TW201731861A - 寡核苷酸的製造方法 - Google Patents

寡核苷酸的製造方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201731861A
TW201731861A TW105137671A TW105137671A TW201731861A TW 201731861 A TW201731861 A TW 201731861A TW 105137671 A TW105137671 A TW 105137671A TW 105137671 A TW105137671 A TW 105137671A TW 201731861 A TW201731861 A TW 201731861A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
group
alkenyl
pseudo
hydrogen atom
protected
Prior art date
Application number
TW105137671A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI729028B (zh
Inventor
Yudai Sugawara
Original Assignee
Nissan Chemical Ind Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nissan Chemical Ind Ltd filed Critical Nissan Chemical Ind Ltd
Publication of TW201731861A publication Critical patent/TW201731861A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI729028B publication Critical patent/TWI729028B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/06—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Abstract

本發明為提供一種使用容易分離且保存安定性高的核苷酸或寡核苷酸之寡核苷酸的新穎製造方法。其為含有於選自由2’位、3’位、5’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有擬似固相保護基，將5’位或3’位為羥基之核苷酸或寡核苷酸的該5’-羥基或3’-羥基經H-膦酸酯化的步驟之寡核苷酸的製造方法。

Description

寡核苷酸的製造方法
本發明係關於寡核苷酸之新穎製造方法。
隨著基因組創藥或基因診斷．治療等最先端生物關連研究的急速進步．發展，近年來興盛利用DNA探針、siRNA、反義DNA、反義RNA等寡核苷酸。作為寡核苷酸之化學合成方法，已知有亞磷醯胺法、H-膦酸酯法等。
在亞磷醯胺法中，可使用作為代表性氨基亞化試藥的氯(二異丙基胺基)亞膦酸2-氰基乙酯或雙(二異丙基胺基)亞膦酸2-氰基乙酯等。這些試藥非常高價，需要於氨基亞體分離時在管柱純化或超低溫之再沈澱等煩雜操作。又，氨基亞體因其安定性低故必須保存在-20℃。
相對於此，在H-膦酸酯法中，使用作為代表性H-膦酸酯化試藥的亞磷酸二苯酯或亞磷酸等。這些較為便宜，但在H-膦酸酯體分離時，需要管柱純化等煩雜的操作。H-膦酸酯體因其安定性的原因故必須保存在0℃(例如參照非專利文獻1)。
在現今，因藉由亞磷醯胺法的固相合成法之 製程最適化及自動化更進展著，故藉由亞磷醯胺法之固相合成法在速度面上較為有利，最被泛用。但，在固相合成法中因有設備制約上規模提升的限制，故有著使用過剩試藥及原料，在途中階段的反應進行狀況之確認、中間體結構解析等亦為困難之缺點。
近年來，作為液相合成法，使用擬似固相保護基的H-膦酸酯法正被檢討著。具體有聚乙二醇(MPEG)(例如參照專利文獻1)或含有長鏈烴之基(例如參照專利文獻2)等作為擬似固相保護基使用的合成法已被揭示。
[先行技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2014-017615號
[專利文獻2]國際公開第2014-077292號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Protocols for Oligonucleotides and Analogs Humana Press (1993)、44-73頁
對於使用聚乙二醇(MPEG)之合成法，雖有舉出至21聚體的寡核苷酸之合成例，但在每次伸長循環後 必須經GPC進行管柱純化。又，對於使用含有長鏈烴之基的製法，雖記載5聚體之寡核苷酸的合成例，但脫保護步驟為低產率。
如上述，雖在寡核苷酸的化學合成法中使用氨基亞體或者H-膦酸酯體，皆在分離時的操作性或化合物的安定性具有課題，期待可對應大量合成之新穎寡核苷酸的製造方法。
本發明之目的為使用可分離容易且保存安定性高的核苷酸或寡核苷酸，提供寡核苷酸的新穎製造方法。
欲解決如此課題，本發明者們經詳細研究結果，發現與由偶合步驟、將磷原子經修飾的步驟(氧化反應、硫化反應等)、脫保護步驟等所構成的通常製造方法相異的製造方法，其為藉由含有將具有擬似固相保護基的核苷酸或寡核苷酸之5’位羥基或3’位羥基進行H-膦酸酯化的步驟之製造方法，解決上述課題，而完成本發明。
本發明為含有以下者。
[1]含有於選自由2’位、3’位、5’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有擬似固相保護基，將5’位或3’位為羥基之核苷酸或寡核苷酸的該5’-羥基或3’-羥基進行H-膦酸酯化的步驟之寡核苷酸的製造方法。
[2]如[1]所記載的製造方法，其為含有至少一個以下 伸長反應循環者，該伸長反應循環為含有選自由2’位、3’位、5’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有擬似固相保護基，將於5’位或3’位為羥基的核苷酸或寡核苷酸之該5’-羥基或3’-羥基進行H-膦酸酯化的步驟。
[3]如[2]之製造方法，其中前述伸長反應循環為具有以下步驟者；第一步驟為含有，於選自2’位、3’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有擬似固相保護基，於3’位具有以基本保護基或擬似固相保護基所保護的羥基，將於5’位具有以一時保護基所保護的羥基之第一核苷酸或第一寡核苷酸之一時保護基經除去後生成5’-羥基的步驟；第二步驟為含有，將所生成的5’-羥基使用H-膦酸酯化試藥進行H-膦酸酯化的步驟；第三步驟為含有，與H-膦酸酯化的5’-羥基，於3’位具有羥基且於5’位具有以一時保護基所保護的羥基之第二核苷酸，或與第二寡核苷酸的3’-羥基形成亞磷酸二酯鍵，得到第一核苷酸或第一寡核苷酸與第二核苷酸或第二寡核苷酸之共軛物的第三步驟。
[4]如[3]之製造方法，其為進一步含有以下第四步驟，該步驟為含有將前述共軛物的亞磷酸二酯鍵轉換為磷酸二酯鍵、硫代磷酸二酯鍵、硼烷磷酸二酯鍵、胺基磷酸二酯鍵、以基本保護基所保護的磷酸二酯鍵或以基本保護基所保護的硫代磷酸二酯鍵之步驟。
[5]如[3]之製造方法，其為進一步含有以下第 四步驟，該步驟為含有將前述共軛物的亞磷酸二酯鍵轉換為磷酸二酯鍵、硫代磷酸二酯鍵、硼烷磷酸二酯鍵或胺基磷酸二酯鍵的步驟。
[6]如[4]或[5]之製造方法，其為進一步含有第五步驟，該步驟為於由選自由前述第一步驟至第四步驟所成群的至少1種步驟所得的反應混合物中，添加極性溶劑使其產生沈澱物，與將所生成的沈澱物藉由固液分離而取得者。
[7]如[6]之製造方法，其中前述極性溶劑為碳數1至6的醇溶劑或碳數1至6的腈溶劑。
[8]如[3]至[7]中任一項之製造方法，其中更含有將前述基本保護基、一時保護基及擬似固相保護基皆除去的第六步驟。
[9]如[3]至[8]中任一項之製造方法，其中前述第一核苷酸或第一寡核苷酸具有於3’位以擬似固相保護基所保護的羥基。
[10]如[3]至[9]中任一項之製造方法，其中前述第三步驟為使用前述第二核苷酸。
[11]如[2]之製造方法，其為含有以下第七步驟至第九步驟者；第七步驟為含有，前述伸長反應循環為，於選自由2’位、5’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有擬似固相保護基，於5’位具有以基本保護基或擬似固相保護基所保護的羥基，將於3’位具有以一時保護基所保護的羥基之第三核 苷酸或第三寡核苷酸的一時保護基除去後生成3’-羥基之步驟；第八步驟為含有，將所生成的3’-羥基使用H-膦酸酯化試藥，使其進行H-膦酸酯化之步驟；第九步驟為含有，由經H-膦酸酯化的3’-羥基，與於5’位具有羥基，於3’位具有以一時保護基所保護的羥基之第四核苷酸或第四寡核苷酸的5’-羥基形成亞磷酸二酯鍵，得到第三核苷酸或第三寡核苷酸與第四核苷酸或第四寡核苷酸的共軛物之步驟。
[12]如[11]之製造方法，其中更含有第十步驟，該步驟為含有，將前述共軛物的亞磷酸二酯鍵轉換為磷酸二酯鍵、硫代磷酸二酯鍵、硼烷磷酸二酯鍵、胺基磷酸二酯鍵、以基本保護基所保護的磷酸二酯鍵或以基本保護基所保護的硫代磷酸二酯鍵之步驟。
[13]如[11]之製造方法，其中更含有第十步驟，該步驟為含有，將前述共軛物的亞磷酸二酯鍵轉換為磷酸二酯鍵、硫代磷酸二酯鍵、硼烷磷酸二酯鍵或胺基磷酸二酯鍵之步驟。
[14]如[12]或[13]之製造方法，其中更含有第十一步驟，該步驟為，於由前述第七步驟至第十步驟中任一步驟所得的反應混合物中，添加極性溶劑使其產生沈澱物，與將所生成的沈澱物藉由固液分離而取得者。
[15]如[14]之製造方法，其中前述極性溶劑為碳數1至6的醇溶劑或碳數1至6的腈溶劑。
[16]如[11]至[15]中任一項之製造方法，其中更含有第十二步驟，該步驟為，將前述基本保護基、一時保護基及擬似固相保護基皆除去的步驟。
[17]如[11]至[16]中任一項之製造方法，其中前述第三核苷酸或第三寡核苷酸為於5’位具有以擬似固相保護基所保護的羥基。
[18]如[11]至[17]中任一項之製造方法，其中前述第九步驟為使用第四核苷酸。
[19]如[1]至[18]中任一項之製造方法，其中前述擬似固相保護基為下述式(I)
(式中，*表示前述擬似固相保護基與欲保護之基的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-， L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L5為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，L6為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，M為0或1，將前述擬似固相保護基於核酸鹼部具有，該擬似固相保護基之m為0時，該擬似固相保護基之L1、L2、L3及L4中，單鍵數目為0至3)所示者。
[20]如[1]至[18]中任一項之製造方法，其中前述擬似固相保護基為下述式(II)
(式中，*表示前述擬似固相保護基與欲保護之基的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數， L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)或-O-，將前述擬似固相保護基於核酸鹼部具有時，該擬似固相保護基之L1、L2、L3及L4中，單鍵數目為0至3)所示者。
[21]如[3]至[20]中任一項之製造方法，其中前述一時保護基為tert-丁基二甲基矽基、4、4’-二甲氧基三苯甲基或乙醯丙醯基。
[22]如[1]至[21]中任一項之製造方法，其中前述進行H-膦酸酯化的步驟為使用選自由亞磷酸、亞磷酸二苯基、苯基-H-膦酸酯之三乙基銨鹽、p-甲苯甲醯基-H-膦酸酯之三乙基銨鹽、2-氯-4H-1,3,2-苯並二氧磷素-4-酮、三氯化磷所成群的至少一種H-膦酸酯化試藥。
[23]如[1]至[22]中任一項之製造方法，其中於 前述第一至第四核苷酸及第一至第四寡核苷酸所含之核酸鹼，各獨立為選自由6-胺基嘌呤-9-基(腺嘌呤殘基)、2-胺基-6-羥基嘌呤-9-基(鳥嘌呤殘基)、2-氧代-4-胺基-1,2-二氫嘧啶-1-基(胞嘧啶殘基)、2-氧代-4-胺基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基(5-甲基胞嘧啶殘基)、2-氧代-4-羥基-1,2-二氫嘧啶-1-基(尿嘧啶殘基)及2-氧代-4-羥基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基(胸腺嘧啶殘基)所成群的至少1種。
[24]一種化合物或其鹽，其特徵係由下述式(XI)：
[式中，n表示1以上的任意整數，BaseZ，各獨立表示核酸鹼、以基本保護基所保護的核酸鹼或以擬似固相保護基所保護的核酸鹼，XZ，各獨立表示氫原子、鹵素原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、於第4位碳原子進行交聯的有機基或以擬似固相保護基所保護的羥基，Y，各獨立表示氫原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、硫醇基、以基本保護基所保護的硫醇基、氫化硼基、單C1-6烷基胺基或二C1-6烷基胺基， Z表示氫原子、基本保護基、一時保護基或擬似固相保護基，且滿足BaseZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的核酸鹼、XZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的羥基，及Z為擬似固相保護基的至少一項]所示。
[25]如[24]之化合物或其鹽，其中前述擬似固相保護基為下述式(II)
(式中，*表示前述擬似固相保護基與欲保護之基的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)或-O-、L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、 C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)或-O-，將前述擬似固相保護基於核酸鹼部具有時，該擬似固相保護基之L1、L2、L3及L4中，單鍵數目為0至3)所示。
[26]如[24]或[25]之化合物或其鹽，其為滿足前述式(XI)中之BaseZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的核酸鹼，及Z為擬似固相保護基的至少一項。
[27]如[24]至[26]中任一項之化合物或其鹽，其中前述式(XI)中之Z為擬似固相保護基。
[28]如[24]至[27]中任一項之化合物或其鹽，其中前述式(XI)中之n為1至30。
[29]一種化合物或其鹽，其特徵係由下述式(XII)：
[式中，n表示1以上的任意整數，BaseZ為獨立表示各核酸鹼、以基本保護基所保護的 核酸鹼或以擬似固相保護基所保護的核酸鹼，XZ為獨立表示各氫原子、鹵素原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、於第4位碳原子進行交聯的有機基或以擬似固相保護基所保護的羥基，Y為獨立表示各氫原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、硫醇基、以基本保護基所保護的硫醇基、氫化硼基、單C1-6烷基胺基或二C1-6烷基胺基，Z表示氫原子、基本保護基、一時保護基或擬似固相保護基，且滿足BaseZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的核酸鹼、XZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的羥基，及Z為擬似固相保護基之至少一項]所示。
[30]如[29]之化合物或其鹽，其中前述擬似固相保護基為下述式(II)
(式中，*表示前述擬似固相保護基與欲保護之基的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基， L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)或-O-，將前述擬似固相保護基於核酸鹼部具有時，該擬似固相保護基之L1、L2、L3及L4中，單鍵數目為0至3)所示。
[31]如[29]或[30]之化合物或其鹽，其為滿足前述式(XII)中之BaseZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的核酸鹼、及Z為擬似固相保護基的至少一項。
[32]如[29]至[30]中任一項之化合物或其鹽，其中前述式(XII)中之Z為擬似固相保護基。
[33]如[29]至[32]中任一項之化合物或其鹽，其中前述式(XII)中之n為1至30。
[34]一種化合物或其鹽，其特徵係由下述式(XIII)：
[式中，n表示1以上的任意整數，BaseZ各獨立表示核酸鹼、以基本保護基所保護的核酸鹼或以擬似固相保護基所保護的核酸鹼，XZ各獨立表示氫原子、鹵素原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、於第4位碳原子進行交聯的有機基或以擬似固相保護基所保護的羥基，W表示氫原子或一時保護基，Y各獨立表示氫原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、硫醇基、以基本保護基所保護的硫醇基、氫化硼基、單C1-6烷基胺基或二C1-6烷基胺基，Z表示氫原子、基本保護基、一時保護基或擬似固相保護基，且滿足BaseZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的核酸鹼、XZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的羥基，及Z為擬似固相保護基之至少一項，前述擬似固相保護基的至少一個為式(I)
(式中，*表示前述擬似固相保護基與欲保護之基的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L5為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，L6為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基， m為0或1，m為0時，L4非單鍵)所示]所示。
[35]一種化合物或其鹽，其特徵係由下述式(XIV)：
(式中，n表示1以上的任意整數，BaseZ為獨立表示各核酸鹼、以基本保護基所保護的核酸鹼或以擬似固相保護基所保護的核酸鹼，XZ為獨立表示各氫原子、鹵素原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、於第4位碳原子進行交聯的有機基或以擬似固相保護基所保護的羥基，W表示氫原子或一時保護基，Y為獨立表示各氫原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、硫醇基、以基本保護基所保護的硫醇基、氫化硼基、單C1-6烷基胺基或二C1-6烷基胺基，Z表示氫原子、基本保護基、一時保護基或擬似固相保護基，且滿足BaseZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的核酸鹼、XZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的 羥基，及Z為擬似固相保護基的至少1項，前述擬似固相保護基的至少一個為式(I)
(式中，*表示前述擬似固相保護基與欲保護之基的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L5為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基， L6為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，m為0或1，m為0時，L4非單鍵)所示]所示化合物、或其鹽。
[36]一種擬似固相保護基，其特徵係由下述式(I)
(式中，*表示與選自由核苷酸或寡核苷酸的2’位、3’位及5’位的羥基以及核酸鹼部所成群的至少1處的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、 C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L5為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，L6為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，m為0或1，m為0時，L4非單鍵)所示。
[37]一種核苷酸或寡核苷酸的製造方法，其為製造具有以下擬似固相保護基的核苷酸或寡核苷酸，其特徵為將於3’位及5’位，獨立具有羥基或經保護的羥基、於選自由2’位、3’位、5’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有羥基，或於2’位及核酸鹼部的至少1處具有羥基或胺基之核苷酸或寡核苷酸，與下述式(X-1)
(式中，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、 C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-)所示羧基化合物、下述式(X-2)
(式中，X為鹵素原子，R1、L1、L2、L3及L4與前述式(X-1)中的定義相同)所示酸鹵素化物或下述式(X-3)
(式中，X為鹵素原子，R1、L1、L2、及L3與前述式(X-1)中之定義相同，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、 C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L5為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，L6為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)所示鹵素化烷基化合物進行反應，製造於選自由2’位、3’位、5’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有下述式(I)
(式中，*表示與選自由2’位、3’位、5’位及核酸鹼部所成群的至少1處的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔 基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L5為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，L6為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，m為0或1，m為0時，L4非單鍵)所示擬似固相保護基的核苷酸或寡核苷酸。
依據本發明，可提供使用容易分離且保存安定性高之核苷酸或寡核苷酸的寡核苷酸之新穎製造方法。又，該新穎製造方法可對應寡核苷酸之大量合成。
[圖1]表示使用於寡核苷酸合成的核酸單體之安定性圖。
[實施發明的形態]
以下對於本發明做詳細說明。
雖無特別記載，在本說明書所使用的所有技術用語及科學用語皆與本發明所屬記屬領域中斯業者所理解的一般意思相同。記載於本說明書的同様或同等任意方法及材料皆可使用於本發明之實施或試驗中，但該較佳方法及材料如以下所記載。
所謂「步驟」之用語，並非僅為獨立步驟，即使無法與其他步驟做明確區分，只要可達成該步驟所期待的目的，皆含於本用語中。又，使用「~」所示數值範圍係將「~」的前後所記載的數值作為各最小值及最大值而涵蓋的範圍。
且，本說明書中「n-」表示正、「i-」表示異、「t-」及「tert-」表示第三，「Ph」表示苯基、「Py」表示吡啶基或吡啶、「Me」表示甲基、「Et」表示乙基、「Pr」表示丙基、「Bu」表示丁基、「Bn」表示苯甲基、「Boc」表示第三丁氧基羰基、「TBS」表示第三丁基二甲基矽基、「TIPS」表示三異丙基矽基、「TBDPS」表示第三丁基二苯基矽基、「DMTr」表示4,4’-二甲氧基三苯甲基。
「L1」與「L1」為同義，「L2」與「L2]為同義，「L3」與「L3」為同義，「L4」與「L4」為同義，「L5」與「L5」為同義，「L6」與「L6」為同義。
本說明書中所謂「鹵素原子」為氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
所謂「C1-6烷基」表示碳數為1至6的直鏈或分支狀飽和烴基，例如可舉出甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基、異丁基、sec-丁基、tert-丁基、n-戊基、異戊基、新戊基、n-己基及異己基等。
所謂「C2-6烯基」表示於任意位置上具有1個以上的雙鍵，碳數為2至6的直鏈或分支狀烴基，例如可舉出乙烯基(乙烯基)、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基(高烯丙基)、4-戊烯基、5-己烯基等。
所謂「C2-6炔基」表示於任意位置上具有1個以上的參鍵，碳數為2至6的直鏈或分支狀烴基，例如可舉出乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、4-戊炔基、5-己炔基等。
所謂「C1-40烷基」表示碳數為1至40的直鏈或分支狀飽和烴基，例如可舉出甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基、異丁基、sec-丁基、tert-丁基、n-戊基、異戊基、新戊基、n-己基、異己基、癸基、十八烷基、二十烷基、三十烷基、四十烷基等。
所謂「C2-40烯基」表示於任意位置上具有1個以上的雙鍵之碳數為2至40的直鏈或分支狀烴基，例如可舉出乙烯基(乙烯基)、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基(高烯丙基)、4-戊烯基、5-己烯基、10-癸烯基、18-十八烯基、20-二十烯基、30-三十烯基、40-四十烯基等。
所謂「C2-40炔基」表示於任意位置上具有1個以上的參鍵之碳數為2至40的直鏈或分支狀烴基，例如可舉出乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、4-戊炔基、5-己炔基、10-癸炔基、18-十八炔基、20-二十炔基、30-三十炔基、40-四十炔基等。
所謂「C10-30烷基」表示碳數為10至30的直鏈或分支狀飽和烴基，例如可舉出癸基、十八烷基、二十烷基、三十烷基等。
所謂「C15-25烷基」表示碳數為15至25的直鏈或分支狀飽和烴基，例如可舉出十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十二烷基等。
所謂「C15-20烷基」表示碳數為15至20的直鏈或分支狀飽和烴基，例如可舉出十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基等。
所謂「C10-30烯基」表示於任意位置上具有1個以上的雙鍵之碳數為10至30的直鏈或分支狀烴基，例如可舉出2-癸烯基、10-癸烯基、18-十八烯基、20-二十烯基、30-三十烯基等。
所謂「C1-6伸烷基」表示自前述「C1-6烷基」中除去1個任意位置之氫原子的2價取代基，例如可舉出伸甲基、伸乙基(乙烷二基)、丙烷-1,3-二基、丙烷-2,2-二基、2,2-二甲基-丙烷-1,3-二基、己烷-1,6-二基、3-甲基丁烷-1,2-二基等。
所謂「C2-6伸烷基」表示前述「C1-6伸烷基」之中，碳數為2至6的直鏈或分支狀2價之取代基，例如可舉出伸乙基(乙烷二基)、丙烷-1,3-二基、丙烷-2,2-二基、己烷-1,6-二基、3-甲基丁烷-1,2-二基等。
所謂「C2-6伸烯基」表示自前述「C2-6烯基」除去1個任意位置的氫原子之2價的取代基，例如可舉出乙烯-1,1-二基、乙烯-1,2-二基、丙烯-1,1-二基、丙烯-1,2-二基、丙烯-1,3-二基、丁-1-烯-1,4-二基、丁-1-烯-1,3-二基、丁-2-烯-1,4-二基、丁-1,3-二烯-1,4-二基、戊-2-烯-1,5-二基、己-3-烯-1,6-二基、己-2,4-二烯-1,6-二基等。
所謂「C2-6伸炔基」表示自前述「C2-6炔基」除去1個任意位置的氫原子之2價的取代基，例如可舉出乙炔-1,2-二基、丙炔-1,3-二基、丁-1-炔-1,4-二基、丁-1-炔-1,3-二基、丁-2-炔-1,4-二基、戊-2-炔-1,5-二基、戊-2-炔-1,4-二基、己-3-炔-1,6-二基等。
所謂「C1-6鹵烷基」表示在1個以上之前述「鹵素原子」中，前述「C1-6烷基」的任意位置之氫原子被取代而成的基，例如可舉出單氟甲基、單氟乙基、單氟丙基、2,2,3,3,3-五氟丙基、單氯甲基、三氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、2,2,2-三氯乙基、1,2-二溴乙基及1,1,1-三氟丙烷-2-基等。
所謂「C2-6鹵烯基」表示在1個以上的前述「鹵素原子」中，前述「C2-6烯基」的任意位置之氫原 子被取代而成的基。
所謂「C3-6環烷基」表示自構成環的碳原子數為3至6個之單環系、縮合環系、交聯環系或螺環系之脂肪族烴環除去1個任意位置的氫原子之1價取代基，作為具體例子，可舉出環丙基、環丁基、環戊基、環己基等。
所謂「C1-6烷氧基」表示前述「C1-6烷基」於氧基(-O-)鍵結的基。
所謂「單C1-6烷基胺基」表示1個前述C1-6烷基鍵結於胺基的基，例如可舉出甲基胺基、乙基胺基、n-丙基胺基、異丙基胺基、n-丁基胺基、異丁基胺基、sec-丁基胺基、tert-丁基胺基、n-戊基胺基、異戊基胺基、新戊基胺基、n-己基胺基及異己基胺基等。
所謂「二C1-6烷基胺基」表示相同或相異的2個前述「C1-6烷基」鍵結於胺基的基，例如可舉出二甲基胺基、二乙基胺基、二-n-丙基胺基、二異丙基胺基、二-n-丁基胺基、二異丁基胺基、二-t-丁基胺基、二-n-戊基胺基、二-n-己基胺基、N-乙基-N-甲基胺基、N-甲基-N-n-丙基胺基、N-異丙基-N-甲基胺基、N-n-丁基-N-甲基胺基、N-異丁基-N-甲基胺基、N-t-丁基-N-甲基胺基、N-甲基-N-n-戊基胺基、N-n-己基-N-甲基胺基、N-乙基-N-n-丙基胺基、N-乙基-N-異丙基胺基、N-n-丁基-N-乙基胺基、N-乙基-N-異丁基胺基、N-t-丁基-N-乙基胺基、N-乙基-N-n-戊基胺基、N-乙基-N-n-己基胺基等。
「C1-6烷氧基羰基」、「單C1-6烷基胺基羰基」及「二C1-6烷基胺基羰基」等表示各前述「C1-6烷氧基」、「單C1-6烷基胺基」及「二C1-6烷基胺基」鍵結於羰基(-C(O)-)的基。
所謂「C6-10芳基」表示自構成環的原子皆為碳原子之碳原子數為6至10個的單環式或二環式之芳香族烴環除去1個任意位置之氫原子的1價取代基，作為具體例子可舉出苯基及萘基等。
所謂「5-10員雜芳基」表示自構成環之原子數為5至10個，構成環之原子中含有1至5個雜原子(該雜原子表示氮原子、氧原子或硫原子，2個以上時可相同亦可相異)之單環系或縮合環系的芳香族雜環除去1個任意位置之氫原子的1價取代基。
作為單環系之「5-10員雜芳基」，可舉出2-噻吩基、3-噻吩基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-吡喃基、3-吡喃基、4-吡喃基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、1-吡唑基、3-吡唑基、4-吡唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、3-異噻唑基、4-異噻唑基、5-異噻唑基、1,2,4-三唑-1-基、1,2,4-三唑-3-基、1,2,4-三唑-5-基、1,2,3-三唑-1-基、1,2,3-三唑-4-基、1,2,3-三唑-5-基、2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-吡嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、3-噠嗪基、4-噠嗪基、1,3,4-噁二唑-2-基、1,3,4-噻二 唑-2-基、1,2,4-噁二唑-3-基、1,2,4-噁二唑-5-基、1,2,4-噻二唑-3-基、1,2,4-噻二唑-5-基、1,2,5-噁二唑-3-基及1,2,5-噻二唑-3-基等。
作為縮合環系的「5-10員雜芳基」，可舉出2-苯並呋喃基、3-苯並呋喃基、4-苯並呋喃基、5-苯並呋喃基、6-苯並呋喃基、7-苯並呋喃基、1-異苯並呋喃基、4-異苯並呋喃基、5-異苯並呋喃基、2-苯並噻吩基、3-苯並噻吩基、4-苯並噻吩基、5-苯並噻吩基、6-苯並噻吩基、7-苯並噻吩基、1-異苯並噻吩基、4-異苯並噻吩基、5-異苯並噻吩基、2-苯並噻唑基、3-苯並噻唑基、4-苯並噻唑基、5-苯並噻唑基、6-苯並噻唑基、7-苯並噻唑基、2-色烯基、3-色烯基、4-色烯基、5-色烯基、6-色烯基、7-色烯基、8-色烯基、1-吲哚嗪基、2-吲哚嗪基、3-吲哚嗪基、5-吲哚嗪基、6-吲哚嗪基、7-吲哚嗪基、8-吲哚嗪基、1-異吲哚基、2-異吲哚基、4-異吲哚基、5-異吲哚基、1-吲哚基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基、1-吲唑基、2-吲唑基、3-吲唑基、4-吲唑基、5-吲唑基、6-吲唑基、7-吲唑基、1-嘌呤基、2-嘌呤基、3-嘌呤基、6-嘌呤基、7-嘌呤基、8-嘌呤基、2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基、8-喹啉基、1-異喹啉基、3-異喹啉基、4-異喹啉基、5-異喹啉基、6-異喹啉基、7-異喹啉基、8-異喹啉基、1-酞嗪基、5-酞嗪基、6-酞嗪基、2,7-氮雜萘-1-基、2,7-氮雜萘-3-基、2,7-氮雜萘-4-基、2,6-氮雜萘-1- 基、2,6-氮雜萘-3-基、2,6-氮雜萘-4-基、1,8-氮雜萘-2-基、1,8-氮雜萘-3-基、1,8-氮雜萘-4-基、1,7-氮雜萘-2-基、1,7-氮雜萘-3-基、1,7-氮雜萘-4-基、1,7-氮雜萘-5-基、1,7-氮雜萘-6-基、1,7-氮雜萘-8-基、1,6-氮雜萘-2-基、1,6-氮雜萘-3-基、1,6-氮雜萘-4-基、1,6-氮雜萘-5-基、1,6-氮雜萘-7-基、1,6-氮雜萘-8-基、1,5-氮雜萘-2-基、1,5-氮雜萘-3-基、1,5-氮雜萘-4-基、1,5-氮雜萘-6-基、1,5-氮雜萘-7-基、1,5-氮雜萘-8-基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、6-喹喔啉基、2-喹唑啉基、4-喹唑啉基、5-喹唑啉基、6-喹唑啉基、7-喹唑啉基、8-喹唑啉基、3-噌啉基、4-噌啉基、5-噌啉基、6-噌啉基、7-噌啉基、8-噌啉基、2-喋啶基、4-喋啶基、6-喋啶基及7-喋啶基等。
所謂「芳烷基」表示前述「C1-6烷基」的任意氫原子由前述「C6-10芳基」所取代的1價取代基。
所謂「雜芳烷基」表示前述「C1-6烷基」的任意氫原子藉由前述「5-10員雜芳基」所取代的1價取代基。
所謂「3-11員含氮非芳香族雜環基」表示自含有至少1個以上氮原子之構成環的原子數為3至11個之單環系、縮合環系(該縮合環系中非芳香族環可縮合為非芳香族環或芳香族環)、交聯環系或螺環系的非芳香族性之雜環除去1個任意位置之氫原子的1價取代基，可舉出氮雜環丁基、吡咯烷基、2-氧代吡咯烷基、哌啶基、3-氧代哌啶基、哌嗪基、嗎啉代基、硫代嗎啉代基、高嗎啉 代基、高哌嗪基等。
「C1-40烷基硫基」、「C3-6環烷基硫基」、「C6-10芳基硫基」、「5-10員雜芳基硫基」、「芳烷基硫代基」及「雜芳基硫基」等表示各前述「C1-40烷基」、「C3-6環烷基」、「C6-10芳基」、「5-10員雜芳基」、「芳烷基」及「雜芳基」鍵結於硫代基(-S-)之基。
對於本說明書，所謂成為寡核苷酸之構成單位的「核苷酸」表示於核酸鹼為糖(例如可舉出核糖、2’-脫氧核糖、2’位與4’位經交聯的核糖)的1’位藉由N-糖苷化所鍵結的化合物。
其中，前述核糖及2’-脫氧核糖為無取代，或由選自由C1-6烷基、鹵素原子、羥基、胺基、以基本保護基所保護的羥基、經保護的胺基所成群的1個以上取代基所取代。又，前述C1-6烷基為無取代，或獨立由選自由鹵素原子、C1-6烷氧基羰基、單C1-6烷基胺基羰基及二C1-6烷基胺基羰基等1個以上取代基所取代。前述C1-6烷氧基羰基、單C1-6烷基胺基羰基及二C1-6烷基胺基羰基等為無取代，或由C6-10芳基、5-10員雜芳基或3-11員含氮非芳香族雜環基所取代。
所謂2’位與4’位經交聯的核糖僅為核苷酸的2’位與4’位藉著交聯基進行交聯，並無限定，例如可舉出2’位與4’位以C2-6伸烷基(該伸烷基為無取代，或由C1-6烷基所取代。又該伸烷基的1個或者2個伸甲基未被取代，或 由選自由-O-、-NR11-(R11表示氫原子或C1-6烷基)、-S-、-CO-、-CS-、-COO-、-OCONR12-(R12表示氫原子或C1-6烷基)、-CONR13-(R13表示氫原子或C1-6烷基)及-CSNR14-(R14表示氫原子或C1-6烷基)的基所取代)進行交聯的核糖。作為具體例子可舉出下述式化合物。核苷酸的糖較佳為核糖或2’-脫氧核糖。
對於本說明書，所謂「核酸鹼」僅為使用於核酸之合成者即可，並無特別限制，例如可舉出胞嘧啶基、尿嘧啶基、胸腺嘧啶基、5-甲基胞嘧啶基等嘧啶鹼、腺苷酸基、鳥苷酸基等嘌呤鹼。又，所謂「經保護的核酸鹼」表示例如可舉出具有胺基的核酸鹼之腺苷酸基、鳥苷酸基、或胞嘧啶基中，胺基經保護者、具有羥基之核酸鹼時羥基經保護者、具有硫醇基之核酸鹼時硫醇基經保護者、或對於具有羰基的核酸鹼，與於該環被取代的胺基或羥基經共軛而羰基成為羥基的形式而被保護者等意思，以可耐得住以3’位或5’位中之一時保護基的脫保護條件之 保護基所保護的核酸鹼為佳。
作為前述核酸鹼中之「胺基的保護基」，並無特別限定，例如可舉出PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS、第3版、JOHN WILLY&SONS出版(1999年)等所記載的保護基。作為該「胺基的保護基」之具體例子，例如可舉出新戊醯基、戊醯氧基甲基、三氟乙醯基、苯氧基乙醯基、4-異丙基苯氧基乙醯基、4-tert-丁基苯氧基乙醯基、乙醯基、苯甲醯基、異丁醯基、二甲基甲脒基、9-芴基甲基氧羰基等。彼等中，以苯氧基乙醯基、4-異丙基苯氧基乙醯基、乙醯基、苯甲醯基、異丁醯基、及二甲基甲脒基為佳。
