TWI374893B - Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide - Google Patents

Description

1374893 九、發明說明 相關的申請案 本申請案申稱先前申請的臨時專利申請案U.S. Serial No. 60/474,654 (申請曰期2003年5月30日），標題 "Humanized Antibodies That Recognize Beta-Amyloid Peptide”的利益。上述參考文獻全文在此倂入參考文獻。 【發明所屬之技術領域】 本發明提供治療病人腦內Αβ澱粉樣沈澱物相關的疾 病之改良藥劑以及方法。較佳的藥劑包含抗體，例如，人 類化抗體。 【先前技術】 阿茲海默氏症（AD)是造成老年痴呆症的進行性疾 病。一般而言可參閱 Selkoe，TINS 16: 403 ( 1993);

Hardy e t a 1., WO 9 2/1 3069 ； Selkoe，J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53 : 438 ( 1994) ; Duff e t a 1., Nature 373 : 476 (1 995 ) ； Games et al., Nature 3 73 ： 5 2 3 ( 1 995 )。大體 而言，此疾病可分成二種範疇：遲發型，發生在老年（65 歲以上）以及早發型，發生在老年之前，即介於35至60 歲之間。在此二類型之疾病中，病理學雖然相同，但早發 型的異常有更嚴重以及散佈更廣的傾向。此疾病之特徵在 於至少有二種類型之腦部損害，分別爲神經纖維纏結以及 老年斑。神經纖維纏結是細胞內相關於tau蛋白質的微管 -5-

1374893 沈灑物，其係由二個相互扭曲的成對絲狀體組成。 (即澱粉狀蛋白斑）是多至1 5 0微米的不規則神經 ，腦組織切片透過顯微鏡的分析可看見其中心有細 澱粉狀蛋白沈澱物。腦內澱粉狀蛋白斑堆積亦與唐 症及其它認知的病症相關。 蛋白斑主要的組份是一種肽，稱爲或yS-源 蛋白肽。肽是較大的橫越細胞膜之糖蛋白質，稱 粉狀蛋白前驅物蛋白質（APP)的39-43個胺基酸 kDa大小的內部片段。彼是APP經不同分泌酶酵素7} 結果，A/3主要可分成短型（長度爲40個胺基酸） 長型（長度爲42-43個胺基酸）。APP厭水性的橫® 膜之結構區部份位於之羧基端，具有使AyS (戈 長型）聚集成蛋白斑之能力。腦部中澱粉狀蛋白斑堆 後會導至神經元細胞的死亡。與此類型神經惡化相闕 狀是阿茲海默氏症。 APP蛋白質內之許多突變與阿茲海默氏症相關。 例如 Goate et al., Nature 349: 704) ( 1991)(緯 至異白胺酸）；Chartier Harlan et al.Nature 353 (1991 )(纈胺酸 717至甘胺酸）；Murrell e Science 254 : 97 ( 1 99 1 )(纈胺酸717至苯丙胺酵 Mullan et al., Nature Genet.1 ： 345 ( 1 992 )(雙突 | 離胺酸5 9 5 ·甲硫胺酸5 9 6至天門冬醯胺酸5 9 5 ·白胺酸 。該突變似可因增加或改變APP至A办之作用引起炉 默氏症，尤其是加工APP以增加長型A々（即A /3 1 . ί年斑 ί區域 Ϊ外的 :綜合 丨粉樣 丨爲澱 之4-:解之 ，及 3細胞 :其是 ^積最 !的症 參閱 ΐ胺酸 ：844 t al.， ：)； @改變 5 9 6 ^ ί茲海 42以 1374893 及 AySl-4 3)之含量。其它基因之突變，例如早老因子基 因、PSI以及PS2，似可間接的影響APP加工，增加長型 A /3 之產量（參閱 Hardy，TIN S20: 154(1997))。

使用小鼠模式已成功地測定澱粉狀蛋白斑在老年痴呆 症的顯著性（Games et al_, supra, Johnson-Wood et al.， Proc.Natl. Acad. Sci. USA 94 : 1 550 ( 1 997 ))。特定言 之，當對PDAPP導入外來基因的老鼠（表現人類APP之 突變形式，並在幼年時即產生阿茲海默氏症）注射長型A

召時，彼可降低老年痴呆症的進展以及增加A/3肽之抗體 效價(Schenk et al., Nature 4 0 0, 173 ( 1999))。以上之 觀察指出AyS (尤其是長型A/3)是阿茲海默氏症的病因 0 據此須要治療阿茲海默氏症之新療法及試劑，特定言 之，能在生理的（例如無毒的）劑量下具有治療利益的療 法及試劑。 【發明內容】 本發明槪要 本發明特色是一種新的免疫試劑，特定言之是一種預 防及治療成澱粉樣疾病（例如阿茲海默氏症）的治療用抗 體試劑。本發明至少部份是基於單株抗體之鑑定以及特徵 化。12A11，可專一結合至Αβ肽以及有效降低和成澱粉 樣病症相關的溶菌斑負擔，分析此抗體的構造及功能可導 至設計各種用於預防及/或治療的人類化抗體。特定言之 1374893 . ，本發明的特色是人類化此抗體之變異區，據此提供人類 化免疫球蛋白或抗體鏈、完整的人類化免疫球蛋白或抗體 、以及功能性免疫球蛋白或抗體片段，尤其是特色化抗體 之抗原結合片段。 亦揭示包含特色化單株抗體之互補性決定區域（ CD Rs )的多胜肽、多核苷酸試劑、載體以及適用於編碼 該多胜肽之宿主細胞。 本發明揭示治療成澱粉樣疾病或病症（例如阿茲海默 ® 氏症）之方法、應用於該用途之藥學組成物及組套。 本發明亦包括確認特色化單株抗體內殘基（對適當的 免疫功能重要的殘基）的方法，以及確認在設計治療試劑 的人類化抗體上可經取代後改良結合親和力及/或降低產 生免疫性之殘基的方法。 本發明的特色亦爲抗體（例如具有改變致效劑功能的 人類化抗體）以及其治療上的用途。 發明之詳細描述 本發明之特色爲預防或治療阿茲海默氏症或其它成澱 粉樣疾病之新穎的免疫試劑及方法。本發明至少是部份地 於特徵化之單株的免疫球蛋白（12A11)、有效的結合β 澱粉樣蛋白質（Αβ)(例如結合可溶解的及/或聚集的Αβ )、調控吞噬作用（例如聚集的Αβ)、降低溶菌斑負重 擔及/或者降低神經失調（例如在病人體內）。本發明進 —步的係基於測定以及特徵化丨2 A 1 1免疫球蛋白可變的輕 1374893 及重鏈之一級及二級結構的構造以及鑑定活性及產生免疫 性重要的殘基。 免疫球蛋白的特色包括在此描述的12A11單株免疫球 蛋白之可變的輕及/或可變的重鏈。較佳的免疫球蛋白（ 例如治療的免疫球蛋白）之特色包括人類化的可變的輕及 /或人類化的可變的重鏈。較佳的可變的輕及/或可變的重 鏈包括來自12A11免疫球蛋白之互補性決定區域（CDR) (例如供體免疫球蛋白）以及（實質上）來自人類受體免 疫球蛋白之可變的架構區域。"實質上來自人類受體免疫 球蛋白”係指來自人類受體序列的主要或關鍵架構殘基， 然而可在某些殘基位置上可用選擇的殘基取代以改良人類 化免疫球蛋白活性（例如改變其活性以更緊密的模仿供體 免疫球蛋白之活性）或選擇的降低人類化免疫球蛋白之產 生免疫性。 在具體實施例之一中，本發明的特色是人類化免疫球 蛋白輕或重鏈’其係包括12A11變異區之互補性決定區域 (CDRs )(即包括序列確認號碼：2之輕鏈變異區序列的 一、二或三個CD Rs或包括序列確認號碼：4之重鏈變異 區序列的~、二或三個CDRs)，以及包括來自人類受體 免疫球蛋白輕或重鏈序列可變的架構區域，可視需要具有 至少一個架構殘基之殘基返回突變至對應的鼠科動物殘基 ，其中該返回突變實質上不影響該鏈直接結合A /3之能力 〇 在具體實施例之一中，本發明的特色是人類化免疫球 -9- 1374893 蛋白輕或重鏈，其係包括12A11變異區之互補性決定區域 (CDRs)(即包括序列確認號碼：2之輕鏈變異區序列的 —、二或三個CDRs或包括序列確認號碼：4之重鏈變異 區序列的一、二或三個CDRs)，以及包括實質上來自人 類受體免疫球蛋白輕或重鏈序列可變的架構區域，可視需 要具有至少一個架構殘基之殘基返回突變至對應的鼠科動 物殘基’其中該返回突變不影響該鏈直接結合之能力 〇 在另一具體實施例中，本發的明特色是人類化免疫球 蛋白輕或重鏈其係包括12A 11變異區互補性決定區域（ CDRs )(例如包括序列確認號碼：2輕鏈變異區序列之一 、二或三個CDRs及/或包括序列確認號碼：4重鏈變異區 序列之一、二或三個CDRs)，以及包括實質上來自人類 受體免疫球蛋白輕或重鏈序列之可變的架構區域，可視需 要具有至少一個架構殘基係經小鼠1 2B4輕或重鏈變異區 序列對應的胺基酸殘基取代，該架構殘基係選自：（a ) 非共價鍵地直接結合至抗原的殘基；（b)與CDR相鄰的 殘基；（c )與CDR交互作用的殘基（例如以已解析之結 構的同源習知免疫球蛋白鏈爲基礎模式化輕或重鏈加以確 認）；以及（d)參與VL-VH界面的殘基。 在另一具體實施例中，本發的明特色是人類化免疫球 蛋白輕或重鏈，其係包括12A11變異區CDRs以及可變的 架構區域來自人類受體免疫球蛋白輕或重鏈序列，可視需 要具有至少一個架構殘基係經小鼠1 2 A 1 1輕或重鏈變異區 -10- 1374893 序列對應的胺基酸殘基取代，架構殘基是經變異區三維模 式分析確認能影響輕鏈變異區構形或功能之殘基，例如能 與抗原交互作用之殘基、接近抗原結合部位之殘基、與 CDR交互作用之殘基、與CDR相鄰的殘基、距CDR6A以 內之殘基、規範的殘基、游標區殘基、鏈間裝塡殘基、獨 特的殘基、或結構模型表面之糖化位點殘基。 在另一具體實施例中，本發明的特色除了上述之取代 以外’至少還取代一個稀有之人類架構殘基。例如稀有殘 基可經此位置人類可變的鏈序列共同的胺基酸殘基取代。 此外稀有殘基可經同源種系可變的鏈序列之對應的胺基酸 殘基取代。 在另一具體實施例中，本發的明特色是人類化免疫球 蛋白，其係包括說明如上之輕鏈以及重鏈，或該免疫球蛋 白之抗原結合片段。在典型的具體實施例中，人類化免疫 球蛋白結合（例如專一地結合）石澱粉樣蛋白肽（A^) 之結合親和力至少爲ΙΟ7 Μ·1、ΙΟ8 Μ·1、或1〇9 Μ·1。在另 一具體實施例中，免疫球蛋白或者抗原結合片段包括具有 同功型之重鏈。在另一具體實施例中，免疫球蛋白或抗原 結合片段結合（例如專一地結合）至可溶解的/3澱粉樣蛋 白肽（Α/3)以及聚集的 a沒。在另一具體實施例中，免 疫球蛋白或者抗原結合片段可捕可溶解的A/3 (例如可溶 解的A々l-42)。在另一具體實施例中’免疫球蛋白或抗 原結合片段可間接中介/?-澱粉樣蛋白肽（A沒）之吞噬作 用（例如誘發吞噬作用）。在另一具體實施例中，免疫球 -11 - 1374893 • 蛋白或抗原結合片段可通過患者之血腦屏障。在另一具體 . 實施例中，疫球蛋白或抗原結合片段可降低患者之沒澱粉 樣蛋白狀（A0 )含量及神經失調。 在另一具體實施例中，本發明的特色是嵌合的免疫球 蛋白，其係包括1 2 A 1 1變異區（例如序列確認號碼：2或 序列確認號碼：4之變異區序列）。在另一具體實施例中 ，免疫球蛋白、或其抗原結合片段進一步的包括從疫球蛋 ^ 白G 1之恆定區。 在此描述之免疫球蛋白尤其適於應用於預防或治療成 澱粉樣疾病的方法。在具體實施例之一中，本發明的特色 是預防或治療成澱粉樣疾病（例如阿茲海默氏症）的方法 ’其係包含對病患投用有效劑量的在此描述的人類化免疫 球蛋白。在另一具體實施例中，本發明之特色爲藥學組成 物，其係包括在此描述之人類化免疫球蛋白以及醫藥上的 載體。本發明的特色亦爲產生在此描述之免疫球蛋白或免 φ 疫球蛋白片段或鏈之分離的核酸分子、載體以及宿主細胞 ’與產生該免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或免疫球蛋白鏈 的方法。 本發明進一步的特色是當產生人類化的12A11免疫球 蛋白時，確認能取代之12A1 1殘基的方法。例如，確認能 取代之可變架構區域殘基的方法包含以解析的同源免疫球 蛋白結構模式化12A11變異區之三維結構以及分析該模式 中能影響1 2A1 1免疫球蛋白變異區構形或功能之殘基，因 而確認能取代之殘基。本發明進一步的特色係使用序列確 -12- 1374893 認號碼：2或序列確認號碼：4之變異區序列，或其任何 部份，產生丨2 All免疫球蛋白、12A11免疫球蛋白鏈、或 其結構區之三度空間影像。 本發明進一步的特色爲具有經改變的致效劑功能（例 如結合到致效劑分子，例如補體或致效細胞受體之能力） 之免疫球蛋白。特定言之，本發明之免疫球蛋白具有經改 變的恆定區（例如Fc區域），其中Fc區域內至少有一個 胺基酸殘基已被不同殘基或側鏈取代。在具體實施例之一 中，此經修飾之免疫球蛋白是G型免疫球蛋白，彼在Fc 區域中至少包含一個代替的胺基酸殘基，因此該免疫球蛋 白相較於未經修飾之免疫球蛋白，具有經改變的致效劑功 能。在特定的具體實施例中，本發明免疫球蛋白具有經改 變的致效劑功能，因此產生免疫性的較低（例如不刺激非 所要求的致效細胞之活性、溶解、或與補體結合），彼具 有改良的澱粉狀蛋白清除率性質，及/或具有令人滿意的 半生期。 在描述本發明之前，爲了幫助對本發明之了解，因此 對用於下文之某些術語作出定義。 本文之”免疫球蛋白"或”抗體”（在本文中係可通用） 意指具有由二個重鏈及二個輕鏈組成之基本的四個多胜鍵 結構之蛋白質，該鏈例如經鏈間雙硫鍵加以穩定，其具有 專一結合至抗原的能力。本文術語之"單一的鏈免疫球蛋 白"或"單一鏈抗體"（在本文中係可通用）意指由重鏈及 輕鏈組成之基本的二個多胜鍵結構之蛋白質，該鏈例如經 -13-

1374893 鏈間肽連結子加以穩定，其具有專一結合至抗原 本文術語之"結構區"意指重或輕鏈多肽的球狀區 由例如P·平板及/或鏈內雙硫鍵組成之肽環（例 至4個肽環形）加以穩定。本文中之結構區可進 成”固定的"或"可變的"結構區，在”固定的”結構 成員之結構區內相對的缺少序列變異，在"可變G 中各類成員之結構區內有顯著的變異。在此技藝 多肽”結構區"經常與抗體或多肽"區域”相互通用 鏈”固定的"結構區可與”輕鏈恆定區”、”輕鏈固定 ”、”CL”區域或"CL”結構區相互通用。抗體重鏈 結構區可與”重鏈恆定區"、"重鏈固定的結構區” 域或”CH”結構區相互通用。抗體輕鏈"固定的"結 ”輕鏈恆定區"、”輕鏈固定的結構區"、"VL"區域 構區相互通用。抗體重鏈"可變的"結構區可與" 區”、"重鏈固定的結構區"、"VH"區域或"VH"結 通用。 本文術語之"區域"亦可意指一部份或部份之 抗體鏈結構區（例如本文定義之一部份或部份之 或一部份或部份之固定的或可變的結構區），以 結構區與更多的不連接的部份。例如輕及重鏈或 可變的結構區包括散布在本文定義的"架構區域 間之"互補性決定區域"或"CDRs"。 免疫球蛋白或抗體可爲單體或聚合體的形 IgM抗體爲五合體的形式及/或IgA抗體爲單體 的能力。 域，其係 如包含3 一步的分 區中各類 β ”結構區 中抗體或 。抗體輕 的結構區 "固定的” 、"CH"區 構區可與 或"VL"結 重鏈恆定 構區相互 抗體鏈或 重或輕鏈 及該鏈或 輕及重鏈 ••或"FRs" 式，例如 、雙體或 -14-

1374893 多體的形式。本文術語之"片段"意指一部份或部份之 或抗體鏈，比完整的或完全的抗體或抗體鏈包含較少 基酸殘基。完整的或完全的抗體或抗體鏈經化學或酵 理後可得到片段。片段亦可得自重組方法。典型的片 括 Fab、Fab’、F(ab·) 2' Fabc 及 /或 Fv 片段。本文 之"抗原結合片段”意指免疫球蛋白或抗體結合抗原或 整的抗體（即與彼來源之完整的抗體）競爭抗原結合 專一的結合）的多肽片段。 本文術語之”構形”意指蛋白質或多肽（例如抗體 體鏈、結構區或其區域）之三級結構。例如'’輕（或 鏈構形”意指輕（或重）鏈變異區之三級結構，以及’’ 構形”或”抗體片段構形”意指抗體或其片段之三級結構 抗體"專一的結合"意指抗體對抗原或較佳的抗原 部位展現可觀的親和力，且較佳者不展現顯著的交互 性。"可觀的”或較佳的結合包括結合親和力至少爲1 ΙΟ7、ΙΟ8、ΙΟ9 M·1、或 l〇1Q M-1。親和力大於 loW1 佳者大於1〇8 Μ'1者爲更佳。上述之中間値亦預期的 發明範圍以及親和力範圍較佳的結合親和力爲例如II 101Q M·1，較佳者 107 至 ΙΟ1。M·1，更佳者 108 至 1〇1( 。"不展現顯著的交互反應性”的抗體將不太會結合至 人滿意的物質（例如非令人滿意的蛋白質物質）。例 一結合至A0的抗體將會結合Αβ但不會與非A/g蛋 或肽類（例如噬菌斑內包括之非ΑΘ蛋白質或肽類） 著的反應。對較佳的抗原決定部位具專一性的抗體將 gttt 抗體 之胺 素處 段包 術語 與完 (即 、抗 重） 抗體 〇 決定 反應 06、 ，較 爲本 )6至 M·1 非令 如專 白質 有顯 (例 -15- 1374893 如）不會與相同蛋白質或肽遠方的抗原決定部位有顯著的 雜交反應。專一的結合可依據任何確認之決定該結合的技 藝方法測定。較佳者，專一結合的測定係依據Sc at chard 分析及/或競爭性的結合測定。 結合片段之製作係經重組DNA技藝，或經酵素或化 學方法切除自完整的免疫球蛋白。結合片段包括Fab、 Fab’、F ( ab，）2、Fabc、Fv、單鏈、及單鏈抗體。除 了" 雙專一的"或"雙功能的"免疫球蛋白或抗體之外，據瞭解 免疫球蛋白或抗體之各個結合部位是相同的。"雙專一性 的”或"雙功能抗體"是人造的雜化抗體，其具有二種不同 的重鏈/輕鏈對，及二種不同的結合部位。雙專一抗體可 用各種方法製作’包括融合瘤融合或聯結Fab'片段。參閱 例如 Songsi vilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 ( 1990 ) ； Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1 547- 1 5 5 3 ( 1 992 ) ° 本文術語之''人類化免疫球蛋白”或”人類化的抗體”意 指包括至少一個人類化免疫球蛋白或抗體鏈（即至少一個 人類化的輕或重鏈）的免疫球蛋白或抗體。本文術語之" 人類化免疫球蛋白鏈"或"人類化的抗體鏈”（即”人類化免 疫球蛋白輕鏈”或”人類化免疫球蛋白重鏈”）意指一種免 疫球蛋白或抗體鏈（即輕或重鏈），其具有實質上來自人 類免疫球蛋白或抗體可變架構區域的變異區以及實質上來 自非人類免疫球蛋白或抗體的互補性決定區域（CDRS ) (例如至少一個 CDR，較佳者二個 CDRs，更佳者三個 -16- 1374893 CDRs)，以及進一步的包括恆定區（例如至少一個輕鏈 的恆定區或其部份，以及較佳者三個重鏈之恆定區）。本 文術語之"人類化的變異區"（例如”人類化的輕鏈變異區，， 或"人類化的重鏈變異區"）意指包括實質上來自人類免疫 球蛋白或抗體可的變架構區域之變異區，以及實質上來自 非人類免疫球蛋白或抗體之互補性決定區域（CDRs)。 ”實質上來自人類之免疫球蛋白或抗體"或"實質上之 人類”係指在比對時可校整至人類免疫球蛋白或抗體之胺 基酸序列，該區域與人類架構或恆定區序列至少有80-90%相同，較佳者至少90-95%相同，更佳者至少95-99% 相同（即具有局部的序列相似性），允許有例如保留性取 代、共識性序列取代、種系取代、返回突變等。引入保留 性取代、共識性序列取代、種系取代、返回突變、及其類 似者，經常稱爲人類化的抗體或鏈之”最適化"。”實質上 來自非人類免疫球蛋白或抗體"或"實質上非人類”係指免 疫球蛋白或抗體序列與非人類生物體（例如非人類之哺乳 動物）至少有8 0-95 %，較佳者至少90-95%，更佳者96% 、9 7 %、9 8 %、或 9 9 % 之相同。 據此，人類化免疫球蛋白或抗體之所有區域或殘基， 或人類化免疫球蛋白或抗體鏈，除了可能地CDRs之外， 實質上與一種或多種天然的人類免疫球蛋白序列其對應的 區域或殘基相同。本文術語之”對應區域”或”對應殘基"意 指第一種及第二種序列經最理想的校整比對後，與第一種 胺基酸或核苷酸序列在佔有相同（即相等）位置之第二種 -17- 1374893 胺基酸或核苷酸序列的區域或殘基。 本文術語之"顯著的特性”係指二種多肽序列，經最理 想的校整（例如經程式GAP或BESTFIT，使用預設間隙 加權），分享至少5 0-60%之序列相似性，較佳者 60-70% 之序列相似性，更佳者 70-80%之序列相似性，更佳者至 少80-90%之相似性，再更佳者至少90-95%之相似性，以 及最佳者至少95%或更多之序列相似性（例如99%或更多 之序列相似性）。本文術語之”實質上相同”係指二種多肽 序歹!J，經最理想的校整（例如經程式GAP或BESTFIT， 使用預設間隙加權），分享至少80-90%之序列相似性， 較佳者90-95%之序列相似性，更佳者至少95%或更多之 序列相似性（例如99%或更多之序列相似性）。在序列比 對時，一般是用一個序列作爲參考序列，以比較測試序列 。當使用序列比對算則時，先將測試及參考序列輸入電 腦，指定次序列坐標（若須要），以及指序列算則程式參 數。然後序列比對算則會基於指定的程式參數計算測試序 列相對於參考序列的序列相似性百分比。 進行最理想的序列校整比對可用例如：局部的同源現 象算貝lj ( Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2 : 482 ( 1981))、同源現象校整算則（Needleman & Wunsch，J. Mol. Biol. 48 : 443 ( 1 970 ))、搜尋相似性的方法（ Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 ： 2444 ( 1 9 8 8 ))、完成電腦化的此類算則（GAP、BESTFIT、 FASTA 、及 TFASTA ， Wisconsin Genetics Software -18- 1374893

Package, Genetics Computer Group, 5 7 5 Science Dr., Madison, WI)、或目視檢驗（一般而言參閱Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)。用於決定

