) 2007-04-27 2008-11-13 Kyushu University, National University Corporation 遺伝子治療用ウイルスベクター
EP3075850A1 (en) 2008-07-16 2016-10-05 IP Pharma Co., Ltd. Method for production of reprogrammed cell using chromosomally unintegrated virus vector
WO2010008054A1 (ja) 2008-07-16 2010-01-21 ディナベック株式会社 染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いてリプログラムされた細胞を製造する方法
WO2010050586A1 (ja) 2008-10-31 2010-05-06 ディナベック株式会社 組み換え蛋白質の発現を増強する方法
WO2011083881A1 (ja) 2010-01-08 2011-07-14 国立大学法人京都大学 タウオパチー治療用ワクチン
US9447432B2 (en) 2010-04-16 2016-09-20 Keio University Method for producing induced pluripotent stem cells
AU2011297075B2 (en) * 2010-08-30 2014-07-17 Dnavec Corporation Composition for inducing pluripotent stem cell, and use thereof
US9090909B2 (en) 2010-08-30 2015-07-28 Dnavec Corporation Composition for inducing pluripotent stem cell, and use thereof
JP5908838B2 (ja) * 2010-08-30 2016-04-26 株式会社Ｉｄファーマ 多能性幹細胞を誘導するための組成物およびその使用
WO2012029770A1 (ja) 2010-08-30 2012-03-08 ディナベック株式会社 多能性幹細胞を誘導するための組成物およびその使用
WO2012053646A1 (ja) 2010-10-22 2012-04-26 国立大学法人北海道大学 ワクシニアウイルスベクターおよびセンダイウイルスベクターからなるプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター
US8911975B2 (en) 2011-02-08 2014-12-16 Mie University Method for producing virus vector for gene transfer
WO2012108195A1 (ja) * 2011-02-08 2012-08-16 国立大学法人三重大学 遺伝子導入用ウイルスベクターの製造方法
WO2015046229A1 (ja) 2013-09-24 2015-04-02 ディナベック株式会社 多能性幹細胞の誘導効率を改善する方法
WO2018092887A1 (ja) 2016-11-17 2018-05-24 国立感染症研究所長が代表する日本国 非感染性パラミクソウイルス粒子を用いた感染症ワクチン
JP7150241B2 (ja) 2016-11-17 2022-10-11 国立感染症研究所長 非感染性パラミクソウイルス粒子を用いた感染症ワクチン
JPWO2018092887A1 (ja) * 2016-11-17 2019-10-17 国立感染症研究所長 非感染性パラミクソウイルス粒子を用いた感染症ワクチン
US11103574B2 (en) 2016-11-17 2021-08-31 Japan, as represented by the Director-General of National Institute of Infectious Disease Infectious disease vaccine using non-infectious paramyxovirus particle
WO2019017438A1 (ja) 2017-07-21 2019-01-24 株式会社Ｉｄファーマ 標的配列を改変するためのポリヌクレオチドおよびその使用
WO2019142933A1 (ja) 2018-01-22 2019-07-25 国立感染症研究所長が代表する日本国 選択的ｃｄ８陽性ｔ細胞誘導ワクチン抗原
US11421248B2 (en) 2019-12-31 2022-08-23 Elixirgen Therapeutics, Inc. Temperature-based transient delivery of nucleic acids and proteins to cells and tissues
WO2022050419A1 (ja) 2020-09-04 2022-03-10 Ｈｅａｒｔｓｅｅｄ株式会社 ｉＰＳ細胞の品質改善剤、ｉＰＳ細胞の製造方法、ｉＰＳ細胞、及びｉＰＳ細胞製造用組成物
WO2022138964A1 (ja) 2020-12-25 2022-06-30 国立大学法人京都大学 体細胞からのナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP3602058B2 (ja) 2004-12-15
AU4614600A (en) 2000-12-05
EP1186667A1 (en) 2002-03-13
CN1355851A (zh) 2002-06-26
DK1186667T3 (da) 2007-10-22
KR20020014786A (ko) 2002-02-25
KR100739938B1 (ko) 2007-07-16
JP2004329222A (ja) 2004-11-25
CA2368948C (en) 2013-12-24
ATE367445T1 (de) 2007-08-15
KR20070058607A (ko) 2007-06-08
DE60035589T2 (de) 2008-04-17
EP1186667B1 (en) 2007-07-18
HK1044352A1 (en) 2002-10-18
ES2288473T3 (es) 2008-01-16
CA2368948A1 (en) 2000-11-23
EP1186667A4 (en) 2004-06-30
DE60035589D1 (de) 2007-08-30
CN1330767C (zh) 2007-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3602058B2 (ja) エンベロープ遺伝子欠損パラミクソ科ウイルスベクター
JP3766596B2 (ja) パラミクソウイルスに由来するｒｎｐ
US7226786B2 (en) Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
US20070009949A1 (en) Paramyxovirus-derived RNP
JP3748535B2 (ja) 改変された転写開始配列を有するパラミクソウイルス
US20020169306A1 (en) Envelope gene-deficient paramyxovirus vector
US6746860B1 (en) Paramyxovirus vectors used for transfer of foreign genes
US20060104950A1 (en) Methods of Tranducing genes into T cells
JPWO2003025570A1 (ja) 粒子形成能が低下した（−）鎖ｒｎａウィルスベクターの検査方法および製造方法
US20030022376A1 (en) Paramyxovirus-derived RNP
WO2006137517A1 (ja) 幼少個体への遺伝子導入用ベクター
JP4791651B2 (ja) 外来遺伝子導入用パラミクソウイルスベクター
JPWO2005001082A1 (ja) 高変異領域が改変された遺伝子を搭載するマイナス鎖ｒｎａウイルスベクター
JP2004344001A (ja) 胚性幹細胞に遺伝子を導入する方法
WO2005087936A1 (ja) 胚性幹細胞に遺伝子を導入する方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 00805673.0

Country of ref document: CN

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09966277

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2368948

Country of ref document: CA

Ref document number: 2368948

Country of ref document: CA

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000927807

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020017012612

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020017012612

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000927807

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWR Wipo information: refused in national office

Ref document number: 1020017012612

Country of ref document: KR

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 2000927807

Country of ref document: EP