作為前述核酸鹼中之「羥基的保護基」，並無特別限定，例如可舉出PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS、第3版、JOHN WILLY&SONS出版(1999年)等記載的任意保護基。具體為可舉出烷基(甲基、tert-丁基等)、芳基甲基(苯甲基、p-甲氧基苯甲基等)、烷氧基烷基(甲氧基甲基、甲氧基乙基、氰基乙氧基甲基、乙氧基乙基等)、2-四氫吡喃基、氰基乙基、胺基甲醯基(苯基胺基甲醯基、1,1-二氧代硫代嗎啉-4-硫代胺基甲醯基等)、醯基(乙醯基、新戊醯基、異丁醯基、苯甲醯基、苯氧基乙醯基、乙醯丙醯基、3-苯甲醯基丙醯基等)、矽基(三甲基矽基、三乙基矽基、三異丙基矽基、tert-丁基二甲基矽基、tert-丁基二苯基矽基等)、[(三異丙基矽基)氧基]甲基(Tom基)、1-(4-氯苯基)-4-乙氧基哌啶- 4-基(Cpep基)等。這些中亦以乙醯基、苯甲醯基、苯甲基或p-甲氧基苯甲基為佳。
作為前述核酸鹼中之「硫醇基的保護基」，除與「羥基之保護基」的同様保護基以外，可舉出形成二硫化物鍵結的保護基。
又，當核酸鹼的羰基經共軛而成為羥基形式而受到保護時，例如可將酚、2,5-二氯酚、3-氯酚、3,5-二氯酚、2-甲醯基酚、2-萘酚、4-甲氧基酚、4-氯酚、2-硝基酚、4-硝基酚、4-乙醯胺基酚、五氟酚、4-戊醯氧基苯甲基醇、4-硝基苯乙基醇、2-(甲基磺醯基)乙醇、2-(苯基磺醯基)乙醇、2-氰基乙醇、2-(三甲基矽基)乙醇、二甲基胺基甲酸氯化物、二乙基胺基甲酸氯化物、乙基苯基胺基甲酸氯化物、1-吡咯烷羧酸氯化物、4-嗎啉羧酸氯化物、二苯基胺基甲酸氯化物等經反應後保護羰基。
又，於該「核酸鹼」中，於除上述基以外，亦包含核酸鹼藉由任意取代基(例如可舉出鹵素原子、烷基、芳烷基、烷氧基、醯基、烷氧基烷基、羥基、胺基、單烷基胺基、二烷基胺基、羧基、氰基、硝基等)，於任意位置上以1至3個經取代的修飾核酸鹼(例如可舉出8-溴腺苷酸基、8-溴鳥苷酸基、5-溴胞嘧啶基、5-碘胞嘧啶基、5-溴尿嘧啶基、5-碘尿嘧啶基、5-氟尿嘧啶基、5-甲基胞嘧啶基、8-氧代鳥苷酸基、次黃嘌呤基等)。
〔伸長反應循環〕
所謂本說明書中「伸長反應循環」表示，將具有擬似固相保護基的核苷酸或寡核苷酸進行H-膦酸酯化後，與具有羥基的核苷酸或寡核苷酸進行反應，得到具有擬似固相保護基的核苷酸或寡核苷酸與具有羥基的核苷酸或寡核苷酸介著含有磷的基進行鍵結的共軛物之反應循環。
伸長反應循環為，例如含有具有擬似固相保護基，除去於3’位或5’位具有以一時保護基進行保護的羥基之核苷酸或寡核苷酸的一時保護基而生成羥基的步驟、含有將生成的羥基進行H-膦酸酯化後得到H-膦酸酯體之步驟、由H-膦酸酯體與具有羥基的核苷酸或寡核苷酸，得到這些介著亞磷酸二酯鍵進行鍵結的寡核苷酸之步驟。
〔擬似固相保護基〕
所謂本發明中所使用的擬似固相保護基表示，藉由將該保護基具有反應基質，使反應基質及反應生成物於低極性溶劑為可溶化，可進行液相中之反應的同時，藉由一定以上極性溶劑的添加使反應生成物或反應基質沈澱，成為可固液分離之保護基，在除去5’位羥基或者3’位羥基的下述一時保護基之條件下為安定之保護基。藉由使用具有擬似固相保護基的反應基質，可兼具反應性與後處理之簡便性。
作為擬似固相保護基，可舉出下述式(I)所示基。
式中，*表示擬似固相保護基與所要保護的基之鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L5為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，L6為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基， m為0或1。
其中，L2為-COO-或-O-，L4為-OCO-或-O-時，L3為C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基者為佳。
作為擬似固相保護基的代表例子，例如可舉出3,4,5-參(十八烷氧基)苯甲基氧基琥珀醯基(3-{3,4,5-參(十八烷氧基)苯甲基氧羰基}丙醯基)、3,4,5-參(十八烷氧基)苯甲醯基、4-氧代-4-(2,4,6-參(十八烷氧基)苯基)丁醯基、2-(3,4,5-參(十八烷氧基)苯甲醯胺)乙氧基琥珀醯基(3-[2-{3,4,5-參(十八烷氧基)苯甲醯胺}乙氧基羰基]丙醯基)、2-(N-甲基-3,4,5-參(十八烷氧基)苯甲醯胺)乙氧基琥珀醯基(3-[2-{N-甲基-3,4,5-參(十八烷氧基)苯甲醯胺}乙氧基羰基]丙醯基)、(N-甲基-3,4,5-參(十八烷氧基)苯甲醯胺)乙醯基、((3,4,5-參(十八烷氧基)苯甲醯基)氧基)甲基、及2-(N-甲基-3,4,5-參(十八烷氧基)苯甲醯胺)乙氧基琥珀醯基氧基甲基({(3-[2-{N-甲基-3,4,5-參(十八烷氧基)苯甲醯胺}乙氧基羰基]丙醯基)氧基}甲基)等。
作為擬似固相保護基的具體例子，亦可舉出國際公開第2014-077292號等所揭示的基。
擬似固相保護基較佳為下述式(II)所示基。
式中，*表示擬似固相保護基與所要保護的基 之鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)或-O-。
其中，L2為-COO-或-O-，L4為-OCO-或-O-時，L3以C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基者為較佳。
擬似固相保護基更佳為下述式(III)所示基。
式中，*表示擬似固相保護基與所要保護的基之鍵結位置， R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為C1-6伸烷基或C2-6伸烯基，L3為C1-6伸烷基或C2-6伸烯基，R2為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基或C2-6烯基。
又，擬似固相保護基更佳為下述式(IV)所示基。
式中，*表示擬似固相保護基與所要保護的基之鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為C1-6伸烷基或C2-6伸烯基，L3為C1-6伸烷基或C2-6伸烯基。
又，擬似固相保護基更佳為下述式(IV-2)所示基。
式中，*表示擬似固相保護基與所要保護的基之鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1 至5的整數，L1為C1-6伸烷基或C2-6伸烯基。
又，擬似固相保護基更佳為下述式(IV-3)所示基。
式中，*表示擬似固相保護基與所要保護的基之鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為C1-6伸烷基或C2-6伸烯基，R2為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基或C2-6烯基。
對於式(II)至式(IV-2)，L1以C1-6伸烷基為佳，特佳為伸乙基。
對於式(IV-3)，L1以C1-6伸烷基為佳，特佳為伸甲基。
對於式(II)至式(IV)，L3以C1-6伸烷基為佳，特佳為伸甲基或伸乙基。
對於式(II)、式(III)及式(IV-3)，R2以氫原子或C1-6烷基為佳，特佳為氫原子或甲基。
做為其他態様，以擬似固相保護基較佳為下述式(V)所示基。
式中，*表示擬似固相保護基與所要保護的基之鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L5為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，L6為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基。
其中，L2為-COO-或-O-，L4為-OCO-或-O-時，L3為C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基為較佳。
擬似固相保護基更佳為下述式(VI)
(式中，*表示擬似固相保護基與所要保護的基之鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為C1-6伸烷基或C2-6伸烯基，L3為C1-6伸烷基或C2-6伸烯基，L4為單鍵或-N(R2)CO-(式中R2為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基或C2-6烯基)，L5為氫原子或C1-6烷基，L6為氫原子或C1-6烷基)所示基、或下述式(VII)
(式中，*表示擬似固相保護基與所要保護的基之鍵結位置， L5為氫原子或C1-6烷基，L6為氫原子或C1-6烷基)所示基。
擬似固相保護基更佳為前述式(VII)所示基。
對於式(I)、式(V)及(VI)，L1以C1-6伸烷基為佳，特佳為伸甲基或伸乙基。
對於式(I)、式(V)及(VI)，L3較佳為C1-6伸烷基，特佳為伸甲基或伸乙基。
對於式(I)、式(V)至式(VII)，L5及L6特佳為氫原子。
式(I)至式(VII)所示擬似固相保護基的R1以C10-30烷基或C10-30烯基為佳，較佳為C10-30烷基，更佳為C15-25烷基，更較佳為C15-20烷基，特佳為十八烷基。
式(I)至式(VII)所示擬似固相保護基的較佳為2至4的整數，更佳為3。
對於式(I)至式(VII)，s為2至5時，各R1可為相同或相異。
〔一時保護基〕
所謂使用於本發明的一時保護基表示保護5’位羥基或者3’位羥基之保護基，對於前述「伸長反應循環」為經脫保護的保護基。經脫保護的5’位羥基或者3’位羥基對於伸長反應循環，經H-膦酸酯化後，被利用於與其他核苷酸或寡核苷酸之鍵結。一時保護基，例如可舉出如以下文 獻所記載的保護基。
Protective Groups in Organic Synthesis,Greene T.W.and Wuts P.G.M.,published by Wiley Interscience,1999及Protecting Groups,Kocienski P.J.,1994,Georg Thieme Verlag。
〔基本保護基〕
所謂本發明所使用的基本保護基表示，其為保護核酸鹼中之胺基、羰基、羥基、或者硫醇基或、2’位羥基、3’位羥基或者5’位羥基、或磷酸二酯鍵的羥基或者硫代磷酸二酯鍵之硫醇基的保護基，對於前述「伸長反應循環」中未被脫保護，且不具有前述「擬似固相保護基」所具有的功能之一般保護基。基本保護基，例如可舉出如以下文獻所記載的保護基。
Protective Groups in Organic Synthesis,Greene T.W.and Wuts P.G.M.,published by Wiley Interscience,1999及Protecting Groups,Kocienski P.J.,1994,Georg Thieme Verlag。
使用於核酸鹼中之胺基、羥基、或者硫醇基的基本保護基如前述核酸鹼中之「胺基的保護基」、前述核酸鹼中之「羥基的保護基」、前述核酸鹼中之「硫醇基的保護基」。
使用於核酸鹼中之羰基的基本保護基，可舉出苯氧基、2,5-二氯苯基、3-氯苯基、3,5-二氯苯基、2-甲 醯基苯基、2-萘基、4-甲氧基苯基、4-氯苯基、2-硝基苯基、4-硝基苯基、4-乙醯胺基苯基、五氟苯基、4-戊醯氧基苯甲基烷基、4-硝基苯乙基烷基、2-(甲基磺醯基)乙基、2-(苯基磺醯基)乙基、2-氰基乙基、2-(三甲基矽基)乙基、二甲基胺基羰基、二乙基胺基羰基、N-甲基-N-苯基胺基甲醯基、1-吡咯烷羰基、4-嗎啉代羰基、N,N-二苯基胺基羰基等，依據前述方法，可得到具有上述經保護的羰基之核苷酸或寡核苷酸。
2’位羥基的基本保護基為作為Xz中之「以基本保護基所保護的羥基」的基本保護基如後述。3’位羥基及5’位羥基的基本保護基作為Z中之「以基本保護基所保護的羥基」的基本保護基如後述。
保護磷酸二酯鍵的羥基或者硫代磷酸二酯鍵的硫醇基之基本保護基如後述。
以保護基進行保護的官能基(以擬似固相保護基進行保護的羥基及核酸鹼、以一時保護基進行保護的羥基、以基本保護基所保護的羥基、胺基、硫醇基等)表示各該官能基之氫原子藉由該保護基進行取代的意思。
本說明書中「於4位碳原子進行交聯的有機基」表示將糖的2’位與4’位進行交聯的有機基，雖無特別限定，例如可舉出C2-6伸烷基(該伸烷基可為無取代，或由C1-6烷基所取代。其中，該伸烷基的1個或者2個伸甲基未被取代，或由選自-O-、-NR11-(R11表示氫原子或C1-6烷基)、-S-、-CO-、-CS-、-COO-、-OCONR12-(R12 表示氫原子或C1-6烷基)、-CONR13-(R13表示氫原子或C1-6烷基)及-CSNR14-(R14表示氫原子或C1-6烷基)的基所取代)之交聯基。
〔寡核苷酸的製造方法〕
其次，對於有關本發明之寡核苷酸的製造方法(以下亦稱為「本發明之製造方法」)做說明。具體對於由以擬似固相保護基所保護的核苷酸或寡核苷酸(以下亦稱為「n個聚合寡核苷酸」)，以核苷酸或寡核苷酸(以下亦稱為「p個聚合寡核苷酸」)進行伸長，製造以擬似固相保護基進行保護的寡核苷酸(以下亦稱為「n+p個聚合寡核苷酸」)的方法做說明。且所謂n個聚合寡核苷酸表示n個核苷酸介著含有磷的基進行鍵結之寡核苷酸，n=1時，n個聚合寡核苷酸被分解為核苷酸，對於p個聚合寡核苷酸亦為同様。
其中，n個聚合寡核苷酸為具有2個以上核酸鹼部時，各核酸鹼部可為相同或相異，n個聚合寡核苷酸為具有2個以上擬似固相保護基時，各擬似固相保護基可為相同或相異，n個聚合寡核苷酸為具有2個以上基本保護基時，各基本保護基可為相同或相異，n個聚合寡核苷酸為具有2個以上之4位碳原子進行交聯的有機基時，於各4位碳原子進行交聯的有機基可為相同或相異。
對於p個聚合寡核苷酸亦為同様。
寡核苷酸的製造方法為含有於選自由2’位、 3’位、5’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有擬似固相保護基，將5’位或3’位為羥基之核苷酸或寡核苷酸的該5’-羥基或3’-羥基經H-膦酸酯化的膦酸酯化步驟。
又，寡核苷酸的製造方法為含有至少一種含有前述H-膦酸酯化步驟之伸長反應循環。
寡核苷酸的製造方法為於伸長反應循環，係以含有將持有擬似固相保護基之核苷酸或寡核苷酸的5’位羥基或3’位羥基進行H-膦酸酯化之步驟為特徵。寡核苷酸的製造方法較佳為將以下步驟a至步驟d含於伸長反應循環。且，步驟a至步驟d的順序為，以步驟a、步驟b、步驟c、步驟d的順序進行，或以步驟a、步驟d、步驟b、步驟c的順序進行。較佳順序為步驟a、步驟b、步驟c、步驟d之順序。
(步驟a)
步驟a為含有於非伸長末端的羥基、核酸鹼部及2’位之中的至少1個具有擬似固相保護基，且除去伸長末端的羥基以一時保護基進行保護的核苷酸或寡核苷酸之一時保護基後成為羥基之脫一時保護基步驟。
(步驟b)
步驟b為含有將除去一時保護基的羥基藉由H-膦酸酯化試藥進行H-膦酸酯化之膦酸酯化步驟。
(步驟c)
步驟c為含有對於在步驟b經H-膦酸酯化的核苷酸或寡核苷酸，添加具有羥基的核苷酸或寡核苷酸，介著該羥基經亞磷酸二酯鍵使其縮合的偶合步驟。
(步驟d)
步驟d為含有將所形成之亞磷酸二酯鍵變換為磷酸二酯鍵、硫代磷酸二酯鍵、胺基磷酸二酯鍵、硼烷磷酸二酯鍵、以基本保護基進行保護的磷酸二酯鍵(磷酸三酯鍵)或以基本保護基進行保護的硫代磷酸二酯鍵(硫代磷酸-O,O,S-三酯鍵)等變換步驟。
其中，前述胺基磷酸二酯鍵的胺基可為無取代，或以1或者2個C1-6烷基進行取代。
以基本保護基進行保護的磷酸二酯鍵為，磷酸二酯鍵的1個羥基之氫原子為藉由C1-40烷基、C3-6環烷基、C6-10芳基、5-10員雜芳基、芳烷基或雜芳烷基等進行取代的鍵。其中，前述C1-6烷基為無取代或藉由鹵素原子、氰基等所取代。C3-6環烷基、C6-10芳基、5-10員雜芳基、芳烷基及雜芳烷基為無取代，或藉由C1-6烷基、鹵素原子、氰基等所取代。
以基本保護基進行保護的硫代磷酸二酯鍵為，硫代磷酸二酯鍵的1個硫醇基之氫原子藉由C1-40烷基、C3-6環烷基、C6-10芳基、5-10員雜芳基、芳烷基或雜芳烷基等所取代的鍵。其中前述C1-40烷基為無取代，或藉由鹵 素原子、氰基等所取代。C3-6環烷基、C6-10芳基、5-10員雜芳基、芳烷基及雜芳烷基為無取代，或藉由C1-6烷基、鹵素原子、氰基等所取代。
含於在步驟a所使用的具有擬似固相保護基之核苷酸或寡核苷酸的核苷酸數n若為1以上之任意整數即可，並無特別限定，以1至50為佳，較佳為1至30，更佳為1至20，更較佳為1至10，特佳為1至5。
含於在步驟c所示使用的具有羥基之核苷酸或寡核苷酸的核苷酸數p若為1以上的任意整數即可，並無特別限定，以1至50為佳，較佳為1至30，更佳為1至20，更較佳為1至5，進一步較佳為1至3，特佳為1，換言之使用核苷酸為特佳。
且，將在步驟d所得之反應混合物可直接使用於步驟a。又，藉由於步驟d終了後適宜地昇溫等，可同時進行步驟a。
寡核苷酸的製造方法可進一步藉由含有下述步驟e，可簡便且有效果地除去過剩原料或副產物，純化核苷酸或寡核苷酸。
(步驟e)
步驟e為於在步驟a至步驟d中任一所得之反應混合物添加極性溶劑，使具有擬似固相保護基之核苷酸或寡核苷酸沈澱後，藉由固液分離取得之分離步驟。
且，步驟e並未存在於未使用擬似固相保護基之通常 液相合成法，亦未存在於固相合成法，其為使用擬似固相保護基的液相合成法之特有步驟。
含於伸長反應循環之步驟e的數目並無特別限制。步驟e亦可在步驟a至步驟d中任一步驟後進行。
步驟e為於步驟a至步驟d的各步驟後，各獨立例如含有0~5次，較佳為含有0~3次，更佳為含有0~2次，更較佳為含有0或1次。其中，步驟a~d之後至少1個為含有1次以上的步驟e。
於伸長反應循環中，以含有1至4次的步驟e者為佳。步驟e為，伸長反應循環中，於步驟a之後、步驟b之後及步驟d之後的至少1個中含有各1次時，可嚴格地控制副產物產生，由可達到高純度寡核苷酸之觀點來看為佳。步驟e為於伸長反應循環中，於步驟b之後含有1次，或於步驟d之後含有1次，或於步驟b及步驟d之後各含1次較佳。
作為其他態様，步驟e為在伸長反應循環中，於步驟a之後含有1次，或於步驟b之後含有1次，或於步驟a及步驟b之後各含有1次，但較佳為步驟a及步驟b之後各含有1次為較佳。
藉由原料之當量管理與控制反應，可控制副產物之產生量的狀況即可，將步驟a至步驟d作為基本單位重複後，進行步驟e者為佳。
寡核苷酸的製造方法可進一步含有步驟f。藉此可分離並製造所望寡核苷酸。
(步驟f)
步驟f為將在步驟a至步驟e所得之寡核苷酸的基本保護基、一時保護基及擬似固相保護基全除去的脫保護步驟。
寡核苷酸的製造方法為藉由寡核苷酸的伸長方向，主要可分類為方法A或方法B。方法A中，將5’位的羥基藉由步驟a至步驟c進行變換，於5’位伸長核苷酸或寡核苷酸。在方法B中，將3’位的羥基藉由步驟a至步驟c進行變換，於3’位伸長核苷酸或寡核苷酸。
方法A為含有，含有於選自由2’位、3’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有擬似固相保護基，於3’位具有以基本保護基或擬似固相保護基進行保護的羥基，於5’位具有以一時保護基進行保護的羥基之第一核苷酸或第一寡核苷酸的一時保護基經除去後生成5’-羥基的步驟之第一步驟(步驟a)與、含有將所生成的5’-羥基使用H-膦酸酯化試藥進行H-膦酸酯化的步驟之第二步驟(步驟b)與由進行H-膦酸酯化的5’-羥基與於3’位具有羥基，於5’位具有以一時保護基進行保護的羥基之第二核苷酸或第二寡核苷酸的3’-羥基行程亞磷酸二酯鍵，得到第一核苷酸或第一寡核苷酸與第二核苷酸或第二寡核苷酸之共軛物的第三步驟(步驟c)與含有將共軛物的亞磷酸二酯鍵轉換為磷酸二酯鍵、硫 代磷酸二酯鍵、硼烷磷酸二酯鍵、胺基磷酸二酯鍵、以基本保護基進行保護的磷酸二酯鍵、或以基本保護基進行保護的硫代磷酸二酯鍵者之第四步驟(步驟d)的寡核苷酸之製造方法。
方法B為含有含有於選自由2’位、5’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有擬似固相保護基，於5’位具有以基本保護基或擬似固相保護基進行保護的羥基，於3’位具有以一時保護基進行保護的羥基之第三核苷酸或第三寡核苷酸的一時保護基經除去而生成3’-羥基之步驟的第七步驟(步驟a)與含有將所生成的3’-羥基使用H-膦酸酯化試藥進行H-膦酸酯化之步驟的第八步驟(步驟b)與經H-膦酸酯化的3’-羥基與於5’位具有羥基，於3’位具有以一時保護基進行保護的羥基之第四核苷酸或第四寡核苷酸的5’-羥基形成亞磷酸二酯鍵，得到第三核苷酸或第三寡核苷酸與第四核苷酸或第四寡核苷酸之共軛物的第九步驟(步驟c)與含有將共軛物的亞磷酸二酯鍵變換為磷酸二酯鍵、硫代磷酸二酯鍵、硼烷磷酸二酯鍵、胺基磷酸二酯鍵、以基本保護基所保護的磷酸二酯鍵、或以基本保護基所保護的硫代磷酸二酯鍵之步驟的第十步驟(步驟d)之寡核苷酸的製造方法。
以下對於步驟a至步驟f的順序作詳細說明。
(步驟a)(脫一時保護基步驟)
首先，將方法A或方法B的各情況的步驟a表示流程1或2。
方法A中之步驟a對於低極性溶劑中，將5’位羥基為可由氟試藥、酸或鹼進行除的一時保護基R所保護的n個聚合寡核苷酸(ia)(式中，n表示1以上的任意整數，n=1時表示核苷酸)的一時保護基R，藉由氟試藥、酸或鹼的添加除去之步驟(脫一時保護基步驟)(流程1)。
流程中，n表示1以上的任意整數，Basez為獨立表示各核酸鹼、以基本保護基所保護的核酸鹼或以擬似固相保護基所保護的核酸鹼，R表示一時保護基，Xz為獨立表示各氫原子、鹵素原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、於第4位碳原子進行交聯的有機基或以擬似固相保護基所保護的羥基，Y為獨立表示各氫原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、硫醇基、以基本保護基所保護 的硫醇基、氫化硼、單C1-6烷基胺基或二C1-6烷基胺基，Z表示基本保護基、一時保護基或擬似固相保護基。其中，BaseZ、XZ及Z之中至少1個中含有擬似固相保護基。
其中，流程1中化合物(ia)或(iia)為具有2個以上核酸鹼部時，各核酸鹼部可為相同或相異，(ia)或(iia)具有2個以上擬似固相保護基時，各擬似固相保護基可為相同或相異，(ia)或(iia)具有2個以上基本保護基時，各基本保護基可為相同或相異，n個聚合寡核苷酸為具有於2個以上4位碳原子進行交聯的有機基時，於各4位碳原子進行交聯的有機基可為相同或相異。
方法B中之(步驟a)，對於低極性溶劑中，將3’位羥基藉由氟試藥、可由酸或鹼除去的以一時保護基R進行保護的n個聚合寡核苷酸(ib)(式中，n表示1以上的任意整數，n=1時表示核苷酸)的一時保護基R藉由氟試藥、酸或鹼之添加而除去之步驟(脫一時保護基步驟)(流程2)。且，流程中，n、Basez、R、Xz、Y及Z與流程1中的定義相同。
擬似固相保護基以含於BaseZ及Z之中的至少1個者為佳，含於Z之中者為較佳。
Z較佳為基本保護基或擬似固相保護基，更佳為擬似固相保護基。
含於XZ或Z的較佳擬似固相保護基為前述式(I)至(VII)所示基，較佳態様亦相同。
含於Basez之擬似固相保護基為下述式(I)所示基，m為1基或或m為0，L1、L2、L3及L4中之單鍵數以0至3的基為佳。
式中，*表示與核酸鹼部之鍵結位置，其他記號與前述式(I)中之定義相同，較佳態様亦相同。
含於Basez的擬似固相保護基為下述式(II)所示基，L1、L2、L3及L4中，單鍵數為0至3的基為較佳。
式中，*表示與核酸鹼部之鍵結位置，其他記 號為與前述式(II)中之定義相同，較佳態様亦相同。
含於Basez的擬似固相保護基以下述式(III)所示基為更佳。
式中，*表示與核酸鹼部之鍵結位置，其他記號與前述式(II)中之定義相同。
又，Basez中所含之擬似固相保護基以下述式(IV)所示基為更佳。
式中，*表示與核酸鹼部之鍵結位置，其他記號與前述式(IV)中之定義相同。
又，含於XZ或Z之擬似固相保護基以下述式(IV-2)所示基者為更佳。
式中，*表示與核酸鹼部之鍵結位置，其他記號與前述式(IV-2)中之定義相同。
又，含於XZ或Z之擬似固相保護基以下述式(IV-3)所示基為更佳。
式中，*表示與核酸鹼部之鍵結位置，其他記號與前述式(IV-3)中之定義相同。
含於Basez的式(II)至式(IV-3)所示擬似固相保護基之L1較佳為C1-6伸烷基，特佳為伸乙基。
含於Basez之式(II)至式(IV)所示擬似固相保護基的L3較佳為C1-6伸烷基，特佳為伸甲基或伸乙基。
作為其他態様，含於Basez之擬似固相保護基較佳為下述式(V)所示基。
式中，*表示與核酸鹼部之鍵結位置，其他記號與前述式(V)中之定義相同，較佳態様亦相同。
含於Basez的擬似固相保護基更佳為下述式(VI)
(式中，*表示與核酸鹼部之鍵結位置，其他記號與前述式(VI)中之定義相同)所示基、或下述式(VII)
(式中，*表示與核酸鹼部之鍵結位置，其他記號與前述式(VII)中之定義相同)所示基。
含於Basez的擬似固相保護基更較佳為前述式(VII)所示基。
含於Basez的式(I)、式(V)或(VI)所示擬似固相保護基之L1較佳為C1-6伸烷基，特佳為伸甲基或伸乙基。
含於Basez的式(I)、式(V)或(VI)所示擬似固相保護基之L3較佳為C1-6伸烷基，特佳為伸甲基或伸乙基。
含於Basez的式(I)、式(V)至式(VII)所示擬似固相保護基之L5及L6特佳為氫原子。
含於Basez之式(I)至式(VII)所示擬似固相保護基的R1較佳為C10-30烷基或C10-30烯基，更佳為C10-30烷基。
含於Basez之式(I)至式(VII)所示擬似固相保護基的s 較佳為2至4的整數，更佳為3。
對於式(I)至式(VII)，s為2至5時，各R1可為相同或相異。
m=1之式(I)、式(V)至式(VII)所示擬似固相保護基導入於胸腺嘧啶或尿嘧啶時，特別有用。
可使用於寡核苷酸之伸長末端的羥基之一時保護基R可藉由氟試藥、酸或鹼進行脫保護，若為可作為羥基的保護基所使用者即可，並無特別限定。作為以氟試藥可脫保護的一時保護基R，可舉出矽基(tert-丁基二甲基矽基、三乙基矽基、三甲基矽基等)。作為可以酸進行脫保護的一時保護基R，可舉出葉黃素基(9-(9-苯基)葉黃素基、9-苯基硫基葉黃素基等)、烷氧基烷基(1-甲氧基-1-甲基乙基、1,3-二呋喃-2-基、1,3-苯並二氧雜環戊-2-基等)、烷基硫基烷基(1,3-二硫戊環-2-基、1,3-苯並二硫醇-2-基)、烷氧基羰基(tert-丁基氧羰基等)、及三芳基甲基(三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、單甲氧基三苯甲基等)等。作為以鹼可進行脫保護之一時保護基R，可舉出乙醯丙醯基、3-苯甲醯基丙醯基。較佳為tert-丁基二甲基矽基、三苯甲基、9-(9-苯基)葉黃素基、9-苯基硫基葉黃素基、1,1-雙(4-甲氧基苯基)-1-苯基甲基(二甲氧基三苯甲基)、1-(4-甲氧基苯基)-1,1-二苯基甲基(單甲氧基三苯甲基)。彼等中，以容易脫保護且容易獲得之觀點來看，以tert-丁基二甲基矽基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基為佳，以tert-丁基二甲基矽基、二甲氧基三苯甲基為 較佳，以二甲氧基三苯甲基為特佳。以tert-丁基二甲基矽基為更特佳。
作為在Xz中之「以基本保護基所保護的羥基」的基本保護基，例如可舉出PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS、第3版、JOHN WILLY&SONS出版(1999年)等記載的保護基。具體可舉出烷基(甲基、tert-丁基等)、芳基甲基(苯甲基、p-甲氧基苯甲基等)、二芳基甲基(二苯基甲基等)、烷氧基烷基(甲氧基甲基、甲氧基乙基、乙氧基乙基、氰基乙氧基甲基等)、2-四氫吡喃基、氰基乙基、胺基甲醯基(苯基胺基甲醯基、1,1-二氧代硫代嗎啉-4-硫代胺基甲醯基等)、醯基(乙醯基、新戊醯基、苯甲醯基、乙醯丙醯基、3-苯甲醯基丙醯基等)、矽基(三異丙基矽基、tert-丁基二甲基矽基、tert-丁基二苯基矽基等)、[(三異丙基矽基)氧基]甲基(Tom)基、1-(4-氯苯基)-4-乙氧基哌啶-4-基(Cpep)基等。彼等中，亦以tert-丁基二甲基矽基、三異丙基矽基或tert-丁基二苯基矽基為佳，以tert-丁基二甲基矽基、三異丙基矽基為較佳。作為其他態様，以乙醯丙醯基或3-苯甲醯基丙醯基為佳，以乙醯丙醯基為較佳。
Xz較佳為氫原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基或於4位碳原子進行交聯的有機基，較佳為氫原子、羥基、或以C1-6烷基、tert-丁基二甲基矽基、三異丙基矽基或者tert-丁基二苯基矽基所保護的羥基，更佳為氫原子或以三異丙基矽基所保護的羥基。其中，前述C1- 6烷基為無取代或以選自由C1-6烷氧基羰基、單C1-6烷基胺基羰基、二C1-6烷基胺基羰基所成群的基所取代。
作為其他態様，Xz較佳為C2-6伸烷基(該伸烷基為無取代或以甲基所取代。其中，該伸烷基的1或者2個伸甲基為不被取代，或可選自-O-、-NR11-(R11表示氫原子或甲基)、-CO-、-CS-、-COO-、-OCONR12-(R12表示氫原子或甲基)、-CONR13-(R13表示氫原子或甲基)及-CSNR14-(R14表示氫原子或甲基)的基進行取代)所示4位碳原子上進行交聯的有機基。Xz較佳為伸乙基(該伸乙基的1或者2個伸甲基為不被取代或以選自-O-、-CONR13-(R13表示氫原子或甲基)及-CSNR14-(R14表示氫原子或甲基)的基進行取代)所示4位碳原子上進行交聯的有機基。
作為Z中之基本保護基，可舉出作為Xz中之「以基本保護基所保護的羥基」的基本保護基所舉出者。
其中亦以tert-丁基二甲基矽基、三異丙基矽基、tert-丁基二苯基矽基、乙醯丙醯基或3-苯甲醯基丙醯基為佳，以乙醯丙醯基或3-苯甲醯基丙醯基為較佳，以乙醯丙醯基為更佳。
於Xz或Z中之基本保護基，在脫保護一時保護基之條件下可使用未經脫保護的保護基。例如，使用以酸進行脫保護的一時保護基時，於前述一時保護基所舉出者中，將未以酸進行脫保護的鹼或以氟試藥進行脫保護的保護基可作為基本保護基使用。相反地，使用以鹼進行脫保護的一時保護基時，於前述一時保護基所舉出者中，將 以鹼未能脫保護之以酸或氟試藥可脫保護之保護基，可作為基本保護基使用。又，使用以氟試藥進行脫保護之一時保護基時，於前述一時保護基所舉出者中，將未以氟試藥進行脫保護的以酸或鹼進行脫保護的保護基可作為基本保護基使用。
例如，Xz或Z中之基本保護基為乙醯丙醯基或3-苯甲醯基丙醯基等時，一時保護基係以tert-丁基二甲基矽基、三乙基矽基等矽基或三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、單甲氧基三苯甲基等三芳基甲基為佳。
一時保護基為乙醯丙醯基或3-苯甲醯基丙醯基等時，Xz或Z中之基本保護基以tert-丁基二甲基矽基、三乙基矽基等矽基或三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、單甲氧基三苯甲基等三芳基甲基為佳。特別在方法B之情況下，可將乙醯丙醯基或3-苯甲醯基丙醯基等作為一時保護基使用。
Y為獨立表示各氫原子、羥基、經保護的羥基、硫醇基、經保護的硫醇基、氫化硼、單C1-6烷基胺基或二C1-6烷基胺基。對於經保護的羥基在後述步驟d變換的「以基本保護基進行保護的磷酸二酯鍵」，與取代為羥基之基相同。對於經保護的硫醇基在後述步驟d變換的「以基本保護基進行保護的硫代磷酸二酯鍵」，與取代為硫醇基之基相同。
Y為獨立表示各以為氫原子、羥基、硫醇基或2-氰基乙氧基為佳，較佳為羥基或硫醇基。含有Y之磷官能基，例如具有以下結構(或於以下結構附有鹽之結構)。
步驟a在不會影響反應之溶劑中進行。於該溶劑中之溶解度越高，可期待優良反應性，故選擇作為目的之化合物的溶解度高之低極性溶劑者為佳。具體為可舉出氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷等鹵素系溶劑；苯、甲苯、二甲苯、三甲苯等芳香族系溶劑；乙酸乙酯、乙酸異丙基等酯系溶劑；己烷、戊烷、庚烷、辛烷、壬烷、環己烷等脂肪族系溶劑；四氫呋喃、二乙基醚、環戊基甲基醚、tert-丁基甲基醚等醚系溶劑。這些溶劑可將2種以上以任意比例進行混合後使用。又，於上述低極性溶劑中，可將吡啶等含氮芳香族系溶劑、乙腈、丙腈等腈系溶劑、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮等醯胺系溶劑等極性溶劑溶解於n個聚合寡核苷酸以外，可藉由任意比例進行混合後使用。其中亦以使用於步驟a之溶劑為二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、苯、甲苯、二 甲苯、三甲苯、己烷、戊烷、庚烷、壬烷、環己烷、乙酸乙酯、乙酸異丙基、四氫呋喃、tert-丁基甲基醚、環戊基甲基醚、或這些組合為佳，以二氯甲烷、四氫呋喃為特佳。
於步驟a中之n個聚合寡核苷酸的溶劑中之濃度若可溶解即可，並無特別限定，較佳為1至30重量%。
作為使用於步驟a之氟試藥、酸或鹼，僅可達成一時保護基良好的脫保護者即可，並無特別限定。
作為氟試藥，以氟化氫之吡啶鹽、四丁基銨氟化物、氟化氫之三乙基胺鹽、氟化氫酸、氟化銨、氟化銨之氟化氫加成物、氟化鉀或氟化鉀之氟化氫加成物為佳，其中亦以氟化氫的吡啶鹽或四丁基銨氟化物為較佳，以氟化氫的吡啶鹽為特佳。
作為酸，以三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、三氯乙酸、甲磺酸、p-甲苯磺酸、鹽酸、乙酸、硝酸銨鈰、膦酸或磷酸為佳，其中亦以三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、三氯乙酸、甲磺酸、p-甲苯磺酸、鹽酸、乙酸或硝酸銨鈰為較佳，以三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、三氯乙酸、甲磺酸或p-甲苯磺酸為更佳，以二氯乙酸或膦酸為特佳。三氟乙酸或p-甲苯磺酸亦特佳。
作為鹼，可舉出肼衍生物(肼一水合物、肼乙酸鹽、硫酸肼鎓、乙醯醯肼、甲基肼(Carbazate)、苯基肼、p-甲苯磺醯基肼等)、乙二胺衍生物(乙二胺等)及無機鹼(碳酸 鉀等)等。作為鹼，以肼衍生物為佳，以肼一水合物為較佳。
這些氟試藥、酸及鹼可經由上述低極性溶劑進行稀釋後使用。又，除氟試藥、酸及鹼以外，可藉由固定化脂肪酶L-2、固定化脂肪酶L-5等酵素進行脫保護。
於步驟a中之氟試藥、酸或鹼的使用量對於n個聚合寡核苷酸1莫耳而言，可使用1至100莫耳，較佳為1至40莫耳，更佳為1至30莫耳，特佳為5至30莫耳。
步驟a之反應溫度若可進行反應即可，並無特別限定，以-10℃至60℃為佳，以0℃至50℃為較佳，以0℃至30℃為更佳。反應時間可依使用之n個聚合寡核苷酸的種類、氟試藥、酸或鹼的種類、溶劑的種類、反應溫度等而相異，以5分鐘至50小時為佳，以5分鐘至12小時為較佳，以30分鐘至6小時為更佳。
作為脫保護劑所使用的氟試藥、酸或鹼，若存在於如後述步驟c之偶合反應中時，因會誘發p個聚合寡核苷酸(iv)的5’位或者3’位羥基之一時保護基R的脫保護，故必須藉由淬火處理而除去。淬火處理的脫保護劑若為氟試藥或酸時，藉由矽試藥或有機鹼進行，脫保護劑若為前述鹼時，藉由酮化合物而進行。
作為使用於淬火處理之矽試藥，若可將前述氟試藥進行淬火者即可，並無特別限定，以六甲基二矽氧烷[TMS2O]、三甲基矽基氯化物[TMSCl]、六甲基二矽氮 烷、三甲基矽基溴化物、三甲基矽基碘化物、三甲基矽基三氟甲烷磺酸鹽、三乙基矽基氯化物、三異丙基矽基氯化物、tert-丁基二甲基矽基氯化物、tert-丁基二苯基矽基氯化物、苯基二甲基矽基氯化物、二苯基甲基矽基氯化物、三苯基矽基氯化物為佳，以TMS2O、TMSCl為較佳，以TMS2O為特佳。
作為使用於淬火處理之有機鹼，僅為可中和前述酸者即可，並無特別限定，以吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、苯並咪唑、1,2,4-三唑、N-苯基咪唑、2-胺基-4,6-二甲基嘧啶、1,10-菲咯啉、咪唑、N-甲基咪唑、2-氯苯並咪唑、2-溴苯並咪唑、2-甲基咪唑、2-苯基苯並咪唑、N-苯基苯並咪唑、5-硝基苯並咪唑為佳，以吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、苯並咪唑、1,2,4-三唑、N-苯基咪唑、N-甲基咪唑、2-胺基-4,6-二甲基嘧啶、1,10-菲咯啉為較佳，以吡啶為特佳。
作為使用於淬火處理之酮化合物，僅可消費前述鹼者即可，並無特別限定，可舉出乙醯丙酮、丙酮等，較佳為乙醯丙酮。
使用於步驟a中之淬火處理的矽試藥、有機鹼或酮化合物之使用量對於氟試藥、酸或鹼1莫耳而言，例如為0.01至100莫耳，較佳為0.1至50莫耳，更佳為1至20莫耳，更較佳為1至3莫耳。
進步驟a後繼續進行的步驟b在液相中為連續化進行，故步驟a中之一時保護基R的脫保護反應中、 或於脫保護反應後添加陽離子捕捉劑為佳。不連續步驟a與步驟b時，可添加或不添加陽離子捕捉劑。
作為陽離子捕捉劑，藉由除去之保護基R的再保護(回到原料)或對經脫保護的官能基之副反應若未進行下，並無特別限定，可使用吡咯、2-甲基吡咯、3-甲基吡咯、2,3-二甲基吡咯、2,4-二甲基吡咯等吡咯衍生物；吲哚、4-甲基吲哚、5-甲基吲哚、6-甲基吲哚、7-甲基吲哚、5,6-二甲基吲哚、6,7-二甲基吲哚等吲哚衍生物。由可得到良好陽離子捕捉效果之觀點來看，以吡咯、3-甲基吡咯、2,4-二甲基吡咯、吲哚、4-甲基吲哚、5-甲基吲哚、6-甲基吲哚、7-甲基吲哚、5,6-二甲基吲哚、6,7-二甲基吲哚為佳，以吡咯、3-甲基吡咯、吲哚為較佳，以吡咯、吲哚為更佳，以吡咯為特佳。
前述陽離子捕捉劑之使用量對於n個聚合寡核苷酸(ia或ib)1莫耳而言，例如為1至50莫耳，較佳為1至15莫耳，更佳為1至3莫耳。
於步驟a之後，實施步驟b或步驟d。於步驟b或步驟d之前，視必要藉由分液處理、溶劑餾去，對在步驟b或步驟d所使用的溶劑之取代，進行步驟e，可使n個聚合寡核苷酸之5’位羥基的脫保護體(iia)或者3’位羥基的脫保護體(iib)之分離等進行。
(步驟b)(膦酸酯化步驟)
首先，將方法A或方法B的各情況之步驟b表示於 流程3或4。
於方法A中之步驟b為，將在方法A中之前述步驟a或者後述步驟d所得之n個聚合寡核苷酸的5’位羥基的脫保護體(iia)的5’位羥基進行H-膦酸酯化的步驟(下述流程3)。流程3中各記號與前述定義相同。
在方法B中之步驟b為，將方法B中之前述步驟a或者後述的步驟d所得之n個聚合寡核苷酸之3’位羥基的脫保護體(iib)的3’位羥基進行H-膦酸酯化的步驟(下述流程4)。流程4中各記號與前述定義相同。
在步驟b所使用的溶劑，具體可舉出與前述步驟a之相同溶劑。其中亦以二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、三甲苯、己烷、戊烷、庚烷、壬烷、環己烷、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、四氫呋喃、tert-丁基甲基醚、環戊基甲基醚或這些組合為佳，以吡啶、二氯甲烷為更佳，以吡啶為特佳。