序列相似性百分比及序列相似性的算則之一個實施例爲 BLAST 算貝ij，其係描述於 Altschul et al., J.. Mol. Biol. 2 1 5 : 403 ( 1 990 )。進行 BLAST分析之軟體公佈於 National Center for Biotechnology Information (可經由 National Institutes of Health NCBI internet server 網際網 路伺服器公開地存取）。雖然自訂的參數亦可使用，一般 可是用預設的程式參數以進行序列比對。比對胺基酸序列 時，BLAST程式使用的預設値：長度（W)爲3、期望値 (E)爲10、以及BLOSUM62分數基質（參閱Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 ： 1 09 1 5 ( 1989 ) 較佳者，不同的殘基位置因保留性胺基酸取代而顯示 出不同。爲了區分成保留性或非守恒性的胺基酸取代，可 將胺基酸分成以下數群：第一群（厭水性的側鏈）：leu 、met、ala、val、leu、ile ;第二群（中性親水性的側鏈 ):cys、ser、thr;第三群（酸性的側鏈）：asp、glu; 第四群（驗性的側鏈）：asn、gin、his、lys、arg;第五 群（影響鏈方向的殘基）：gly、pro ;以及第六群（芳香 族側鏈）：trp ' tyr、phe。保留性取代包含同群內胺基酸 間之取代。非守恒性的取代則是由不同群之胺基酸間之交 換所構成。 -19- 1374893 較佳者，人類化免疫球蛋白或抗體結合抗原之親和力 爲對應的非人類化抗體的三、四、或五倍》例如若非人類 化的抗體具有結合親和力爲ΙΟ9 M·1，則人類化的抗體之 結合親和力至少爲3 X ΙΟ9 M5、4 X ΙΟ9 M·1或5χ ΙΟ9 M-1 。當描述免疫球蛋白或抗體鏈之結合性質時，可基於鏈" 直接地與抗原（例如A yS )結合"之能力對鏈加以描述。 當完整的免疫球蛋白或抗體（或其抗原結合片段）具有專 一的結合性質或結合親和力，則該鏈可"直接地與抗原結 合"。若突變可影響（例如減低）完整的免疫球蛋白或抗 體（或其抗原結合片段）之結合親和力，而該抗體或其抗 原結合片段與缺少該突變之鏈相差至少一個數量級，則該 突變（例如返回突變）可實質上影響重或輕鏈直接與抗原 結合之能力。若突變可影響（例如減低）完整的免疫球蛋 白或抗體（或其抗原結合片段）之結合親和力，而該抗體 或其抗原結合片段與缺少該突變之鏈僅相差二、三或四倍 ，則該突變不會實質上影響重或輕鏈直接與抗原結合之 能力。 本文術語之"嵌合型免疫球蛋白"或抗體意指變異區來 自第一種物種以及恆定區來自第二種物種之免疫球蛋白或 抗體。嵌合型免疫球蛋白或抗體可構築（例如用遺傳工程 方法）自屬於不同物種之免疫球蛋白基因片段。本文術語 之"人類化免疫球蛋白”或”人類化的抗體"不預期包含上述 定義之嵌合型免疫球蛋白或抗體。雖然人類化免疫球蛋白 或抗體是以嵌合的方式建築（即包含一種蛋白質以上之區 -20- 1374893 域），但彼包括嵌合型免疫球蛋白或抗體所沒有 色（即包含供體CD R殘基之變異區以及受體架 〇 "抗原"是抗體專一結合的實體（例如蛋白質 肽）。 本文術語之"抗原決定部位"或"抗原決定位" 上可與免疫球蛋白或抗體（或其抗原結合片段） 合的位點。抗原決定部位可由疊連群胺基酸或鄰 三級摺疊之非疊連群胺基酸所形成。疊連群胺基 抗原決定部位在變性溶劑的曝露下一般仍可保留 摺疊形成的抗原決定部位用變性溶劑處理後一般 。典型地抗原決定部位包括在獨特的空間構形中 、4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14 或 1 酸。決定抗原決定部位空間構形）的方法包括， 射線結晶學以及2-維核磁共振。參閱例如 Mapping Protocols in Methods in Molecular Biol 66，G. E. Morris，Ed· ( 1 996 ) 〇 辨識相同抗原決定部位的抗體可用簡單的顯 體阻塞另一抗體結合至目標抗原能力之免疫測定 性的結合測定）加以確認。在測試的免疫球蛋白 考抗體專一的結合至共同的抗原（例如Αβ)之: 測定競爭性的結合。許多的型態競爭性結合測定 測定’例如：直接或間接的固相放射免疫分析法 、直接地或間接的固相酵素免疫分析法（El A ) 的額外特 構殘基） 的實體或 意指抗原 專一地結 近蛋白質 酸形成的 ，而三級 則會喪失 的至少3 5個胺基 例如：X Epitope ogy，Vo 1. 示一個抗 (即競爭 可抑制參 測定中可 爲習知的 (RIA ) 、三明治 -21 - 1374893 競爭測定（參閱 Stahli et al_，Methods in Enzymology 9 : 242 ( 1 983 ));直接地固相生物素-卵白素EIA (參閱 Kirkland et al., J. Immunol. 137 · 36 1 4 ( 1 986 )):直接 標記的固相測定、直接標記的固相三明治測定（參閱 Harlow and Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press ( 1 98 8 ));使用 1-125 直接標記的 固相 RIA (參閱 Morel et al·，Mol. bnmunol. 25(1) :7

(1 988 ))； 直接地固相生物素-卵白素 EIA ( Cheung et al·，Virology 176: 546 ( 1990)):以及直接標記的 RIA ( Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 3 2 : 77 ( 1 990 ))。通常該測定包含使用結合至固體表面之純化的 抗原或帶有此類抗原的細胞、未標記的測試免疫球蛋白以 及標記的參考免疫球蛋白。在測試免疫球蛋白存在下決定 標記物結合至固體表面或細胞的含量以測量競爭性的抑制 。通常測試免疫球蛋白係於測試中過量存在。通常當競爭 抗體過量時，將至少抑制50-55%、5 5-60%、60-65%、65-70%、70-75 %或更多的參考抗體專一的結合至共同的抗原 抗原決定部位亦可被免疫細胞（例如B細胞及/或T 細胞）確認。可用活體外測定決定抗原決定部位之細胞辨 視作用’其係測定3 Η -胸腺嘧U定倂入計量抗原依存的增殖 、細胞激動素分泌、抗體分泌、或抗原-依存的殺死作用 (細胞毒性的T淋巴細胞測定）。 在人類澱粉狀蛋白前驅物蛋白質（APP)中可發現典 -22- 1374893 型的抗原決定部位或抗原決定位，但較佳者是在APP的A 召肽中發現抗原決定位。APP有多重異構形式’例如 APP69 5、APP751以及 ΑΡΡ77β。APP內的胺基酸係依據 ΑΡΡ77〇的異構形式序列編號（參閱例如 GenBank Accession No. P05067) 。A)3狀（在此亦指召澱粉樣肽以

及八-点）大約是4-匕〇3之內部的39-4 3個胺基酸之众？？（ A)S39、A/340、A/341、AyS42 以及 A召 343)。例如 A 泠 40是由APP之殘基672-711組成以及A/342是由APP之 殘基673-7 1 3組成。APP經不同分泌酵素在活體或原位中 進行蛋白質水解後發現A 0是"短形式"（長度爲40個胺基 酸），以及"長形式"（長度介於4-43個胺基酸）。在此描 述的較佳抗原決定部位或抗原決定位，位於A谷肽的N-端 內以及包括胺基酸1-10的殘基，較佳者爲A/342的 殘基1-3、1-4、1-5、1-6、1-7或3-7。額外的抗原決定部 位或抗原決定位包括A/3的殘基2-4、5、6、7或8，A冷 的殘基3-5、6、7、8或9，或Αβ342的殘基4-7、8、9或 10。當抗體結合至具有特定殘基的抗原決定部位（例如A 石3-7)時，意指抗體專一結合至內含特定殘基的多肽（ 即例如Αβ33 )。該抗體並不須與A沒3-7上的每個殘基接 觸。每個由 A /3 3 - 7取代或刪除的單一胺基酸亦不須會顯 著影響結合親和力。 本文術語之”成澱粉樣疾病"包括任何與不溶的澱粉狀 蛋白細纖維之形成或沉積相關之疾病。典型的成澱粉樣疾 病包括（但非限於）：全身性澱粉樣變性、阿茲海默氏症 -23- 1374893 、成長後開始發作的糖尿病、帕金森氏病、杭丁頓氏舞蹈 病、額顳骨的痴呆症、及與蛋白質感染素相關的可傳染的 海綿狀體腦脊髓炎病變（人類的庫魯症以及Creutzfeldt-Jacob疾病）以及羊的搔癢症以及牛的BSE)。不同成澱 粉樣疾病之定義或其特徵在於沉積之細纖維的多肽成份之 本質。例如可用/3-澱粉狀蛋白蛋白質沉積之澱粉狀蛋白 的多肽成份（例如野生型、變型、或縮短型/5-澱粉狀蛋 白蛋白質）特徵化阿茲海默氏症的病患或病人。據此，阿 茲海默氏症是例如患者或病患的腦部"其特徵在於A石沈 澱"或"與A万沈澱相關的疾病"之疾病的實施例。本文術語 之"/3 -澱粉狀蛋白蛋白質"、"沒-澱粉樣蛋白酶"、"石-澱 粉狀蛋白”、"A /3 "以及"A召肽"在此可相互通用。 "產生免疫性的藥劑"或’’抗原”是指投用至哺乳動物後 能誘發免疫的反應對抗自生之藥劑，其可視需要倂入佐劑 〇 本文術語之"治療"定義成對病患施用或投用治療劑， 或對取且具有疾病、疾病症狀或病室之遺傳傾向的病患之 分離組織或細胞株施用或投用治療劑，以治療、治癒、緩 和、減輕、改變、痊癒、改善、改良或影響疾病、疾病症 狀或疾病之遺傳傾向。 本文術語之"有效劑量"或"有效的劑量"的定義是充分 的達成或至少局部地達成所要求的效應之劑量。本文術語 之"治療上有效劑量"的定義是充分的治療或至少局部地遏 止疾病以及患有該疾病之病患的倂發症之劑量。有效的劑 -24- 1374893 量將取決於感染之嚴重性以及病人自身免疫系統的一般狀 能〇 本文術語之"病患"包括得到預防性的或治療性的治療 之人類以及其它哺乳動物的病患。 ••可溶解的"或"解離的"A 意指非凝聚或非聚集的A 多肽，包括單體型可溶解的與寡聚型可溶解的A万多肽 (例如可溶解的Αβ二聚物、三聚物、及其類似者）。"不 溶的"A /3意指凝聚的Αβ多肽，例如經非共價鍵結合之A /3。據相信A /3 (例如A々42 )是經由於至少部份地存在 於肽C-端（APP橫越細胞膜之結構區部份）的厭水性殘基 而聚集。在活體內可在生物的體液例如腦脊髓液及/或血 清發現可溶解的A 0。此外，經由純淨的DMSO在音波振 盪下溶解冷凍乾燥的肽可製備可溶解的Αβ。生成的溶液 可用離心（例如1 4,000xg，4°C、10分鐘）去除任何不溶 的微粒。 本文術語之"致效劑功能"意指抗體（例如IgG抗體） Fc區域之活性以及包括例如抗體結合致效劑分子（例如補 體及/或Fc受體）之能力，其可控制抗體的數個免疫功能 ，例如對致效細胞之活性、溶解、補體-調節的活性、抗 體清除率、及抗體半生期。 本文術語之"致效劑分子"意指能結合至抗體（例如 IgG抗體）Fc區域之分子包括（但非限於）補體蛋白或 Fc受體。

本文術語之"致效細胞"意指能結合至抗體（例如IgG -25- 1374893 抗體）Fc部份（典型地經致效細胞表面表現的Fc受體） 之細胞，包括（但非限於）淋巴細胞例如抗原呈現細胞以 及T細胞。 本文術語之"Fe區域"意指IgG抗體的C-端區域，特 定言之爲該IgG抗體重鏈之C_端區域。雖然IgG重鏈Fc 區域的邊界可稍微地變化，典型地Fc區域是定義成IGg 重鏈之胺基酸殘基Cys2 26至羧基端。.

本文術語之"Kabat編號"除非另行說明，是定義成使 用 EU 指數（參見 Kabat et al. : Sequences of Proteins of

Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. ( 1991)，全 文在此倂入參考文獻），對IgG重鏈抗體的殘基編號。 本文術語之"Fc受體”或"FcR"意指結合至抗體Fc區域 之受體。結合至抗體（例如IgG抗體）Fc區域之代表性 的Fc受體包括（但非限於）FcyRI、FcyRII、及FcyRIII 次級受體，包括對偶基因的變型以及此類受體替代接合的 形式。Fc受體之回顧可參見 Ravetch and Kinet, Annu.

Rev. Immunol 9 ： 45 7-92 ( 1 99 1 ) ; Capel et al·，

Immunomethods 4 ： 25-3 4 ( 1 994 );以及 de Haas et al ‘， J. Lab. Clin. Med. 126 ： 330-4 1 ( 1 995 )。 I.免疫及治療劑 本發明的免疫及治療劑包含或由在此定義之免疫原或 抗體、或其功能的或抗原結合片段組成。基本的抗體構造 -26- 1374893 單位是習知的包含次單體之四合體。各四合體由二對 的多胜鍵組成，各對具有一個"輕"（約25 kDa)以及 "重"鏈（約50-70 kDa)。各鏈的胺基端部份包括約 至110或更多個胺基酸之變異區，其可辨視抗原。各 羧基端部份爲恆定區，其具有致效劑功能。 輕鏈可分成/c或A，長度約爲230個殘基。重鏈 成T、宾、α、δ、或ε，長度約爲450-6 00個殘基 體之同功型可分別定義成IgG、IgM、Ig A、Ig D以 E。重及輕鏈可摺疊成結構區。本文術語之"結構區" 蛋白質的球狀區域，例如免疫球蛋白或抗體。免疫球 或抗體結構區包括例如3或四個經yS-平板穩定的肽 及鏈間之雙硫鍵。完整的輕鏈具有例如二個結構區 以及CL)以及完整的重鏈具有例如四或五個結構區 、CH1、CH2、及 CH3 )。 輕鏈及重鏈內，可變及恆定區用大約12個或更 胺基酸之"J"區域相聯，重鏈亦包括約多10個胺基 "D"區域。參閱 Fundamental Immunology ( Paul，W.， 2nd ed. Raven Press，Ν·Υ· ( 1 989 )，Ch. 7，全文在此 參考文獻。 各輕/重鏈對之變異區可形成抗體結合部位。因 完整的抗體具有二個結合部位。除了雙功能或雙專一 體之外’此二結合部位均相同。所有鏈均展現具有相 恆之架構區域（FR)的一般結構並聯結著三個高變異 亦稱爲互補性決定區域或CDR)。天然的鏈或重組製 相同 -個 100 鏈的 可分 ，抗 及Ig 意指 蛋白 環以 (VL (VH 多個 酸之 e d ·， 并入 此， 的抗 對守 區（ 作的 -27- 1374893 鏈可與前導序列一起表現，經細胞的加工作用移除前導序 列後可產生成熟的鏈。亦可用非天然前導序列重組的製 作成熟的鏈，以增進分泌或改變特定鏈的加工。

經架構區域校準之各對來自二個鏈的CDR，可結合至 專一性的抗原決定部位。從N-端至C-端，此輕及重鏈包 含 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 以及 FR4 結構 區。在此技藝中"FR4"亦稱爲可變的重鏈之D/J區域以及 可變的輕鏈之J區域。各結構區胺基酸的編號係依據 K a b a t 之定義（S e q u e n c e s o f P r 〇 t e i n s o f I m m u η ο 1 o g i c a 1 Interest > National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1 98 7 and 199)。另一定義構造的方法可參見Chothia et al., J. Mol. Biol. 196 ： 90 1 ( 1 987 ) ； Nature 342 ： 878 ( 1989) ; and J. Mol. Biol. 186: 651 ( 1989)(以下統稱 "Chothia et al."以及全文在此并入參考文獻）。 A. A|3抗體 本發明治療劑包括專一結合至A/3或澱粉狀蛋白斑之 其它成份的抗體。較佳的抗體是單株抗體。一些該抗體可 專一的結合至AyS的聚集形式而不會結合至可溶解的形式 。一些該抗體可專一的結合至可溶解的形式而不會結合至 聚集的形式。一些該抗體可結合至聚集的以及可溶解的形 式。用於治療方法的抗體，較佳者具有完整的垣定區或至 少可與Fc受體交互作用之充分的恆定區。較佳的抗體可 有效的刺激經Fc-調節的蛋白斑中ΑΘ之吞嗤作用。人類 -28- 1374893 同功型IgGl是較佳的，因爲它是與吞噬細胞（例如位於 腦部之巨噬細胞或微神經膠質細胞）的FcRI受體具有最 高親和力的人類同功型抗體。人類的IgGl相當於鼠科動 物的IgG2a，如此後者係適用於在老年痴呆症的動物（例 如小鼠）模式中測試活體內功效。亦可用雙專一的Fab片 段，其中抗體的一臂具有A/3的專一性，以及另一臂具有 Fc受體的專一性。較佳的抗體結合至的結合親和力大 於（或等於）1、10、108、109、或l〇1Q M·1 (包括此類 數値中間値的親和力）。

AyS內單株抗體結合的專一性抗原決定部位可爲構形 的或非構形的抗原決定部位。可使用導入外來基因的動物 模式程序（描述於實施例）測試抗體的預防性及治療性功 效。較佳的單株抗體結合至AyS內殘基1-10的抗原決定 部位（天然A/3 N-端的第一個殘基指定爲1)，更佳者結 合至ΑΘ內殘基3-7的抗原決定部位。在一些方法中，可 使用對不同抗原決定部位具結合專一性的多重單株抗體， 例如共投用對A /3內殘基3 - 7的抗原決定部位具有專一性 的抗體及對A/3內殘基3-7的抗原決定部位之外具有專一 性的抗體。該抗體可連續地或同時的投用。亦可用對抗A 冷澱粉狀蛋白成份以外之抗體（例如投用或共同投用）。 可用例如形成噬菌體顯示基因庫（其中不同成員顯示 不同A /3次序列），測定抗體對抗原決定部位之專一性。 然後選擇噬菌體顯示基因庫中與測試抗體專一結合的成員 。分離該序列之家族。典型地，該家族含有共同的核心序 -29- 1374893 列，以及不同成員有不同長度的鄰接序列。顯示能專一結 合至抗體之最短的核心序列即定義爲抗體抗結合的原決定 部位。抗體亦可用已測定過抗原決定部位專一性的抗體經 由競爭測定測試抗原決定部位之專一性。例如，與1 2 A 1 1 抗體競爭結合A/3的抗體，可結合至與12A11相同或相似 的抗原決定部位（即ΑΘ之殘基3-7)。篩選抗體的抗原 決定部位專一性可用於預測治療的功效。例如經測定可結 合至A月殘基1-7的抗原決定部位之抗體，可有效的依據 本發明方法預防及治療阿茲海默氏症。 專一結合至A/3較佳片斷而不結合A/3其它區域的抗 體，相對於結合至其它區域的單株抗體或結合至完整A冷 的多株血清有許多優點。第一，在相等質量劑量下，專一 結合至較佳的片段的抗體之劑量含有可有效的清除澱粉狀 蛋白斑的較高抗體莫耳濃度劑量。第二，專一結合至較佳 片段的抗體可誘發清除反應對抗澱粉狀蛋白沈澱物而不會 誘發清除反應對抗完整的APP多肽，從而降低可能產生的 副作用》 1 .產生非人類抗體 本發明的特色是非人類抗體，例如對本發明較佳的 Αβ抗原決定部位具有專一性的抗體。該抗體可用於調製 本發明的各種治療組成物，較佳者提供互補性決定區域以 產生人類化的或嵌合型的抗體（詳細描述於下）。用Α冷 對動物進行免疫可產生非人類單株抗體，例如：鼠科動物 -30- 1374893 、天竺鼠、靈長類動物、兔子或大白鼠。亦可用包含A冷 或A yS產生免疫性的片段之較長的多肽或抗A Θ抗體特異 型的抗體。參閱上述Harlow & Lane supra之參考文獻， 全文在此并入參考文獻。該抗原可得自天然的來源、肽合 成或重組表現。該抗原視需要可與運載蛋白融合或複合後 投用（敘述如下）。視需要該抗原可與佐劑投用。本文術 語之"佐劑"意指當與抗原併用後可增加抗原之免疫反應的 化合物，但當投用單獨時則不會對抗原產生免疫反應。 佐劑可增加數個機制之免疫反應，包括徵募淋巴細胞、刺 激B及/或T細胞、以及刺激巨噬細胞。可使用下述許多 類型之佐劑。免疫實驗動物宜使用完全的Freund's佐劑接 著使用不完全的佐劑。 一般係用兔子或天竺鼠製作多株的抗體。製備多株的 抗體用於例如被動性的保護作用，其進行方法如下。將 125隻非導入外來基因的老鼠用100微克A冷1-42、加上 CFA/IF A佐劑進行免疫反應，以及在4-5個月後安樂死 。收集免疫小鼠的血液。從血液中分離IgG。用親和層析 法局部地純化具有抗原專一性的抗體。每隻小鼠平均得到 約0.5-1毫克之抗原專一性的抗體，總共得到60-120毫克 〇 一般用小鼠製作單株抗體。對小鼠注射A肽片段或較 長的形式、製備融合瘤以及篩選產生可專一結合至AyS的 抗體之融合瘤可製備對抗A肽片段之單株的抗體。可視需 要篩選結合至A/3專一的區域或所要求的片段，而不結合 -31 - 1374893 至其它A0非重疊片段之抗體。後一篩選可經決定抗體對 A冷狀刪除突變體集合之結合以及決定結合至抗體的刪除 突變體而加以完成。結合可用例如西方轉漬法或ELISA加 以評估。顯示專一的結合至抗體的最小片段即可定義抗體 之抗原決定部位。此外，抗原決定部位的專一性可經競爭 測定（測試及參考抗體競爭對A /3之結合）加以測定。若 測試以及參考抗體可相互競爭，則彼可結合至相同的抗原 決定部位或近到結合一個抗體可干擾其他抗體結合之抗原 決定部位。該抗體較佳的同功型是小鼠同功型IgG 2a或 其它物種相當的同功型。小鼠同功型IgG 2A相當於人類 同功型IgG 1 (例如人類IgG 1 )。 2.嵌合以及人類化的抗體 本發明的特色亦是yS澱粉樣蛋白肽專一的嵌合型及/ 或人類化的抗體（即嵌合型及/或人類化免疫球蛋白）。 嵌合型及/或人類化的抗體與提供起始材料構築嵌合型或 人類化抗體的小鼠或其它非人類抗體具有相同或相似的結 合專一性及親和力。 a.產生嵌合的抗體 本文術語之"嵌合的抗體”意指經遺傳工程從不同物種 之免疫球蛋白基因片段構築輕及重鏈基因之抗體。例如鼠 單株抗體的可變（V)片段基因可爲相聯至人類例如IgGi 以及IgG4的恒定的（C)片段。較佳者爲人類同功型 -32- 1374893

IgGl。如此有代表性的嵌合型抗體爲雜種蛋白質，其係由 小鼠抗體之V或抗原結合結構區以及人類抗體之c或致效 劑結構區組成。 b.產生人類化的抗體 本文術語之"人類化的抗體”意指包含至少一個包含實 質上來自人類抗體（稱爲受體免疫球蛋白或抗體）鏈變異 區架構殘基的鏈以及至少一個來自小鼠抗體（稱爲供體免 疫球蛋白或抗體）實質上之互補性決定區域的抗體。參閱 ，Queen et al., P r o c. Natl. Acad. Sci. USA 86 ： 1 0029-1 0033 ( 1 989 ) ' US 5,530,1 0 1 ' US 5,5 85,089 ' US 5,693,76 1 ' US 5,693,762 ' Selick et al.、WO 90/0786 1、 及Winter，US 5,225,539 (全文在此并入參考文獻）。恆 定區（若有的話）亦實質上或完全地來自人類免疫球蛋白 〇 若人類的可變結構區架構與小鼠可變的架構（原本的 CDRs )有相同或相似的構形，則將小鼠CDRs取代成人類 可變的結構區架構最可能保留正確的空間定向。經由得到 人類抗體可變的結構區，其架構序列與鼠科動物原本 CDRs之可變的架構結構區展現高度之序列相似性，可加 以達成。重及輕鏈可變的架構區域可源自相同或不同的人 類抗體序列。人類抗體序列可爲天然人類抗體序列或可爲 許多人類抗體的共識性序列。參閱Kettleborough et al·， Protein Engineering 4 ： 773 ( 1 99 1 ) ； Kolbinger et al·, -33- 1374893

Protein Engineering 6 : 97 1 ( 1 993 )以及 Carter et WO 92/22653。 確認鼠科動物供體免疫球蛋白及適當的人類受體 球蛋白之互補性決定區域後，下一步驟是測定是否此 份中有任何殘基應經取代以最適化產生的人類化抗體 質。一般而言，用人類胺基酸殘基取代鼠科動物胺基 基應能將副作用減至最低，因爲引入鼠科動物殘基會 抗體之風險，引起人類之人類-抗-小鼠-抗體（HAMA 應。進行決定免疫反應之技藝確認方法爲監視特定病 於臨床試驗期間的HAMA反應。投用人類化抗體的病 在該治療開始時及治療期間進行產生免疫性評估。測 患血清樣品之HAMA反應（例如偵測抗人類化的治療 體），係使用在此技藝中習知的方法，包括表面電漿 技藝（BIAC ORE)及/或固相 ELISA分析。 可基於某些人類變異區架構殘基之胺基酸可能對 構形及/或結合至抗原的影響，選擇彼進行取代。非 的倂列鼠科動物CDR區域與人類的可變架構區域可 非天然的構形限制，除非經某些胺基酸殘基取代的校 則會導致結合親和力流失。 取代胺基酸殘基之選擇係用電腦模式（部份地） 測定。在此將描述產生免疫球蛋白分子三度空間影像 腦硬體及軟體。一般而言，製作分子模式是從免疫球 鏈或其結構區解析的構造開始。將要進行模式化的鏈 解析之三維結構的鏈或結構區，進行胺基酸序列相似 al., 免疫 類成 的性 酸殘 增加 )反 患或 人可 量病 劑抗 共振 CDR 天然 產生 正否 加以 之電 蛋白 與已 性比 -34- 1374893 較，以及選擇顯示最大測試序列相似性之鏈或結構區作爲 構築分子模式的起點。選擇至少5 0 %序列相似性，以及較 佳者係選擇至少6 0 %、7 0 %、8 0 %、9 0 %序列相似性或9 0 % 以上之鏈或結構區進行模式化。解析的起始構造經修飾後 可允許與免疫球蛋白鏈或結構區，以及與起始結構中有實 際差異的胺基酸被模式化。然後將經修飾之構造組裝成免 疫球蛋白組合物。最後’用能量最小化以及證實所有原子 相互地位於適當的距離之內以及鍵長及角度位於化學可 接受的限制之內加以精煉模式。 選擇取代之胺基酸殘基’亦可經檢驗特定位置胺基酸 之特性，或以經驗觀察取代或誘變特定胺基酸的效應加以 測定（部份地）。例如’當鼠科動物變異區架構殘基與選 擇的人類變異區架構殘基胺基酸不同時，通常人類架構胺 基酸應經小鼠抗合理預測之相等的體架構胺基酸取代： (1)直接經非共價鍵結合抗原的胺基酸， (2 )相鄰CDR區域的胺基酸， (3 )與C DR區域交互作用（例如經電腦模式測定在 CDR區域內約3-6A)之其它胺基酸，或 (4)參與VL-VH界面的胺基酸。 "直接經非共價鍵結合抗原”的殘基包括在架構區域位 置之胺基酸’其有良好的機率直接與位於抗原上的胺基酸 以已知的化學力（例如：氫鍵、凡得瓦爾力、忌水性交互 作用等）交互作用。 CDR以及架構區域定義於上述之Rabat et al.或 -35- 1374893