在步驟b使用吡啶等含氮芳香族系溶劑以外的溶劑時，添加吡啶等求核劑為佳。作為求核劑，若可達成良好H-膦酸酯化者即可，並無特別限定，具體可舉出吡啶、2,6-二-tert-丁基吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、3,4-盧剔啶,2,6-盧剔啶、2,4-盧剔啶、3,5-盧剔啶、2,4,6-可力丁、4-乙醯吡啶、N,N-二甲基胺基吡啶、2-氰基吡啶、3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、2-氯吡啶、3-氯吡啶、4-氯吡啶、2-甲氧基吡啶、3-甲氧基吡啶、4-甲氧基吡啶、甲基吡啶酸乙基、菸鹼酸乙基、異菸鹼酸乙基等吡啶系求核劑；(S,S)-2,6-雙(4-異丙基-2-噁唑啉-2-基)吡啶、(R,R)-2,6-雙(4-苯基-2-噁唑啉-2-基)吡啶等Pybox系求核劑、喹啉、奎寧、奎尼丁、辛可寧等喹啉系求核 劑、N-甲基咪唑、嘧啶、2-甲基吡嗪、3-甲基噠嗪、1,10-菲咯啉等含氮芳香族系求核劑；4-甲氧基吡啶-N-氧化物等N-氧化物系求核劑；N,N-二甲基苯胺等苯胺系求核劑；1,3-二-tert-丁基咪唑-2-亞基、1,3-雙三甲苯基咪唑-2-亞基等N-雜環狀卡賓(Carbene)求核劑；三苯基膦、亞磷酸三甲基等磷系求核劑；三乙基胺、1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷等脂肪族胺系求核劑等。其中亦以吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、3,4-盧剔啶,2,6-盧剔啶、2,4,6-可力丁、N,N-二甲基胺基吡啶、3-甲氧基吡啶、4-甲氧基吡啶、(S,S)-2,6-雙(4-異丙基-2-噁唑啉-2-基)吡啶、(R,R)-2,6-雙(4-苯基-2-噁唑啉-2-基)吡啶、喹啉、奎尼丁、N-甲基咪唑、3-甲基噠嗪、4-甲氧基吡啶-N-氧化物為佳，以吡啶為特佳。
步驟b中之求核劑的使用量並無特別限制，對於n個聚合寡核苷酸(iia或iib)1莫耳而言，例如為1至300莫耳，較佳為1至100莫耳，更佳為1至40莫耳。
使用於步驟b之H-膦酸酯化試藥若可達成良好H-膦酸酯化即可，並無特別限定，可舉出亞磷酸、亞磷酸二芳基(亞磷酸二苯基等)、芳基-H-膦酸酯之銨鹽(苯基-H-膦酸酯之三乙基銨鹽、p-甲苯甲醯基-H-膦酸酯之三乙基銨鹽等)、鹵化磷(2-氯-4H-1,3,2-苯並二氧磷素-4-酮、三氯化磷等)等。其中亦以亞磷酸、亞磷酸二苯基、苯基-H-膦酸酯之三乙基銨鹽、p-甲苯甲醯基-H-膦酸酯之 三乙基銨鹽、2-氯-4H-1,3,2-苯並二氧磷素-4-酮、三氯化磷為佳，以亞磷酸、亞磷酸二苯酯為較佳。
作為H-膦酸酯化試藥，使用亞磷酸、芳基-H-膦酸酯的銨鹽時，添加縮合劑者為佳。作為該縮合劑，可舉出通常使用於H-膦酸酯法的縮合劑，具體可舉出2,2-二甲基丁醯基氯化物、異丁醯基氯化物、新戊醯氯、乙醯氯、1-金剛烷基氯化物、氯磷酸二苯酯、2,4,6-三異丙基苯磺醯基氯化物、2-(苯甲醯基三唑1-基氧基)-1,3-二甲基-2-吡咯烷-1-基-1,3,2-二氮雜磷鎓 六氟油酸酯[BOMP]、N,N-雙(2-噁唑烷基)膦氯化物[BopCl]、苯甲醯基氯化物、安息香酸酐、碳酸二苯酯、碳酸二-p-硝基苯酯或碳酸雙五氟苯酯等碳酸二芳酯等。其中亦以2,2-二甲基丁醯基氯化物、異丁醯基氯化物、1-金剛烷基氯化物、氯磷酸二苯基、2,4,6-三異丙基苯磺醯基氯化物、BopCl為佳，以2,2-二甲基丁醯基氯化物為較佳。
作為H-膦酸酯化試藥，使用亞磷酸二芳基或芳基-H-膦酸酯之銨鹽時，於反應終了後藉由以水與三乙基胺等3級胺進行處理，可變換為H-膦酸酯基。
步驟b中之H-膦酸酯化試藥的使用量對於n個聚合寡核苷酸(iia或iib)1莫耳而言，以1至100莫耳為佳，以1至40莫耳為較佳，以10至40莫耳為更佳。
步驟b中之縮合劑的使用量對於n個聚合寡核苷酸(iia或iib)1莫耳而言，以1至100莫耳使用為佳，以1至40莫耳為較佳，以10至30莫耳為更佳。
步驟b之反應溫度若可進行反應即可，並無特別限定，以-10℃至60℃為佳，以20℃至50℃為較佳。反應時間，依據所使用的n個聚合寡核苷酸之種類、溶劑之種類、求核劑之種類、H-膦酸酯化試藥之種類、縮合劑之種類、反應溫度等而相異，以5分鐘至24小時為佳，以10分鐘至12小時為較佳，以30分鐘至6小時為更佳。
於步驟b之後，實施步驟c。於步驟c之前，視必要，可進行分液處理、藉由溶劑餾去對在步驟c所使用的溶劑之取代、或藉由步驟e之n個聚合寡核苷酸的5’位H-膦酸酯體(iiia)或者3’位H-膦酸酯體(iiib)的分離。
(步驟c)(偶合步驟)
首先方法A或方法B之各情況(步驟c)如流程5或6所示。
於方法A中之(步驟c)為，使在前述方法A中之(步驟b)所得之n個聚合寡核苷酸的5’位羥基之H-膦酸酯體(iiia)與、5’位羥基藉由一時保護基R進行保護，且具有3’位羥基之p個聚合寡核苷酸(iva)(式中，p表示1以上之任意整數，p=1時表示核苷酸)進行縮合之步驟(流程5)。
式中，p表示1以上的任意整數，其他記號與前述定義相同，但化合物(iva)中之BaseZ及XZ之中的至少1個中可含有或可不含有擬似固相保護基。具有2個以上核酸鹼部時，具有2個以上擬似固相保護基時及具有2個以上基本保護基時亦與前述定義相同。
方法B中之步驟c為將在前述方法B中之步驟b所得之n個聚合寡核苷酸的3’位羥基之H-膦酸酯體(iiib)與3’位羥基藉由一時保護基R進行保護，且具有5’位羥基之p個聚合寡核苷酸(ivb)(式中，p表示1以上之任意整數，p=1時表示核苷酸)進行縮合之步驟(流程6)。流程6中，各記號與前述定義相同，但化合物(ivb)中之BaseZ及XZ中的至少1個可含有會未含有擬似固相保護基。
在步驟c所使用的溶劑，具體可舉出與前述步驟a相同的溶劑。其中亦以吡啶、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯等為佳，以吡啶為特佳。
在步驟c中，使用吡啶等含氮芳香族系溶劑以外的溶劑時，添加吡啶等求核劑者為佳。作為求核劑，若可達成良好偶合反應者即可，並無特別限定，具體可舉出與前述步驟b同様之求核劑，以吡啶為特佳。
在步驟c所使用的前述求核劑對於在步驟b所得之n個聚合寡核苷酸的H-膦酸酯體(iiia或iiib)1莫耳而言，例如為1~100莫耳，以1~20莫耳為佳，更佳為1~10莫耳。
使用於步驟c的p個聚合寡核苷酸(iva或ivb)之使用量，對於在步驟b所得之n個聚合寡核苷酸的H-膦酸酯體(iiia或iiib)1莫耳而言，以1至10莫耳為佳，較佳為1至5莫耳，更佳為1至3莫耳，特佳為1至1.5莫耳。
使用於步驟c的縮合劑，若可使偶合反應良好地進行即可，並無特別限定，具體可舉出與前述步驟b之相同縮合劑。其中亦以2,2-二甲基丁醯基氯化物、異丁醯基氯化物、1-金剛烷基氯化物、氯磷酸二苯基、2,4,6-三異丙基苯磺醯基氯化物、雙(2-氧代-3-噁唑烷基)膦酸氯化物、碳酸雙五氟苯酯等為佳，以2,2-二甲基丁醯基氯化物或碳酸雙五氟苯酯為特佳。
使用於步驟c的縮合劑對於在步驟b所得之n個聚合寡核苷酸的H-膦酸酯體(iiia或iiib)1莫耳而言，例如為1至200莫耳，較佳為1至100莫耳，更佳為1至50莫耳。
步驟c的反應溫度若可進行反應即可，並無特別限定，以-10℃至60℃為佳，以0℃至50℃為較佳，以0℃至30℃為更佳。反應時間為依據使用的n個聚合寡核苷酸之種類、溶劑之種類、求核劑之種類、縮合劑之種類、反應溫度等而相異，以1分鐘至12小時為佳，以2分鐘至6小時為較佳，以5分鐘至3小時為更佳。
於步驟c之反應後，若在流程5或6中、式(iva或ivb)所示化合物或其鹽、或者流程3或4中殘存式(iia或iib)所示化合物或其鹽時，視必要，將所得之溶液可賦予封端反應。封端反應為使用乙酸酐、安息香酸酐等酸酐，或加入於前述縮合劑，使用甲基-H-膦酸酯的三乙基銨鹽、乙基-H-膦酸酯的三乙基銨鹽、異丙基-H-膦酸酯的三乙基銨鹽及2-氰基乙基-H-膦酸酯的三乙基銨鹽等烷 基-H-膦酸酯之銨鹽，可依據一般方法實施。
且，所謂封端反應為將殘存於偶合反應、氧化反應後的具有羥基之化合物的羥基，變換為不使核苷酸或寡核苷酸伸長的取代基之反應。
封端反應可在後述步驟d之後實施。封端反應可在步驟c或步驟d之後實施為佳。
於步驟c之後，實施步驟d或步驟a。於步驟d或步驟a之前，視必要藉由分液處理、溶劑餾去，對在步驟b或步驟a所使用的溶劑之取代，進行步驟e的n+p個聚合寡核苷酸(va或vb)的分離等可進行。又，亦可將步驟c的反應溶液直接使用於下面步驟d或步驟a。
(步驟d)(變換步驟)
步驟為藉由於在步驟c所得之n+p個聚合寡核苷酸(va或vb)或者在步驟a所得之n個聚合寡核苷酸使修飾磷原子的試藥進行反應，將該n+p個聚合寡核苷酸(va或vb)的亞磷酸二酯鍵變換為磷酸二酯鍵、硫代磷酸二酯鍵、胺基磷酸二酯鍵、硼烷磷酸二酯鍵、以基本保護基進行保護的磷酸二酯鍵或以基本保護基進行保護的硫代磷酸二酯鍵之步驟。
方法A中之步驟d為下述流程7(流程7中，各記號與前述定義相同，但步驟a後時，R為氫原子)所示。
方法B中之步驟d為下述流程8(流程8中，各記號與前述定義相同，但步驟a後時，R為氫原子)所示。
步驟d為，無須分離在步驟c所得的n+p個聚合寡核苷酸(va或vb)或在步驟a所得之n個聚合寡核苷酸(iia或iib)，於步驟c或步驟a後之反應混合物中，可 直接添加修飾磷原子之試藥而進行。作為修飾磷原子的試藥，可使用氧化劑、硫化劑、氨基亞化劑或硼化劑。使用氧化劑或硫化劑，變換為磷酸二酯鍵、硫代磷酸二酯鍵、以基本保護基進行保護的磷酸二酯鍵、或以基本保護基進行保護的硫代磷酸二酯鍵者為佳，轉換為磷酸二酯鍵或硫代磷酸二酯鍵者為較佳。步驟d為，可將在步驟c所得之n+p個聚合寡核苷酸(va或vb)或在步驟a所得之n個聚合寡核苷酸(iia或iib)進行分離而進行。
在步驟d所使用的溶劑，具體可舉出與前述步驟a之相同溶劑，可藉由所使用之氧化劑、硫化劑、氨基亞化劑或硼化劑做適宜選擇。
在步驟d所使用的「氧化劑」無須氧化其他部位，僅具有將亞磷酸二酯鍵氧化為磷酸二酯鍵的能力即可，並無特別限定，以碘、(1S)-(+)-(10-異冰片基磺醯基)氧氮丙啶、tert-丁基過氧化氫(TBHP)、2-丁酮過氧化物、1,1-二氫過氧環十二烷、雙(三甲基矽基)過氧化物、m-氯過安息香酸為佳。由達到產率或反應速度良好之氧化反應的觀點來看，以碘、tert-丁基過氧化氫、2-丁酮過氧化物為佳，以碘為特佳。該氧化劑可以適當的溶劑稀釋至0.05至2M的濃度後使用。作為該稀釋溶劑，若對反應為惰性的溶劑即可，並無特別限定，可舉出吡啶、四氫呋喃[THF]、二氯甲烷、水或這些混合溶劑。其中，例如使用碘/水/吡啶之混合溶劑或者碘/水/吡啶/THF之混合溶劑為佳。
在步驟d使用前述氧化劑時，步驟d之反應溶劑與前述稀釋溶劑相同。
使用於步驟d之「硫化劑」若具有使亞磷酸二酯鍵變換為硫代磷酸二酯鍵之能力者即可，並無特別限定，以單體硫、3-胺基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(ADTT)、3-((N,N-二甲基胺基亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(DDTT)、3H-1,2-苯並二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(Beaucage試藥)、3H-1,2-苯並二硫醇-3-酮、苯基乙醯二硫化物(PADS)、四乙基秋蘭姆二硫化物(TETD)、N-(苯甲醯基硫)-琥珀酸醯亞胺為佳。由產率或反應速度為良好之反應進行的觀點來看，以單體硫、ADTT為較佳，單體硫為特佳。該硫化劑可使用適當溶劑稀釋至0.05至2M的濃度後使用。作為該稀釋溶劑，若為對反應為惰性之溶劑即可，並無特別限定，例如可舉出二氯甲烷、乙腈、吡啶或這些混合溶劑。
在步驟d使用前述硫化劑時，步驟d之反應溶劑與前述稀釋溶劑相同。
將亞磷酸二酯鍵變換為「以基本保護基進行保護的磷酸二酯鍵」時的試藥，僅具有該變換能力即可，並無特別限定，以對應之醇化合物與四氯化碳、碘、溴化三氯化碳、N-氯琥珀酸醯亞胺、三氯異氰脲酸、次亞氯酸鈉、3,3-二氯-5,5-二甲基乙內醯脲、N,N’-二氯雙(2,4,6-三氯苯基)尿素等氧化劑為佳。作為前述變換反應之溶劑，若對反應為惰性之溶劑即可，並無特別限定，可舉出二氯 甲烷、吡啶或這些混合溶劑，較佳為二氯甲烷或吡啶，更佳為吡啶。
將亞磷酸二酯鍵變換為「以基本保護基進行保護的硫代磷酸二酯鍵」時的試藥，僅具有該變換能力者即可，並無特別限定，可舉出鄰苯二甲醯亞胺系硫化劑、含琥珀酸系硫化劑及嗎啉二酮系硫化劑等。作為前述變換反應之溶劑，若對反應為惰性的溶劑即可，並無特別限定，可舉出二氯甲烷、吡啶或這些混合溶劑，較佳為二氯甲烷或吡啶，更佳為吡啶。
作為鄰苯二甲醯亞胺系硫化劑，對應目的之「以基本保護基進行保護的硫代磷酸二酯鍵」之N-(C1-40烷基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-(C3-6環烷基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-(C6-10芳基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-(5-10員雜芳基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-(芳烷基硫)鄰苯二甲醯亞胺及N-(雜芳基硫基)鄰苯二甲醯亞胺等可舉出。其中，目的之「以基本保護基進行保護的硫代磷酸二酯鍵」含有鹵素原子、氰基、C1-6烷基等取代基時，可使用前述N-(C1-40烷基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-(C3-6環烷基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-(C6-10芳基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-(5-10員雜芳基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-(芳烷基硫)鄰苯二甲醯亞胺及N-(雜芳基硫基)鄰苯二甲醯亞胺之對應部分含有這些取代基之硫化劑。作為鄰苯二甲醯亞胺系硫化劑，具體可舉出N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺、N-(甲基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-(乙基硫基)鄰苯二甲醯 亞胺、N-(丙基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-(異丙基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-(丁基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-(tert-丁基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-(環己基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-(十二烷基硫)鄰苯二甲醯亞胺、N-(苯甲基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-(苯基硫基)鄰苯二甲醯亞胺、N-{(p-氯苯基)硫代}鄰苯二甲醯亞胺、N-{(p-甲基苯基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺及N-[(2-苯並噻唑基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺等。
作為琥珀酸系硫化劑，對應目的之「以基本保護基進行保護的硫代磷酸二酯鍵」之N-(C1-40烷基硫基)琥珀酸醯亞胺、N-(C3-6環烷基硫基)琥珀酸醯亞胺、N-(C6-10芳基硫基)琥珀酸醯亞胺、N-(5-10員雜芳基硫基)芳烷基硫琥珀酸醯亞胺及N-(雜芳基硫基)琥珀酸醯亞胺等可舉出。其中，目的之「以基本保護基進行保護的硫代磷酸二酯鍵」含有鹵素原子、氰基、C1-6烷基等取代基時，可使用前述N-(C1-40烷基硫基)琥珀酸醯亞胺、N-(C3-6環烷基硫基)琥珀酸醯亞胺、N-(C6-10芳基硫基)琥珀酸醯亞胺、N-(5-10員雜芳基硫基)琥珀酸醯亞胺、N-(芳烷基硫)琥珀酸醯亞胺及N-(雜芳基硫基)琥珀酸醯亞胺之對應部分含有這些取代基之硫化劑。作為含琥珀酸醯亞胺硫化劑，具體可舉出N-[(2-氰基乙基)硫代]琥珀酸醯亞胺、N-(甲基硫基)琥珀酸醯亞胺、N-(乙基硫基)琥珀酸醯亞胺、N-(丙基硫基)琥珀酸醯亞胺、N-(異丙基硫基)琥珀酸醯亞胺、N-(丁基硫基)琥珀酸醯亞胺、N-(tert-丁基硫 基)琥珀酸醯亞胺、N-(環己基硫基)琥珀酸醯亞胺、N-(十二烷基硫)琥珀酸醯亞胺、N-(苯甲基硫基)琥珀酸醯亞胺、N-(苯基硫基)琥珀酸醯亞胺、N-{(p-氯苯基)硫代}琥珀酸醯亞胺、N-{(p-甲基苯基)硫代]琥珀酸醯亞胺及N-[(2-苯並噻唑基)硫代]琥珀酸醯亞胺等。
作為嗎啉二酮系硫化劑，對應目的之「以基本保護基進行保護的硫代磷酸二酯鍵」之N-(C1-40烷基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(C3-6環烷基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(C6-10芳基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(5-10員雜芳基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(芳烷基硫)嗎啉-3,5-二酮及N-(雜芳基硫基)嗎啉-3,5-二酮等可舉出。其中，目的之「以基本保護基進行保護的硫代磷酸二酯鍵」為含有鹵素原子、氰基、C1-6烷基等取代基時，可使用前述N-(C1-40烷基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(C3-6環烷基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(C6-10芳基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(5-10員雜芳基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(芳烷基硫)嗎啉-3,5-二酮及N-(雜芳基硫基)嗎啉-3,5-二酮之對應部分含有這些取代基之硫化劑。作為嗎啉二酮系硫化劑，具體可舉出N-[(2-氰基乙基)硫代]嗎啉-3,5-二酮、N-(甲基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(乙基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(丙基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(異丙基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(丁基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(tert-丁基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(環己基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(十二烷基硫)嗎啉-3,5-二酮、N-(苯甲基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-(苯基硫基)嗎啉-3,5-二酮、N-{(p- 氯苯基)硫代}嗎啉-3,5-二酮、N-{(p-甲基苯基)硫代]嗎啉-3,5-二酮及N-[(2-苯並噻唑基)硫代]嗎啉-3,5-二酮等。
使用於步驟d之「氨基亞化劑」若為具有將亞磷酸二酯鍵變換為胺基磷酸二酯鍵之能力者即可，並無特別限定，以對應之胺化合物與四氯化碳、碘、溴化三氯化碳、N-氯琥珀酸醯亞胺、三氯異氰脲酸、次亞氯酸鈉、3,3-二氯-5,5-二甲基乙內醯脲、N,N’-二氯雙(2,4,6-三氯苯基)尿素等氧化劑為佳。作為前述變換反應之溶劑，若對反應為惰性的溶劑即可，並無特別限定，可舉出二氯甲烷、吡啶或這些混合溶劑，較佳為二氯甲烷或吡啶，更佳為吡啶。
在步驟d所使用的「硼化劑」僅為具有將亞磷酸二酯鍵變換為硼烷磷酸二酯鍵之能力者即可，並無特別限定，以氫化硼(BH3)、BH3-THF錯體、BH3-二甲基硫化物錯體、BH3-吡啶錯體等為佳。作為前述變換反應之溶劑，若對反應為惰性之溶劑即可，並無特別限定，可舉出二氯甲烷、吡啶或這些混合溶劑，以二氯甲烷或吡啶為佳，較佳為吡啶。
修飾磷原子的試藥之使用量對於在步驟c所得之n+p個聚合寡核苷酸(va或者vb)或在步驟a所得之n個聚合寡核苷酸(iia或者iib)1莫耳而言，以1至50莫耳為佳，較佳為1至15莫耳，更佳為1至10莫耳，更較佳為1至7莫耳。
反應溫度僅反應可進行即可並無特別限定， 以-10℃至60℃為佳，以20℃至50℃為較佳。反應時間雖依據在步驟c所得的n+p個聚合寡核苷酸(va或者vb)或在步驟a所得之n個聚合寡核苷酸(iia或者iib)的種類、使用的修飾磷原子的試藥之種類、反應溫度等而相異，較佳為1分鐘至24小時，更佳為10分鐘至12小時，更較佳為30分鐘至6小時。
使用氧化劑或硫化劑時，該氧化劑及硫化劑可能會再反應終了後或次步驟以後誘發出不期待的副反應，欲抑制該副反應，可於反應終了後使用還原劑進行淬火處理。作為具體還原劑，可使用3價磷試藥(例如可舉出亞磷酸三甲基、亞磷酸三乙酯、參(2-羧基乙基)膦等亞磷酸三烷基或亞磷酸二甲基或亞磷酸二乙基等亞磷酸二烷基)、硫代硫酸鈉等還原劑。前述淬火處理亦可能可省略。
於步驟c之後進行步驟d時，於步驟d的反應之後，流程5或6中，式(iva或ivb)所示化合物或其鹽，或者流程3或4中，式(iia或iib)所示化合物或其鹽有殘存時，視必要可將所得之溶液賦予封端反應。封端反應為使用乙酸酐、安息香酸酐等酸酐，加入於或前述縮合劑，使用甲基-H-膦酸酯之三乙基銨鹽、乙基-H-膦酸酯之三乙基銨鹽、異丙基-H-膦酸酯之三乙基銨鹽及2-氰基乙基-H-膦酸酯之三乙基銨鹽等烷基-H-膦酸酯之銨鹽，可藉由通常方法實施。
封端反應可在前述步驟c之後實施。
於步驟a之後進行步驟d時，於步驟d之後不實施前述封端反應。
(步驟e)(沈澱化及固液分離步驟)
步驟e為於由步驟a至步驟d中任一所得之反應溶液中加入極性溶劑後使寡核苷酸沈澱，並藉由固液分離而取得之步驟。
作為步驟e中之極性溶劑，例如可舉出甲醇、乙醇、異丙醇n-丁醇等醇系溶劑；乙腈、丙腈等腈系溶劑；丙酮、2-丁酮等酮系溶劑；二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、N-甲基哌啶酮等醯胺系溶劑、二甲基亞碸等亞碸系溶劑；使用水、以及2種以上混合溶劑。於步驟e中之極性溶劑較佳為醇系溶劑、腈系溶劑，較佳為碳數1至6的醇溶劑或碳數1至6的腈溶劑，特佳為甲醇或乙腈。
使用在步驟d所得之反應溶液進行步驟e時，藉由使用將前述還原劑加入於沈澱化溶劑之甲醇或乙腈的溶液，修飾磷原子的試藥之淬火處理與步驟e可同時進行。
本發明之寡核苷酸的製造方法為，將上述步驟a至步驟e重複所望次數後，可得到高純度且高產率之目的寡核苷酸。
(步驟f)(脫保護．寡核苷酸分離步驟)
對於寡核苷酸的製造方法，於步驟e之後，對應基本 保護基、一時保護基及擬似固相保護基之種類．性質，進行脫保護，可分離寡核苷酸。作為脫保護之方法，例如依據PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS、第3版、JOHN WILLY&SONS出版(1999年)等記載的脫保護方法，可進行除去寡核苷酸之所有保護基的步驟。具體為擬似固相保護基、以及基本保護基之苯甲醯基、異丁醯基、苯氧基乙醯基、乙醯基、乙醯丙醯基等保護磷酸二酯鍵或硫代磷酸二酯鍵保護之基本保護基的2-氰基乙基等可藉由在氨水、氨水/乙醇溶液、或氨水與甲基胺水溶液之混合液進行處理，將所有除去。又，5’位或3’位羥基的一時保護基可藉由在步驟a所使用的氟試藥、酸或鹼、或將這些經適宜稀釋後的溶液進行處理而除去。又，依據journal of the chemistry coordination science park transaction1、2002年、2619頁-2633頁所記載的脫保護方法，以DBU[1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一碳烯]及三甲基矽基氯化物進行處理，除去保護磷酸二酯鍵或硫代磷酸二酯鍵之氰基乙基等後，可藉由氨水除去擬似固相保護基、以及基本保護基之苯甲醯基、異丁醯基、苯氧基乙醯基、乙醯基、乙醯丙醯基等方法。又，亦可使用藉由無機鹼(碳酸鉀等)除去基本保護基之苯甲醯基、異丁醯基、苯氧基乙醯基、乙醯基、乙醯丙醯基等方法。
藉由基本保護基所保護之磷酸二酯鍵，例如可舉出journal of the chemistry coordination science park transaction1、1999、1477頁-1486頁所記載之方法(以(E)- 2-硝基苯甲醛肟、吡啶-2-醛肟等肟化合物及、1、1、3、3-四甲基胍、DBU等鹼進行處理之方法)進行脫保護，可變換為磷酸二酯鍵。2-氰基乙基等藉由β脫離之可脫保護的基本保護基進行保護的硫代磷酸二酯鍵藉由前述鹼性條件下的脫保護，可變換為硫代磷酸二酯鍵。以其他基本保護基所保護之硫代磷酸二酯鍵，例如依據journal of the chemistry coordination science park transaction1、1999、1477頁-1486頁所記載之方法(以前述肟化合物及前述鹼進行處理的方法等)進行脫保護後，可變換為磷酸二酯鍵。
不具有保護基之寡核苷酸因藉由酵素容易分解，故空氣清淨度管理下分離寡核苷酸為佳。
上述步驟a至步驟d及步驟f中之反應進行的確認，可適用任一種與一般液相有機合成反應之相同方法。即可使用薄層矽膠層析法、高速液體層析法等來追蹤反應。
藉由步驟e或步驟f所得之寡核苷酸，進一步藉由實施有機合成反應，可導向所望寡核苷酸衍生物。可使用使用方法A所製造的寡核苷酸及使用方法B所製造的寡核苷酸，使用方法A或方法B製造出寡核苷酸。
例如，將以方法A中之步驟b所得的n個聚合寡核苷酸之5’位羥基的H-膦酸酯體(iiia)與、以方法B中之步驟a所得的n個聚合寡核苷酸(iib)與，在與前述步驟c之同様條件下，可藉由亞磷酸二酯鍵進行縮合。本步 驟表示於流程9。流程中之記號與前述定義相同，式(iiia)的n與式(iib)的n可相同或相異，式(iiia)的Z與式(iib)的Z可相同亦可相異。
又，將以方法B中之步驟b所得之n個聚合寡核苷酸的5’位羥基之H-膦酸酯體(iiib)與、以方法A中之步驟a所得之n個聚合寡核苷酸(iia)在與前述步驟c之相同條件下，可藉由亞磷酸二酯鍵進行縮合。本步驟如流程10所示。流程中之記號與前述定義相同，式(iiib)的n與式(iia)的n可相同亦可相異，式(iiib)的Z與式(iia)的Z可相同亦可相異。
將前述經縮合的寡核苷酸(vii)的亞磷酸二酯鍵在與步驟d之同様條件下，可轉換為磷酸二酯鍵、硫代磷酸二酯鍵、胺基磷酸二酯鍵、硼烷磷酸二酯鍵、以基本保護基進行保護的磷酸二酯鍵或以基本保護基所保護的硫代磷酸二酯鍵。本步驟如流程11所示。流程中之記號與前述定義相同，式(vii)中之2個n可相同或相異，式(vii)中之2個Z可相同亦可相異。式(viii)亦相同。
使用前述藉由亞磷酸二酯鍵進行縮合的步驟所得的反應混合物，與步驟e同様下將具有擬似固相保護基之經縮合的前述核苷酸或寡核苷酸(vii)沈澱，可實施藉由固液分離所取得的分離步驟。又，使用藉由轉換前述亞磷酸二酯鍵之步驟所得之反應混合物，與步驟e同様地，將具有擬似固相保護基之亞磷酸二酯鍵經變換的核苷酸或寡核苷酸(viii)沈澱，可實施藉由固液分離所取得之分離步驟。
於前述分離步驟之後，與步驟f同様地，配合基本保護基、一時保護基及擬似固相保護基之種類．性質，進行脫保護，可分離寡核苷酸。
前述藉由亞磷酸二酯鍵之縮合體(vii)、或該亞磷酸二酯鍵之變換體(viii)所具有的2個Z之內的至少一個為基本保護基，可將該基本保護基作為一時保護基使 用時，將藉由前述亞磷酸二酯鍵之縮合體(vii)、或該亞磷酸二酯鍵之變換體(viii)於流程1或2中作為式(ia或ib)所示化合物使用，可實施方法A或方法B中之步驟a。
所製造之寡核苷酸可使用於各種人體用或動物用之醫藥品(RNA、DNA、寡核苷酸醫藥、等)、功能性食品、特定保健食品、食品、化成品、生體用高分子材料、工業用高分子材料等各種用途。
寡核苷酸的製造方法中之出發物質可藉由已知的氧化、還原、水解、酯化反應、醯胺縮合等一般官能基變換法(例如可參照Comprehensive Organic Transformations,Second Edition、R.C.Larock著、Wiley-VCH(1999年)等)進行而製造。
例如2’位與4’位以-CSNR14-(R14表示氫原子或C1-6烷基)進行交聯的核糖上，鍵結核酸鹼之核苷酸係由具有以對應的-CONR13-(R13表示氫原子或C1-6烷基)進行交聯的結構之核苷酸等，使用硫代羰基化試藥(例如勞森試藥等)，勢必要進行保護反應及脫保護反應而合成。
導入擬似固相保護基的核苷酸或寡核苷酸可具以下所示方法製造，但下述製造方法為一般製造方法的一例子者，並非限定於有關本實施形態之擬似固相保護基經導入的核苷酸等製造方法者。
前述式(I)所示擬似固相保護基之中，m為0之基經導入的核苷酸或寡核苷酸，例如可藉由下述式(X-1)所示的羧酸或者下述式(X-2)所示的羧酸鹵化物與核苷酸 或寡核苷酸之羥基或者核酸鹼的反應而得。
式中，X表示鹵素原子，其他記號與前述定義相同。
於擬似固相保護基的導入使用羧酸時，於溶劑中使用二環己基碳二亞胺、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、N,N,N’,N’-四甲基-O-(苯並三唑-1-基)脲六氟磷酸酯及羰基二咪唑等縮合劑，可將擬似固相保護基導入於核苷酸或寡核苷酸。視必要，可組合1-羥基苯並三唑等添加劑而使用。使用羧酸鹵化物時，可舉出溶劑中使用三乙基胺、二異丙基乙基胺等鹼的方法。作為溶劑，可舉出氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷等鹵素系溶劑；苯、甲苯、二甲苯、三甲苯等芳香族系溶劑；乙酸乙酯、乙酸異丙酯等酯系溶劑；己烷、戊烷、庚烷、辛烷、壬烷、環己烷等脂肪族系溶劑；四氫呋喃、二乙基醚、環戊基甲基醚、tert-丁基甲基醚等醚系溶劑；N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮等醯胺系溶劑等。
該羧酸或者酸鹵化物可藉由進行已知的氧 化、還原、水解等、一般已知的官能基變換法(例如參照Comprehensive Organic Transformations,Second Edition、R.C.Larock著、Wiley-VCH(1999年)等)而製造。
又，於L1與L2間之鍵結、L2與L3間之鍵結、L3與L4間之鍵結內，將任意鍵結使用上述縮合法或官能基變換法等而形成，可階段式地導入擬似固相保護基。又，L2為-COO-、-CON(R2)-、OCO-或-N(R2)CO-時，將L2所含的酯鍵或醯胺鍵使用上述縮合法或官能基變換法等而形成，可階段式地導入擬似固相保護基。L4與-COO-、-CON(R2)-、OCO-或-N(R2)CO-之情況亦相同。其中，R2與前述定義相同。
例如可舉出核苷酸或寡核苷酸與式(X-4)所示二羧酸酐(琥珀酸酐等)進行反應，得到具有持羧基的下述式(X-5)所示基之核苷酸或寡核苷酸後，將該具有持羧基之式(X-5)所示基的核苷酸或寡核苷酸與下述式(X-6)所示醇化合物或下述式(X-7)所示胺化合物進行縮合，製造出前述式(I)所示擬似固相保護基之中，m為0，L2為具有-COO-或-CON(R2)-之基的核苷酸或寡核苷酸。
式中，L1與前述定義相同。
式中的記號與前述定義相同。
式中的記號與前述定義相同。
具有持前述羧基的式(X-5)所示基之核苷酸或寡核苷酸與前述式(X-6)所示醇化合物或前述式(X-7)所示胺化合物的縮合，通常在溶劑中使用二環己基碳二亞胺、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、N,N,N’,N’-四甲基-O-(苯並三唑-1-基)脲六氟磷酸酯或羰基二咪唑等縮合劑。視必要，可組合1-羥基苯並三唑等添加劑後使用。溶劑與在前述式(X-1)或者式(X-2)所示化合物與核苷酸或寡核苷酸之反應相同。
又，例如將下述式(X-8)或者(X-10)所示羧酸或下述式(X-9)或者(X-11)所示羧酸鹵化物與核苷酸或寡核苷酸之羥基或者核酸鹼在與前述縮合反應之相同條件下進行縮合，視必要其後進行脫保護反應後，得到下述式(X- 12)所示醇化合物或下述式(X-13)所示胺基化合物，將所得之式(X-12)所示醇化合物或式(X-13)所示胺基化合物與式(X-14)所示羧基化合物或式(X-15)所示芳基羧酸鹵化物以與前述縮合反應之相同條件下進行縮合，可製造出前述式(I)所示擬似固相保護基中，具有m為0，L4為-OCO-或-N(R2)CO-之基的核苷酸或寡核苷酸。
(式中，P1表示羥基之保護基，P2表示胺基之保護基，X表示鹵素原子，其他記號與前述定義相同)P1可選自保護羥基之一時保護基或基本保護基，P2可選自保護胺基之基本保護基。
式中的記號與前述定義相同。
式中的記號與前述定義相同，X表示鹵素原子。
前述脫保護反應之條件可參照PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS、第3版、JOHN WILLY&SONS出版(1999年)等。
前述式(I)所示擬似固相保護基之中，導入m為1之基的核苷酸或寡核苷酸，例如可藉由將下述式(X-3)所示烷基鹵化物與核苷酸或寡核苷酸之羥基或者核酸鹼在溶劑中進行反應而得。
式中，X表示鹵素原子，其他記號與前述定義相同。
於前述式(X-3)所示烷基鹵化物與核苷酸或寡核苷酸之反應中使用鹼(碳酸鉀、三乙基胺等)。作為前述溶劑，使用前述鹵素系溶劑、芳香族系溶劑、酯系溶劑、脂肪族系溶劑、醚系溶劑或醯胺系溶劑等所使用者，其中 亦可使用醯胺系溶劑。
前述式(X-3)所示烷基鹵化物為可藉由將前述式(X-1)所示羧酸與氯甲磺酸氯化物在溶劑中進行反應(國際公開第2014-144285號所記載的方法)，又藉由將前述式(X-1)所示羧酸、對甲醛及氯化鋅在溶劑中進行反應後製造(Journal of Medicinal Chemistry、2009年、52卷、771頁-778頁的方法)。
又，L1與L2之間的鍵結、L2與L3之間的鍵結、L3與L4之間的鍵結內，將任意鍵結使用上述縮合法或官能基變換法等而形成，可藉由階段式導入擬似固相保護基。又，L2為-COO-、-CON(R2)-、OCO-或-N(R2)CO-時，將L2所含的酯鍵或醯胺鍵使用上述縮合法或官能基變換法等而形成，可藉由階段式導入擬似固相保護基。L4為-COO-、-CON(R2)-、OCO-或-N(R2)CO-時亦相同。其中，R2與前述定義相同。
[實施例]
其次舉出實施例具體說明本發明，但本發明並未受到這些限定。且實施例中，NMR表示核磁共振光譜，MS表示質量分析。
1H-NMR數據若記載時，係以300MHz(JNM-ECP300；日本電子(JEOL)公司製、或JNM-ECX300；日本電子(JEOL)公司製)所測定，其表示將四甲基矽烷作為內部標準的信號之化學位移δ(單位：ppm)(分裂圖型、積分 值)。「s」表示單重，「d」表示雙重，「t」表示三重，「q」表示四重，「quint」表示五重，「dd」表示雙重．of．雙重，「m」表示多重，「brs」表示寬單重，「CDCl3」表示重氯仿，「C5D5N」表示重吡啶。
若記載31P-NMR數據時，表示以JNM-ECX300；日本電子(JEOL)公司製)所測定的信號之化學位移δ(單位：ppm)。
MS若無特別記載時，藉由以下條件1，使用ESI(電子噴霧離子化)法進行測定。「ESI+」表示ESI正離子模式，「ESI-」表示ESI負離子模式。
條件1：
裝置：AB SCIEX TripleTOF 5600
管柱：Kinetex PFP(2.6μm、2.1×75mm)
管柱溫度：40℃
溶離液組成：
有機層：四氫呋喃/乙腈=1/1(體積比)
水層：10mM甲酸銨水溶液
將有機層與水層的混合比以50/50進行測定開始後，在10分鐘直線地改為90/10。其後5分鐘，將有機層與水層之混合比固定在90/10。
流速：0.50mL/min、檢測波長：260nm
在矽膠管柱層析法的純化雖無特別記載時，其為使用山善製Hi-Flash管柱。
參考例(於5’位羥基具有4,4’-二甲氧基三苯甲基之核酸單體的安定性評估)
作為使用於寡核苷酸合成的核酸單體，選擇5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷[OH]、5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-羥基膦胸苷三乙基胺鹽[p(H)]、及5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-氰基乙氧基(二異丙基胺基)膦胸苷[PA]。各固體直接在100℃進行攪拌，於一定小時經過後進行HPLC分析。該結果如圖1所示。
由圖1可得知，與H-膦酸酯體及氨基亞體比較，核苷酸較為安定。
參考合成例1(於5’位羥基具有tert-丁基二甲基矽基的核苷酸之合成)：化合物1之合成
在氮氣環境下，於胸苷(24.20g、100mmol)的吡啶(60mL)懸浮液中，在0℃加入tert-丁基二甲基矽基氯化物(16.62g、110mmol)，進行22小時29分鐘之攪拌。將溶劑減壓下餾去，加入二氯甲烷與水後分液。於所得之水層中加入二氯甲烷並分液，合併所得之有機層，以5%碳酸氫鈉水溶液洗淨，並以水洗淨。將溶劑減壓下餾去，加入甲苯並析出的固體經過濾後得到化合物1(29.77g，產率84%)之白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.11(s、3H)、0.12(s、3H)、0.92(s、9H)、1.92(d、3H)、2.02-2.16(m、2H)、2.32-2.39(m、1H)、3.81-3.92(m、2H)、4.01-4.04(m、1H)、4.45-4.49(m、1H)、6.36(q、1H)、7.48(d、1H)、8.27(brs、1H)。
參考合成例2(於5’位羥基具有tert-丁基二甲基矽基，於2’位羥基具有三異丙基矽基的核苷酸之合成)：5’-O-(tert-丁基二甲基矽基)-2’-O-三異丙基矽基尿苷之合成
步驟1 5’-O-(tert-丁基二甲基矽基)尿苷之合成
在氮氣環境下，於尿苷(12.03g、49.3mmol)、咪唑(6.74g、99.0mmol)的N,N-二甲基甲醯胺[DMF](120g)溶液中，在室溫加入tert-丁基二甲基矽基氯化物(7.76g、51.5mmol)，進行5小時1分鐘攪拌。將該反應混合物滴入於水(240g)中，將析出的固體經過濾。於所得之粗物中加入甲苯後進行30分鐘攪拌，經過濾後得到5’-O-(tert-丁基二甲基矽基)尿苷(10.49g，產率59%)之白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.11(s、6H)、0.92(s、9H)、3.82-3.87(m、1H)、4.00-4.05(m、1H)、4.14-4.15(m、1H)、4.21-4.26(m、2H)、5.67(d、1H)、5.90(d、1H)、8.06(d、1H)。