Chothia etal·。當架構殘基（定義於上述Kabat et al.)構 成構造的環形殘基（定義於上述之Chothia et al.)，可選 擇存在於小鼠抗體之胺基酸對人類化的抗體進行取代。”

相鄰CDR區域的"殘基包括位置立即相鄰人類化免疫球蛋 白鏈一級序列之一個或多個CDR的胺基酸殘基，例如位 置立即相鄰至CDR(定義如Kabat)，或CDR(定義如 Chothia)的殘基（參閱例如 Chothia and Lesk JMB 196: 901 ( 1987))。此類胺基酸尤其是可能與CDR之胺基酸 交互作用，並可扭曲供體CDR及降低親和力（若其係選 自受體）。此外，相鄰的胺基酸可直接的與抗原交互作用 (Amit et al·, Science, 233 : 7 4 7 ( 1986)，全文在此倂入 參考文獻）以及從供體選擇此類胺基酸可令人滿意的保持 所有在原始的抗體中提供親和力的抗原接觸點。 ”其它與CDR區域交互作用"的殘基包括那些經二級結 構分析測定顯示空間性的定向足以影響CDR區域的殘基 。具體實施例之一中，"其它與CDR區域交互作用"的殘基 係經供體免疫球蛋白三度空間模式（例如電腦產生之模式 )分析加以確認。三度空間模式（典型之原始的供體抗體 )顯示CDR外面之某些胺基酸緊鄰CDRs，具有良好的或 然率經氫鍵、凡得瓦爾力、忌水性交互作用等與CDR胺 基酸交互作用。在那些胺基酸位置上，可選擇供體免疫球 蛋白的胺基酸（而不是受體免疫球蛋白的胺基酸）。依據 此標準之胺基酸一般而言具有之側鏈原子與CDR內之一 些原子相鉅約爲3埃單位（A)之內且必須含有可依據已 -36- 1374893 知的化學力（例如上述）可與CDR原子交互作用之原子 〇 當原子可形成氫鍵時，其原子核之間相距3A，但原 子不形成一種鍵結時，其凡得瓦爾表面之間相距3A。因 此，在後者之實例中原子核必須相距約6A之內（3A加上 凡得瓦爾半徑之總和）才可考慮原子能交互作用。在許多 案例中原子核將相距4或5至6A。在決定胺基酸是否可 與CDR交互作用時，不宜考慮CDR部份之重鏈CDR 2的 最後8個胺基酸，因爲基於結構之觀點，此8個胺基酸更 像是架構的部份。 能與CDR胺基酸交互作用之胺基酸，可用另一方法 確認。各架構胺基酸溶劑可接近的表面積可用二種方法計 算：（1)完整的抗體，以及（2)假設的分子其係由移除 CDR的抗體組成。此類數目之間顯著的差別約爲10埃平 方或更多，顯示架構胺基酸接近溶劑至少部份被CDR阻 塞，因此該胺基酸係與CDR接觸。胺基酸之溶劑可接近 的表面積，可基於抗體三度空間之模式使用技藝上已知的 算貝IJ (例如 Connolly, J. Appl. Cryst. 16: 548 ( 1983)以 及 Lee and Richards, J. Mol. Biol. 5 5 : 3 79 ( 1 97 1 ) ’ 全 文在此倂入參考文獻）加以計算。架構胺基酸亦可偶而與 CDR間接作用，其係經影響另一架構胺基酸之構形而接觸 到 CDR。 許多抗體中，已知架構上許多位置之胺基酸是決定 CDR 構形之重要胺基酸（Chothia and Lesk，supra， -37- 1374893

Chothia et al., supra 以及 T ramontano et a 1., J. Mol. Biol. 215: 175 ( 1 99 0)，全文在此倂入參考文獻）。經分析許 多已知抗體的構造，此類作者確認CDR構形上重要的保 守構架殘基。基於CDR構形，抗體分析找到有限數目之 構造的或"規範的"殘基。規範分類的保守構架殘基稱爲" 規範的"殘基。規範的殘基包含：輕鏈殘基25、29、30、 33、48、64、71、90、94 以及 95 以及重鏈殘基 24、26、 29、34、54、55、71以及94。其他的殘基（例如，決定 CDR 構造之殘基 1)可依據 Martin and Thorton ( 1996) J. Mot. Biol. 263 : 800之方法確認。注意，已知輕鏈位置2 、48、64及71以及重鏈26-30、71以及94(依據 Kabat 編號）的胺基酸爲能與許多抗體之CDR交互作用。在輕 鏈之位置35以及重鏈93及103之胺基酸亦可能與CDR 交互作用。形成CDR構形之其他殘基，可依據Foote and Winter ( 1992) J. Mol. Biol. 224: 487 之方法確認。該殘 基稱爲"游標尺"殘基且是在構架區之內緊接CDR的下方的 殘基（即形成CDR的平台）。在所有此類編號的位置， 當供體胺基酸與受體胺基酸彼此不同時，人類化免疫球蛋 白宜選擇供體胺基酸（而不是受體胺基酸）。另一方面， 某些殘基能與CDR區域交互作用，例如有時可選擇受體 免疫球蛋白輕鏈之前5個胺基酸而不喪失人類化免疫球蛋 白之親和力。 ”參與VL-VH界面”之殘基或”裝塡殘基”包括介於VL 及 VH界面間之殘基，定義於例如Novotny and Haber, -38- 1374893

Pr〇c.Natl. Acad. Sci· USA, 82 : 4592-66 ( 1 985 )或上述 之Chothia et al» —般而言，人類化的抗體中應保有獨特 的裝塡殘基（若彼與人類架構殘基不同）。 一般而言，符合上述標準之一個或多個胺基酸已被取 代。在某些具體實施例中，所有或大部份符合上述標準之 胺基酸已被取代。偶而，特定的胺基酸是否符合上述標準 仍有一些模糊，所以製作另一變型免疫球蛋白時有的帶有 特定的取代，其他的則否。 如此製作之另一變型免疫球蛋白，可用在此描述之任 何測定測試所要求的活性，以及選擇較佳的免疫球蛋白。 通常人類化抗體的CDR區域實質上相同，更常見的 是與供體抗體對應的CDR區域相同。然而，在某些具體 實施例中，爲修改一個或更多個CDR區域以修改抗體抗 原結合之專一性及/或減少抗體產生之令人滿意的免疫性 。典型地’是改變一個或多個CDR之殘基以修改結合達 成更佳之結合率’更佳之離開率，或兩者，以達成理想的 結合常數。使用此策略可使抗體達成超高結合親和力，例 如1 01° Μ'1或更多。簡言之，供體CDR序列是稱爲基本 序列然後從此改變一個或多個殘基。親和力成熟技藝，如 描述於此’可用以改變CDR區域，接著篩選結合產生所 要求的改變之結合分子。此方法亦可爲用以改變供體CDR ’典型小鼠CD R ’產生較少的產生免疫性，因此將可能的 人類抗-小鼠抗體（HAMA )反應減至最低或加以避免。據 此改變CDR ’可監測改變結合親和力與產生免疫性以及達 -39- 1374893 成優選之合倂最佳結合性以及最低產生免疫性的抗體（參 閱例如美國專利第 6.656.467號以及美國專利公告 US20020 1 64326A1 )。 在另一方法中，分析抗體之CDR區域，經系統性的 取代人類相對部份之各供體CDR測定各個別地CDR對抗 體結合及/或產生免疫性之貢獻。產生人類化抗體的板面 ’然後對各CDR之抗原親和力和可能的產生免疫性計分 。在此方法中，測定候選結合分子二種重要的臨床性質， 即抗原結合以及低產生免疫性。若可得到病人對抗對應的 鼠科動物或CDR-接枝形成之（人類化的）抗體的血清， 則可篩選代表全身性的人類CDR交換之全部抗體板面， 測定病人對抗各供體CDR特異型的反應（技藝的細節可 參閱例如，Iwa shi et al_ Mbl.Imunol. 36: 1079-91 ( 1999 ))。該解決方式可從非必需的供體CDRs確認必需的供 體CDR區域。然後非必要的供體CDR區域可和人類相對 之CDR交換。當必需的CDR區域因交換而會產生不可接 受的功能流失時，可進行例如，位點誘變鑑定專一性之殘 基（SDRs )。然後在此方法中CDR可重新構建僅保持 SDRs以及在CDR殘留之位置中僅保留人類及/或最小的產 生免疫性的胺基酸。該方法中僅接枝部分之供體CDR，亦 簡稱爲CDR-接枝（前述技藝的細節可參閱例如Tamura el al.. J. of Immunology 1 64 ( 3 ) : 1 432-4 1，（ 2000 ): Gonzales et al.Mol.Irnmmnol 40 : 3 3 7-349 ( 2003 ): Kashmiri et al., Crii. Rev. Oncnl. Hematol.38 ： 3-16 ( -40- 1374893 2 0 0 1 );以及 De Pascalis et.al.J.of immunogy 169 ( 6) 3076-84. ( 2002 ))。 此外，有時可能用一個或多個保留性胺基酸取代CDR 殘基而不影響產生的人類化免疫球蛋白之結合親和力。保 留性取代預期的組合例如爲gly，ala; val，ile, leu; asp， glu; asn, gin ； ser, thr ； lys, arg ；以及 phe, tyro 額外的取代候選者爲人類免疫球蛋白在此位置獨特的 或"稀少的"人類受體架構胺基酸。此類胺基酸可經小鼠供 體抗體相等位置之胺基酸或經更有代表性的人類免疫球蛋 白相等位置之胺基酸取代。例如，當人類受體免疫球蛋白 架構區域此位置之胺基酸是稀有的胺基酸以及供體免疫球 蛋白對應的胺基酸與此位置之人類免疫球蛋白序列相同時 則適宜進行此取代；或當此位置之受體免疫球蛋白之胺基 酸以及供體免疫球蛋白對應的胺基酸相對的至其它人類序 列亦爲稀有的胺基酸時則適宜進行此取代。當是稀有的殘 基時，當選擇供體CDR構形殘基進行返回突變，亦可考 慮人類受體構架序列殘基。例如，若返回突變導致受體人 類構架序列稀有殘基之代替，可測試人源化抗體是否具有 活性。若返回突變不是活度所必須，則可去除以減低產生 免疫性。例如，可在下列受體人類構架序列稀有的殘基引 入返回突變；uk= v2 ( 2.0%) ' L3 ( 0.4%) 、T7 ( 1.8%) ' Q18 ( 0.2% ) 、L83 ( 1.2%) 、185 ( 2.9%) 、Α100 ( 0.3%)以及 L106 ( 1.1%);以及 vh = T3 ( 2.0%) 、Κ5 ( 1.8%) ' II 1 ( 0.2%) 、S23 ( 1.5%) > F24 ( 1.5%) 、S41 -41 - 1374893 (2.3%) > K71 ( 2.4% ) ' R 7 5 ( 1.4%) 、182 ( 1.4%)、 D83 ( 2.2%)以及L109 ( 0.8%)。此類標準可輔助確保人 類架構中非典型的胺基酸不會破壞抗體結構。此外，經有 代表性的人類抗體之供體抗體胺基酸取代獨特的人類受體 胺基酸，可製作降低產生免疫性之人類化抗體。 本文術語之”稀有的"，意指發生在代表樣本序列此位 置之胺基酸少於約2 0 %，較佳者少於約1 0 %，更佳者少於 約5%，甚至更佳者少於約3%，甚至更佳者少於約2%以 及甚至更佳者少於約1 %，以及本文術語之"一般的"意指 發生在代表樣本序列此位置之胺基酸大於約25%但通常大 於約50%。例如當決定人類受體序列之胺基酸是否是"稀 有的”或” 一般的"胺基酸時，宜僅考慮人類變異區序列以 及當決定小鼠胺基酸是否是”稀有的"或"一般的"胺基酸時 ，宜僅考慮小鼠變異區序列。此外’所有人類之輕及重鏈 變異區序列可分別區分成序列"亞類”，其係相互同源以及 在某些關鍵性的位置具有相同胺基酸（上述之Kabat et al_ )。當在人類序列之中決定人類受體序列胺基酸是否爲” 稀少的，，或”共同的”胺基酸時’經常宜僅考慮受體序列中 相同亞類之人類序列。 額外的取代候選者是人類受體架構胺基酸’其爲上述 Chothia et al.定義確認之CDR區域的一部份。額外的取 代候選者是人類受體架構胺基酸’其爲以AbM及/或接觸 之定義確認的CDR區域之一部份。 額外的取代候選者爲受體架構殘基’其係相應於稀有 -42- 1374893 的或獨特的供體架構殘基。稀有的或獨特的供體架構 爲鼠科動物抗體此位置稀有的或獨特的（本文之定義 鼠科動物抗體中，亞類之測定可依據Kabat及確認不 識性之殘基位置。此類供體特定的差異可爲增進鼠科 序列活性的軀體突變點。保留預測可影響結合的獨特 (例如包裝規範及/或游標殘基），而預測爲不重要 合殘基可經取代。在1 2 A 11 vh序列之內稀有的殘基 185 ( 3.6%)。在12A1 1 vh序列之內稀有的殘基包含 1.0% ) ' 11 1 ( 1.7%) > L 1 2 ( 1.7%) 、S 4 1 ( 2.8 % D 8 3 ( 1 · 8 % )以及 A 8 5 ( 1 . 8 % )。 額外的取代候選者爲發生在受體架構區域之非種 基。例如，當受體抗體鏈（即與供體抗體鏈分享顯著 列相似性之人類抗體鏈）校整至種系抗體鏈（同樣地 體鏈分享顯著的序列相似性）時，受體鏈架構與種系 構之間不配對之殘基可經種系序列對應的殘基取代。 除了以上討論的特定胺基酸取代之外，人類化免 蛋白架構區域通在常實質上相同，以及更通常的是與 自之人類抗體架構區域相同。當然了，許多架構區域 基酸對抗體之專一性或親和力少有或沒有直接地貢獻 此，許多架構殘基個別地保留性取代是可耐受而未可 改變產生的人類化免疫球蛋白的專一性或親和力。因 在具體實施例之一中人類化免疫球蛋白可變的架構區 人類可變的架構區域序列或該序列之共識性序列共享 8 5 %之序列相似性。在另一具體實施例中，人類化免 殘基 )。 同共 動物 殘基 的結 包含 T3 ( 系殘 的序 與供 鏈架 疫球 彼源 之胺 。因 觀的 此， 域與 至少 疫球 -43- 1374893 蛋白可變的架構區域與人類可變的架構區域序列或該序列 之共識性序列共享至少90%、較佳者95%、更佳者96%、 97%、98%或99%之序列相似性。然而一般而言該取代是 不必要的。 在典型的具體實施例中，人類化的抗體較佳者展現與 抗原專一的結合親和力至少爲107、108、109或 。在其它具體實施例中，本發明抗體之結合親和力至少爲 10|()、1011或ΙΟ^ΝΓ1。通常人類化的抗體與抗原結合親和 力之上限在供體免疫球蛋白的三、四或五倍之內。通常結 合親和力之下限亦在供體免疫球蛋白的三、四或五倍之內 。此外，其結合親和力與無取代的人類化抗體（例如具有 供體CDR及受體FR，但無FR取代之抗體）相似。在該 實例中，選定的抗體（經取代）之結合宜比未經取代的抗 體至少大二至三倍，或大三至四倍。比對時，可測定各種 抗體之活性，例如經BIACORE (即用未標記的試劑進行 表面電漿共振）或競爭性的結合測定。 c.產生人類化的12Α1 1抗體 本發明較佳的具體實施例的特色是以對抗A (L)N-端 的人類化抗體，特定言之，應用在此描述的方法進行治療 及/或診斷。產生人類化的抗體尤佳的起始材料爲單株抗 體12A11。12A11具有ΑβΝ-端之專一性以及（I)具有高 抗體親抗原性可聚集ΑβΙ-42，（2)具有能力捕獲可溶解 的Αβ ’以及（3 )中介澱粉樣溶菌斑之吞噬作用（例如誘 -44- 1374893 發吞噬作用）（參閱實施例I ) 。12A1 1抗體在活體內之 效用描述於實施例II。編碼12A 11抗體重及輕鏈變異區之 選殖及cDNA定序描述於實施例III。 經電腦比對小鼠變異區胺基酸序列與習知的人類抗體 序列確認適當的人類受體抗體序列。分別地進行重及輕鏈 之比對，但原理相似。特定言之，經使用NCBI BLAST ( 經 National Institutes of Health NCBI 網際網路伺服器公 開存取）以各鼠科動物架構序列詢問Kabat資料庫或免疫 球蛋白G蛋白質序列資料庫以確認人類抗體其架構序列與 鼠科動物VL及VH架構區域展現高度序列相似性之可變 的結構區。具體實施例之一中，選擇與鼠科動物供體序列 共享大於50%序列相似性之受體序列，例如受體構架（FR )序歹！J。較佳者，選擇共享 60%、65%、70%、75%、80% 、8 5%、90%、9 5%序列相似性或以上之受體抗體序列。 電腦比較12A11後顯示，12A11輕鏈（小鼠亞類II) 與人類輕鏈次型/c II呈現最大的序列相似，而1 2A 1 1重鏈 (小鼠亞類lb )與人類重鏈次型II呈現最大的序列（如 上述之Kabat etal.定義）相似。人類架構區域之輕及重鏈 可源自此類次型，或該次型共識性序列之人類抗體。在人 源化的第一個努力中，輕鏈可變的構架區是源自人類第Π 亞類之抗體。基於以前達成人類化抗體（具有源自人類第 II亞類之抗體重鏈可變的構架區）高表現量的實驗’發現 該抗體之表現量有時很低。據此，基於描述於Saidanha et al. ( 1991) Mol Immuol.36 : 709-19 之推理，是選擇人類 -45- 1374893 亞類III構架區抗體而不是人類亞類π構架區抗體。 人類亞類 π抗體 Κ64 ( AIMS4 )(寄存編號 BAC0 1 733 )是確認自NCBI非多餘的資料庫，與12Α1 1 輕鏈變異區具有顯著的序列相似性。人類亞類III抗體 Μ72 (寄存編號ΑΑΑ697 34 )是確認自NCBI非多餘的資 料庫，與12Α11重鏈變異區具有顯著的序列相似性。（亦 可參閱 Schroeder and Wang ( 1 9 9 0 ) Proc· Natl. Acad. Sci. U.S.A. S72 : 6 1 46-6 1 50 )。

其他輕鏈受體序列包括，例如：PDB寄存編號1 KP A (gi2 4 1 5 8 7 82 ) 、PDB 寄存編號 1 ΚΕΑ ( gi24 1 5 8 784 )、 EMBL 寄存編號 CAE75 5 74.1 ( gi3 8 5 225 8 7 ) 、EMBL 寄存 編號 CAE755 7 5.1 ( gi3 8 5 225 90 ) 、EMBL 寄存編號 CAL84952.1 ( g i 3 9 8 3 8 8 9 1 ) 、D J B 寄存編號 B A C 0 1 7 3 4.1 (gi21669419) 、DJB 寄存編號 BAC01730.1 (gi21669411 )、PIR 寄存編號 S40312 (gi481978 ) 、EMBL 寄存編 號 CAA5I 090.1 ( gi3 9 80 1 1 8 ) 、GenBank 寄存編號 AAH63 599.1 ( gi39794308 ) 、PIR 寄存編號 S22902 (

gil 06540 ) 、PIR 寄存編號 S4261 1 (gi631215) 、EMBL 寄存編號 CAA 3 80 72.1 ( gi43 3 8 90 ) ' GenBank 寄存編號 AAD008S6.1 ( gi4 1 00384 ) 、E Μ B L 寄存編號 C A A3 9 0 7 2 · 1 (gi34000 ) 、PIR 寄存編號 S23230 ( gi2 8425 6 ) 、DBJ 寄 存編號 BAC0 1 729.1 ( gi2 1 669 i 49 ) 、DBJ 寄存編號 BACOI 729.1 ( gill 669409 ) 、DBJ 寄存編號 BACOI 562.1 (gi2 1 669075 ) 、 EMBL 寄存編號 CAA8 5 5 90.1 ( -46- 1374893 gi 5 8 73 1，8 ) 、 GenBank 寄存編號 AAQ99243.1 ( gi3 7694665 ) 'GenBank 寄存編號 AAK948 1 1.1 ( gi 1 8025604 ) 、EMBL 寄存編號 CAB5 1 297.1 ( gi5578794 )、DBJ 寄存編號 BACOI 740 1 (t.i2 1 66943 1 )、以及 〇8〗寄存編號8八(：01733.1 (8丨21669417)。其他重鏈受體 序列包括，例如：GenBank寄存編號 AAB 35009.1 ( gi 1 04 1 885 ) 、DBJ 寄存編號 BACOI 904.1 ( gi2 1 669789 )、

GenBank 寄存編號 AAD5 3 8 1 6.1 ( gi5 834 1 00 ) 、GenBank

寄存編號 AAS 860 8 1.1 ( gi4625422 3 ) 、DBJ 寄存編號 BAC0 1 462.1 ( gi2 1 66 8 8 70 ) 、 GenBank 寄存編號 AAC18191.1 ( gi 3 1 70 773 ) 、DBJ 寄存編號 BAC02266.1 ( gill 6705 1 3 ) 、G e η B an k 寄存編號 A A D 5 6 2 5 4.1 ( gi 5 92 1 5 89 ) 、GenBank 寄存編號 AAD5 3 807.1 ( gi5 834082 )、DBJ 寄存編號 BACO2260.1 ( gi2 1 67050 1 ) 、GenBank 寄存編號 AAC 18166.1 (gi3170723) 、EMBL 寄存編號 C AA49495.1 ( gi3 3 0 8 5 ) 、PIR 寄存編號 531513 ( gi3 45 903 ) 、GenBank 寄存編號 AASS6079.1 ( gi462542 1 9 )、DBJ 寄存編號 BACOI 917.1 (gi2 1 6698 1 5 ) 、DBJ 寄 存編號 BACOI 9 1 2.1 ( gi2 1 669 805 ) 、GenBank 寄存編號 AAC 1 82 8 3.1 (gi3 1 7096 1 ) 、DBJ 寄存編號 BACOI 903 ( gi2 1 669787 ) 、DBJ 寄存編號 BACOI 88 7.1 (gi21 669755 )、DBJ 寄存編號 BAC0225 9.1 ( gig 1 370499 ) ' DBJ 寄 存編號 BAC01913.1 ( gi2 1 669807 ) 、DBJ 寄存編號 BAC01910.1 (gi2 1 66980 1 ) 、DJB 寄存編號 BAC02267.1 -47- 1374893 (gi2 1 6705 1 5 ) 、GenBank 寄存編號 AAC 1 8 3 06.1 ( gi3171011) 、GenBank 寄存編號 AAD53 8 1 7.1 (gi5 834 1 02 )、PIR 寄存編號 E36005 (gil06423) 、EMBL 寄存編號 CAB3 7 1 29.1 ( gi4456494 )、以及 GenBank 寄存編號 AAA68892.1 ( gil861 90 )。 在典型的具體實施例中，本發明人類化的抗體包含來 自上述受體序列目錄之12A1 lCDRs以及FR。在構架區內 之殘基中，選擇在此描述對CDR構形及/或活性重要的殘 基進行返回突變（若供體和受體序列之間有差異）° 接著再依下述選擇取代的殘基。當12A 11可變的架構 區域與以及相當之人類可變的架構區域之胺基酸不同時’ 人類架構胺基酸通常應經以下合理預期之相當的小鼠胺基 酸取代： (1 )直接經非共價鍵結合抗原的胺基酸， (2)相鄰於CDR區域、在上述Chothia et al.提出之 另一定義的CDR區域之一部份、或其它與CDR區域交互 作用（例如約CDR區域3A內）的胺基酸，或 (3 )參與VL-VH界面的胺基酸。 結構分析12A11抗體重及輕鏈變異區，以及人類化之 12B4抗體描述於實施例 V。簡言之，硏究解決鼠科動物 抗體結構輕鏈1KTR以及重鏈1 JRH以及1 ETZ之三度空 間模式。 另一種三度空間模式可確認殘基，對於鑑定CDR構 象（例如游標尺殘基）相當重要，其包含：輕鏈方面， -48- 1374893 PDB 寄存編號 2JEL(gi3212688) 、PDB 寄存編號 FIE( gi494639) 、PDB 寄存編號 IJP5 (gil6975307) 、PDB 寄 存編號 1CBV ( gi49391 7 ) 、PDB 寄存編號 2PCP ( gi4388943) 、PDB 寄存編號 1191 (gi2050118) 、PDB 寄 存編號 1CLZ ( gil 827926 ) 、PDB 寄存編號 1FL6 ( gil 794261 5 )以及 PDB 寄存編號 1KEL ( gi 1 942968 );以 及重鏈方面，PDB 1GGI ( gi442938 ) 、PDB寄存編號 1GGB ( gi442934 ) 、PDB 寄存編號 1 N 5 Y ( g i 2 8 3 7 3 9 1 3 )

、PDB 寄存編號 2HMI ( gi3891821) 、PDB 寄存編號 FDL

(gi2299 1 5 ) 、PDB 寄存編號 1 KIP ( g i 1 9 4 2 7 8 8 ) 、PDB 寄存編號lKIQ(gil942791)以及PDB寄存編號1VFA( gi 5 763 2 5 )。 在此描述的抗體之三度空間構造資料可公開得自例如

Research Coll aboratory for Structural Bioinformatics1 Protein Data Bank (PDB) 。PDB可經網際網路自由存取 ，描述於 Berman et al. ( 2000 ) Nucleic Acids Research, 28: 235。解決三度空間構造之硏究可鑑定12A11內之 CD R-交互作用殘基。此外，可使用電腦模式軟體產生 12A1 1 VH以及VL鏈三度空間模式》簡言之，三度空間模 式之產生係基於最接近的已解析之鼠科動物抗體重及輕鏈 構造。爲此目的，可用1 KTR作爲模版模式化12A11輕鏈 以及用IETZ以及1 JRH作爲模版模式化重鏈。此模式可 經一系列能量最小化步驟以減少不利的原子接觸以及最適 化靜電及凡得瓦交互作用進一步的精煉。可使用2JEL( -49-