步驟2 5’-O-(tert-丁基二甲基矽基)-2’-O-三異丙基矽基尿苷之合成
在氮氣環境下，於5’-O-(tert-丁基二甲基矽基)尿苷(5.40g、15.1mmol)、硝酸銀[AgNO3](10.3g、60.6mmol)、吡啶(6.1mL,75mmol)的THF(50mL)懸浮液中，在室溫加入三異丙基矽基氯化物(11.65g、60.4mmol)，進行23小時6 分鐘攪拌。將該反應混合物以矽藻土過濾，將溶劑減壓下餾去後加入乙酸乙酯。加入水並分液，於所得之水層中加入乙酸乙酯並分液。合併所得之有機層，以6%碳酸氫鉀水溶液洗淨，以水洗淨。將溶劑減壓下餾去，加入己烷並析出固體，在0℃冷卻後，經過濾後得到5’-O-(tert-丁基二甲基矽基)-2’-O-三異丙基矽基尿苷(5.24g，產率68%)之白色固體。
將所得之濾液在減壓下餾去，以矽膠層析法(己烷-乙酸乙酯)進行純化後，得到5’-O-(tert-丁基二甲基矽基)-2’-O-三異丙基矽基尿苷(1.72g，產率22%)之白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.12(s、6H)、0.94(s、9H)、1.04-1.16(m、21H)、2.80(d、1H)、3.81(d、1H)、3.96(d、1H)、4.13-4.20(m、2H)、4.36(t、1H)、5.70(d、1H)、6.07(d、1H)、7.95(dd、1H)、8.17(brs、1H)。
實施例1(於3’位羥基鍵結擬似固相保護基之核苷酸的合成)：化合物3之合成
步驟1 化合物2之合成
在氮氣環境下，於化合物1(8.02g、22.4mmol)、琥珀酸酐(3.35g、33.5mmol)的二氯甲烷(80g)溶液中，在室溫加入三乙基胺(6.21mL、44.8mmol)，進行4小時3分鐘攪拌。於反應混合物加入2.0M磷酸-三乙基胺水溶液並分液。將所得之有機層以2M磷酸-三乙基胺水溶液進行2次分液而洗淨，以硫酸鎂乾燥後，將溶劑減壓下餾去，得到化合物2之薄紫色固體(11.37g，產率91%)。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.13(s、6H)、0.93(s、9H)、1.23(t、9H)、1.92(d、3H)、2.04-2.13(m、1H)、2.39-2.46(m、1H)、2.55-2.66(m、4H)、3.02(q、6H)、3.86-3.95(m、2H)、4.13(d、1H)、5.25(d、1H)、6.35(q、1H)、7.55(d、1H)。
步驟2 化合物3之合成
在氮氣環境下，於化合物2(2.79g、5.0mmol)、3,4,5-參(十八烷氧基)苯甲基醇(依據Tetrahedron、2011、67、6633-6643所記載的方法所合成)(3.13g、3.4mmol)的二氯甲烷(65g)溶液中，在室溫加入2-(1H-苯並三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽[HBTU](2.55g、6.7mmol)、二異丙基乙基胺(1.2mL、7.1mmol)、二甲基胺基吡啶[DMAP](847mg、6.9mmol)，進行1小時8分鐘攪拌。於反應混合物加入甲醇並將析出的固體過濾，得到化合物 3(4.53g，產率98%)之白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.130(s、3H)、0.133(s、3H)、0.88(t、9H)、0.94(s、9H)、1.14-1.83(m、96H)、1.93(d、3H)、2.05-2.15(m、1H)、2.37-2.44(m、1H)、2.68(t、4H)、3.89-3.97(m、8H)、4.07(d、1H)、5.02(s、2H)、5.27(d、1H)、6.34(q、1H)、6.53(s、2H)、7.54(d、1H)、8.11(brs、1H)。
實施例2(TBS基的脫保護)：化合物4之合成
在氮氣環境下，於化合物3(2.97g、2.2mmol)的四氫呋喃[THF](65g)溶液，在室溫加入1.0M四丁基銨氟化物[TBAF]/THF溶液(2.4mL、2.4mmol)，進行2小時10分鐘攪拌。於反應混合物中加入甲醇並過濾析出之固體，得到化合物4(2.66g，產率98%)之白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.09-1.84(m、96H)、1.93(d、3H)、2.30-2.45(m、2H)、2.62- 2.73(m、4H)、3.82-4.04(m、9H)、5.02(s、2H)5.25-5.29(m、1H)、6.19(q、1H)、6.53(s、2H)、7.49(d、1H)、8.07(brs、1H)。
實施例3(H-膦酸酯化)：化合物5a之合成
在氮氣環境下，於亞磷酸(336mg、4.0mmol)的吡啶(10mL)溶液，在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.33mL、2.4mmol)，進行39分鐘攪拌。於該反應混合物中，加入化合物4(498mg、0.40mmol)，在40℃進行1小時攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(56μL、0.40mmol)，再進行1小時45分鐘攪拌。加入乙腈並析出固體，經冰冷後過濾後得到化合物5a(562mg)之白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.16-1.83(m、96H)、1.92(d、3H)、2.31-2.35(m、2H)、 2.68(brs、4H)、3.90-3.98(m、6H)、4.17-4.24(m、3H)、5.02(s、2H)、5.39(d、1H)、6.38(q、1H)、6.53(s、2H)、6.94(d、1H)、7.68(d、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ6.54。
實施例4(H-膦酸酯化)：化合物5b(三乙基胺鹽)之合成
在氮氣環境下，於亞磷酸二苯基(0.72g、3.1mmol)的吡啶(7g)溶液中，在35℃加入化合物4(0.5g、0.40mmol)的吡啶(5g)溶液，以吡啶(3g)洗淨。在35℃進行1小時55分鐘攪拌，以水(2.5g)、三乙基胺(1.9g)的順序加入並進行26分鐘攪拌。將加入乙腈所析出的固體經過濾，得到化合物5b(507mg)之白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.20-1.81(m、105H)、1.98(s、3H)、2.32-2.35(m、2H)、2.67(brs、4H)、3.00-3.09(m、6H)、3.90-4.17(m、9H)、5.02(s、2H)、5.41(t、1H)、6.41(t、1H)、6.53(s、2H)、 6.90(d、1H)、7.84(s、1H)、7.92(brs、1H)、12.67(brs、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ5.11。
實施例5(偶合及酸化)：化合物6之合成
在氮氣環境下，於化合物5a(49mg)與化合物1(20mg、0.056mmol)的吡啶(1mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(25μL、0.18mmol)，進行41分鐘攪拌。其後加入0.1M碘 吡啶/THF/水溶液(0.73mL、0.073mmol)，進行29分鐘攪拌，加入亞磷酸三甲基(4.3μL、0.036mmol)。將反應混合物減壓下濃縮，加入乙腈並析出固體，於冰冷後過濾後得到化合物6(34mg)之皮 膚色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.091-0.13(m、6H)、0.85-0.95(m、18H)、1.08-1.83(m、96H)、1.90(s、3H)、1.91(s、3H)、2.36(brs、2H)、2.57-2.67(m、6H)、3.81-4.29(m、12H)、4.91(t、1H)、5.01(s、2H)、5.42(s、1H)、6.28-6.37(m、2H)、6.53(s、2H)、7.51(s、1H)、7.72(s、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.70。
MS(ESI-)：[M-H]- 1654.1197。
實施例6(3mer合成)：化合物9之合成
步驟1 化合物6之合成
在氮氣環境下，於化合物3(1.00g、0.74mmol)的二氯 甲烷(5mL)溶液，在40℃加入氟化氫-吡啶(86.5μL、3.3mmol)，進行4小時42分鐘攪拌，加入六甲基二矽氧烷[TMS2O](0.55mL、2.6mmol)。該反應混合物中，於化合物30.57mmol中加入吡啶(8mL)，在減壓下濃縮。再度加入吡啶(8mL)，減壓下濃縮後加入吡啶(6mL)，成為化合物4之吡啶溶液。
在氮氣環境下，於亞磷酸(0.50g、6.1mmol)的吡啶(16mL)溶液，在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.41mL、3.0mmol)，進行35分鐘攪拌。於該溶液加入化合物4之吡啶溶液，並以吡啶(1mL)洗淨。在40℃進行6小時35分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.12mL、0.87mmol)並再進行3小時攪拌。加入乙腈並析出固體，經冰冷後過濾，得到化合物5a(737mg)之白色固體。
在氮氣環境下，於化合物5a(702mg)與化合物1(279mg、0.78mmol)的吡啶(14mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.36mL、2.6mmol)，進行33分鐘攪拌。其後，加入含有0.1M之碘、吡啶、THF及水的溶液(6.3mL、0.63mmol)，進行21分鐘攪拌，加入亞磷酸三甲基(12μL、0.11mmol)。於反應混合物加入乙腈並析出固體，減壓下濃縮，加入乙腈使其冰冷後過濾，得到化合物6(799mg)之淡皮膚色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.096(s、3H)、0.11(s、3H)、0.85-0.95(m、18H)、1.10-1.83(m、96H)、1.90(s、 3H)、1.91(s、3H)、2.35(brs、2H)、2.57-2.67(m、6H)、3.86-4.28(m、12H)、4.92(t、1H)、5.02(s、2H)、5.35(s、1H)、6.28-6.33(m、2H)、6.53(s、2H)、7.49(s、1H)、7.59(s、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.96。
步驟2 化合物9之合成
在氮氣環境下，於化合物6(750mg)的二氯甲烷(4mL)溶液，在40℃加入氟化氫-吡啶(51.9μL、2.0mmol)，進行3小時23分鐘攪拌，加入六甲基二矽氧烷[TMS2O](0.33mL、1.6mmol)。加入吡啶(8mL)，減壓下濃縮。再度加入吡啶(8mL)，減壓下濃縮，加入吡啶(6mL)，成為化合物7之吡啶溶液。
在氮氣環境下，於亞磷酸(0.37g、4.4mmol)的吡啶(12mL)溶液中，在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.37mL、2.7mmol)，進行39分鐘攪拌。於該溶液加入化合物7的吡啶溶液，以吡啶(1mL)洗淨。在40℃進行1小時43分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(61μL、0.44mmol)再進行3小時31分鐘攪拌。加入乙腈並析出固體，經冰冷後過濾，得到化合物8(611mg)之白色固體。
在氮氣環境下，於化合物8(600mg)與化合物1(194mg、0.54mmol)的吡啶(10mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.25mL、1.8mmol)，進行34分鐘攪拌。其後加入含有0.1M之碘、吡啶、THF及水之溶 液(4.3mL、0.43mmol)，進行58分鐘攪拌，加入亞磷酸三甲基(16μL、0.14mmol)。於反應混合物中加入乙腈並析出固體，減壓下濃縮，加入乙腈並冰冷後過濾，得到化合物9(634mg)之淡皮膚色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.093(s、3H)、0.10(s、3H)、0.85-0.92(m、18H)、1.09-1.89(m、105H)、2.01-2.52(m、6H)、2.67(brs、4H)、3.85-4.26(m、15H)、4.92(s、1H)、5.01(s、2H)、5.02(s、1H)、5.38(s、1H)、6.13(s、1H)、6.24-6.30(m、2H)、6.53(s、2H)、7.42(s、1H)、7.48(s、1H)、7.60(s、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ-1.52、-1.33。
實施例7(偶合及硫化)：化合物10之合成
在氮氣環境下，於化合物5a(102mg)與化合物1(38mg、0.11mmol)的吡啶(2mL)溶液在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(49μL,0.36mmol)，進行23分鐘攪拌。其後加入單體硫(28mg、0.87mmol)，進行1小時8分鐘攪拌，加入乙腈並析出固體，經冰冷後過濾，得到化合物10(121mg)之白色固體。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ60.46、61.07。
MS(ESI-)：[M-H]- 1670.0959。
實施例8(一時保護基為二甲氧基三苯甲基時的2mer合成)：化合物11之合成
在氮氣環境下，於化合物5a(103mg)與5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷(東京化成工業公司製)(61mg、0.11mmol)的吡啶(2mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(50μL,0.36mmol)，進行22分鐘攪拌。其後加入含有0.1M之碘、吡啶、THF及水的溶液(0.88mL、88μmol)，進行57分鐘攪拌，加入亞磷酸三甲基(1.7μL,14μmol)。加入乙腈並將反應混合物減壓下濃縮。加入乙腈並析出固體，經冰冷後過濾，得到化合物11(96mg)之淡紅色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.09-2.01(m、102H)、2.37-2.69(m、8H)、3.67-4.22(m、18H)、 4.91-5.02(m、3H)、5.38(s、1H)、6.09(s、1H)、6.25(s、1H)、6.54(s、2H)、6.81-7.36(m、13H)、7.51(s、1H)、7.56(s、1H)。
實施例9(對5'→3’方向之2mer合成)：化合物16之合成
步驟1 化合物12之合成
在氮氣環境下，於3’-O-(tert-丁基二甲基矽基)胸苷(Berry公司製)(3.07g、8.6mmol)、琥珀酸酐(1.29g、12.9mmol)的二氯甲烷(31g)溶液，在室溫加入三乙基胺(2.64g、26.1mmol)，進行2小時33分鐘攪拌。於反應混合物加入2.0M磷酸-三乙基胺水溶液並分液。將所得之 有機層以2M磷酸-三乙基胺水溶液進行2次分液並洗淨，以硫酸鎂乾燥後，將溶劑減壓下餾去，得到化合物12之白色泡狀固體(3.73g)。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.10(s、3H)、0.12(s、3H)、0.90(s、9H)、1.23(t、9H)、1.90(s、3H)、2.05-2.14(m、1H)、2.36-2.43(m、1H)、2.51-2.86(m、4H)、3.00(q、6H)、4.10(brs、1H)、4.21-4.26(m、1H)、4.40-4.43(m、1H)、4.59-4.63(m、1H)、5.30(s、1H)、6.08(q、1H)、7.41(d、1H)、9.95(brs、1H)。
步驟2 化合物13之合成
在氮氣環境下，於化合物12(3.73g、8.2mmol)、3,4,5-參(十八烷氧基)苯甲基醇(4.96g、5.4mmol)的二氯甲烷(224g)溶液，在室溫加入2-(1H-苯並三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽[HBTU](4.13g、10.9mmol)、二異丙基乙基胺(1.42g、11.0mmol)、二甲基胺基吡啶(1.37g、11.2mmol)，進行16小時18分鐘攪拌。於反應混合物中加入甲醇並過濾析出之固體，得到化合物13(7.18g)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.080-0.085(m、6H)、0.86-0.89(m、18H)、1.18-1.84(m、96H)、1.94(d、3H)、2.05-2.14(m、1H)、2.27-2.34(m、1H)、2.64-2.74(m、4H)、3.91-3.98(m、6H)、4.04-4.07(m、1H)、4.20-4.39(m、3H)、5.01(s、2H)、6.25(t、1H)、6.52(s、2H)、 7.27(d、1H)、8.01(brs、1H)。
步驟3(伸長反應循環步驟a：脫保護)化合物14之合成
在氮氣環境下，於化合物13(6.06g、4.5mmol)的四氫呋喃[THF](60g)溶液，在室溫加入1.0M四丁基銨氟化物[TBAF]/THF溶液(4.5mL、4.9mmol)，進行1小時23分鐘攪拌。於反應混合物中加入甲醇並過濾析出之固體，得到化合物14(5.45g)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.08-1.84(m、96H)、1.93(d、3H)、2.07-2.16(m、1H)、2.32-2.40(s、1H)、2.62-2.79(m、4H)、3.91-4.00(m、7H)、4.16(dd、1H)、4.27(quint、1H)、4.39(dd、1H)、5.01(q、2H)、6.25(t、1H)、6.53(s、2H)、7.24(d、1H)。
步驟4(伸長反應循環步驟b：H-膦酸酯化)化合物15之合成
在氮氣環境下，於亞磷酸二苯基(1.36g、5.8mmol)的吡啶(15mL)溶液，在室溫加入化合物14(1.05g、0.85mmol)的吡啶(10mL)溶液，以吡啶(5mL)洗淨。在40℃進行1小時22分鐘攪拌，以水(5.13g)、三乙基胺(3.79g)的順序加入並進行14分鐘攪拌。於反應混合物加入乙腈並析出的固體經過濾，得到化合物15(1.09g)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.20- 1.83(m、96H)、1.93(d、3H)、2.14-2.23(m、1H)、2.54-2.74(m、5H)、3.90-3.98(m、6H)、4.32-4.39(m、3H)、4.80-4.86(m、1H)、5.00(s、2H)、6.30(t、1H)、6.52(s、2H)、6.89(d、1H)、7.28(d、1H)、8.17(brs、1H)、12.32(brs、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ3.86。
步驟5(伸長反應循環步驟c及d：偶合及酸化)化合物16之合成
在氮氣環境下，於化合物15(250mg)與3’-O-(tert-丁基二甲基矽基)胸苷(97mg、0.27mmol)的吡啶(5mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.12mL、0.90mmol)，進行29分鐘攪拌。其後加入含有0.1M的碘、吡啶、THF及水的溶液(2.2mL、0.22mmol)，進行40分鐘攪拌，加入亞磷酸三甲基(4.3μL、36μmol)。將反應混合物減壓下濃縮，加入乙腈並析出固體，冰冷後過濾，得到化合物16(270mg)的淡皮膚色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.076(s、6H)、0.83-0.96(m、18H)、1.06-1.83(m、96H)、1.89(s、3H)、1.92(s、3H)、2.11-2.67(m、8H)、3.90-4.47(m、13H)、4.92(s、1H)、4.99(s、2H)、6.19-6.28(m、2H)、6.52(s、2H)、7.26(s、1H)、7.55(s、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ-0.48。
MS(ESI-)：[M-H]- 1654.1123。
實施例10(2mer合成)：化合物20之合成
步驟1 化合物18之合成
在氮氣環境下，於化合物17(依據日本特開第2011-126993號所記載的方法合成)(4.26g、4.8mmol)的硝基苯(43g)溶液中，在60℃加入琥珀酸單乙基氯化物(1.36mL,9.7mmol)，加入氯化鋁(1.30g、9.8mmol)，在60℃進行2小時2分鐘攪拌。冷卻至室溫，以水經2次分液並洗淨。於所得之有機層加入甲醇並析出固體，經過濾得到淡黃色固體。
於該固體之THF(15g)溶液中，加入氫氧化鉀(3.17g、48mmol)水溶液，加熱迴流下進行1小時25分鐘攪拌。加入水(2g)，以濃鹽酸將水層的pH自7調整至8。加入二氯甲烷(38g)、水(12g)並分液，將所得之有機層在減壓下濃縮。將所得之殘渣溶解於THF，加入甲醇並析出的固體經過濾，得到化合物18(3.70g)之褐色固體。
1H-NMR：(300MHz；C5D5N)δ0.88(t、9H)、1.11-1.88(m、96H)、3.17(t、2H)、3.62(t、2H)、4.04(t、4H)、4.11(t、2H)、6.53(s、2H)。
MS(ESI-)：[M-H]- 981.8884。
步驟2 化合物19之合成
在氮氣環境下，於化合物18(3.56g、3.6mmol)、化合物1(1.98g、5.6mmol)的二氯甲烷(22g)溶液，在室溫加入2-(1H-苯並三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽[HBTU](2.75g、7.3mmol)、二異丙基乙基胺(1.23mL、7.2mmol)、二甲基胺基吡啶(0.91g、7.4mmol)，進行1小 時31分鐘攪拌。於反應混合物加入水並分液。將所得之水層以二氯甲烷分液，合併所得之有機層，以飽和氯化鈉水溶液洗淨，並減壓下濃縮。加入己烷並析出固體，經過濾除去固體。將所得之粗物以矽膠層析法(己烷-乙酸乙酯)純化後得到化合物19(2.85g)之橘色油狀物。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.13(s、6H)、0.88(t、9H)、0.93(s、9H)、1.14-1.87(m、96H)、1.92(d、3H)、2.05-2.14(m、1H)、2.39-2.45(m、1H)、2.67(t、2H)、3.09(t、2H)、3.88-3.94(m、8H)、4.11(d、1H)、5.27(d、1H)、6.05(s、2H)、6.35(q、1H)、7.55(d、1H)、8.01(d、1H)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1322.0619。
步驟3 化合物20之合成
在氮氣環境下，於化合物19(22.5mg)的二氯甲烷(0.3mL)溶液中加入氟化氫-吡啶(3μL)，進行7小時3分鐘攪拌，加入三甲基矽基氯化物[TMSCl](10μL)。加入吡啶(0.1mL)，加入亞磷酸(2.9mg)、2,2-二甲基丁醯基氯化物(20μL)，加入化合物1(12.9mg)。進行2天攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(10μL)並再進行1小時28分鐘攪拌。加入含有0.1M的碘之吡啶、THF及水的溶液(1mL)，進行1天攪拌，加入硫代硫酸鈉為飽和的乙腈與水的混合溶劑(乙腈/水=9/1(重量比))並過濾後得到化合物20。
MS(ESI-)：[M-H]- 1624.1104。
實施例11(2mer合成)：化合物23之合成
步驟1 化合物22之合成
在氮氣環境下，於亞磷酸(329mg、4.0mmol)的吡啶(11mL)溶液，在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.33mL、2.4mmol)，進行32分鐘攪拌。於該溶液中加入化合物21(依據國際公開第2014-077292號所記載的方法進行合成)(492mg、0.39mmol)，以吡啶(0.40mL)洗淨。在40℃進行3小時40分鐘攪拌，加入乙腈並析出固體，冰冷後過濾，得到化合物22(495mg)之淡黃色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.17- 1.83(m、96H)、1.97(d、3H)、2.18(s、3H)、2.33-2.44(m、2H)、2.54-2.58(m、2H)、2.73-2.79(m、2H)、3.95-4.05(m、6H)、4.20(t、1H)、4.27(d、2H)、5.37(d、1H)、6.38(t、1H)、7.10(s、2H)、6.94(d、1H)、7.76(d、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ6.62。
步驟2 化合物23之合成
在氮氣環境下，於化合物22(453mg)與化合物1(177mg、0.50mmol)的吡啶(9mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.14mL、1.0mmol)，進行28分鐘攪拌。加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.14mL、1.0mmol)再進行44分鐘攪拌，其後加入含有0.1M之碘的吡啶、THF及水的溶液(4.0mL、0.40mmol)，進行1小時36分鐘攪拌，加入亞磷酸三甲基(7.8μL、0.066mmol)。於反應混合物中加入乙腈並析出固體，減壓下濃縮，加入乙腈並冰冷後過濾，得到化合物23(478mg)之淡褐色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.095-0.13(m、6H)、0.85-0.97(m、18H)、1.08-1.83(m、96H)、1.89-1.95(m、6H)、2.06-2.39(m、7H)、2.54-2.65(m、2H)、2.75-2.82(m、2H)、3.86-4.30(m、12H)、4.90-5.39(m、2H)、6.12-6.40(m、2H)、7.12(d、2H)、7.45-7.82(m、2H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ-1.27。
實施例12(2mer合成)：化合物26之合成
步驟1 化合物24之合成
在氮氣環境下，於化合物2(89mg、0.16mmol)、N-(2-羥基乙基)-3,4,5-參(十八烷氧基)苯甲醯胺(依據日本特開第2001-122889號所記載的方法進行合成)(100mg、0.10mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液中，在40℃加入2-(1H-苯並三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽[HBTU](77mg、0.20mmol)、二異丙基乙基胺(35μL、0.21mmol)、二甲基胺基吡啶(25mg、0.20mmol)，進行1小時21分鐘攪拌。於反應混合物中加入甲醇並過濾析出 之固體，得到化合物24(135mg，產率93%)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.096(s、3H)、0.11(s、3H)、0.88(t、9H)、0.91(s、9H)、1.12-1.84(m、96H)、1.92(d、3H)、2.04-2.14(m、1H)、2.34-2.41(m、1H)、2.68(brs、4H)、3.70(q、2H)、3.86(s、2H)、3.96-4.02(m、6H)、4.07(s、1H)、4.32(t、2H)、5.25(d、1H)、6.29-6.34(m、1H)、6.55(t、1H)、6.98(s、2H)、7.52(d、1H)、8.07(brs、1H)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1409.0956。
步驟2 化合物25之合成
在氮氣環境下，於化合物24(99mg、0.070mmol)的二氯甲烷(0.5mL)溶液中，在40℃加入氟化氫-吡啶(8.3μL、0.32mmol)，進行3小時34分鐘攪拌，加入六甲基二矽氧烷[TMS2O](53mL、0.25mmol)。加入吡啶(1mL)，減壓下濃縮。再度加入吡啶(1mL)，減壓下濃縮，加入吡啶(0.8mL)，成為經脫保護的化合物之吡啶溶液。
在氮氣環境下，於亞磷酸(57mg、0.693mmol)的吡啶(2mL)溶液中，在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(59μL、0.43mmol)，進行31分鐘攪拌。於該混合物中加入上述經脫保護的化合物之吡啶溶液，以吡啶(0.5mL)洗淨。在40℃進行1小時12分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(15μL、0.11mmol)再進行1小時17分鐘攪拌。於反應混合物中加入乙腈並析出固體，冰冷後過濾， 得到化合物25(78mg)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.18-1.83(m、96H)、1.91(s、3H)、2.19-2.36(m、2H)、2.65(brs、4H)、3.69(brs、2H)、3.95-4.01(m、6H)、4.13(s、1H)、4.17(s、1H)、4.20(s、1H)、4.32(t、2H)、5.28(d、1H)、6.29(q、1H)、6.80(brs、1H)、6.88(d、1H)、7.00(s、2H)、7.53(s、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ6.86。
MS(ESI-)：[M-H]- 1356.9650。
步驟3 化合物26之合成
在氮氣環境下，於化合物25(69mg)與化合物1(28mg、78mmol)的吡啶(1.4mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(35μL、0.25mmol)，進行48分鐘攪拌。其後加入含有0.1M之碘的吡啶、THF及水的溶液(0.6mL、0.060mmol)，進行1小時攪拌，加入亞磷酸三甲基(1.2μL、0.010mmol)。將反應混合物減壓下濃縮，加入乙腈並冰冷後過濾，得到化合物26(76mg)之淡褐色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.087-0.12(m、6H)、0.85-0.95(m、18H)、1.17-1.78(m、96H)、1.86-1.89(m、6H)、2.02-2.65(m、8H)、3.67-4.30(m、16H)、4.92-5.36(m、2H)、6.12-6.32(m、2H)、6.90(brs、1H)、6.99-7.03(m、2H)、7.45-7.60(m、2H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ-1.11。
實施例13(在RNA之2mer合成)：化合物27之合成
在氮氣環境下，於化合物25(9.4mg)與5’-O-(tert-丁基二甲基矽基)-2’-O-三異丙基矽基尿苷(參考合成例2記載)(5.3mg、10mmol)的吡啶(0.50mL)溶液中，在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(9.4μL、69μmol)，進行37分鐘攪拌。其後加入含有0.05M的碘之吡啶與水的溶液(0.17mL、8.5μmol)並進行4小時攪拌，其後在80℃進行15小時23分鐘攪拌。將反應混合物減壓下濃縮，得到化合物27。
MS(ESI-)：[M-H]- 1755.1612。
實施例14(偶合~脫保護連續化)：化合物28之合成
在氮氣環境下，於化合物25(100mg)與化合物1(38mg、0.11mmol)的吡啶(5.0mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(47μL、0.34mmol)，進行14分鐘攪拌。其後加入含有0.05M之碘的吡啶與水的溶液(1.7mL、0.085mmol)，進行55分鐘攪拌，進一步加入含有0.05M之碘的吡啶與水的溶液(0.41mL、0.021mmol)，進行38分鐘攪拌。其後，加入亞磷酸二甲基(0.63μL、0.0069mmol)，進行在100℃的5小時57分鐘攪拌。將反應混合物冷卻，加入乙腈(41g)並析出固體，冰冷後過濾，得到化合物28(0.11g)之皮膚色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.17-1.82(m、96H)、1.86(s、3H)、2.23-2.34(m、4H)、2.64(brs、4H)、3.67-4.31(m、16H)、5.04(brs、1H)、5.41(s、1H)、6.13(t、1H)、6.29(t、1H)、6.97-7.00(m、 1H)、7.02(s、2H)、7.26-7.63(m、2H)、9.28(brs、2H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ-0.069。
實施例15(將碳酸雙五氟苯酯作為縮合劑使用的偶合)：化合物29之合成
在氮氣環境下，於化合物25(10mg)與化合物1(4.2mg、0.012mmol)的吡啶(0.50mL)溶液中，在25℃加入碳酸雙五氟苯酯(15.4mg、0.039mmol)，進行20分鐘攪拌。將反應混合物減壓下濃縮，得到將化合物29作為主生成物者。
MS(ESI-)：[M-H]- 1711.1424。
實施例16(將苯甲醯氯使用於縮合劑之1循環)：化合物30之合成
在氮氣環境下，於化合物25(102mg)與化合物1(39mg、0.11mmol)的吡啶(5.0mL)溶液中，在25℃加入苯甲醯氯(24μL、0.21mmol)，進行15分鐘攪拌。其後加入含有0.05M之碘的吡啶與水的溶液(2.1mL、0.11mmol)，進行36分鐘攪拌後，加入亞磷酸二甲基(3.2μL、0.035mmol)。在100℃進行4小時31分鐘攪拌，將反應混合物減壓下濃縮。加入吡啶(5.0mL)，減壓下濃縮後，加入吡啶(5.0mL)。加入亞磷酸(56mg、0.68mmol)，將苯甲醯氯(50μL、0.43mmol)分為3分，在40℃下隔10分鐘加入，進行2小時35分鐘攪拌，加入苯甲醯氯(8.3μL、0.071mmol)，再進行54分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(44g)並析出的固體經過濾後，得到化合物30(0.11g)的淡褐色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.87(t、9H)、1.08- 1.99(m、102H)、2.23-2.63(m、8H)、3.67(brs、2H)、3.96(t、6H)、4.15-4.27(m、6H)、5.08(brs、1H)、5.35(s、1H)、6.16(s、1H)、6.24(s、1H)、6.83(d、1H)、7.04(s、2H)、7.13(brs、1H)、7.47(s、1H)、7.53(s、1H)、9.86(brs、2H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ-1.59、5.89。
實施例17(以DNA進行脫保護連續化之1循環)：化合物35之合成
步驟1 化合物31之合成
在氮氣環境下，於N-(2-羥基乙基)-N-甲基-3,4,5-參(十八烷氧基)苯甲醯胺(依據日本特開第2001-253896號所記載的方法所合成)(5.0g、5.1mmol)與琥珀酸酐(1.0g、10mmol)的二氯甲烷(50g)溶液，在室溫加入三乙基胺(2.1mL、15mmol)，進行1小時57分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(513g)並析出固體後過濾，得到化合 物31(5.3g，產率95%)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.86-0.90(m、9H)、1.09-1.84(m、96H)、2.65(s、4H)、3.05(s、3H)、3.76(brs、2H)、3.96(t、6H)、4.38(brs、2H)、6.58(s、2H)。
MS(ESI)：[M-H]- 1082.9343。
步驟2 化合物32之合成
在氮氣環境下，於化合物31(1.0g、0.92mmol)與化合物1(0.51g、1.4mmol)的二氯甲烷(25mL)溶液，在室溫加入HBTU(0.70g、1.8mmol)、二異丙基乙基胺(0.31mL、1.8mmol)、DMAP(0.23g、1.9mmol)，進行1小時9分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於甲醇(102g)並析出的固體經過濾，得到化合物32(1.3g，產率99%)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.13(s、6H)、0.86-0.94(m、18H)、1.09-1.84(m、96H)、1.92(s、3H)、2.14-2.43(m、2H)、2.66(brs、4H)、3.06(s、3H)、3.68(brs、2H)、3.90-3.98(m、8H)、4.10(s、1H)、4.34(brs、2H)、5.27(d、1H)、6.34(q、1H)、6.57(s、2H)、7.54(s、1H)、8.07(brs、1H)。
MS(ESI-)：[M-H]- 1421.1060。
步驟3 化合物33之合成
在氮氣環境下，於化合物32(1.2g、0.86mmol)的 THF(10mL)溶液，在室溫加入1.0M TBAF/THF溶液(0.95mL、0.95mmol)，進行1小時10分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於甲醇(123g)，並將析出的固體經過濾，得到化合物33(1.2g、定量的)之淡皮膚色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.03-1.84(m、96H)、1.92(s、3H)、2.36-2.41(m、2H)、2.65(brs、4H)、3.06(s、3H)、3.75(brs、2H)、3.86(brs、2H)、3.93-3.98(m、6H)、4.07(d、1H)、4.36(brs、2H)、5.30-5.34(m、1H)、6.21(t、1H)、6.59(s、2H)、7.51(s、1H)、8.21(brs、1H)。
MS(ESI-)：[M-H]- 1307.0241。
步驟4 化合物34之合成
在氮氣環境下，於亞磷酸(0.63g、7.6mmol)的吡啶(20mL)溶液中，在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.68mL、5.0mmol)，進行32分鐘攪拌。於該溶液中，加入化合物33(1.0g、0.77mmol)，在40℃進行3小時3分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(52μL、0.38mmol)再進行1小時4分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(210g)並將析出的固體經過濾後得到化合物34(1.0g)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.10-1.81(m、96H)、1.91(s、3H)、2.33-2.37(m、2H)、2.66(brs、4H)、3.06(s、3H)、3.68-3.80(brs、2H)、3.94- 4.36(m、11H)、6.36(q、1H)、6.59(s、2H)、6.90(d、1H)、7.60(s、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ6.56。
MS(ESI-)：[M-H]- 1370.9904。
步驟5 化合物35之合成
在氮氣環境下，於化合物34(106mg)與化合物1(43mg、0.12mmol)的吡啶(2.0mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(49μL、0.36mmol)，進行30分鐘攪拌。其後加入含有0.05M之碘的吡啶與水的溶液(2.0mL、0.10mmol)，進行38分鐘攪拌，再加入含有0.05M的碘之吡啶與水的溶液(0.13mL、0.0063mmol)，進行10分鐘攪拌。其後，加入亞磷酸二甲基(3.3μL、0.036mmol)，在100℃進行3小時33分鐘攪拌。將反應混合物減壓下濃縮，加入吡啶(5.0mL)，再度減壓下濃縮後，加入吡啶(1.5mL)。
在氮氣環境下，於亞磷酸(64mg、0.77mmol)的吡啶(2.0mL)溶液中，在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(64μL、0.46mmol)，進行28分鐘攪拌。於該溶液中加入含有上述的經脫保護的化合物之反應混合物，在40℃進行1小時5分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(20μL、0.14mmol)，再進行1小時12分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(51g)，並將析出之固體經析出過濾後，得到化合物35(0.12g)之褐色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.15-1.89(m、102H)、2.23-2.38(m、4H)、2.66(brs、4H)、3.05(s、3H)、3.72(brs、2H)、3.93-4.35(m、14H)、5.11(brs、1H)、5.37(s、1H)、6.17(brs、1H)、6.28(t、1H)、6.58(s、2H)、6.83(d、1H)、7.46(s、1H)、7.54(s、1H)、9.61(brs、2H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ-1.52、6.01。
MS(ESI-)：[M-H]- 1675.0476。
實施例18~29(縮合劑檢討)：化合物29之合成
與實施例15之同様條件下，將縮合劑變更為HBTU(16.1mg、實施例18)、1,1’-羰基二咪唑[CDI](5.6mg、實施例19)、甲烷磺醯基氯化物[MsCl](2.8μL、實施例20)六氟磷酸(苯並三唑-1-基氧基)三吡咯烷鏻[PyBOP](20.8mg、實施例21)、N,N’-二環己基碳二亞胺[DCC](9.1mg、實施例22)、三氟乙酸酐[TFAA](4.7μL、實施例23)、三氟乙酸五氟苯基(6.1μL、實施例24)、p-甲苯磺醯基氯化物(9.1mg、實施例25)、異丁醯基氯化物(3.8μL、實施例26)、乙醯氯(2.6μL、實施例27)、丙醯基氯化物(3.1μL、實施例28)或丁醯基氯化物(3.7μL、實施例29)實施反應，得到化合物29。在實施例19、20、21、22、25、26中得到主生成物之化合物29。
實施例30(使用脫氧胞苷之2mer合成)：化合物36之合成
與實施例17之步驟5的同様條件下，將化合物1變更為N4-苯甲醯基-5’-O-(tert-丁基二甲基矽基)-2’-脫氧胞苷(東京化成工業公司製)(5.3mg)並實施反應，得到將化合物36作為主生成物者。
MS(ESI-)：[M-H]- 1700.0868。
實施例31(使用脫氧腺苷之2mer合成)：化合物37之合成
與實施例17之步驟5的同様條件下，將化合 物1變更為N6-苯甲醯基-5’-O-(tert-丁基二甲基矽基)-2’-脫氧腺苷(東京化成工業公司製)(5.4mg)並實施反應，得到將化合物37作為主生成物者。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1726.1283。
實施例32(使用脫氧鳥嘌呤核苷之2mer合成)：化合物38之合成
與實施例17之步驟5的同様條件下，將化合物1變更為N2-異丁醯基-5’-O-(tert-丁基二甲基矽基)-2’-脫氧鳥嘌呤核苷(東京化成工業公司製)(6.5mg)並實施反應，得到將化合物38作為主生成物者。
MS(ESI-)：[M-H]- 1706.1275。
實施例33(於核酸鹼導入擬似固相保護基之單體及2mer合成)：化合物40之合成
步驟1 化合物39之合成
在氮氣環境下，於5’-O-(tert-丁基二甲基矽基)-2’-脫氧胞苷(依據Journal of Organic Chemistry、2011年、76卷、105頁-126頁所記載的方法而合成)(2.5g、7.3mmol)與化合物31(5.3g、4.9mmol)的二氯甲烷(155mL)及DMF(25mL)的混合溶液中，在40℃加入1-羥基苯並三唑[HOBt](酐)(0.74g、5.5mmol)，繼續加入1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽[WSC．HCl](1.9g、9.9mmol)，進行1小時40分鐘攪拌。將反應混合物在減壓下濃縮後，加入甲醇(503g)並析出固體後經過濾，得到化合物39(6.8g，產率98%)之黃色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.09-0.10(m、6H)、0.84-0.90(m、18H)、1.20-1.81(m、96H)、2.12-2.21(m、1H)、2.28-2.36(m、1H)、2.61-2.77(m、5H)、3.05(s、3H)、3.76(brs、2H)、3.81-3.97(m、8H)、4.07(q、1H)、4.37(brs、2H)、4.40-4.45(m、1H)、6.29(t、1H)、6.57(s、2H)、7.31(d、1H)、8.31(d、1H)、8.88(brs、1H)。
MS(ESI-)：[M-H]- 1406.1107。
步驟2 化合物40之合成
在氮氣環境下，於化合物39(6.7g、4.8mmol)、DMAP(0.062g、0.50mmol)、乙醯丙酸(0.86g、7.4mmol)的THF(69g)溶液中，在室溫加入WSC．HCl(1.4g、7.5mmol)，進行50分鐘攪拌。其後，加入DMAP(0.26g、2.1mmol)，在室溫進行3天攪拌。將反應混合物過濾後，將所得之濾液在減壓下濃縮後，加入THF(38g)成為溶液後，加入乙腈(505g)並析出之固體經過濾，得到化合物40(6.7g，產率93%)之淡黃色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.09(s、6H)、0.86-0.90(m、18H)、1.26-1.81(m、96H)、2.01-2.13(m、2H)、2.20(s、3H)、2.52-2.80(m、8H)、3.06(s、3H)、3.77(brs、2H)、3.86-3.98(m、8H)、4.20(s、1H)、4.38(brs、2H)、5.26(d、1H)、6.32-6.37(m、1H)、6.57(s、2H)、7.33(d、1H)、8.27(d、1H)、9.17(brs、 1H)。
MS(ESI-)：[M-H]- 1504.1412。
步驟3 化合物41之合成
在氮氣環境下，於化合物37(6.5g、4.3mmol)、乙酸(2.9mL、50mmol)的THF(71g)溶液中，在30℃加入1.0M TBAF/THF溶液(28mL、28mmol)，進行4小時53分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於甲醇(531g)並將所析出之固體經過濾，得到化合物41(6.0g、定量的)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.20-1.80(m、96H)、2.20(s、3H)、2.38-2.80(m、10H)、3.05(s、3H)、3.78(brs、2H)、3.88-3.98(m、8H)、4.18(d、1H)、4.39(brs、2H)、5.36(quint、1H)、6.20(dd、1H)、6.59(s、2H)、7.21-7.31(m、1H)、8.19(d、1H)。
MS(ESI-)：[M-H]- 1390.0541。
步驟4 化合物42之合成
在氮氣環境下，於亞磷酸(1.20g、14.6mmol)的吡啶(40mL)溶液中，在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(1.28mL、9.3mmol)，進行30分鐘攪拌。於該溶液中加入化合物41(2.0g、1.4mmol)，在40℃進行1小時23分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈並將析出之固體經過濾，得到化合物42(2.2g)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.26-1.83(m、96H)、2.19(s、3H)、2.38-2.88(m、10H)、3.06(s、3H)、3.75(brs、2H)、3.92-4.35(m、11H)、5.37(d、1H)、6.17(t、1H)、6.58(s、2H)、6.88(d、1H)、7.26-7.28(m、1H)、8.51(d、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ5.73。
MS(ESI-)：[M-H]- 1454.0237。
步驟5 化合物43之合成
在氮氣環境下，於化合物42(96mg)與化合物1(36mg、0.10mmol)的吡啶(2.0mL)溶液中，在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(45μL、0.33mmol)，進行23分鐘攪拌。其後加入含有0.05M之碘的吡啶與水的溶液(2.6mL、0.13mmol)，進行1小時29分鐘攪拌。其後，加入亞磷酸二甲基(3.0μL、0.033mmol)，加入水(0.26mL,14.4mmol)後，在70℃進行15小時55分鐘攪拌。將反應混合物減壓下濃縮，得到化合物43作為主生成物者。
MS(ESI-)：[M-H]- 1694.1110。
實施例34(2mer合成)：化合物44之合成
在氮氣環境下，於化合物42(1.0g)與化合物1(0.35g、0.98mmol)的吡啶(20mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.45mL、3.3mmol)，進行17分鐘攪拌。其後加入含有0.1M之碘的吡啶、THF及水的溶液(9.8mL、0.98mmol)，進行38分鐘攪拌。其後，將反應混合物在減壓下濃縮。加入甲苯(27g)在減壓下濃縮的操作重複3次後，加入二氯甲烷(12g)，將不溶物經過濾除去，以二氯甲烷(6g)進行二次洗淨。於該溶液中，將氟化氫-吡啶(76.1μL、2.9mmol)在室溫下加入，進行18小時57分鐘攪拌。加入TMSCl(0.29mL、2.3mmol)，進行17分鐘攪拌。其後，將反應混合物減壓下濃縮，加入吡啶，在減壓下濃縮。
在氮氣環境下，於亞磷酸(0.70g、8.5mmol)的吡啶(18mL)溶液中，在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.80mL、5.8mmol)，進行39分鐘攪拌。於該溶液中加入前述濃縮物，並在40℃進行2小時37分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(518g)並經析出的固體經過濾，得到化合物44(1.0g)之淡皮膚色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.15- 1.83(m、96H)、1.90(s、3H)、2.18(s、3H)、2.46-2.95(m、12H)、3.06(s、3H)、3.68(brs、2H)、3.92-4.34(m、14H)、5.02(s、1H)、5.35(s、1H)、6.16(t、1H)、6.25(t、1H)、6.59(s、2H)、6.82(d、1H)、7.07(d、1H)、7.46(s、1H)、8.65(d、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ-2.16、4.97。
MS(ESI-)：[M-H]- 1758.0754。
實施例35(4mer合成)：化合物46之合成
步驟1 化合物44之合成
在氮氣環境下，於化合物42(0.94g)與5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷(東京化成工業公司製)(0.49g、 0.91mmol)的吡啶(20mL)溶液中，在25℃加入作為縮合劑之2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.42mL、3.0mmol)，進行20分鐘攪拌(偶合反應)。其後加入含有0.1M之碘的吡啶、THF及水的溶液(9.1mL、0.91mmol)，進行20分鐘攪拌。其後，加入鄰甲酸三甲酯(1.3mL、12mmol)，在25℃進行34分鐘攪拌，將反應混合物在減壓下濃縮。加入甲苯(30g)，在減壓下濃縮的操作重複3次後，加入二氯甲烷(10mL)，將不溶物以吸引過濾除去後，以二氯甲烷(5mL)進行2次萃取。於該溶液中，將吡咯(0.13mL、1.8mmol)、膦酸(0.73g、9.1mmol)在室溫下加入，進行29分鐘攪拌。將吡啶(2.8mL)在室溫下加入後，將2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.83mL、6.0mmol)分為3分，隔10分鐘加入並進行1小時16分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.14mL、1.0mmol)，再進行45分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(396g)並析出之固體經過濾後得到化合物44(1.0g)之淡灰色固體。
MS(ESI-)：[M-H]- 1758.0512。
步驟2 化合物45之合成
在氮氣環境下，於化合物44(0.98g)與5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷(東京化成工業公司製)(0.45g、0.83mmol)的吡啶(20mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.38mL、2.8mmol)，進行27分鐘攪拌。其後加入含有0.1M之碘的吡啶、THF及水的溶液(8.3mL、 0.83mmol)，進行44分鐘攪拌。其後，加入鄰甲酸三甲基(1.2mL、11mmol)，在25℃進行42分鐘攪拌，將反應混合物在減壓下濃縮。加入甲苯(30g)並在減壓下濃縮的操作重複3次後，加入二氯甲烷(10mL)，將不溶物以吸引過濾除去，以二氯甲烷(5mL)進行2次萃取。於該溶液中，將吡咯(0.12mL、1.7mmol)、膦酸(0.69g、8.3mmol)在20℃加入，進行30分鐘攪拌。將吡啶(2.8mL)在25℃下加入後，將2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.76mL、5.5mmol)分為3分並隔10分鐘加入後進行39分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.14mL、1.0mmol)再進行49分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(396g)並經析出的固體經過濾後得到化合物45(1.2g)之淡灰色固體。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2064.1191。
步驟3 化合物46之合成
在氮氣環境下，於化合物45(1.16g)與5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷(東京化成工業公司製)(0.43g、0.81mmol)的吡啶(20mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.37mL、2.7mmol)，進行29分鐘攪拌。其後加入含有0.1M之碘的吡啶、THF及水的溶液(8.1mL、0.81mmol)，進行25分鐘攪拌。其後，加入鄰甲酸三甲基(1.2mL、11mmol)，在25℃進行21分鐘攪拌，將反應混合物在減壓下濃縮。加入甲苯(30g)並在減壓下濃縮的操作重複3次後，二氯甲烷(10mL)，將不溶物以吸引過濾除 去，以二氯甲烷(5mL)進行2次洗淨。於該溶液中，將吡咯(0.11mL、1.6mmol)及膦酸(0.65g、8.1mmol)在27~30℃下加入，進行24分鐘攪拌。將吡啶(3.0mL)在22~28℃下加入後，將2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.74mL、5.4mmol)分為3分並隔10分鐘加入，進行41分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.49mL、3.6mmol)，再進行1小時20分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(397g)並將析出的固體經析出過濾後，得到化合物46(1.33g)之淡灰色固體。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2368.1574。
實施例36(在RNA之2mer合成)：化合物47之合成
在氮氣環境下，於化合物42(9.5mg)與2’-O-(tert-丁基二甲基矽基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷(由關東化學公司所購入)(7.8mg、0.012mmol)的吡啶(0.20mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(4.5μL、0.033mmol)，進行35分鐘攪拌。其後加入含有 0.1M之碘的吡啶、THF及水的溶液(98μL、0.098mmol)，進行20分鐘攪拌。將反應混合物減壓下濃縮，加入甲苯(1mL)，在減壓下濃縮的操作重複3次後，加入二氯甲烷(0.30mL)，將不溶物以吸引過濾除去，以二氯甲烷(0.20mL×2次)萃取。於該溶液中，將吡咯(2μL、0.029mmol)、膦酸(9.1mg、0.11mmol)在室溫下加入，進行30分鐘攪拌。將反應混合物減壓下濃縮，得到將化合物47作為主生成物者。
MS(ESI-)：[M-H]- 1810.2131。
實施例37(2mer合成)：化合物49之合成
在氮氣環境下，於化合物42(104mg)與5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷(東京化成工業公司 製)(58mg、107mmol)的吡啶(2.0mL)溶液中，在室溫加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(46μL、0.34mmol)，進行32分鐘攪拌而進行偶合反應。其後，作為硫化劑加入單體硫(3.2mg、0.10mmol)，進行1小時32分鐘攪拌，將反應混合物在減壓下濃縮。加入甲苯(4.0mL)在減壓下濃縮的操作重複3次後，加入二氯甲烷(1.0mL)，將不溶物以注射器濾器除去，以二氯甲烷(0.50mL×2次)洗淨。於該溶液中，將吡咯(14μL、0.20mmol)、膦酸(80mg、1.0mmol)在室溫下加入，進行36分鐘攪拌後，進行脫一時保護基反應。將吡啶(0.30mL)在室溫下加入後，將2,2-二甲基丁醯基氯化物(92μL、0.67mmol)分為3分並隔10分鐘加入，進行2小時24分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(16μL、0.12mmol)，再進行40分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(49g)並將析出之固體進行析出過濾後得到化合物49(98mg)的白色固體。
MS(ESI-)：[M-H]- 1774.0443。
實施例38(硫化劑檢討2mer合成)：化合物49之合成
在與實施例37之同様條件下，將硫化劑變更為3-胺基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(11.8mg)，實施反應後，得到化合物49(99mg)之淡黃色固體。
實施例39(硫化劑檢討2mer合成)：化合物48之合成
在與實施例37之同様條件下，將硫化劑變更 為3-((二甲基胺基-亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮[DDTT](11.8mg)，實施反應後，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到將化合物48作為主生成物者。
實施例40(硫化劑檢討2mer合成)：化合物48之合成
將與實施例37之同様條件下實施的偶合反應後之反應溶液分為4分，將硫化劑變更為3H-1,2-苯並二硫醇-3-酮(3.7mg)並實施，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到將化合物48作為主生成物者。
實施例41(硫化劑檢討2mer合成)：化合物48之合成
使用在實施例40所得之偶合反應後的反應溶液的4分之1，在與實施例37之同様條件下，將硫化劑變更為3H-1,2-苯並二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(3.3mg)，實施反應，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到將化合物48作為主生成物者。
實施例42(硫化劑檢討2mer合成)：化合物48之合成
使用在實施例40所得之偶合反應後的反應溶液的4分之1，在與實施例37之同様條件下，將硫化劑變更為四乙基秋蘭姆二硫化物(4.4mg)，實施反應，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到將化合物48作為主生成物者。
實施例43(硫化劑檢討2mer合成)：化合物48之合成
在與實施例37之同様條件下，將硫化劑變更為雙(苯基乙醯)二硫化物(4.5mg)，實施反應，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到將化合物48作為主生成物者。
實施例44(硫化劑檢討2mer合成)：化合物48之合成
在與實施例37之同様條件下，將硫化劑變更為N-(苯甲醯基硫)-琥珀酸醯亞胺(依據Synthesis、1980年、721-722頁所記載的方法進行合成)(3.7mg)，實施反應，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到將化合物48作為主生成物者。
實施例45(使用脫氧腺苷的2mer合成)：化合物50之合成
在與實施例37之同様條件下，將5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷變更為N6-苯甲醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧腺苷(東京化成工業公司 製)(66.4mg)，實施反應，將脫一時保護基反應後之反應混合物在減壓下濃縮，得到化合物50。
MS(ESI-)：[M-H]- 1823.1213。
實施例46(使用脫氧鳥嘌呤核苷的2mer合成)：化合物51之合成
在與實施例37之同様條件下，將5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷變更為N2-異丁醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧鳥嘌呤核苷(東京化成工業公司製)(6.6mg)，實施反應，將偶合反應後之反應混合物在減壓下濃縮，得到將化合物51作為主生成物者。
MS(ESI-)：[M-H]- 2075.2896。
實施例47(3mer合成)：化合物52之合成
在氮氣環境下，於化合物44(9.5mg)與5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷(東京化成工業公司製)(6.0mg、0.011mmol)的吡啶(0.20mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(3.8μL、0.028mmol)，進行26分鐘攪拌。其後，單體硫(2.1mg、0.065mmol)，進行1小時40分鐘攪拌。將反應混合物在減壓下濃縮，得到將化合物52作為主生成物者。
MS(ESI-)：[M-H]- 2316.2547。
實施例48(在H-膦酸酯二酯進行2mer合成)：化合物53之合成
在氮氣環境下，於化合物42(12mg)與5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷(東京化成工業公司製)(7.0mg、0.013mmol)的THF(0.20mL)溶液中，在25℃加入吡啶(1.7μL、0.034mmol)後，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(4.6μL、0.034mmol)，進行45分鐘攪拌。其後追加吡啶(1.7μL、0.034mmol)，進行18分鐘攪拌。於該溶液中，將吡咯(1.4μL、0.020mmol)、膦酸(8.5mg、0.10mmol)在25℃下加入，進行44分鐘攪拌。加入二氯甲烷(0.20mL)，再進行1小時20分鐘攪拌。將吡啶(30μL)在25℃下加入後，將2,2-二甲基丁醯基氯化物(9.2μL、0.067mmol)分為3分並隔10分鐘加入，進行35分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(2g)，並將析出的固體經過濾，得到化合物53。
MS(ESI-)：[M-H]- 1742.1016。
實施例49(H-膦酸酯化)：化合物5b(三乙基胺鹽)之合成
在氮氣環境下，於亞磷酸(345mg、4.2mmol)的吡啶(10mL)溶液中，在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.33mL、2.4mmol)，進行35分鐘攪拌。於該反應混合物加入化合物4(497mg、0.40mmol)，在40℃進行1小時2分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(83μL、0.61mmol)後再進行1小時13分鐘攪拌。加入三乙基胺(2.8mL、20mmol)後，加入乙腈(211g)並析出固體，冰冷後經過濾，得到化合物5b(547mg)的白色固體。
實施例50(H-膦酸酯化)：化合物5c(N-甲基咪唑鹽)之合成
在氮氣環境下，於亞磷酸(241mg、2.9mmol)的吡啶(7mL)溶液，在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.23mL、1.7mmol)，進行30分鐘攪拌。於該反應混合物中加入化合物4(350mg、0.28mmol)，在40℃進行1小時49分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(39μL、 0.28mmol)，再進行2小時攪拌。將所得之溶液分為3分(化合物4：0.093mmol相當)，加入N-甲基咪唑(0.32mL、4.1mmol)後，加入乙腈(40g)並析出固體，冰冷後經過濾後得到化合物5c(103mg)之固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.26-1.83(m、96H)、1.92(s、3H)、2.32-2.36(m、2H)、2.67(s、4H)、3.89-3.98{m、6H+3H(N-甲基咪唑)}、4.18-4.21(m、3H)、5.02(s、2H)、5.41(t、1H)、6.38(t、1H)、6.53(s、2H)、6.93(d、1H)、7.04(s、1H、N-甲基咪唑)、7.31(s、1H、N-甲基咪唑)、7.73(d、1H)、8.84(s、1H、N-甲基咪唑)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ5.74。
實施例51(H-膦酸酯化)：化合物5d(N-甲基嗎啉鹽)之合成
對於在實施例50分為3分的溶液之1(化合物 4：0.093mmol相當)，加入N-甲基嗎啉(0.45mL、4.1mmol)後，加入乙腈(43g)，析出固體，冰冷後過濾，得到化合物5d(96mg)之固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.09-1.84(m、96H)、1.96(s、3H)、2.01(s、3H、N-甲基嗎啉)、2.31-2.36(m、2H)、2.68(s、4H)、2.76(s、4H、N-甲基嗎啉)、3.90-3.98{m、6H+4H(N-甲基嗎啉)}、4.10-4.17(m、3H)、5.02(s、2H)、5.41(t、1H)、6.38(t、1H)、6.53(s、2H)、6.89(d、1H)、7.71(d、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ5.88。
實施例52(2mer合成)：化合物54之合成
在氮氣環境下，於化合物42(99mg)與N6-苯甲醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧腺苷(東京化成工業公司製)(66mg、0.10mmol)的吡啶(2.0mL)溶液中，在25℃加入作為縮合劑之2,2-二甲基丁醯基氯化物(28μL、0.20mmol)，進行21分鐘攪拌。其後，加入作為 硫化劑之N-(苯基硫基)鄰苯二甲醯亞胺(27mg、0.11mmol)，進行43分鐘攪拌。加入水(3.6μL、0.20mmol)並進行1小時37分鐘攪拌，將反應混合物在減壓下濃縮。加入甲苯(4.0mL)在減壓下濃縮的操作重複3次後，加入二氯甲烷(2.0mL)，將吡咯(14μL、0.20mmol)、膦酸(8.7mg、0.11mmol)在室溫下加入，進行1小時28分鐘攪拌後，進行脫一時保護基反應。將吡啶(0.30mL)、膦酸(74mg、0.90mmol)在室溫中加入後，將2,2-二甲基丁醯基氯化物(92μL、0.67mmol)分為3分，並隔10分鐘加入進行59分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(31μL、0.22mmol)後再進行42分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(51g)中並過濾析出的固體，得到化合物54(100mg)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.13-1.80(m、96H)、2.17-2.85(m、15H)、3.03(s、3H)、3.68-4.33(m、16H)、5.20-5.35(m、2H)、6.07-6.17(m、2H)、6.43-6.53(m、2H)、6.56(s、2H)、7.24-8.78(m、14H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ6.10、25.20、25.30。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1965.1202。
實施例53(硫化劑檢討2mer合成)：化合物55之合成
在與實施例52之同様條件，將硫化劑變更為N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(依據Tetrahedron、1997年、53卷、14411-14416頁所記載的方法進行合成)(4.3mg)而實施反應，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到化合物55作為主生成物者。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2180.2862。
實施例54(硫化劑檢討2mer合成)：化合物56之合成
與實施例52同様條件下，將硫化劑變更為N-[(p-甲基苯基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(依據Nucleic Acid Research、1999年、27卷、963-971頁所記載的方法進行 合成)(27mg)並實施反應，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到化合物56作為主生成物者。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2217.2981。
實施例55(硫化劑檢討2mer合成)：化合物57之合成
與實施例52之同様條件下，將N6-苯甲醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧腺苷變更為5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷(東京化成工業公司製)(5.2mg)，將硫化劑變更為N-[(p-氯苯基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(依據Tetrahedron、1997年、53卷、14411-14416頁所記載的方法進行合成)(4.3mg)並實施，將脫一時保護基反應後之反應混合物在減壓下濃縮，得到化合物57作為主生成物者。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1788.1262。
實施例56(硫化劑檢討2mer合成)：化合物58之合成
與實施例52之同様條件下，將N6-苯甲醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧腺苷變更為N2-異丁醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧鳥嘌呤核苷(東京化成工業公司製)(7.0mg)，將硫化劑變更為N-(環己基硫基)鄰苯二甲醯亞胺(3.3mg)而實施反應，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到化合物58。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2191.3401。
實施例57(2mer合成)：化合物55之合成
與實施例53同様條件下，將縮合劑變更為碳酸雙五氟苯酯(9.1mg)並實施反應，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到化合物55作為主生成物者。
實施例58(硫化劑檢討2mer合成)：化合物59之合成
與實施例52同様條件下，將硫化劑變更為N-(甲基硫基)鄰苯二甲醯亞胺(依據Tetrahedron、1997年、53卷、14411-14416頁所記載的方法進行合成)(9.9mg)並實施反應，將脫一時保護基反應後之反應混合物在減壓下濃縮，得到化合物59作為主生成物者。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1839.1373。
參考合成例3(硫化劑合成)：N-(十二烷基硫)鄰苯二甲醯亞胺之合成
在氮氣環境下，於鄰苯二甲醯亞胺(4.0g、27mmol)的乙腈(15mL)與吡啶(12mL)的混合溶液中加入十二烷硫醇(6.8mL、29mmol)，在室溫將溴(1.7mL、 33mmol)的乙腈(20mL)溶液經40分鐘滴入，在室溫進行2小時43分鐘攪拌。加入甲醇(32g)、水(5g)，冷卻至0℃，將析出的固體經過濾後得到目的物(6.0g)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、3H)、1.08-1.64(m、20H)、2.88(t、2H)、7.75-7.80(m、2H)、7.89-7.95(m、2H)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 348.2003。