1374893 2·5Α)及/或1TET ( 2.3A)作爲輕鏈以及1GGI 爲重鏈（或者其它上述之抗體），基於此類已 鼠科動物構造與個別1 2 A 1 1鏈間之相似性進行 空間及/或模式化分析。 可以電腦模式之1 2 A 1 1結構作爲起始點， 架構構造取代的內含12A11互補性決定區域之 結構。可構築額外的模式以代表進一步引入取 結構。 一般而言，須要取代一個、大多數或所有纪 滿足上述之標準。據此，本發明的人類化抗體短 取代的人類輕鏈架構殘基，其中至少有1、2、3 選擇位置對應至12A11之殘基。人類化抗體通言 代的人類重鏈架構殘基，其中至少有1、2、3 % 擇位置對應至1 2 A 1 1之殘基。 然而偶爾，特定的胺基酸是否符合上述標肆 模糊’所以製作另一變型免疫球蛋白時有的帶；^ 代’其他的則否。例如用鼠科動物殘基進行取f 類免疫球蛋白特定的位置將引進稀有的殘基，g 試含或不含特定取代之抗體的活性。若含或不爸 活性（例如結合親和力及/或結合專一性）大約 則以未取代之抗體爲爲較佳，因爲預期其引起的 應將較小（如本文描述）。 其他取代的候選者爲人類免疫球蛋白在此β 人類受體架構胺基酸。此類胺基酸可用更有代赛 2.8Α)作 解析之之 他之三度 測經人類 體的三維 胺基酸的 胺基酸以 常將含有 或更多個 將含有取 更多個選 仍有一些 特定的取 時，在人 此須要測 取代者之 相同時， hama 反 置特有的 性的人類 -50- 1374893 免疫球蛋白相等位置之胺基酸取代。此外，當該胺基酸爲 代表性的人類免疫球蛋白相等位置之胺基酸時，則可將小 鼠12A 11相等位置之胺基酸引入人類架構區域。 其它取代的候選者爲發生在架構區域之非種系殘基。 將12A11與習知的種系序列進行電腦比較時，可確認與重 或輕鏈具有最大程度序列相似性之種系序列。對準架構區 域與種系序列後，將可選擇取代對應的種系殘基之殘基。 可選擇於選擇之輕鏈受體架構中與此類種系序列之一無配 對之殘基，取代對應的種系殘基。 供體VL及/或VH序列與其它亞類成員（依據Kabat )供體VL及/或VH之序列，經序列比較後可確認稀有的 小鼠殘基以及確認不同於共識性殘基之殘基位置。此類供 體專一的差異可爲增進活性的體突變位點。接近結合部位 之獨特的或稀有的殘基可能會與抗原接觸，所以是小鼠殘 基中要保留的殘基。然而，若獨特的小鼠殘基並非重要的 結合殘基，則宜使用對應的受體殘基，因爲在人類化的抗 體中小鼠殘基可創造產生免疫性的新抗原決定部位。在供 體序列獨特的殘基實質上是對應的受體序列共同殘基之情 況下，較佳的殘基是受體的殘基。 表1 A總結12A1 1 VH以及VL區域之序列分析。 -51 - 1374893 表1. 12 A1 1 V區域序列之摘要 鏈 VL VH 小鼠亞類 II lb 人類亞類 II Π(或 ΠΙ) 小鼠vk內稀有的胺基酸(％頻萄 185(3.6%) 111(1.7%) Chothia規範的分類 L1 :第 4 類[16f] L2 :第 1 類[7] L3 :第 1 類[9] HI :第 3 類[7] H2 :第 1 類[16] H31 2 最接近的小鼠已解析的MAb構造 1 KTR3 I ETZ4(2.6A)和 1 JRH5 同源性模式化 94% 83%以及86% 模版 · 人類構架序列 K64(BAC01733)(87 %FR，總共 67%) M72(AAA69734)(61°/〇 FR，總共 45%) 供體註記 與12A11具有相同 規範構造群的Hu k LC 亞類 IICDR 與12A11具有相同規範 構造群的HU HC亞類 IIICDR 返回突變註記 Μ y \\\ A24F，F29L : H1R71 K :規範的，H2 V371 ·· 組裝 T28S，V48L， F67L，N73T，L78V : 游標 Hu Fr之參考種系 Α19 VL Vk2-28 傳訊 RNA : X63397.1 (GI ： 33774) AAA69731.1 (GI ： 567123)

-52- 1 III之選擇是基於描述於上述實施例I之標準。 2 無規範的分類，但依據 Shirai et al. ( 1 999 ) FEBS Lett.4 5 5 : 1 8 8 - 1 9 7之法則可形成紐結的基礎。 3

Kaufmann et a 1. ( 2 0 0 2 ) J Mol B o 1 . 318 : 135-147。 4

Guddat et al. ( 2000 ) J Mel Biol. 3 02 ： 8 5 3 - 8 72 ° 5

Sogabe et al. ( 1 997 ) J Mol Biol. 273 ： 8 82-897 ° 1374893 上述之種系序列可用於選擇取代之胺基酸。 在此描述的抗體之三度空間構造資料可公開得自例如 Research Coll aboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank(PDB) 。PDB可經網際網路自由存取 ，描述於 Berman et al. ( 2000 ) Nucleic Acids Research,

p2 3 5-2 42。本文之參考種系基因序列是公開的，例如可得 自收集Igh、Ig/c以及Ig又種系V基因之National Center for Biotechnology Information (NCBI)序列資料庫（位 於 National Institutes of Health (NIH)所屬之 National Library of Medicine ( NLM )部門）。可用 IgG BLASTtm 同源搜尋NCBI之"Ig種系基因"資料庫。 在典型的具體實施例中，本發明之人源化抗體含有（ i)包含可變結構區的輕鏈，其係包含鼠科動物12A11 VLCDRs以及人類受體構架，該構架具有零、一、二、三 、四、五、六、七、八、九或更多個殘基經對應的1 2 A 1 1 殘基取代以及（ii)包含12A11 VHCDRs以及人類受體構 架之重鏈，該構架具有至少一、二、三、四、五、六、七 、八、九或更多個殘基經對應的12A1 1殘基取代，可視需 要由至少一個，較佳者二或三個殘基經對應的人類種系殘 基取代。 在尤較佳的具體實施例中，本發明的人類化抗體具有 在此描述的構造特色，並進一步的具有至少一個（較佳者 二、三、四個或所有）下列活性：（1)結合可溶解的A 召；（2)結合聚集的AyS 1-4 2 (例如經ELISA測定）； -53- 1374893 (3)捕獲可溶解的A)g : (4)結合蛋白斑中之(例 如染色 AD及/或PDAPP斑）；（5)當相較於嵌合型 1 2 A 1 1 (例如具有鼠科動物變異區序列以及人類恆定區序 列之12A11)以不低於嵌合型12All二至三倍的結合親和 力結合A/5 ; (6)間接中介AyS之吞噬作用（例如在此 描述的體外吞噬作用測定）：以及（7)通過血腦屏障（ 例如於在此描述之PDAPP動物模式中顯示短期之腦部定 域作用）。 在另一典型的具體實施例中，本發明之人源化抗體含 有（i)包含可變結構區的輕鏈，其係包含鼠科動物12A1 VLCDRs以及人類受體構架，該構架具有至少—、二、三 、四、五、六、七、八、九或更多之返回突變的殘基（即 經對應的12A11殘基取代）：其中返回突變是規範的、包 裝及/或游標殘基以及（ii)包含12A11 VHCDRs以及人類 受體構架之重鏈，該構架具有至少一、二、三、四、五、 六、七、八、九或更多之返回突變的殘基，其中返回突變 的殘基是規範的、包裝及/或游標殘基。在某些具體實施 例中’返回突變僅位於包裝及/或規範殘基或主要是位於 規範及/或包裝殘基（例如，供體和受體序列間之不同游 標殘基僅1或2個進行返回突變）。 在其它具體實施例中相較於供體抗體（或者其嵌合的 版本）’人源化抗體包括最少數量之返回突變而仍保持結 合親和力。爲了達成該版本，可去除各種返回突變組合以 及測試產生的抗體之功效（例如結合親和性）。例如可去 -54 - 1374893 除遊標殘基之返回突變（例如1、2或者4個返回突變） 或去除游標與包裝、游標與規範或包裝及規範殘基的返回 突變。 在另一具體實施例中’本發明的人類化抗體具有在此 描述的構造特色，其可結合Αβ或具有足以引起至少一個 下列活體內效應之親和力：（1)降低蛋白斑含量； (2)預防蛋白斑形成；（3)降低可溶解的Aig之含量： (4)降低與成澱粉樣病症相關的神經病理學；（5)減輕 或改善至少一個與成澱粉樣病症相關的生理症狀；及/或 (6 )改良認知的功能。 在另一具體實施例中，本發明的人類化抗體具有在此 描述的構造特色，並專一結合至包含殘基3-7之抗原 決定部位8 在另一較佳的具體實施例中，本發明的人類化抗體具 有在此描述的構造特色，其可結合至Ay3之N-端抗原決定 部位（例如結合至A yS胺基酸3 - 7之抗原決定部位），以 及能降低（1) A0肽之含量；（2) A/3蛋白斑之含量； 以及（3 )與成澱粉樣病症相關的神經性負擔或神經失調 上述之活性可利用任何各種在此描述或此技藝中之測 定（例如結合測定、吞噬作用測定等）進行測定。活性測 定可爲活體內測定（例如使用標記的測定成份及/或影像 技藝）或活體外測定（例如使用源自患者之樣品或檢體） 。活性測定可爲直接的或間接的測定。在某些較佳的具體 -55- 1374893 實施例中，可測定神經終點（例如澱粉狀蛋白負擔量、神 經負擔等）。該測試終點可使用非侵入性偵測方法測定活 著的病患（例如針對阿茲海默氏症之動物模式或人類病患 例如進行免疫療法）。此外該測試終點可在病患死後測定 。動物模式及/或人類病患死後之終點測定可用於評估各 種藥劑（例如人類化的抗體）之療效以應用於相似的免疫 治療。其它較佳的具體實施例中，可評估行爲或神經參數 ’作爲上述神經病理的活性或測試終點之指標。 3.產生變異區 槪念性的選擇CDR以及人類化免疫球蛋白的架構成 份後，可用各種方法產生該免疫球蛋白。一般而言，抗體 重及/或輕鏈之一個或多個鼠科動物之互補性決定區域（ CDR )可使用引子爲礎的聚合酶連鎖反應（pcr )加以人 類化’例如置入一個或多個人類構架區。簡言之，設計能 徐冷至目標鼠科動物CDR區域，亦含有重疊序列以及可 徐冷至人類構架區之引子。據此，在適當的條件下，該引 子可從鼠科動物抗體模版核酸放大鼠科動物CDR以及在 模版部分加入人類構架序列。同樣地，可設計能徐冷至目 標人類構架區之引子，使用此類引子經PCR反應產生一個 放大的人類構架區。然後將各放大產物變性、合倂；以及 徐冷至其他產物’可基因地聯結具有重疊人類構架序列之 鼠科動物CDR區域與放大的人類構架序列。據此，在一 個或多個反應中，一個或多個鼠科動物CDR區域可基因 -56- 1374893 地聯結到中介的人類構架區。 某些具體實施例中，引子亦可包含令人滿意的限制酶 辨視序列以協助將遺傳工程產生的PCR放大的序列送人較 大的遺傳的片段，例如可變的輕或重鏈片段、重鏈、或載 體。此外，用以放大鼠科動物CDR區域或人類構架區之 引子可帶有配對的錯誤，以在鼠科動物CDR或人類構架 區引入不同的密碼子。本文將描述在人類構架區之內引入 之保存或改良鼠科動物CDR構造的定向以及它的結合親 和性的典型配對錯誤。 前述的解決方式可用以引入一、二、或所有三個鼠科 動物CDR區域到人類構架區之中。使用以引子爲基礎的 PCR 放大和聯結不同序列之方法描述於，例如 Sambrook.Fritsch and Maniatis.Molecular Cloning : Cold Spring Harbor- Laboratory Press ( 1 989 ) ; DNA Cloning.

Vols. 1 and 2, ( D.N. Glover，Ed. 198.5 ) ； PCR Handbook

Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry，Beaucage， Ed. John Wiley & Sons ( 1 999 ) ( Editor ) ; Current

Protocols in Molecular Biology，eds . Ausubel el al.. Jo h n Wiley & Sons ( 1 992 )。 因爲編碼之退化現象，許多核酸序列可編碼各免疫球 蛋白之胺基酸序列。經全新地固相DNA合成或PCR誘變 先前製備的所要求的多核苷酸變型可製作所要求的核酸序 列。寡核苷酸調節的誘變是製備目標多肽DNA之取代、 刪除及插入變型的較佳方法。參閱Adelman et al., DNA 2 -57- 1374893 :183 ( 1983)。簡言之，將所要求的突變之寡核苷酸編 碼與單鏈DNA模版雜交可改變多肽 DNA。雜化後，使用 DN A聚合酶合成該模版含寡核苷酸引子之全部的第二互補 的股，以及在目標多肽 DNA編碼選擇的改變。 4.選擇恆定區

將描述如上製作之抗體可變的片段（例如嵌合的或人 類化的抗體之重及輕鏈變異區）一般聯結到至少部份之疫 球蛋白恆定區（Fc區域）（一般爲人類免疫球蛋白）。人 類恆定區DNA序列可依據熟知的方法分離自各種人類細 胞，但較佳者爲永生的B細胞（參閱上述之Kabat et al. 及1^11“&1.，\¥08 7/0 2671)(全文在此并入參考文獻）。 最初抗體將含有輕鏈及重鏈恆定區。重鏈恆定區通常包括 CH1、樞紐、CH2、CH3、及 CH4區域。本文之抗體包括 具有所有恆定區型態之抗體，包括IgM、IgG、IgD、IgA 以及IgE，以及任何之同功型，包括IgGI、IgG2、IgG3以 及IgG4。當要求抗體（例如人類化的抗體）展現細胞毒 性的活性時，固定的結構區通常固定上固定的結構區，一 般爲IgGI之固定結構區。較佳者爲人類同功型IgGI。輕 鏈恆定區可爲λ或/C。人類化的抗體可包含一種以上分類 或同功型之序列。表現的抗體可爲內含二個輕及二個重鏈 之四合體、分離之重鏈、輕鏈、Fab、Fab，F(ab') 2、以 及Fv、或重及輕鏈可變的結構區經由間隔物聯結的單鏈 抗體。 -58- 1374893 5.表現重組抗體

嵌合型以及人類化的抗體一般是用重組表現製作。將 編碼輕及重鏈變異區之核酸（可視需要聯結至恆定區）插 入表現載體。輕及重鏈可選殖入相同或不同的表現載體。 編碼免疫球蛋白鏈之DNA片段可操作地聯結的至表現載 體之控制序列以確保免疫球蛋白多胜肽之表現。表現控制 序列包括（但非限於）：啓動子（例如天然的相關的或異 性的啓動子）、信號序列、強化子元件、及轉錄終止序列 。較佳之表現控制序列是能轉形或轉染真核宿主細胞載體 內之真核的啓動子系統（例如COS細胞）。載體一旦倂 入適當的宿主後，將宿主維持在適於高水準表現核苷酸序 列之條件下，並收集及純化雜交反應抗體。 此類表現載體一般可在宿主生物體中以附加體的方式 或是以宿主染色體DN A的整體部份進行複製。通常表現 載體含有選擇標識（例如氨比西林抗性、潮黴素抗性、四 環素抗性、康黴素抗性或新黴素抗性）以偵測到轉形入所 要求的DNA序列的細胞（參閱例如Itakura et al.，US專 利 4,704,362 )。 大腸桿菌是一種原核的宿主，尤其可用於選殖本發明 之多核苷酸（例如DNA序列）。其它適用的微生物的宿 主包括芽孢桿菌，例如：枯草芽孢桿菌，以及其它腸桿菌 ，例如：沙門桿菌、沙雷氏菌屬、及各種假單胞菌。在 此類原核的宿主中，亦可使用含有與宿主細胞相容的表現 -59- 1374893 控制序列（例如複製起始點）之表現載體。此外，可存在 有任何數量之各種習知的啓動子，例如乳糖啓動子系統 、色胺酸（trp)啓動子系統、沒-內醯胺酶啓動子系統、 或噬菌體λ之啓動子系統。一般啓動子將可控制表現，可 視需要含操作子序列，以及具有核糖體結合部位序列及其 類似者’啓動及完成轉錄及轉譯作用。 亦可用其它微生物，例如酵母菌進行表現。釀酒酵母 菌是較佳的酵母菌宿主，適當的載體具有所要求的表現控 制序列（例如啓動子）、複製起始點、終止序列及其類似 者。代表性的啓動子包括3-磷酸甘油酸激酶以及其它醣解 酵素。其他可誘發的酵母菌啓動子包括乙醇脫氫酶、異細 胞色素C、及利用麥芽糖及半乳糖之酵素的啓動子。 除了微生物，亦可用哺乳動物組織的培養細胞以表現 及產生本發明（例如編碼免疫球蛋白或其片段之多核苷酸 )之多胜肽。參閱 Winnacker，From Genes to Clones, VCH Publishers，Ν·Υ.，Ν_Υ· ( 1 987 )。真核細實質上較佳，因 爲在此技藝中已發展出許多能分泌異性的蛋白質（例如完 整的免疫球蛋白）的適當宿主細胞株，包括CHO細胞株 、各種 Cos細胞株、HeLa細胞，較佳之骨髓癌細胞株、 或轉形的B細胞或融合瘤。較佳者爲非人類細胞。此類細 胞之表現載體可包括表現控制序列，例如複製起始點、啓 動子、及強化子（Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49 ( 1 986 ))，以及必須的加工資料位點，例如核糖體結合部 位、RNA剪接位、聚腺苷酸化作用位點、及轉錄的終止子 -60- 1374893 序列。較佳的表現控制序列是源自免疫球蛋白基因、SV40 、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒、巨細胞病毒等之啓動子β參 閱 Co et al., J. Immunol. 148 : 1 1 4 9 ( 1 992 ) 〇 此外，編碼抗體之序列可併入導入基因，引入導入外 來基因動物的基因組以及後續的表現在導入外來基因動物 的牛奶中（參閱例如 Deboer et al.，US 5,741,95 7, Rosen, US 5,304,489，以及 Meade et al., US 5,849.992 )。適當 的導入基因包括輕及/或重鏈操作聯結乳腺專一的基因， 例如酪蛋白或沒乳球蛋白之啓動子及強化子的編碼序列。 此外，本發明抗體（例如人源化抗體）可以轉基因植 物（例如，煙草、玉米、大豆以及苜蓿）產生。改良的’· 植物抗體’'載體（Hendy et of ( 1 909 ) J. Immunol.Methods 231: 137-146)以及純化策略；結合一個增加轉形能力的 作物使該方法不僅是產生人類與動物之治療用而且是產生 工業用（例如催化的抗體）重組免疫球蛋白的實用和有效 率方法。此外，植物製作之抗體已顯示其安全性以及有效 性，以及可避免使用源自動物之材料以及因此可避免傳染 性海綿性腦脊髓炎病變（TSE )感染源污染之危機。進一 步的，植物以及哺乳動物細胞製作之抗體其糖化圖樣之差 異與抗原結合或專一性無關。此外，局部口服源自植物分 泌的二聚體IgA抗體之病人並無中毒或HAMA之證據（參 閱 L a r r i c k e t a 1. ( 1 9 9 8 ) R e s · I m m u η ο 1. 1 4 9 : 6 0 3 - 6 0 8 ) 可使用導入外來基因的植物表現重組抗體之各種方法 -61 - 1374893 。例如，抗體重及輕鏈可獨立選殖到表現載體（例如根瘤 土壤桿菌載體），接著在體外將重組細菌轉型入植物或直 接使用例如塗層載體之顆粒轉型然後用物理方法例如彈射 方法引入植物組織。其後，表現個別鏈之植物是經有性交 配重組，最後產生完全組裝以及功能的抗體。以相似的準 則在菸草植物之內表現功能的抗體（參閱Hiatt et al.( 1989) Nature 342: 76-87)。在各種具體實施例中，可信 利用號序列促進表現、結合以及未裝配抗體鏈在適當植物 環境內的折疊（例如質外體之水溶液環境或其他專一性的 植物組織，包括塊莖、果實或種子）（參閱Fiedler ci al. (1 995 ) Bio/Technology 13 ： 1090-1093)。亦可植用物 生物反應器增加抗體產率以及顯著的減低成本。 內含重要聚核苷酸序列（例如重及輕鏈之編碼序列以 及表現控制序列）的載體可依宿主細胞之型態用已知的方 法轉移入宿主細胞。例如原核細胞通常利用氯化鈣轉染作 用，而其他細胞宿主可使用磷酸鈣處理、電穿透作用、轉 脂作用、生物投射或病毒性的轉染作用。（參閱一般而言 Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed·, 1 989 )(全文在此并 入參考文獻）。其它用以轉形哺乳動物的細胞之方法包括 使用凝聚胺、原生質體融合、脂球體、電穿透作用、及顯 微注射（參閱上述之Sambrook et al.)。爲了產生基因轉 殖動物，導入基因可微注射入受精的卵母細胞，或可倂入 胚胎幹細胞的基因組，並將該細胞之細胞核轉移入除去細 -62- 1374893 胞核的卵母細胞。 當重及輕鏈分別選殖入表現載體時，可共轉染載體以 表現及組裝完整的免疫球蛋白。一旦表現後，可依據技藝 之標準方法（包括硫酸銨沉澱、親和力管柱、管柱層析法 、HPLC純化、膠體電泳及其類似者，參閱 Scopes, Protein Purification ( Springer-Verlag, N.Y., ( 1 982 )) 純化本發明的全部抗體、其二聚物、個別地輕及重鏈、或 其它免疫球蛋白形式。在醫藥學的用途上，較佳者爲至少 約90至95%均一性之相當純的免疫球蛋白，以及最佳者 爲98至99%或更多之均一性。 6.抗體片段 本發明範圍亦包括抗體片段。在具體實施例之一中提 供非人類片段，及/或嵌合型抗體。在另一具體實施例中 提供人類化的抗體片段。一般此類片段與抗原專一的結合 之親和力至少爲1〇7，以及更典型者爲1〇8或10 9 M·1。人 類化的抗體片段包括分離之重鏈、輕鏈、Fab、Fab·、F ( ab〇 2、Fabc、及Fv。片段之製作係經重組DNA技藝， 或經酵素的或化學方式分離自完整的免疫球蛋白。 7·抗原表位測定 可進行抗原表位測定測定抗體確認Αβ之抗原決定位 或抗原決定部位。具體實施例之一中，抗原表位測定是依 據 Replacement NET ( rNET)分析進行。rNET抗原表位 -63- 1374893 測定分析提供抗原表位內個別殘基對抗體結合總體活性之 資料。rNET分析係使用合成的系統性經單—取代的肽類 似物。抗體之結合測試是測定抗體對抗天然肽（天然的抗 原）以及對抗19個另外的"經單一取代的，，肽類（各肽係 在1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12個非天然的胺基酸位置經取代）的能力。產生的圖 譜是反映此位置經各種非天然殘基代替之效應。在沿著抗 原性肽的連續位置產生同樣的圖譜。然後合併的圖譜，或 抗原決定部位地圖，（反映在所有19個非天然的殘基位 置之取代）可相較於第二抗體產生之同樣地圖譜。實質上 相似的或相同的圖譜，是指比較的抗體具有相同或相似的 抗原決定部位專一性。 -64- 1 .在動物模式中測試抗體的治療功效 2 將一組7-9個月大的PDAPP小鼠各自注射〇.5毫克之 3 PBS的多株抗-A冷或專一的抗-八卢單株抗體。將所有抗體 4 製劑純化至低內毒素之含量。對小鼠注射A /3片段或較長 5 的形式，製備融合瘤以及篩選產生可專一結合至A/3所要 6 求的片段且不結合至其它A/3非重疊片段的融合瘤以製備 7 對抗Αβ片段之單株的抗體。 8 將小鼠腹腔內的進行4個月以之上注射以保持循環中 9 的抗體濃度經酵素聯結免疫抗體檢測法測定之値效價大於 10 1/1 000 (經酵素聯結免疫抗體檢測法檢測Αβ42或其它抗 11 原定義）。監測値效價，以及在6個月之注射終點將小鼠 12 安樂死。死後進行組織化學、Αβ之含量以及毒理學分析 1374893 。每組使用十隻小鼠。 9·篩選抗體之清除活性 本發明亦提供篩選抗體清除澱粉樣沉積物、或任何其 它抗原、或相關的生物實體之須要的清除活性之方法。篩 選對抗澱粉樣沉積物時，係將阿茲海默氏症病人或具有老 年痴呆症病理學特徵之動物模型的腦組織樣本在體外培養 液中接觸帶有Fc受體之吞噬細胞（例如小膠質細胞）與 抗體進行測驗。吞噬細胞可爲初級培養細胞或細胞株，以 及可源自鼠科動物（例如BV-2或C8-B4細胞）或人類（ 例如TAP-1細胞）。在一些方法中，可將組成物置於顯微 鏡載玻片以協助微觀的監測。在一些方法中，在微型滴定 盤並聯的孔洞內進行多重反應。在該版式中，可用不同的 微型顯微鏡載玻片覆蓋在不同的孔洞內，或可用非微觀的 檢測版式，例如酵素聯結免疫抗體檢測法偵測Αβ。較佳 者，在體外反應混合物中測定一系列澱粉樣沉積物之含量 ，從反應之前的基線値開始進行，以及在反應期間進行一 個或多個測驗値。可經染色偵測抗原，例如用螢光標記的 抗Αβ或其它澱粉樣斑成分之抗體。用於染色之抗體可與 測試清除活性之抗體相同或不相同。澱粉樣沈澱物反應期 間降低至基線顯示測驗抗體具有清除活性。該抗體是有可 能用於預防或治療老年痴呆症以及其他成澱粉樣疾病。預 防或治療老年痴呆症以及其它成澱粉樣疾病尤其適用的抗 體包含能消除緻密的以及滲開澱粉樣噬菌斑之抗體，例如 -65- 1374893 本發明之12A11抗體，或其嵌合的或人類化的版本。