參考合成例4(硫化劑合成)：N-[(2-苯並[d]噻唑基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺之合成
在氮氣環境下，於鄰苯二甲醯亞胺(4.0g、27mmol)的乙腈(15mL)與吡啶(12mL)的混合溶液加入2-巰基苯並噻唑(4.8g、29mmol)，在室溫將溴(1.7mL、33mmol)的乙腈(20mL)溶液經38分鐘滴入，在室溫進行4小時30分鐘攪拌。加入甲醇(30g)、水(5g)，進行17分鐘攪拌，過濾析出之固體後得到目的物(6.8g)之淡粉紅色固 體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ7.27-7.38(m、1H)、7.40-7.48(m、1H)、7.69-7.77(m、1H)、7.82-7.94(m、3H)、7.99-8.62(m、2H)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 313.0090。
實施例59(硫化劑檢討2mer合成)：化合物60之合成
與實施例52同様條件下，將硫化劑變更為N-(十二烷基硫)鄰苯二甲醯亞胺(4.0mg)並實施反應，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到化合物60。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2295.4570。
實施例60(硫化劑檢討2mer合成)：化合物61之合成
與實施例52同様條件下，將硫化劑變更為N-[(2-苯並[d]噻唑基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(4.8mg)並實施反應，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到化合物61。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2277.2747。
實施例61(縮合劑檢討2mer合成)：化合物55之合成
與實施例53同様條件下，將縮合劑變更為乙酸五氟苯酯(7.1mg)並實施反應，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到化合物55作為主生成物者。
實施例62(縮合劑檢討2mer合成)：化合物55之合成
與實施例53同様條件下，將縮合劑變更為氯磷酸二苯基(4.2μL)實施反應，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，化合物55作為主生成物者。
實施例63(縮合劑檢討2mer合成)：化合物55之合成
與實施例52之同様條件下，將縮合劑變更為 氯磷酸雙(2-氯苯基)(4.6μL)並實施反應，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到化合物55作為主生成物者。
實施例64(縮合劑檢討2mer合成)：化合物55之合成
與實施例53同様條件下，將縮合劑變更為氯磷酸雙(2、4-二氯苯基)(10.7mg)並實施反應，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到化合物55作為主生成物者。
實施例65(縮合劑檢討2mer合成)：化合物55之合成
與實施例53同様條件下，將縮合劑變更為氯磷酸雙(2、6-二甲基苯基)(7.1mg)並實施反應，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮，得到化合物55作為主生成物者。
實施例66(在3’位TBDPS基之2mer合成)：化合物65之合成
步驟1 3’-O-(tert-丁基二苯基矽基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧胞苷之合成
在氮氣環境下，於N4-苯甲醯基-3’-O-(tert-丁基二苯基矽基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧胞苷(依據Biochemistry、2004年、43卷、6167-6181頁所記載的方法進行合成)(6.5g、6.8mmol)的甲醇(301g)溶液，在室溫加入40%甲基胺水溶液(5.8mL、69mmol)，進行23小時26分鐘攪拌。將反應混合物在減壓下濃縮後以矽膠層析法(氯仿-甲醇)進行純化後得到目的物(5.1g，產率98%)之泡狀固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ1.00(s、9H)、1.95-1.97(m、1H)、2.51-2.59(m、1H)、3.02-3.07(m、1H)、3.25-3.30(m、1H)、3.77(s、6H)、4.44-4.49(m、1H)、 5.22(d、1H)、6.35(t、1H)、6.71-6.75(m、4H)、7.08-7.41(m、16H)、7.53-7.59(m、4H)、7.77(d、1H)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 768.3391。
步驟2 化合物62之合成
在氮氣環境下，於3’-O-(tert-丁基二苯基矽基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧胞苷(2.5g、3.2mmol)與化合物31(2.2g、2.0mmol)的二氯甲烷(70mL)及吡啶(14mL)的混合溶液，在40℃加入HOBt(無水)(0.35g、2.6mmol)，繼續加入WSC．HCl(0.92g、4.8mmol)並進行2小時26分鐘攪拌。將反應混合物中之不溶物藉由過濾除去，在減壓下濃縮後加入甲醇(250g)並析出固體後過濾，得到化合物62(3.5g)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(s、9H)、1.01(s、9H)、1.26-1.81(m、96H)、1.91-1.99(m、1H)、2.68-2.71(m、5H)、3.04-3.08(m、4H)、3.25-3.29(m、1H)、3.77(brs、8H)、3.95(t、6H)、4.13-4.46(m、4H)、6.30(t、1H)、6.56(s、2H)、6.72-6.75(m、4H)、6.91(d、1H)、7.08-7.42(m、15H)、7.53-7.59(m、4H)、8.05(d、1H)、8.92(brs、1H)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1834.2754。
步驟3 化合物63之合成
在氮氣環境下，於化合物62(3.5g、1.9mmol)的二氯 甲烷(35g)溶液在室溫加入吡咯(0.39mL、5.7mmol)，在10℃加入二氯乙酸(1.6mL、19mmol)，進行1小時53分鐘攪拌。加入吡啶(0.77mL、9.5mmol)，將反應混合物加入於甲醇(351g)，並將析出的固體過濾後得到化合物63(2.8g)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(s、9H)、1.08(s、9H)、1.26-1.82(m、96H)、2.16-2.25(m、1H)、2.51-2.59(m、1H)、2.69-2.75(m、4H)、3.04(s、3H)、3.19-3.24(m、1H)、3.61-3.65(m、3H)、3.92-4.43(m、10H)、6.21(t、1H)、6.57(s、2H)、7.21(d、1H)、7.35-7.45(m、6H)、7.60-7.66(m、4H)、8.03(d、1H)、9.02(brs、1H)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1532.1383。
步驟4 化合物64之合成
在氮氣環境下，於亞磷酸(0.39g、4.7mmol)的吡啶(14mL)溶液中，在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.41mL、3.0mmol)，進行30分鐘攪拌。於該溶液中在30℃下加入化合物63(0.70g、0.46mmol)，並在30℃進行46分鐘攪拌。其後，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.38mL、2.7mmol)，進行58分鐘攪拌。將反應混合物加入於乙腈(200g)並將析出的固體過濾後得到化合物64(0.70g)的白色固體。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1596.1098。
步驟5 化合物65之合成
在氮氣環境下，於化合物64(0.70g)與5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷(0.37g、0.68mmol)的吡啶(20mL)溶液，在室溫加入碳酸雙五氟苯酯(0.57g、1.4mmol)，進行24分鐘攪拌。其後加入N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(0.17g、0.71mmol)，進行16小時54分鐘攪拌。將反應混合物加入於甲醇(200g)後過濾析出的固體，得到化合物65(0.88g)。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(s、9H)、1.07(s、9H)、1.25-2.01(m、97H)、2.33-2.93(m、10H)、3.04(s、3H)、3.32-4.34(m、24H)、5.08-5.18(m、1H)、6.25-6.36(m、2H)、6.58(s、2H)、6.82-6.85(m、4H)、7.22-7.65(m、21H)、7.79-7.85(m、1H)、8.96(brs、1H)、9.28(brs、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ27.08、27.20。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2207.3152。
實施例67(3’位TBDPS基的脫保護)：化合物66之合成
在氮氣環境下，於化合物65(10mg)的二氯甲烷(0.20mL)溶液，在室溫加入氟化氫-吡啶(1.3μL、0.045mmol)，進行3小時45分鐘攪拌。將反應混合物在減壓下濃縮後得到化合物66。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1969.2010。
實施例68(4mer合成)：化合物69之合成
步驟1 化合物67之合成
在氮氣環境下，於化合物42(1.5g)的吡啶(20mL)溶液中加入5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷(東京化成工業公司製)(0.34g、0.62mmol)、碳酸雙五氟苯酯(0.74g、1.9mmol)，進行22分鐘攪拌。其後加入N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(0.19g、0.81mmol)，進行15小時29分鐘攪拌，得到含有化合物82之反應溶液。其後，加入亞磷酸三乙酯(90μL、0.52mmol)、水(0.28mL、16mmol)並在25℃下攪拌1小時攪拌，將反應混合物在減壓下濃縮。加入甲苯(25g)在減壓下濃縮的操作重複3次後，加入二氯甲烷(20mL)，將吡咯(0.11mL、1.6mmol)、膦酸(1.0g、13mmol)在10℃下加入，進行1小時15分鐘攪拌。加入吡啶(3.0mL)後，在室溫下將2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.96mL、7.0mmol)分4分並隔10分鐘加入，進行33分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.48mL、3.5mmol)再進行35分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(200g)並將析出之固體經過濾後得到化合物67(1.9g)的白色固體。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1829.0819。
步驟2 化合物68之合成
與步驟1同様條件下，取代化合物42使用化合物67，取代5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷使用N4-苯甲 醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧胞苷(東京化成工業公司製)(0.60g)而實施反應後，得到化合物68(0.97g)的白色固體。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2291.1664。
步驟3 化合物69之合成
在氮氣環境下，於化合物68(0.96g)與N2-異丁醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧鳥嘌呤核苷(東京化成工業公司製)(0.51g、0.80mmol)的吡啶(20mL)溶液中，在25℃加入碳酸雙五氟苯酯(0.65g、1.7mmol)，進行10分鐘攪拌。將反應混合物減壓下濃縮後得到化合物69。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2912.4312。
實施例69(4mer合成)：化合物70之合成
與實施例68之步驟1同様條件下，取代化合 物42使用化合物68並實施反應後，得到化合物70。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2817.3753。
實施例70(4mer合成)：化合物71之合成
與實施例68之步驟1同様條件下，取代化合物42使用化合物68，取代5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷使用N4-苯甲醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧胞苷(東京化成工業公司製)(5.4mg)並實施反應後，得到化合物71。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2906.4242。
實施例71(4mer合成)：化合物72之合成
與實施例68之步驟1同様條件下，取代化合物42使用化合物68，取代5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-胸苷使用N6-苯甲醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧腺苷(東京化成工業公司製)(4.9mg)並實施反應後，得到化合物72。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2930.4184。
實施例72(5mer合成)：化合物74之合成
步驟1 化合物67之合成
在氮氣環境下，於化合物42(1.2g)的吡啶(20mL)溶液加入5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷(東京化成工業公司製)(0.44g、0.80mmol)、碳酸雙五氟苯酯(0.67g、1.7mmol)，進行23分鐘攪拌。其後N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(0.19g、0.83mmol)，進行1小時32分鐘攪拌。其後，加入亞磷酸三乙酯(90μL、0.52mmol)、水(0.28mL、16mmol)，在25℃進行50分鐘攪拌，將反應混合物在減壓下濃縮。加入甲苯(25g)並在減壓下濃縮的操作重複3次後，加入二氯甲烷(20mL)，將吡咯(0.11mL、 1.6mmol)、二氯乙酸(0.43mL、5.3mmol)在10℃下加入，進行2小時27分鐘攪拌。加入吡啶(3.0mL)後升溫至室溫，將反應混合物加入於乙腈(200g)，並將析出的固體過濾，得到化合物95(0.72g)之淡皮膚色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.25-1.89(m、99H)、2.20(s、3H)、2.21-2.89(m、13H)、3.06-3.20(m、5H)、3.21-3.98(m、11H)、4.19-4.4.44(m、6H)、5.32-5.34(m、2H)、6.10-6.23(m、2H)、6.58(s、2H)、7.41(t、1H)、7.51(d、1H)、7.95-8.08(m、1H)、8.70-9.60(m、2H)。31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ27.55、27.94。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1765.1162.在氮氣環境下，於所得之化合物95(0.72g)的二氯甲烷(15mL)與吡啶(2.3mL)的混合溶液中，在室溫加入膦酸(0.56g、6.8mmol)，將2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.56mL、4.1mmol)分為4分，並隔10分鐘加入進行31分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.42mL、3.1mmol)後在進行23分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(203g)並將析出的固體過濾後得到化合物67(0.72g)的白色固體。
步驟2 化合物68之合成
在氮氣環境下，於化合物67(0.72g)的吡啶(19mL)溶液加入N4-苯甲醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧胞苷(東京化成工業公司製)(0.49g、0.77mmol)、碳酸雙 五氟苯酯(0.60g、1.5mmol)，進行22分鐘攪拌。其後，作為硫化劑加入N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(0.18g、0.76mmol)，進行1小時10分鐘攪拌。其後，將反應混合物分為2分，一方在減壓下濃縮。加入甲苯(10g)後減壓下濃縮的操作重複3次後，加入二氯甲烷(10mL)，將吡咯(51μL、0.74mmol)、二氯乙酸(0.20mL、2.4mmol)在10℃下加入，進行2小時10分鐘攪拌。加入吡啶(1.2mL)後升溫至室溫，將反應混合物在分為2分，將一方加入於乙腈(50g)並將析出的固體進行析出過濾後得到化合物77(0.18g)之淡皮膚色固體。
在氮氣環境下，於所得之化合物77(0.18g)的二氯甲烷(3.0mL)與吡啶(0.50mL)的混合溶液中，在室溫下加入膦酸(0.12g、1.5mmol)，將2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.13mL、0.96mmol)分為4分，隔10分鐘加入，並進行57分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(33μL、0.24mmol)再進行40分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(51g)並將析出的固體過濾後得到化合物68(0.15g)的白色固體。
步驟3 化合物73之合成
與步驟2同様條件下，取代化合物67使用化合物68，取代N4-苯甲醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧胞苷使用N2-異丁醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧鳥嘌呤核苷(東京化成工業公司製)(86mg)，實 施反應後，得到化合物73(0.12g)的白色固體。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2759.2472。
步驟4 化合物74之合成
與步驟2同様條件下，取代化合物67使用化合物73，取代N4-苯甲醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧胞苷使用N6-苯甲醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧腺苷(東京化成工業公司製)(66mg)，並實施反應。將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮後得到化合物74作為主生成物者。
MS(ESI+)：[M+2H]2+ 1742.2655。
實施例73(3’位乙醯丙醯基的脫保護)：化合物75之合成
將在實施例72的步驟4所得之硫化後反應混合物的一半冷卻於0℃，加入肼1水合物(4.4μL、 0.091mmol)並進行3小時40分鐘攪拌。再加入肼1水合物(2.2μL、0.045mmol)並進行1小時7分鐘攪拌，加入乙醯丙酮(50μL)。其後，將反應混合物加入於乙腈(25g)並將析出的固體過濾後得到化合物75。
MS(ESI+)：[M+2H]2+ 1693.2314。
實施例74(3’位乙醯丙醯基的脫保護)：化合物76之合成
在實施例68的步驟1所得之含有化合物82之硫化後反應混合物的0.5重量%中，在室溫加入肼1水合物(1.3μL)並進行4小時攪拌。將反應混合物在減壓下濃縮後得到化合物76。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1969.2134。
實施例75(3’位乙醯丙醯基的脫保護)：化合物78之合成
在氮氣環境下，將化合物77(99mg、45μmol)的二氯甲烷(2.0mL)與乙酸(0.40mL)的混合溶液冷卻至0℃，加入肼1水合物(5.2μL、0.11mmol)並進行10小時28分鐘攪拌。將反應混合物在減壓下濃縮後，加入甲醇(30g)並將析出的固體經過濾後得到化合物78(70mg)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2129.1466。
實施例76(硫化劑檢討2mer合成)：化合物82之合成
與實施例68的步驟2同様條件下，將硫化劑變更為N-[(2-氰基乙基)硫代]琥珀酸醯亞胺(Journal of Chemistry Society Perkin Transaction 1、2002年、2619-2633頁所記載的方法進行合成)(13.7mg)並實施，將硫化後的反應混合物在減壓下濃縮後得到化合物82。
實施例77(對腺嘌呤之擬似固相保護基導入)：化合物79之合成
在氮氣環境下，於5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧腺苷(東京化成工業公司製)(41mg、0.075mmol)與化合物31(53mg、0.049mmol)的二氯甲烷(1.5mL)及吡啶(0.30mL)的混合溶液中，在40℃加入HOBt(無水)(7.0mg、0.052mmol)，繼續加入WSC．HCl(17.7mg、0.092mmol)並進行5小時攪拌。將反應混合物減壓下濃縮後得到化合物79。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1620.1583。
實施例78(對鳥嘌呤之擬似固相保護基導入)：化合物80之合成
在氮氣環境下，於5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧鳥嘌呤核苷(東京化成工業公司製)(43mg、0.075mmol)與化合物31(50mg、0.046mmol)的二氯甲烷(1.5mL)及吡啶(0.30mL)的混合溶液中，在40℃加入HOBt(無水)(7.2mg、0.053mmol)，繼續加入WSC．HCl(18.4mg、0.096mmol)，進行約1星期攪拌。將反應混合物減壓下濃縮後得到化合物80。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1636.1879。
參考合成例5(腺苷3’位乙醯丙醯基化)：5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-乙醯丙醯基-2’-脫氧腺苷之合成
在氮氣環境下，於5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧腺苷(Chem-Impex公司製)(2.6g、4.6mmol)、DMAP(58mg、0.48mmol)及乙醯丙酸(0.80g、6.9mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液，在室溫加入WSC．HCl(1.3g、6.8mmol)，進行3小時55分鐘攪拌。加入乙酸(0.45mL)及三乙基胺(0.78mL)的水(20g)溶液並進行5分 鐘攪拌並經分液。於所得之有機層中加入水(20g)並進行3分鐘攪拌，並經分液。將所得之有機層的溶劑在減壓下餾去後，以矽膠層析法(氯仿-甲醇)進行純化後得到5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-乙醯丙醯基-2’-脫氧腺苷(2.8g，產率93%)之淡黃色泡狀固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ2.21(s、3H)、2.58-2.66(m、3H)、2.76-2.81(m、2H)、2.90-3.00(m、1H)、3.42(d、2H)、3.78(s、6H)、4.29(s、1H)、5.51(d、1H)、5.96(s、2H)、6.43-6.48(m、1H)、6.80(d、4H)、7.18-7.44(m、9H)、7.97(s、1H)、8.28(s、1H)。MS(ESI+)：[M+H]+ 652.2741。
參考合成例6(鳥嘌呤核苷3’位乙醯丙醯基化)：5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-乙醯丙醯基-2’-脫氧鳥嘌呤核苷之合成
在氮氣環境下，於5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧腺苷(Chem-Impex公司製)(1.5g、 2.6mmol)、DMAP(39mg、0.32mmol)及乙醯丙酸(0.63g、5.4mmol)的二氯甲烷(60mL)溶液，在室溫加入WSC．HCl(1.0g、5.4mmol)，進行27小時44分鐘攪拌。加入乙酸(0.26mL)及三乙基胺(0.46mL)的水(20g)溶液並進行23分鐘攪拌並分液。於所得之有機層中加入水(21g)並進行8分鐘攪拌，經分液。將所得之有機層經溶劑減壓下餾去，得到5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-乙醯丙醯基-2’-脫氧鳥嘌呤核苷(1.8g)之淡黃色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ2.20(s、3H)、2.49-2.94(m、6H)、3.39(s、2H)、3.77(d、6H)、4.24(s、1H)、5.52(d、1H)、6.07(s、2H)、6.19-6.24(m、1H)、6.80(d、4H)、7.19-7.40(m、9H)、7.63(s、1H)、11.97(brs、1H)。MS(ESI+)：[M+H]+ 668.2715。
實施例79(對鳥嘌呤之擬似固相保護基導入)：化合物81之合成
在氮氣環境下，於化合物31(8.9mg、8.2μmol)的二氯甲烷(1.0mL)溶液，在室溫加入氯甲酸乙酯(1.3μL、0.014mmol)，繼續加入三乙基胺(1.9μL、0.014mmol)並進行1小時57分鐘攪拌。進一步加入氯甲酸乙酯(1.3μL、0.014mmol)、三乙基胺(1.9μL、0.014mmol)後進行36分鐘攪拌。其後，將5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-乙醯丙醯基-2’-脫氧鳥嘌呤核苷(10.5mg、0.016mmol)在室溫下加入並進行59分鐘攪拌後，將三乙基胺(0.10mL、0.72mmol)在室溫下加入，升溫至40℃後進行3小時3分鐘攪拌。將反應混合物減壓下濃縮後得到化合物81。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1734.1983。
實施例80(對鳥嘌呤之擬似固相保護基導入)：化合物81之合成
在氮氣環境下，於5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-乙醯丙醯基-2’-脫氧鳥嘌呤核苷(0.94g、 1.4mmol)與化合物31(1.0g、0.93mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中，在40℃以二異丙基乙基胺(0.78mL、4.6mmol)、DMAP(0.57g、4.7mmol)、WSC．HCl(0.89g、4.6mmol)的順序加入，進行3小時21分鐘攪拌。將反應混合物在減壓下濃縮，加入甲醇(100g)後將析出的固體過濾，得到化合物81之粗物(1.5g)。將粗物以矽膠層析法(氯仿-甲醇)進行純化後得到化合物81(47mg)。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.26-1.81(m、96H)、2.19(s、3H)、2.20-2.60(m、7H)、2.75-2.80(m、2H)、2.94-3.06(m、4H)、3.37(d、2H)、3.38-3.79(m、8H)、3.95(t、6H)、3.90-4.50(m、3H)、5.50(d、1H)、6.12-6.20(m、1H)、6.57(s、2H)、6.76-6.80(m、4H)、7.19-7.43(m、9H)、7.79(s、1H)、9.34(brs、1H)、11.89(brs、1H)。MS(ESI+)：[M+H]+ 1734.1951。
參考合成例7：5’-O-(tert-丁基二甲基矽基)-3’-O-乙醯丙醯基胸苷之合成
在氮氣環境下，於化合物1(5.3g、15mmol)、DMAP(0.17g、1.4mmol)及乙醯丙酸(2.8g、24mmol)的THF(38g)溶液，在室溫加入WSC．HCl(4.6g、24mmol)，進行15小時13分鐘攪拌。加入乙酸(1.5g、26mmol)及三乙基胺(2.6g、19mmol)的水(38g)溶液，進行5分鐘攪拌，加入乙酸乙酯(37g)後進行14分鐘攪拌並分液。將所得之有機層的溶劑經減壓下餾去後得到5’-O-(tert-丁基二甲基矽基)-3’-O-乙醯丙醯基胸苷(6.9g)的淡橘色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.13(s、6H)、0.93(s、9H)、1.92(d、3H)、2.05-2.15(m、1H)、2.21(s、3H)、2.39-2.45(m、1H)、2.58-2.62(m、2H)、2.76-2.81(m、2H)、3.90-3.91(m、2H)、4.099-4.103(m、1H)、5.26(d、1H)、6.37(q、1H)、7.55(d、1H)、9.34(brs、1H)。
實施例81(於胸腺嘧啶3位鍵結擬似固相保護基之核苷酸的合成)：化合物85之合成
步驟1 化合物83之合成
在氮氣環境下，於3,4,5-參(十八烷氧基)安息香酸(依據國際公開第2014-077292號所記載的方法進行合成)(3.0g、3.2mmol)、於碳酸鈉(1.1g、10mmol)、硫酸氫四-n-丁基銨(0.13g、0.38mmol)的二氯甲烷(71g)與水(30g)的混合溶液中，在室溫下加入氯甲磺酸氯化物(0.39mL、3.9mmol)，進行2小時42分鐘攪拌。再加入氯甲磺酸氯化物(60μL、0.60mmol)並進行18分鐘攪拌後，升溫至40℃後進行10分鐘攪拌。停止攪拌後分液，於所得之水層中加入二氯甲烷並萃取。合併所得之有機層，將溶劑減壓下餾去，加入乙腈(70g)並將析出的固體經過濾後得到化合物83之白色固體(3.16g)。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.86-0.90(m、9H)、1.26-1.84(m、96H)、3.99-4.05(m、6H)、5.93-6.01(m、 2H)、7.27-7.36(m、2H)。
步驟2 化合物84之合成
在氮氣環境下，於化合物83(1.0g、1.1mmol)、5’-O-(tert-丁基二甲基矽基)-3’-O-乙醯丙醯基胸苷(0.71g、1.6mmol)的DMF(50mL)溶液中，在70℃加入碳酸鉀(0.21g、1.5mmol)，並進行2小時5分鐘攪拌，再加入碳酸鉀(0.91g、6.mmol)並進行2小時44分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(201g)中，並將析出的固體經過濾後得到化合物84(1.01g)之黃色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.14(s、6H)、0.86-0.93(m、18H)、1.26-1.81(m、96H)、2.13-2.43(m、5H)、2.56-2.60(m、2H)、2.74-2.79(m、2H)、3.92-4.12(m、9H)、5.26(d、1H)、6.22(q、2H)、6.42(q、1H)、7.22(s、2H)、7.59(s、1H)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1394.0827。
步驟3 化合物85之合成
在氮氣環境下，於化合物84(0.94g、0.67mmol)、乙酸(0.41mL、7.2mmol)的THF(10mL)溶液中，在30℃加入1.0M TBAF/THF溶液(3.5mL、3.5mmol)，進行4小時2分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於甲醇(100g)並將析出的固體經過濾後，得到化合物85(0.85g，產率99%(步驟3))之黃色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.26-1.81(m、96H)、2.20(s、3H)、2.39-2.44(m、2H)、2.58-2.60(m、2H)、2.76-2.78(m、2H)、3.93(t、3H)、3.96-4.01(m、6H)、4.11(d、1H)、5.34-5.38(m、1H)、6.21(q、2H)、6.32(t、1H)、7.21(s、2H)、7.61(d、1H)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1279.9950。
實施例82(H-膦酸酯化)：化合物86之合成
在氮氣環境下，於亞磷酸(0.40g、4.9mmol)的吡啶(15mL)溶液在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.45mL、3.3mmol)，進行39分鐘攪拌。於該溶液加入化合物85(0.65g、0.51mmol)，在40℃進行1小時27分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(151g)，並將析出的固體經過濾後得到化合物86(0.66g)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.26-1.81(m、96H)、1.97(d、3H)、2.19(s、3H)、2.34- 2.41(m、2H)、2.55-2.59(m、2H)、2.74-2.78(m、2H)、3.96-4.01(m、6H)、4.20-4.29(m、3H)、5.39(d、1H)、6.20(q、2H)、6.45-6.50(m、1H)、6.96(d、1H)、7.21(s、2H)、7.76-7.81(m、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ6.28。
MS(ESI-)：[M-H]- 1341.9722。
實施例83(2mer合成)：化合物87之合成
在氮氣環境下，於化合物86(51mg)與化合物1(19mg、0.053mmol)的吡啶(1.0mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(24μL、0.18mmol)，進行19分鐘攪拌。其後加入含有0.05M之碘的吡啶與水的溶液(1.1mL、0.055mmol)，進行36分鐘攪拌。其後，加入水(0.14mL)並升溫至70℃，進行15小時43分鐘攪拌。其後，將反應混合物在減壓下濃縮，加入吡啶並在減壓下濃縮的操作重複2次實施，得到含有TBS基經脫保護體的化合物之反應混合物。
在氮氣環境下，於亞磷酸(43mg、0.52mmol)的吡啶(1.5mL)溶液中，在40℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(49μL、0.36mmol)，進行38分鐘攪拌。於該溶液中加入含有上述經脫保護的化合物之反應混合物，在40℃進行2小時14分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(26g)並過濾析出的固體，得到化合物87(52mg)之褐色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.08-1.83(m、96H)、1.89(s、3H)、1.94(s、3H)、2.19(s、3H)、2.23-2.79(m、8H)、3.96-4.00(m、6H)、4.18-4.41(m、6H)、5.18(brs、1H)、5.38(d、1H)、6.14-6.25(m、3H)、6.43-6.48(m、1H)、6.86(d、1H)、7.21(s、2H)、7.46(s、1H)、7.65(s、1H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ-1.10、6.08。
MS(ESI-)：[M-H]- 1646.0226。
實施例84(2mer合成)：化合物88之合成
在氮氣環境下，於化合物86(52mg)與N4-苯 甲醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧胞苷(東京化成工業公司製)(36mg、0.057mmol)的吡啶(1.0mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(15μL、0.11mmol)，進行53分鐘攪拌。其後加入單體硫(13mg、0.41mmol)，進行2小時10分鐘攪拌。其後，將反應混合物在減壓下濃縮。加入甲苯(2mL)，在減壓下並濃縮的操作重複3次後，加入二氯甲烷(0.50mL)，將不溶物以吸引過濾除去，以二氯甲烷(0.25mL×2次)洗淨。於該溶液中將吡咯(7.4μL、0.11mmol)及膦酸(46mg、0.56mmol)在室溫下加入，進行51分鐘攪拌。將吡啶(0.15mL)在室溫下加入後，將2,2-二甲基丁醯基氯化物(49μL、0.36mmol)分為3分，並隔10分鐘加入進行35分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(16μL、0.12mmol)再進行45分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(26g)，並將析出的固體經過濾後得到化合物88(47mg)之淡黃色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、0.98-1.99(m、99H)、2.13-2.34(m、7H)、2.56(brs、2H)、2.75(brs、2H)、3.97-4.21(m、12H)、5.17-5.35(m、2H)、6.14-6.21(m、3H)、6.44(t、1H)、6.93(d、1H)、7.20(s、2H)、7.54-8.34(m、8H)。
31P-NMR：(300MHz；CDCl3)δ5.11、59.77、61.38。
MS(ESI-)：[M-H]- 1751.0079。
實施例85(於胸腺嘧啶3位鍵結擬似固相保護基之核苷酸 之合成)：化合物90之合成
步驟1 化合物89之合成
在氮氣環境下，於化合物31(1.0g、0.92mmol)、碳酸鈉(0.36g、3.4mmol)、硫酸氫四-n-丁基銨(34mg、0.11mmol)的二氯甲烷(30g)與水(10g)的混合溶液中，在室溫下加入氯甲磺酸氯化物(0.20mL、2.0mmol)並進行41分鐘攪拌。其後，升溫至40℃，進行2小時19分鐘攪拌。停止攪拌後分液，於所得之水層中加入二氯甲烷，並進行萃取。合併所得之有機層，將溶劑減壓下餾去，加入乙腈(50g)並將析出的固體經過濾後得到化合物89之淡黃色固體(0.96g)。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.26-1.84(m、96H)、2.70-2.73(m、4H)、3.05(s、3H)、 3.74(brs、2H)、3.93-3.98(m、6H)、4.36(brs、2H)、5.69(s、2H)、6.58(s、2H)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1132.9248。
步驟2 化合物90之合成
在氮氣環境下，於化合物89(11mg、9.7μmol)、5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-乙醯丙醯基胸苷(依據國際公開第2014-077292號所記載的方法進行合成)(10mg、0.016mmol)的DMF(0.20mL)溶液中，在60℃加入碳酸鉀(20mg、0.15mmol)，並進行19小時30分鐘攪拌。將反應混合物減壓下濃縮後得到化合物90。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1739.1983。
實施例86(於胸腺嘧啶3位鍵結擬似固相保護基之核苷酸的合成)：化合物91之合成
與實施例85之步驟2同様條件下，將5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-乙醯丙醯基胸苷變更為5’- O-(tert-丁基二甲基矽基)-3’-O-乙醯丙醯基胸苷(11mg)並實施反應。將反應混合物減壓下濃縮，得到化合物91。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1551.1540。
實施例87(在二氯甲烷溶劑進行2mer合成)：化合物43之合成
在氮氣環境下，於化合物42(98mg)、化合物1(36mg、0.10mmol)與吡啶(53μL、0.66mmol)的二氯甲烷(2.0mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(45μL、0.33mmol)，進行50分鐘攪拌。其後加入含有0.1M之碘的吡啶、THF及水的溶液(0.98mL、0.098mmol)，進行38分鐘攪拌。其後，加入亞磷酸二甲基(3.0μL、0.033mmol)，加入二氯甲烷(1.0mL)，減壓下濃縮。加入二氯甲烷(5.0mL)，再度減壓下濃縮。將不溶物以吸引過濾除去，以二氯甲烷(1.0mL×2次)洗淨。於該溶液將氟化氫-吡啶(84.5μL、3.3mmol)在40℃下加入，進行5小時33分鐘攪拌。加入TMSCl(0.41mL、3.3mmol)，將反應混合物在減壓下濃縮後得到化合物43。
實施例88(在THF溶劑進行2mer合成)：化合物43之合成
在氮氣環境下，於化合物42(85mg)、化合物1(30mg、0.084mmol)與吡啶(45μL、0.55mmol)的THF(1.5mL)溶液中，在25℃加入2,2-二甲基丁醯基氯化 物(38μL、0.28mmol)，進行14分鐘攪拌。其後加入含有0.1M之碘的吡啶、THF及水的溶液(1.2mL、0.12mmol)，進行3小時49分鐘攪拌。其後，加入亞磷酸二甲基(3.0μL、0.033mmol)，將反應混合物在減壓下濃縮。加入甲苯(3.0mL)，在減壓下濃縮重複3次後，加入二氯甲烷(1.0mL)，將不溶物以吸引過濾除去，以二氯甲烷(1.0mL×2次)洗淨。於該溶液將氟化氫-吡啶(6.5μL、0.25mmol)在25℃下加入，在40℃進行一整夜攪拌。其後，將反應混合物在減壓下濃縮後得到化合物43。
實施例89(縮合劑檢討)：化合物92之合成
與實施例35之步驟2同様條件下，將縮合劑變更為2、4、6-三異丙基苯磺酸氯化物(8.4mg)並實施反應，將偶合反應後之反應混合物在減壓下濃縮後得到化合物92作為主生成物者。
MS(ESI-)：[M-H]- 2284.3243。
實施例90(縮合劑檢討)：化合物92之合成
與實施例35之步驟2同様條件下，將縮合劑變更為2、4-三甲苯二磺酸二氯化物(8.8mg)並實施反應，將偶合後反應的反應混合物經減壓下濃縮後得到化合物92作為主生成物者。
實施例91(縮合劑檢討)：化合物92之合成
與實施例35之步驟2同様條件下，將縮合劑變更為1-金剛烷羰基氯化物(5.5mg)並實施反應，將偶合反應後的反應混合物在減壓下濃縮後得到化合物92作為主生成物者。
實施例92(於核酸鹼導入擬似固相保護基之單體及2mer合成)：化合物41之合成
步驟1 化合物93之合成
與實施例66之步驟2同様條件下，取代3’-O-(tert-丁基二苯基矽基)-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧胞苷使用5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧胞苷(Chem-Impex公司製)(4.0g)並實施反應後，得到化合物93(7.4g)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.19-1.80(m、96H)、2.17-2.28(m、1H)、2.69-2.80(m、5H)、3.05(s、3H)、3.41-3.79(m、10H)、3.92-3.97(m、6H)、4.09-4.46(m、4H)、6.24(t、1H)、6.57(s、2H)、6.84(d、4H)、7.15-7.40(m、10H)、8.20(d、1H)、9.27(brs、1H)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1596.1595。
步驟2 化合物94之合成
在氮氣環境下，於化合物93(7.4g、4.7mmol)、DMAP(0.065g、0.53mmol)、乙醯丙酸(0.87g、7.5mmol)的二氯甲烷(70mL)溶液，在室溫加入WSC．HCl(1.4g、7.5mmol)，進行5小時4分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(504g)，並將析出的固體經過濾後得到化合物94(7.9g)之淡黃色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.20-1.81(m、96H)、2.19(s、3H)、2.23-2.33(m、1H)、2.51-2.60(m、2H)、2.70-2.80(m、7H)、3.06(s、3H)、3.44(d、 2H)、3.79(brs、8H)、3.93-3.98(m、6H)、4.03-4.36(m、3H)、5.39(d、2H)、6.27(t、1H)、6.57(s、2H)、6.81-6.85(m、4H)、7.11(d、1H)、7.21-7.36(m、9H)、8.07(d、1H)、9.32(brs、1H)。
步驟3 化合物41之合成
在氮氣環境下，於化合物94(5.8g、3.4mmol)的二氯甲烷(50g)溶液，在室溫加入吡咯(0.71mL、10mmol)、二氯乙酸(1.4mL、17mmol)，進行23分鐘攪拌。加入吡啶(1.4mL、17mmol)，將反應混合物加入於甲醇(502g)並將析出的固體經過濾後得到化合物41(4.6g)的白色固體。
實施例93(3’位乙醯丙醯基的脫保護)：化合物78之合成
與實施例75之同様條件下，取代肼1水合物使用乙醯醯肼(7.6mg)，在室溫下實施反應，將反應混合物減壓下濃縮後得到化合物78。
實施例94(3’位乙醯丙醯基的脫保護)：化合物78之合成
在氮氣環境下，將化合物77(10mg、4.5μmol)的二氯甲烷(0.20mL)與吡啶(0.20mL)的混合溶液冷卻至0℃，加入硫酸肼鎓(10.7mg、0.082mmol)，在40℃進行一整夜攪拌。將反應混合物在減壓下濃縮後得到化合物78。
實施例95(3’位乙醯丙醯基的脫保護)：化合物78之合成
與實施例75之同様條件下，取代肼1水合物使用乙二胺(1.5μL)，在40℃下實施反應，將反應混合物減壓下濃縮後得到化合物78。
實施例96(3’位乙醯丙醯基的脫保護)：化合物78之合成
與實施例75之同様條件下，取代肼1水合物使用肼乙酸鹽(0.7mg)並實施反應，將反應混合物減壓下濃縮後得到化合物78作為主生成物者。
實施例97(3’位乙醯丙醯基的脫保護)：化合物78之合成
與實施例75之同様條件下，取代肼1水合物使用苯基肼(2.5mg)並實施反應，將反應混合物在減壓下濃縮後得到化合物78。
實施例98(3’位乙醯丙醯基的脫保護)：化合物78之合成
與實施例75之同様條件下，取代肼1水合物使用p-甲苯磺醯基肼(2.0mg)並實施反應，將反應混合物減壓下濃縮後得到化合物78。
實施例99(3’位乙醯丙醯基的脫保護)：化合物78之合成
與實施例75之同様條件下，取代肼1水合物使用甲基肼(3.1mg)並實施反應，將反應混合物減壓下濃縮後得到化合物78。
實施例100(3’位乙醯丙醯基的脫保護)：化合物96之合成
在氮氣環境下，將肼1水合物(0.50mg、10.3mmol)的二氯甲烷(0.20mL)與乙酸(40μL)的混合溶液冷卻至0℃，加入化合物41(10mg、7.3μL)的二氯甲烷(0.10mL)溶液並進行5小時攪拌。將反應混合物藉由LC-MS進行分析，確認化合物96之生成。
實施例101(3’位乙醯丙醯基的脫保護)：化合物96之合成
在氮氣環境下，將固定化脂肪酶L-2(3.7mg)加入於0.15M磷酸緩衝液(pH6.8)(0.23g)。其後，加入化合物41(9.0mg、6.5μmol)的1,4-二噁烷(1.0g)溶液，升溫至40℃，進行13小時20分鐘攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物96的生成。
實施例102(3’位乙醯丙醯基的脫保護)：化合物96之合成
在氮氣環境下，將固定化脂肪酶L-5(10mg)加入於0.15M磷酸緩衝液(pH6.8)(0.21g)。其後，加入化合物41(10mg、7.2μmol)的1,4-二噁烷(1.0g)溶液並升溫至40℃，進行13小時20分鐘攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物96的生成。
實施例103(於3’末端具有羥基之5mer合成)：化合物97之合成
步驟1 化合物74之合成
與實施例72的步驟4之同様條件下實施反應，將硫化後的反應混合物加入於甲醇中並過濾析出的固體，得到化合物74(2.3g、90%)之淡皮膚色固體。
步驟2 化合物97之合成
在氮氣環境下，將化合物74(0.50g、0.14mmol)的THF(20mL)溶液冷卻至0℃，加入乙酸(3.0mL)後，加入肼1水合物(14μL、0.29mmol)，進行6小時攪拌。於反應混合物加入乙醯丙酮(100μL)，升溫至室溫，減壓下濃縮後，加入於甲醇(102g)並將析出之固體過濾後得到化合物97(0.45g)。
MS(ESI+)：[M+2H]2+ 1693.2456。
實施例104(於5’末端具有H-膦酸酯基之5mer合成)：化合物99之合成
步驟1 化合物98之合成
在氮氣環境下，將化合物74(0.51g、0.15mmol)的二氯甲烷溶液(10mL)冷卻至10℃，加入吡咯(30μL、0.43mmol)並進行14分鐘攪拌。其後，加入二氯乙酸(82μL、1.0mmol)，進行4小時3分鐘攪拌。加入吡啶(1.5mL)後升溫至室溫，將反應混合物加入於乙腈(86g)後將析出的固體經過濾後得到化合物98(0.46g)。
MS(ESI+)：[M+2H]2+ 1591.1922。
步驟2 化合物99之合成
在氮氣環境下，於化合物98(0.45g、0.14mmol)的二氯甲烷(5.0mL)與吡啶(1.0mL)的混合溶液中，在40℃加入膦酸(0.20g、2.4mmol)，將2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.19mL、1.4mmol)分為4分，隔10分鐘加入，並進行1小時53分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(0.42mL、0.71mmol)再進行1小時8分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(84g)並將析出的固體經過濾後，得到化合物99(0.42g)的白色固體。
MS(ESI+)：[M+2H]2+ 1623.1824。
實施例105(5mer合成)：化合物99之合成
在氮氣環境下，將化合物74(10mg、2.9μmol)、吡咯(60μL、8.6μmmol)的二氯甲烷溶液(0.20mL)冷卻至10℃，加入膦酸(0.71mg、8.6μmol)，進行1小時35分鐘攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物98為主生成物。其後，加入吡啶(30μL)並升溫至室溫，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(8.0μL、58μmmol)，進行30分鐘攪拌。經反應混合物藉由LC-MS分析，確認化合物99為主生成物。
實施例106(10mer合成)：化合物100之合成
在氮氣環境下，於化合物97(0.44g、0.13mmol)與化合物99(0.41g)的吡啶(10mL)溶液，在室溫加入碳酸雙五氟苯酯(0.80g、2.0mmol)，進行11分鐘攪拌。其後，作為硫化劑加入N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(62mg、0.27mmol)，進行1小時52分鐘攪拌。將反應混合物加入於甲醇(102g)，並將析出的固體經過濾後得到化合物100(0.81g)。
MS(ESI+)：[M+3H]3+ 2232.9346。
實施例107(於3’末端具有羥基之10mer合成)：化合物101之合成
在氮氣環境下，將化合物100(0.39g、58μmol)的THF(15mL)溶液冷卻至0℃，加入乙酸(2.3mL)後，加入肼1水合物(5.5μL、0.11mmol)，進行7小時攪拌。再加入肼1水合物(5.5μL、0.11mmol)，進行1小時12分鐘攪拌。於反應混合物加入乙醯丙酮(0.50mL)，升溫至室溫，減壓下濃縮後，將該濃縮物加入於甲醇(100g)，並將析出的固體經過濾後得到化合物101(0.35g)。
在氮氣環境下，將化合物101(0.15g、23μmol)的THF(3.0mL)溶液冷卻至10℃，加入乙酸(0.90mL)後，加入肼1水合物(7.5μL、0.15mmol)，進行30分鐘攪拌。將反應混合物加入於甲醇(57g)，並將析出的固體經過濾後得到化合物101(0.14g)。
MS(ESI+)：[M+3H]3+ 2200.2656。
實施例108(於5’末端具有H-膦酸酯基之10mer合成)：化合物103之合成
步驟1 化合物102之合成
在氮氣環境下，將化合物100(0.39g、58μmol)、吲哚(21mg、0.18mmol)的二氯甲烷溶液(8.0mL)冷卻至10℃，加入二氯乙酸(33μL、0.40mmol)，進行2小時攪拌。再加入二氯乙酸(14μL、0.17mmol)，進行2小時32分鐘攪拌。加入吡啶(0.60mL)升溫至室溫，將反應混合物加入於甲醇(100g)，將析出的固體經過濾後得到化合物101(0.35g)。
MS(ESI+)：[M+3H]3+ 2132.2235。
步驟2 化合物103之合成
在氮氣環境下，於化合物101(0.17g、27μmol)的二氯甲烷(1.0mL)與吡啶(0.20mL)的混合溶液在40℃加入膦酸(38mg、0.46mmol)，將2,2-二甲基丁醯基氯化物(36μL、0.27mmol)分為4分，並隔10分鐘加入，進行1小時5分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(73μL、0.53mmol)再進行49分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(51g)，將析出的固體經過濾後得到化合物102(0.17g)的白色固體。
MS(ESI+)：[M+3H]3+ 2153.5570。
實施例109(11mer合成)：化合物104之合成
在氮氣環境下，於化合物101(5.5mg、0.83μmol)與化合物42(2.7mg)的吡啶(0.20mL)溶液，在室溫加入碳酸雙五氟苯酯(50mg、0.13mmol)，進行3小時8分鐘攪拌。其後，作為硫化劑加入N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(3.4mg、15μmol)，進行1小時攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物104的生成。
MS(ESI+)：[M+3H]3+ 2707.5985。
實施例110(11mer合成)：化合物105之合成
在氮氣環境下，於化合物102(5.8mg、0.91μmol)與5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-羥基膦-2’-脫氧胞苷三乙基胺鹽(Chem jeans公司製)(2.3mg、2.9μmmol)的吡啶(0.20mL)溶液，在室溫加入碳酸雙五氟苯酯(28mg、72μmol)，進行1小時40分鐘攪拌。其後，作為硫化劑使用N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(3.6mg、16μmol)，進行1小時攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物105為主生成物。
MS(ESI+)：[M+3H]3+ 2386.9640。
實施例111(11mer合成)：化合物105之合成
在氮氣環境下，於化合物103(4.5mg、0.70μmol)與N4-苯甲醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧胞苷(東京化成工業公司製)(2.9mg、4.6μmmol)的吡啶(0.20mL)溶液，在室溫加入碳酸雙五氟苯酯(23mg、57μmol)，進行28分鐘攪拌。其後，作為硫化劑使用N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(2.8mg、12μmol)，進行1小時攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物105的生成。
實施例112(於3’末端具有H-膦酸酯基之10mer合成)：化合物106之合成
在氮氣環境下，於亞磷酸二苯基(2.0μL、10μmol)的吡啶(0.20mL)溶液，在室溫加入化合物101(9.3mg、1.4μmol)，在室溫進行3小時7分鐘攪拌。其後，追加亞磷酸二苯基(2.0μL、10μmol)，在室溫進行11小時50分鐘攪拌。以水、三乙基胺的順序加入，將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物106的生成。
MS(ESI+)：[M+3H]3+ 2221.5833。
實施例113(10mer的脫保護)：化合物107之合成
在氮氣環境下，將化合物101(8.7mg、1.3μmol)的乙醇(0.15g)懸浮液升溫至45℃，加入40%甲基胺水溶液(0.50mL)，進行20分鐘攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物107的生成。
MS(ESI+)：[M+2H]2+ 1566.1633
實施例114(於3’末端具有H-膦酸酯基之5mer合成)：化合物108之合成
在氮氣環境下，於亞磷酸二苯基(3.9μL、20μmol)的吡啶(0.20mL)溶液，在室溫加入化合物97(9.0mg、2.7μmol)，在室溫進行1小時攪拌。其後，加入水(50μL)，將反應混合物加入於乙腈，將析出的固體經過濾後得到化合物108(0.80mg)的白色固體。
MS(ESI+)：[M+2H]2+ 1725.2231。
實施例115(15mer合成)：化合物109之合成
在氮氣環境下，於化合物102(1.7mg、0.27μmol)與化合物108(0.80mg)的吡啶(0.20mL)溶液，在室溫加入碳酸雙五氟苯酯(29mg、73μmol)，進行30分鐘攪拌。將反應混合物經LC-MS分析後，確認化合物109的生成。
MS(ESI+)：[M+4H]4+ 2457.0209。
實施例116(15mer合成)：化合物107之合成
在氮氣環境下，於化合物101(11mg、1.7μmol)與化合物99(4.8mg)的吡啶(0.20mL)溶液，在室溫加入碳酸雙五氟苯酯(64mg、0.16mmol)，進行1小時5分鐘攪拌。其後，作為硫化劑使用N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(5.0mg、22μmol)，進行1小時攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物110的生成。
MS(ESI+)：[M+4H]4+ 2478.2707。
實施例117(對腺嘌呤之擬似固相保護基導入)：化合物111之合成
在氮氣環境下，將化合物31(11mg、10μmol)的二氯甲烷(0.20mL)與DMF(5.0μL)的混合溶液冷卻至10℃，加入亞硫醯氯(4.0μL、55μL)後升溫至室溫，進行58分鐘攪拌。將該反應混合物10℃下加入於5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-乙醯丙醯基-2’-脫氧腺苷(12mg、18μmol)與二異丙基乙基胺(14μL、83μmol)的二氯甲烷(0.20mL)溶液中，進行1小時20分鐘攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物111的生成。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1718.2007。
實施例118(對鳥嘌呤之擬似固相保護基導入)：化合物81之合成
在氮氣環境下，於化合物31(12mg、11μmol)的二氯甲烷(0.30mL)與DMF(5.0μL)的混合溶液中，在室溫加入亞硫醯氯(4.0μL、55μL)，進行20分鐘攪拌。將該反應混合物在室溫下加入於5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-乙醯丙醯基-2’-脫氧鳥嘌呤核苷(10mg、15μmol)與二異丙基乙基胺(28μL、0.17mmol)的二氯甲烷(0.20mL)溶液，進行30分鐘攪拌。將反應混合物經LC-MS分析後，確認化合物81的生成。
實施例119(對腺嘌呤之擬似固相保護基導入)：化合物112之合成
在氮氣環境下，於5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-乙醯丙醯基-2’-脫氧腺苷(0.93g、1.4mmol)與化合物31(1.1g、0.97mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中，在40℃以DMAP(0.56g、4.6mmol)、WSC．HCl(0.90g、4.7mmol)的順序加入，進行16小時35分鐘攪拌。將反應混合物減壓下濃縮，加入甲醇(102g)，將析出的固體經過濾後得到化合物112的粗物(1.3g)。將粗物以矽膠層析法(氯仿-甲醇)純化後得到化合物112(0.68g)。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.85(t、9H)、1.25-1.81(m、96H)、2.21(s、3H)、2.59-3.07(m、11H)、3.26-3.78(m、12H)、3.93-4.31(m、9H)、5.53(d、1H)、6.48-6.49(m、1H)、6.59(s、2H)、6.77-6.80(m、4H)、7.20-7.38(m、9H)、8.10(s、1H)、8.61(s、1H)、8.83(brs、1H)。MS(ESI+)：[M+H]+ 1718.2015。
實施例120(導入擬似固相保護基之腺苷的5’位官能基變換)：化合物114之合成
步驟1 化合物113之合成
在氮氣環境下，將化合物112(0.29g、0.17mmol)的二氯甲烷(1.0mL)溶液冷卻至10℃，加入吡咯(35μL、0.51mmol)並進行5分鐘攪拌。其後，加入二氯乙酸(42μL、0.51mmol)，進行1小時13分鐘攪拌。加入吡啶(0.14mL)後升溫至室溫，將反應混合物加入於乙腈(50g)，將析出的固體經過濾後得到化合物113(0.20g)。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.16-1.83(m、96H)、2.22(s、3H)、2.45-2.51(m、1H)、2.59-2.63(m、2H)、2.79-2.83(m、4H)、3.07-3.20(m、4H)、3.27-4.29(m、15H)、5.56(d、1H)、6.31-6.36(m、1H)、6.58(s、2H)、8.06(d、1H)、8.64(s、1H)、8.93(brs、1H)。MS(ESI+)：[M+H]+ 1416.0785。
步驟2 化合物114之合成
在氮氣環境下，將膦酸(17mg、0.21mmol)的吡啶(0.30mL)溶液升溫至40℃，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(6.3μL、46μmol)並進行30分鐘攪拌。其後，加入化合物113(11mg、7.8μmol)並進行2小時15分鐘攪拌，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(21μL、0.15mmol)，再進行1小時10分鐘攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物114為主生成物。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1480.0474。
實施例121(導入擬似固相保護基之腺苷的3’位脫保護)：化合物115之合成
在氮氣環境下，於化合物112(33mg、19μmol)的二氯甲烷(0.13g)溶液在室溫下加入乙酸(0.20mL)後，冷卻至0℃，加入肼1水合物(1.9μL、39μmol)，進行4小時30分鐘攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合 物115為主生成物。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1620.1626。
實施例122(新穎擬似固相保護基之合成及腺苷之5’位官能基變換)：化合物120之合成
步驟1 化合物116之合成
在氮氣環境下，將5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-乙醯丙醯基-2’-脫氧腺苷(2.0g、3.1mmol)與DMAP(0.78g、6.4mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液升溫至 40℃，以N-α-(9-芴基甲氧基羰基)-N-α-甲基甘胺酸(2.0g、6.3mmol)、WSC．HCl(1.2g、6.3mmol)的順序加入，在40℃進行3小時攪拌。冷卻至室溫後，以5%碳酸氫鈉水溶液洗淨2次，將所得之有機層以水洗淨1次。將有機層在減壓下濃縮後以矽膠層析法(氯仿-甲醇)進行純化後得到化合物116(1.3g)。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ2.21(s、3H)、2.42-2.81(m、5H)、3.05-3.14(m、4H)、3.45(brs、2H)、3.77(s、6H)、4.00-4.69(m、6H)、5.55(brs、1H)、6.50(brs、1H)、6.77-6.91(m、4H)、7.19-7.78(m、17H)、8.14(d、1H)、8.52-8.90(m、2H)。MS(ESI+)：[M+H]+ 945.3776。
步驟2 化合物117之合成
在氮氣環境下，於化合物116(0.10g、0.11mmol)的乙腈(2.1g)溶液，在室溫加入哌啶(32μL、0.32mmol)，並進行2小時39分鐘攪拌。加入庚烷後分液，將乙腈層以庚烷洗淨3次。將所得之有機層在減壓下濃縮後得到化合物117(61mg)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 723.3209。
步驟3 化合物118之合成
在氮氣環境下，於3,4,5-參(十八烷氧基)安息香酸(依據國際公開第2014-077292號所記載的方法進行合 成)(51mg、55μmol)與化合物117(61mg、85μmol)的二氯甲烷(2.5g)溶液中，加入HOBt(無水)(12mg、90μmol)，繼續加入WSC．HCl(18mg、92μmol)，進行4小時39分鐘攪拌。將反應混合物加入於甲醇(31g)，析出固體後經過濾，得到化合物118(65mg)的白色固體。
1H-NMR：(300MHz；CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.26-1.77(m、96H)、2.21(s、3H)、2.58-2.81(m、5H)、3.01-3.16(m、4H)、3.78(s、6H)、3.96(s、6H)、4.81(s、2H)、5.53(d、1H)、6.48(q、1H)、6.70(s、2H)、6.77-7.39(m、14H)、8.11(s、1H)、8.58(brs、1H)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1632.1611。
步驟4 化合物120之合成
在氮氣環境下，將化合物118(11mg、6.9μmol)及吲哚(2.1mg、18μmmol)的二氯甲烷(0.20mL)溶液冷卻至10℃，加入膦酸(14mg、0.17mmmol)，進行1小時27分鐘攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物119為主生成物。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1330.0382。
其後，加入吡啶(0.050mL)並升溫至室溫，加入2,2-二甲基丁醯基氯化物(14μL、0.10mmmol)，進行1小時40分鐘攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物120為主生成物。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1394.0054。
實施例123(硫化劑檢討)：化合物121之合成
在氮氣環境下，於化合物42(0.15g)與N6-苯甲醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧腺苷(東京化成工業公司製)(0.10g、0.16mmol)的吡啶(3.0mL)溶液中，在25℃加入作為縮合劑之碳酸雙五氟苯酯(0.13g、0.32mmol)，進行20分鐘攪拌，進行偶合反應。反應混合物(3.53g)之中，於0.47g加入作為硫化劑的N-(乙基硫基)鄰苯二甲醯亞胺(依據Shinret、2009年、1號、112頁-116頁所記載的方法進行合成)(4.5mg、22μmol)，在室溫進行1小時攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物121為主生成物。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2155.2871。
實施例124(硫化劑檢討)：化合物122之合成
於在實施例123所得之偶合反應後的反應混合物(0.46g)中，加入作為硫化劑之N-(n-丙基硫基)鄰苯二甲醯亞胺(依據Bio Organic and Medicinal Chemistry、2006年、14卷、11號、3775頁-3784頁所記載的方法進行合成)(5.7mg、26μmol)，在室溫進行1小時攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物122為主生成物。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2169.3107。
實施例125(硫化劑檢討)：化合物123之合成
於在實施例123所得之偶合反應後的反應混 合物(0.48g)中，作為硫化劑加入N-(異丙基硫基)鄰苯二甲醯亞胺(依據Bio Organic and Medicinal Chemistry、2006年、14卷、11號、3775頁-3784頁所記載的方法進行合成)(5.6mg、25μmol)，在室溫進行3小時30分鐘攪拌。其後，追加N-(異丙基硫基)鄰苯二甲醯亞胺(32mg、0.15mmol)，進行1小時攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物123為主生成物。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2169.2959。
實施例126(硫化劑檢討)：化合物124之合成
於在實施例123所得之偶合反應後的反應混合物(0.48g)中，作為硫化劑加入N-(n-丁基硫基)鄰苯二甲醯亞胺(依據Bio Organic and Medicinal Chemistry、2006年、14卷、11號、3775頁-3784頁所記載的方法進行合成)(6.6mg、28μmol)，在室溫進行1小時攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物124為主生成物。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2183.3273。
實施例127(硫化劑檢討)：化合物125之合成
於在實施例123所得之偶合反應後的反應混合物(0.47g)，作為硫化劑加入N-(tert-丁基硫基)鄰苯二甲醯亞胺(依據Shinret、2009年、1號、112頁-116頁所記載的方法進行合成)(6.4mg、27μmol)，在室溫進行3小時30分鐘攪拌。其後，追加N-(tert-丁基硫基)鄰苯二甲醯亞胺(0.11g、0.47mmol)，進行1小時攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物125為主生成物。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2183.3326。
實施例128(硫化劑檢討)：化合物126之合成
於在實施例123所得的偶合反應後之反應混合物(0.48g)中，作為硫化劑加入N-(苯甲基硫基)鄰苯二甲醯亞胺(依據Bio Organic and Medicinal Chemistry、2006年、14卷、11號、3775頁-3784頁所記載的方法進行合成)(5.7mg、21μmol)，在室溫進行1小時攪拌。將反應混合物藉由LC-MS分析後確認化合物126為主生成物。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2217.3232
參考合成例8(5mer合成)：化合物134之合成
步驟1 化合物128之合成
使用3’-O-乙醯丙醯基胸苷(依據Bio Organic and Medicinal Chemistry、2013年、21卷、8013頁-8018頁所記載的方法進行合成)(0.75g、2.2mmol)，於含有依據特表2003-525305所記載的方法進行合成之化合物132的二氯甲烷(26g)溶液中，加入吲哚(0.78g、6.6mmol)並冷卻至10℃，加入二氯乙酸(0.90mL、11mmol)，進行1小時17分鐘攪拌。再加入二氯乙酸(0.90mL、11mmol)，進行40分鐘攪拌。將反應混合物加入於5%碳酸氫鈉水溶液並分液。於所得之水層中加入二氯甲烷，並分液的再萃取操作實施11次，合併所得之有機層，將溶劑減壓下餾去得到粗物。將粗物以矽膠層析法(氯仿-甲醇)純化後得到化合物128(0.65g)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 714.1865。
步驟2 化合物130之合成