類似的方法可用以篩選抗體清除其它型態的生物實體 之活性。此分析可用以偵測對抗實際上任何型式之生物實 體的清除活性。典型地生物實體對人類或動物疾病具有一 些功能。生物的實體可爲組織樣本或分離之形式。若爲組 織樣本時，此組織樣本宜未經固定以接近組織樣本中之成 份以及避免因固定偶發性的攪亂成份之構形。在分析內測 試之組織樣品實施例包含：癌組織、癌症發生前的組織、 內含良性的生長組織，例如疣或痣之組織、病理微生物感 染的組織、浸潤發炎性細胞的組織、細胞間帶有病理基質 之組織（例如纖維素性心包炎）、帶有異常抗原的組織； 以及傷疤組織。可使用之分離生物實體實施例包含Αβ、 病毒的抗原或病毒、蛋白多糖、其它病理微生物之抗原、 腫廇抗原以及粘附分子。該抗原可得自天然的來源、重組 表現或化學合成。組織樣本或分離生物的實體可在培養液 內接觸帶有Fc受體的呑噬菌細胞，例如單核白血球或小 膠質細胞，與測試抗體進行測試。在測驗時抗體可直接的 結合生物的實體物或者和生物的實體相關的抗原。後一情 形下測驗物體是吞噬抗原之生物實體。通常，雖然未必， 抗體和生物的實體（有時具有相關的抗原）是在添加入呑 噬細胞之前進行接觸。然後監測生物實體及/或殘留在培 養液之內相關的抗原（若有的話）之濃度。降低培養液之 內抗原或者相關的生物實體之濃度意指抗體與吞噬細胞具 有消除抗原及/或相關的生物實體物之能力。 -66 - 1374893 ίο.其具有改變效應子功能之嵌合型/人類化之抗體 包含恆定區（Fc區域）的上述本發明抗體，亦可令人 滿意的改變分子致效劑之功能。一般而言，抗體之致效劑 功能位於分子固定的或Fc區域，其可間接中介各種致效 劑分子（例如補體蛋白或Fc受體）之結合。補體與Fc區 域之結合是重要的，例如調理以及溶解細胞病原體以及活 化發炎反應。抗體結合至Fc受體，例如致效細胞之表面 可觸發許多重要的以及各樣的生物的反應，包括例如卷吞 及破壞塗覆抗體的病原體或顆粒、清除免疫複合體、經殺 手細胞溶解塗覆抗體的目標細胞（即抗體依存的經細胞調 節的細胞毒性，或ADCC )、釋放發炎性的調控物、胎盤 轉移抗體、及控制免疫球蛋白產生。 據此，取決於特定的治療的或診斷的用途，須要上述 的免疫功能，或僅選擇性的免疫功能。改變抗體之Fc區 域，可達成各種分子致效劑功能之特色，包括提高或抑制 各種免疫系統反應，具有診斷以及治療有利的效應。 本發明製作的抗體可僅與某些Fc受體類型反應，例 如本發明抗體可經修飾刪除或改變抗體Fc區域之Fc受體 結合部位以僅結合至某些Fc受體，或視需要完全缺少Fc 受體結合。其它本發明抗體Fc區域令人滿意的改變歸納 於下。使用一般Kabat編號系統指定Fc區域（例如IgG 抗體）上改變之胺基酸殘基（例如胺基酸取代）以使致效 功能達成所要求的改變。亦可使用編號系統比較各種抗體 -67- 1374893 (例如小鼠抗體）以觀察到所要求的致效劑功能，然後可 系統化的用遺傳工程改造本發明的人類、人類化、或嵌合 型抗體。

例如已觀察到抗體（例如IgG抗體）可分成三群，分 別與Fc受體（例如人類單核白血球Fc受體（FcYRI)) 展現強度、中間、或弱結合。比較此類不同親和力群之胺 基-酸序列，可確認樞紐聯結區域之單核白血球結合部位 (Leu2 3 4-Ser2 3 9 )。此外，人類FcYRI受體可結合單體人 類IgGl以及小鼠IgG2a，但結合小鼠lgG2b則弱1 00倍 。比較此類蛋白質樞紐聯結區域之序列顯示具有強烈結合 劑的序列 234至 23 8，即 Leu-Leu-Gly-Gly-Pro(序列確 認號碼：32 )在小鼠r 2b中變成Leu-Glu-Gly-Gly-Pro ( 序列確認號碼：3 3 )(即弱結合劑）。據此，若須要降低 FcYI受體之結合的話，可在人類抗體樞紐序列作對應的改 變。據瞭解其它改變亦可達成相同或相似的結果。例如， 取代側鏈具有不適當的官能基之特定的殘基、或引入帶電 價的官能基（例如Glu或Asp)或例如芳香族非極性殘基 (例如Phe、Tyr、或Trp )可改變FcYRI結合親和力。 此類改變可相等地施用至鼠科動物、人類、及老鼠系 統，使不同免疫球蛋白之間具有序列同源現象。據顯示將 人類IgG3(結合至人類FcyRI受體）之Leu 235改變成 Glu可破壞突變者與受體之交互作用。如此製作適當的突 變可打開或關閉此受體之結合部位。 相鄰的或接近樞紐聯結區域位點之突變（例如殘基 -68 - 1374893 234、236或237用Ala取代）顯示改變殘基234、235、 236、及237至少可影響FcYRI受體之親和力。據此，本 發明抗體亦可有改變的Fc區域，相較於未經修飾之抗體 其係改變FqUI之結合親和力。該抗體一般係修飾胺基酸 殘基 234、2 35 ' 236、或 23 7 〇 相似的方法可改變其它Fc受體之親和力，用不同方 法控制免疫反應。 在進一步的實施例中，結合補體之C1成份後可改變 IgG抗體之水解性質。 補體系統的第一個成份C1包含三個共同緊密結合的 已知的蛋白質Clq、Clr以及Cls。據顯示Clq負責此三 個蛋0質之複合體與抗體之結合。 據此，重鏈胺基酸殘基31、320、及322中至少有一 個被改變成具有不同側鏈殘基之改變CH2結構區的抗體， 可改變抗體與Clq之結合活性。重鏈殘基編號爲EU指數 (參閱上述之Kabat et al.)。其它適當的改變，例如降低 或去除Clq與抗體專一的結合，包括將任何一個殘基318 (Glu) 、320(Lys)以及 322(Lys)改變成 Ala。 此外，在此類殘基製作突變，據顯示只要殘基318 具有氫鍵側鏈及殘基320以及3 22均有正電價的側鏈則可 保留與Clq之結合。 在三個特定的殘基中將任何一個殘基取代成側鏈具有 不適當的官能性之殘基，則可徹底破壞C 1 q結合活性。不 是僅有將離子的殘基用Ala代替才可破壞Clq之結合。 -69-

1374893 亦可用其它經烷基取代的非離子殘基，例如Gly、 Leu、或Val'或該芳香族非極性殘基（Phe、Tyr、T 及Pro )代替三個特定的殘基中的任何一個殘基， 破壞Clq之結合。此外，亦可使用極性非離子殘基 Thr、Cys、及Met代替殘基320以及322(但不是: 以破壞Clq之結合。 亦値得注意的是殘基的離子或非離子極性側鏈將 與GU殘基以相似的鍵結形成方法形成氫鍵。因此 (GU)殘基用極性殘基代替可進行修飾但不破壞C 合活性。 亦知用 Ala取代殘基297 ( Asn )可去除水解活 僅稍微地降低（約三倍弱）對C 1 q之親和力。此改變 糖基化作用位點，而補體活化須要碳水化合物之存在 位點之任何其它取代亦將破壞糖基化作用位點。 本發明亦提供改變致效劑功能之抗體，其中抗體 經修飾之樞紐區域。經修飾之樞紐區域可包含源自不 體種類或源自CH1結構區次分類抗體之完整的樞紐區 例如，IgG抗體的固定結構區（CH1 )可附著至IgG4 之樞紐區域。此外，新樞紐區域可包含部份之天然樞 源自天然樞紐區域的重複單位。在實施例之一中，天 樞紐區域係將一個或多個半胱胺酸殘基轉換成中性的 (例如丙胺酸），或將適當位置的殘基轉換成半胱胺 基而加以改變。該改變可使用蛋白質化學技藝，較佳 在此描述之遺傳工程技藝進行。 lie、 rp以 均可 Ser ' Π 8 ) 能夠 >318 結 性而 破壞 。此 具有 同抗 域。 抗體 紐或 然的 殘基 酸殘 者爲 -70- 1374893 在本發明的具體實施例之一中，降低抗體樞紐區域半 胱胺酸殘基之數目，例如降低至一個半胱胺酸殘基。此修 飾之優點是可促進抗體，例如雙專一性的抗體分子以及Fc 部份已經致效劑或報導分子取代之抗體分子的組裝，因爲 僅必須形成一個二硫鍵。此修飾亦提供專一的目標使樞紐 區域附著至另一樞紐區域或致效劑或報導分子（直接的或 間接的）例如經化學的方法。 相反地’可增加抗體樞紐區域半胱胺酸殘基之數目， 例如至少比正常發生的半胱胺酸殘基多一個半胱胺酸殘基 。增加半胱胺酸殘基之數目可穩定相鄰的樞紐間之交互作 用。此修飾之另一優點可增進至致效劑或報導分子使用半 胱胺酸硫醇基附著至改變的抗體，例如放射性標記的抗體 〇 據此，本發明提供交換樞紐區域之抗體（特定言之 IgG )，及/或增加或降低樞紐區域半胱胺酸殘基之數目以 改變致效劑功能（參閱例如美國專利第5,677,425號，全 文在此倂入參考文獻）。測定改變之抗體的致效劑功能係 使用在此描述之測定或其它確認的技藝。 重要的是，產生的抗體可用一種或多種測定以評估相 較於起始抗體之任何生物活性的改變。例如，改變Fc區 域之抗體結合補體或Fc受體之能力可使用揭示於在之測 定與任何確認技藝測定評估。 產生本發明抗體可用任何適當的技術進行，包括在此 描述之技藝與熟悉此技藝的專業人士習知的技藝。可合成 -71 - 1374893 例如適當的蛋白質序列，例如抗體形成部份或所有 固定的結構區，例如Fc區域（即CH2，及/或CH3 )，以及包括適當改變殘基抗體，然後化學地相聯 分子適當的位置。 較佳者用遺傳工程技藝產生改變型抗體。較佳 包括例如製備適當的引子應用於聚合酶連鎖反應（ ，在編碼至少部份之IgG重鏈（例如Fc或恆定區 CH2、及/或CH3)的DNA序列上改變一個或多個 然後將此片斷操作地聯結至抗體的其餘部份，例如 異區以及細胞表現須要的調控元。 本發明亦包括用以轉形細胞株之載體，用於產 載體之載體、轉形載體轉形的細胞株、製備的載體 細胞、以及其生產方法。 較佳者，產生改變Fc區域（即改變致效劑功 抗體的轉形細胞株是永生的哺乳動物細胞株（例$ 細胞）。 雖然較佳之用於產生改變Fc區域抗體的細胞 哺乳動物的細胞株，此外亦可使用任何其它適當的 ，例如細菌的細胞株或酵母菌細胞株。 11.親合性成熟作用 本發明之抗體（例如人類化之抗體）可使用任 和力成熟技藝修飾以改良功能。典型地先確認對給 標分子具有結合親和性之候選分子以及然後進一步 相關的 結構區 至抗體 的技藝 PCR ) ，例如 殘基。 抗體變 生轉形 轉形的 能）之 口 CHO 株者是 細胞株 何之親 定的目 的使用 -72- 1374893 致突變技藝改良或”成熟"以產生和目標分子具有所要求的 結合交互作用的一個或多個相關的候選分子。典型地，其 係修飾抗體之親和性（或者抗體親抗原性，即抗體目標抗 原合併的親和力），然而分子之其它性質，例如穩定性、 效應子功能 '清拆、分泌、或者運送功能，亦可使用親和 力成熟技藝與親和性分別或並行修飾。 在可做典型的具體實施例中，此抗體（例如本發明之 人源化抗體）之親和性是增加。例如，具有至少Ιί^Μ·1、 li^ivr1或結合親和力之抗體可經成熟作用將其親 和力增加至至少109M_I、10l()]vri或ΙΟ12!^1。 親和性成熟的決方式之一是合成編碼此結合分子，或 其部分之核酸的結合分子，其中此結合分子編碼所要求的 改變。合成寡核苷酸是已知的技藝上以及可立即自動產生 —種或多種具有任何改變所要求的密碼子之核酸。亦可用 此方法引入限制位、沈默的突變、以及有利的密碼子選擇 。此外，可改變一個或多個密碼子以代表特定的胺基酸之 子集，例如排除可形成雙硫鍵之半胱胺酸子集，且限制於 定義之區域，例如CDR區域或其部分。此外，此區域可 由局部地或完全地隨機設定之胺基酸代表（詳情請參閱， 例如美國專利 5,830,650 ; 5,798,208 ; 5,824,514 ; 5817,483 ； 5,814,476 ； 5,723,523 ； 4,528,266 ； 4,359,53 ；5,840,479 ;以及 5,869,644 ) 〇 據瞭解，上述方法可使用技藝上已知的聚合酶連鎖反 應（PCP )部份地或完整的進行以及具有倂入寡核苷酸之 -73- 1374893 優點’例如，具有例如雙股的核酸所要求的改變之放大量 的引子或單股的核酸，以及適用於其它操作（例如以遺傳 工程學的方法構建到一個適當的表現或選殖載體）之放大 量的引子或單股的核酸。該PCR亦可在錯誤摻入核苷酸之 條件下進行從而在放大的核酸中引入額外的變異性。進行 PCR以及相關的組套、試劑、以及引子設計等實驗的細節 可參閱例如：美國專利 4，683,202; 4,683,195; 6,040,166 :以及6,096,551。使用以引子爲基礎的PCR方法將CDR 區域引入到抗體構架區，該方法可參閱美國專利第 5，858,725號。以引子爲基礎的PCR方法放大抗體基因庫 (和依據該方法製造的基因庫）係使用最少對之引子發現 較大的抗體分子之序列同源性，因而可有效地放大較大以 及各種不同的抗體分子，描述例如於美國專利5，780,225 :6,3 03，3 13 ;以及6,47 9,243。亦可用非引子爲基礎的 PCR方法進行位點定向誘變，以及包含'Kunkel'誘變，其 係使用內含模版之單股的尿嘧啶以及雜交引子，經由大腸 桿菌特定的菌株引入突變（參閱例如美國專利第 4,873，192 號）。 改變抗體序列，或其部分其他的方法；包含核酸合成 或在下不是最佳的（即除錯）條件下進行之核酸PCR、該 核酸之變性以及復性作用（徐冷）、核酸外切酶及/或核 酸內切酶水解接著經連接反應或PCR (核酸交錯洗牌）重 新裝配，或組合一種或多種前述的技藝，如描述於例如： 美國專利 6,410,668; 6,238,884: 6，171，820; 5,965,408; -74- 1374893 6,36 1,974 ; 6,3 58,709 ； 6,352,842 ； 4,888,286 ； 6,3 3 7,1 86 ;6，165,793 ; 6，132,970 ; 6，117,679 ; 5,830,721 ;以及 5,605,793 。

在某些具體實施例中，可表現包含在某些候選抗體、 分子部份之內具有多樣性之候選抗體分子家族，例如，一 個或多個CDR區域（或者其部分）、一個或多個構架區 、及/或一個或多個恆定區（例如具有效應子功能之恒定 區）之抗體基因庫（或者親和力成熟基因庫）以及使用確 認技藝篩選所要求的性質（參閱例如美國專利第629 1，1 6 1 ;6,29 1,1 60 ; 6,291，159;以及 6,29 1,1 5 8 號。例如，可構 築具有多樣性之CDR3序列之抗體可變的結構區之表現基 因庫以及經引入、誘變多樣性之CDR3序列的方法，產生 具有多樣性之CDR3序列之人類抗體基因庫以及回收此基 因庫（參閱例如美國專利6,248,5 1 6 )。 最後爲了表現親和性成熟的抗體，可將編碼候選抗體 分子之核酸在適當的表現版式下，例如：全長之抗體重及 輕鏈（例如免疫球蛋白G )、抗體Fab片段（例如Fab、F (ab' ) 2 )，或例如：單鏈抗體（scFv )使用標准載體和 細胞轉染/轉型技藝（參閱例如美國專利第 6,331，415; 6,1 03,889 ； 5,260,203 ； 5,258,498;以及 4,946,778 號）弓 | 入細胞。 B.編碼免疫劑以及治療劑之核酸 亦可投用編碼抗體及其成份鏈之核酸作爲被動免疫法 -75- 1374893 誘發對抗澱粉狀蛋白沈澱物之免疫反應。該核酸可爲DNA 或RNA。編碼抗原的核酸片斷一般係聯結至調控元，例如 啓動子以及強化子，其可允許DNA片斷在預期的病患目 標細胞中表現。在血液細胞中表現（令人滿意的誘發免疫 反應）時，適於直接表現的啓動子以及強化子元件係爲來 自輕或重鏈免疫球蛋白基因或爲CMV之主要的中間物早 期啓動子以及強化子（Stinski，美國專利第5,168,062以 及5,385,839號）。聯結的調控元與編碼序列經常被選殖 入載體。投用雙鏈抗體時，二個鏈可選殖入相同或分離的 載體。 可使用許多的病毒載體系統，包括：反轉錄的病毒系

Develop. 3: 102-109(1993));腺病毒的載體（參閱例 如，Bett et al.，J Virul.67: 5911 ( 1993)):腺病毒相 關的病毒載體（參閱例如Zhou et al·，J Exp. Med. 179: 1867 ( 19 94 ))、水痘家族的病毒載體，包括牛痘病毒以 及雞痘病毒、α病毒屬病毒的載體，例如源自Sindhis以 及 Semliki Forest 病毒（參閱例如，Dubensky et al., J. Virol. 70: 508 ( 1996))、委內瑞拉馬腦炎病毒（參閱 Johnston et al·，US 5,643,576)以及棒狀病毒，例如水泡 性口炎病毒（參閱Rose，6,168,943)以及乳頭瘤病毒（ Ohe et al., Human Gene Therapy 6 ： 3 25 ( 1 995 ) ； Woo et al.，WO 94/1 2629 以及 Xiao & Brandsma，Nucleic Acids.

Res. 24, 2630-2622 ( 1 996 )。 -76- 1374893 編碼抗原DNA，或內含抗原DNA的載體，可包裝入 脂球體。適當的脂質以及相關的類似物描述於Eppstein et al_、US 5,208,03 6 ' Feigner et al·、US 5,264,6 1 8 ' Rose 、US 5,279,83 3、以及 Epand et al_、US 5,2 83,1 85。載體 以及抗原DNA編碼亦可吸附或聯結微粒載體，其實施例 包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物以及聚丙內酯以及聚（丙交 醋-共乙交醋），參閱例如McGee et al.，J. Micro Encap. (1996)。

基因治療載體或裸露的多胜肽（例如DNA )可經活體 內運送，一般係經全身性投藥（例如靜脈內的、腹腔內的 、鼻腔的、胃、皮膚內的、肌肉內的、次真皮的、或顱內 的灌入）或塗覆施用（參閱例如 Anderson et al.、US 5，3 99，3 46 )投用於個別病患。本文術語之"裸露的多核苷 酸"’意指不經相關的轉染促進劑運送的多核苷酸。裸露的 多核苷酸有時是選殖入質體載體。該載體可進一步的包括 促進劑例如布比瓦辛（bupivacine) (Weiner et al., US 5,593,972 ) 。DNA亦可使用基因槍投用。參閱上述的

Xiao & Brandsma。將編碼抗原的DNA沈激在微金屬圓珠 之表面。微抛體用衝擊波或擴張氦氣加速，並穿過數層細 胞組織。適當的裝置是例如，由Agricetus，Inc. Middleton WI製作之AccelTM基因傳輸裝置。此外，可簡單地用化學 或機械的刺激將DN A點在皮膚上，裸露的DNA可經由皮 膚進入血流（參閱 Howell et al., WO 95/05 85 3 )。 在進一步的變體中，編碼免疫原之載體可運送至體外 -77- 1374893 的細胞，例如植入個別病患的細胞（例如淋巴細胞、骨髓 塊、組織活體檢查）或全適型供血者血液幹細胞，接著將 細胞再植入病患，之後通常選擇帶有併入載體之細胞。 II.預防和治療方法 本發明係直接的關於治 粉樣疾病，其係以產生有利 A冷、降低蛋白斑、抑制蛋 進認知的功能、及/或逆轉 條件對病患投用A々專一性 (例如人類化免疫球蛋白） 。本發明亦關於使用揭示的 蛋白）製作治療或預防成澱 特色之一中，本發明提 /3澱粉狀蛋白沈澱物相關的 海默氏症、唐氏綜合症以及 含或不含其它成澱粉樣疾病 括對病患投用有效劑量之專 份的抗體。該方法尤其可用 海默氏症。典型的方法包含 體。較佳的方法包含投用有 10的抗原決定部位之抗體， 的抗原決定部位之抗體，專 決定部位之抗體，專一結合 療老年痴呆症的以及其它成澱 的治療的反應（例如誘發呑噬 白斑形成、降低神經失調、改 、治療或預防認知的衰退）之 抗原決定部位治療的免疫試劑 ，以預防或治療成澱粉樣疾病 免疫試劑（例如人類化免疫球 粉樣疾病之藥劑。 供預防或治療病患腦部中與A 疾病之方法。該疾病包括阿茲 認知的受損。後者發生時，可 之特性。本發明的一些方法包 一結合至澱粉狀蛋白沈積物成 於預防或治療人類病患之阿茲 投用有效劑量結合至A/3的抗 效劑量專一結合至A/S殘基1-例如專一結合至A /5殘基1 - 3 —結合至殘基1-4的抗原 至A/5殘基1-5的抗原決定部 -78- 1374893 位之抗體，專一結合至A/3殘基1-6的抗原決定部位之抗 體，專一結合至A沒殘基1-7的抗原決定部位之抗體，或 專一結合至AyS殘基3-7的抗原決定部位之抗體。在另一 特色中，本發明之特色係投用結合至包含A冷自由N-端殘 基之抗原決定部位的抗體。在另一特色中，本發明之特色 係投用結合至包含殘基1-10之抗原決定部位的抗體 ，其中之殘基1及/或殘基7爲天門冬胺酸。在另一特 色中，本發明之特色係投用專一結合至Α/3而不結合至全 長澱粉狀蛋白前驅物蛋白質（ΑΡΡ )的抗體。在另一特色 中，抗體同功型爲人類IgGl。 在另一特色中，本發明之特色係投用結合至病患澱粉 狀蛋白沈積物的抗體以及誘發對抗澱粉狀蛋白沈積物之清 除反應。例如，該清除反應爲經Fc受體調節的吞噬作用 〇 本發明治療劑爲相當純的形式不含不利的污染物。此 係指藥劑一般至少約有50%w/w (重量/重量）之純度，且 實質上不含干擾蛋白質及污染物。有時藥劑至少約 80%w/w ’更佳者至少90或約95%w/w純度。然而使用習 見的蛋白質純化技藝，至少可得到99%w/w均質的肽類。 此方法可用於無症狀的及目前顯示疾病症狀之病人。 用於該方法之抗體可爲人類、人類化的、嵌合的或非人類 ’或其片段（例如抗原結合片段）以及可爲在此描述 @單株或多株抗體。在另一特色中，本發明之特色係投用 _備自人類以A沒肽免疫的抗體，人類可爲抗體治療的病 -79- 1374893 患。 在另一特色中，本發明之特色是投用含醫藥上的載體 作爲藥學組成物之抗體。此外，投用至病患的抗體可爲至 少編碼一個抗體鏈之多核苷酸。多核苷酸在病患中可表現 產生抗體鏈。視需要，多核苷酸可編碼抗體之重及輕鏈。 多核苷酸在病患中可表現產生重及輕鏈。典型的具體實施 例中，係監測病患血液中投用抗體之水準。 如此本發明可滿足治療上長期的須要以預防或改善神 經病理學，以及一些病患相關於阿茲海默氏症的認知受損 A.能治療的病人

能治療的病人包括有疾病風險但無症狀之個人，與目 前顯示症狀之病人。以阿茲海默氏症爲例，實際上任何人 只要活得夠久都有患有阿茲海默氏症之風險。因此，本發 明方法可預防性投用至一般族群而不須要任何病患之風險 評估。本發明方法尤其可用於已知有阿茲海默氏症風險的 個人。該類個人包括有親屬經歷此疾病之個人，以及經基 因或生化的標識分析測定有風險之個人。阿茲海默氏症風 險之遺傳標記包括APP基因之突變，尤其是在位置717以 及位置670及671之突變分別稱爲Hardy及Swedish突變 (參閱上述之Hardy)。其它風險標識爲早老因子基因、 PS1以及PS2、以及Ap〇E4突變，AD、高膽固醇血症或動 脈粥樣硬化之家族病史。目前確認阿茲海默氏症之病人的 -80- 1374893 標準是特徵化的痴呆症，以及具有上述說明風險因子。此 外，有許多診斷測試可檢驗AD病人。此類診斷包括測量 CSF tau以及A沒342之含量。tau上升且A/3 342之含量 減低意味著有AD之存在。ADRDA標準（討論實施例）亦 可用以診斷阿茲海默氏症的病人。 在無症狀的病患中，治療可始於任何年齡（例如：1 0 、20、30)。然而通常不須要等病患到達40、50、60或 70歲才開始治療。一般治療是於一段期間內投用多重劑量 。於一段期間內測定抗體之含量可監測治療成效。若反應 下降則可加強劑量。對可能產生唐氏綜合症病患，可在產 前對母親投用治療劑或於分娩之後立即治療。 B .治療遼程及劑量 在預防性的應用上，可對易感的病患，或有阿茲海默 氏症風險的病患投用充分劑量的藥學組成物或藥劑，以排 除或降低風險，降低嚴重性，或遲延疾病的啓動，包括疾 病的生化、組織的及/或行症狀，其倂發症以及於發展疾 病期間呈現之中間物病理的表現型。在治療的用途上，可 對可疑的病患，或已患有該疾病的病患投用充分劑量的組 成物或藥劑以治療、或至少局部地遏止疾病症狀（生化的 、組織的及/或行爲的），包括其倂發症以及於發展疾病 期間呈現之中間物病理的表現型》 在一些方法中，可對未發展出特徵化之老年痴呆症病 理學的病人投用藥劑以降低或消除肌肉認知的受損。完成 -81 - 1374893 治療的或預防性的治療之適當量的定義爲治療上或預防上 地有效劑量。在預防性的以及治療的療程中，通常投用數 個藥劑劑量直到達成充分免疫反應爲止。本文術語之"免 疫反應"或"免疫的反應"包括發展直接對抗接受患者抗原 之體液的（抗體中介的）及/或細胞的（經抗原專一的T 細胞或其分泌產物所調節）反應。該反應可爲主動的反應 ，即經投用抗原加以誘發，或被動的反應，即投用免疫球 蛋白或抗體或先導型T-細胞加以誘發。一般要監測免疫反 應，若免疫反應起始終止時則給予重覆的劑量。 本發明組成物治療上述描述症狀之有效劑量取決於許 多不同因子而變化，包括投藥方法、目標位點、病患的生 理狀態、病患是否是人類或動物、投用的其它藥物、以及 是否爲預防性的或治療性的治療。通常，病患是人類，但 亦可治療非人類哺乳動物包括導入外來基因的哺乳動物。 須要滴定治療劑量以最適北安全性及功效。 在抗體被動免疫法中，劑量範圍約0.0001至100毫 克/公斤，以及更通常約0.01至5毫克/公斤（例如0.02 毫克/公斤、0.25毫克/公斤、0.5毫克/公斤、0.75毫克/公 斤、1毫克/公斤、2毫克/公斤等）之宿主體重。例如劑量 可爲1毫克/公斤體重或10毫克/公斤體重或介於1_1〇毫 克/公斤之內’較佳者至少爲1毫克/公斤。在另一實施例 中，劑量可爲0.5毫克/公斤體重或5毫克/公斤體重或介 於〇_5-15毫克/公斤之內，較佳者至少爲丨毫克/公斤。上 述範圍之中間劑量亦預期涵蓋在本發明範圍中。病患可每 -82- 1374893 曰、隔天、每週一次或依據任何其它實驗分析流程測定， 投用該劑量。典型的治療包含長期的投用多重劑量’例如 至少六個月。其他的治療療程包含每二週或每個月一次或 每3至6個月投藥一次。典型的劑量流程包括連續投用1-1〇毫克/公斤或15毫克/公斤’隔天投用30毫克/公斤或 每週一次投用60毫克/公斤。在一些方法中’可同時的投 用兩種或多種不同結合專一性的單株抗體，在各例中，各 抗體投用劑量在本發明的範圍之內》 抗體通常是多重投用。單一劑量之投藥間隔可爲每週 一次、每月一次或每年一次。投藥間隔亦可不規則，經測 量病患血液中A/3抗體之含量而決定。在一些方法中，調 整劑量以達成血漿抗體濃度爲1 - 1 000微克/毫升以及在一 些方法中爲25 -300微克/毫升。此外，可以延釋調配物投 用抗體，其係較不須要經常投藥。 . 投用頻率的變化取決於在病患中抗體之半生期。一般 而言，人類化的抗體顯示較長的半生期、依次是嵌合型抗 體以及非人類抗體。 投藥劑量及頻率依是否爲預防性的或治療性的治療而 變化。在預防性的應用中，將內含本抗體或其混合物之組 成物投用至無疾病狀態之病患以增進病人的抗性。該劑量 之定義爲"預防性的有效劑量"。在此用途中，精確的劑量 再一次取決於病人的健康狀況狀態以及一般的免疫力，但 —般而言介於0.1至25毫克/劑量，尤其是0.5至2.5毫 克/劑量。於長期間相對不頻繁的投藥間隔可投用相對低 -83- 1374893 劑量。一些病人可在有生之年繼續接受治療。 在治療應用中，有時須要在較短投藥間隔內投用相對 高劑量（例如約1至200毫克抗體/劑量，更常用5至25 毫克之劑量）直到降低或終止疾病進展，較佳者直到病患 顯示部份的或完全的改善疾病症狀。因此本專利可在預防 性的療程中投用。 編碼抗體核酸之劑量約10毫微克至1克、100毫微克 至100毫克、1微克至10毫克 '或3 0-3 00微克DNA/病患 。感染性的病毒性載體劑量之變化爲10-100(或更多）病 毒粒子/劑量。 治療劑可非經腸的、塗覆的、靜脈內的、口服的、皮 下的、動脈內的、顱內的、腹腔內的、鼻腔內的或肌肉內 投用以進行預防性及/或治療性治療。產生免疫性的藥劑 的最具代表性投藥路徑是皮下的路徑，雖然其它路徑同樣 有效。其次最常見的路徑是肌肉內的注射。此類型之注射 最常見的是在臂或腿肌肉進行。在一些方法中，將藥劑直 接的注射入沈澱物堆積的特定組織，例如顱內的注射。肌 肉內的注射或靜脈內的灌入是抗體較佳的投藥方法。在一 些方法中，特定的治療的抗體是直接的注射入頭蓋骨。在 一些方法中，抗體用延釋組成物或裝置（例如MedipadTM 裝置）投用。 本發明藥劑可視需要結合其它至少可部份有效的治療 成澱粉樣疾病之藥劑投用。在某些具體實施例中，本發明 人類化的抗體（例如，人類化的12A11)是結合第二種產 -84- 1374893

生免疫性的或免疫藥劑投用。例如，本發明人類化的 UA11抗體可結合另一 Αβ之人源化抗體投用。在其它具 體實施例中，人類化的12A11抗體是投用至得到或是接受 AP疫苗處理之病人。在老年痴呆症的以及唐氏綜合症中 ’澱粉狀蛋白沈澱物發生在腦部，本發明藥劑亦可倂用其 它增加本發明藥劑通過血腦屏障之藥劑投用。本發明藥劑 亦可結合其它增進治療劑接近目標細胞或組織之藥劑（例 如脂球體等）投用。共投用此藥劑可降低治療劑劑量（例 如治療的抗體或抗體鏈）之須求以達成所要求的效應。 C.藥學組成物 本發明藥劑經常以藥學組成物的型式投用，其係包含 活性的治療劑以及各種其它醫藥學上可接受的成份。參閱 Remington's Pharmaceutical Science ( 15 th ed., Mack

Publishing Company, Easton, Pennsylvania ( 1 980 ))。較 佳的形式取決於預期的投藥模式以及治療的用途。組成物 亦可包括（取決於所要求的調配物）醫藥學上可接受的、 無毒的載體或稀釋劑，其定義爲通常用以調配投藥至動物 或人類之藥學組成物的載劑。選擇的稀釋劑是以不影響組 合的生物活性爲原則。該稀釋劑的實施例爲蒸餾水、磷酸 鹽緩衝的生理食鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、及 Hank's溶液。此外，藥學組成物或調配物亦可包括其它載 體、佐劑、或無毒性的、無治療的、無產生免疫性的穩定 劑等。 -85-

1374893 藥學組成物亦可包括大的、緩慢代謝的大分子例 白質、多糖例如聚乙醯殼多醣、聚乳酸、聚乙醇酸以 聚物（例如膠乳功能化的瓊脂糖（TM )、瓊脂糖、 素、及其類似者）、聚合的胺基酸、胺基酸共聚物、 質聚集物（例如油滴或脂球體）。此外，此類載體可 免疫刺激藥劑（即佐劑）。 不經腸道的方法給藥時，本發明藥劑可以注射投 含物質之生理上可接受的稀釋劑與醫藥上的載體（可 菌之液體例如：水、油類、生理食鹽水、甘油、或乙 之溶液或懸浮液。此外，組成物中可存在輔助的物質 如溼化劑或乳化劑、表面活性劑、酸鹼度緩衝物質及 似者。藥學組成物的其它成份爲石油、起源自動物、 、或合成的例如花生油、大豆油、及礦物油。一般而 乙二醇類例如丙二醇或聚乙二醇爲較佳的液體載體， 是用於注射溶液。抗體可以儲藏處注射或植入物製劑 式投用，其可用該方法調製成容許有效成份延期釋放 型的組成物包含5毫克/毫升之單株抗體，調製於50 耳濃度L-組織胺酸、150毫莫耳濃度NaCl、酸鹼度用 調至6.0之水溶性緩衝液。 組成物一般是製備成注射液（液體溶液或懸浮液 亦可製備成在注射之前適用於溶於或懸浮於溶液或液 、液體載劑之固體形式。製劑亦可乳化或封包於脂球 微顆粒例如：聚丙內酯、聚糖內酯、或共聚物以增強 討論之佐劑效應（參閱Langer，Science 249: 1 527 ( 如蛋 及共 纖維 及脂 作爲 用內 爲滅 醇） ，例 其類 蔬菜 言， 尤其 的形 〇典 毫莫 HC1 )； 懸浮 體或 以上 1990 -86- 1374893 )以及 Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28 ： 97 ( 1 997 ))。本發明藥劑可以儲藏處注射或植入物製劑的形 式投用，其可用該方法調製成容許有效成份延期釋放或搏 動的釋放。

適用於其它投藥模式的額外調配物包括口服的、鼻腔 內的、以及肺部的、栓劑、以及經皮用途的調配物。栓劑 、結合劑以及載體包括，例如：聚伸烷基乙二醇類或三酸 甘油酯；該栓劑可形成內含0.5%至10%，較佳者1%-2% 有效成份之混合物。口服調配物包括賦形劑，例如醫藥級 的甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、 及碳酸鎂。此類組成物之形式爲溶液、懸浮液、藥片、藥 九、膠囊、延釋調配物或粉末以及含有1〇%-95%，較佳者 25%-70%之有效成份。 塗覆施用可產生經皮或皮膚內的傳輸。塗覆投藥時可 共同投用霍亂毒素或解毒的衍生物或次單體其或其它相似 的細菌毒素藥劑以增加效應（參閱Glenn et al.，Nature 3 9 1，8 5 1 ( 1 99 8 ))。可使用混合物成份或化學交聯得到 的聯結分子或表現融合型蛋白達成共同投用之目的》 此外，可使用皮膚貼片或使用轉移體達成經皮的傳輸 (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25 ： 3.5 2 ( 1 995 ) ； Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1 3 68 : 2 0 1 - 1 5 ( 1 998 )) D.監測療程 -87- 1374893 本發明提供監測患有或易感老年痴呆症的病患治療療 程的方法，即監測投用於病患的治療療程。該方法可用以 監視症候性病人的治療性治療以及無症狀病患的預防性治 療。特定言之，該方法係用於監測被動免疫法（例如測量 投用抗體之水準）。 一些方法包含決定基線値，例如在投用藥劑前病患抗 體之水準或輪廓，以及比較治療後之輪廓或水準的數値。 水準或輪廓信號之數値顯著的增加（即在相同樣本之重覆 測定中大於試驗誤差，用該測定平均値的一個標準差表示 )代表正性治療結果（即投用藥劑達成所要求的反應）。 若免疫反應數値無顯著的改變、或減低則爲負性的治療結 果。 在其它方法中，控制組數値（即平均値以及標準差） 之水準或輪廓係測定自控制組族群。一般控制組族群的個 體未經過前治療。病患於投用治療劑之後將實測數値之水 準或輪廓與控制組數値相比較。相對於控制組數値顯著增 加（例如大於一個平均値的標準差）的信號代表正性或充 分的治療結果。缺少顯著增加或降低信號代表負性的或不 充分的治療結果。一般而言，相對於控制組數値其數値增 加則繼續投用藥劑。如前述，達成相對於控制組數値平台 代表可停止治療投藥或降低劑量及/或頻率。 在其它方法中，控制組數値之水準或輪廓（例如平均 値及標準差）係測定自進行治療劑治療之控制組族群的個 體，在治療之反應下其含量或輪廓已達平台。將病患實測 -88- 1374893 數値之含量或輪廓與控制組數値相比較。若病患之測量水 準與控制組數値顯著的不同（例如大於一個標準差），則 可停止治療。若病患之測量水準顯著的低於控制組數値， 則繼續投用藥劑。若病患之測量水準持續低於控制組數値 ，則要改變治療方式。 在其它方法中，對目前未接受治療但以前已進行過治 療療程之病患，監測其抗體之含量或輪廓以測定是否須要 在中斷後重新開始治療。病患之測量水準或輪廓與已進行 過治療療程之病患的可數値相比較。相對於以前的測量其 數値顯著的降低（即大相同樣本重覆測定之誤差）是代表 可恢復治療。此外，病患測量數値可與控制組數値（平均 値加上標準差）相比較以測定病人族群於進行治療之後的 效果。此外，病患實測數値可與無疾病症狀預防上地處理 的病人族群，或治療處理顯示改善疾病特性之治療族群的 病人之控制組數値相比較。所有此類案例中，相對於控制 水平顯著的降低（即大於一個標準差）是表示病患應恢復 治療。 分析之組織樣本一般爲病患之血液、血漿、血清、黏 液流體或腦脊髓液。分析樣本的例如Αθ肽抗體之含量或 輪廓，例如人類化的抗體之含量或輪廓。偵測專一對抗A 冷之抗體的ELISA之方法描述於實施例。在—些方法中， 投用抗體之水準或輪廓係使用清除測定加以測定，例如在 此描述之活體外吞噬作用測定。在該方法中將病患之測試 組織樣本與澱粉狀蛋白沈澱物（例如來自PDAPP小鼠） -89- 1374893 以及帶有Fc受體之吞噬細胞接觸。然後監測後續澱粉狀 蛋白沈積物的清除。清除反應之存在及程度代表抗體有效 的清除測試病患的組織樣本中之存在性及水準。 被動免疫後之抗體輪廓一般顯示抗體濃度之立即吸收 峰接著以指數型式衰變。無進一步的劑量下，在數天至數 月（取決於投用抗體之半生期）後衰退至前處理之含量。

在一些方法中，在投藥之前進行病患中 Α/3抗體之基 線測量，進行第二個測量測定吸收峰抗體水準，以及在投 藥間隔中進行一個或多個進一步的測定監視抗體含量之衰 退。當抗體之水準衰退至基線或少於基線預定的吸收峰百 分比（例如50%、25%或10% )，則進一步的投用抗體劑 量。在一些方法中，吸收峰或後續測量之少於背景値的含 量可與其它病患先前測定構成有利的預防性的或治療性的 治療療程之參考値相比較。若測量之抗體水準顯著的少於 參考値（例如少於平均値減去自治療受益之病人族群參考 値的一個標準差），則要額外的投用抗體劑量。 其他方法包括經硏究人員或醫生以例行的程序監測（ 於治療療程）任何經技藝確認的生理症狀（例如：物理或 精神的症狀），以診斷或監視成澱粉樣疾病（例如阿茲海 默氏症）。例如可監視認知的受損。後者是阿茲海默氏症 以及唐氏綜合症症狀但亦可爲非此類疾病之症狀》例如， 可由病人在Mini-Mental State Exam上的分數於治療療程 中監測認知的受損。 -90- 1374893 E. 組套 本發明進一步的提供進行上述監測方法的組套。一般 該組套含有專一結合至AyS抗體的藥劑。組套亦可包括標 記物。爲了偵測到A石抗體，標記物一般是標記的抗-特 異型抗體的形式。爲了偵測到抗體，提供的藥劑可預先結 合至固相’例如結合至微滴定盤之微孔。組套一般亦可含 有使用組套之指示。該指示亦可包括測量標記物之A沒抗 體含量的圖式或其它相關事物之含量。本文術語之指示意 指在任何生產、運輸、販賣、或使用期間，組套中任何附 帶的書寫或紀錄材料。例如，本文術語之指示包含廣告卡 、以及小冊子、包裝材料、說明、錄音或錄影卡式盒、電 腦磁碟、與直接書寫在組套上的文字。 本發明亦提供診斷的組套，例如硏究、偵測及/或診 斷的組套（例如進行活體內影像分析的組套）。該組套一 般含有結合A/3抗原決定部位（較佳者於殘基！·！〇)之抗 體。較佳者，抗體爲標記的抗體或可用組套內之二級標記 試劑標記。較佳者，組套標示進行預期用途的說明，例如 進行活體內影像測定。典型的抗體描述於此。 F. 活體內造影 本發明提供病患活體內影像化澱粉狀蛋白沈澱物的方 法。該方法適用於診斷或證實阿茲海默氏症之診斷，或其 易感性之診斷。例如，該方法可用於呈現痴呆症症狀之病 患。若病患有異常的澱粉狀蛋白沈澱物，則該病患可能患 -91 - 1374893 有阿兹海默氏症。該方法亦可用於無症狀的病患。出現澱 粉狀蛋白異常的沈澱物意指對未來的症候性的疾病具有易 感性。該方法亦可用於監測疾病進展及/或先前已診斷出 阿茲海默氏症病人對治療之反應。 該方法可對病患投用試劑（例如結合至Ayg之抗體） ’然後於結合之後偵測藥劑。較佳的抗體係結合至病患的 A召沈澱物而不結合全長之APP多肽。尤佳的抗體係結合 至A/3胺基酸1-10的抗原決定部位。在一些方法中，抗 體係結合至胺基酸7-10之抗原決定部位。該抗體可 結合而不誘導實質上的清除反應。在其他方法中，抗體結 合至A/3胺基酸1-7之抗原決定部位。該抗體可結合以及 誘發ΑΘ之清除反應。然而使用缺少全長恆定區（例如

Fabs )抗體片段可避免清除反應。在—些方法中，相同抗 體可作爲治療及診斷的試劑。一般而言，結合APC-端至 殘$ 10之抗原決定部位的抗體和結合至抗原決定部位殘 基1-10之抗體不同，無強烈的信號，可能因爲澱粉狀蛋 白沈澱物不會露出C-端之抗原決定部位。據此該抗體較差 〇 診斷的試劑可經靜脈注射，或直接的經顱內的注射投 用至腦部或在頭顱鑽孔投用至病患身體。試劑劑量應與治 療方法之範圍相同。一般試劑是標記的，雖然在一些方法 中’具A办親和力的一級試劑是未標記的以及使用二級標 記藥劑結合至一級試劑。標記之選擇取決於偵測裝置。例 如’螢光標記適用於光學偵測。使用順磁性的標記適用於 -92- 1374893 斷層χ線檢驗的偵測而非外科手術。放射性的標記亦可使 用PET或SPECT偵測。 診斷係比較對應的基線値與標記的基因座之數量、大 小、及/或強度》基線値可代表族群中無疾病個體的平均 値。基線値亦可代表在相同病患以前測定的含量。例如， 在病患開始治療之前可測定基線値，以及然後比較基線値 與實測數値。相對於基線信號降低數値代表治療之正性反 應。 【實施方式】 本發明將用下列非限制實施例作更完全的描述。 實施例 下列序列辨識符號係用於實施例，意指免疫球蛋白鏈 變異區核苷酸以及胺基酸序列。

-93- 1374893 抗體 VL核苷酸序列 VL胺基酸序列 VH贿酸序列 VH胺基酸序列 12Α11 序列確認號碼:1 (編碼） 序列確認號碼:2 序列確認號碼:3 (編碼） 序列確認號碼:4 12Α11 vl 序列確認號碼:34 序列確認號碼:7 序列確認號碼:35 序列確認號碼:10 12Α11ν2 序列確認號碼:7 序列確認號碼:13 12A1W2.1 序列確認號碼:7 序列確認號碼:14 12A1W3 序列確認號碼:7 序列確認號碼:15 12Α11ν2 序列確認號碼:5 序列確認號碼:6

本文中包含序列確認號碼：1 - 4之VL及/或VH序列 的任何抗體或者免疫球蛋白序列可包含完整序列或可包含 成熟的序列（即成熟的肽而無信號或領導肽）。 以前的硏究展示有可能在活體內經抗體體外結合噬菌 斑（例如在PDAPP或AD腦部切片部分）之能力及/或啓 動體外溶菌斑清除行動之吞噬作用分析（Bard et al.( 2000 ) Nat. Med. 6: 916-919)預測各種Αβ抗體在降低 AD-相關的神經病理學（例如溶菌斑負擔）之功效。此相 互關係證實經微型的神經膠質細胞及/或巨噬細胞之Fc-依 存的吞噬作用是在活體內清除溶菌斑的重要作用。然而， 亦有報導指出在生物體內經Fc交互作用非依存的機制亦 可得到抗體功效（Bacskai et al.( 2002) J. Neurosci. 22 :78 73 -78 78 )。有硏究指出直接對抗Αβ中間部分的抗體 (不能識別澱粉樣噬菌斑），可結合至溶解的Αβ以及減 -94- 1374893 低溶菌斑 a-*(DeMaltosetal.( 200 1 )Prot.Natl. Acad. Sci. USA 98 ： 8 85 0-8 85 5 )。 爲了特徵化鼠科動物單株抗體12A11C同功型免疫球 蛋白G1)在生物體內可能之功效，先進行各種體外測定 mAb 12A11對Αβ1-42之抗體親抗原性。進行酵素聯 結免疫抗體檢測法單株抗體12Α 11與聚集的合成的Αβί-42 之結合，如描述於 Schenk, et al.( Nature 400: 173 (

1 999 ))。爲了比較，亦測定mAbs 12B4,以及10D5。可 溶解的Αβ1-42意指合成的Αβ1-42肽以超音波振盪溶於甲 基亞颯（DMSO )。系列稀釋抗體至 20微克/毫升，與 50,000 cpm 〔 125〕A1-42 ( 190 uCi/umol;以蛛化法試劑 標記）在室溫下反應過夜。將內含75毫克/毫升蛋白質A 瓊脂糖（Amersham Pharmacia)以及 200微克兔子抗-小 鼠免疫球蛋白克（H + L) (Jackson ImmunoResearch)之 五十微升泥漿和稀釋抗體在室溫下反應lh，清洗雨次， 以及用Wallac γ計數器（Perkin-Elmer)計數。所有步驟 是在RIA緩衝液之內進行，RIA緩衝液係由10毫莫耳濃 度三羥甲基胺基甲烷、0.5 M NaCl、1毫克/毫升明膠、以 及 0.5%Nonidet P-40，酸鹼度 8.0 組成。 抗體親抗原性硏究之結果展示於以下的表2» -95- 1374893 表2. 抗體 抗原決定部位 同功型 聚集的Αβ1-42 捕獲可溶解的 之 ro50 (ρΜ) Αβ 1-42 之％ 10D51 Αβ3-7 免疫球蛋白G1 53 1 12Β4' Αβ3-7 免疫球蛋白G2a 667 δ 12Α11 Af33-7 免疫球蛋白G1 233 30

1抗體10D5以及12B4分別地詳細描述於w〇 02/46237以 及國際專利申請案序號PCT/US03/077 1 5。 *比較上’抗體266在10微克/毫升下捕獲70%之Αβ1-42 各種抗體（包括12Α11)捕獲可溶解的Αβ之能力進 —步的測定如下。將各種濃度之抗體（多至10微克/毫升 )與 50,000 CPM 之 Ι25Ι-Αβ1-42 (或 Ι25Ι-Αβ1-40)反應。 以捕獲式放射性免疫分析測定充分的結合25%之放射性的 計數之抗體濃度。未捕獲25%之放射性的計數之抗體，測 定在10微克/毫升抗體下之結合百分比。12Α 11在10微克 /毫升下結合20%之放射性的計數（即125Ι-Αβ)。大於其 它二測試Αβ3-7抗體（12Β4以及10D5)的結合量（在10 微克/毫升下之結合量分別爲7%以及2% )。因此，在測 試抗體之Ν-端（抗原決定部位Αβ3-7) ，12Α11-展示捕獲 Αβ最多的能力。 所有的測試抗體均展示對聚集的Αβ1-42之高抗體親 抗原性。 -96- 1374893 此外’抗體12B4以及12A11在抗體濃度20微克/毫 升下明顯地捕獲可溶解的Αβί-42。如展示於表2，免疫球 蛋白G1抗體12Α11捕獲Αβ1-42比免疫球蛋白G2a抗體 12B4或免疫球蛋白G1抗體10D5更有效。

爲了測量抗體啓動Fc-調節的溶菌斑清除行動之能力 ’亦比較抗體對一級小鼠微神經膠質細胞體外之吞噬作用 以及PDAPP小鼠之腦組織切片。使用不相干的免疫球蛋 白G1以及免疫球蛋白G2a (不與Αβ或其它分析成份反應 之抗體），作爲同功型相配的負控制組。簡言之，將鼠科 動物一級微神經膠質細胞和未固定的低溫切片之PDAPP 小鼠腦部在抗體存在下培養。培養24 h之後，經酵素聯 結免疫抗體檢測法測量培養中Αβ之總量。定量溶菌斑清 除行動/Αβ降解之程度。從培養之微神經膠質萃取Αβ以 及將腦切片（η = 3)經8 Μ尿素處理進行酵素聯結免疫 抗體檢測法分析。用ANOVA，接著用事後Dunnett's測試 分析數據。 如展示於圖1，12B4抗體降低 Αβ之效能（73%， 12Β4 ; Ρ<〇·001 )在統計上顯著的少於 12Α11 ( 48% , 12Α11，Ρ<〇·〇5) 。10D5抗體未能顯著的減少Αβ之含量