在氮氣環境下，於化合物133(0.65g、0.91mmol)與N2-異丁醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-羥基膦-2’-脫氧胞苷三乙基胺鹽(Chem jeans公司製)(1.0g、1.3mmol)的吡啶(8mL)溶液，在室溫加入碳酸雙五氟苯酯(1.3g、3.2mmol)，進行15分鐘攪拌。其後，作為硫化劑加入N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(0.43g、1.9mmol)，進行1小時57分鐘攪拌。加入二氯甲烷與5% 碳酸氫鈉水溶液並分液，將所得之水層以二氯甲烷洗淨2次。合併所得之有機層，將溶劑減壓下餾去，得到含有化合物134之反應混合物(13g)。其中將12g進一步減壓下濃縮，加入甲苯後減壓下濃縮的操作重複3次後，加入二氯甲烷(16g)、吲哚(0.30g、2.6mmol)，冷卻至10℃，加入二氯乙酸(0.69mL、8.4mmol)，進行1小時40分鐘攪拌。將反應混合物加入於5%碳酸氫鈉水溶液並分液。於所得之水層中加入二氯甲烷並分液，將再萃取操作的實施2次，合併所得之有機層，將溶劑減壓下餾去得到粗物。將粗物以矽膠層析法(氯仿-甲醇)純化後得到化合物130(0.30g)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1176.2650。
步驟3 化合物132之合成
在氮氣環境下，於化合物130(0.24g、0.20mmol)與N6-苯甲醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-羥基膦-2’-脫氧鳥嘌呤核苷三乙基胺鹽(Chem jeans公司製)(0.23g、0.29mmol)的吡啶(6mL)溶液，在室溫加入碳酸雙五氟苯酯(0.43g、1.1mmol)，進行27分鐘攪拌。其後，作為硫化劑使用N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(0.10g、0.43mmol)，進行1小時34分鐘攪拌。加入二氯甲烷與5%碳酸氫鈉水溶液並分液，將所得之水層以二氯甲烷洗淨2次。合併所得之有機層，將溶劑減壓下餾去，得到含有化合物136之反應混合物。加入甲苯並將減壓下 濃縮的操作重複3次後，加入二氯甲烷(8.0g)及吲哚(77mg、0.66mmol)，冷卻至10℃，加入二氯乙酸(0.17mL、2.0mmol)，進行2小時8分鐘攪拌。將反應混合物加入於5%碳酸氫鈉水溶液並分液。於所得之水層中加入二氯甲烷並進行分液，再萃取操作實施2次，合併所得之有機層，將溶劑減壓下餾去，得到粗物。將粗物以矽膠層析法(氯仿-甲醇)純化後得到化合物132(0.12g)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 1644.3648。
步驟4 化合物134之合成
在氮氣環境下，於化合物132(0.12g、74μmol)與N6-苯甲醯基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-羥基膦-2’-脫氧腺苷三乙基胺鹽(Chem jeans公司製)(90mg、0.11mmol)的吡啶(5mL)溶液，在室溫加入碳酸雙五氟苯酯(0.28g、0.71mmol)，進行1小時2分鐘攪拌。其後，作為硫化劑使用N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(37mg、0.16mmol)，進行2小時8分鐘攪拌。加入二氯甲烷、乙腈與5%碳酸氫鈉水溶液並分液，將所得之水層以二氯甲烷與乙腈之混合溶劑洗淨2次。合併所得之有機層，將溶劑減壓下餾去，得到含有化合物133之反應混合物。於該反應混合物中加入二氯甲烷(3.1g)，冷卻之0℃，加入乙酸(0.15mL)後，加入肼1水合物(36μL、0.74mmol)，進行1小時26分鐘攪拌。於反應混合物加入乙醯丙酮(0.30mL)後升溫至室溫，加入5%碳酸氫鈉水溶 液並分液後所得之水層加入於二氯甲烷並分液的再萃取操作實施2次，合併所得之有機層，將溶劑減壓下餾去得到粗物。將粗物以矽膠層析法(氯仿-甲醇)純化後得到化合物134(55mg)。
MS(ESI+)：[M+H]+ 2334.5224。
實施例129(15mer合成)：化合物136之合成
步驟1 化合物135之合成
在氮氣環境下，於化合物103(43mg)與化合物134(19mg、8.3μmol)的吡啶(1.4mL)溶液，在室溫加入碳酸雙五氟苯酯(59mg、0.15mmol)，進行58分鐘攪拌。其後，作為硫化劑使用N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二甲醯亞胺(10mg、44μmol)，進行40分鐘攪拌。其後，將反應混合物在減壓下濃縮。加入甲苯(2g)並在減壓下濃縮的操作重複3次後，加入二氯甲烷(1.2mL)，將吲哚(2.5mg、21μmol)、二氯乙酸(6.2μL、76mmol)在10℃下加入，進行1小時51分鐘攪拌。其後，追加二氯乙酸(6.2μL、76mmol)，進行2小時41分鐘攪拌。進一步追加二氯乙酸(6.2μL、76mmol)，進行1小時38分鐘攪拌。加入吡啶(0.20mL)並升溫至室溫，將反應混合物加入於乙腈(38g)，將析出的固體析出過濾後得到化合物135(51mg)之淡皮膚色固體。
MS(ESI+)：[M+4H]4+ 2140.0080。
步驟2 化合物136之合成
在氮氣環境下，於化合物135(50mg、5.8μmol)的二氯甲烷(2.0mL)與吡啶(0.12mL)的混合溶液中，在40℃加入膦酸(19mg、0.23mmol)，將2,2-二甲基丁醯基氯化物(25μL、0.18mmol)分為5分加入後進行1小時12分鐘攪拌。其後，將反應混合物加入於乙腈(39g)，將析出的固 體經過濾後得到化合物136(44mg)之淡皮膚色固體。
MS(ESI+)：[M+4H]4+ 2155.9794。
實施例130(20mer合成)：化合物137之合成
在氮氣環境下，於化合物134(19mg、8.1μmol)與化合物136(44mg)的吡啶(1.2mL)溶液，在室溫加入碳酸雙五氟苯酯(274mg、0.69mmol)，進行1小時攪拌。其後，作為硫化劑使用N-[(2-氰基乙基)硫代]鄰苯二 甲醯亞胺(5.1mg、22μmol)，進行1小時攪拌。將反應混合物加入於甲醇(30g)，將析出的固體經過濾後得到化合物137(46mg)的白色固體。
MS(ESI+)：[M+5H]5+ 2205.1210。
實施例131(20mer的脫保護)：化合物138之合成
在氮氣環境下，於化合物137(2.6mg、0.24μmol)的二氯甲烷(0.38g)溶液，在室溫加入1,8-二氮 雜雙環[5.4.0]-7-十一碳烯[DBU](3.5μL、23μmol)、TMSCl(0.70μL、5.5μmol)，進行30分鐘攪拌。將反應混合物(1.6g)在減壓下濃縮，加入28%氨水(1.0mL)、乙二胺四乙酸(3.1mg、11μmol)，在80℃進行2小時6分鐘攪拌。將反應混合物經LC-MS分析後，確認化合物138的生成。
MS(ESI+)：[M+3H]3+ 2123.8976。
[產業上可利用性]
本發明為與由偶合步驟、氧化反應或硫化反應等將磷原子經修飾的步驟、脫保護步驟等所構成的通常製造方法相異的製造方法，可提供藉由含有具有擬似固相保護基之核苷酸或寡核苷酸的5’位羥基或3’位羥基經H-膦酸酯化的步驟之製造方法，使用容易分離且保存安定性高的核苷酸或寡核苷酸，可對應大量合成之寡核苷酸的新穎製造方法。因此，本發明可適用於siRNA、反義核酸、疫苗的輔助劑等寡核苷酸之製造上，在基因組創藥或基因診斷．治療等領域中極有用。

Claims (37)

  1. 一種寡核苷酸的製造方法，其特徵為於選自由2’位、3’位、5’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有擬似固相保護基，將5’位或3’位為羥基之核苷酸或寡核苷酸的該5’-羥基或3’-羥基進行H-膦酸酯化的步驟。
  2. 如請求項1之製造方法，其中至少含有1個伸長反應循環，該伸長反應循環為含有於選自由2’位、3’位、5’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有擬似固相保護基，將5’位或3’位為羥基之核苷酸或寡核苷酸的該5’-羥基或3’-羥基進行H-膦酸酯化的步驟。
  3. 如請求項2之製造方法，其中前述伸長反應循環為具有以下步驟者；第一步驟為含有，於選自2’位、3’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有擬似固相保護基，於3’位具有以基本保護基或擬似固相保護基所保護的羥基，將於5’位具有以一時保護基所保護的羥基之第一核苷酸或第一寡核苷酸之一時保護基經除去後生成5’-羥基的步驟；第二步驟為含有，將所生成的5’-羥基使用H-膦酸酯化試藥進行H-膦酸酯化的步驟；第三步驟為含有，與H-膦酸酯化的5’-羥基，於3’位具有羥基且於5’位具有以一時保護基所保護的羥基之第二核苷酸，或與第二寡核苷酸的3’-羥基形成亞磷酸二酯鍵，得到第一核苷酸或第一寡核苷酸與第二核苷酸或第二寡核苷酸之共軛物的第三步驟。
  4. 如請求項3之製造方法，其為進一步含有以下第四步驟，該步驟為含有將前述共軛物的亞磷酸二酯鍵轉換為磷酸二酯鍵、硫代磷酸二酯鍵、硼烷磷酸二酯鍵、胺基磷酸二酯鍵、以基本保護基所保護的磷酸二酯鍵或以基本保護基所保護的硫代磷酸二酯鍵之步驟。
  5. 如請求項3之製造方法，其為進一步含有以下第四步驟，該步驟為含有將前述共軛物的亞磷酸二酯鍵轉換為磷酸二酯鍵、硫代磷酸二酯鍵、硼烷磷酸二酯鍵或胺基磷酸二酯鍵的步驟。
  6. 如請求項4或5之製造方法，其為進一步含有第五步驟，該步驟為於由選自由前述第一步驟至第四步驟所成群的至少1種步驟所得的反應混合物中，添加極性溶劑使其產生沈澱物，與將所生成的沈澱物藉由固液分離而取得者。
  7. 如請求項6之製造方法，其中前述極性溶劑為碳數1至6的醇溶劑或碳數1至6的腈溶劑。
  8. 如請求項3至7中任一項之製造方法，其中更含有將前述基本保護基、一時保護基及擬似固相保護基皆除去的第六步驟。
  9. 如請求項3至8中任一項之製造方法，其中前述第一核苷酸或第一寡核苷酸具有於3’位以擬似固相保護基所保護的羥基。
  10. 如請求項3至9中任一項之製造方法，其中前述第三步驟為使用前述第二核苷酸。
  11. 如請求項2之製造方法，其為含有以下第七步驟至第九步驟者；第七步驟為含有，前述伸長反應循環為，於選自由2’位、5’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有擬似固相保護基，於5’位具有以基本保護基或擬似固相保護基所保護的羥基，將於3’位具有以一時保護基所保護的羥基之第三核苷酸或第三寡核苷酸的一時保護基除去後生成3’-羥基之步驟；第八步驟為含有，將所生成的3’-羥基使用H-膦酸酯化試藥，使其進行H-膦酸酯化之步驟；第九步驟為含有，由經H-膦酸酯化的3’-羥基，與於5’位具有羥基，於3’位具有以一時保護基所保護的羥基之第四核苷酸或第四寡核苷酸的5’-羥基形成亞磷酸二酯鍵，得到第三核苷酸或第三寡核苷酸與第四核苷酸或第四寡核苷酸的共軛物之步驟。
  12. 如請求項11之製造方法，其中更含有第十步驟，該步驟為含有，將前述共軛物的亞磷酸二酯鍵轉換為磷酸二酯鍵、硫代磷酸二酯鍵、硼烷磷酸二酯鍵、胺基磷酸二酯鍵、以基本保護基所保護的磷酸二酯鍵或以基本保護基所保護的硫代磷酸二酯鍵之步驟。
  13. 如請求項11之製造方法，其中更含有第十步驟，該步驟為含有，將前述共軛物的亞磷酸二酯鍵轉換為磷酸二酯鍵、硫代磷酸二酯鍵、硼烷磷酸二酯鍵或胺基磷酸二酯鍵之步驟。
  14. 如請求項12或13之製造方法，其中更含有第十一步驟，該步驟為，於由前述第七步驟至第十步驟中任一步驟所得的反應混合物中，添加極性溶劑使其產生沈澱物，與將所生成的沈澱物藉由固液分離而取得者。
  15. 如請求項14之製造方法，其中前述極性溶劑為碳數1至6的醇溶劑或碳數1至6的腈溶劑。
  16. 如請求項11至15中任一項之製造方法，其中更含有第十二步驟，該步驟為，將前述基本保護基、一時保護基及擬似固相保護基皆除去的步驟。
  17. 如請求項11至16中任一項之製造方法，其中前述第三核苷酸或第三寡核苷酸為於5’位具有以擬似固相保護基所保護的羥基。
  18. 如請求項11至17中任一項之製造方法，其中前述第九步驟為使用第四核苷酸。
  19. 如請求項1至18中任一項之製造方法，其中前述擬似固相保護基為下述式(I) (式中，*表示前述擬似固相保護基與欲保護之基的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1 至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L5為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，L6為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，M為0或1，將前述擬似固相保護基於核酸鹼部具有，該擬似固相保護基之m為0時，該擬似固相保護基之L1、L2、L3及L4中，單鍵數目為0至3)所示者。
  20. 如請求項1至18中任一項之製造方法，其中前述擬似固相保護基為下述式(II) (式中，*表示前述擬似固相保護基與欲保護之基的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)或-O-，將前述擬似固相保護基於核酸鹼部具有時，該擬似固相保護基之L1、L2、L3及L4中，單鍵數目為0至3)所示者。
  21. 如請求項3至20中任一項之製造方法，其中前述 一時保護基為tert-丁基二甲基矽基、4、4’-二甲氧基三苯甲基或乙醯丙醯基。
  22. 如請求項1至21中任一項之製造方法，其中前述進行H-膦酸酯化的步驟為使用選自由亞磷酸、亞磷酸二苯基、苯基-H-膦酸酯之三乙基銨鹽、p-甲苯甲醯基-H-膦酸酯之三乙基銨鹽、2-氯-4H-1,3,2-苯並二氧磷素-4-酮、三氯化磷所成群的至少一種H-膦酸酯化試藥。
  23. 如請求項1至22中任一項之製造方法，其中於前述第一至第四核苷酸及第一至第四寡核苷酸所含之核酸鹼，各獨立為選自由6-胺基嘌呤-9-基(腺嘌呤殘基)、2-胺基-6-羥基嘌呤-9-基(鳥嘌呤殘基)、2-氧代-4-胺基-1,2-二氫嘧啶-1-基(胞嘧啶殘基)、2-氧代-4-胺基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基(5-甲基胞嘧啶殘基)、2-氧代-4-羥基-1,2-二氫嘧啶-1-基(尿嘧啶殘基)及2-氧代-4-羥基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基(胸腺嘧啶殘基)所成群的至少1種。
  24. 一種化合物或其鹽，其特徵係由下述式(XI)： [式中，n表示1以上的任意整數， BaseZ，各獨立表示核酸鹼、以基本保護基所保護的核酸鹼或以擬似固相保護基所保護的核酸鹼，XZ，各獨立表示氫原子、鹵素原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、於第4位碳原子進行交聯的有機基或以擬似固相保護基所保護的羥基，Y，各獨立表示氫原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、硫醇基、以基本保護基所保護的硫醇基、氫化硼基、單C1-6烷基胺基或二C1-6烷基胺基，Z表示氫原子、基本保護基、一時保護基或擬似固相保護基，且滿足BaseZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的核酸鹼、XZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的羥基，及Z為擬似固相保護基的至少一項]所示。
  25. 如請求項24之化合物或其鹽，其中前述擬似固相保護基為下述式(II) (式中，*表示前述擬似固相保護基與欲保護之基的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數， L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)或-O-、L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)或-O-、將前述擬似固相保護基於核酸鹼部具有時，該擬似固相保護基之L1、L2、L3及L4中，單鍵數目為0至3)所示。
  26. 如請求項24或25之化合物或其鹽，其為滿足前述式(XI)中之BaseZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的核酸鹼，及Z為擬似固相保護基的至少一項。
  27. 如請求項24至26中任一項之化合物或其鹽，其中前述式(XI)中之Z為擬似固相保護基。
  28. 如請求項24至27中任一項之化合物或其鹽，其中前述式(XI)中之n為1至30。
  29. 一種化合物或其鹽，其特徵係由下述式(XII)： [式中，n表示1以上的任意整數，BaseZ為獨立表示各核酸鹼、以基本保護基所保護的核酸鹼或以擬似固相保護基所保護的核酸鹼，XZ為獨立表示各氫原子、鹵素原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、於第4位碳原子進行交聯的有機基或以擬似固相保護基所保護的羥基，Y為獨立表示各氫原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、硫醇基、以基本保護基所保護的硫醇基、氫化硼基、單C1-6烷基胺基或二C1-6烷基胺基，Z表示氫原子、基本保護基、一時保護基或擬似固相保護基，且滿足BaseZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的核酸鹼、XZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的羥基，及Z為擬似固相保護基之至少一項]所示。
  30. 如請求項29之化合物或其鹽，其中前述擬似固相保護基為下述式(II) (式中，*表示前述擬似固相保護基與欲保護之基的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)或-O-，將前述擬似固相保護基於核酸鹼部具有時，該擬似固相保護基之L1、L2、L3及L4中，單鍵數目為0至3)所示。
  31. 如請求項29或30之化合物或其鹽，其為滿足前 述式(XII)中之BaseZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的核酸鹼、及Z為擬似固相保護基的至少一項。
  32. 如請求項29至31中任一項之化合物或其鹽，其中前述式(XII)中之Z為擬似固相保護基。
  33. 如請求項29至32中任一項之化合物或其鹽，其中前述式(XII)中之n為1至30。
  34. 一種化合物或其鹽，其特徵係由下述式(XIII)： [式中，n表示1以上的任意整數，BaseZ各獨立表示核酸鹼、以基本保護基所保護的核酸鹼或以擬似固相保護基所保護的核酸鹼，XZ各獨立表示氫原子、鹵素原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、於第4位碳原子進行交聯的有機基或以擬似固相保護基所保護的羥基，W表示氫原子或一時保護基，Y各獨立表示氫原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、硫醇基、以基本保護基所保護的硫醇基、氫化硼基、單C1-6烷基胺基或二C1-6烷基胺基， Z表示氫原子、基本保護基、一時保護基或擬似固相保護基，且滿足BaseZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的核酸鹼、XZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的羥基，及Z為擬似固相保護基之至少一項，前述擬似固相保護基的至少一個為式(I) (式中，*表示前述擬似固相保護基與欲保護之基的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、 C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L5為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，L6為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，m為0或1，m為0時，L4非單鍵)所示]所示。
  35. 一種化合物或其鹽，其特徵係由下述式(XIV)： (式中，n表示1以上的任意整數，BaseZ為獨立表示各核酸鹼、以基本保護基所保護的核酸鹼或以擬似固相保護基所保護的核酸鹼，XZ為獨立表示各氫原子、鹵素原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、於第4位碳原子進行交聯的有機基或以擬似固相保護基所保護的羥基，W表示氫原子或一時保護基， Y為獨立表示各氫原子、羥基、以基本保護基所保護的羥基、硫醇基、以基本保護基所保護的硫醇基、氫化硼基、單C1-6烷基胺基或二C1-6烷基胺基，Z表示氫原子、基本保護基、一時保護基或擬似固相保護基，且滿足BaseZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的核酸鹼、XZ的至少一個為以擬似固相保護基所保護的羥基，及Z為擬似固相保護基的至少1項，前述擬似固相保護基的至少一個為式(I) (式中，*表示前述擬似固相保護基與欲保護之基的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-， L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L5為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，L6為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，m為0或1，m為0時，L4非單鍵)所示]所示化合物、或其鹽。
  36. 一種擬似固相保護基，其特徵係由下述式(I) (式中，*表示與選自由核苷酸或寡核苷酸的2’位、3’位及5’位的羥基以及核酸鹼部所成群的至少1處的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基， L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L5為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，L6為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，m為0或1，m為0時，L4非單鍵)所示。
  37. 一種核苷酸或寡核苷酸的製造方法，其為製造具有以下擬似固相保護基的核苷酸或寡核苷酸，其特徵為將於3’位及5’位，獨立具有羥基或經保護的羥基、於選自由2’位、3’位、5’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有羥基，或於2’位及核酸鹼部的至少1處具有羥基或胺基之核苷酸或寡核苷酸，與下述式(X-1) (式中，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-)所示羧基化合物、下述式(X-2) (式中，X為鹵素原子，R1、L1、L2、L3及L4與前述式(X-1)中的定義相同)所示酸鹵素化物或下述式(X-3) (式中，X為鹵素原子，R1、L1、L2、及L3與前述式(X-1)中之定義相同，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L5為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，L6為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)所示鹵素化烷基化合物進行反應，製造於選自由2’位、3’位、5’位及核酸鹼部所成群的至少1處具有下述式(I) (式中，*表示與選自由2’位、3’位、5’位及核酸鹼部所成群的至少1處的鍵結位置，R1為C1-40烷基、C2-40烯基或C2-40炔基，s為1至5的整數，L1為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L2為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L3為單鍵、C1-6伸烷基、C2-6伸烯基或C2-6伸炔基，L4為單鍵、-COO-、-CON(R2)-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-OCO-、-N(R2)CO-(式中R2表示氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基)、-C(O)-或-O-，L5為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，L6為氫原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C2-6烯基或C2-6鹵烯基，m為0或1，m為0時，L4非單鍵)所示擬似固相保護基的核苷酸或寡核苷酸。
TW105137671A 2015-11-17 2016-11-17 寡核苷酸的製造方法 TWI729028B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015-224617 2015-11-17
JP2015224617 2015-11-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201731861A true TW201731861A (zh) 2017-09-16
TWI729028B TWI729028B (zh) 2021-06-01

Family

ID=58718980

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105137671A TWI729028B (zh) 2015-11-17 2016-11-17 寡核苷酸的製造方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11548910B2 (zh)
EP (1) EP3378869A4 (zh)
JP (3) JP6950529B2 (zh)
CN (1) CN108350018A (zh)
TW (1) TWI729028B (zh)
WO (1) WO2017086397A1 (zh)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3378869A4 (en) * 2015-11-17 2019-09-18 Nissan Chemical Corporation PROCESS FOR THE PREPARATION OF OLIGONUCLEOTIDES
EP3398955A4 (en) 2015-12-16 2019-10-16 Ajinomoto Co., Inc. PROCESS FOR PRODUCING OLIGONUCLEOTIDES AND NUCLEOSIDE, NUCLEOTIDE OR OLIGONUCLEOTIDE
CN109641931B (zh) * 2016-06-21 2022-10-18 基因设计有限公司 核糖核酸h-磷酸酯单体的合成方法和使用了该单体的寡核苷酸合成
JP7306263B2 (ja) * 2017-05-02 2023-07-11 日産化学株式会社 オリゴヌクレオチドの製造方法
JP7140111B2 (ja) * 2017-05-16 2022-09-21 日産化学株式会社 オリゴヌクレオチドの製造方法
JP7229539B2 (ja) * 2017-12-27 2023-02-28 神戸天然物化学株式会社 高脂溶性ホスホラミダイトの製造
CN108586449A (zh) * 2018-06-08 2018-09-28 山东阳谷华泰化工股份有限公司 一种n-（2-巯基苯并噻唑）邻苯二甲酰亚胺及其制备方法和应用
JP7296636B2 (ja) * 2018-07-20 2023-06-23 藤本化学製品株式会社 アルコキシフェニル誘導体、ヌクレオシド保護体およびヌクレオチド保護体、オリゴヌクレオチド製造方法、ならびに、置換基除去方法
JP6770553B2 (ja) * 2018-07-20 2020-10-14 藤本化学製品株式会社 アルコキシフェニル誘導体、ヌクレオシド保護体およびヌクレオチド保護体、オリゴヌクレオチド製造方法、ならびに、置換基除去方法
WO2020166705A1 (ja) 2019-02-15 2020-08-20 味の素株式会社 オリゴヌクレオチドの製造方法
CN113631564A (zh) 2019-03-28 2021-11-09 味之素株式会社 具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法
EP3960749A4 (en) * 2019-05-21 2023-02-22 Natias Inc. MULTIFLUORINE BLOCKERS FOR OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS AND METHODS OF OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS USING THE SAME
US20230406878A1 (en) * 2020-11-11 2023-12-21 Biogen Ma Inc. Oligonucleotides, reagents, and preparation thereof
JP7220439B1 (ja) * 2022-03-14 2023-02-10 国立大学法人東北大学 キメラ分子の製造方法
JP7433684B1 (ja) 2023-05-24 2024-02-20 塩野フィネス株式会社 疑似固相保護基、それを用いたヌクレオシド保護体又はオリゴヌクレオチド保護体、オリゴアミダイト前駆体の製造方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3739015A (en) 1970-09-04 1973-06-12 Tanabe Seiyaku Co Esters of p-phenoxy and p-alkoxy cinnamic acid
US3860722A (en) 1972-09-22 1975-01-14 Richardson Merrell Inc Hypolipidemic agents
JPS60174797A (ja) 1984-02-21 1985-09-09 Funai Corp Ν−アロイルチミジン誘導体ならびに抗腫瘍活性物質の毒性低下剤
EP0863910A1 (en) 1995-10-19 1998-09-16 NeXstar Pharmaceuticals, Inc. Method for solution phase synthesis of oligonucleotides
US20040215010A1 (en) 2000-06-13 2004-10-28 Viktor Kumarev Universal solid supports for solid phase oligosynthesis and methods for their preparation and use
JP3947483B2 (ja) 2003-02-28 2007-07-18 財団法人野口研究所 ジアミド型ゲル化剤
WO2004089925A1 (en) * 2003-04-03 2004-10-21 Semafore Pharmaceuticals, Inc. Pi-3 kinase inhibitor prodrugs
WO2005028494A1 (ja) * 2003-09-02 2005-03-31 Takeshi Wada ５'-ホスフィチル化モノマーおよびh-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法
JP5548852B2 (ja) 2009-05-29 2014-07-16 国立大学法人東京農工大学 疎水性基結合ヌクレオシド、疎水性基結合ヌクレオシド溶液、及び疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法
CN102139203B (zh) 2011-01-14 2013-01-23 河北师范大学 一种选择性凝胶化苯胺(或取代苯胺)的有机小分子凝胶剂及其应用
US9029528B2 (en) * 2011-05-17 2015-05-12 Ajinomoto Co., Inc. Solution-based method of making oligonucleotides via phosphoramidite coupling
WO2013122236A1 (ja) * 2012-02-17 2013-08-22 味の素株式会社 塩基部保護オリゴヌクレオチド
DK2857412T3 (en) 2012-05-30 2017-04-03 Hokkaido System Science Co Ltd Method for Oligonucleotide Synthesis Using High-Resolution Liquid Phase Carrier
EP2878604B1 (en) 2012-07-25 2018-08-29 Kochi University Monomer for synthesis of rna, method for producing same, and method for producing rna
CN104918949B (zh) * 2012-11-14 2017-10-10 武田药品工业株式会社 核酸的液相合成方法
CN113717239A (zh) 2015-01-21 2021-11-30 味之素株式会社 沉淀促进剂以及使用其的沉淀方法
EP3378869A4 (en) * 2015-11-17 2019-09-18 Nissan Chemical Corporation PROCESS FOR THE PREPARATION OF OLIGONUCLEOTIDES
EP3398955A4 (en) 2015-12-16 2019-10-16 Ajinomoto Co., Inc. PROCESS FOR PRODUCING OLIGONUCLEOTIDES AND NUCLEOSIDE, NUCLEOTIDE OR OLIGONUCLEOTIDE

Also Published As

Publication number Publication date
US20190169223A1 (en) 2019-06-06
TWI729028B (zh) 2021-06-01
EP3378869A4 (en) 2019-09-18
EP3378869A1 (en) 2018-09-26
JP2023100975A (ja) 2023-07-19
CN108350018A (zh) 2018-07-31
WO2017086397A1 (ja) 2017-05-26
JP6950529B2 (ja) 2021-10-13
US11548910B2 (en) 2023-01-10
JP2022000444A (ja) 2022-01-04
JPWO2017086397A1 (ja) 2018-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW201731861A (zh) 寡核苷酸的製造方法
US11279736B2 (en) Conformationally-preorganized, MiniPEG-containing gamma-peptide nucleic acids
US10329318B2 (en) Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
CN105228999B (zh) 吗啉代寡核苷酸的制备方法
EP3423451B1 (en) Inhibitors of wdr5 protein-protein binding
EP1678169B1 (en) 4-(pyrazol-3-ylamino)pyrimidine derivatives for use in the treatment of cancer
TWI568734B (zh) 作為ｈｂｖ抑制劑的二氫嘧啶並環衍生物
CN104768964B (zh) 具有胍桥的人工核苷和寡核苷酸
TW201906855A (zh) 寡核苷酸之製造方法
CN108473526B (zh) 寡核苷酸的制备方法以及核苷、核苷酸或寡核苷酸
CN111848599A (zh) 一类含氧五元杂环化合物、合成方法、药物组合物及用途
KR20120097508A (ko) 벤조디아제핀 브로모도메인 억제제
CN107108676A (zh) 用于制备非对映异构纯的磷酰胺酯前药的方法
CN106029644B (zh) 硫代吡喃糖化合物及其制造方法
CN103204825B (zh) 作为蛋白激酶抑制剂的苯并噻唑化合物及其制备方法和用途
EP2484671A1 (en) Fluorescent molecule and method for detecting target nucleic acid
CN111246855A (zh) 用于分子的跨膜递送的化合物和方法
JP2000514404A (ja) 光不安定保護基を有するヌクレオシド誘導体
ES2963447T3 (es) Nuevos procesos e intermediarios para la preparación de estimulantes de guanilato ciclasa soluble
AU2010300788B2 (en) Process for preparing biphenyl imidazole compounds
CN109384785B (zh) 吡咯并吡啶酮类衍生物、其制备方法及其在医药上的用途
CN110343088B (zh) 一种基于PARP抑制剂Niraparib的衍生物及其制备方法和应用
TW201718617A (zh) 人工核苷及人工核苷酸以及人工寡核苷酸
Kohda et al. Synthesis and properties of N-aminoguanines
Larock et al. Synthesis of C-5 substituted nucleosides via palladium-catalyzed coupling of dienes and amines