。12Α 11在體外吞噬作用之效能在轉化成免疫球蛋白G2 A 同功型（微神經膠質呑噬作用較佳的同功型）後可加以己女 良。 實施例Π :小鼠1 2 A 1 1抗體在生物體內之功效 -97- 1374893 小鼠抗體12A11在活體內降低類阿茲海默症之神經病 理學。

爲了測定在活體內12A11之功效，經每週一次的腹膜 內注射爲期6個月投用10毫克/公斤之抗體（包括12A 11 、12B4、或 10D5)至小鼠，如描述於 Bard et al.(2000 )Nat. Met/ 6: 916。硏究之後，經酵素聯結免疫抗體檢 測法測定Αβ之總含量。如圖2A展示，相較於PBS對照 組各抗體顯著的降低總Αβ之含量（P<0.001)，即12B4 顯示69%之降低，10D5顯示52%之降低，以及12A1 1顯 示3 1 %之降低。

然後在上述小鼠的腦組織切片內檢查神經失調之水準 ，測定溶菌斑清除行動以及保護神經元的相關性。從腦影 像分析數據檢查神經萎縮暫據額骨皮質的百分比，展示於 圖2B。經在此描述之分析測定，此類數據顯示抗體10D5 以及12A1 1未能如12B4般有效的在降低神經失調（12B4 ，P<0.05 ; ANOVA 接著事後 Dunnetts 測試）。再一次， 12A1 1之活性，經轉換成免疫球蛋白G2a同功型（鼠科動 物功效）可加以改良。針對1 2 A 1 1人類化的版本，免疫球 蛋白GI同功型是降低神經失調較佳的版本。 展現抗體12A11之結合性質以及在活體內功效的實驗 亦描述於 Bard. etalPA AS 100: 2023 (2003)，全文在 此并入參考文獻。 總之，在體外分析所有抗體對聚集的Αβ均具有顯著 的抗體親抗原性以及可啓動溶菌斑清除行動。免疫球蛋白 -98- 1374893 G2a同功型（具Fc受體親和性，尤其是FcYRl)對清除 Αβ以及保護對抗神經失調至爲重要。抗體12Α11 (免疫 球蛋白GI)捕獲可溶解的單體Αβ1-42比12134(免疫球 蛋白G2a)或10D5(免疫球蛋白G 1)更有效，但在降低 神經失調則較無效力。增強降低溶菌斑負擔以及降低神經 失調之功效可經構建具有最大吞噬作同功型之抗體達成。 尤其有效的抗體是結合至Α βΝ-端抗原決定部位之抗體。

實施例III :選殖以及定序小鼠12Α1 1之變異區 12Α1 VH之選殖以及序列分析。使用融合瘤之傳訊 RNA以及標準選殖方法學經RT-PCR以及5' RACE選殖融 合瘤細胞12A1 1之VH及VL區域。源自二種非依存的 cDNA選殖株，編碼假定12A11 VH結構區之核苷酸序列 (序列確認號碼：3 )以及推演之胺基酸序列（序列確認 號碼：4)分別列於表3及表4。 表3. 小鼠1 2A1 1 VH之DNA序列。

ATGGACAGGCTTACTACTTCATTCCTGCTGCTGATTGTCCCTGCATATGTCTT

GTCCCAAGTTACTCTAAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGAAGCCCTCACAG

ACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTAT

GAGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGC

ACACATTTGGTGGGATGATGATAAGTACTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGG

CTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGAAACCAGGTATTCCTCAAGATCACCA

GTGTGGACACTGCAGATACTGCCACTTACTACTGTGCTCGAAGAACTACTAC GGCTGACTACTTTGCCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (序列確認號碼：3 ) -99- 1374893 表4.小鼠12A11 VH之胺基酸序列

mdrlttsflllivpayvlsQVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLStsgmsvgWIRQPSGKG LEWLAhiwwdddkyynpslksRLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARrtttadyfa

yWGQGTTLTVSS (序列確認號碼：4 ) *小寫字型是領導肽以及CDR。

12A1 VL之選殖以及序列分析。12A1 1輕鏈可變的 V L區域係用選殖V Η區域類似的方法加以選殖。源自二種 非依存的cDNA選殖株，編碼假定12Α1 1 VL結構區之核 苷酸序列（序列確認號碼：1 )以及推演之胺基酸序列（ 序列確認號碼：2 )分別列於表5及表6。 表5.小鼠12A1 1 VL之DNA序列。

ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAG

CAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAG

ATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGG

AAACACCTACTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCT

CCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGT

GGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCT

GAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAAGTTCACATGTTCCTCTCACGTT CGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA (序列確認號碼：〇 -100- 1374893 表6.小鼠12A11 VL之胺基酸序列

mklpvrllvlmfWipasssDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCrssqsivhsngntyleWYLQKPGQ

SPKLLIYkvsnrfsGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCfqsshvpltFGAGTK

LELK (序列確認號碼：2 ) #小寫字型是領導肽以及CDR。

12A1 1 VL以及VH序列符合V區域功能標準，從開始 的甲硫胺酸至C-區域含有ORF疊連群，以及分享免疫球 蛋白V區域基因之守恆殘基特徵。從N-端至C-端，此輕 及重鏈包含 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 以及 FR4結構區。 實施例IV:表現嵌合型12A11抗體 表現嵌合型12A 11抗體：將可變的重及輕鏈區域分別 再構建入編碼VDJ或VJ接合點接合供體序列下游，以及 將重鏈選殖入哺乳動物的表現載體pCMV-ΙιγΙ，將輕鏈選 殖入pCMV-hKl»此類載體於插入的變異區卡式盒下游編 碼人類γΐ以及Ck恆定區之外子片段。序列驗證後，將重 鏈及輕鏈表現載體共轉染COS細胞。將各種重鏈質體分 別與不同嵌合的輕鏈質體共轉染以證實結果之重現性。使 用蛋白質A瓊脂糖將抗體自COS細胞條件化的培養液中 免疫沈澱。在SDS-P AGE凝膠之免疫墨點上偵測抗體鏈。 使用山羊-抗-人類-免疫球蛋白克（H + L)抗體在1:5000 稀釋、室溫下反應1小時完成檢測。在條件化的培養液內 -101 - 1374893 偵測到顯著量之12A11 H + L鏈。 用ELISA測試嵌合型12A11抗體與A沒之直接地結合 。圖4顯示嵌合型12A11以高抗體親抗原性結合至A/3， 此與嵌合的以及人類化的3D6相似。（選殖、鑑定及人類 化3D6描述於美國專利申請案序號1〇/〇1〇, 942，全文在此 倂入參考文獻。）結合抗體親抗原性亦與嵌合的以及人類 化的12B4相似。（選殖、鑑定及人類化12B4，描述於美 國專利申請案序號1 0/3 88,214，全文在此併入參考文獻。

實施例V :人源化之12A1 1 A. 12A1 1之人源化抗體，版本1

同源性/分子模型分析。爲了在鼠科動物1 2 A 1 1抗體 之內鑑定關鍵性的結構構架殘基，利用三度空間模式之硏 究以解析決鼠科動物抗體與12A11重及輕鏈的同源性。選 擇一個與12A11輕鏈具有接近的同源性之抗體（稱爲1 KTR)以及二個與12A11重鏈具有接近的同源性之抗體抗 體（稱爲1 ETZ以及1 JRH)。此類小鼠抗體和12A11具 有強烈的序列守恆性（Vk的1 1 2個胺基酸中有94%相同 以及Vh的121個胺基酸中有83%相同）。1 ETZ之重鏈 結構是與1KTR重疊。此外，Vk中選擇抗體的CDR環路 與12A1VL之CDR環路中之規範的Chothia構造同類。在 此類抗體之晶體結構中檢視預計在抗體功能中重要殘基（ 例如，C D R構形中重要的F R殘基等），以及與功能上相 -102-

1374893 似的12A1 1抗體進行比對。 選擇人類之受體抗體序列。經電腦比對小j 基酸序列與習知的人類抗體序列，確認適當的. 體序列。分別進行12A1 1重鏈，輕鏈之比對。ί 經使用 NCBI BLAST (經 National Institutes NCBI網際網路伺服器公開存取）以各鼠科動ί[ 詢問NCBI Ig資料庫以確認人類抗體其架構序; 物VL及VH架構區域展現高度序列相似性之_ 區。 基於下列標準：（1 )和主題序列之同源性 供體序列分享規範的CDR構造；以及（3 )在損 不含任何稀有的胺基酸殘基選擇二個候選序列 列。在NCBI Ig非多餘的資料庫中選擇的VL今 BAC01733。在NCBI Ig非多餘的資料庫中選擇启 序列是AAA69734。第一版本的人類化的12A11 用此類選擇的受體抗體序列。 胺基酸殘基之取代。如上述，本發明人類伯 含實質上人類免疫球蛋白（受體免疫球蛋白）纪 區以及實質上小鼠免疫球蛋白12Α11(供體免g 的互補性決定區域。確認12A11之互補性決定！ 的人類受體免疫球蛋白後，下一步驟是測定是召 中有任何殘基應經取代以最適化產生的人類化技 變異區胺 類受體抗 定言之， of Health 架構序列 與鼠科動 變的結構 ;(2 )和 架區之內 爲受體序 體序列是 J VH受體 抗體係使 的抗體包 可變構架 球蛋白） 域及適當 此類成份 體的性質 -103- 1374893 重新塑造輕鏈V區域： 重新塑造之輕鏈V區域其胺基酸序列對比展示於圖 5A。從相同之人類亞類（相當於鼠科動物V區域）選擇 之受體構架（BAC01 733) ’無獨特的構架殘基，以及此 CDR屬於相同之Chothia規範結構基團。在版本1之人類 化的12A11內，無返回突變。 重新塑造重鏈V區域：

重新塑造之重鏈V區域其胺基酸序列對比展示於圖 5B。從人類亞類III (如先前描述）選擇受體構架（ AAA69734 )以及不含獨特的構架殘基。鼠科動物VH鏈（ 1 ETZ以及1 JRH)之結構分析，AAA69734與至鼠科動物 序列之胺基酸序列比對，在版本1重新塑造之重鏈（vl ) 內發現9個返回突變：分別爲A24F、T28S、F29L、V37I 、V48L、F67L、R7 1 K、N73T、L78V (依 Kabat 編號）。 在胺基酸序列比對內，回復突變經星號標示，展示於圖 5B » 9個回復突變中，3個爲係依模型發現，因爲該殘基 是規範的殘基（A24F、F29L、&R7IK，經紅色盒子標示） ，即由於靠近CDR殘基的緣故其爲可促成抗原結合之構 架殘基。次重要的回復突變是涉及VH-VL包裝交互作用 (經藍色盒子標示）之介面殘基，即V37I。N73T突變是 在沿著結合部位之游標殘基（綠盒）上，可能與鄰近的 CDR1之 S30交互作用。剩下的4個回復突變（T28S、 -104- 1374893 V48L、F67L、L78V，Kabat編號）殘基亦爲游標殘基（間 接的構成CDR構形，經綠色盒子標示，圖5B)。 倂入版本1之人類化的12A1 1其改變之摘要列於表7

表7.人類化的12A1 l.vl中改變之摘要 改變 VL (112 殘基） VH (120 殘基） Hu->Mu構架 0/112 9/120 CDR1 5/16 6/7 CDR2 3/7 10/16 CDRS 6/8 8/11 Β Hu->Mu 14/1 12 (12.5%) 33/120 (27.5%) Mu->Hu :構架 11/112 26/1 20 返回突變註記 沒有 1. 規範：A24F，F29L，R71K 2. 包裝：V37I 3. 游標·· T28S，V48L，F67L， N73T，L78V 受體註記 4.基因資料庫編號BAC01733 7.基因資料庫編號AAA69734 ( H1-分類卜H2=分類3) 5.與供體小鼠相同規範的構 8.與供體小鼠相同規範的構造的 造的CDR ; CDR 6.免疫球蛋白κ輕鏈K64 ( AIMS4) 9.胎兒Ig -105- 1374893 表8以及9分別爲各種輕及重鏈之Kab at編號檢索表 表8. 12A11輕鏈的Kabat編號檢索表 小鼠 人類 A19- KAB 12 All 12 All BAC 菌株 # # 麵 VL VL 01733 評論 2 34567891011121314151617181920212223 1 2 FR1 34567891011121314151617181920212223 D V lmtqtplslpvslgdqasisc

D V VMTQSPLSLPVTPGEPASISC

D V VMTQSPLSLPVTPGEPASISC

D I VMTQSPLSLPVTPGEPASISC 游 -106- 1374893 24 25 26 27 27A 27B 27C 27D 27E 28 29 30 31 32 33 34 24 CDR1 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 FR2 50 51 52 53 54 55 56 55 56 57 58 59 60 61 CDR2 rssqsivhsngntyle wylqkpgqspklliy kvsnrfs rssqsivhsngntyle wylqkpgqspqlliy kvsnrfs rssqsllhsngynyld wylqkpgqspqlliy lgsnras rssqsllhsngynyld wylqkpgqspqlliy lgsnras 健sill -107- 1374893 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 FR3 89 90 91 92 93 94 95 96 97 94 95 96 97 98 99 100 101 102 CDR3

GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYC FQSSHVPLT

GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQSSHVPLT

GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC MQALQTP GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAED.VGVYYC MQALQTPYT -108- 1374893

98 103 FR4 F F F 99 104 G G G 100 105 A Q Q 101 106 G G G 102 107 T T T 103 108 K K K 104 109 L L L 105 110 E E E 106 111 L I I 106A 112 K K K 包裹

-109- 1374893 表9. 1 2A1 1 # 1 2 3 4 5 6 重鏈的Kabat編號檢索表 小鼠 人類 麵 12 All 12A11 AAA # YE VHvl 69734

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718192021222324252627282930 FR1 qvtlkesgpgilkpsqtlsltcsf sgfs l s qvqlvesgggvvqpgrslrlscaf sgfs l s qvqlvesgggvvqpgrslrlscaa sgft f s

567123 line 評論 Q V 游動 Q L V E S G G G V V Q P G R s L R L S c A A VI之HI回復 突變爲正規 s G 正規 F 正規 T 游動，接近VI 之H1回復突變 F VI之H1回復 突變爲正規 S -110- 1374893

31 32 33 34 35 35A 35B 31 CDR1 32 33 34 35 36 37 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 FR2 49 51 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 CDR2 tsgmsvg wirqapgkglewl a hiwwdd -dkyynpslks tsgmsvg wirqpsgkglewl a hiwwdd - dkyynpslks SYAMH · - wvrqapgkglewv a visydgsnkyyadsvkg s Y A Μ Η

W V包裹-VI之回復突變 R Q 包裹 A P G K G L 包裹 E W 包裹 V 游動(接近H2)-VI之回復突變 A V I S Y D G S N K Y Y A D S Vκ G -111 - 1374893 67 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9012-Asy3456700901234 66 6 6 7 7 77 7 7 7 7 7 7888828282888888899999 R L TISK D T srnqv flkitsvdtadtatyycar R3 F 89 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1234567890123456789 66 7 7 7 7 77 7 7 7 7 8 8888888889999999999

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SKNTV YLQMNSLRAEDTAVYYCAR

RF TISR DN SKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAR

R F TISRDN SKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAR 游動(接近H2,可與 L63相互作肋-VI 之回復突變 VI之H2回復突變 爲腿 游動(結合部鹏 緣，可與S30相互 作用)-Vl之回復 突變 游動(被H1包埋， 可與V35A相互作 用)-VI之回復突變 包裹 包裹 -112- 1374893

D

A

K

L

L

M

L

L

I S 包裹

- D 95 100 CDR3 R R R 96 101 Τ T H 97 102 Τ T S 98 103 Τ T S 99 104 A A S 100 105 D D W 100Α 106 Y Y Y 100Β 107 F F Y 101 108 A A G 102 109 Y Y M - - D - - V 103 110 W W W 104 111 G G G 105 112 Q Q Q 106 113 G G G 107 114 FR4 T T T 108 115 T T T 109 116 L V V 110 117 T T T 111 118 V V V 112 119 s S S 113 120 s s S

G

A

K

G

Q w s

P s

L 人類化的抗體與Αβ專一的結合親和力宜至少爲i〇7 、108、10或101Q Μ」。通常人類化的抗體與Αβ結合親和 力之上限在12Α11的三、四或五倍之內（即約1〇9 Μ·1) 。通常結合親和力之下限亦在12Α11的三、四或五倍之內 組裝以及表現人類化的12Α1 1 VH以及VL，版本I 使用PCR-調節的組裝以適當的寡核苷酸引子產生hv 1。人類化的12A1 1 VL之核苷酸序列（版本1 )(序列確 認號碼：3 4 )以及1 2 A 1 1 V Η (版本1 )(序列確認號碼： 3 5 )分別列於以下之表1 0以及1 1。 -113- 表10.人類化的12A11 VLvl核苷酸序列。

atgaggctccctgctcagctcctggggctgctgatgctctgggtctctggctccagtgggGATGTTGTGAT

GACCCAATCTCCACTCTCCCTGCCTGTCACTCCTGGAGAGCCAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGA

GCATTGTGCATAGTAATGGAAACACCTACCTGGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTC

CTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGA

TTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAAGTTCACATG

TTCCTCTCACCTTCGGTCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA (序列確認號碼：34 ) (大寫者僅爲VL部分）經A19種系序列編碼之領導肽源 自X6397領導肽》 表11.人類化的12A1 1 VHvl核苷酸序列。

atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttctgagaggtgtccagtgtCAAGTTCAGCTGGT

GGAGTCTGGCGGCGGGGTGGTGCAGCCCGGACGGTCCCTCAGGCTGTCTTGTGCTTTCTCTGGGTTTTCAC

TGAGCACTTCTGGTATGAGTGTGGGCTGGATTCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACAC

ATTTGGTGGGATGATGATAAGTACTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTC

CAAAAACACCGTGTACCTCCAGATGAACAGTCTGCGGGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACTGTGCTCGAA

GAACTACTACCGCTGACTACTTTGCCTACTGGGGCCAAGGCACCACTGTCACAGTCTCCTCA (序列確認號碼：3 5 ) 領導肽（小寫），源自 VH供體序列編號 M3 403 0.1 / aaa69734/M72 人類化的1 2A 1 1 VL (版本1 )(序列確認號碼：7 ) 以及1 2 A 1 1 VH (版本1 )(序列確認號碼：1 0 )之胺基酸 序列是分別描述於圖5A以及5B。 8.人類化的12六11抗體-版本2、2.1以及3 游標殘基（例如S28T、V48L、F67L、L78V )係間接 的參與CDR構形所以假設它對構形擾動較不重要。目標

的殘基是使用Strategene組套以及hl2All VH vl之pCRS -114- 1374893 質體作爲突變的模版進行定點突變產生對應版本2之菌落 。將經定序証實V-插入區域之版本2次選殖到重鏈表現 載體 pCMV-Cgammal之 BamHl/Hindlll位點以產生重組 hl2Al 1 v2抗體。除了在位置T73N之外以同樣地方法產 生具有上述游標殘基突變（即除去返回突變）之版本2.1 的抗體。除了在位置K7 1 R之外以同樣地方法產生具有上 述突變S28T、L48V、L67F、V78L及T73N之版本3的抗體。

C.人類化的12A11抗體-版本4至6 此外設計在規範的以及包裝殘基保持返回突變但一個 (版本4.1至4.4)、二個（版本5.1至5.6)或三個（版 本6.1至6.4)游標殘基消除返回突變之人類化的12A11 版本。進行定點突變以及建築無性系如描述於以上C之次 部份。重組抗體是在COS細胞之內表現以及純化自COS 細胞懸浮液。其他的版本可包含結合上述，例如人類殘基 1、2、3、4或5游標殘基與至少一個包裝及/或規範的殘 基（例如，人類殘基位置28、37、48、67、71以及78或 人類殘基位置28、37、48、67、71、73以及78)的版本 D.人類化的12A11抗體-版本7以及8 人類化的12A11之第七版本，除了在殘基28(游標 )之T至S返回突變以及殘基37(包裝）之V至I返回 突變以外，具有版本1之各返回突變。人類化的12A11之 -115- 1374893 第八版本，除了在殘基73(游標）之N] 外，具有版本1之各返回突變。人類化的 及8重鏈之胺基酸序列分別爲序列確認號 〇 當相較於版本1，版本7僅含有7個 返回突變具有保守性以及在版本7之重鏈 本7內亦刪除包裝殘基V3 71之返回突變 1，版本7僅含有8個返回突變。在版本J (游標）返回突變。 其他版本可包含上述，例如在殘基β 以及73上刪除1、2、3、4 (或者5 )個 返回突變）之組合，可視需要在至少一個 位置37)及/或至少一個規範的殘基刪除 實施例VI :人類化的1 2 A 1 1抗體之功能測 人類化的12A11版本1之選殖如描述 類化的12A11是在COS細胞內經短暫的 依據技藝上確認的方法純化。人源化抗體 是經定性的酵素聯結免疫抗體檢測法分析 。人類化的12A 11版本1可進一步的和它 嵌合的相對物比較二種性質：抗原結合（ 聯結免疫抗體檢測法）以及相對的親和性 結合活性是以定量的Αβ表示。酵素聯結 巨Τ返回突變以 12Α1 1版本7以 碼：3 0以及3 1 返回突變。T28S 內被刪除》在版 。當相較於版本 i內，刪除Ν 7 3 Τ :置 28 、 48 ' 78 殘基（例如刪除 包裝殘基（例如 返回突變之組合 試 於實施例V。人 表現製作，以及 之結合活性首先 (數據未顯示） 的鼠科動物以及 定量的 Α β酵素 。h 1 2 A 1 1 v 1 之 免疫抗體檢測法 -116- 1374893 的結果發現彼與鼠科動物以及嵌合形式之12A11相同（參 閱圖7)。

經競爭性Αβ酵素聯結免疫抗體檢測法，顯示hi 2A 11 v 1抗體之親和力亦與鼠科動物以及嵌合的12AU抗體相 似。爲了進行競爭性結合分析，使用生物素共軛結合的重 組小鼠12A11 Cy2a(同功型轉換的12A11)。生物素化之 rnl2All Cy2a聚集Αβΐ-42的結合活性，如報導般是經酵 素聯結免疫抗體檢測法分析使用鏈霉和素- HRP証實。如 報導般使用HRP共軛結合的山羊抗-小鼠HRP，直接比較 所有二種異構形式12Α11 (Cyl、Cy2a)之結合，証實生 物素共軛結合的重組12A1I Cy2A與原本的Cyl小鼠抗體 相似。 使用生物素共軛結合的ml2All Cy2a在固定濃度和一 個檢驗抗體濃度範圍競爭之競爭結合硏究示於圖8。圖8 顯示hl2Al lvl與hl2Al 1 v 1和嵌合的以及鼠科動物形式 競爭性分析比較之結果。人類化的12Allvl和它的鼠科動 物以及嵌合的相對物之競爭介於2X IC5Q數値之內。此數 據和使用Biacore技術（數據未顯示）測定之親和力一致 ，鼠科動物CY2a以及hl2Al 1 vl之KD値分別爲38nM以 及23 nM。總之此發現暗示hl2Allvl保留它原本的鼠科 動物相對物之抗原結合性質以及親和性。 將COS細胞短暫的轉染不同的人類化12A11 VH以及 h 1 2A 1 1 VLv 1之組合。轉染後72小時，收集條件化的培 養液。從轉染COS細胞的條件化培養液中經定量的人類 -117- 1374893 免疫球蛋白G酵素聯結免疫抗體檢測法測定抗體之濃度。 定量的Αβ( 1-42)聚集體結合分析証實hl2All v2、v2.1 以及v3與hl2Allvl以及1嵌合的12A11對抗原之結合 相似。此外，結合分析測試顯示版本51-5.6以及6.1-6.3 展示相似的結合活性。版本6.4顯示在分析試驗中喪失— 些活性，但v2則恢復顯著的活性。 亦使用B1A核心技術比較鼠科動物12A11以及 hl2Allvl之結合性質。當暴露至低-或高-密度固定化Αβ 肽（生物DAE肽）時，鼠科動物12Α11以及hl2Allvl展 示相似的結合輪廓。亦進行鼠科動物1 2 A 1 1相對於 hl2All vl之動力分析》在此類硏究中，使用EBIAcore核 心技術測量可溶解的抗體與固相結合的生物素化的DAE 肽之結合。然後將肽固定在抗生蛋白鏈菌素生物感測器晶 片上，三重覆施用各種濃度之各抗體以及測量結合與時間 之函數。使用B1A評估軟體以二價的模型分析動力的數據 。從感測器適當的區域使用完整的分析計算視分解（kd ) 以及結合（ka)速率常數。從動力的速率常數計算生物 DA E10與抗體間之交互作用的親和力常數。從此類測定 取得視分解（kd)以及結合（ka)速率常數以及用以計算 交互作用之KD値。表12包括經B1 Ac ore分析測定之Αβ 結合12Α11抗體的動力分析之摘要》 -118- 1374893 二價的模型G 整體分析） 抗體 ka (1/Ms) kd (1/s) KA (1/M) KD (nM) Chi2 ml2All 1.05E+05 3.98E-03 2.64E-07 38.00 0.247 hl2Allvl 1.47E+05 3.43E-03 4.29E+07 23.30 0.145 此數據指出人類化的12A1 1 vl當相較於親代的鼠科

動物12A1 1與Αβ肽具有相似的親和力。 實施例VII :預防以及治療人類病患 爲了測定藥物對人類的安全性進行單一劑量的相I實 驗。將增加劑量之治療劑投用至不同病人，起始自約假定 功效之0.01倍，以及成三倍增加直到達成約小鼠有效劑 量的1 0倍。 爲了測定治療的功效進行相II實驗。選擇具有早期至 中期阿茲海默氏症定義（使用阿茲海默氏症以及AD相關 的病症相聯（ADRD A )標準）之病人。適當的病人分數介 於 Mini-Mental State Exam ( MMSE) 12-26 分之範圍。其 它選擇標準爲病人於硏究期間存活，以及例如同時使用可 干擾藥物時無倂發症。病患功能之基線評估係使用典型的 精神計量’例如MMSE、及ADAS，其爲評估病人阿茲海 默氏症狀態及功能的高等標度。此類精神標度提供老年痴 呆症症狀進展的計量。適當的定性的生命標度亦可用監視 治療。疾病進展亦可用MRI監測。亦可監測病人血液輪廓 -119- 1374893 ，包括測定抗原專一的抗體以及τ-細胞反應。 基線測定後，病人開始接受治療。彼係用盲目方式以 治療劑或安慰劑隨機的處理。至少每六個一次月監測病人 。相對於安慰劑群，測定治療群的功效顯示顯著的降低治 療群之疾病進展。

爲了評估病人從非阿茲海默氏症早期記億流失，有時 稱爲與年齡相關的記億受損（ΑΑΜΙ )或輕微的認知的受 損（MCI )，轉化至可能的阿茲海默氏症（由 ADRDA標 準所定義）所以進行第二相II實驗。轉化成阿茲海默氏症 之高風險病人，其係選自經篩選記憶流失早期症候或其它 難以與前老年痴呆症的症候學相關的參考族群、阿茲海默 氏症家族病史、基因的風險因子、年齡、性別、以及預測 高風險阿茲海默氏症的其它特色之非臨床的族群。收集包 括MMSE以及ADAS與其它爲了評估更正常族群而設計的 計測法，測定的適當基線分數。此類病患族群可分成適當 的集團進行投服安慰劑及藥劑之測試。約六個月投藥間隔 後觀測此類病患族群，以及觀察各病患之測試終點是否轉 變成可能的阿茲海默氏症（由ADRDA標準加以定義）。 雖然爲了清楚了解本發明，本發明已詳細的加以描述 ’但某些修飾明顯的屬於附加的申請專利範圍之範圍。所 有引用之出版以及專利文件與本文出現之圖式以及序列表 ，全文在此并入參考文獻。 從上述說明中，顯示本發明可提供許多用途。例如， 本發明提供使用任何說明如上之A /3抗體，治療、預或 -120- 1374893 診斷成澱粉樣疾病，或製作以彼藥劑或診斷的組成物。 【圖式簡單說明】 圖1圖式化地描述檢視各種抗體，包括12A11，體外 吞噬作用分析在消除Αβ噬菌斑之療效的實驗結果。

圖2A圖式化地描述檢視各種抗體，包括12A11，在 降低總Αβ之含量的療效之實驗結果。條棒代表中位數値 ，以及虛線水平線代表控制水平。圖2 B圖式化地描述分 析各種抗體，包括12A11，在降低神經失調的療效之實驗 結果。條棒代表中位數値，以及虛線水平線代表控制水平 。數據代表個別的動物以及以神經失調之百分比相對於控 制組平均値（設定在100%)表示。 圖3A描述脫氧核糖核酸序列，包括鼠科動物i2Ail VL鏈之序列以及VL鏈推演之胺基酸序列（分別爲序列確 認號碼：5以及2 )。成熟的VL鏈是用實心黑棒表示。 CDR是用空心條表示。圖3B描述脫氧核糖核酸序列，包 括鼠科動物12A11 VH鏈之序列以及VH鏈推演之胺基酸 序列（分別爲序列確認號碼：6以及3 )。成熟的VH鏈 是用實心黑棒表示。CDR是用空心條表示。 圖4圖式化地描述實驗測量嵌合的1 2 A 1 1、嵌合的以 及人類化的3D6、以及嵌合的以及人類化的12B4結合至 Αβ 1-42酵素聯結免疫抗體檢測法之結果。 圖5Α描述鼠科動物（或者嵌合的）12Α11 (序列確認 號碼：2)、人類化的12Α11 (成熟的肽，序列確認號碼： -121 - 1374893

7 )、基因資料庫BAC01 733 (序列確認號碼：8 )以及種 系 A19 (X63397，序列確認號碼：9)抗體之輕鏈，胺基 酸序列之序列比對。CDR區域是用方盒表示。包裝殘基是 用劃底線表示。數目起算自第一個甲硫胺酸，而非使用 Kabat計數法。圖5B描述鼠科動物（或者嵌合的）12A11 (序列確認號碼：4)、人類化的12aAll (版本1)(成 熟的肽，序列確認號碼：1 〇 )、基因資料庫AAA69734 ( 序列確認號碼：1 1 )以及種系GenBank 567 1 23 (序列確認 號碼：12)抗體之重鏈，胺基酸序列之序列比對。包裝殘 基是用劃底線表示，規範的殘基是用實心表示，以及游標 殘基是用斑點表示。數目起算自第一個甲硫胺酸，而非使 用Kabat計數法。 圖6A-B描述人類化的12A1 1 vl (序列確認號碼：1〇 )、v2 (序列確認號碼：1 3 ) 、ν2 · 1 (序列確認號碼：14 )、v3 (序列確認號碼：1 5 ) 、v4.1 (序列確認號碼：16 )、v4 · 2 (序列確認號碼：1 7 ) 、v4.3 (序列確認號碼： 18 ) 、ν4·4 (序列確認號碼：19 ) 、ν5·1 (序列確認號碼 :20 ) v5.2 (序列確認號碼：21 ) 、ν5·3 (序列確認號碼 :2 2 ) 、v 5.4 (序列確認號碼：2 3 ) 、v 5 5 (序列確認號 碼：2 4 ) 、v 5 _ 6 (序列確認號碼：2 5 ) 、v 6. 1 (序列確認 號碼：26) 、ν6·2(序列確認號碼：27) 、v6.3(序列確 認號碼：28 ) 、ν6·4 (序列確認號碼：29 ) 、v7 (序列確 認號碼：30 )以及v8 (序列確認號碼：3 i )之重鏈，胺基 酸序列之序列比對。圖6C是人類化的12A1 1 vl返向V8 -122- 1374893 之返回 圖 類化的 1 2 A 1 1 結果。 圖 hl2Al 1 突變。 7描述比較嵌合的12A1 1、人類化的12A1 1 12A11 v2、人類化的 12A11 ν2·1、以及人 v3，酵素聯結免疫抗體檢測法聚集的Αβ ( 1- 8描述比較鼠科動物12Α11、嵌合的12Α1 vl競爭性Αβ1-4 2 EL1SA結合分析之結果。 vl、人 類化的 42)之 1以及

-123- 序列表 <110> Elan Pharmaceuticals, Inc. <120>能辨識召薇粉樣肽之人類化抗體 <130> ELN-028PC <150> 60/474654 <151> 2003-05-30 <160> 35 <i7〇> FastSEQ視窗版本4·0 <210> 1 <211> 393 <212> DNA <213〉鼠 <220> <221> CDS <222〉 （1)…（393) <220><221>信號肽 <222> (1) . .. (57) <400> 1 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct get Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp lie Pro Ala -15 -10 -5 tcc age agt gat gtt ttg atg acc caa act cca etc tcc ctg cct gtc Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 15 10 agt ett gga gat caa gcc tcc ate tet tgc aga tet agt cag age att Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser lie 15 20 25 gta cat agt aat gga aac acc tac tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 30 35 40 45 ggc cag tet cca aag etc ctg ate tac aaa gtt tcc aac ega ttt tet Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 50 55 60 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tea ggg aca gat ttc aca Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 etc aag ate age aga gtg gag get gag gat ctg gga att tat tac tgc Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly lie Tyr Tyr Cys 80 85 90 48 96 144 192 240 288 1 336 384 1374893 ttt caa agt tea cat gtt cct etc aeg ttc ggt get ggg acc aag ctg Phe Gin Ser Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 95 100 105 393 gag ctg aaa Glu Leu Lys 110

<210> 2 <211〉 131 <212> PRT <213> 鼠 <220> <221> 信號肽 <222> (1)…（19) <400> 2

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu -15

Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr 1 5

Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser lie 15 20

Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 30 35

Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 50

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 65

Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala 80 85

Phe Gin Ser Ser His Val Pro Leu 95 100

Glu Leu Lys 110

Val Leu Met Phe Trp lie Pro Ala -10 -5

Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 10

Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser lie 25

Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 40 45

Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 70 75

Glu Asp Leu Gly lie Tyr Tyr Cys 90

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 105

<210> 3 <211> 417 <212> DNA <213> 鼠 <220> <221> CDS <222> (1)…（417) <220> <221>信號肽 <222> (1)... (57) <400> 3 48 atg gac agg ett act act tea ttc ctg ctg ctg att gtc cct gca tat Met Asp Arg Leu Thr Thr Ser Phe Leu Leu Leu lie Val Pro Ala Tyr -15 -10 -5 gtc ttg tcc caa gtt act eta aaa gag tet ggc cct ggg ata ttg aag Val Leu Ser Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu Lys 15 10 2 96 144 ccc tea cag acc etc agt ctg act tgt tet ttc tet ggg ttt tea ctg Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu 15 20 25 age act tet ggt atg agt gta ggc tgg att cgt cag cct tea ggg aag Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys 30 35 40 45 ggt ctg gag tgg ctg gca cac att tgg tgg gat gat gat aag tac tat Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr 50 55 60 aac cca tcc ctg aag age egg etc aca ate tee aag gat acc tee aga Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Arg 65 70 75 aac cag gta ttc etc aag ate acc agt gtg gac act gca gat act gee Asn Gin Val Phe Leu Lys lie Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala 80 85 90 act tac tac tgt get ega aga act act aeg get gac tac ttt gee tac Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr 95 100 105 tgg ggc caa ggc acc act etc aca gtc tec tea Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 110 115 120 192 240 288 336 384 417

<210> 4 <211> 139 <212> PRT <213> 鼠 <220> 一 <221> 信號肽 <222> ⑴…（19) <400> 4

Met Asp Arg Leu Thr Thr Ser Phe Leu Leu Leu lie Val Pro Ala Tyr -15 -10 -5

Val Leu Ser Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu Lys 15 10

Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu 15 20 25

Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys 30 35 40 45

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr 50 55 60

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Arg 65 70 75

Asn Gin Val Phe Leu Lys lie Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala 80 85 90

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr 95 100 105

Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 110 115 120 3

<210> 5 <211> 429 <212> DNA <213> ΛΧ序列 <220> <223> 合成 <400> 5 cmgmaagctt gccgccacca tgaagttgcc tgttaggctg ttggtgctga tgttctggat 60 tcctgcttcc agcagtgatg ttttgatgac ccaaactcca ctctccctgc ctgtcagtct 120 tggagatcaa gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc attgtacata gtaatggaaa 180 cacctactta gaatggtacc tgcagaaacc aggccagtct ccaaagctcc tgatctacaa 240 agtttccaac cgattttctg gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat cagggacaga 300 tttcacactc aagatcagca gagtggaggc tgaggatctg ggaatttatt actgctttca 360 aagttcacat gttcctctca cgttcggtgc tgggaccaag ctggagctga aacgtgagtg 420 gatcctmgr 429

<210> 6 <211> 445 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223>合成 <400> 6 aagcttgccg ccaccatgga caggcttact acttcattcc tgctgctgat tgtccctgca 60 tatgtcttgt cccaagttac tctaaaagag tctggccctg ggatattgaa gccctcacag 120 accctcagtc tgacttgttc tttctctggg ttttcactga gcacttctgg tatgagtgta 180 ggctggattc gtcagccttc agggaagggt ctggagtggc tggcacacat ttggtgggat 240 gatgataagt actataaccc atccctgaag agccggctca caatctccaa ggatacctcc 300 agaaaccagg tattcctcaa gatcaccagt gtggacactg cagatactgc cacttactac 360 tgtgctcgaa gaactactac ggctgactac tttgcctact ggggccaagg caccactctc 420 acagtctcct caggtgagtg gatcc 445 <210> 7 <211> 112 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223〉合成hl2Allvl - VL 區 <400> 7

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser lie Val His Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Ser 85 90 95

Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 134 <212> PRT <213> 人 <220> <221〉信號肽 <222> (1)…（22) <400> 8

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala -20 -15 -10

Ala Gin Pro Ala Met Ala Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser -5 15 10

Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser 15 20 25

Gin Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu 30 35 40

Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Leu Gly Ser Asn 45 50 55

Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 60 65 70

Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 75 80 85 90

Tyr Tyr Cys Met Gin Ala Leu Gin Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Leu Glu lie Lys 110 <210> 9 <211> 120 <212> PRT <213> 人 <220> <221>信號肽 <222> (1)…（20) <400> 9

Met Arg Leu Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser -20 -15 -10 -5

Gly Ser Ser Gly Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro 1 5 10

Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser 15 20 25

Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys 30 35 40

Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala 45 50 55 60

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75

Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 80 85 90

Cys Met Gin Ala Leu Gin Thr Pro 95 100 <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> XX序列 <220> <223> hl2Allvl - VH 區 <400> 10

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 141 <212> PRT <213> 人 <220> <221> 信號肽 <222> (1)...(19) <400> 11

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly -15 -10 -5

Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 15 10

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25

Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45

Glu Trp Val Ala Val lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 65 70 75

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg His Ser Ser Ser Trp Tyr Tyr Gly Met 95 100 105

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 12 <211> 137 <212> PRT <213> 人 <220> <221>信號肽 <222> (1)...(19) <400> 12

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly -15 -10 -5

Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 15 10

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25

Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45

Glu Trp Val Ala Val lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 65 70 75

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Lys Leu Leu Met Leu Leu lie Ser Gly 95 100 105

Ala Lys Gly Gin Trp Ser Pro Ser Leu 110 115 <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 合成 hl2Allv2 <400> 13

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Val Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成hl2Allv2-l <400〉 14

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10^ 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Val Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成hl2Allv3 <400> 15

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Val Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 120 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉合成hl2Allv4.1 1374893 <400> 16

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 17 <211> 120 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 合成hl2Allv4.2 <400> 17

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Val Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 120 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 合成hl2Allv4.3 <400> 18

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 9 1374893

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 19 <211> 120 <212> PRT <213>人工序列 <220>

<223〉合成hl2Allv4.4 <400> 19

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 120 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 合成hl2Allv5.1 <400> 20

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Val Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 10

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 90 95 Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 110

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp 100 105

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 21 <211> 120 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 合成 hl2Allv5-2 <400> 21

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 . 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 121 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成 hl2Allv5.3 <400> 22

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val 115 120 11 1374893 <210> 23 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 合成hl2Allv5.4 <400> 23

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Val Ala His He Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 HO

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val 115 120 <210> 24 <211> 120 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> ^^hl2Allv5.5 <400> 24

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Val Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 120 <212> PRT <213> 人工序列 12 1374893 <220> <223> 合成 hl2Allv5.6 <400> 25

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala His He Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 26 <211> 120 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成hl2A116.1 <400> 26

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Val Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 120 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 合成hl2Allv6-2 <400> 27

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 13 1374893

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Val Ala His He Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 120 <212> PRT <213〉人工序列

<220> <223> 合成hl2Allv6-3 <400> 28

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 29 <211> 120 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 合成 hl2Allv6.4 <400> 29

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Val Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 14 1374893

Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 120 <212> PRT _ <213>人工序列 <220> <223〉合成hl2Allv7 <400> 30

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 . 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 31 <211> 120 <212> PRT • <213> 人工序列 <220> <223> 合成hl2Allv8 <400> 31

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 15 1374893

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> ΛΧ序列 <220> <223>合成igg鉸鏈區 <400〉 32

Leu Leu Gly Gly Pro 1 5

<210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>合成igg鉸鍵區 <400> 33

Leu Glu Gly Gly Pro <210> 34 <211> 396 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人類化12A11 vl VL序列 <220> <22；L>信號肽 <222> (1)...(60) <400> 34 atgaggctcc gatgttgtga atctcttgca tacctgcaga tctggggtcc agcagagtgg ctcaccttcg ctccagtggg 60 gccagcctcc 120 cctggaatgg 180 caaccgattt 240 actcaagatc 300 acatgttcct 360 396 <210> 35 <211> 417 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 耀化 12A11 vl VH 序列 ctgctcagct tgacccaatc gatctagtca aaccaggcca cagacaggtt aggctgagga gtcaggggac cctggggctg tccactctcc gagcattgtg gtctccacag cagtggcagt tgtgggagtt caagctggag ctgatgctct ctgcctgtca catagtaatg ctcctgatct ggatcaggga tattactgct atcaaa gggtctctgg ctcctggaga gaaacaccta acaaagtttc cagatttcac ttcaaagttc 16 1374893 <220> <221> <222> {|號狀(57) <400> 35 atggagtttg gttcagctgg tgtgctttct gctccaggga aacccatccc ctccagatga actaccgctg ggctgagctg tggagtctgg ctgggttttc agggtctgga tgaagagccg acagtctgcg actactttgc ggttttcctc cggcggggtg actgagcact gtggctggca gctcacaatc ggctgaagat ctactggggc gttgctcttc gtgcagcccg tctggtatga cacatttggt tccaaggata actgccgtgt caaggcacca tgagaggtgt gacggtccct gtgtgggctg gggatgatga cctccaaaaa actactgtgc ctgtcacagt ccagtgtcaa 60 caggctgtct 120 gattcgtcag 180 taagtactat 240 caccgtgtac 300 tcgaagaact 360 ctcctca 417

17

Claims (1)

1374893 附件3A

十、申請專利範園 1. 一種經分離之核酸，其編碼專一性結合β澱粉樣 肽（Αβ)之人類化免疫球蛋白或該人類化免疫球蛋白之抗原 結合片段之輕鏈，該人類化免疫球蛋白包含人類化輕鏈可 變區和人類化重鏈可變區，其中

該人類化輕鏈可變區包含源自12Α11免疫球蛋白輕鏈 可變區序列SEQ ID Ν0:2之3個互補決定區（CDR)和源自 人類接受體免疫球蛋白輕鏈可變區之4個可變架構區（FR) ，該等 CDR 和 FR 係呈 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3- FR4之序歹[J ;且 該人類化重鏈可變區包含源自12Α11免疫球蛋白重鏈 可變區序列SEQ ID Ν0:4之3個CDR和源自人類接受體 免疫球蛋白重鏈可變區之4個可變FR，該等CDR和FR •係呈 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 之序歹IJ。 2. —種經分離之核酸，其編碼專一性結合β澱粉樣 肽（Αβ)之人類化免疫球蛋白或該人類化免疫球蛋白之抗原 結合片段之重鏈，該人類化免疫球蛋白包含人類化輕鏈可 變區和人類化重鏈可變區，其中 該人類化輕鏈可變區包含源自12Α1 1免疫球蛋白輕鏈 可變區序列SEQ ID Ν0:2之3個互補決定區（CDR)和源自 人類接受體免疫球蛋白輕鏈可變區之4個可變架構區（FR) ，該等 CDR 和 FR 係呈 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3- 1374893 FR4之序列；且 該人類化重鏈可變區包含源自12A 11免疫球蛋白重鏈 可變區序列SEQ ID N0:4之3個CDR和源自人類接受體 免疫球蛋白重鏈可變區之4個可變FR，該等CDR和FR 係呈 FIU-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 之序歹!J 。 3. —種經分離之核酸，其編碼專一性結合β澱粉樣 肽（Αβ)之人類化免疫球蛋白或該人類化免疫球蛋白之抗原 結合片段之人類化輕鏈可變區和人類化重鏈可變區，該人 類化免疫球蛋白包含人類化輕鏈可變區和人類化重鏈可變 區，其中 該人類化輕鏈可變區包含源自12Α 11免疫球蛋白輕鏈 可變區序列SEQ ID Ν0:2之3個互補決定區（CDR)和源自 人類接受體免疫球蛋白輕鏈可變區之4個可變架構區（FR) ，該等 CDR 和 FR 係呈 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4之序列；且 該人類化重鏈可變區包含源自12Α11免疫球蛋白重鏈 可變區序列SEQ ID Ν0:4之3個CDR和源自人類接受體 免疫球蛋白重鏈可變區之4個可變FR，該等CDR和FR 係呈 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 之序歹IJ。 4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之經分離之 核酸，其中該人類化輕鏈可變區包含SEQ ID Ν0:2之CDR L1 (胺基酸 24-39)、CDR L2 (胺基酸 55-61)及 CDR L3 (胺 基酸94- 1 02)，且該人類化重鏈可變區包含 SEQ ID NO:4 之 CDR HI (胺基酸 31-37)、CDR H2 (胺基酸 52-67)及 1374893 CDR H3 (胺基酸 I00·1 13)。 5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之經分離之 核酸，其中選自該輕鏈可變區FR1至FR4之—或多個輕 鏈可變區FR係與源自免疫球蛋白K64 (Genbank取得編號 BAC0 1 73 3.1 : SEQ ID N0:8)之對應的人輕鏈可變區架構序 列共有至少9 0 °/。之序列同一性。 6. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之經分離之

核酸，其中選自該重鏈可變區FR1至FR4之一或多個重 鏈可變區FR係與源自免疫球蛋白M72 (GenBank取得編 號AAA69734.1 ; SEQ ID N0:11)之對應的人重鏈可變區架 構序列共有至少90%之序列同一性。 7.如申請專利範圍第1至3項中任一項之經分離之 核酸，其中至少一個重鏈可變區架構殘基係源自12A11重 鏈可變區序列（SEQ ID NO:4)且該等殘基選自H24、H28、 H29、H37、H4 8、H67、H71、H73 或 H78 (Kabat 編號規 φ 則），其中該重鏈可變區架構之殘餘殘基係源自該人類接 受體免疫球蛋白。 8.如申請專利範圍第1至3項中任一項之經分離之 核酸，其中至少3個重鏈可變區架構殘基係源自12A11重 鏈可變區序列（SEQ ID NO:4)且該等殘基選自H24、H28、 H29、H37、H48、H67、H71、H73 或 H78 (Kabat 編號規 則），其中該重鏈可變區架構之殘餘殘基係源自該人類接 受體免疫球蛋白。 9 ·如申請專利範圍第8項之經分離之核酸，其中人 -3- V. V.1374893 類化重鏈可變區架構位置H2 4、H28、H2 9、H37、H48、 H67、H71、H7 3及H78 (Kabat編號規則）上係分別爲F、S 、L、I、L、L、K、T&V。 10.如申請專利範圍第8項之經分離之核酸，其中人 類化重鏈可變區架構位置H24、H29及H37 (Kabat編號規 則）上係分別爲F、L及I » H.如申請專利範圍第1至3項中任一項之經分離之 核酸，其中該輕鏈可變區包含至少一個可變區架構殘基， 該等可變區架構殘基選自源自該單株抗體12A11輕鏈可變 區序列（SEQ ID NO:2)之 L2、L4、L36、L38、L40' L44、 L46 、 L47 、 L48 、 L49 、 L64 、 L66 、 L68 、 L69 、 L71 、 L87 或L98 (Kabat編號規則）。 12.如申請專利範圍第1至3項中任一項之經分離之 核酸，其中該重鏈可變區包含至少一個可變區架構殘基， 該等可變區架構殘基選自源自該單株抗體12A11重鏈可變 區序列（SEQ ID NO:4)之 H2、H24、H26、H27、H28、H29 、H37、H39、H45、H47、H48、H67、H71、H73 ' H78、 H91、H93、H94 或 H103 (Kabat 編號規則）。 如申請專利範圍第1至3項中任一項之經分離之 核酸’其中該重鏈或輕鏈中至少一者之至少一個稀有人類 架構殘基係經源自生殖系可變重鏈或輕鏈序列之對應胺基 酸殘基取代。 14·如申請專利範圍第13項之經分離之核酸，其中 該生殖系可變重鏈序列係源自 GenBank取得編號 -4- 1374893 AAA69731.1 (GI :567123 ； SEQ ID N0:12)。 15·如申請專利範圍第13項之經分離之核酸，其中 該生殖系可變輕鏈序列係源自 GenBank取得編號 X63397.1 (GI:3 3 774 ； SEQ ID N0:9)。 16.如申請專利範圍第1至3項中任一項之經分離之 核酸，其中該人類化免疫球蛋白或抗原結合片段係以至少 i〇_7m之結合親和性專一性結合β澱粉樣肽（Αβ) ^ ^ 17.如申請專利範圍第1至3項中任一項之經分離之 核酸’其中該人類化免疫球蛋白或抗原結合片段專一性結 合可溶性Ρ澱粉樣肽（Αβ)。 18.如申請專利範圍第1至3項中任一項之經分離之 核酸，其中該人類化免疫球蛋白或抗原結合片段減少個體 之β澱粉樣狀（Αβ)斑量。 1 9.如申請專利範圍第1至3項中任一項之經分離之 核酸，其中該人類化免疫球蛋白或抗原結合片段結合β澱 φ 粉樣肽（Αβ)之殘基3至7中的抗原決定部位。 20.如申請專利範圍第1至3項中任一項之經分離之 核酸，其中該人類化重鏈可變區含有選自SEQIDNO:10 、SEQ ID NO: 1 3 ' SEQ ID N O : 1 4、S E Q ID N O : 1 5、S E Q ID NO: 1 6 ' SEQ ID NO: 1 7 ' SEQ ID NO:18、SEQ ID NO: 19 ' SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27 ' SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29' SEQ ID NO:30 或 SEQ ID NO:31 之胺基酸序列的胺基酸1至120之胺基酸序列、或選自 -5- 1374893 SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23之胺基酸序列的胺基酸1 至121之胺基酸序列，且該人類化輕鏈可變區含有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的胺基酸1至112之胺基酸序列。

21. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之經分離之 核酸，其中該人類化重鏈可變區含有SEQ ID NO:10之胺 基酸序列的胺基酸1至120之胺基酸序列，且該人類化輕 鏈可變區含有SEQ ID NO:7之胺基酸序列的胺基酸1至 1 1 2之胺基酸序列。 22. —種載體，其包含如申請專利範圍第1至21項 中任一項之核酸。 23. —種經分離之宿主細胞，其包含如申請專利範圍 第22項之載體。

24. —種產製抗體或彼之片段之方法，其包含於使 該抗體或片段被產製之條件下培養如申請專利範圍第2 3 項之宿主細胞，及自該宿主細胞或培養基分離該抗體或片 段。